RU2203495C2 - Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце - Google Patents
Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце Download PDFInfo
- Publication number
- RU2203495C2 RU2203495C2 RU2001115074/14A RU2001115074A RU2203495C2 RU 2203495 C2 RU2203495 C2 RU 2203495C2 RU 2001115074/14 A RU2001115074/14 A RU 2001115074/14A RU 2001115074 A RU2001115074 A RU 2001115074A RU 2203495 C2 RU2203495 C2 RU 2203495C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liposomes
- sample
- antigen
- antigens
- lysis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 50
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 19
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 16
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 6
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N dicetyl hydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOP(O)(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093541 dicetylphosphate Drugs 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- FUIZKNBTOOKONL-DPSBJRLESA-K trisodium;5-[(e)-(3-carboxy-5-methyl-4-oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)-(2,6-dichloro-3-sulfonatophenyl)methyl]-3-methyl-2-oxidobenzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C(C([O-])=O)C(=O)C(C)=C\C1=C(C=1C(=C(C=CC=1Cl)S([O-])(=O)=O)Cl)\C1=CC(C)=C(O)C(C([O-])=O)=C1 FUIZKNBTOOKONL-DPSBJRLESA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце. Сущность способа: проводят встраивание в мембрану липосом антигена, включение детектируемого вещества внутрь липосом, проведение лизиса в присутствии специфического к антигену антитела и определение количества аналита в пробе по выходу детектируемого вещества из лизированных липосом, при этом в мембрану липосом встраивают по крайней мере два антигена, а определение различных антигенов в пробе образца осуществляют путем проведения серии реакций комплементзависимого лизиса с различными специфичными к определяемым антигенам антителами. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала иммунодиагностических способов. 2 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской технике, в частности к иммуноанализу, и может быть использовано для ранней диагностики различных заболеваний.
Для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний в образце биологической жидкости, взятой у человека или животного, зачастую необходимо определять несколько специфичных для данного заболевания соединений (аналитов). В качестве аналитов могут выступать специфические антитела, вырабатываемые организмом при инфекционном заболевании, антигены, присущие возбудителю инфекционного заболевания, или аутоантитела, образующиеся к компонентам собственного организма. При этом возникают проблемы правильного выбора способа исследований с целью получения детектируемых визуально или инструментальными средствами сигналов, свидетельствующих о наличии упомянутых выше аналитов в пробе биологической жидкости.
Известен способ липосомального гомогенного иммуноанализа и средства для его осуществления (РСТ, патент 88/08982, класс МКИ G 01 N 33/542). Способ включает операции взаимодействия аналита (антигена), липосом, несущих первые антитела к антигену и содержащих внутри детектируемое вещество, вторичных антител к данному антигену (аналиту), третьих антител, способных прямо или косвенно связываться с вторичным антителом, освобождение детектируемого вещества из липосом в количестве, зависящем от количества аналита, в присутствии комплемента.
Недостатком способа является высокая стоимость, длительность и трудоемкость анализа.
Известен способ анализа образцов с использованием липосом с инкапсулированным внутрь детектируемым веществом (патент США 4.704.355, класс НКИ 435/6). В способе используется вариант гетерогенного анализа, сущность которого заключается в том, что определяемый аналит (антиген) приводят в контакт с твердым носителем, на котором иммобилизованы антитела, связывающиеся с определяемым аналитом, затем твердофазный носитель приводят в контакт с раствором, содержащим липосомы с инкапсулированным аденозинтрифосфатом (АТФ). Тестирование аналита осуществляют по взаимодействию освобожденного АТФ с люциферин-люциферазой, при этом свет эмиссии измеряют фотометром или люминометром. Анализ бактериальных и вирусных антигенов осуществляют на стрипах, мембранах, частицах.
Недостатком способа является использование в качестве маркера АТФ, который может присутствовать в исследуемой биологической жидкости так же, как и ингибиторы люциферин-люциферазы, что снижает точность измерений, а также использование операций отмывки от не связавшихся реагентов и примесей, что делает анализ более длительным и трудоемким и требует дополнительных средств для осуществления способа.
