RU2167936C2 - Способ минимизации деградации активированного протеина с (варианты), стабилизированная композиция активированного протеина с - Google Patents
Способ минимизации деградации активированного протеина с (варианты), стабилизированная композиция активированного протеина с Download PDFInfo
- Publication number
- RU2167936C2 RU2167936C2 RU95100178/13A RU95100178A RU2167936C2 RU 2167936 C2 RU2167936 C2 RU 2167936C2 RU 95100178/13 A RU95100178/13 A RU 95100178/13A RU 95100178 A RU95100178 A RU 95100178A RU 2167936 C2 RU2167936 C2 RU 2167936C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activated protein
- protein
- solution
- apc
- activity
- Prior art date
Links
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 claims abstract 17
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims abstract 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 19
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YBHYYFYQHRADCQ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YBHYYFYQHRADCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 9
- 230000003297 denaturating effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 45
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 16
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 6
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- -1 N-cyclohexylamino Chemical group 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007819 clotting time assay Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000000019 pro-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009076 regulation of hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4866—Protein C (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение осуществляют инкубированием в растворе соли активированного протеина С (аРС) при низких значениях рН, около 6,3 - 6,5. Аутодеградацию аРС можно также минимизировать за счет инкубирования аРС в ЗМ мочевине. Полное выделение аРС активности достигается после удаления денатурирующего агента или за счет инкубирования аРС в присутствии экстремальных концентраций соли. Настоящее изобретение касается стабилизированной композиции активированного протеина С, которая поддерживает аРС при низких значениях рН, в денатурирующем агенте или при экстремальных концентрациях соли. Изобретение обеспечивает минимальную аутодеградацию аРС. 3 с. и 14 з.п. ф-лы, 4 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области энзимологии, в частности к способам предотвращения разложения активированного протеина C.
Протеин C представляет собой серин-протеазу и является природным антикоагулянтом, который играет роль в регуляции гемостаза за счет активирования факторов Va и VIIIa в классической схеме коагуляции. Человеческий протеин C образуется ин виво, главным образом, в печени в виде отдельного полипептида, содержащего 461 аминокислоту. Эта молекула предшественника претерпевает множество посттрансляционных модификаций, включая 1/ отщепление сигнальной последовательности из 42 аминокислот, 2/ протеолитическое удаление из одноцепочечного зимогена лизинового остатка в положении 155 и остатка аргинина в положении 156, до получения двухцепочечной формы молекулы /то есть легкой цепи из 155 аминокислотных остатков, присоединенной через дисульфидный мостик к содержащей серин-протеазу тяжелой цепи из 262 аминокислотных остатков/; 3/ зависящее от витамина К карбоксилирование девяти остатков глутаминовой кислоты в первых 42 аминокислотах легкой цепи, в результате чего получают 9 остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты; и 4/ присоединение углеводов по четырем сайтам/ один в легкой цепи, а три - в тяжелой/. Тяжелая цепь содержит хорошо известную триаду серин-протеазы Asp 257, His 211 и Ser 360. И, наконец, цирбуляция 2-цепочечного зимогена активируется ин виво тромбином у поверхности фосфолипида в присутствии иона кальция. Активирование происходит за счет удаления додекапептида по N-концу тяжелой цепи, в результате чего образуется активированный протеин C /aPC/, обладающий энзиматической активностью.
При работе с большими количествами и высокими концентрациями aPC наблюдается протеолитический разрыв /Clip/ по лизиновому остатку в положении 308 тяжелой цепи. Последовательность нового N-конца, образующегося в результате этого разрыва, начинается с C Glu-Ala-Zys и приводит к образованию III аминокислотного фрагмента, названного "EKA фрагментом" из C-терминального конца тяжелой цепи. EAK фрагмент ковалентно не связан с легкой цепью или N-концевым участком тяжелой цепи за счет дисульфидных связей. EAK фрагмент содержит также активный сайт серии из серин-протеазы, но не содержит остатков Asp или His. Так было обнаружено, что препараты протеина C с EAK фрагментом имеют измененную антикоагулянтную активность. Настоящее изобретение включает способы предотвращения или минимизации деградации молекулы протеина C за счет содержания молекулы при пониженных pH, в денатурирующем агенте или при экстремальных концентрациях соли.
