RU2157406C2 - NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY - Google Patents
NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157406C2 RU2157406C2 RU96104372A RU96104372A RU2157406C2 RU 2157406 C2 RU2157406 C2 RU 2157406C2 RU 96104372 A RU96104372 A RU 96104372A RU 96104372 A RU96104372 A RU 96104372A RU 2157406 C2 RU2157406 C2 RU 2157406C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- tgf
- family
- dna
- Prior art date
Links
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 11
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 239000004053 dental implant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 101100472152 Trypanosoma brucei brucei (strain 927/4 GUTat10.1) REL1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 18
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MMBKSAPXEVKALE-KCDQGTFASA-N I25 Chemical compound C1=NC(C(NC=N2)=O)=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC=N3)=O)N=C2)O)[C@H]1O MMBKSAPXEVKALE-KCDQGTFASA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101150072730 Bmp6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100165560 Mus musculus Bmp7 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101150061927 BMP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100040895 Growth/differentiation factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710194458 Growth/differentiation factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 239000007756 Ham's F12 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100165554 Mus musculus Bmp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100026166 TFIIA-alpha and beta-like factor Human genes 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241001447056 Uristes Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical group C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002218 isotachophoresis Methods 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к новому фактору роста/дифференциации TGF- β -семейства и кодирующим его ДНК-последовательностям. The present invention relates to a new growth / differentiation factor for the TGF-β family and its DNA sequences coding for it.
TGF- β -семейство факторов роста, к которому относятся родственные BMP, TGF и ингибину протеины /Poberts и Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 419-472/, особенно уместно для широкой области медицинских методов лечения и применений. Эти факторы пригодны в способах, которые относятся к заживлению ран и регенерации тканей. Далее, некоторые члены TGF- β -семейства индуцируют рост тканей, в особенности рост костей, и поэтому играют центральную роль при индуцировании развития хрящей и костей. TGF-β family of growth factors, which include related BMP, TGF and inhibin proteins / Poberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 419-472 /, is particularly relevant for a wide range of medical treatment methods and applications. These factors are useful in methods that relate to wound healing and tissue regeneration. Further, some members of the TGF-β family induce tissue growth, especially bone growth, and therefore play a central role in inducing the development of cartilage and bone.
Wozney /Progress in Growth Fact or Research, 1, (1989), 267-280 и Vale и др. / Handbook of Experimental Pharmacology, 95 (1990), 211-248/ описывают различные факторы роста, как, например, таковые, которые являются родственными группе BMP (костно-морфогенетические протеины) и группе ингибина. Члены этих групп обладают значительным структурным сходством. Предшественник протеина состоит из аминоконцевой сигнальной последовательности, пропептид- и карбоксиконцевой последовательности примерно из 110 аминокислот, которая отщепляется от предшественника и представляет собой зрелый протеин. Далее, ее члены определяются путем гомологии аминокислотных последовательностей. Зрелый протеин содержит высококонсервативные последовательности, в особенности семь цистеиновых остатков, которые консервативны у членов семейства. TGF- β -образные протеины представляют собой многофункциональные, гормонально активные факторы роста. Они обладают также родственными биологическими активностями, как, например, хемотактическое притяжение клеток, способствование дифференциации клеток и индуцирующие ткани способности, как, например, индуцирующие хрящи и кости способности. В патенте США N 5013649 раскрыты ДНК-последовательности, которые кодируют остеоиндуктивные протеины, обозначаемые как BMP-2, а из патентных заявок США N 179101 и N 170197 известны BMP-протеины: BMP-1 и BMP-3. Далее, многие типы клеток в состоянии синтезировать TGF- β -образные протеины, и практически все клетки содержат TGF- β -рецепторы. Wozney / Progress in Growth Fact or Research, 1, (1989), 267-280 and Vale et al. / Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211-248 / describe various growth factors, such as, for example, are related to the BMP group (bone-morphogenetic proteins) and the inhibin group. Members of these groups have significant structural similarities. A protein precursor consists of an amino-terminal signal sequence, a propeptide and carboxy-terminal sequence of approximately 110 amino acids, which is cleaved from the precursor and is a mature protein. Further, its members are determined by the homology of amino acid sequences. The mature protein contains highly conserved sequences, especially seven cysteine residues, which are conserved in family members. TGF-β-like proteins are multifunctional, hormone-active growth factors. They also have related biological activities, such as chemotactic attraction of cells, promoting cell differentiation and tissue-inducing abilities, such as cartilage and bone-inducing abilities. US Pat. No. 5,013,649 discloses DNA sequences that encode osteoinductive proteins designated as BMP-2, and BMP proteins BMP-1 and BMP-3 are known from US patent applications N 179101 and N 170197. Further, many types of cells are able to synthesize TGF-β-like proteins, and almost all cells contain TGF-β-receptors.
В целом, эти протеины различаются по своей структуре, что приводит к значительным вариациям в их точной биологической функции. Далее, они находятся в широкой области различных видов тканей и стадий развития. Следовательно, они могут иметь различия в отношении их точной функции, например, необходимой клеточной физиологической среды (окружения), продолжительности их жизни, их местоположения, их потребности во вспомогательных факторах и их устойчивости к деструкции. Итак, хотя и описываются многочисленные протеины, которые обладают индуктивным в отношении тканей, в особенности остеоиндуктивным, потенциалом, их естественные задачи в организме и - еще важнее - их медицинскую применимость еще нужно детально исследовать. С большой вероятностью предполагается наличие еще неизвестных членов TGF- β -семейства, которые важны для остеогенеза или для дифференциации/индукции других видов тканей. Большая трудность при выделении этих новых TGF- β -образных протеинов, однако, состоит в том, что их функции еще недостаточно точно могут быть описаны для разработки биологического анализа с целью их распознавания. С другой стороны, ожидаемая гомология нуклеотидных последовательностей для известных членов семейства слишком незначительна, чтобы сделать возможным скрининг с помощью классических методов гибридизации нуклеиновых кислот. Однако дальнейшее выделение и характеристика новых TGF- β -образных протеинов необходимы, чтобы получить другие протеины дифференцировки и индукции, которые удовлетворяют всем желательным медицинским требованиям. Эти факторы могут найти применение в медицине при лечении (заживлении) повреждений и при лечении дегенеративных заболеваний костей и/или других видов тканей, как, например, почки или печень. In general, these proteins differ in their structure, which leads to significant variations in their exact biological function. Further, they are in a wide area of various types of tissues and stages of development. Therefore, they may have differences with respect to their exact function, for example, the necessary cellular physiological environment (environment), their life expectancy, their location, their need for auxiliary factors and their resistance to destruction. So, although numerous proteins are described that have tissue inductive potential, especially osteoinductive potential, their natural tasks in the body and - more importantly - their medical applicability still need to be investigated in detail. It is very likely that there are still unknown members of the TGF-β family that are important for osteogenesis or for differentiation / induction of other tissue types. The great difficulty in isolating these new TGF-β-like proteins, however, lies in the fact that their functions cannot yet be accurately described for the development of biological analysis in order to recognize them. On the other hand, the expected homology of nucleotide sequences for known members of the family is too small to allow screening using classical nucleic acid hybridization methods. However, the further isolation and characterization of new TGF-β-like proteins is necessary in order to obtain other differentiation and induction proteins that satisfy all the desired medical requirements. These factors can find application in medicine in the treatment (healing) of injuries and in the treatment of degenerative diseases of bones and / or other types of tissues, such as the kidney or liver.
В патентной заявке PCT / EP 93 / 00350 указана нуклеотидная и аминокислотная последовательности для TGF- β -протеина MP-52, причем указана соответствующая зрелому пептиду последовательность и большая часть соответствующей пропептиду MP-52 последовательности. Полная последовательность пропептида MP-52 не раскрыта. PCT / EP 93/00350 discloses the nucleotide and amino acid sequences for the TGF-β-protein of MP-52, the sequence corresponding to the mature peptide and the majority of the sequence corresponding to the propeptide MP-52. The complete sequence of the MP-52 propeptide is not disclosed.
Положенная в основу настоящего изобретения задача состоит в том, чтобы получить ДНК-последовательности, которые кодируют новые члены семейства TGF- β -протеинов с митогенным и/или дифференцирующе-индуктивным, например остеоиндуктивным, потенциалом. В особенности задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить полную ДНК- и аминокислотную последовательность TGF-протеина MP-52. The object of the present invention is to obtain DNA sequences that encode new members of the TGF-β-protein family with mitogenic and / or differentiatively inductive, for example, osteoinductive, potential. In particular, the object of the present invention is to obtain the complete DNA and amino acid sequence of the
Эта задача решается благодаря молекуле ДНК, которая кодирует протеин TGF- β -семейства и включает:
(а) кодирующую зрелый протеин часть (участок) и в случае необходимости другие функциональные части указанной в SEQ ID NO 1 нуклеотидной последовательности;
(б) соответствующую последовательность из п. (а) в рамках дегенерации генетического кода нуклеотидную последовательность;
(в) аллельное производное соответствующей последовательностям из п.п. (а) и (б) нуклеотидной последовательности; или
(г) гибридизирующуюся с одной из последовательностей (а), (б) или (в) последовательность;
при предположении, что молекула ДНК согласно п. (г) содержит по меньшей мере одну часть, кодирующую зрелый протеин TGF- β -семейства.This problem is solved thanks to a DNA molecule that encodes a protein of the TGF-β family and includes:
(a) a portion (region) encoding a mature protein and, if necessary, other functional parts of the nucleotide sequence indicated in
(b) the corresponding sequence from paragraph (a) within the framework of the degeneration of the genetic code, the nucleotide sequence;
(c) an allelic derivative corresponding to the sequences of (a) and (b) a nucleotide sequence; or
(d) hybridizing with one of the sequences (a), (b) or (c) a sequence;
under the assumption that the DNA molecule according to paragraph (d) contains at least one part encoding a mature protein of the TGF-β family.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к предмету п. п. 2-10 формулы изобретения. Дальнейшие признаки и преимущества изобретения следуют из описания предпочтительных вариантов осуществления и чертежей. Ниже кратко описываются протоколы (схемы) последовательностей и чертежи. Other embodiments of the present invention relate to the subject of claims 2-10. Further features and advantages of the invention follow from the description of preferred embodiments and drawings. The protocols (diagrams) of sequences and drawings are briefly described below.
В SEQ ID NO 1 представлена полная нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей TGF- β -протеин MP-52. ATG - Стартовый кодон начинается с нуклеотида 640. "Старт" зрелого протеина начинается после нуклеотида 1782.
В SEQ ID NO 2 представлена полная аминокислотная последовательность TGF- β -протеина MP-52, которая производится от указанной в SEQ ID NO 1 нуклеотидной последовательности. Последовательности SEQ ID NO1 и SEQ ID NO2 приведены в графической части.
На фиг. 1 представлено сравнение аминокислотной последовательности MP-52 с некоторыми членами семейства BMP-протеинов с началом на первом из семи сохранившихся цистеиновых остатков. Знак * обозначает, что аминокислота одинакова во всех сравниваемых протеинах; знак + обозначает, что аминокислота совпадает по меньшей мере в одном из протеинов по сравнению с MP-52.In FIG. 1 shows a comparison of the amino acid sequence of MP-52 with some members of the BMP protein family with the start of the first of the seven remaining cysteine residues. The * sign indicates that the amino acid is the same in all compared proteins; the + sign indicates that the amino acid coincides in at least one of the proteins compared to MP-52.