Известен способ гомогенного липосомального иммуноанализа образцов биологических жидкостей (РСТ, патент 86/04682, класс МКИ G 01 N 33/53). Сущность способа заключается в том, что аналит представляет собой растворимый антилиганд, который связывается непосредственно с молекулами лиганда, встроенного в мембрану липосом, образуя комплексы на поверхности липосом. В присутствии комплемента содержащие на поверхности специфичные комплексы липосомы лизируются, высвобождая инкапсулированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, количество которой пропорционально количеству аналита, связавшегося с липосомами.
Недостатком использования в качестве маркера фермента, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, является снижение его активности в процессе получения липосом и их хранения в водной среде. Кроме того, использование дополнительной индикаторной системы реагентов для повышения чувствительности способа при регистрации активности фермента, включающей дихлориндофенол и феназинметасульфат, делает процедуру проведения анализа более длительной и трудоемкой, а такие компоненты реакционной смеси, как NAD+ и NADH, могут присутствовать в сыворотке крови и влиять на точность проведения анализа.
Известен способ количественного определения антигенов или антител (патент США 4.623.618, класс НКИ 435/6). Способ позволяет проводить одновременное количественное измерение нескольких антигенов или антител в тестируемом образце и используется для выявления инфекционных заболеваний, хронических нарушений печени, злокачественных опухолей, иммуноглобулинов человека (IgG, IgM и IgA), в диагностике рака и др., в тех случаях, когда в одном образце необходимо определить несколько аналитов. В способе используют несколько видов микрокапсул, каждый из которых связан только с одним типом антигена или антител, причем каждый вид микрокапсул имеет включенное внутрь детектируемое вещество, отличное для каждого вида микрокапсул, которое высвобождается при проведении реакции комплементзависимого лизиса и определяется количественно в растворе. Количество высвободившегося вещества пропорционально количеству детектируемого антигена (антитела) в исследуемом образце. В качестве детектируемых веществ используют аминокислоты, сахара, белки, пептиды, полисахариды, ферменты и т.п. соединения, имеющие различный молекулярный вес. В качестве детектирующего средства используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), а в качестве микрокапсул - тени эритроцитов барана.
Использование для детектирования ВЭЖХ увеличивает время проведения анализа и его стоимость, а тени эритроцитов, используемые в качестве микрокапсул, не предназначены для длительного хранения.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ иммуноанализа, использующий липосомы и предназначенный для детектирования по крайней мере одного аналита в тестируемом образце (патент США 5.369.036, класс НКИ 436/523). Сущность способа заключается в том, что для определения, например, двух аналитов (антигенов) в пробе используют смесь липосом, в каждый тип из которых инкапсулированы различные детектируемые вещества и поверхности которых связаны с различными антителами или антигенами. Способ осуществляют на твердом носителе с иммобилизованным антигеном (антигенами). Наличие одного или другого аналита в образце регистрируют по изменению окраски компонентов реагентной смеси. В качестве детектируемых веществ могут быть использованы красители, водорастворимые или липофильные, поглощающие в видимой области (сульфородамин В, хромазурол S, акридины и др.), регистрация которых может быть проведена с помощью фотометров или визуально, либо вещества, обладающие флуоресцентными свойствами (фталоцианины, порфирины, хелаты лантанидов и др.), регистрация которых проводится с помощью инструментального анализа. В способе использован вариант гетерогенного анализа, что приводит к усложнению способа из-за наличия операций адсорбции антигенов или антител на твердом носителе и нескольких операций отмывок.
Способ не предназначен для определения нескольких аналитов в образце при наличии одного типа липосом.
Задачей является создание гомогенного способа ранней диагностики заболеваний человека и животных, основанного на использовании универсального, простого в изготовлении, дешевого реагента, сохраняющего свою активность в течение длительного времени.
Технический результат достигается предлагаемым изобретением.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце, включающем встраивание в мембрану липосом антигена и включение детектируемого вещества внутрь липосом, проведение лизиса в присутствии специфичного к антигену антитела и определение количества аналита в пробе по выходу детектируемого вещества из лизированных липосом, в мембрану липосом встраивают по крайней мере два антигена, а определение различных антигенов в образце осуществляют путем проведения серий реакций комплементзависимого лизиса с различными, специфичными к определяемым антигенам антителами.
Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную совокупности в заявляемой формуле изобретения. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны.
Предлагаемое изобретение отличается от прототипа иным способом получения липосомального реагента и другой последовательностью операций. Встраивание в мембрану липосом по крайней мере двух антигенов и инкапсулирование внутрь липосом одного детектируемого вещества позволяет проводить определение нескольких аналитов (антигены или антитела) в образце при использовании одного реагента и одного детектируемого вещества, что позволяет упростить и удешевить осуществление способа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.
Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (сальмонеллез, туляремия) человека и животных; в эпидемиологии - для оценки распространения инфекционных заболеваний среди работников животноводческих ферм, птицефабрик, пищевой и мясоперерабатывающей промышленности, имеющих постоянный контакт с животными и продуктами животноводства как потенциальными источниками инфекции для человека. Способ является доступным (детектируемое вещество, помещаемое внутрь липосом, - кальцеин, сульфородамин 101, сульфородамин В и специфические антисыворотки выпускаются отечественной промышленностью, липополисахариды могут быть получены в лабораторных условиях), экспрессным (время анализа 1-1,5 ч), гомогенным, что создает возможности его автоматизации, липосомальные реагенты стабильны при хранении в течение 6-8 месяцев при 4oС. Способ может быть использован для мониторинга нескольких заболеваний. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.
На фиг. 1 показана калибровочная кривая для определения липополисахаридного антигена (AГ1) F.tularensis; на фиг.2 показана калибровочная кривая для определения липополисахаридного антигена (АГ2) S.typhimurium.
Способ осуществляют следующим образом.
При осуществлении способа проводят встраивание в мембрану липосом нескольких различных антигенов (АГ1, АГ2 и т.д.), включение детектируемого вещества (метки) внутрь липосом, проведение реакции комплементзависимого лизиса в присутствии исследуемого образца и специфичного для одного из определяемых антигенов антитела (AT1, АТ2 и т.д.) с последующим определением искомого антигена по выходу детектируемого вещества из лизированных под действием комплемента липосом. Содержание АГ1 (или AT1) в исследуемом образце пропорционально количеству образовавшихся на поверхности липосом комплексов AГ1-AT1, которые активируют комплемент, что сопровождается лизисом липосом и выходом встроенного в липосомы детектируемого вещества. Таким образом, содержание антигена (или антитела) в образце пропорционально количеству освобожденного детектируемого вещества. В качестве детектируемого вещества могут быть использованы различные водорастворимые флуоресцентные соединения (сульфородамин 101, сульфородамин В, кальцеин). Для определения всех искомых антигенов в образце проводят серию реакций с частями исследуемого образца в присутствии специфичных к каждому последующему определяемому антигену (АГ2, АГ3 и т.д.) антител (АТ2, АТ3 и т.д.).
Для повышения точности анализа, кроме проведения полной реакции в присутствии липосом, антител и комплемента (при определении антител) или липосом, антигена, антител и комплемента (при определении антигена), ставят ряд контролей на неспецифический лизис липосом в присутствии только комплемента, только антител, только антигена или только буферного раствора. Полный лизис липосом определяют после разрушения липосом дезоксихолатом натрия. Регистрируют интенсивность флуоресценции детектируемого вещества после проведения реакции комплементзависимого лизиса и в каждом контроле. При определении содержания антигена иммунный лизис (А1) рассчитывают по уравнению
A1={F6-[(F3-F1)+F5]}/{F2-[(F3-F1)+ F4]}•100%, (1)
где F1 - фоновая флуоресценция детектируемого вещества в образце липосом;
F2 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антитела и комплемент;
F3 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и антитела;
F4 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и комплемент;
F5 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген и комплемент;
F6 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген, антитела и комплемент.
A1={F6-[(F3-F1)+F5]}/{F2-[(F3-F1)+ F4]}•100%, (1)
где F1 - фоновая флуоресценция детектируемого вещества в образце липосом;
F2 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антитела и комплемент;
F3 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и антитела;
F4 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы и комплемент;
F5 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген и комплемент;
F6 - флуоресценция детектируемого вещества в образце, содержащем липосомы, антиген, антитела и комплемент.