Для целей настоящего изобретения в части его раскрытия и в формуле изобретения использованы следующие термины:
aPC - активированный человеческий протеин C,
APTT - время частичной активации тромбопластина,
AU - амидолитические единицы,
BME - бета-меркаптоэтанол,
CHES - 2/N-циклогексиламино/этансульфокислота,
EAK фрагмент - Фрагмент III аминокислот, возникающий при разрыве в положении 308 тяжелой цепи протеина C,
EДTA - этилендиаминтетрауксусная кислота,
HEPES - N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота,
HPC - зимоген человеческого протеина C,
MEA - 2-аминоэтанол,
MES - 2-/N-морфолино/-этансульфокислота.
aPC - активированный человеческий протеин C,
APTT - время частичной активации тромбопластина,
AU - амидолитические единицы,
BME - бета-меркаптоэтанол,
CHES - 2/N-циклогексиламино/этансульфокислота,
EAK фрагмент - Фрагмент III аминокислот, возникающий при разрыве в положении 308 тяжелой цепи протеина C,
EДTA - этилендиаминтетрауксусная кислота,
HEPES - N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота,
HPC - зимоген человеческого протеина C,
MEA - 2-аминоэтанол,
MES - 2-/N-морфолино/-этансульфокислота.
"Возникающий" /Nascent/ протеин - полипептид, образующийся при трансляции мРНК транскрипта до любой посттрансляционной модификации. Однако такие посттрансляционные модификации, как гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспарагиновой кислоты, могут начаться до того, как протеин будет полностью транслирован с мРНК транскрипта.
Активность протеина C - любое свойство протеина С человека, ответственное за протеолитическую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую /антикоагулянтную или профибринолитическую/ активности. Способы тестирования антикоагулянтной и амидолитической активностей протеина C хорошо известны специалистам, например, см. Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192.
rHPC - рекомбинантно полученный зимоген человеческого протеина C.
Зимоген - энзиматически неактивный предшественник протеолитического энзима. Зимоген протеина C, в том смысле, как здесь использован, обозначает секретированные неактивные формы, одной или двух цепей протеина C.
Все сокращения, касающиеся аминокислот и использованные в настоящем описании, соответствуют принятым Патентным Ведомством США и указанным в 37 C,F.R. 1.822 /b/ /2/ /1990/.
Настоящее изобретение относится к способам предотвращения или минимизации аутодеградации активированного протеина C.
Настоящее изобретение иллюстрируется осуществлением процессинга очистки и/или хранения активированного протеина C при низких значениях pH, например, от около 6,3 до около 7,0. Аутодеградация aPC может быть также сведена к минимуму за счет инкубирования aPC в 3М мочевине /полное выделение aPC активности достигается после удаления денатурирующего агента/ или за счет инкубирования aPC в присутствии экстремальных концентраций соли. Для целей настоящего описания экстремальная концентрация соли означает концентрацию выше, чем около 0,4 моля, или ниже, чем около 0,05 молей. Настоящее изобретение включает также aPC композиции, которые поддерживают aPC при низких значениях pH, в денатурирующем агенте или при экстремальных концентрациях соли.
Роль протеина C в поддержании гемостаза привлекает большой интерес к этому соединению, как к терапевтическому агенту для широкого крута сосудистых заболеваний. Получение протеина C человека в больших количествах и с высокими концентрациями привело к обнаружению того факта, что молекула может претерпевать аутодеградацию, что, в свою очередь, ведет к снижению антикоагулянтной активности. Аутодеградация aPC приводит к образованию фрагмента III аминокислот, называемого "EAK фрагментом", из C-терминального конца тяжелой цепи. EAK фрагмент не присоединен ковалентно к легкой цепи или N-терминальному участку тяжелой цепи за счет дисульфидных связей. EAK фрагмент содержит также активный сайт серинового остатка серин-протеазы, но не содержит Asp или His остатков. Таким образом, препараты протеина C с EAK фрагментом обладают измененной антикоагулянтной активностью за счет присутствия протеолитического разрыва.
Для уменьшения или предотвращения аутодеградации, которая ведет к образованию EAK фрагмента, интактную активированную молекулу протеина C можно содержать при pH от около 6,3 до около 7,0. Молекулу нужно содержать в условиях с pH в этом интервале на протяжении всех процессов очистки и активации, а также при получении окончательного раствора композиции. Для поддержания pH раствора можно использовать множество различных буферных систем. Представители таких буферных систем включают Трис-ацетат, цитрат натрия, цитрат-глицин и фосфат натрия. Специалистам известно и множество других буферных систем, которые доступны, и которые можно использовать в способах настоящего изобретения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к предотвращению или уменьшению образования EAK фрагмента за счет поддержания активированной молекулы протеина C в растворе с экстремальной концентрацией соли. Так, например, при pH 7,0 в натрийфосфатном буфере образование фрагмента EAK минимально, если в буфере нет соли. Однако при pH 7,0 в натрийфосфатном буфере образование EAK фрагмента также минимально, если концентрация натрийхлорида в буфере составляет около 0,4М. Между этими двумя концентрациями соли образование EAK фрагмента происходит с различными скоростями; но специалистам должно быть ясно, что поддержание концентраций соли между 0,05М и около 0,4М наиболее легко предотвращает или минимизирует образование EAK фрагмента. Предпочтительны другие концентрации соли ниже 0,05М /например, 0,01М или 0,005М/, хотя наилучшие фармацевтические композиции соответствуют значениям pH около 7,0 без добавления к раствору соли. Специалистам должно быть ясно, что можно использовать много различных солей при получении фармацевтических соединений и композиций. Представители подходящих для использования солей включают хлорид калия, хлорид кальция и, что наиболее предпочтительно, хлорид натрия.