На фиг. 2 представлены нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые применяются в настоящем изобретении, и сравнение этих последовательностей с известными членами TGF- β -семейства. M обозначает A или C; S обозначает C или G; R обозначает A или G; и K обозначает G или T, "2a" обозначает последовательность праймера OD; "2b" обозначает последовательность праймера OID. In FIG. 2 shows the nucleotide sequences of oligonucleotide primers that are used in the present invention, and a comparison of these sequences with known members of the TGF-β family. M is A or C; S is C or G; R is A or G; and K is G or T, "2a" is the OD primer sequence; "2b" denotes the sequence of the OID primer.
Настоящее изобретение охватывает по меньшей мере кодирующую зрелый протеин часть и в случае необходимости функциональную часть указанной в SEQ ID NO 1 нуклеотидной последовательности, а также последовательности, которые соответствуют этой последовательности в рамках вырожденности генетического кода, и аллельные производные таких последовательностей. Далее, настоящее изобретение охватывает также последовательности, гибридизирующиеся с такого рода последовательностями, при предположении, что такая молекула ДНК содержит часть, кодирующую зрелый протеин TGF- β -семейства. The present invention encompasses at least the coding for the mature protein part and, if necessary, the functional part of the nucleotide sequence indicated in
Понятие "функциональная часть" в смысле настоящего изобретения обозначает часть протеина, которая в состоянии действовать, как, например, часть сигнального пептида, пропептида, соответственно, зрелого протеина, т.е. выполнять по меньшей мере одну из биологических функций естественных частей протеина MP-52. The term "functional part" in the sense of the present invention refers to a part of a protein which is able to act, such as, for example, a part of a signal peptide, propeptide or mature protein, i.e. perform at least one of the biological functions of the natural parts of the MP-52 protein.
Кодирующая зрелую часть протеина область простирается от нуклеотидов 1783-2142 указанной в SEQ ID NO 1 последовательности. В случае необходимости, молекула ДНК может еще содержать функциональные части указанной в SEQ ID NO 1 последовательности, а именно кодирующие сигнальную и/или пропептидную часть нуклеотидные последовательности. Особенно предпочтительно молекула ДНК содержит последовательность сигнальной и пропептидной части и часть зрелого протеина, т. е. нуклеотиды 640-2142 указанной в SEQ ID NO 1 последовательности. С другой стороны, молекула ДНК, наряду с кодирующей зрелый протеин частью, также может содержать еще функциональные сигнальные и/или пропептидные части других протеинов, в особенности других протеинов TGF- β -семейства, например вышеуказанных BMP-протеинов. Соответствующие нуклеотидные последовательности можно представить из вышеуказанных ссылок, на раскрытие которых здесь ссылаются. The region encoding the mature portion of the protein extends from nucleotides 1783-2142 of the sequence indicated in
Далее настоящее изобретение включает также молекулу ДНК, такую, как указанная выше, которая дополнительно между нуклеотидами 1270 и 1271 указанной в SEQ ID NO 1 последовательности содержит некодирующую интрононую последовательность. Эта интрононая последовательность содержится в депонированной в DSM плазмиде SKL 52 (H3) MP 12, которая имеет геномную последовательность нуклеиновых кислот MP-52. Further, the present invention also includes a DNA molecule, such as the one indicated above, which further comprises a non-coding intronon sequence between nucleotides 1270 and 1271 of the sequence indicated in
Изобретение также охватывает кодированную фагом λ 15. 1 кДНК-последовательность MP-52-протеина. Эта последовательность начинается с нуклеотида 321 указанной в SEQ ID NO 1 последовательности. The invention also encompasses phage encoded λ15. 1 cDNA sequence of MP-52 protein. This sequence begins with nucleotide 321 specified in
Хотя аллельные, вырожденные и гибридизирующие последовательности, которые входят в настоящее изобретение, имеют структурные различия на основании незначительных изменений в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности, кодированные такого рода последовательностями протеины обладают еще по существу такими же полезными свойствами, которые делают возможным их использование в принципе для таких же применений в медицине. Although the allelic, degenerate and hybridizing sequences that are included in the present invention have structural differences based on minor changes in the nucleotide and / or amino acid sequence, the proteins encoded by these sequences have essentially the same useful properties that make them possible to use in principle for the same medical applications.
Согласно настоящему изобретению, обозначение "гибридизация" представляет собой обычные условия гибридизации, предпочтительно условия с концентрацией соли 6 х SSC при 62-66oC, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа, промывкой с помощью 0,6 х SSC, 0,1% SDS, при 62-66oC. Особенно предпочтительно обозначение "гибридизация" относится к строгим условиям гибридизации с концентрацией соли 4 х SSC при 62-66oC, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа, промывкой с помощью 0,1 х SSC, 0,1% SDS, при 62-66oC.According to the present invention, the designation "hybridization" represents the usual hybridization conditions, preferably conditions with a salt concentration of 6 x SSC at 62-66 o C, followed by 1 hour washing with 0.6 x SSC, 0.1 % SDS, at 62-66 ° C. The term “hybridization” is particularly preferred for stringent hybridization conditions with a salt concentration of 4 x SSC at 62-66 ° C., followed by 1 hour washing with 0.1 x SSC, 0.1% SDS, at 62-66 ° C.
Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются ДНК-последовательности, как указанные выше, которые получают от позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, как, например, свинья, коровы и грызуны, как, например, крысы или мыши, и в особенности от приматов, как, например, люди. Preferred embodiments of the present invention are DNA sequences, as described above, which are obtained from vertebrates, preferably mammals, such as pigs, cows and rodents, such as rats or mice, and especially primates, such as people.
Особенно предпочтительной формой осуществления настоящего изобретения является указанная в SEQ ID NO 1 и обозначаемая как MP-52 последовательность. Транскрипты MP-52 получаются из эмбриональной ткани и кодируют протеин, который проявляет значительную гомологию аминокислот по отношению к зрелой части BMP-образных протеинов (см. фиг. 1). Протеиновые последовательности BMP 2 (=BMP 2A) и BMP 4 (=BMP 2B) описаны Wozney и др., Science, 242 (1988), 1528-1534. Соответствующие последовательности BMP 5, BMP 6 и BMP 7 описаны Celeste и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, (1990), 9843-9847. Некоторые типичные гомологии последовательностей, которые специфичны для известных BMP-последовательностей, находятся также в пропептидной части MP-52, в то время как другие части предшественника MP-52 имеют значительные различия с BMP-предшественниками. A particularly preferred embodiment of the present invention is that indicated in
Следующим предметом настоящего изобретения является вектор, который содержит по меньшей мере одну копию предлагаемой согласно изобретению молекулы ДНК. В такого рода векторе предлагаемая согласно изобретению ДНК-последовательность предпочтительно оперативно связана с последовательностью, контролирующей экспрессию. Такие векторы пригодны для получения TGF- β -образных протеинов в стабильно- или временно-трансформированных клетках. Различные системы животных, растений, грибов и бактерий можно применять для трансформации и последующего культивирования. Предлагаемые согласно изобретению векторы предпочтительно содержат необходимые для репликации в клетке-хозяине последовательности и автономно реплицируемы. Далее, предпочтительно применение векторов, которые содержат селектируемые маркерные гены, благодаря чему может быть доказана трансформация клетки-хозяина. The next subject of the present invention is a vector that contains at least one copy of the proposed according to the invention DNA molecule. In such a vector, the DNA sequence of the invention is preferably operably linked to an expression control sequence. Such vectors are suitable for producing TGF-β-like proteins in stably or temporarily transformed cells. Various systems of animals, plants, fungi and bacteria can be used for transformation and subsequent cultivation. The vectors of the invention preferably contain the sequences necessary for replication in the host cell and are autonomously replicable. Further, it is preferable to use vectors that contain selectable marker genes, whereby transformation of the host cell can be proved.
Другим предметом изобретения является клетка-хозяин, которая трансформирована с помощью предлагаемой согласно изобретению ДНК или предлагаемого согласно изобретению вектора. Примеры пригодных клеток-хозяев включают различные эукариотные и прокариотные клетки, как, например, E. coli, клетки насекомых, клетки растений, клетки млекопитающих и грибы, как, например, дрожжи. Another subject of the invention is a host cell that has been transformed with the DNA of the invention or of the vector of the invention. Examples of suitable host cells include various eukaryotic and prokaryotic cells, such as, for example, E. coli, insect cells, plant cells, mammalian cells and fungi, such as yeast.
Следующим предметом изобретения является протеин TGF- β -семейства, который кодируется ДНК-последовательностью по п. 1 формулы изобретения. Предлагаемый согласно изобретению протеин предпочтительно содержит указанную в SEQ ID NO 2 аминокислотную последовательность или, в случае необходимости, ее функциональные части и обладает биологическими свойствами, как, например, индуктивные для ткани, в особенности остеоиндуктивные, и/или митогенные способности, которые могут быть пригодны для терапевтического применения. Вышеуказанные признаки протеина могут изменяться в зависимости от образования гомодимеров или гетеродимеров. Такие структуры могут оказаться также пригодными для клинических применений. A further subject of the invention is a protein of the TGF-β family, which is encoded by the DNA sequence of
Биологические свойства предлагаемых согласно изобретению протеинов, в особенности митогенный и остеоиндуктивный потенциал, можно определять, например, путем испытания согласно Seyedin и др., PNAS, 82 (1985), 2267-2271; или Sampath и Reddi, PNAS, 78 (1981), 7599-7603. The biological properties of the proteins according to the invention, in particular the mitogenic and osteoinductive potential, can be determined, for example, by testing according to Seyedin et al., PNAS, 82 (1985), 2267-2271; or Sampath and Reddi, PNAS, 78 (1981), 7599-7603.
Другим предметом настоящего изобретения является способ получения протеина TGF- β -семейства, который отличается тем, что культивируют трансформированную с помощью предлагаемой согласно изобретению ДНК или предлагаемого согласно изобретению вектора клетку-хозяина и TGF- β -протеин получают из клетки и/или надосадочной жидкости после культивирования. Такой способ включает культивирование трансформированной клетки-хозяина в пригодной питательной среде и очистку полученного TGF- β -образного протеина. Таким образом способ позволяет получить достаточное количество желательного протеина для использования при лечении в медицине или при тех применениях, где употребляют методы с использованием культуры клеток, при которых необходимы факторы роста. Клеткой-хозяином может быть бактерия, как, например, Bacillus или E. coli; гриб, как правило, дрожжи; клетка растения, как, например, табак, картофель или Arabidopsis; или клетка животного, в особенности линия клеток позвоночного животного, как, например, MO-, COS- или CHO-линии клеток; или линия клеток насекомых. Another subject of the present invention is a method for producing a protein of the TGF-β family, which is characterized in that the host cell transformed with the DNA according to the invention or the vector according to the invention is cultured and the TGF-β protein is obtained from the cell and / or supernatant after cultivation. Such a method involves culturing the transformed host cell in a suitable nutrient medium and purifying the resulting TGF-β-like protein. Thus, the method allows to obtain a sufficient amount of the desired protein for use in medical treatment or in those applications where methods using cell culture are used in which growth factors are necessary. The host cell may be a bacterium, such as, for example, Bacillus or E. coli; mushroom, usually yeast; a plant cell, such as tobacco, potato or Arabidopsis; or an animal cell, in particular a vertebrate cell line, such as, for example, an MO, COS or CHO cell line; or insect cell line.
