RU2186394C2 - Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction - Google Patents
Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2186394C2 RU2186394C2 RU2000102071A RU2000102071A RU2186394C2 RU 2186394 C2 RU2186394 C2 RU 2186394C2 RU 2000102071 A RU2000102071 A RU 2000102071A RU 2000102071 A RU2000102071 A RU 2000102071A RU 2186394 C2 RU2186394 C2 RU 2186394C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigens
- helicobacter pylori
- preparing
- sera
- detection
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 16
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 title description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims abstract description 16
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 8
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 8
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241001478240 Coccus Species 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- 206010048249 Yersinia infections Diseases 0.000 description 2
- 208000025079 Yersinia infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010051226 Campylobacter infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 241001465977 Coccoidea Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 description 1
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 1
- 201000004927 campylobacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 206010013864 duodenitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000011140 intestinal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Назначение: биотехнология, может быть использован в области медицины и ветеринарии, а именно в иммунологии, в частности для экспрессной диагностики заболеваний, ассоциированных с Неlicobacter pylopi. Appointment: biotechnology, can be used in the field of medicine and veterinary medicine, namely in immunology, in particular for the rapid diagnosis of diseases associated with Hlicobacter pylopi.
Сущность изобретения: получают сыворотки при иммунизации кроликов прогретыми /для разрушения термолабильных антигенов/ бактериями разных штаммов Неlicobacter pylopi /Нр/, имеющих антигены палочковидных и кокковых форм; отбирают сыворотки с разным спектром антител к поверхностным термостабильным специфическим антигенам этих бактерий; сыворотками сенсибилизируют убитые формалином и прогреванием клетки Staphylococcus aureus штамм Cowan 1, которые затем отмывают, ресуспендируют, контролируют, консервируют; полученные препараты используют в качестве монодиагностикумов /не менее пяти/ при постановке реакции коагглютинации /РКА/ с рядом последовательных разведений исследуемого материала, а результаты учитывают по вычислению среднеарифметического титра антигенов Нр из этих пяти определений. The inventive serum is obtained by immunization of rabbits with warmed / for the destruction of thermolabile antigens / bacteria of different strains of Nonlicobacter pylopi / Np / having rod-shaped and coccal antigens; sera with a different spectrum of antibodies to surface thermostable specific antigens of these bacteria are selected; sera sensitize Staphylococcus aureus cells killed by formalin and warming,
Способ позволяет получить диагностикумы для выявления антигенов Нр палочковидных и кокковых форм бактерий непосредственно в исследуемом материале. The method allows to obtain diagnostics for the detection of antigens Hp rod-shaped and coccal forms of bacteria directly in the test material.
Диагностика заболеваний, при которых Нр играет ключевую роль в этиологии и патогенезе/гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, миелосаркома желудка и др./трудна, многоэтапна, дорогостояща и нуждается в предварительном проведении гастродуоденоскопии, использовании изотопов, сложного оборудования. Diagnosis of diseases in which NR plays a key role in the etiology and pathogenesis / gastritis, duodenitis, peptic ulcer of the stomach and duodenum, myelosarcoma of the stomach, etc. / is difficult, multi-stage, expensive and requires preliminary gastroduodenoscopy, the use of isotopes, and complex equipment.
Применение методов, позволяющих выявлять антигены-маркеры Нр непосредственно в биологическом материале от больных, таких как слюна, кал, кровь, является наиболее простым и доступным приемом диагностики, учитывая же безопасность и информативность, выявление антигенов Нр может быть использовано для скрининга инфекций, вызываемых этим возбудителем, мониторирования в ходе заболевания, определения сроков и полноты санации организма, оценки эффективности лечения. The use of methods to detect HP marker antigens directly in biological material from patients, such as saliva, feces, blood, is the most simple and affordable diagnostic technique, taking into account safety and information content, the detection of HP antigens can be used to screen for infections caused by this pathogen, monitoring during the course of the disease, determining the timing and completeness of the reorganization of the body, evaluating the effectiveness of treatment.