Еще один аспект изобретения относится к предотвращению или уменьшению аутодеградации активированного протеина C за счет осуществления очистки и/или получения композиции в присутствии денатурирующего агента. Можно использовать многие денатурирующие агенты, но наиболее предпочтительным агентом является мочевина в концентрациях около 3М.
Настоящее изобретение не ограничено способами получения активированного протеина C. Хотя наиболее эффективно получение молекул активированного протеина C с использованием рекомбинантной технологии ДНК, последние достижения в области крупномасштабной очистки протеина позволяют выделять значительные количества активированного протеина C из сыворотки человека. Получение таких больших количеств протеина C позволяет одновременно обрабатывать высокие концентрации активированного протеина C. Как было указано ранее, авторы обнаружили, что концентрации активированного протеина C выше уровня около 50 мкг/мл демонстрируют аутодеградацию молекул активированного протеина C, сопровождающуюся соответствующим падением антикоагулянтной активности. Наиболее важным фактом является то, что скорость аутодеградации повышается с повышением концентрации активированного протеина C в растворе. При промышленном производстве не эффективно вести процессы очистки больших количеств продукта при очень низких концентрациях протеина.
Так как промышленное и фармацевтическое применение получения активированного протеина C требует обработки молекул при концентрациях, значительно превосходящих 50 мкг, настоящее изобретение позволяет специалистам получать большие количества продукта без существенной потери активности продукта. Композиции настоящего изобретения позволяют хранить стабильные растворы активированного протеина C в течение более длительного промежутка времени, нежели те, которые были известны специалистам ранее.
Специалистам должно быть ясно, что способы настоящего изобретения позволяют пользователям получать большие объемы активированного протеина C с более высокими концентрациями, нежели те, которые можно было получать ранее, без опасности потерь продукта за счет аутодеградации. Кроме того, стабильные фармацевтические композиции настоящего изобретения можно легко использовать для лечения пациентов, страдающих заболеваниями в соответствии с указаниями Taylor, Jr. et al. в патенте США N 5009889, данные которого включены сюда по ссылке.
Далее приводятся примеры, как средство иллюстрации настоящего изобретения, и они никоим образом не ограничивают это изобретение.
Пример 1
Получение человеческого протеина C
Рекомбинантный человеческий протеин C /rHPC/ получают в клетках 293 человеческой почки способами, хорошо известными специалистам, например способом Jan патент США 4981952 /включен в качестве ссылки/. Ген, кодирующий человеческий протеин C, раскрыт и в заявке Bang et al., патент США 4775624 /включен в качестве ссылки/. Плазмида, которую используют для экспрессии человеческого протеина C в клетки 293, представляет собой плазмиду pLPC, которая раскрыта Bang et al. в патенте США 4992373. Конструирование плазмиды pLPC раскрыто также в Европейской патентной публикации N 0445939 и у Grinnell et al. 1937 Bio/Thechnology 5:1189-1192 /включены в качестве ссылки/. Короче, плазмиду трансфектируют в клетки 293, затем стабильные трансформанты идентифицируют, субкультивируют и выращивают на среде, не содержащей сыворотки. После ферментации микрофильтрацией получают не содержащую клеток среду.
Получение человеческого протеина C
Рекомбинантный человеческий протеин C /rHPC/ получают в клетках 293 человеческой почки способами, хорошо известными специалистам, например способом Jan патент США 4981952 /включен в качестве ссылки/. Ген, кодирующий человеческий протеин C, раскрыт и в заявке Bang et al., патент США 4775624 /включен в качестве ссылки/. Плазмида, которую используют для экспрессии человеческого протеина C в клетки 293, представляет собой плазмиду pLPC, которая раскрыта Bang et al. в патенте США 4992373. Конструирование плазмиды pLPC раскрыто также в Европейской патентной публикации N 0445939 и у Grinnell et al. 1937 Bio/Thechnology 5:1189-1192 /включены в качестве ссылки/. Короче, плазмиду трансфектируют в клетки 293, затем стабильные трансформанты идентифицируют, субкультивируют и выращивают на среде, не содержащей сыворотки. После ферментации микрофильтрацией получают не содержащую клеток среду.
