RU2174558C1

RU2174558C1 - Method of l-aspartic acid producing

Info

Publication number: RU2174558C1
Application number: RU2000130575A
Authority: RU
Inventors: М.К. Синолицкий; Наталья Ивановна Атрахимович; С.П. Воронин; Т.В. Герасимова; В.Г. Дебабов; О.Ю. Клыгина; С.В. Козулин; Г.А. Ларикова; Т.Е. Леонова; Е.Е. Полунина; Петр Тимофеевич Петров; А.А. Синтин; С.В. Синолицкая; Татьяна Викторовна Трухачева; Валерий Минович Царенков; А.С. Яненко
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Биоамид"
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2001-10-10

Abstract

FIELD: biotechnology, biochemistry, amino acids. SUBSTANCE: invention relates to method of production of L-aspartic acid used in medicine, food and microbiological industry. Method involves metabolism of ammonium fumarate using biocatalyst based on cells of the strain Escherichia coli 858 (VKPM B-7188) and isolation of the end product. High activity of enzyme aspartase is obtained in cells of the strain E. coli 858 cultured in nutrient medium containing acetic acid. Cells of the strain E. coli 858 are used in native or immobilized form. Effectiveness of producing the end product is caused by the use of more active biocatalyst based on the strain E. coli 858. EFFECT: improved economy of method, decreased cost, intensified method of preparing cells of strain Escherichia coli 858 as compared with known methods. 3 cl, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-аспарагиновой кислоты, применяемой в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. The invention relates to biotechnology and relates to a method for producing L-aspartic acid used in medicine, food and microbiological industries.

Известны способы получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью микроорганизмов рода Serratia (заявка EP 0111293, 1984), рода Escherichia (заявка EP 0110422, 1984), рода Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium и др. (заявка EP 0752476, 1997). Однако все эти способы являются многостадийными, достаточно трудоемкими, требуют специальных питательных сред для используемых штаммов. Known methods for producing L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate using microorganisms of the genus Serratia (application EP 0111293, 1984), the genus Escherichia (application EP 0110422, 1984), the genus Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium and others (application EP 0752476, 1997) . However, all these methods are multi-stage, rather laborious, require special nutrient media for the strains used.

Известен способ получения L-аспарагиновой кислоты с использованием штамма Escherichia coli 85 (авт. св-во СССР N 644833). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности используемого штамма. A known method of obtaining L-aspartic acid using a strain of Escherichia coli 85 (ed. St. USSR N 644833). The method is not effective enough due to the low aspartase activity of the used strain.

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, предусматривающий обработку раствора фумарата аммония биокатализатором, на основе клеток Escherichia coli с последующим выделением L-аспарагиновой кислоты (авт. св-во СССР N 659611, C 12 P 13/20, 1979). В качестве биокатализатора в данном способе используют клетки одного из штаммов Escherichia coli 83 или АН 52, или 85, иммобилизованные включением в полиакриламидный гель. Процесс биотрансформации ведут, как правило, пропуская раствор фумарата аммония через колонку, заполненную частицами полиакриламидного геля с включенными в него клетками E. coli. Closest to the claimed method is a method for producing L-aspartic acid, comprising treating a solution of ammonium fumarate with a biocatalyst based on Escherichia coli cells, followed by isolation of L-aspartic acid (ed. USSR USSR N 659611, C 12 P 13/20, 1979 ) As a biocatalyst in this method, cells of one of the strains of Escherichia coli 83 or AN 52, or 85, immobilized by incorporation into a polyacrylamide gel are used. The biotransformation process is usually carried out by passing a solution of ammonium fumarate through a column filled with particles of a polyacrylamide gel with E. coli cells included in it.

Недостатками способа являются невысокая эффективность процесса культивирования клеток Е. coli, получения биокатализатора и как следствие низкая эффективность всего процесса получения L- аспарагиновой кислоты. The disadvantages of the method are the low efficiency of the process of culturing E. coli cells, obtaining a biocatalyst and, as a consequence, the low efficiency of the entire process for producing L-aspartic acid.

