RU2203089C2

RU2203089C2 - Method for obtaining vaccine of tick- borne encephalitis

Info

Publication number: RU2203089C2
Application number: RU2001117483/13A
Authority: RU
Inventors: И.В. Красильников; О.И. Шарова; И.А. Мищенко; М.С. Воробьева; М.Н. Расщепкина; Н.Х. Ставицка; Н.Х. Ставицкая; Г.П. Билалова
Original assignee: Федеральное Государственное унитарное предприятие научно-производственное объединение "Вирион"
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-04-27
Also published as: CN1398638A

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: process to obtain vaccine includes reproduction of virus in cellular culture, its inactivation, isolation, addition of protamine sulfate, purification and sorption upon aluminium hydroxide. At the stage of viral reproduction, one should add chicken extract into culture medium. Addition of protamine sulfate is carried out into unpurified inactivated culture medium without preliminary purification. Concentration of inactivated virus is conducted due to ultrafiltration after purification of culture medium by centrifuging. Purification of concentrated virus is performed due to chromatography upon porous silica. Chromatographically purified fraction is controlled for the content of total protein and proteins of chicken embryo, diluted with buffer solution in accordance to its antigenic activity to use in obtaining the sorbed vaccine. Concentration of proteins in chicken embryo in purified vaccine semifinished product does not exceed 1 mcg/vaccine dose. Vaccine obtained due to above-mentioned method contains minimum amount of proteins of chicken embryo and has improved antigenic properties. EFFECT: higher efficiency. 7 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении культуральных вакцин клещевого энцефалита (КЭ). The invention relates to microbiology and can be used to obtain tick-borne encephalitis (CE) culture vaccines.

Вакцина клещевого энцефалита может быть изготовлена на основе культуральных вирусных сборов, для получения которых используют первичные или перевиваемые клеточные культуры. Tick-borne encephalitis vaccine can be made on the basis of viral culture cultures, for which primary or transplantable cell cultures are used.

Согласно требованиям ВОЗ в вакцинах на основе перевиваемых клеточных культур жестко лимитируется содержание остаточной ДНК: оно не должно превышать 10 нг на 1 дозу вакцины для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия. According to WHO requirements, vaccines based on transplantable cell cultures strictly limit the residual DNA content: it should not exceed 10 ng per 1 dose of the vaccine to exclude the potential for its oncogenic and transforming effects.

Содержание гетерологичных белков в вакцине регламентируется Национальным Органом Контроля страны-производителя. При получении вакцины клещевого энцефалита с использованием первичной культуры клеток куриных эмбрионов существуют ограничения по содержанию в конечном продукте таких гетерологичных белков, как белки сыворотки крови крупного рогатого скота и белки куриного эмбриона. Согласно требованиям Национального Органа Контроля медицинских иммунобиологических препаратов - Государственного института стандартизации и контроля им. Л. А.Тарасевича (ГИСК им Л.А.Тарасевича) содержание гетерологичных белков в вакцине клещевого энцефалита должно быть не более 1 мкг/дозу. The content of heterologous proteins in the vaccine is regulated by the National Control Authority of the country of origin. When obtaining a tick-borne encephalitis vaccine using a primary chicken embryo cell culture, there are restrictions on the content of heterologous proteins such as cattle serum proteins and chicken embryo proteins in the final product. According to the requirements of the National Body for the Control of Medical Immunobiological Preparations - State Institute of Standardization and Control named after L. A. Tarasevich (GISK named after L. A. Tarasevich), the content of heterologous proteins in the tick-borne encephalitis vaccine should be no more than 1 μg / dose.

Известен способ получения культуральных вакцин КЭ, предусматривающий заражение вирусом культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, выделением, очисткой и сорбцией на адъюванте (пат. SU 1003738, кл. А 61 К 39/12, 22.12.78). A known method of obtaining culture vaccines CE, providing for virus infection of cell culture with subsequent reproduction and release of the virus into the culture medium, its inactivation, isolation, purification and sorption on adjuvant (US Pat. SU 1003738, class A 61 K 39/12, 22.12.78 )

Использование этого способа получения вирусной суспензии как в суспензионной, так и в монослойной культуре клеток куриных эмбрионов связано с достаточно высоким накоплением в ней белков куриного эмбриона. The use of this method of producing a viral suspension both in suspension and in a monolayer culture of chicken embryo cells is associated with a fairly high accumulation of chicken embryo proteins in it.