Еще одним следующим предметом настоящего изобретения является приготовление фармацевтических композиций, которые содержат фармацевтически эффективное количество предлагаемого согласно изобретению TGF- β -протеина в качестве биологически активного вещества. В случае необходимости такая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество, разбавитель или наполнитель. Такая фармацевтическая композиция может применяться при заживлении ран и регенерации тканей, а также при лечении повреждений костей, хрящей, соединительных тканей, кожи, слизистой оболочки, эпителия или зубов и в случае зубных имплантатов, либо индивидуально, либо в комбинации с другими биологически активными веществами, например, с другими протеинами TGF- β -семейства или факторами роста, как, например, EGF (эпидермальный фактор роста) или PDGF (происходящий от тромбоцитов фактор роста). Далее, такую фармацевтическую композицию можно применять для предупреждения заболевания, как, например, для предупреждения остеопороза и артроза. Another further subject of the present invention is the preparation of pharmaceutical compositions which comprise a pharmaceutically effective amount of the TGF-β-protein of the invention as a biologically active substance. If necessary, such a composition includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition can be used in wound healing and tissue regeneration, as well as in the treatment of damage to bones, cartilage, connective tissues, skin, mucous membrane, epithelium or teeth and in the case of dental implants, either individually or in combination with other biologically active substances, for example, with other proteins of the TGF-β family or growth factors, such as EGF (epidermal growth factor) or PDGF (platelet-derived growth factor). Further, such a pharmaceutical composition can be used to prevent disease, such as, for example, to prevent osteoporosis and arthrosis.
Другим возможным клиническим применением предлагаемого согласно изобретению TGF- β -образного протеина является использование в качестве супрессора иммунной реакции для избежания отторжения трансплантатов органов или использование в связи с антиогенезом. Предлагаемую согласно изобретению фармацевтическую композицию можно также применять для профилактики или в косметической хирургии. Далее, применение композиции не ограничивается людьми, а ее можно применять также в случае животных, в особенности домашних животных. Another possible clinical application of the TGF-β-protein according to the invention is the use of an immune response as a suppressor to avoid organ transplant rejection or use in connection with antigenesis. The pharmaceutical composition according to the invention can also be used for prophylaxis or in cosmetic surgery. Further, the use of the composition is not limited to humans, but it can also be used in the case of animals, especially domestic animals.
Наконец, дальнейшим предметом изобретения является антитело, которое может специфически связываться с предлагаемыми согласно изобретению протеинами, или такого рода фрагмент антитела (например, Fab или Fab1). Способы получения такого специфического антитела или фрагмента антитела относятся к общему специальному знанию среднего специалиста. Предпочтительно такое антитело представляет собой моноклональное антитело. Такие антитела или фрагменты антител могут быть пригодны также для диагностических методов.Finally, a further subject of the invention is an antibody that can specifically bind to the proteins of the invention, or an antibody fragment of this kind (for example, Fab or Fab 1 ). Methods for producing such a specific antibody or antibody fragment are within the general specialist knowledge of a person skilled in the art. Preferably, such an antibody is a monoclonal antibody. Such antibodies or antibody fragments may also be suitable for diagnostic methods.
Далее, изобретение должно быть более наглядным благодаря следующему примеру. Further, the invention should be more apparent due to the following example.
Пример 1
Выделение MP-52
1.1. Полную РНК выделяют из человеческой эмбриональной ткани (в возрасте 8-9 недель) по методу Chirgwin и др., Biochemistry, 18 (1979), 5294-5299. Поли (A+)-РНК отделяют от полной РНК путем олиго (dT) - хроматографии согласно инструкциям изготовителя (Stratagene Poly (A) Quick-колонки).Example 1
Isolation of MP-52
1.1. Complete RNA was isolated from human embryonic tissue (aged 8–9 weeks) by the method of Chirgwin et al., Biochemistry, 18 (1979), 5294-5299. Poly (A +) - RNA is separated from total RNA by oligo (dT) chromatography according to the manufacturer's instructions (Stratagene Poly (A) Quick Column).
1.2. Для обратной реакции транскрипции 1-2,5 мкг поли (A+)-РНК в течение 5 минут нагревают при 65oC и быстро охлаждают льдом. Реакционная смесь содержит 27 ед. РНК - Guard (Pharmacia), 2,5 мкг олиго (dT) 12-18 (Pharmacia), 5 х буфер (250 ммоль/л ТРИС/HCl, pH 8,5; 50 ммоль/л MgCl2; 50 ммоль/л ДТТ (дитиотреитола); 5 ммоль/л любого дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфата); 600 ммоль/л KCl) и 20 ед. AMV обратной транскриптазы (Boehringer Mannheim) на 1 мкг поли (A+)-РНК. Реакционную смесь (25 мкл) инкубируют в течение 2 часов при 42oC.1.2. For the reverse transcription reaction, 1-2.5 μg of poly (A +) - RNA is heated at 65 ° C for 5 minutes and quickly cooled with ice. The reaction mixture contains 27 u RNA - Guard (Pharmacia), 2.5 μg oligo (dT) 12-18 (Pharmacia), 5 x buffer (250 mmol / L TRIS / HCl, pH 8.5; 50 mmol / L MgCl 2 ; 50 mmol / L DTT (dithiothreitol); 5 mmol / L of any dNTP (deoxynucleoside triphosphate); 600 mmol / L KCl) and 20 units. AMV reverse transcriptase (Boehringer Mannheim) per 1 μg poly (A +) - RNA. The reaction mixture (25 μl) was incubated for 2 hours at 42 o C.
1.3. Указанные на фиг. 2 дезоксинуклеотидные праймеры OD и OID получают на автоматическом ДНК-синтезаторе (Biosearch). Очистку осуществляют путем денатурирующего электрофореза на полиакриламидном геле и выделения основной полосы из геля путем изотахофореза. Путем сравнения последовательностей нуклеиновых кислот известных членов TGF- β -семейства и выбора областей с самым высоким сохранением проектируют олигонуклеотиды. Сравнение этих областей представлено на фиг. 2. Для облегчения клонирования оба нуклеотида содержат сайты рестрикции EcoRI и OD содержит дополнительно сайт рестрикции NcoI на своем 5'-конце. 1.3. Referring to FIG. 2 deoxynucleotide primers OD and OID are obtained on an automatic DNA synthesizer (Biosearch). The purification is carried out by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and isolating the main strip from the gel by isotachophoresis. By comparing the nucleic acid sequences of known members of the TGF-β family and selecting regions with the highest conservation, oligonucleotides are designed. A comparison of these areas is shown in FIG. 2. To facilitate cloning, both nucleotides contain EcoRI restriction sites and the OD additionally contains an NcoI restriction site at its 5'-end.
1.4. В случае полимеразной цепной реакции (PCR-реакции) применяют 20 нг соответствующей поли (A+)-РНК кДНК из исходного материала. Реакцию осуществляют в объеме 50 мкл, и он содержит 1 х PCR-буфер (16,6 ммоль/л (NH4)2SO4; 67 ммоль/л ТРИС/HCl, pH 8,8; 2 ммоль/л MgCl2; 6,7 мкмоль/л ЭДТК, 10 ммоль/л β -меркапто-этанола; 170 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота (Gibco); 200 мкмоль/л любого дНТФ (Pharmacia); 30 пкмоль каждого олигонуклеотида (OD и OID) и 1,5 ед. Taq-полимеразы (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). Реакционную смесь покрывают парафином и осуществляют 40 циклов полимеразной цепной реакции. Продукты полимеразной цепной (PCR) реакции очищают путем экстракции с помощью фенола с хлороформом и концентрируют путем осаждения этанолом.1.4. In the case of the polymerase chain reaction (PCR reaction), 20 ng of the corresponding poly (A +) - RNA cDNA from the starting material is used. The reaction is carried out in a volume of 50 μl, and it contains 1 x PCR buffer (16.6 mmol / L (NH 4 ) 2 SO 4 ; 67 mmol / L TRIS / HCl, pH 8.8; 2 mmol / L MgCl 2 ; 6.7 μmol / L EDTA, 10 mmol / L β-mercapto-ethanol; 170 μg / ml bovine serum albumin (Gibco); 200 μmol / L any dNTP (Pharmacia); 30 pmol each oligonucleotide (OD and OID) and 1.5 units of Taq polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). The reaction mixture is coated with paraffin and 40 cycles of polymerase chain reaction are carried out. Products of the polymerase chain (PCR) reaction are purified by extraction with phenol and chloroform and concentrated by ethanol REPRESENTATIONS.
1.5. Продукт полимеразной цепной реакции расщепляют с помощью рестрикционных ферментов SphI (Pharmacia) и ALWNI (Biolabs) соответственно инструкциям изготовителя. 1.5. The polymerase chain reaction product is digested with restriction enzymes SphI (Pharmacia) and ALWNI (Biolabs) according to the manufacturer's instructions.
1.6. Продукты рестрикционного расщепления фракционируют путем электрофореза на агарозном геле. После окрашивания с помощью этидиумбромида нерасщепленные продукты амплификации вырезают из геля и выделяют путем экстракции фенолом. Полученную ДНК затем очищают путем двукратной экстракции фенолом с хлороформом. 1.6. Restriction cleavage products are fractionated by agarose gel electrophoresis. After staining with ethidium bromide, undigested amplification products are excised from the gel and isolated by phenol extraction. The resulting DNA is then purified by double extraction with phenol and chloroform.
1.7. После осаждения этанолом одну четвертую или одну пятую часть выделенной ДНК реамплифицируют, причем используют такие же условия, как и для первичной амплификации, кроме того, что число циклов уменьшается до 13. Продукты реамплификации (повторной амплификации) очищают, разрезают с помощью таких же ферментов, как указанные выше, и неразрезанные продукты, как пояснено выше для продуктов амплификации, выделяют из агарозных гелей. Стадию реамплификации (повторной амплификации) повторяют дважды. 1.7. After ethanol precipitation, one fourth or one fifth of the extracted DNA is re-amplified, and the same conditions as for primary amplification are used, except that the number of cycles is reduced to 13. The products of re-amplification (re-amplification) are purified, cut using the same enzymes, as described above, and uncut products, as explained above for amplification products, are isolated from agarose gels. Stage reamplification (re-amplification) is repeated twice.