При определении содержания антител иммунный лизис (А2) рассчитывают по уравнению
A2={F2-[F4+(F3-F1)]}/(F7 - F1)•100%, (2)
где F1, F2, F3 и F4 имеют те же обозначения, что и в уравнении (1), а F7 - флуоресценция детектируемого вещества в образце после разрушения липосом дезоксихолатом натрия.
A2={F2-[F4+(F3-F1)]}/(F7 - F1)•100%, (2)
где F1, F2, F3 и F4 имеют те же обозначения, что и в уравнении (1), а F7 - флуоресценция детектируемого вещества в образце после разрушения липосом дезоксихолатом натрия.
Пример 1. Получение липосомального реагента
Раствор липидов - яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат (в молярном соотношении 2:1,5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 по объему) упаривают на роторном испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 100 мМ сульфородамина 101, липополисахарид (ЛПС) F.tularensis (АГ1) из расчета 300 мкг на 1 мкмоль суммарного липида и ЛПС S.typhimurium (АГ2), предварительно обработанный 0,1 N NaOH, из расчета 150 мкг на 1 мкмоль суммарного липида. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц 3-4 раза по 30 с. Эмульсию помещают в круглодонную колбу на 20 мл и упаривают на роторном испарителе при давлении 50 кПа до образования липосом, а затем при 25 кПа до полного удаления эфира. Невключившийся сульфородамин 101 отделяют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-50, уравновешанной трис-солевым буфером (ТСБ), а затем центрифугируют при 100 000 g в течение 40 мин. Полученный липосомальный реагент в ТСБ сохраняется в концентрированном состоянии (4-6 мкмоль липида/мл) при +4oС без утраты своей биологической активности в течение 6-8 месяцев.
Раствор липидов - яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат (в молярном соотношении 2:1,5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 по объему) упаривают на роторном испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 100 мМ сульфородамина 101, липополисахарид (ЛПС) F.tularensis (АГ1) из расчета 300 мкг на 1 мкмоль суммарного липида и ЛПС S.typhimurium (АГ2), предварительно обработанный 0,1 N NaOH, из расчета 150 мкг на 1 мкмоль суммарного липида. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц 3-4 раза по 30 с. Эмульсию помещают в круглодонную колбу на 20 мл и упаривают на роторном испарителе при давлении 50 кПа до образования липосом, а затем при 25 кПа до полного удаления эфира. Невключившийся сульфородамин 101 отделяют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-50, уравновешанной трис-солевым буфером (ТСБ), а затем центрифугируют при 100 000 g в течение 40 мин. Полученный липосомальный реагент в ТСБ сохраняется в концентрированном состоянии (4-6 мкмоль липида/мл) при +4oС без утраты своей биологической активности в течение 6-8 месяцев.
Пример 2. Построение калибровочной кривой для определения липополисахаридного антигена (АГ1) F.tularensis
Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛПС-AГ1 (1 мг/мл ) в ТСБ. 10 мкл раствора АГ1 (с учетом двух параллельных) каждой концентрации смешивают с 20 мкл АТ1. Используют такое разведение АТ1, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, затем добавляют по 20 мкл суспензии липосомального реагента, содержащего 10 нмолей суммарного липида, инкубируют 10 мин, добавляют 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl2 и 1,5 мМ CaCl2, и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы только с ТСБ, липосомы только с AT1, липосомы только с комплементом. Через 1 ч инкубации при 20-24oС реакцию останавливают добавлением 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А1) проводят по уравнению (1). За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствии ЛПС. Строят кривую зависимости величины иммунного лизиса липосом (А1 в %) от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ1 в растворе (фиг.1). Диапазон измеряемых концентраций ЛПС F.tularensis от 0,1 до 50 мкг/мл исходного раствора.
Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛПС-AГ1 (1 мг/мл ) в ТСБ. 10 мкл раствора АГ1 (с учетом двух параллельных) каждой концентрации смешивают с 20 мкл АТ1. Используют такое разведение АТ1, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, затем добавляют по 20 мкл суспензии липосомального реагента, содержащего 10 нмолей суммарного липида, инкубируют 10 мин, добавляют 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl2 и 1,5 мМ CaCl2, и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы только с ТСБ, липосомы только с AT1, липосомы только с комплементом. Через 1 ч инкубации при 20-24oС реакцию останавливают добавлением 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А1) проводят по уравнению (1). За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствии ЛПС. Строят кривую зависимости величины иммунного лизиса липосом (А1 в %) от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ1 в растворе (фиг.1). Диапазон измеряемых концентраций ЛПС F.tularensis от 0,1 до 50 мкг/мл исходного раствора.
Пример 3. Построение калибровочной кривой для определения липополисахаридного антигена (АГ2) S.typhimurium
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2. Используют АТ2 к S. typhimurium и растворы ЛПС S. typhimurium (АГ2) в ТСБ. На фиг.2 представлена кривая зависимости иммунного лизиса (А1 в %) липосом от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ2 в растворе. Диапазон измеряемых концентраций ЛПС S.typhimurium от 0,5 до 200 мкг/мл.
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2. Используют АТ2 к S. typhimurium и растворы ЛПС S. typhimurium (АГ2) в ТСБ. На фиг.2 представлена кривая зависимости иммунного лизиса (А1 в %) липосом от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ2 в растворе. Диапазон измеряемых концентраций ЛПС S.typhimurium от 0,5 до 200 мкг/мл.
Пример 4. Количественное определение липополисахаридного антигена F. tularensis
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение AT1, что и в примере 2. Из полученных величин A1 в % с помощью калибровочной кривой (фиг.1) находят концентрацию ЛПС-АГ1.
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение AT1, что и в примере 2. Из полученных величин A1 в % с помощью калибровочной кривой (фиг.1) находят концентрацию ЛПС-АГ1.
Пример 5. Количественное определение липополисахаридного антигена S. typhimurium
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 3, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение АТ2, что и в примере 3. Из полученных величин А1 в % с помощью калибровочной кривой (фиг.2) находят концентрацию ЛПС-АГ2.
Постановку реакции и расчет величины иммунного лизиса проводят, как описано в примере 3, за исключением того, что вместо раствора ЛПС известной концентрации вносят 10 мкл исследуемой пробы. Используют тоже разведение АТ2, что и в примере 3. Из полученных величин А1 в % с помощью калибровочной кривой (фиг.2) находят концентрацию ЛПС-АГ2.
Пример 6. Определение в образце титра антител к F.tularensis (АТ1)
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ1 на ТСБ от 1:2 до 1: 8192. В пробирки (с учетом двух параллельных) вносят по 20 мкл суспензии липосомального реагента, полученного по методу, приведенному в примере 1, содержащей 10 нмолей суммарного липида, 20 мкл AT1 каждого разведения, инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl2 и 1,5 мМ CaCl2, и 20 мкл комплемента. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы в ТСБ, липосомы с АТ2, липосомы с комплементом, а также определяют полный лизис липосом после их обработки 4% дезоксихолатом натрия. Через 1 ч инкубации при 20-24oС реакцию останавливают 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А2) проводят по уравнению (2). За титр АТ1 принимают минимальное разведение образца, дающее 10%-ный иммунный лизис липосом.
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ1 на ТСБ от 1:2 до 1: 8192. В пробирки (с учетом двух параллельных) вносят по 20 мкл суспензии липосомального реагента, полученного по методу, приведенному в примере 1, содержащей 10 нмолей суммарного липида, 20 мкл AT1 каждого разведения, инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл ТСБ, содержащего 5 мМ MgCl2 и 1,5 мМ CaCl2, и 20 мкл комплемента. Объем смеси доводят до 100 мкл ТСБ. Одновременно (с учетом двух параллельных) ставят контроли: липосомы в ТСБ, липосомы с АТ2, липосомы с комплементом, а также определяют полный лизис липосом после их обработки 4% дезоксихолатом натрия. Через 1 ч инкубации при 20-24oС реакцию останавливают 3 мл ТСБ. Флуоресценцию в каждой пробе измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волн эмиссии и возбуждения 585 и 620 нм соответственно. Расчет величины иммунного лизиса (А2) проводят по уравнению (2). За титр АТ1 принимают минимальное разведение образца, дающее 10%-ный иммунный лизис липосом.