Одним из таких методов является реакция коагглютинации /РКА/, используемая при многих инфекционных заболеваниях, в том числе кишечных /1/. Однако диагностикумы для выявления антигенов Нр с помощью этой реакции до последнего времени не были разработаны. One of these methods is the coagglutination reaction / RCA /, used in many infectious diseases, including intestinal / 1 /. However, diagnostics for the detection of Hp antigens using this reaction have not been developed until recently.
Известен способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров /поливалентный/ в РКА, предусматривающий получение сывороток иммунизацией кроликов культурами кампилобактеров разных серверов и видов, убитых прогреванием и ацетоном для разрушения термолабильных антигенов, иммунизацию кроликов в дозах 1-16 млрд микр. клеток, сенсибилизацию стафилококка смесью сывороток для получения поливалентного диагностикума. Этот способ выбран в качестве ближайшего аналога /2/. A known method for producing a diagnosticum for detecting thermostable Campylobacter antigens / polyvalent / in RCA, providing for serum immunization of rabbits with Campylobacter cultures of different servers and species killed by heating and acetone to destroy thermolabile antigens, immunization of rabbits in doses of 1-16 billion microns. cells, sensitization of staphylococcus with a mixture of serums to obtain a multivalent diagnosticum. This method is selected as the closest analogue / 2 /.
Однако известный способ получения диагностикума для РКА не пригоден для получения хеликобактерного диагностикума вследствие особенностей антигенной структуры и иммунобиологических свойств этого возбудителя. Хеликобактеры имеют в своем составе большое количество термолабильных поверхностных белковых антигенов, перекрестно реагирующих с антигенами других бактерий. Термостабильные специфические антигены Нр недостаточно исследованы, специфический О-антиген /ЛПС/ слабо иммуногенен. Штаммы Нр, в том числе выделяемые от больных и тем более длительно культивируемые на питательных средах, весьма вариабельны по количественному и качественному составу антигенов, легко переходят из палочковидных в кокковые формы с иной иммунологической специфичностью. Даже выделяемые от больных штаммы Нр в 30% случаев могут состоять из кокковых форм. However, the known method for producing a diagnosticum for RCA is not suitable for obtaining a helicobacter diagnosticum due to the characteristics of the antigenic structure and immunobiological properties of this pathogen. Helicobacter pylori include a large number of thermolabile surface protein antigens that cross-react with antigens of other bacteria. Thermostable specific Hp antigens are insufficiently studied, the specific O-antigen / LPS / is weakly immunogenic. Hp strains, including those isolated from patients and, moreover, cultivated for a long time on nutrient media, are highly variable in the quantitative and qualitative composition of antigens, and easily pass from rod-shaped to coccal forms with a different immunological specificity. Even Hp strains isolated from patients can in 30% of cases consist of coccal forms.
Исходя из этих немногочисленных данных, а также принимая во внимание отсутствие хеликобактерных коммерческих диагностикумов для РКА, нами были проведены исследования антигенного состава этих бактерий, получены сыворотки и разработан способ получения препарата для диагностики заболеваний, ассоциированных с Нр. Based on these few data, as well as taking into account the absence of Helicobacter pylori diagnostic kits for RCA, we studied the antigenic composition of these bacteria, obtained serum and developed a method for producing a drug for the diagnosis of diseases associated with HP.
Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, является то, что получен диагностикум для выявления термостабильных специфических антигенов - маркеров Нр в культурах, биологическом материале /слюна, кал, кровь/ от людей, не требующий предварительного проведения инвазивных процедур /гастродуоденоскопии, введения изотопов и др./, что делает его безвредным и безопасным, особенно для детей и тяжелобольных, и экономичным; использование диагностикума значительно сокращает время и упрощает проведение анализа. Он достигается тем, что отбирают штаммы хеликобатеров, популяция которых содержит в различных соотношениях палочковидные и кокковые формы бактерий, для иммунизации кроликов используют густые взвеси/30-33 млрд микр. тел/ этих бактерий; после прогревания бактерий при 100oС в течение 10 мин и центрифугирования при 2000 об/мн в течение 10 мин проводят многократную /7-8 раз/ внутривенную иммунизацию кроликов в дозе 1 мл, кровь берут через 3, 5, 8 инъекций для определения антител к палочковидным и кокковым формам бактерий; для сенсибилизации стафилококка отбирают несколько /не менее 5/ сывороток с разным составом антител, на основе которых готовят монодиагностикумы, и реакцию коагглютинации ставят с каждым из них, смешивая на стекле с разведенным двукратно /от 1:5 до 1:80/ исследуемым материалом. Результат реакции учитывают по величине среднеарифметического титра антигенов из пяти определений. Агглютинацию стафилококка при разведении 1:5-1:9 считают слабо положительной, 1:10-1:19- положительной, 1:20 и более - резко положительной.The technical result achieved by using the developed method is that a diagnosticum is obtained for detecting thermostable specific antigens - Нр markers in cultures, biological material / saliva, feces, blood / from people, which does not require prior invasive procedures / gastroduodenoscopy, the introduction of isotopes and etc. /, which makes it harmless and safe, especially for children and seriously ill, and economical; the use of a diagnosticum significantly reduces time and simplifies the analysis. It is achieved by the fact that strains of Helicobaters are selected, the population of which contains rod-shaped and coccal forms of bacteria in various ratios; for immunization of rabbits, thick suspensions / 30-33 billion microns are used. bodies / these bacteria; after heating the bacteria at 100 o C for 10 min and centrifugation at 2000 rpm for 10 min, repeated (7-8 times) intravenous immunization of rabbits in a dose of 1 ml is carried out, blood is taken after 3, 5, 8 injections to determine antibodies to rod-shaped and coccal forms of bacteria; for sensitization of staphylococcus, several / at least 5 / sera with different compositions of antibodies are selected, on the basis of which monodiagnostics are prepared, and the coagglutination reaction is set with each of them, mixing on the glass with the test material diluted twice / from 1: 5 to 1: 80 /. The result of the reaction is taken into account by the value of the arithmetic mean titer of antigens from five determinations. Agglutination of staphylococcus at a dilution of 1: 5-1: 9 is considered weakly positive, 1: 10-1: 19 - positive, 1:20 or more - sharply positive.
Диагностикум представляет собой комплект, включающий 5 емкостей, заполненных диагностикумами, приготовленными на основе пяти разных сывороток к палочковидным и кокковым формам Нр, и одной емкости с 1% взвесью стафилококка для отрицательного контроля. Diagnosticum is a set that includes 5 containers filled with diagnosticums prepared on the basis of five different serums for rod-shaped and coccal forms of Нр, and one container with 1% suspension of staphylococcus for negative control.
Способ получения хеликобактерного диагностикума для выявления антигенов Нр и его возможное использование представлены в примерах. A method of obtaining Helicobacter pylori diagnosticum for detecting Hp antigens and its possible use are presented in the examples.
Пример 1. Получение и отбор сывороток для изготовления хеликобактерных диагностикумов /предварительный этап/. Example 1. Obtaining and selection of sera for the manufacture of Helicobacter pylori diagnostic / preliminary stage /.
Использованы штаммы Helicobacter pylori АТСС 7392, НСТС 11637, НСТС 11639. Первый из них находился преимущественно в палочковидной форме, второй в палочковидной и кокковой форме, третий преимущественно в кокковой форме. Бактерии выращивали на Columbia агаре с антибиотиками и 5% лошадиной сыворотки или 7% эритроцитов крови человека 1/0/группы; густую взвесь бактерий /30-33 млрд микр. тел/мл по оптическому стандарту/ прогревали на водяной бане при температуре 100oС в течение 10 мин для разрушения термолабильных антигенов Нр и белков крови, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин.Used strains of Helicobacter pylori ATCC 7392, HCST 11637, HCTS 11639. The first was mainly in rod-shaped form, the second in rod-shaped and coccal form, the third mainly in coccal form. Bacteria were grown on Columbia agar with antibiotics and 5% horse serum or 7% human blood red blood cells of a 1/0 / group; a thick suspension of bacteria / 30-33 billion mic. tel / ml according to the optical standard / was heated in a water bath at a temperature of 100 o C for 10 min to destroy the thermolabile Hp antigens and blood proteins, centrifuged at 2000 rpm for 10 min.