1.8. После последнего выделения из геля продукты амплификации расщепляют благодаря 4 ед. EcoRI (Pharmacia) при рекомендуемых изготовителем условиях. Одну четвертую часть смеси после рестрикции лигируют с расщепленным с помощью EcoRI вектором pBLuescriptII SK+ (Stratagene). После лигирования 24 клона анализируют далее путем секвенирования. Расщепленный с помощью ALWNI и SpHI образец дает новую последовательность, которая обозначается как MP-52. Другие клоны содержат преобладающие BMP 6-последовательности и один клон содержит BMP 7-последовательность. Клон на 3'-конце дополняют кДНК согласно подробно описанному Frohmann методу (Амплификации, опубликовано Perkin-Elmer Corp. , Issue 5 (1990), с. 11-15). Такую же эмбриональную мРНК, которая была применена для выделения первого фрагмента MP-52, подвергают обратной транскрипции как описано выше. Амплификацию осуществляют при применении адаптерного праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) и внутреннего праймера (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) MP-52-последовательности. Продукты амплификации реамплифицируют (повторно амплифицируют) при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) MP-52-последовательности. Продукты реамплификации, после рестрикционного расщепления с помощью NcoI, клонируют в расщепленном таким же образом векторе [pUC 19 (Pharmacia N 27-4951-01) с одним измененным составным (multiplen) участком клонирования, который содержит единственный сайт рестрикции NcoI], и секвенируют. Клоны характеризуют путем соединения внахлестку их последовательности с 3'-концом известной MP-52-последовательности. Один из них используют в качестве зонда для скрининга человеческого геномного банка генов (Stratagene N 946203) согласно описанному подробно Ausubel и др. методу (Current Protocolsin Molecular Biology, опубликовано Greene Publishing Associates und Wiley-Intersience /1989/). Из 8•105 λ -фагов выделяют фаг ( λ 2.7.4), который содержит вставку примерно из 20 кб и депонирован в DSM под номером 7387. Этот клон, наряду с выделенной из мРНК путем описанных методов амплификации последовательностью, содержит другие, несущие информацию последовательности /Sequenzinformationen/ на 5'-конце.1.8. After the last isolation from the gel, the amplification products are cleaved thanks to 4 units. EcoRI (Pharmacia) under manufacturer's recommended conditions. One fourth of the mixture after restriction is ligated with the EcoRI digested pBLuescriptII SK + vector (Stratagene). After ligation, 24 clones are further analyzed by sequencing. Cleaved using ALWNI and SpHI, the sample gives a new sequence, which is designated as MP-52. Other clones contain
Для анализа путем секвенирования HindIII-фрагмент длиной примерно 7,5 кб субклонируют в разрезанном таким же образом векторе (Bluescript SK, Stratоgene N 212206). Эта, обозначаемая как SKL 52 (H3) MP12, плазмида также хранится в DSM под номером 7353. Представленная в SEQ ID NO 1 несущая информацию последовательность происходит от фага λ 2.7.4. ATG в положении 640 представляет собой первый ATG в рамке считывания (в положении 403 появляется стоп-кодон). На основании указанной последовательности нужно предполагать, что при этом речь идет о стартовом кодоне для трансляции. For analysis by sequencing, a HindIII fragment of approximately 7.5 kb is subcloned into a vector cut in the same manner (Bluescript SK, Stratogenene N 212206). This plasmid, also designated as SKL 52 (H3) MP12, is also stored in DSM under the number 7353. The information-carrying sequence shown in
Геномная ДНК содержит интрон длиной примерно 2 кб между парами оснований 1270 и 1271 SEQ ID NO 1. Последовательность интрона не показана. Правильность места сплайсинга подтверждается путем секвенирования продукта амплификации, который происходит от кДНК, содержащей эту область. Эти несущие информацию последовательности получают с помощью слегка модифицированного метода, который подробно описан Frohman (Амплификации, опубликовано Perkin-Elmer-Corporation, Issue 5, (1990), с. 11-15). Такую же эмбриональную РНК, которую использовали для изолирования 3'-конца MP-52, подвергают обратной транскрипции при применении внутреннего, ориентированного в 5'-направлении, праймера MP-52-последовательности (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT). Поли-A-конец (хвост) присоединяют к 5'-концу первой кДНК-нити при применении концевой трансферазы. Осуществляют двухстадийную амплификацию, сначала путем применения состоящего из олиго-dT и адаптерной последовательности праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC /T 16/) и, во-вторых, при применении адаптерного праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) и внутреннего праймера (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) МP-52-последовательности. Продукты амплификации реамплифицируют (повторно амплифицируют) при применении такого же адаптерного праймера и перекрывающего (соединяющегося внахлестку) внутреннего праймера (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) MP-52-последовательности. Затем продукты реамплификации повторно амплифицируют при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) MP-52-последовательности. Продукты повторной амплификации с помощью гладких концов клонируют в векторе (Bluescript, SK, Stratagene N 212206), который расщеплен с помощью EcoRV. Клоны характеризуют путем перекрывания их последовательности с помощью ДНК фага λ 2.7.4. Genomic DNA contains an intron of approximately 2 kb in length between base pairs 1270 and 1271 of
Далее, кДНК-банк, полученный из РНК человеческих фибробластов и клонированный в фаге λ qt 10, подвергают скринингу. При этом исследуют 2 х 106 фагов, причем в качестве радиоактивного зонда служит величиной примерно 1 кб фрагмент геномной MP-52-ДНК (2-ой экзон вплоть до сайта рестрикции HindIII в неподвергнутой трансляции 3'-области). Выделяют 17 пятен (зон гемолиза) смеси, которые дополнительно исследуют с помощью PCR при применении праймеров из 5'-3'-области MP-52-последовательности. После этого выбирают и разъединяют 8 стерильных пятен. кДНК выделяют из фага путем частичного расщепления с помощью EcoRI и клонируют в также расщепленном с помощью EcoRI Bluescript-векторе. Next, a cDNA bank obtained from RNA of human fibroblasts and cloned in
Секвенирование одной из результирующих плазмид SK 52 L 15. IMP25 показывает, что самый длинный фаг (15.1) начинается с нуклеотида N 321 SEQ ID K N 1. Далее, путем секвенирования подтверждается место сплайсинга (нуклеотид 1270). Sequencing of one of the resulting plasmids SK 52 L 15. IMP25 shows that the longest phage (15.1) begins with nucleotide N 321
Плазмида SKL 52 (H3) MP 12 хранится под номером 7353 в DSM (немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток, Mascheroder Weg 1b, 38124, Braunschweig) с 10 декабря 1992 г. Plasmid SKL 52 (H3)
Фаг λ 2.7.4. хранится под номером 7387 в DSM с 13 января 1993 г. Phage λ 2.7.4. stored at 7387 at DSM from January 13, 1993
Плазмида SK 52 L15. IMP25 хранится под номером 8421 в DSM с 16 июля 1993 г.
Пример 2
Экспрессия MP-52
Для экспрессии MP-52 испытывают различные системы. Применение вирусов оcповакцины в качестве системы экспрессии подробно и как служащее руководством для специалиста описано в Curren Protocols в Molecular Biology (Ausubel и др., Greene Publishing Associates and Wilay-Interscience, Wiley and Sans), в дальнейшем сокращенно называемых CP, в главе 16, часть 16.15 - 16.18. Система основана на том, что чужеродные ДНК при применении определенных векторов путем гомологичной рекомбинации можно интегрировать в геном вируса осповакцины. Для этой цели используемый вектор содержит ТК (тимидинкиназа) ген из генома осповакцины. Для того чтобы сделать возможной селекцию в отношении рекомбинантных вирусов, вектор, далее, содержит E.coli-ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза-ген (gpt)/Falkner и др., J. Virol. 62 (1988), 1849-18544/. В этом векторе клонируют кДНК со всей кодирующей областью MP-52. кДНК происходит от плазмиды SK 52L15. IMP25 (DSM, номер 8421), которую для удаления большой части не подвергнутой трансляции 5'-области, однако, сначала подвергают делеции и промежуточно клонируют. Для этого плазмиду SK 52L15. IMP25 линеаризируют с помощью SalI и 5'-конец последовательно подвергают делеции с помощью набора ExoIII/Mung Bean (Stratagene # 200 330) согласно указаниям изготовителя. После рестрикции с помощью BamHI в разном степени подвергшиеся делеции MP-52-кДНК на агарозогеле отделяют от остаточного вектора, изолируют и согласно стандартным методам (Sambrook и др. , Molecular Cloning, 2-е издание, Colg Spring Harbor Laboratory Press, 1989) промежуточно клонируют в подвергнутом рестрикции с помощью EcoRV и BamHI pBLuescriptII SK-векторе (Stratagene #212206) /p.SK52S/. Все рестрикции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Дополнительное секвенирование с помощью секвеназы (USB/Amersham #70770) дает, между прочим, клон, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID NO 1 (на 64 пары оснований удален от стартового кодона). Из него за счет рестрикции с помощью SalI и SacI изолируют кДНК-вставку и клонируют в таким же образом расщепленном векторе для рекомбинации в осповакцине. Результирующую плазмиду (pBPIM52S) хранят в DSM (под номером 9217) с 24 мая 1994 г. и используют для получения рекомбинантных вирусов осповакцины. Для этого до 80% конфлюэнтных 14 3B клеток (HuTk-, ATCC CRL 8303) в чашках для культур диаметром 35 мм инфицируют с помощью вируса осповакцины дикого типа в 2 мл PBS (фосфатно-буферного рассола) в течение 30 минут при комнатной температуре и при встряхивании по случаю (1 вирус на 10 клеток). После отсасывания надосадочной жидкости и добавки 2 мл питательной среды (MEM, Gibco BRL #041-01095) инкубируют в течение 2 часов при 37oC. Среду затем удаляют, и трансформации этих клеток достигают с помощью 100 нг pВPIMP52S, 2 мкг носителя ДНК (телячья вилочковая железа, Boehringer Mannheim # 104175) и 10 мкл липофектина (Gibco BRL # 18292-011) в 1 мл MEM в течение 15 часов при 37oC. После добавки 1 мл MEM с 20% FCS (Gibco BRL # 011-06290) инкубируют в течение следующих 24 часов при 37oC и лизированные клетки затем замораживают. gpt-Селекцию на ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу и изоляцию и амплификацию отдельных рекомбинантных вирусов осуществляют по существу как описано в части 16.17 CP, с тем различием, что применяют РК-13 клетки (ATCC CCL 37).Example 2
Expression MP-52
Various systems are tested for the expression of MP-52. The use of vaccine vaccine viruses as an expression system is described in detail and as a guide for a specialist in Curren Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wilay-Interscience, Wiley and Sans), hereinafter abbreviated as CP, in chapter 16, part 16.15 - 16.18. The system is based on the fact that foreign DNA, when using certain vectors by homologous recombination, can be integrated into the genome of the vaccinia virus. For this purpose, the vector used contains the TK (thymidine kinase) gene from the smallpox vaccine genome. In order to enable selection for recombinant viruses, the vector further comprises E. coli-xanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase-gene (gpt) / Falkner et al., J. Virol. 62 (1988), 1849-18544 /. In this vector, cDNA is cloned with the entire coding region of MP-52. cDNA is derived from plasmid SK 52L15. IMP25 (DSM, number 8421), which, to remove a large portion of the undeveloped 5'-region, however, is first deleted and intermediate cloned. For this, plasmid SK 52L15. IMP25 is linearized using SalI and the 5'-end is subsequently deleted by using the ExoIII / Mung Bean kit (Stratagene # 200 330) according to the manufacturer's instructions. After restriction by BamHI, the MP-52 cDNAs that were deletion on the agarozogel to different degrees were separated from the residual vector, isolated and, according to standard methods (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Colg Spring Harbor Laboratory Press, 1989) intermediate restriction cloned using EcoRV and BamHI pBLuescriptII SK vector (Stratagene # 212206) /p.SK52S/. All restriction is carried out according to the manufacturer's instructions. Additional sequencing using sequenase (USB / Amersham # 70770) yields, among other things, a clone that starts with nucleotide 576 in SEQ ID NO 1 (64 base pairs away from the start codon). From it, by restriction with SalI and SacI, the cDNA insert is isolated and cloned in the same split vector for recombination in vaccinia. The resulting plasmid (pBPIM52S) was stored in DSM (numbered 9217) from May 24, 1994 and used to produce recombinant vaccinia viruses. For this, up to 80% of confluent 14 3B cells (HuTk-, ATCC CRL 8303) in culture dishes with a diameter of 35 mm are infected with the wild-type vaccinia virus in 2 ml of PBS (phosphate buffered saline) for 30 minutes at room temperature and at shaking on occasion (1 virus per 10 cells). After suction of the supernatant and the addition, 2 ml of culture medium (MEM, Gibco BRL # 041-01095) were incubated for 2 hours at 37 ° C. The medium was then removed and these cells were transformed with 100 ng pBPIMP52S, 2 μg DNA carrier ( calf thymus, Boehringer Mannheim # 104175) and 10 μl of lipofectin (Gibco BRL # 18292-011) in 1 ml of MEM for 15 hours at 37 o C. After adding 1 ml of MEM with 20% FCS (Gibco BRL # 011-06290 ) incubated for the next 24 hours at 37 o C and lysed cells are then frozen. gpt-Selection for xanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase and isolation and amplification of individual recombinant viruses is carried out essentially as described in section 16.17 CP, with the difference that PK-13 cells are used (ATCC CCL 37).