Задачей предлагаемого способа является получение высокоиммуногенной очищенной вакцины клещевого энцефалита, снижение количества белков куриного эмбриона в вакцине клещевого энцефалита, полученной известным методом на культуре клеток куриных эмбрионов. The objective of the proposed method is to obtain a highly immunogenic purified vaccine of tick-borne encephalitis, a decrease in the number of chicken embryo proteins in a tick-borne encephalitis vaccine obtained by a known method on a cell culture of chicken embryos.

Поставленная задача достигается тем, что заявляемый способ предусматривает заражение вирусом КЭ культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, очисткой и сорбцией на адъюванте. На стадии репродукции в культуральную среду добавляют куриный экстракт, добавление протаминсульфата осуществляют в неосветленную инактивированную культуральную среду, концентрирование инактивированного вируса осуществляют ультрафильтрацией после осветления культуральной среды проточным центрифугированием и фильтрацией, очистку концентрированного вируса проводят хроматографией на диолмодифицированном сорбенте. Куриный экстракт используют с конечной концентрацией в среде от 0,5 мкг/мл до 1 мкг/мл. Протаминсульфат добавляют в неосветленную культуральную среду до конечной концентрации от 50 до 100 мкг/мл. Осветление культуральной вируссодержащей среды центрифугированием проводят после добавления в среду формальдегида и протаминсульфата. Осветление проводят на проточной центрифуге с ускорением от 12000 до 15000 g с последующей фильтрацией через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом полуфабрикат концентрируют в 30-50 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах или трековых мембранах с диаметром пор от 40 до 60 нм. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с макропористым кремнеземом. Кремнезем используют с порами диаметром от 50 до 100 мкм. This object is achieved in that the claimed method involves infection of the CE virus with cell culture, followed by reproduction and release of the virus into the culture medium, its inactivation, purification and sorption on the adjuvant. At the stage of reproduction, chicken extract is added to the culture medium, protamine sulfate is added to the unclarified inactivated culture medium, the inactivated virus is concentrated by ultrafiltration after clarification of the culture medium by flow centrifugation and filtration, and the concentrated virus is purified by chromatography on a di-modified sorbent. Chicken extract is used with a final concentration in the medium from 0.5 μg / ml to 1 μg / ml. Protamine sulfate is added to the non-clarified culture medium to a final concentration of 50 to 100 μg / ml. Clarification of the culture virus-containing medium by centrifugation is carried out after adding formaldehyde and protamine sulfate to the medium. Clarification is carried out in a flow centrifuge with an acceleration from 12000 to 15000 g, followed by filtration through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. Thus obtained semi-finished product is concentrated 30-50 times by ultrafiltration on synthetic filters or track membranes with pore diameters from 40 to 60 nm. Next, the concentrate is purified by gel chromatography on a column of macroporous silica. Silica is used with pores with a diameter of 50 to 100 microns.

Предложенный способ осуществляют следующим образом. The proposed method is as follows.