Иммунизацию кроликов породы шиншилла весом 4-5 кг проводят внутривенно, многократно /7-8 раз/ каждую неделю надосадочной жидкостью вышеназванных штаммов в дозе 1 мл, раздельно. Через 7-10 дней после 3-, 5-, 8-кратной иммунизации берут кровь из вены уха. Сыворотки исследуют в реакции коагглютинации на стекле, используя пробные диагностикумы. Immunization of chinchilla rabbits weighing 4-5 kg is carried out intravenously, repeatedly / 7-8 times / each week by supernatant of the above strains in a dose of 1 ml, separately. 7-10 days after 3-, 5-, 8-fold immunization, blood is taken from the ear vein. Sera are examined in a coagglutination reaction on glass using test diagnostics.
Для получения пробных диагностикумов берут сыворотки от разных кроликов, иммунизированных штаммами Нр, разных по содержанию палочковидных и кокковых форм, после 3-, 5- и 8-кратного введения бактерий. To obtain test diagnosticums, sera are taken from different rabbits immunized with HP strains, different in content of rod-shaped and coccal forms, after 3-, 5- and 8-fold introduction of bacteria.
Сыворотки разводят 1: 2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:15, 1:20 физиологическим раствором натрия хлорида. Берут 0,1 мл каждого разведения сыворотки, добавляют 0,9 мл 10% взвеси отмытых и стабилизированных формалином /0,5% р-р формальдегида в течение 2 ч/ и прогреванием 85oС в течение 2 ч/ Staph. aureus Cowan 1, перемешивают и доводят до 10 мл фосфатно-солевым буфером /pH 7,2/.Serum is diluted 1: 2, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 8, 1:10, 1:15, 1:20 with physiological saline sodium chloride. Take 0.1 ml of each dilution of serum, add 0.9 ml of 10% suspension of washed and stabilized with formalin / 0.5% solution of formaldehyde for 2 hours / and warming at 85 o C for 2 hours / Staph. aureus Cowan 1, mixed and adjusted to 10 ml with phosphate-buffered saline / pH 7.2 /.
Приготовленные таким образом пробные диагностикумы контролируют путем постановки РКА с ЛПС и лиофилизированными разведенными десятикратно /10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 мг/мл/ лизатами бактерий штаммов Нр в палочковидной и кокковой формах, а также ЛПС других возбудителей кишечных инфекций /шигелл, сальмонелл, иерсиний, кампилобактеров, эшерихий/ и др. для определения чувствительности и специфичности.The test diagnostics prepared in this way are monitored by stating RCA with LPS and lyophilized diluted tenfold / 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 mg / ml / lysates of bacteria of HP strains in rod-shaped and coccal forms, and also LPS of other pathogens of intestinal infections / Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter, Escherichia / et al. to determine sensitivity and specificity.
При постановке РКА одну каплю каждого разведения антигена наносят на предметное стекло, разделенное на сектора стеклографом, и добавляют по одной капле диагостикума. В контроле вместо антигена помещают каплю ФСБ. Во втором отрицательном контроле вместо диагностикума помещают каплю взвеси несенсибилизированного 1% стафилококка. Капли осторожно перемешивают покачиванием стекла, стекла помещают во влажную камеру на 30 мин. Учет реакции проводят по 4-крестовой шкале, положительной считают реакцию на 1 крест /1+/. When setting the RCA, one drop of each dilution of the antigen is applied to a glass slide, divided into sectors by a stenograph, and one drop of a diagnosticum is added. In the control, a drop of FSB is placed instead of antigen. In the second negative control, a drop of suspension of unsensitized 1% staphylococcus is placed instead of a diagnosticum. Drops are gently mixed by rocking the glass, the glass is placed in a humid chamber for 30 minutes. Accounting for the reaction is carried out on a 4-cross scale, consider the reaction to 1 cross / 1 + / to be positive.