Интеграцию MP-52-кДНК в вирусный геном подтверждают путем анализа при использовании блоттинг-метода по Саузерну и дот-блоттинга (CP, часть 16.18). Рекомбинантный вирус используют для экспрессионных анализов в линии клеток 143 B (HuTk-, ATCC CRL, 8303, человек). Конфлюэнтные клетки инфицируют с помощью соответствующего числу клеток числа вирусов в течение 45 минут при 37oC и затем добавляют соответствующую питательную среду (MEM, Gibco BRL # 041-01095) с 10% FCS и пенициллин/стрептомицин (1:500, Gibco BRL # 043-0514 OH). Спустя 6 часов при 37oC удаляют среду, клетки промывают дважды с помощью, например, HBSS (Gibco BRL # 042-0418 OM) и добавляют питательную среду (например, MEM) без FCS. После продуцирования в течение 20-22 часов собирают надосадочную жидкость культуры клеток. Анализ экспрессии осуществляют путем вестерн-блоттинга по стандартным методам (CP, часть 10.8). Для этого протеины осаждают из 100-500 мкл недосадочной жидкости культуры клеток путем добавки эквивалентного объема ацетона и инкубации по меньшей мере в течение 1 часа на льду и отделяют путем центрифугирования. После повторного суспендирования осадка в заданном буфере (7 М мочевины, 1% SDS, 7 ммоль дигидрофосфата натрия, 0,01% бромфенолового синего и, в случае необходимости, 1% β -меркаптоэтанола) осуществляют разделение на 15%-ном полиакриламидном геле. В качестве маркерных протеинов используют предварительно окрашенный стандарт по молекулярной массе протеина (Gibco BRL # 26041-020). Перенос на PVDF-мембрану (Immobilon # IPVH00010) и блокирование мембраны осуществляют стандартными методами.The integration of MP-52 cDNA into the viral genome is confirmed by analysis using Southern blotting and dot blotting (CP, part 16.18). Recombinant virus is used for expression assays in the 143 B cell line (HuTk-, ATCC CRL, 8303, human). Confluent cells are infected using the appropriate cell number of viruses for 45 minutes at 37 ° C and then appropriate culture medium (MEM, Gibco BRL # 041-01095) with 10% FCS and penicillin / streptomycin (1: 500, Gibco BRL #) are added. 043-0514 OH). After 6 hours at 37 ° C., the medium is removed, the cells are washed twice with, for example, HBSS (Gibco BRL # 042-0418 OM) and culture medium (eg, MEM) without FCS is added. After production for 20-22 hours, the cell culture supernatant is collected. Expression analysis is carried out by Western blotting according to standard methods (CP, part 10.8). For this, proteins are precipitated from 100-500 μl of cell culture non-supernatant by adding an equivalent volume of acetone and incubating for at least 1 hour on ice and separated by centrifugation. After resuspension of the precipitate in a predetermined buffer (7 M urea, 1% SDS, 7 mmol sodium dihydrogen phosphate, 0.01% bromophenol blue and, if necessary, 1% β-mercaptoethanol), separation is carried out on a 15% polyacrylamide gel. As marker proteins, a pre-stained standard for molecular weight protein is used (Gibco BRL # 26041-020). Transfer to the PVDF membrane (Immobilon # IPVH00010) and blocking of the membrane is carried out by standard methods.
Для обнаружения MP-52 на мембране получают поликлональные антитела против MP-52 как в случае кур, так и также в случае кроликов. Для этого зрелую часть MP-52 с 6 гистидинами на N-конце экспрессируют в E.coli и очищают, как, например, описано Hochuli и др. (B 10/Technology, 6, 1321-1325 /1988/). С помощью обоих антител можно обнаруживать специфически экспрессию MP-52, причем димерный MP-52 менее эффективно распознается, чем мономерный. Для вестерн-блоттинга, согласно фиг. 3, применяют куриные антитела, которые специфически очищены путем ПЭГ-преципитации /Thalley и др. B 10/Technology, 8, 934-938 (1990)/ и через связанный с мембраной антиген (зрелый MP-52 с 6 гистидинами) (18, 17; Sambrook и др., Molecular Cloning, 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В качестве второго антитела используют анти-куриный IgG с присоединенной щелочной фосфатозой (Sigma A 9171). In order to detect MP-52 on the membrane, polyclonal antibodies against MP-52 are obtained both in the case of chickens and also in the case of rabbits. For this, the mature portion of MP-52 with 6 histidines at the N-terminus is expressed in E. coli and purified, as, for example, described by Hochuli et al. (
Обнаружение осуществляют с помощью набора для определения протеина Tropix Western-Light (Serva #WL10 RC), согласно указаниям изготовителя. Detection is performed using the Tropix Western-Light Protein Detection Kit (Serva # WL10 RC), as directed by the manufacturer.
Вестерн-блоттинг на фиг. 3 показывает, что только в случае рекомбинантных вирусов, однако не в случае вирусов дикого типа (без интегрированной чужеродной ДНК), появляются специфические для MP-52 полосы. Экспрессия MP-52 приводит к секретированному протеину с проявляющейся в геле при невосстанавливающих условиях молекулярной массой приблизительно 25 кДа. При восстанавливающих условиях протеин с 14-15 кДа проникает в гель. Эти результаты показывают, что MP-52 экспримируется как димерный зрелый протеин. В случае появляющихся при вестерн-блоттинг-анализе слабых полос в области выше 60 кДа речь идет, вероятно, об остатках неразрезанных протеинов-предшественников. Поведение в отношении проникания к тому же подтверждает получаемые из SEQ ID NO 2 теоретические молекулярные массы, сообразно с чем зрелый мономерный MP-52 имеет величину 13.6 кДа. Western blotting in FIG. 3 shows that only in the case of recombinant viruses, but not in the case of wild-type viruses (without integrated foreign DNA), MP-52 specific bands appear. The expression of MP-52 results in a secreted protein with a molecular weight of approximately 25 kDa that appears in the gel under non-reducing conditions. Under reducing conditions, a protein with 14-15 kDa penetrates the gel. These results indicate that MP-52 is expressed as a dimeric mature protein. In the case of weak bands appearing during western blotting analysis in the region above 60 kDa, we are probably talking about the residues of uncut precursor proteins. The penetration behavior also confirms the theoretical molecular weights obtained from
Экспрессию MP-52 и расщепление протеина-предшественника до зрелого MP-52 можно обнаружить в различных линиях клеток. Испытывали клетки C 127 (ATCC CRL, 1616, мышь), BHK 21 (ATCC CCL, 10, хомяк), MRC-5 (ATCC CCL, 171, человек) и 3TG Swiss albino (ATCC CCL, 96, мышь). The expression of MP-52 and the cleavage of the precursor protein to mature MP-52 can be detected in various cell lines. Cells C 127 (ATCC CRL, 1616, mouse), BHK 21 (ATCC CCL, 10, hamster), MRC-5 (ATCC CCL, 171, humans) and 3TG Swiss albino (ATCC CCL, 96, mouse) were tested.
Экспрессия и расщепление до зрелого MP-52 показана также в другой эукариотной системе экспрессии. Для этого кДНК MP-52 (начинающуюся с нуклеотида 576) клонируют в плазмиде экспрессии pSG5 (Stratagene # 216201). Плазмиду pSK52s подвергают рестрикции с помощью ClaI и XbaI и путем обработки T4-полимеразой делают тупыми выступающие концы MP-52-вставки. Клонирование в подвергнутом рестрикции и также с тупыми концами за счет обработки с помощью T4-полимеразы векторе p.SG5 осуществляют стандартными методами. Все ферментативные реакции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Правильную ориентацию MP-52-вставки обеспечивают за счет рестрикционного анализа и дополнительного секвенирования с помощью 17-праймера (Stratagene # 300302). Результирующую плазмиду pSG52s (хранится с 17.05.1994 г. в DSM под номером 9204) можно контрасформировать с помощью вектора, который кодирует выбираемый маркер, как, например, ген устойчивости G418, чтобы получить стабильные линии клеток. Для этой цели pSG52s контрансформируют вместе с плазмидой p3616 (хранится в DSM под номером 9203 с 17.05.1994 г.) в L929-клетки (ATCC CCL, 1, мышь) с помощью липофектина (Cibco BRL # 18292-011), согласно указаниям изготовителя. Селекцию с помощью G418 осуществляют согласно известным специалисту методам (CP, часть 9.5) и приходят к линии клеток, которая в вестерн-блоттинге продуцирует обнаруживаемый зрелый MP-52. Expression and cleavage to mature MP-52 are also shown in another eukaryotic expression system. For this, MP-52 cDNA (starting at nucleotide 576) is cloned into the pSG5 expression plasmid (Stratagene # 216201). The plasmid pSK52s is subjected to restriction with ClaI and XbaI and the protruding ends of the MP-52 insert are blunted by treatment with T4 polymerase. Cloning, subjected to restriction and also with blunt ends, by processing with the T4 polymerase p.SG5 vector is carried out by standard methods. All enzymatic reactions are carried out according to the manufacturer's instructions. The correct orientation of the MP-52 insert is provided by restriction analysis and additional sequencing using a 17 primer (Stratagene # 300302). The resulting plasmid pSG52s (stored since May 17, 1994 in DSM under the number 9204) can be counter-formed using a vector that encodes a selectable marker, such as, for example, the G418 resistance gene to obtain stable cell lines. For this purpose, pSG52s are transformed with plasmid p3616 (stored in DSM under 9203 from 05.17.1994) into L929 cells (ATCC CCL, 1, mouse) using lipofectin (Cibco BRL # 18292-011), according to the manufacturer's instructions . G418 selection is carried out according to methods known to the person skilled in the art (CP, part 9.5) and reaches a cell line that produces detectable mature MP-52 in Western blotting.
Другой вектор экспрессии для MP-52 получают при применении плазмиды pABWN (Niwa и др., Gene, 108 (1991), 193-200; и фиг. 4), который представлен в распоряжение Dr. Miyazaki. Another expression vector for MP-52 is obtained using the plasmid pABWN (Niwa et al., Gene, 108 (1991), 193-200; and Fig. 4), which is made available to Dr. Miyazaki.