Человеческий протеин C выделяют из культуральной жидкости, адаптируя методики Jan, патент США 4981952. Очищенную среду доводят до 4 мМ в ЕДТА перед тем, как абсорбируют на анионообменной смоле /Fast-Flow Q, Pharmacia/. После промывки 4 объемами колонки 20мМ Tris 200 мМ NaCl pH 7,4 и 2 объемами колонки 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,4, связанный зимоген рекомбинантного человеческого протеина C элюируют 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, pH 7,4. Элюированный протеин оказывается более 95% чистоты после элюирования по данным электрофореза в SDS - полиакриламидном геле.
Дальнейшую очистку протеина осуществляют, получая ЗМ в NaCl протеин с последующей адсорбцией на смоле с гидрофобным взаимодействием /Toyopearl Phenyl 650 M, Toso Haas/, уравновешенной в 20 мМ Tris, 3 М NaCl, 10 мМ CaCl2, pH 7,4. После промывки 2 объемами уравновешивающим буфером колонки без CaCl2, рекомбинантный человеческий протеин C элюируют 20 мМ Tris, pH 7,4. Элюированный протеин подготавливают для активации, удаляя остатки кальция. Рекомбинантный человеческий протеин C пропускают через металлическую афинную колонку /Chelex-100, Bio-Rad/ для удаления кальция, и снова связывают на анионообменнике /Fast Flow Q, Pharmacia/. Обе эти колонки устанавливают в серию и уравновешивают 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 7,4. После загрузки протеина колонку Chelex-100 промывают одним объемом колонки того же самого буфера, перед тем, как колонки разъединяют. Анионообменную колонку промываю 3 объемами уравновешивающего буфера перед тем, как элюируют протеин 0,4М NaCl, 20 мМ Tris - ацетата, pH 6,5. Концентрации протеина в растворах рекомбинантного человеческого протеина C и рекомбинантного активированного протеина C определяют по коэффициенту экстинкции на 280 нм /УФ/.
E0,1% = 1,85 или 1,95 соответственно.
Пример 2
Активирование рекомбинантного человеческого протеина C
Бычий тромбин соединяют с активированной CH-Сефарозой 4В /Pharmacia/ в присутствии 50 мМ HEPES, pH 7,5 при 4oC. Реакцию сочетания ведут на смоле, уже помещенной в колонку, используя примерно 5000 ед. тромбина на мл смолы. Раствор тромбина циркулирует через колонку в течение примерно 3 часов перед тем, как добавляют MEA до концентрации 0,6 мл/л циркулирующего раствора. MEA-содержащий раствор циркулирует еще 10-12 часов для того, чтобы обеспечить полную блокаду непрореагировавших аминов на смоле. После блокирования смолу с присоединенным тромбином промывают 10 объемами колонки 1М NaCl 20 мМ Tris, pH 6,5 для удаления всего неспецифически связанного протеина, и используют в реакциях активации после уравновешивания активационным буфером.
Активирование рекомбинантного человеческого протеина C
Бычий тромбин соединяют с активированной CH-Сефарозой 4В /Pharmacia/ в присутствии 50 мМ HEPES, pH 7,5 при 4oC. Реакцию сочетания ведут на смоле, уже помещенной в колонку, используя примерно 5000 ед. тромбина на мл смолы. Раствор тромбина циркулирует через колонку в течение примерно 3 часов перед тем, как добавляют MEA до концентрации 0,6 мл/л циркулирующего раствора. MEA-содержащий раствор циркулирует еще 10-12 часов для того, чтобы обеспечить полную блокаду непрореагировавших аминов на смоле. После блокирования смолу с присоединенным тромбином промывают 10 объемами колонки 1М NaCl 20 мМ Tris, pH 6,5 для удаления всего неспецифически связанного протеина, и используют в реакциях активации после уравновешивания активационным буфером.
Очищенный rHPC доводят до 5 мМ в EDTA /для хелатирования/ всего оставшегося кальция/ и разбавляют до концентрации 2 мг/мл 20 мM Tris, pH 7,4 или 20 мМ Tris-ацетата, pH 6,5. Этот материал пропускают через тромбиновую колонку, уравновешенную при 37oC 50 мМ NaCl и либо 20 мМ Tris pH 7,4, либо 20 мМ Tris-ацетата, pH 6,5. Скорость потока устанавливают такой, чтобы обеспечить примерно 20-минутное контактирование между rHPC и тромбиновой смолой. Выходящую жидкость собирают и немедленно проводят анализ на амидолитическую активность. Если материал не обладает специфической активностью /амидолитической/ по сравнению со стандартом aPC его рециклизуют в тромбиновую колонку для активации rHPC до завершения. После этого проводят разбавление 1: 1 материала 20 мМ буфера /указанного ранее/ с pH либо 7,4, либо 6,5 для поддержания aPC при низких концентрациях, пока ожидаются следующие стадии обработки.