Вирусный сбор (вирусную суспензию) получают путем репродукции вируса в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный экстракт. Культивирование проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре 36-37^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200 ± 20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а инактивированную вирусную суспензию контролируют на отсутствие вирусной активности. Перед объединением культуральную среду, содержащую клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, обрабатывают протаминсульфатом, затем вирусный сбор центрифугируют, объединяя в общую емкость, и фильтруют для освобождения от клеточного субстрата. Операцию производят следующим образом: в инактивированную вирусную суспензию добавляют 4%-ный раствор протаминсульфата до конечной концентрации 50-100 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6±2)^oС на 0,5-12 часов. Далее преципитат удаляют последовательным центрифугированием полуфабриката из отдельных емкостей на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении ~13000g с последующей фильтрацией объединенного полуфабриката через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 30-50 раз ультрафильтрацией на синтетических или асимметричных трековых мембранах. Концентрат дополнительно очищают хроматографией на колонке с модифицированным пористым кремнеземом. Тип сорбента - диол кремнезем или кремнезем, модифицированный поливинилпирролидоном. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита, количество общего белка и белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разводят в соответствии с его антигенной активностью и используют для приготовления сорбированной вакцины.Viral collection (viral suspension) is obtained by reproduction of the virus in a suspension primary culture of chicken embryonic cells. Chicken extract is added to increase reproduction. Cultivation is carried out in 6.0 liter bottles for 4 days at a temperature of 36-37 ^o With continuous stirring on a roller unit with a rotation speed of 8-10 rpm. Then the virus suspension is inactivated with formaldehyde at a final concentration of 200 ± 20 μg / ml for 3 days at a temperature of (32 ± 1) ^o C. The concentration of the infectious virus in the viral suspension is monitored before inactivation, and the inactivated virus suspension is monitored for the absence of viral activity. Before combining, the culture medium containing cell debris, virus suspension and cells with the virus is treated with protamine sulfate, then the viral collection is centrifuged, combining in a common container, and filtered to release from the cellular substrate. The operation is performed as follows: a 4% solution of protamine sulfate is added to an inactivated viral suspension to a final concentration of 50-100 μg / ml. Leave for interaction at a temperature of (6 ± 2) ^o C for 0.5-12 hours. Next, the precipitate is removed by sequential centrifugation of the semi-finished product from individual containers on an OTR-101K-01 flowing centrifuge at an acceleration of ~ 13000g, followed by filtration of the combined semi-finished product through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. Thus obtained, the combined semi-finished product is concentrated 30-50 times by ultrafiltration on synthetic or asymmetric track membranes. The concentrate is further purified by chromatography on a column of modified porous silica. The type of sorbent is diol silica or silica modified with polyvinylpyrrolidone. In the collected chromatographic fraction, the antigenic activity of tick-borne encephalitis virus, the amount of total protein and proteins of the chicken embryo are controlled. Then the obtained purified concentrate is filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm, diluted in accordance with its antigenic activity and used to prepare a sorbed vaccine.

Пример 1. Example 1

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oC при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oC. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 50 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 30-40 мин. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 30 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с пористым кремнеземом. Тип сорбента - диол кремнезем. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят равным количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.A viral suspension is obtained by reproduction of the virus (strain TBEV 205) in a suspension primary culture of chicken embryo cells. To increase reproduction, chicken embryonic extract is added at a final concentration of 1 μg / ml. The cultivation of the virus is carried out in 6.0 liter bottles for 4 days at a temperature of (37 ± 1) ^o C with continuous stirring on a roller unit with a rotation speed of 8-10 rpm. Then the viral suspension is inactivated with formaldehyde at a final concentration of 200 ± 20 μg / ml for 3 days at a temperature of (32 ± 1) ^o C. The concentration of the infectious virus in the viral suspension is controlled before inactivation, and the amount of chicken embryo proteins in the semi-finished product after inactivation. This is followed by the stage of release from the cellular substrate and the union of the semi-finished product. The operation is performed as follows: in a bottle with an inactivated culture medium containing cell debris, a virus suspension and cells with a virus, protamine sulfate is added to a final concentration of 50 μg / ml. Leave for interaction at a temperature of (6 + 2) ^o C for 30-40 minutes Then, cell detritus and the precipitate formed are removed by centrifugation on an OTP-101K-01 flowing centrifuge with an acceleration of 13,200 g. Collection of the semi-finished product coming from the centrifuge is carried out in a common container, then it is filtered through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. The combined semi-finished product thus obtained is concentrated 30 times by ultrafiltration on synthetic filters. Next, the concentrate is purified by gel chromatography on a column of porous silica. The type of sorbent is diol silica. In the collected chromatographic fraction, the antigenic activity of tick-borne encephalitis virus and the amount of chicken embryo proteins are controlled. Then, the obtained purified concentrate is diluted with an equal amount of buffer solution, filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm and used to prepare a sorbed vaccine. Determination of protein concentration of the chicken embryo is carried out by the method of counter immunoelectrophoresis.