Исследование пробных диагностикумов позволяет определить оптимальные разведения сывороток /максимальное разведение сыворотки, необходимое для получения диагностикума, дающего положительную реакцию со специфическими антигенами в разведениях 10-1 мг/мл и более и не дающего агглютинации с несенсибилизированным стафилоккоком/, спектр антител в них к палочковидным и кокковым формам Нр, специфичность, и на основании этих критериев отобрать не менее 5 сывороток, необходимых для изготовления диагностикумов на конечном этапе производства.The study of test diagnosticum allows you to determine the optimal serum dilution / maximum serum dilution necessary to obtain a diagnosticum that gives a positive reaction with specific antigens in dilutions of 10 -1 mg / ml or more and does not agglutinate with unsensitized staphylococcus /, the spectrum of antibodies to them is rod-shaped and coccid forms of HP, specificity, and based on these criteria, select at least 5 sera necessary for the manufacture of diagnosticums at the final stage of production.
Пример 2. Изготовление диагностикумов для определения антигенов хеликобатеров в реакции коагглютинации /конечный этап/. Example 2. The manufacture of diagnostic kits for determining Helicobater antigens in the coagglutination reaction / final stage /.
Готовые диагностикумы в необходимом количестве получают на основе сывороток, отобранных при исследовании пробных диагностикумов и используя оптимальные их разведения. Технология получения описана в примере 1. Изготавливают комплекты диагностикумов, состоящие из пяти диагностикумов, способных выявлять антигены палочковидных и кокковых форм в их минимальной концентрации, и 1% взвеси стафилококка для отрицательного контроля. Ready-made diagnostics in the required quantity are obtained on the basis of sera selected in the study of test diagnostic diagnostics and using their optimal dilutions. The production technology is described in Example 1. Sets of diagnostic kits are made, consisting of five diagnostic kits capable of detecting rod-shaped and coccal antigens in their minimum concentration, and 1% suspension of staphylococcus for negative control.
Приготовленные таким образом диагностикумы должны быть специфичными и чувствительными. Они должны давать агглютинацию с ЛПС и лизатами хеликобактеров разных штаммов до концентрации 10-1-10-2 мг/мл и не давать реакцию с антигенами /ЛПС/ кампилобактеров разных видов и сероваров, а также других возбудителей кишечных инфекций и некоторых других, как представлено в таблице 1.Diagnostics prepared in this way should be specific and sensitive. They should agglutinate with LPS and lysates of Helicobacter pylori of different strains to a concentration of 10 -1 -10 -2 mg / ml and not give a reaction with antigens / LPS / Campylobacter of different species and serovars, as well as other pathogens of intestinal infections and some others, as presented in table 1.
Пример 3. Применение диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori в динамике инфекционного процесса. Example 3. The use of diagnostic kits for the detection of Helicobacter pylori antigens in the dynamics of the infectious process.
Выявление антигенов Нр у больных проводят в пробах слюны, кала. Слюну собирают утром натощак, до чистки зубов в чистые пенициллиновые флаконы или другие емкости в количестве 2-3 мл и используют при постановке РКА неразведенными и разведенными от 1:5 и выше. Кал помещают в такие же емкости в количестве 2-3 г, перед исследованием его разводят 1:5, взбалтывают, дают отстояться и надосадочную жидкость также как и слюну прогревают в водяной бане при температуре 100oС в течение 20 мин, осветляют центрифугированием или фильтрованием через бумажный фильтр и используют для постановки РКА, как указано в примере 1, с каждым из пяти диагностикумов. Учет реакции проводят по определению среднеарифметического титра антигенов.The detection of Hp antigens in patients is carried out in samples of saliva, feces. Saliva is collected in the morning on an empty stomach, before brushing your teeth in clean penicillin vials or other containers in an amount of 2-3 ml and used when stating RCA undiluted and diluted from 1: 5 and above. The feces are placed in the same containers in an amount of 2-3 g, before the test they are diluted 1: 5, shaken, allowed to stand, and the supernatant as well as saliva are heated in a water bath at a temperature of 100 o C for 20 minutes, clarified by centrifugation or filtration through a paper filter and used to set the RCA, as described in example 1, with each of the five diagnostic kits. Accounting for the reaction is carried out to determine the arithmetic mean titer of antigens.