Удаление выщелаченного тромбина из материала aPC завершают, связывая aPC с анионообменной смолой /Fast Flow Q, Pharmacia/ уравновешенной в активационном буфере /либо 20 мМ Tris, pH 7,4, либо 20 мМ Tris-ацетат, pH 6,5/ 150 мМ NaCl. Тромбин не взаимодействует с анионообменной смолой в этих условиях, но проходит через колонку в вытекающий образец. После того, как aPC загружают в колонку, ее промывают 2 - 6 объемами 20 мМ уравновешивающего буфера перед элюированием связанного aPC, со стадией элюирования, используя 0,4 М NaCl либо в 5 мМ Tris - ацетате, pH 6,5, либо в 20 мМ Tris, pH 7,4. Большие объемы промывок облегчают более полное удаление додекапептида. Этот материал элюируют из колонки и хранят либо в замороженном растворе /-20oC/, либо в виде лиофилизированного порошка.
Амидолитическую активность /AU/ aPC определяют по высвобождению p-нитроанилида из синтетического субстрата H-D-Phe-Pip-Arg-p-нитроанилида /S-2238/, поставляемого Kabi Vitrum, с использованием Вескман DU-7400 спектрофотометра. Одну единицу активированного протеина C определяют как количество энзима, необходимое для высвобождения 1 мкмоля p-нитроанилина за 1 минуту при 25oC, pH 7,4, используя коэффициент экстинкции для p-нитроанилина на 405 нм 9620 М-1 см-1.
Антикоагулянтную активность активированного протеина C определяют, измеряя пролонгирование времени свертывания в анализе на время свертывания частично активированного тромбопластина /APTT/. Стандартную кривую получают при разбавлении буфером /1 мг/мл BSA степени чистоты для радиоиммуноанализа, 20 мМ Tris, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3/ в интервале концентраций протеина C от 125 до 1000 нг/мл, когда образцы приготавливают для нескольких разбавлении в этом интервале концентраций.
В каждую кювету с образцами добавляют 50 мкл холодной лошадиной плазмы и 50 мкл восстановленного частично активированного тромбопластинового временного реагента /APTT реагент, Сигма/, и инкубируют при 37oC в течение 5 минут. После инкубирования в каждую кювету добавляют 50 мкл соответствующего образца или стандарты. Буфер разбавления используют вместо образца или стандарта для определения основного времени свертывания. Таймер фиброметра /CoA Screener Hemostasis Analyzer American Labor включают сразу после добавления 50 мкл 37oC 30 мМ CaCl2 к каждому образцу или стандарту. Концентрацию активированного протеина C в образцах рассчитывают из уравнения линейной регрессии стандартной кривой. Указанные времена свертывания представляют собой среднее из минимум трех повторов, включая и кривые для стандартов.
Для получения образцов для сравнительных измерений, полной аутодеградации aPC /7,3 мг/мл/ в 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl достигают, спустя 44 часа инкубирования при 25oC или после концентрирования на анионообменной смоле /FFQ, Pharmacia/ pH 7,4 при 4oC. Анализы на амидолитическую активность, HPLC /ВЭЖХ/, N-теминальное секвенирование и SDS-PAGE осуществляют на образцах для подтверждения и количественного определения степени аутодеградации и сайтов расщепления аминокислотной последовательности.
Пример 3
Анализы стабилизации активированного протеина C
Влияние pH на активность aPC определяют, контролируя AU. Для определения pH условий в интервале 6-9,3 /с 0,3 pH инкрементами/ используют три буферные системы, используя 50 мМ каждого из MES /pH 5,5-7/, HEPES /pH 6,8-8,2/ и CHES /pH 8,6-10/. APC разбавляют до конечной концентрации 0,4 мг/мл соответствующим pH буфером и инкубируют при этой концентрации перед измерением активности. Образцы оценивают вначале и спустя 30 часов при 4oC, используя амидолитические анализы при инкубационных pH. Эти измерения показывают колоколообразную pH зависимость амидолитической активности. Результаты этих анализов приводятся далее в таблице I.