Пример 2. Example 2

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 100 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 12 час. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 15000 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 50 раз ультрафильтрацией на асимметричных трековых мембранах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с модифицированным пористым кремнеземом. Тип сорбента - диасорб-750-диол. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.A viral suspension is obtained by reproduction of the virus (strain TBEV 205) in a suspension primary culture of chicken embryo cells. To increase reproduction, chicken embryonic extract is added at a final concentration of 1 μg / ml. The cultivation of the virus is carried out in 6.0 liter bottles for 4 days at a temperature of (37 ± 1) ^o C with continuous stirring on a roller unit with a rotation speed of 8-10 rpm. Then the viral suspension is inactivated with formaldehyde at a final concentration of 200 ± 20 μg / ml for 3 days at a temperature of (32 ± 1) ^o C. The concentration of the infectious virus in the viral suspension is controlled before inactivation, and the amount of chicken embryo proteins in the semi-finished product after inactivation. This is followed by the stage of release from the cellular substrate and the union of the semi-finished product. The operation is performed as follows: in a bottle with an inactivated culture medium containing cell debris, protamine sulfate is added to a final concentration of 100 μg / ml. Leave for interaction at a temperature of (6 + 2) ^o C for 12 hours. Then, cell detritus and the precipitate formed are removed by centrifugation on an OTP-101K-01 flow-through centrifuge at an acceleration of 15,000 g. Collection of the semi-finished product coming from the centrifuge is carried out in a common container, then it is filtered through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. The combined semifinished product thus obtained was concentrated 50 times by ultrafiltration on asymmetric track membranes. The concentrate is then purified by gel chromatography on a column of modified porous silica. The type of sorbent is diasorb-750-diol. In the collected chromatographic fraction, the antigenic activity of tick-borne encephalitis virus and the amount of chicken embryo proteins are controlled. Then, the obtained purified concentrate is diluted with an appropriate amount of a buffer solution, filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm and used to prepare a sorbed vaccine. Determination of protein concentration of the chicken embryo is carried out by the method of counter immunoelectrophoresis.

Пример 3. Example 3

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oС. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 75 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 1 час. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 40 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с пористым кремнеземом. Тип сорбента - диасорб-1000-диол. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.A viral suspension is obtained by reproduction of the virus (strain TBEV 205) in a suspension primary culture of chicken embryo cells. To increase reproduction, chicken embryonic extract is added at a final concentration of 1 μg / ml. The cultivation of the virus is carried out in 6.0 liter bottles for 4 days at a temperature of (37 ± 1) ^o C with continuous stirring on a roller unit with a rotation speed of 8-10 rpm. Then the viral suspension is inactivated with formaldehyde at a final concentration of 200 ± 20 μg / ml for 3 days at a temperature of (32 ± 1) ^o C. The concentration of the infectious virus in the viral suspension is controlled before inactivation, and the amount of chicken embryo proteins in the semi-finished product after inactivation. This is followed by the stage of release from the cellular substrate and the union of the semi-finished product. The operation is performed as follows: in a bottle with an inactivated culture medium containing cell debris, virus suspension and cells with the virus, protamine sulfate is added to a final concentration of 75 μg / ml. Leave for interaction at a temperature of (6 + 2) ^o C for 1 hour. Then, cell detritus and the precipitate formed are removed by centrifugation on an OTP-101K-01 flowing centrifuge with an acceleration of 13,200 g. Collection of the semi-finished product coming from the centrifuge is carried out in a common container, then it is filtered through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. The combined semi-finished product thus obtained is concentrated 40 times by ultrafiltration on synthetic filters. Next, the concentrate is purified by gel chromatography on a column of porous silica. The type of sorbent is diasorb-1000-diol. In the collected chromatographic fraction, the antigenic activity of tick-borne encephalitis virus and the amount of chicken embryo proteins are controlled. Then, the obtained purified concentrate is diluted with an appropriate amount of a buffer solution, filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm and used to prepare a sorbed vaccine. Determination of protein concentration of the chicken embryo is carried out by the method of counter immunoelectrophoresis.