Для этого HindIII-фрагмент из плазмиды p.SK52s, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID NО 1, изолируют и выступающие концы затупляют путем обработки с помощью фрагмента Кленова. Путем лигирования адаптера в оба конца фрагмента вводят сайт рестрикции NotI. Адаптер:
AGCGGCCGCT
TCGCCGGCGA
Вектор pABWN подвергают рестрикции с помощью XhoI, также обрабатывают фрагментом Кленова и дефосфорилируют с помощью кишечной щелочной фосфатазы теленка (Boehringer Mannheim). Этот фосфорилированный адаптер дополнительно лигируют так, что теперь возможна вставка MP-52-фрагмента после рестрикции с помощью NotI в генерированное NotI место разреза вектора. Результирующий вектор экспрессии ниже обозначается как HindIII-MP-52/pABWN. Все осуществляемые реакции клонирования проводят по стандартным методам (например, CP, часть 3.16). Структура HindIII-MP-52/pABWN-вектора экспрессии подтверждается путем секвенирования и получения карты рестрикции. HindIII-MP-52/pABWN содержит MP-52-последовательность, начинающуюся с нуклеотида 576 и заканчивающуюся нуклеотидом 2278 в SEQ ID NO 1.For this, the HindIII fragment from the plasmid p.SK52s, which begins with nucleotide 576 in
AGCGGCCGCT
TCGCCGGCGA
The pABWN vector is subjected to restriction with XhoI, is also treated with a Klenov fragment and dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim). This phosphorylated adapter is additionally ligated so that it is now possible to insert the MP-52 fragment after restriction with NotI into the NotI generated site of the vector cut. The resulting expression vector is hereinafter referred to as HindIII-MP-52 / pABWN. All cloning reactions carried out are carried out according to standard methods (for example, CP, part 3.16). The structure of the HindIII-MP-52 / pABWN expression vector is confirmed by sequencing and obtaining a restriction map. HindIII-MP-52 / pABWN contains an MP-52 sequence starting at nucleotide 576 and ending at nucleotide 2278 in
HindIII-MP-52/pABWN трансфицируют в L-клетки (мышиные фибробласты), и оттуда получают стабильные трансформанты. Для этого, смотря по обстоятельствам, 4 мкг плазмиды (HindIII-MP-52/pABWN или pABWN) трансфицирую в 5•105 L-клеток, находящихся в чашках для культур диаметром 6 см, при применении 20 мкл реактива Lipofect AMINE (Gibco BRL # 18324-012). Для этой цели раствор A (4 мкг соответствующей плазмиде ДНК в 200 мкл OPTI-MEM I /Gibco BRL # 31985/) осторожно смешивают с раствором B (20 мкл реактива Lipofect AMINE в 200 мкл OPTI-MEM I) и при комнатной температуре в течение 45 минут инкубируют для образования комплекса ДНК-липосомы. Во время этой процедуры клетки промывают один раз с помощью 2 мл OPTI-MEM I. Для каждой трансфекции в сосуд с ДНК-липосомным комплексом вводят 1,6 мл OPTI-MEM I. Раствор осторожно перемешивают и таким образом переслаивают промытые клетки. Клетки инкубируют с разбавленным комплексом в течение 5 часов при 37oC в CO2-содержащем инкубаторе. После инкубации добавляют 2 мл DMEM (Gibco BRL, модифицированная Dulbecco Eagle-среда) с 20% FCS. Спустя 24 часа после трансфекции среду заменяют свежей DMEM с 10% FCS. Спустя 48 часов после начала трансфекции клетки переносят в чашки для культур диаметром 10 см. Спустя 72 часа после начала трансфекции с концентрации 800 мкг/мл начинается селекция G 418. Стабильные клоны появляются спустя 1-2 недели.HindIII-MP-52 / pABWN is transfected into L cells (murine fibroblasts), and stable transformants are obtained from there. To do this, depending on the circumstances, 4 μg of the plasmid (HindIII-MP-52 / pABWN or pABWN) will be transfected into 5 • 10 5 L-cells located in 6 cm diameter culture dishes using 20 μl Lipofect AMINE reagent (Gibco BRL # 18324-012). For this purpose, solution A (4 μg of the corresponding DNA plasmid in 200 μl of OPTI-MEM I / Gibco BRL # 31985 /) is carefully mixed with solution B (20 μl of Lipofect AMINE reagent in 200 μl of OPTI-MEM I) and at room temperature for 45 minutes incubated to form a complex of DNA liposomes. During this procedure, the cells are washed once with 2 ml of OPTI-MEM I. For each transfection, 1.6 ml of OPTI-MEM I is injected into the vessel with the DNA liposome complex. The solution is gently mixed and the washed cells are thus interlaced. Cells are incubated with the diluted complex for 5 hours at 37 ° C. in a CO 2 -containing incubator. After incubation, add 2 ml of DMEM (Gibco BRL, modified Dulbecco Eagle-medium) with 20% FCS. 24 hours after transfection, the medium is replaced with fresh DMEM with 10% FCS. 48 hours after the start of transfection, the cells are transferred to 10 cm diameter culture plates. After 72 hours after the start of transfection, a concentration of G 418 begins at a concentration of 800 μg / ml. Stable clones appear after 1-2 weeks.
5 мл кондиционированной DMEM с или без FCS получают от конфлюэнтных трансформантов, которые выросли в течение 3 дней в чашке для культуры диаметром 10 см. Трансфицированные двумя различными надосадочными жидкостями культур клеток (HindIII-MP-52/pAВWN и pABWN) клетки, а также лизаты клеток исследуют путем вестерн-блоттинга. При этом в кондиционированной среде, а также в лизатах трансфицированных с помощью HindIII-MP-52/pABWN клеток найден зрелый MP-52. Клоны клонируют далее и продуцирующие MP-52 клетки, смотря по обстоятельствам, выбирают согласно вестерн-блоттинг-анализу. Оценки из вестерн-блоттинг-анализов показывают MP-52-продуцирование вплоть до 1 мг/л. 5 ml of conditioned DMEM with or without FCS is obtained from confluent transformants that grew for 3 days in a 10 cm diameter culture dish. Cells transfected with two different supernatant fluids (HindIII-MP-52 / pAWWN and pABWN) as well as lysates cells are examined by western blotting. Moreover, mature MP-52 was found in the conditioned medium, as well as in the lysates of cells transfected with HindIII-MP-52 / pABWN. The clones are further cloned and MP-52 producing cells, depending on the circumstances, are selected according to Western blot analysis. Estimates from Western blot analyzes show MP-52 production up to 1 mg / L.
Пример 3
Биологическая активность MP-52
Для того чтобы обнаружить биологическую активность MP-52 и доказать полезность настоящего изобретения для применений в медицине с целью избежания и/или лечения заболеваний костей, осуществляют различные эксперименты ин витро и ин виво.Example 3
Biological Activity MP-52
In order to detect the biological activity of MP-52 and prove the usefulness of the present invention for medical applications in order to avoid and / or treat bone diseases, various in vitro and in vivo experiments are carried out.
1. Испытание ин витро
1.1.1. In vitro test
1.1.
Так как усиление синтеза гликозаминогликана (GAG) в хондроцитах после TGF- β -стимуляции описано (Hiraki и др., Biochimica et Biophysica Acta, 969 (1988), 91-99), исследуют, оказывает ли также MP-52 это влияние. При применении надосадочных жидкостей культур клеток (DMEM с 10% FCS), продуцирующих MP-52 трансформантов L-клеток (трансфекция с помощью HindIII-MP-52/pABWN), изучают хондрогенную активность MP-52 в первичных культурах из зародышевых конечностей крыс. Since enhancing the synthesis of glycosaminoglycan (GAG) in chondrocytes after TGF-β stimulation has been described (Hiraki et al., Biochimica et Biophysica Acta, 969 (1988), 91-99), it is investigated whether MP-52 also has this effect. Using supernatants of cell cultures (DMEM with 10% FCS) producing MP-52 L-cell transformants (transfection with HindIII-MP-52 / pABWN), the chondrogenic activity of MP-52 was studied in primary cultures from rat germinal limbs.
Для этой цели используют 44 конечности крысиных плодов в возрасте 16 дней. После трипсинирования, полученные клетки в F-12-среде (питательная смесь Ham's F-12, Gibco BRL # 21700) с 10% FCS помещают на покрытые коллагеном типа 1 пластины с 24 углублениями в количестве 3•105 клеток и культивируют примерно 2 дня вплоть до конфлюэнции. К 500 мкл питательной среды (F-12-среда с 10% FCS), смотря по обстоятельствам, добавляют 56 мкл кондиционированной среды (KM) трансфектантов за счет HindIII-MP-52/pABWN L-клеток, трансфектантов за счет pABWN-L-клеток или только среду (DMEM с 10% FCS). Через промежуток времени 0, 3, 6 и 9 дней применяют F-12-среду с 10% FCS, а также соответствующие добавки. Все три дня осуществляют перемену среды с соответствующими добавками. Затем следующие 2 дня культуру культивируют в F-12-среде без FCS в присутствии соответствующих добавок (кондиционированные среды, соответственно, контрольная среда) и после этого добавляют 35S-сульфат за 6 часов. Инкорпорированную в полисахариды 35S определяют после проназа-E-переваривания и преципитации, как описано Hiraki и др. (Biochimica et Biophisica Acta, 969 (1988), 91-99).For this purpose, use 44 limbs of rat fetuses at the age of 16 days. After trypsinization, the obtained cells in F-12 medium (Ham's F-12 nutrient mixture, Gibco BRL # 21700) with 10% FCS are placed on
Как видно из таблицы, 1 надосадочные жидкости культур клеток продуцирующих MP-52 трансфектантов значительно стимулируют синтез GAG по сравнению с чистой питательной средой (DMEM с 10% FCS) или надосадочной жидкостью культуры L-клеток, трансфицированных с помощью pABWN. Это показывает, что MP-52 может стимулировать дифференциацию хондроцитов. As can be seen from the table, 1 supernatant of cell cultures producing MP-52 transfectants significantly stimulate GAG synthesis compared to pure nutrient medium (DMEM with 10% FCS) or supernatant of L-cell culture transfected with pABWN. This shows that MP-52 can stimulate chondrocyte differentiation.
1.2. 1.2.
Описанный эффект некоторых членов BMP-семейства представляет собой усиление активности щелочной фосфатазы (ALP-активности) в остеобластях. Клональные линии клеток крыс ROВ - C-26 (C-26) причисляют к остеобластам относительно ранней стадии созревания (Yamaguchi и др., Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225). The described effect of some members of the BMP family is an increase in the activity of alkaline phosphatase (ALP activity) in osteoblasts. Clonal cell lines of rats ROB - C-26 (C-26) are classified as osteoblasts of a relatively early stage of maturation (Yamaguchi et al., Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225).
Для остеоиндуктивных протеинов, как, например, BMP-2, описана способность усиливать ALP-активность: Yamaguchi и др., J. Cell. Biol. 113 (1991), 681-687. For osteoinductive proteins, such as BMP-2, the ability to enhance ALP activity has been described: Yamaguchi et al., J. Cell. Biol. 113 (1991), 681-687.
Влияние MP-52 на C-26-клетки исследуют следующим образом. C-26-Клетки в количестве 3•104 клеток на углубление высевают на пластину с 24 углублениями и культивируют в среде α -MEM (Gibco BRL) с 10% FCS вплоть до конфлюэнции. На углубление добавляют 56 мкл надосадочной жидкости культуры продуцирующих MP-52 трансфектантов L-клеток (HindIII-MP-52/pABWN), соответственно, надосадочной жидкости трансфектантов L-клеток, полученных с помощью pABWN, или только надосадочной жидкости культуры (DMEM с 10% FCS) L-клеток к 500 мкл среды культуры клеток C-26. Замену среды с соответствующими добавками осуществляют все три дня. ALP-Активность в экстрактах клеток определяют спустя 0, 3, 6, 9 и 12 дней с помощью стандартных способов, базирующихся на п-нитрофенилфосфате в качестве субстрата, как, например, описано Takuwa и др. (Am. J. Physiol. 257 /1989/, E797-E803).The effect of MP-52 on C-26 cells is investigated as follows. C-26-cells in the amount of 3 × 10 4 cells per well are seeded on a 24-well plate and cultured in α-MEM (Gibco BRL) medium with 10% FCS until confluence. 56 μl of culture supernatant of producing MP-52 L-cell transfectants (HindIII-MP-52 / pABWN), respectively, of supernatant of L-cell transfectants obtained with pABWN, or only culture supernatant (DMEM with 10% FCS) L cells to 500 μl of C-26 cell culture medium. Replace the medium with the appropriate additives for all three days. ALP activity in cell extracts is determined after 0, 3, 6, 9, and 12 days using standard methods based on p-nitrophenyl phosphate as a substrate, as described, for example, by Takuwa et al. (Am. J. Physiol. 257 / 1989 /, E797-E803).