Анализы стабилизации активированного протеина C
Влияние pH на активность aPC определяют, контролируя AU. Для определения pH условий в интервале 6-9,3 /с 0,3 pH инкрементами/ используют три буферные системы, используя 50 мМ каждого из MES /pH 5,5-7/, HEPES /pH 6,8-8,2/ и CHES /pH 8,6-10/. APC разбавляют до конечной концентрации 0,4 мг/мл соответствующим pH буфером и инкубируют при этой концентрации перед измерением активности. Образцы оценивают вначале и спустя 30 часов при 4oC, используя амидолитические анализы при инкубационных pH. Эти измерения показывают колоколообразную pH зависимость амидолитической активности. Результаты этих анализов приводятся далее в таблице I.
Максимальная активность для aPC составляет 7,4, тогда как экстремальные значения pH 6 и 9,3 дают существенно сниженную активность. Хотя aPC, по-видимому, сохраняет некоторую амидолитическую активность при экстремальных значениях pH, эти данные дают возможность предположить, что аутодеградация снижается, если избежать таких условий, при которых aPC имеет максимальную активность.
Для того, чтобы определить, является ли pH зависимость амидолитической активности функцией образования EAK фрагмента, aPC образцы инкубируют при pH 6,0, 7,5 и 9,0, 1,5 мг/мл при 4oC в течение 18 часов. Количество образующегося EAK определяют, интегрируя площадь под EAK ВЭЖХ пиком, а также качественно оценивая EAK полосу в SDS-PAGE. Эти данные свидетельствуют о том, что не происходит увеличения EAK образования в процессе инкубирования при pH 6,0, тогда как наблюдается примерно 30% возрастание при pH 7,5 и 50% при pH 9,0. Несмотря на повышенные уровни образования EAK фрагмента в образцах с pH 7,5 и 9,0, препараты все еще обладают высокой AU активностью при оценке при pH 7,4. Таким образом, образование EAK фрагмента нет необходимости связывать с потерей амидолитической активности.
Скорее EAK фрагмент должен оставаться достаточно связанным с остальной aPC тяжелой цепью для сохранения функциональности серин-протеазы. Если оно и существует, то более высокое содержание EAK фрагмента связано с более высокой амидолитической активностью.
EAK фрагмент содержит активный сайт серина /остаток 360/ каталитической триады /включая His 211 и Asp 257, находящиеся в N-терминальной части тяжелой цепи/. Поэтому, если EAK фрагмент ковалентно не связан с остальной частью тяжелой цепи, его протеолитический разрыв может привести к снижению энзиматической активности. Чтобы определить влияние различных количеств EAK на антикоагулянтную активность, несколько различных порций aPC приготавливают по способу примеров 1 и 2.
Амидолитические анализы проводят для концентраций субстратов в интервале 22 - 198 мкМ N S-2238, APC концентраций в интервале 1,6 - 3,3 нМ /75-150 г/мл/, 20 мМ Tris, pH 7,4, 150 мМ NaCl. Результаты этого анализа приведены далее в таблице II.
pH зависимость деградации используют для получения aPC образцов, которые содержат различные количества EAK. Эти образцы получают по способам примеров 1 и 2. Образцы с различным содержанием EAK фрагмента сравнивают с интактным aPC /менее 3% EAK фрагмента/. Амидолитические кинетические характеристики, включая Km, Kсат и Vmax значения, определяют для каждой из этих порций для трех различных концентраций энзимов, и результаты суммированы в таблице III.
Значения Km для трех aPC образцов, по-видимому, одинаковы /в пределах ошибки эксперимента/ и дают среднее значение 0,16 мМ субстрата. Это предполагает, что афинность для S-2238 субстрата не нарушается при деградации aPC. Неожиданно оказалось, что деградированный материал все еще обладает AU активностью, практически аналогичной активности интактного aPC.
Активированный протеин C может иметь интактную амидолитическую функциональность от трипептидного субстрата /NS-2238/ даже при высоком содержании EAK фрагмента. Ин витро антикоагуляционную активность можно определить в APTT анализе.
Неожиданно оказалось, что высокая AU активность не коррелирует с антикоагулянтной активностью. Тогда как AU активность возрастает с увеличением содержания EAK, APTT активность снижается с увеличением содержания EAK.
Влияние солевой концентрации на образование EAK фрагмента и стабильность активированного протеина C изучали, инкубируя образцы активированного протеина C при различных pH уровнях и концентрациях соли, затем измеряя процент образования EAK фрагмента в час. Концентрации протеина C в анализе были 4-5 мг/мл. Все анализы проводят в 5-20 мМ фосфатном буфере. В качестве соли используют хлорид натрия /если присутствует соль/, и все анализы проводят при 25oC. Процент образования EAK фрагмента в час определяют, интегрируя ВЭЖХ. Результаты этих анализов представлены в таблице IV.