В таблице 1 приведены результаты определения величин иммунного лизиса липосом, соответствующих определенным разведениям образца АТ1.
Из данных таблицы 1 видно, что титр AT1 составляет ~1:40000.
Пример 7. Получение иммунного лизиса липосом в присутствии антител к S. typhimurium (АТ2)
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ2 на ТСБ от 1:2 до 1: 32. Далее постановку реакции и расчет иммунного лизиса липосом проводят, как описано в примере 3. В таблице 2 приведены результаты определения величин иммунного лизиса липосом, соответствующих определенным разведениям образца АТ2.
Готовят ряд последовательных рабочих разведений АТ2 на ТСБ от 1:2 до 1: 32. Далее постановку реакции и расчет иммунного лизиса липосом проводят, как описано в примере 3. В таблице 2 приведены результаты определения величин иммунного лизиса липосом, соответствующих определенным разведениям образца АТ2.
Из данных таблицы 2 видно, что титр АТ2 составляет ~1:80.
Claims (1)
- Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце, включающий встраивание в мембрану липосом антигена и включение детектируемого вещества внутрь липосом, проведение лизиса в присутствии специфического к антигену антитела и определение количества аналита в пробе по выходу детектируемого вещества из лизированных липосом, отличающийся тем, что в мембрану липосом встраивают по крайней мере два антигена, а определение различных антигенов в пробе образца осуществляют путем проведения серии реакций комплементзависимого лизиса с различными специфичными к определяемым антигенам антителами.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001115074/14A RU2203495C2 (ru) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001115074/14A RU2203495C2 (ru) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001115074A RU2001115074A (ru) | 2002-04-10 |
| RU2203495C2 true RU2203495C2 (ru) | 2003-04-27 |
Family
ID=20250328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001115074/14A RU2203495C2 (ru) | 2001-06-06 | 2001-06-06 | Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2203495C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2497128C2 (ru) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" | Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом |
-
2001
- 2001-06-06 RU RU2001115074/14A patent/RU2203495C2/ru active IP Right Revival
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2497128C2 (ru) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" | Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4859583A (en) | Chemiluminescent immunochemical technique for low molecular weight antigens | |
| US4786589A (en) | Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants | |
| JP2505979B2 (ja) | イムノアッセイ装置 | |
| US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
| US4916080A (en) | Immunoassay with antigen or antibody labelled microcapsules containing fluorescent substance | |
| US9274056B2 (en) | Use of non-chelated fluorochromes in rapid test systems | |
| AU7484187A (en) | Fluorescence immunoassay involving energy transfer between two fluorophores | |
| JPH0137694B2 (ru) | ||
| US4804625A (en) | Assay procedures | |
| EP0022768A1 (en) | CONTROLLING A MACROMOLECULAR MILIEUS IN RECEPTOR-SPECIFIC ANALYSIS. | |
| JPH01248061A (ja) | 試験キットおよび免疫リガンドの測定方法 | |
| CA2111555A1 (en) | Mixed luminescent conjugate test assays | |
| EP0132556B1 (en) | Immunoassay | |
| Carter et al. | Rapid detection of aflatoxin B1 with immunochemical optrodes | |
| NAKAMURA et al. | A Liposome Immunoassay Based on a Chemiluminescense Reaction | |
| RU2203495C2 (ru) | Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце | |
| Song et al. | Detection of multivalent interactions through two-tiered energy transfer | |
| CA2097952C (en) | Early diagnosis of sepsis utilizing antigen-antibody interactions amplified by whole blood chemiluminescence | |
| US4491634A (en) | Chemiluminescent immunoassay with activator of hydrogen peroxide and a chloramine | |
| JPS6281567A (ja) | 粒子凝集反応を用いる定量方法 | |
| EP0079962B1 (en) | Immunoprecipitation assay | |
| Kim et al. | A qualitative agar gel immunoprecipitin (IP) test for detection of fecal occult human hemoglobin | |
| Matsumoto et al. | Latex agglutination test for detecting antibodies to Treponema pallidum | |
| US5243074A (en) | Immunoreagents | |
| SU1763984A1 (ru) | Способ определени липополисахаридного антигена |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040607 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160607 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20171006 |