Как следует из таблицы 2, ALF-активность значительно усиливается за счет добавки MP-52 по сравнению с чистой средой DMEM с 10% FCS и средой инфицированных с помощью pABWN L-клеток. As follows from table 2, ALF activity is significantly enhanced by the addition of MP-52 compared with pure DMEM medium with 10% FCS and the medium infected with pABWN L-cells.
Этот результат показывает, что MP-52 может способствовать не только дифференциации хондроцитов, но и также дифференциации и созреванию остеобластов. This result shows that MP-52 can contribute not only to differentiation of chondrocytes, but also to differentiation and maturation of osteoblasts.
Другая линия клеток остеобластов (MC3T3-EI, мышь), которая, как описано Takuwa и др. (Biochem. Biophys. Res. Com., 174 (1991), 96-101), путем обработки BMP-2 показывает увеличение ALP-активности, после инкубации с кондиционированной средой продуцирующих MP-52 трансфектантов L-клеток (HindIII-MP-52/pABWN) или со средой после продуцирования MP-52 за счет инфекции рекомбинантными вирусами осповакцины не показывает никакого изменения ALP-активности. Это указывает на то, что MP-52 обладает отчасти специфичностью клетки, отклоняющейся от BMP-2. Различные функции, обусловленные разными целевыми участками отдельных членов TGF- β -семейства, могут иметь большую пригодность в медицине. Another osteoblast cell line (MC3T3-EI, mouse), which, as described by Takuwa et al. (Biochem. Biophys. Res. Com., 174 (1991), 96-101), by treatment with BMP-2 shows an increase in ALP activity after incubation with conditioned medium producing MP-52 L-cell transfectants (HindIII-MP-52 / pABWN) or with medium after producing MP-52 due to infection with recombinant vaccinia viruses, there is no change in ALP activity. This indicates that MP-52 has partly cell specificity that deviates from BMP-2. Different functions due to different target areas of individual members of the TGF-β family can be of great medical utility.
2. Эксперименты ин виво
2.1.2. In vivo experiments
2.1.
Наиболее четко высказанная возможность исследования развития костей базируется на эктопическом костеобразовании ин виво. Его можно индуцировать, например, путем имплантации деминерализованной костной матрицы (Urist, Science, 150 (1965), 893-899). Путем комбинации неактивной матрицы с индуцирующими кости протеинами можно индуцировать такой же процесс, который описан, например, Sampath и др. (PNAS (Proc. Natl. Acad. Sci., США), 78 (1981), 7599-7603). Этот процесс костеобразования похож на таковой эмбрионального энхондрального костеобразования и лечения костей во взрослом состоянии. Таким образом, этот метод дает возможность исследовать протеины на их способность к индуктированию костей ин виво. The most clearly expressed opportunity to study bone development is based on ectopic bone formation in vivo. It can be induced, for example, by implantation of a demineralized bone matrix (Urist, Science, 150 (1965), 893-899). By combining an inactive matrix with bone-inducing proteins, the same process as described, for example, by Sampath et al. (PNAS (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 78 (1981), 7599-7603) can be induced. This process of bone formation is similar to that of embryonic enchondral bone formation and treatment of bones in adulthood. Thus, this method makes it possible to study proteins for their ability to induce bone in vivo.
Для такого эксперимента MP-52-протеин, который получают путем экспрессии в системе осповакцины (см. пример 2), частично очищают и имплантируют. For such an experiment, the MP-52 protein, which is obtained by expression in the smallpox vaccine system (see Example 2), is partially purified and implanted.
Для этой цели 143B-клетки (HuTk-, ATCC CRL 8303) выращивают в чашках для культивирования и микролитражных емкостях вплоть до конфлюэнции и, как описано в примере 2 для анализов путем экспрессии, инфицируют с помощью рекомбинантных вирусов, промывают и оставляют аккумулировать примерно в течение 20 часов MP-52 в MEM (Gibco BRL, примерно 1 мл на 106 клеток). В качестве контроля осуществляют такое же приготовление путем инфекции с помощью вирусов дикого типа. Надосадочную жидкость культуры клеток (кондиционированная среда) каждого приготовления (смеси) собирают и центрифугируют (40000•g в течение 30 минут при 4oC). Для удаления вирусов надосадочные жидкости фильтруют через неорганические фильтры (величина пор 0,1 мкм, Whatman, Anotop 25). В ходе охарактеризовывания MP-52 смогли обнаружить, что этот протеин связывается с гепарин-сефарозой. Это поведение используют для частичной очистки. Для этой цели отфильтрованную и отцентрифугированную, кондиционированную среду доводят до конечной концентрации 50 ммоль ТРИС, pH 7,0; 100 ммоль NaCl и 6 моль мочевины и загружают в колонку с гепарином (HiTropTM, Pharmacia # 17-0407-01), которая уравновешена буфером A (50 ммоль ТРИС, pH 7,0, 100 ммоль NaCl и 6 моль мочевины). Нагруженную колонку промывают буфером A и с помощью линейного градиента до 100% буфера B (50 ммоль ТРИС, pH 7,0, 600 ммоль NaCl и 6 моль мочевины) при скорости истечения 0,5 мл/мин элюируют в течение 50 мин (2,5 мл на фракцию). Применение мочевины необязательно. Путем вестерн-блоттинг-анализа (см. пример 2) можно дополнительно проверить, что MP-52 элюируется воспроизводимо в основном в 2 фракциях при концентрации NaCl примерно 250-400 ммоль. Аликвоты этих фракций также, согласно инструкциям изготовителя, проверяют с помощью окрашенных серебром 15%-ных полиакриламидных гелей (Silver Stain-II, Daiichi # SE 140000) и объединяют. Сопоставимые фракции, после очистки от кондиционированной среды после инфекции с помощью вирусов дикого типа, также объединяют после анализа в окрашенных серебром гелях.For this purpose, 143B cells (HuTk-, ATCC CRL 8303) are grown in culture dishes and microtiter containers until confluence and, as described in Example 2 for expression analysis, are infected with recombinant viruses, washed and allowed to accumulate for approximately 20 hours MP-52 in MEM (Gibco BRL, approximately 1 ml per 10 6 cells). As a control, the same preparation is carried out by infection with wild-type viruses. The cell culture supernatant (conditioned medium) of each preparation (mixture) was collected and centrifuged (40,000 x g for 30 minutes at 4 ° C). To remove viruses, the supernatant is filtered through inorganic filters (pore size 0.1 μm, Whatman, Anotop 25). During characterization, MP-52 was able to detect that this protein binds to heparin-sepharose. This behavior is used for partial cleaning. For this purpose, the filtered and centrifuged, conditioned medium is adjusted to a final concentration of 50 mmol TRIS, pH 7.0; 100 mmol NaCl and 6 mol urea and loaded onto a heparin column (HiTrop TM , Pharmacia # 17-0407-01), which is equilibrated with buffer A (50 mmol TRIS, pH 7.0, 100 mmol NaCl and 6 mol urea). The loaded column is washed with buffer A and, using a linear gradient, up to 100% buffer B (50 mmol TRIS, pH 7.0, 600 mmol NaCl and 6 mol urea) are eluted at a flow rate of 0.5 ml / min for 50 min (2, 5 ml per fraction). Urea is optional. By Western blot analysis (see Example 2), it can further be verified that MP-52 elutes reproducibly in mainly 2 fractions at a NaCl concentration of about 250-400 mmol. Aliquots of these fractions are also, according to the manufacturer's instructions, checked using silver stained 15% polyacrylamide gels (Silver Stain-II, Daiichi # SE 140000) and combined. Comparable fractions, after purification from the conditioned medium after infection with wild-type viruses, are also combined after analysis in silver stained gels.
Из дальнейших исследований в отношении MP-52 следует, что MP-52 также связывается с гидроксиапатитом. Поэтому в принципе можно достигать дополнительной очистки при использовании колонки с гидроксиапатитом, соответственно заменять колонку с гепарином (например, B10-RAD, Econo-pac HTP). Для дальнейших очисток возможны также другие, известные специалисту методы, как, например, колонки с гель-ситами (Gelsiebsoulen), колонки с ионообменниками, аффинные колонки, колонки с хелатами металлов или колонки, базирующиеся на гидрофобных взаимодействиях. From further studies regarding MP-52, it follows that MP-52 also binds to hydroxyapatite. Therefore, in principle, additional purification can be achieved by using a column with hydroxyapatite, respectively replacing the column with heparin (for example, B10-RAD, Econo-pac HTP). For further purifications, other methods known to the person skilled in the art are also possible, such as, for example, columns with gel sieves (Gelsiebsoulen), columns with ion exchangers, affinity columns, columns with metal chelates or columns based on hydrophobic interactions.
Предварительно очищенный путем хроматографии на гепаринсефарозе MP-52-протеин соответственно, еще соответственно загрязняющие протеины, которые находятся также в инфицированных диким типом надосадочных жидкостях культуры клеток, очищают далее с помощью обращенной фазы ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Для этой цели C8-колонку (Aquapore RP 300, Applied Biosystems, размер частиц: 7 мкм; величина пор: 300 
Также частично очищенный MP-52-протеин в определенной путем вестерн-блоттинг-анализа концентрации 50 нг/мл показывает отчетливое повышение ALP-активности на ROB-C-26-клетках после трех стадий инкубации. Also partially purified MP-52 protein in a concentration determined by Western blot analysis of 50 ng / ml shows a distinct increase in ALP activity on ROB-C-26 cells after three stages of incubation.
Частично очищенный MP-52-протеин, соответственно контрольный протеин из соответственно частично очищенных надосадочных жидкостей культур клеток после инфекции вирусами дикого типа, реконструируют с матрицей и имплантируют крысам, чтобы доказать способность к хряще- и костеобразованию. Partially purified MP-52 protein, respectively a control protein from respectively partially purified supernatant of cell cultures after infection with wild-type viruses, is reconstructed with a matrix and implanted into rats to prove the ability to cartilage and bone formation.
В принципе должны быть применимы различные, известные специалисту матричные материалы, т. е. природные (также модифицированные), и синтетически полученные матрицы, предпочтительно, однако, биосовместимые, биологически разрушаемые ин виво пористые материалы. В этих экспериментах применяют костную матрицу крыс, которая по существу приготовлена подобно тому, как описано Sampath и др. (PNAS, 80 (1983), 6591-6595). Крысиные кости (бедро и большеберцовая кость) деминерализуют в течение 24 часов в 0,6 М HCl и затем удаляют еще имеющийся костный мозг. После промывки с помощью воды и обезжиривания в течение 3 часов в смеси хлороформа с метанолом (1:1) кости высушивают на воздухе, замороженными при низкой температуре пульверизуют (распыляют) в мельнице и отделяют путем просеивания частицы размером 400-1000 мкм. После этого матрицу в течение 7 дней при комнатной температуре экстрагируют в 4 М гуанидиний-HCl в присутствии ингибиторов протеазы. После экстенсивных (обильных) промывок водой матрицу лиофилизируют и хранят при 4oC. Таким образом обработанные матрицы не проявляют, ни одна из них, никакой индуктирующей кости активности.In principle, various matrix materials known to those skilled in the art, i.e., natural (also modified), and synthetically prepared matrices, preferably, however, biocompatible, biologically degradable, in vivo porous materials, should be applicable. In these experiments, a bone matrix of rats is used, which is essentially prepared in the same way as described by Sampath et al. (PNAS, 80 (1983), 6591-6595). Rat bones (thigh and tibia) are demineralized for 24 hours in 0.6 M HCl and then the existing bone marrow is removed. After washing with water and degreasing for 3 hours in a mixture of chloroform with methanol (1: 1), the bones are dried in air, frozen at a low temperature, they are pulverized (sprayed) in a mill and particles 400–1000 μm in size are separated by sieving. After that, the matrix was extracted at room temperature for 7 days in 4 M guanidinium-HCl in the presence of protease inhibitors. After extensive (abundant) washes with water, the matrix is lyophilized and stored at 4 ° C. Thus, the treated matrices do not show, none of them, any bone inducing activity.