Пример 4.
Композиция активированного протеина C
Человеческий активированный протеин C получали согласно методике, описанной в примерах 1 и 2. Комбинации активированного протеина C основаны на данных изучения стабильности активированного протеина C, представленные в примере 3. Композиция активированного протеина C включает активированный протеин C в концентрации 0,4 мг/мл, хлорид натрия в концентрации ниже 0,05 М или выше 0,40 М, натрийфосфатный буфер в концентрации от 0,05 М до 0,020 М при pH от 6,4 до 7,0. Описанная композиция активированного протеина C имеет пониженное содержание EAK фрагмента.
Человеческий активированный протеин C получали согласно методике, описанной в примерах 1 и 2. Комбинации активированного протеина C основаны на данных изучения стабильности активированного протеина C, представленные в примере 3. Композиция активированного протеина C включает активированный протеин C в концентрации 0,4 мг/мл, хлорид натрия в концентрации ниже 0,05 М или выше 0,40 М, натрийфосфатный буфер в концентрации от 0,05 М до 0,020 М при pH от 6,4 до 7,0. Описанная композиция активированного протеина C имеет пониженное содержание EAK фрагмента.
Claims (17)
1. Способ минимизации деградации активированного протеина С, отличающийся тем, что активированный протеин С инкубируют в растворе соли с рН около 6,3 - 7,0.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе менее чем около 0,050 М или более чем около 0,40 М.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе менее чем около 0,050 М.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе менее чем около 0,010 М.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе более 0,40 М.
6. Способ по п.2, отличающийся тем, что солью в указанном растворе является хлорид натрия.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН раствора 6,3 - 6,5.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН раствора 6,3.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН раствора 6,4.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН раствора 6,5.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный раствор лиофилизируют.
12. Способ по п.2, отличающийся тем, что солью в указанном растворе является Tris-ацетат, или цитрат натрия, или цитрат глицина, или фосфат натрия.
13. Способ минимизации деградации активированного протеина С, отличающийся тем, что активированный протеин С инкубируют в 3М растворе мочевины, являющемся денатурирующим агентом.
14. Стабилизированная композиция активированного протеина С, отличающаяся тем, что содержит активированный протеин С, полученный способом по п.1.
15. Стабилизированная композиция активированного протеина С по п.14, отличающаяся тем, что содержит раствор соли в концентрации менее чем около 0,05 М и более чем около 0,4 М.
16. Стабилизированная композиция активированного протеина С по п.15, отличающаяся тем, что концентрация соли в растворе менее чем около 0,05 М.
17. Стабилизированная композиция активированного протеина С по п.15, отличающаяся тем, что содержит раствор соли, выбранный из Tris-ацетата, цитрата натрия, цитрата глицина и фосфата натрия.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17783294A | 1994-01-05 | 1994-01-05 | |
| US08/177,832 | 1994-01-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95100178A RU95100178A (ru) | 1997-03-27 |
| RU2167936C2 true RU2167936C2 (ru) | 2001-05-27 |
Family
ID=22650141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95100178/13A RU2167936C2 (ru) | 1994-01-05 | 1995-01-04 | Способ минимизации деградации активированного протеина с (варианты), стабилизированная композиция активированного протеина с |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1087011A3 (ru) |
| JP (1) | JP3778588B2 (ru) |
| KR (1) | KR950032287A (ru) |
| CN (1) | CN1109891A (ru) |
| AT (1) | ATE201045T1 (ru) |
| AU (1) | AU1003195A (ru) |
| BR (1) | BR9500017A (ru) |
| CA (1) | CA2139468C (ru) |
| CO (1) | CO4600680A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ1395A3 (ru) |
| DE (2) | DE10299053I2 (ru) |
| DK (1) | DK0662513T3 (ru) |
| ES (1) | ES2156190T3 (ru) |
| FI (1) | FI115635B (ru) |
| GR (1) | GR3036277T3 (ru) |
| HU (1) | HUT70465A (ru) |
| IL (1) | IL112236A (ru) |
| LU (2) | LU90992I2 (ru) |
| NL (1) | NL300108I2 (ru) |
| NO (2) | NO320157B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ270271A (ru) |
| PE (1) | PE43995A1 (ru) |
| PL (1) | PL180703B1 (ru) |
| PT (1) | PT662513E (ru) |
| RU (1) | RU2167936C2 (ru) |
| SI (1) | SI0662513T1 (ru) |