Это связано с тем, что используемые в способе штаммы Е.coli требуют для своего выращивания многокомпонентных сред, стоимость которых достаточно высока. Кроме того, к недостаткам штаммов Escherichia coli можно отнести следующее: аспартазная активность штамма достигает максимальных значений на ранних логарифмических стадиях роста (6-10 ч), когда урожай клеток низкий. На стационарной фазе роста, когда достигается максимальный урожай клеток, аспартазная активность быстро снижается. В присутствии в питательной среде глюкозы, как источника углерода, аспартазная активность бактерий снижается и как результат этого снижается эффективность процесса получения аспарагиновой кислоты. This is due to the fact that the E. coli strains used in the method require multicomponent media for their growth, the cost of which is quite high. In addition, the following can be attributed to the disadvantages of Escherichia coli strains: aspartase activity of the strain reaches its maximum values at the early logarithmic growth stages (6-10 h), when the cell yield is low. In the stationary phase of growth, when the maximum cell yield is reached, aspartase activity rapidly decreases. In the presence of glucose in the nutrient medium as a carbon source, the aspartase activity of bacteria decreases and, as a result, the efficiency of the process of producing aspartic acid decreases.

По этой причине при культивировании клеток E.coli приходится использовать большие объемы или осуществлять многократное воспроизведение клеток штамма-биотрансформатора. For this reason, when culturing E.coli cells, large volumes have to be used or multiple reproduction of cells of the biotransformer strain has to be performed.

Все вышеперечисленные факторы удорожают процесс и делают его неэффективным с точки зрения промышленного воспроизводства. All of the above factors increase the cost of the process and make it ineffective from the point of view of industrial reproduction.

Настоящее изобретение направлено на повышение эффективности процесса получения L-аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоемкости и удешевления процесса, связанного с применением более эффективного биокатализатора на основе нового штамма E.coli и особенностей культивирования штамма. The present invention is aimed at improving the efficiency of the process of obtaining L-aspartic acid by reducing the complexity and cost of the process associated with the use of a more effective biocatalyst based on a new E. coli strain and the cultivation features of the strain.

Технический результат заявленного способа заключается, в частности, в обеспечении более высокой аспартазной активности биокатализатора на основе клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188). The technical result of the claimed method consists, in particular, in providing a higher aspartase activity of a biocatalyst based on cells of E. coli strain 858 (VKPM B-7188).

Таким образом, предлагаемый способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе микробных клеток Escherichia coli с последующим выделением целевого продукта предусматривает использование в процессе биотрансформации биокатализатора на основе штамма Е.coli ВКПМ В-7188, выращенного на питательной среде, содержащей уксусную кислоту. Thus, the proposed method for producing L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate using a biocatalyst based on Escherichia coli microbial cells with subsequent isolation of the target product involves the use of a biocatalyst based on E. coli strain VKPM B-7188 grown on a nutrient medium in the biotransformation process containing acetic acid.

В качестве биокатализатора в предлагаемом способе может быть использована биомасса клеток штамма Е.coli ВКПМ В-7188 как в нативном, так и в иммобилизованном виде. При этом может быть использована биомасса клеток штамма ВКПМ В-7188, выращенного на среде с содержанием уксусной кислоты 0,0001 до 5%. As a biocatalyst in the proposed method, the biomass of cells of the E. coli strain VKPM B-7188 can be used both in native and in immobilized form. In this case, the biomass of cells of the VKPM B-7188 strain grown on a medium with an acetic acid content of 0.0001 to 5% can be used.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

Характеристика используемого штамма E.coli 858 (ВКПМ В-7188). Characterization of the used strain E.coli 858 (VKPM B-7188).