Как показано на чертеже, антигены Нр у здорового человека не определяются. После инфицирования антигены Нр обнаруживаются в течение 1-2 суток, затем выявляются в незначительных титрах. С началом клинических симптомов заболевания /тошнота, изжога, боль в области желудка, затем в тонком кишечнике, головная боль, температура/ антигены Нр обнаруживаются постоянно на высоком уровне. Высокий уровень антигенов Нр держится в период ранней реконвалесценции, затем постепенно снижается и периодически выявляется еще в течение 1-2,5 месяцев, после чего наступает стойкая длительная санация организма. As shown in the drawing, Hp antigens in a healthy person are not determined. After infection, Hp antigens are detected within 1-2 days, then detected in minor titers. With the onset of clinical symptoms of the disease / nausea, heartburn, pain in the stomach, then in the small intestine, headache, fever / Hp antigens are constantly detected at a high level. A high level of Hp antigens is maintained during the period of early convalescence, then it gradually decreases and is periodically detected for another 1-2.5 months, after which there is a persistent long-term rehabilitation of the body.
Применение хеликобактерных диагностикумов, т.о., позволяет проводить динамические исследования на наличие антигенов - маркеров Нр при инфекционном процессе, вызываемом этим возбудителем. Они позволяют определять Нр в период инфицирования, в процессе острого периода заболевания и в периоды ранней и поздней реконвалесценции, определять сроки и полноту санации организма от возбудителя. The use of Helicobacter pylori diagnosticums, thus, allows dynamic studies to be carried out for the presence of antigens - markers of HP in the infectious process caused by this pathogen. They make it possible to determine HP during the period of infection, during the acute period of the disease, and during the periods of early and late convalescence, and to determine the timing and completeness of the body's debridement from the pathogen.
Пример 4. Выявление антигенов Helicobacter pylori у больных острыми бактериальными кишечными инфекциями. Example 4. Detection of Helicobacter pylori antigens in patients with acute bacterial intestinal infections.
Пробы слюны и кала берут так же, как в примере 3. Samples of saliva and feces are taken in the same way as in example 3.
Исследовано 345 человек, из числа которых по данным РКА с соответствующими диагностикумами больные дезинтерией Флекснера, Зонне, Ньюкасл составляли 23 человека, сальмонеллезом В,С1,С2,Д,Е серогрупп - 47 человек, иерсиниозом псевдотуберкулеза I и III сероваров, иерсиниозом энтероколитика, вызванным кишечными иерсиниями 03,09,07,8,06,30 - 63 человека, кампилобактериозом - 31 человек, а также 181 больной кишечными инфекциями, возбудитель у которых не был выявлен. Результаты определения антигенов Нр у больных этих групп представлены в таблице 2.345 people were examined, among whom, according to RCA data with the corresponding diagnostics, patients with Flexner, Sonne, Newcastle deserteria comprised 23 people, serogroup Salmonellosis B, C 1 , C 2 , D, E - 47 people, serovar yersiniosis pseudotuberculosis, enterocolytic yersiniosis caused by intestinal yersinia 03.09.09.07.06.06.30 - 63 people, campylobacteriosis - 31 people, as well as 181 patients with intestinal infections, the pathogen of which was not identified. The results of the determination of Hp antigens in patients of these groups are presented in table 2.
Как видно из таблицы, антигены Нр в биологических жидкостях больных кишечными инфекциями разной этиологии в диагностических титрах /1:10 и выше/ выявляются с высокой частотой - в среднем в 56,5% /от 29% до 83%/ случаев. Средний титр антигенов в этих группах колеблется от 1:40 до 1:82, в 4-12% случаев из числа положительных реакций отмечаются и более высокие титры - от 1:160 и выше. As can be seen from the table, Hp antigens in biological fluids of patients with intestinal infections of various etiologies in diagnostic titers / 1: 10 and higher / are detected with a high frequency - on average 56.5% / from 29% to 83% / cases. The average titer of antigens in these groups ranges from 1:40 to 1:82, in 4-12% of cases of positive reactions, higher titers are also noted - from 1: 160 and higher.