Пример 4. Example 4

Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса (штамм ВКЭ 205) в суспензионной первичной культуре клеток куриных эмбрионов. Для увеличения репродукции добавляют куриный эмбриональный экстракт в конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Культивирование вируса проводят в бутылях объемом 6,0 л в течение 4-х суток при температуре (37±1)^oС при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 8-10 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)^oC. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а количество белков куриного эмбриона в полуфабрикате после инактивации. Далее следует стадия освобождения от клеточного субстрата и объединение полуфабриката. Операцию выполняют следующим образом: в бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь и клетки с вирусом, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 70 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)^oС на 30-40 мин. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием на проточной центрифуге ОТР-101К-01 при ускорении 13200 g. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 40 раз ультрафильтрацией на синтетических фильтрах. Далее концентрат очищают гель-хроматографией на колонке с макропористым кремнеземом. Тип сорбента - МПС-1000-ПВП. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита и количество белков куриного эмбриона. Затем полученный очищенный концентрат разводят соответствующим количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины. Определение концентрации белков куриного эмбриона проводят методом встречного иммуноэлектрофореза.A viral suspension is obtained by reproduction of the virus (strain TBEV 205) in a suspension primary culture of chicken embryo cells. To increase reproduction, chicken embryonic extract is added at a final concentration of 1.5 μg / ml. The cultivation of the virus is carried out in 6.0 liter bottles for 4 days at a temperature of (37 ± 1) ^o C with continuous stirring on a roller unit with a rotation speed of 8-10 rpm. Then the virus suspension is inactivated with formaldehyde in a final concentration of 200 ± 20 μg / ml for 3 days at a temperature of (32 ± 1) ^o C. The concentration of the infectious virus in the virus suspension is controlled before inactivation, and the amount of chicken embryo proteins in the semi-finished product after inactivation. This is followed by the stage of release from the cellular substrate and the union of the semi-finished product. The operation is performed as follows: in a bottle with an inactivated culture medium containing cell debris, virus suspension and cells with the virus, protamine sulfate is added to a final concentration of 70 μg / ml. Leave for interaction at a temperature of (6 + 2) ^o C for 30-40 minutes Then, cell detritus and the precipitate formed are removed by centrifugation on an OTP-101K-01 flowing centrifuge with an acceleration of 13,200 g. Collection of the semi-finished product coming from the centrifuge is carried out in a common container, then it is filtered through a filter bag with a final pore size of 0.45 μm. The combined semi-finished product thus obtained is concentrated 40 times by ultrafiltration on synthetic filters. Next, the concentrate is purified by gel chromatography on a column of macroporous silica. Type of sorbent - MPS-1000-PVP. In the collected chromatographic fraction, the antigenic activity of tick-borne encephalitis virus and the amount of chicken embryo proteins are controlled. Then, the obtained purified concentrate is diluted with an appropriate amount of a buffer solution, filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm and used to prepare a sorbed vaccine. Determination of protein concentration of the chicken embryo is carried out by the method of counter immunoelectrophoresis.

Данная технология позволяет снижать количество белков куриного эмбриона с 10-16 мкг/мл в объединенном полуфабрикате до 1 мкг/мл и менее в очищенном полуфабрикате вакцины. При этом повышается эффективность производства вакцины клещевого энцефалита, так как в 2-2,5 раза снижается расход фильтров для осветляющей фильтрации вирусной суспензии и расход синтетических фильтров для последующего концентрирования ее ультрафильтрацией. Значительно сокращается время выполнения этих операций. Уменьшается количество операций, необходимых для получения вакцины из вирусной суспензии. This technology allows you to reduce the number of proteins of the chicken embryo from 10-16 μg / ml in the combined semi-finished product to 1 μg / ml or less in the purified semi-finished vaccine. This increases the efficiency of the production of tick-borne encephalitis vaccine, since the consumption of filters for clarifying the filtration of the viral suspension and the consumption of synthetic filters for subsequent concentration by ultrafiltration are reduced by a factor of 2–2.5. Significantly reduced time to complete these operations. The number of operations required to obtain a vaccine from a viral suspension is reduced.

Claims

1. A method of obtaining a tick-borne encephalitis vaccine, comprising infecting a cell culture virus with subsequent reproduction and release of the virus into the culture medium, its inactivation, isolation, addition of protamine sulfate, purification and sorption on an adjuvant, characterized in that chicken is added to the culture medium at the stage of virus reproduction the extract, the addition of protamine sulfate is carried out in an inactivated culture medium containing cell debris, viral suspension and cells with the virus, concentration of inact virovannogo virus is performed by ultrafiltration of the culture medium after clarification by centrifugation, and the concentrated virus purification was performed by chromatography on a modified porous silica.

2. The method according to claim 1, characterized in that protamine sulfate is added to the unclarified culture medium to a final concentration of 50 to 100 μg / ml.

3. The method according to p. 1, characterized in that the clarification of the culture of the virus-containing medium by centrifugation is carried out after adding formaldehyde and protamine sulfate to the medium.

4. The method according to claim 1, characterized in that the interaction of the culture suspension with protamine sulfate is 0.5-12 hours

5. The method according to claim 1, characterized in that the clarification is carried out on a flow centrifuge with an acceleration from 12000 to 15000 g.

6. The method according to claim 1, characterized in that the concentration is carried out on synthetic or asymmetric track membranes.

7. The method according to claim 6, characterized in that the asymmetric track membranes are used with pores with a diameter of from 40 to 60 microns.

8. The method according to claim 1, characterized in that for the purification by chromatography using a modified diol silica.