Среди клонов Е.coli 85, образующих колонии на среде М9 с альфа-метил-D-глюкопиранозидом, 50 мМ (аналогом глюкозы) были выделены мутанты с высокой аспартазной активностью. Выделенные штаммы выращивали при 37^oC в колбах с перемешиванием. Среда для культивирования - М9 с добавлением: аммония хлорида 3 г/л, глюкозы 10 г/л, кукурузного экстракта 5 г/л. В табл. 1 представлены сравнительные данные по активности для родительского и выделенных мутантных штаммов.Among the E. coli 85 clones forming colonies on M9 medium with alpha-methyl-D-glucopyranoside, 50 mM (glucose analogue), mutants with high aspartase activity were isolated. The isolated strains were grown at 37 ^° C. in flasks with stirring. Cultivation medium - M9 with the addition of: ammonium chloride 3 g / l, glucose 10 g / l, corn extract 5 g / l. In the table. 1 shows comparative activity data for the parent and isolated mutant strains.

Используемый в способе штамм Е.coli 858 (ВКПМ В-7188) показал повышение аспартазной активности при включении в питательную среду уксусной кислоты (или ее солей). Причем это повышение активности наблюдалось как для культур в логарифмической, так и в стационарной фазе. The E. coli 858 strain (VKPM B-7188) used in the method showed an increase in aspartase activity when acetic acid (or its salts) was included in the nutrient medium. Moreover, this increase in activity was observed both for cultures in the logarithmic and in the stationary phase.

Способ получения стационарных культур с высокой аспартазной активностью и урожаем клеток осуществляли культивированием клеток Escherichia coli на среде следующего состава, г/л:
Na₂HPO₄•12H₂O - 1.5
KH₂PO₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl₂ - 0.01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
В этих условиях штамм Е.coli 858 обладает высокой аспартазной активностью, которая достигает максимума на стационарной фазе роста (21 ч). Результаты культивирования используемого и исходного штаммов в колбах представлены в табл. 2.A method of obtaining stationary cultures with high aspartase activity and cell yield was carried out by culturing Escherichia coli cells on a medium of the following composition, g / l:
Na ₂ HPO ₄ • 12H ₂ O - 1.5
KH ₂ PO ₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl ₂ - 0.01
Sodium Fumarate - 3
Ammonium Acetate - 5
Corn Extract - 5
Under these conditions, the strain E. coli 858 has a high aspartase activity, which reaches a maximum in the stationary phase of growth (21 h). The results of the cultivation of the used and initial strains in flasks are presented in table. 2.

Таким образом, использование уксусной кислоты вместо глюкозы в качестве источника углерода для выращивания штамма Е. coli 858 позволяет решить две важные проблемы - повысить аспартазную активность клеток и обеспечить достижение максимального уровня активности на стационарной фазе, когда клеточный урожай достигает максимальных значений. Вводимое в питательную среду количество уксусной кислоты (от 0,0001 до 5%) является оптимальным. Повышение концентрации свыше 5% не приводит к повышению урожайности клеток. Thus, the use of acetic acid instead of glucose as a carbon source for growing E. coli 858 strain allows solving two important problems - increasing the aspartase activity of cells and ensuring the achievement of the maximum level of activity in the stationary phase when the cell yield reaches maximum values. The amount of acetic acid introduced into the culture medium (from 0.0001 to 5%) is optimal. Increasing the concentration of more than 5% does not increase cell productivity.

Ниже приводятся примеры по получению клеток штамма Е.coli 858 (ВКПМ В-7188), являющегося биокатализатором процесса получения L-аспарагиновой кислоты, и примеры получения L-аспарагиновой кислоты с его использованием. The following are examples of the production of cells of E. coli strain 858 (VKPM B-7188), which is a biocatalyst for the process of producing L-aspartic acid, and examples of the preparation of L-aspartic acid using it.

Аспартазную активность определяли следующим образом: к 4 мл 1М раствора фумарата аммония прибавляли 1 мл суспензии предварительно активированных микробных клеток и инкубировали смесь при перемешивании один час при 37^oC. Количество образовавшейся аспарагиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ. За единицу активности принято образование одного микромоля аспарагиновой кислоты за один час. Оптическую плотность клеточной суспензии определяли при длине волны 540 нм и оптическом пути 5 мм.Aspartase activity was determined as follows: 1 ml of a suspension of previously activated microbial cells was added to 4 ml of a 1M solution of ammonium fumarate and the mixture was incubated with stirring for one hour at 37 ^° C. The amount of aspartic acid formed was determined by HPLC. The unit of activity is the formation of one micromole of aspartic acid in one hour. The optical density of the cell suspension was determined at a wavelength of 540 nm and an optical path of 5 mm.

Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводили инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумара аммония при 37^oC в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионов фумарата и аспартата.Activation of microbial cells before obtaining L-aspartic acid was carried out by incubating a suspension of cells in a 1M solution of ammonium fumar at 37 ^° C for 16-18 hours. The activation goal was to increase the permeability of the cell membrane for fumarate and aspartate ions.

Пример 1. Культивирование микроорганизмов. Example 1. The cultivation of microorganisms.

Односуточную культуру Escherichia coli 858 (ВКПМ-В-7188) смывают с поверхности МПА 1-2мл физиологического раствора и стерильно переносят в колбу Эрленмеера на 250 мл с жидкой питательной средой в объеме 50 мл следующего состава, г/л:
Na₂HPO₄•12H₂О - 1.5
KH₂PO₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl₂ - 0-01
Фумарат натрия - 3
Ацетат аммония - 5
Кукурузный экстракт - 5
pH 7.0. Культивирование ведут при 28-30^oC на круговом встряхивателе в течение 16-20 ч. Посевной материал переносят в трехлитровый ферментер, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Условия культивирования: температура 29^oC, аэрация 2 л/мин, перемешивание 500 об/мин, pH 7.9. Система автоматического поддержания pH осуществляет дозировку питательного раствора уксусной кислоты (70 г). Время культивирования 22-26 ч. Оптическая плотность К.Ж. на сливе 20 ед. (540 нм). Удельная аспартазная активность 148.0 Ед.акт. /ОП. Общая аспартазная активность 2960 Ед.акт./мл. Клетки отделяли центрифугированием и промывали физиологическим раствором. Количество собранных влажных клеток в виде пасты составило 104 г.A one-day culture of Escherichia coli 858 (VKPM-B-7188) is washed off the surface of MPA 1-2 ml of physiological solution and sterilely transferred to a 250 ml Erlenmeer flask with a liquid nutrient medium in a volume of 50 ml of the following composition, g / l:
Na ₂ HPO ₄ • 12H ₂ O - 1.5
KH ₂ PO ₄ - 0.75
NaCl - 0.5
CaCl ₂ - 0-01
Sodium Fumarate - 3
Ammonium Acetate - 5
Corn Extract - 5
pH 7.0. Cultivation is carried out at 28-30 ^o C on a circular shaker for 16-20 hours. The seed is transferred to a three-liter fermenter containing 2 l of nutrient medium of the same composition. Cultivation conditions: temperature 29 ^o C, aeration 2 l / min, stirring 500 rpm, pH 7.9. The automatic pH maintenance system doses the acetic acid nutrient solution (70 g). The cultivation time is 22-26 hours. Optical density K.Zh. on the sink 20 units. (540 nm). Specific aspartase activity 148.0 / OP. Total aspartase activity 2960 Ed.act. / Ml. Cells were separated by centrifugation and washed with saline. The number of collected wet cells in the form of a paste was 104 g.

Пример 2. Получение аспарагиновой кислоты свободными клетками. Example 2. Obtaining aspartic acid free cells.

0.8 г пасты клеток, полученной в примере 1, разводят в 19 мл 1М раствора фумарата аммония. Полученная суспензия имеет оптическую плотность 15 ед. (540 нм). Данную суспензию помещают в термостат на 37^oC на 17 ч.0.8 g of the cell paste obtained in example 1 was diluted in 19 ml of a 1M solution of ammonium fumarate. The resulting suspension has an optical density of 15 units. (540 nm). This suspension is placed in a thermostat at 37 ^o C for 17 hours