Важно отметить, что маркер Нр в 1/3 случаев /29%/ в достаточно высоких титрах/1: 10 и выше/ обнаруживается в группе больных кишечными инфекциями, у которых другие патогенные возбудители не были обнаружены /группа ОКИНЭ/. Эти данные свидетельствуют о перспективности применения хеликобактерного диагностикума для определения патогенетической роли Нр при моно- и микст-инфекциях желудочно-кишечного тракта. It is important to note that the HP marker in 1/3 of cases / 29% / in fairly high titers / 1: 10 and higher / is found in the group of patients with intestinal infections in which other pathogenic pathogens were not detected / OKINE group /. These data indicate the promise of using Helicobacter pylori diagnosticum to determine the pathogenetic role of Hp in mono- and mixed infections of the gastrointestinal tract.
Применение диагностикумов для выявления антигенов - маркеров Нр непосредственно в биологическом материале от больных в реакции коагглютинации открывает широкие возможности для скрининга лиц, инфицированных Нр, мониторирования в ходе заболевания, ранней диагностики с целью своевременного назначения этиотропной терапии, объективной оценки тяжести и исходов заболевания, оценки полноты санации, определения бессимптомного бактерионосительства, оценки эффективности антибактериальной терапии, выявления микст-инфекций. Обладая специфичностью и достаточно высокой чувствительностью, не уступающей другим иммунологическим методам /например ИФА/, этот метод обладает рядом преимуществ - простотой, доступностью для малооснащенных лабораторий, быстрым получением ответа /1-2 ч/. Область применения: микробиология, эпидемиология, клиника, санитария, ветеринария, научные исследования патогенеза, иммунитета, профилактики заболеваний, ассоциированных с хеликобактериями. The use of diagnostic kits for identifying antigens - markers of Hp directly in biological material from patients in the coagglutination reaction opens up great opportunities for screening people infected with Hp, monitoring during the disease, early diagnosis for the purpose of timely administration of etiotropic therapy, objective assessment of the severity and outcome of the disease, assessment of completeness sanitation, determination of asymptomatic bacteriocarrier, evaluation of the effectiveness of antibiotic therapy, detection of mixed infections. Possessing specificity and sufficiently high sensitivity, not inferior to other immunological methods (for example, ELISA), this method has several advantages - simplicity, accessibility for low-equipped laboratories, and quick response / 1-2 hours /. Scope: microbiology, epidemiology, clinic, sanitation, veterinary medicine, scientific research of pathogenesis, immunity, prevention of diseases associated with helicobacteria.
Источники информации
1. Белая О. Ф. Итоги и перспективы применения реакции коагглютинации в качестве иммунологического метода выявления антигенов возбудителей кишечных инфекционных заболеваний // Патогенез, иммунология, клиника и диагностика инфекционных болезней. Сб. научн. тр. - М., 1992, - с.19-24.Sources of information
1. Belaya O. F. Results and prospects of using the coagglutination reaction as an immunological method for identifying antigens of intestinal infectious disease pathogens // Pathogenesis, immunology, clinic and diagnosis of infectious diseases. Sat scientific tr - M., 1992, - p. 19-24.
2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Быстрова С.М., Петрухин В.Г., Прокофьева Е.М. Способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров. // Патент 2086984. БИ 22, 10.08.97. 2. Belaya Yu.A., Belaya O. F., Bystrova S. M., Petrukhin V. G., Prokofiev E. M. A method for producing a diagnosticum for detecting thermostable campylobacter antigens. // Patent 2086984.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000102071A RU2186394C2 (en) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000102071A RU2186394C2 (en) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000102071A RU2000102071A (en) | 2002-07-10 |
| RU2186394C2 true RU2186394C2 (en) | 2002-07-27 |
Family
ID=20229871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000102071A RU2186394C2 (en) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2186394C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2232989C1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-07-20 | Белая Юлия Александровна | Method for preparing test-system for determination of helicobacter pylori cytotoxin-associated protein antigens in biological material in infected patients by co-agglutination reaction |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996012965A1 (en) * | 1994-10-20 | 1996-05-02 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Helicobacter pylori diagnostic methods and kits |