| UA (1) | UA39178C2 (ru) |
| YU (1) | YU295A (ru) |
| ZA (1) | ZA9514B (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1557463A1 (en) * | 1997-04-28 | 2005-07-27 | Eli Lilly & Company | Improved methods for processing activated protein C |
| EA004881B1 (ru) * | 1997-04-28 | 2004-08-26 | Эли Лилли Энд Компани | Лиофилизированные композиции на основе рекомбинантного человеческого активированного протеина с и их применение |
| US6630137B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
| US7204981B2 (en) | 2000-03-28 | 2007-04-17 | Eli Lilly And Company | Methods of treating diseases with activated protein C |
| CA2410567A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Eli Lilly And Company | Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
-
1994
- 1994-12-22 NZ NZ270271A patent/NZ270271A/xx unknown
-
1995
- 1995-01-03 PE PE1995258411A patent/PE43995A1/es not_active Application Discontinuation
- 1995-01-03 AU AU10031/95A patent/AU1003195A/en not_active Abandoned
- 1995-01-03 PL PL95306671A patent/PL180703B1/pl unknown
- 1995-01-03 KR KR1019950000002A patent/KR950032287A/ko not_active Abandoned
- 1995-01-03 CA CA002139468A patent/CA2139468C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-03 NO NO19950018A patent/NO320157B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-01-03 ZA ZA9514A patent/ZA9514B/xx unknown
- 1995-01-03 IL IL11223695A patent/IL112236A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-01-03 CO CO95000126A patent/CO4600680A1/es unknown
- 1995-01-03 CZ CZ9513A patent/CZ1395A3/cs unknown
- 1995-01-04 CN CN95101130A patent/CN1109891A/zh active Pending
- 1995-01-04 PT PT95300042T patent/PT662513E/pt unknown
- 1995-01-04 JP JP00008695A patent/JP3778588B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-04 DE DE2002199053 patent/DE10299053I2/de active Active
- 1995-01-04 AT AT95300042T patent/ATE201045T1/de active
- 1995-01-04 RU RU95100178/13A patent/RU2167936C2/ru active
- 1995-01-04 DK DK95300042T patent/DK0662513T3/da active
- 1995-01-04 SI SI9530503T patent/SI0662513T1/xx unknown
- 1995-01-04 HU HU9500021A patent/HUT70465A/hu unknown
- 1995-01-04 UA UA95018011A patent/UA39178C2/ru unknown
- 1995-01-04 FI FI950044A patent/FI115635B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-01-04 YU YU295A patent/YU295A/sh unknown
- 1995-01-04 ES ES95300042T patent/ES2156190T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-04 DE DE69520844T patent/DE69520844T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-04 EP EP00203385A patent/EP1087011A3/en not_active Withdrawn
- 1995-01-04 EP EP95300042A patent/EP0662513B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-04 BR BR9500017A patent/BR9500017A/pt not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-24 GR GR20010401126T patent/GR3036277T3/el unknown
-
2002
- 2002-12-03 NL NL300108C patent/NL300108I2/nl unknown
- 2002-12-18 LU LU90992C patent/LU90992I2/fr unknown
- 2002-12-18 LU LU90993C patent/LU90993I2/fr unknown
-
2006
- 2006-05-02 NO NO2006006C patent/NO2006006I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU740753C (en) | Improved methods for processing activated protein C | |
| Zhang et al. | Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated human protein C in defining its in vitro anticoagulant activity | |
| US6037322A (en) | Methods for treating vascular disorders using activated protein C | |
| AU677309B2 (en) | Purification of factor VII | |
| KR20110036071A (ko) | 그의 보조인자의 부존재하에서 응고활성을 갖는 인자 ｉｘ 변이체 및 출혈 질환을 치료하기 위한 그의 용도 | |
| RU2167936C2 (ru) | Способ минимизации деградации активированного протеина с (варианты), стабилизированная композиция активированного протеина с | |
| Yu et al. | Construction, expression, and properties of a recombinant chimeric human protein C with replacement of its growth factor-like domains by those of human coagulation factor IX | |
| JP4680329B2 (ja) | 血管障害の治療方法 | |
| IE903212A1 (en) | Method for activating protein c | |
| EP0363898A2 (en) | Process for the preparation of urokinase derivatives | |
| CA2330171A1 (en) | Human protein c polypeptide | |
| AU769144B2 (en) | Improved methods for processing activated protein C | |
| AU608232B2 (en) | Modified tissue plasminogen activator | |
| EP1557463A1 (en) | Improved methods for processing activated protein C | |
| AU2003252774A1 (en) | Human Protein C Polypeptide | |
| Zhang et al. | Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated | |
| JP2001514516A (ja) | 活性化ビタミンｋ依存性血液因子およびその製造方法 |