В реактор с рубашкой и мешалкой объемом 250 мл помещают 180 мл раствора фумарата аммония. В рубашку реактора непрерывно подают воду с температурой 37^oC. При перемешивании добавляют суспензию активированных клеток. Реакцию трансформации ведут в течение 6 ч. Затем полученный раствор центрифугируют, отделяя микробные клетки, и к надосадочной жидкости при перемешивании добавляют 30%-ный раствор серной кислоты до достижения pH в растворе 2.9 ед. При этом выпадает обильный осадок аспарагиновой кислоты. Полученную суспензию охлаждают до 10^oC, выдерживают 1 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 200 мл захоложенной воды и сушат при температуре 50^oC до постоянного веса. Количество полученного продукта 21.4 г.180 ml of a solution of ammonium fumarate are placed in a reactor with a jacket and a stirrer of 250 ml. Water at a temperature of 37 ^° C is continuously fed into the jacket of the reactor. A suspension of activated cells is added with stirring. The transformation reaction is carried out for 6 hours. Then, the resulting solution is centrifuged to separate microbial cells, and a 30% sulfuric acid solution is added to the supernatant with stirring until the pH in the solution reaches 2.9 units. In this case, an abundant precipitate of aspartic acid precipitates. The resulting suspension was cooled to 10 ^o C, incubated for 1 h. The precipitate was filtered off, washed with 200 ml of chilled water and dried at a temperature of 50 ^o C to constant weight. The amount of product obtained is 21.4 g.

Пример 3. Получение L-аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Е.coli 858. Example 3. Obtaining L-aspartic acid using immobilized in polyacrylamide gel cells of E. coli 858.

Биомассу клеток штамма Е.coli 858 из примера 1 в количестве 15 г суспензируют в 27.3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7.5 Смесь охлаждают до 5^oC и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6.15 г акриламида, 0,36 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5%-ного водного раствора N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина и 0,2 свежеприготовленного 5%-ного водного раствора персульфата аммония.The biomass of cells of the strain E. coli 858 of Example 1 in an amount of 15 g is suspended in 27.3 g of a solution of sodium asparaginate with a concentration of 20%, pH 7.5. The mixture is cooled to 5 ^° C and 6.15 g of acrylamide, 0.36 g N, are added successively to the cooled mixture. N'-methylene-bis-acrylamide, 1.0 g of a 5% aqueous solution of N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine and 0.2 freshly prepared 5% aqueous solution of ammonium persulfate.

Полученный гель измельчают, промывают сначала водой, потом 1,5 М раствором фумарата аммония. Гранулами геля заполняют термостатируемую при 30^oC колонку и пропускают через нее 1,5 М раствор фумарата аммония, содержащий 0,0001 MgSO₄, pH 8,5. Выделение L-аспарагиновой кислоты проводят как в примере 2. Из 1000 мл элюата получают 184 г кристаллической L-аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н. HCl[α] $\binom{20}{D}$ = 24.9. Как показали эксперименты, предлагаемый способ обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет удешевления и упрощения процесса, достижения максимальной аспартазной активности используемого штамма E.coli 858 и урожайности культуры. Исключается необходимость использования дорогостоящих питательных сред и больших объемов культивирования.The resulting gel is ground, washed first with water, then with a 1.5 M solution of ammonium fumarate. The granules of the gel fill the column thermostatically controlled at 30 ^o C and pass through it a 1.5 M solution of ammonium fumarate containing 0.0001 MgSO ₄ , pH 8.5. The isolation of L-aspartic acid is carried out as in example 2. From 1000 ml of the eluate, 184 g of crystalline L-aspartic acid are obtained. Specific rotation angle of 5 N. HCl [α] $\binom{20}{D}$ = 24.9. As experiments have shown, the proposed method provides a more efficient production of L-aspartic acid due to the reduction in cost and simplification of the process, achieving maximum aspartase activity of the used E. coli 858 strain and crop yield. Eliminates the need for expensive nutrient media and large volumes of cultivation.

Claims

1. The method of obtaining L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate using a biocatalyst based on Escherichia coli cells with subsequent isolation of the target product, characterized in that the transformation process uses a biocatalyst based on the Escherichia coli strain VKPM B-7188 grown on a nutrient medium containing acetic acid.

2. The method according to claim 1, characterized in that the biomass of cells of the E. coli strain VKPM B-7188 is used in native or immobilized form.

3. The method according to claim 1, characterized in that the biomass of cells of the E. coli strain VKPM B-7188 grown on a medium containing 0.0001-5% acetic acid is used.