| WO1997011721A1 (en) * | 1995-09-25 | 1997-04-03 | Astra Aktiebolag | Method to identify therapeutically active compounds |
| RU2086984C1 (en) * | 1996-05-22 | 1997-08-10 | Юлия Александровна Белая | Method of preparing diagnosticum for detection of campylobacter thermostable antigens |
| WO1998054563A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Angelo Joseph P D | Estimation of active infection by helicobacter pylori |
-
2000
- 2000-01-31 RU RU2000102071A patent/RU2186394C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996012965A1 (en) * | 1994-10-20 | 1996-05-02 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Helicobacter pylori diagnostic methods and kits |
| WO1997011721A1 (en) * | 1995-09-25 | 1997-04-03 | Astra Aktiebolag | Method to identify therapeutically active compounds |
| RU2086984C1 (en) * | 1996-05-22 | 1997-08-10 | Юлия Александровна Белая | Method of preparing diagnosticum for detection of campylobacter thermostable antigens |
| WO1998054563A1 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Angelo Joseph P D | Estimation of active infection by helicobacter pylori |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2232989C1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-07-20 | Белая Юлия Александровна | Method for preparing test-system for determination of helicobacter pylori cytotoxin-associated protein antigens in biological material in infected patients by co-agglutination reaction |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blakebrough et al. | The epidemiology of infections due to Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica in a northern Nigerian community | |
| Williams et al. | Inhibition of streptococcal attachment to receptors on human buccal epithelial cells by antigenically similar salivary glycoproteins | |
| Ward et al. | Rapid diagnosis of Hemophilus influenzae type b infections by latex particle agglutination and counterimmunoelectrophoresis | |
| Kosunen et al. | Diagnostic value of decreasing IgG, IgA, and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter pylori | |
| Leinonen et al. | Preliminary serologic evidence for a pathogenic role of Branhamella catarrhalis | |
| Califano et al. | Antibody reactive with Porphyromonas gingivalis serotypes K1‐6 in adult and generalized early‐onset periodontitis | |
| Crowder et al. | Type-specific immunity in pseudomonas diseases | |
| JPH07507387A (en) | Broadly reactive opsonic antibodies that react with common staphylococcal antigens | |
| Bokkenheuser | Vibrio fetus infection in man: a serological test | |
| Nato et al. | Production of polyclonal and monoclonal antibodies against group A, B, and C capsular polysaccharides of Neisseria meningitidis and preparation of latex reagents | |
| Finkelstein et al. | In vitro detection of antibody to cholera enterotoxin in cholera patients and laboratory animals | |
| RU2186394C2 (en) | Method of preparing diagnosticum for detection of helicobacter pylopi antigen in coagglutination reaction | |
| Brooks et al. | Studies on the relationships between serum bactericidal activity and uncomplicated genital infections due to Neisseria gonorrhoeae | |
| US8663940B2 (en) | Ex-vivo passive protection bacteremia assay | |
| Barua et al. | Vibriocidal antibodies induced by Yersinia enterocolitica serotype IX | |
| Sloyer Jr et al. | Otitis media in the young infant: an IgE-mediated disease? | |
| Andrews et al. | An epidemic of respiratory infection due to Mycoplasma pneumoniae in a civilian population | |
| Dahlberg‐Lagergård | Target antigens for bactericidal and opsonizing antibodies to Haemophilus influenzae | |
| Reimann et al. | AN INDIRECT HAEMAGGLUTINATION TEST FOR DEMONSTRATION OF GONOCOCCAL ANTIBODIES USING GONOCOCCAL PILI AS ANTIGEN: Methodology and Preliminary Results | |
| Kodama et al. | Cellular immunity to the P6 outer membrane protein of nontypeable Haemophilus influenzae | |
| Greenwood et al. | Antigen-negative meningitis due to group A Neisseria meningitidis | |
| RU2410699C1 (en) | Method of obtaining erythrocytal anthrax antigenic diagnosticum for detection of antibodies to protective antigen | |
| Haltalin et al. | Microdetermination of Shigella hemagglutinins in human and rabbit sera with monovalent and polyvalent antigens | |
| SU1673973A1 (en) | Method for diagnosis of plant diseases, caused by pseudomonas syringae of iv serogroup | |
| RU2232989C1 (en) | Method for preparing test-system for determination of helicobacter pylori cytotoxin-associated protein antigens in biological material in infected patients by co-agglutination reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100201 |