Протеин при применении различных, известных специалисту методов можно комбинировать с проэкстрагированной костной матрицей. Protein can be combined with a well-extracted bone matrix using various methods known to the person skilled in the art.
MP-52-Протеин, соответственно контрольный протеин, который очищен как при использовании гепарин-сефарозы, так и также обращенной фазы ВЭЖХ, в растворе ацетонитрила с трифторуксусной кислотой, после элюирования, объединяют в количестве по 25 мг. матрицы на имплантат, хорошо смешивают, замораживают при низких температурах и лиофилизируют. MP-52-Protein, respectively, is a control protein, which was purified using both heparin-sepharose and also reverse phase HPLC in a solution of acetonitrile with trifluoroacetic acid, after elution, combined in an amount of 25 mg. matrices on the implant, mix well, freeze at low temperatures and lyophilize.
Для имплантации связанного с матрицей MP-52 используют крыс (Wistar) в возрасте примерно 3 месяца, которых приводят в состояние наркоза путем внутримышечной инъекции наркотизирующего средства (0,2 мл Rompun (Bayer), смешанные с 0,5 мл Ketanest 50 (Parke Davis)) в количестве 0,14 мл на 100 г веса тела. Для имплантатов приготовляют с двух сторон карманы в брюшных мышцах (ниже грудной клетки, начиная примерно на 0,5 см ниже самой нижней реберной дуги). Связанный с матрицей MP-52 (примерно 2-4 мкг согласно определению по вестерн-блоттинг-анализу), а также соответственно связанные с матрицей контрольные протеины увлажняют с помощью 0,9%-ного раствора хлорида натрия (Delta Pharma) и переносят в мышечные карманы. Мышечные карманы, а также необходимые разрезы кожи затем зашивают. Крыс иммуноподавляют с помощью циклоспорина A (Sandimmun). Approximately 3 months old rats (Wistar) are used to implant the MP-52 matrix. They are anesthetized by intramuscular injection of an anesthetic (0.2 ml Rompun (Bayer) mixed with 0.5 ml Ketanest 50 (Parke Davis) )) in the amount of 0.14 ml per 100 g of body weight. For implants, pockets in the abdominal muscles are prepared on both sides (below the chest, starting about 0.5 cm below the lowest costal arch). Associated with the MP-52 matrix (approximately 2-4 μg as determined by Western blot analysis), as well as the associated control proteins, are moistened with a 0.9% sodium chloride solution (Delta Pharma) and transferred to muscle pockets. The muscle pockets as well as the necessary skin incisions are then sutured. Rats are immunosuppressed with cyclosporin A (Sandimmun).
Спустя 18, соответственно 26 дней имплантаты извлекают из крыс и фиксируют для гистологических исследований. Так как имплантат с MP-52 после 26 дней уже позволяет предполагать макроскопически образование костей, то его помещают (заделывают) в метилметакрилат для приготовления тонких пленок; другие имплантаты заделывают в парафин. Минерализованные хрящевые и костные ткани чернят (делают черными) благодаря способу окраски Von Kossa (Romeis B. , Mikroskopische Technik, изд. Bock P.; Urban и Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien /1989/). При окрашивании с помощью трихром-красителей (Trichromfarbung) согласно Masson-Goldner (Romeis B.; Mikroskopisсhe Technik, изд. Bock P.; Urban и Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien /1989/) минерализованная костная ткань и коллаген окрашиваются слегка зеленым, остеоид является красным, а цитоплазма имеет красновато-коричневую окраску. К имплантатам из обеих крыс применяют оба способа окрашивания. С помощью обоих способов окрашивания в случае обоих подопытных животных можно доказать отчетливое хряще- и костеобразование в имплантатах, которые содержат MP-52. Соответствующие имплантаты с контрольным протеином не показывают никакого хряще- и костеобразования. Доля предстадий хряща с хондроцитами и хрящевыми областями с начинающимся образованием внеклеточной матрицы и ее минерализация в концентрических кругах в имплантате с MP-52 спустя 18 дней выше, чем в таковом спустя 26 дней. Однако также в имплантате спустя 18 дней уже обнаруживаются зрелые костные ткани с векториальным образованием остеоида, а также отдельные остеоциты в кости. Далее, распознаваемы замкнутые косточки (Ossikel) с начинающимся образованием костного мозга. В случае имплантата спустя 26 дней также еще обнаруживаются хрящевые области с начинающимся образованием матрицы и кальцинозом, доля окрашенной в зеленый цвет минерализованной костной ткани с остеоцитами и остеоидными краями, однако, отчетливо увеличена. Также в этом имплантате обнаруживается образование костного мозга с единичными (отдельными) случаями жировых клеток. Для наглядности на фиг. 5 показано получаемое путем окраски обнаружение (von Kossa) костного материала из всего имплантата спустя 26 дней. На фиг. 6 показан маленький вырез из того же самого имплантата после окрашивания по Masson-Goldner. Видны активные кости с ободком (краем) из кубиодальных остеобластов и в отдельных "вмурованных" остеобластях распознаваемы остеоиды. Далее, видны отдельные остеоциты в минерализованной костной ткани (в подлинном препарате окрашено зеленым). Также обнаруживается образование костного мозга. After 18, respectively, 26 days, the implants are removed from rats and fixed for histological examination. Since the implant with MP-52 after 26 days already suggests macroscopic bone formation, it is placed (embedded) in methyl methacrylate to prepare thin films; other implants are embedded in paraffin. Mineralized cartilage and bone tissue are blackened (made black) by the Von Kossa staining method (Romeis B., Mikroskopische Technik, ed. Bock P .; Urban and Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien / 1989 /). When stained with trichrome dyes (Trichromfarbung) according to Masson-Goldner (Romeis B .; Mikroskopishe Technik, publ. Bock P .; Urban and Schwarzenberg; Munchen, Baltimore, Wien / 1989 /), mineralized bone tissue and collagen are stained slightly green, the osteoid is red, and the cytoplasm has a reddish-brown color. Both staining methods are used for implants from both rats. Using both staining methods in the case of both experimental animals, it is possible to prove a clear cartilage and bone formation in implants that contain MP-52. Corresponding implants with a control protein show no cartilage and bone formation. The proportion of the appearance of cartilage with chondrocytes and cartilage regions with the beginning of the formation of the extracellular matrix and its mineralization in concentric circles in the implant with MP-52 after 18 days is higher than in that after 26 days. However, also in the implant after 18 days mature bone tissues with vectorial formation of osteoid, as well as individual osteocytes in the bone, are already detected. Further, closed bones (Ossikel) with starting bone marrow formation are recognizable. In the case of the implant, after 26 days, cartilaginous regions with the onset of matrix formation and calcification are also found, the proportion of green-colored mineralized bone tissue with osteocytes and osteoid edges, however, is clearly increased. Also in this implant is the formation of bone marrow with isolated (individual) cases of fat cells. For clarity, in FIG. Figure 5 shows the staining detection (von Kossa) of bone material from the entire implant after 26 days. In FIG. 6 shows a small cutout from the same implant after Masson-Goldner staining. Active bones with a rim (edge) from cubodial osteoblasts are visible and in separate "walled" osteoblasts osteoids are recognized. Further, individual osteocytes are visible in the mineralized bone tissue (in the original preparation it is colored green). Bone marrow formation is also detected.
Опыт показывает, что рекомбинантно полученный MP-52, один, в комбинации с матрицей, в состоянии индуцировать энхондральное костеобразование. Experience shows that recombinantly obtained MP-52, alone, in combination with a matrix, is able to induce endochondral bone formation.
2.2. 2.2.
Для подтверждения результатов осуществляют другой тест эктопического костеобразования при применении трансформантов за счет MP-52 L-клеток. Продуцирующие MP-52 (трансфицированные с помощью HindIII-MP-52/pABWN) и непродуцирующие MP-52 (трансфицированные с помощью pABWN) L-клетки (1•106 клеток) вводят путем инъекции с обеих сторон мышц бедра взятым по три самцам голых мышей. Спустя 3 недели всех животных умерщвляют, мышцы бедра отделяют и исследуют их как с помощью рентгеновского излучения с низкой энергией, так и гистопатологически.To confirm the results, another test of ectopic bone formation is carried out with the use of transformants due to MP-52 L-cells. Producing MP-52 (transfected with HindIII-MP-52 / pABWN) and non-producing MP-52 (transfected with pABWN) L cells (1 x 10 6 cells) are injected on both sides of the thigh muscles taken from three male naked mice. After 3 weeks, all animals are sacrificed, the thigh muscles are separated and examined using both low-energy X-rays and histopathologically.
Как представлено в таблице 3, анализ путем рентгеновского излучения показывает плотный материал в местах инъекции в мышечную ткань всех продуцирующих MP-52 L-клеток. С помощью гистологических исследований можно установить простое хрящеобразование и кальцинозное хрящеобразование в мышках. Также эти результаты подтверждают, что MP-52 может индуцировать энхондральное костеобразование. As shown in table 3, analysis by x-ray radiation shows a dense material at the injection sites in the muscle tissue of all producing MP-52 L-cells. Using histological studies, simple cartilage formation and calcification of cartilage in mice can be established. Also, these results confirm that MP-52 can induce endochondral bone formation.
Осуществленные эксперименты подтверждают, что MP-52-протеин стимулирует образование хрящей из недифференцированных мезенхимных клеток, а также дифференциацию и созревание остеобластов. Это приводит к энхондральному костеобразованию, которое равно индукционному каскаду при эмбриональном костеобразовании и излечиванию (срастанию) костей при переломах. The experiments carried out confirm that MP-52 protein stimulates the formation of cartilage from undifferentiated mesenchymal cells, as well as the differentiation and maturation of osteoblasts. This leads to enchondral bone formation, which is equal to the induction cascade during embryonic bone formation and healing (fusion) of bones in fractures.
Указанные в опытах условия нужно рассматривать в качестве иллюстрации MP-52-активности, а не как ограничение. Изобретение можно также рассматривать и охарактеризовывать в другой форме. The conditions indicated in the experiments should be considered as an illustration of MP-52 activity, and not as a limitation. The invention can also be considered and characterized in another form.
Для указанных в заявке линий клеток и плазмид в качестве приложения даются материалы, из которых очевидны подтверждающие данные. For the cell lines and plasmids indicated in the application, materials are given as an application, from which the supporting data are obvious.
Описание чертежей
На фиг. 1 представлено сравнение аминокислотной последовательности MP-52 с некоторыми членами семейства BMP-протеинов с началом на первом из семи сохранившихся цистеиновых остатков. Знак * обозначает, что аминокислота одинакова во всех сравниваемых протеинах; знак + обозначает, что аминокислота совпадает по меньшей мере в одном из протеинов по сравнению с MP-52.Description of drawings
In FIG. 1 shows a comparison of the amino acid sequence of MP-52 with some members of the BMP protein family with the start of the first of the seven remaining cysteine residues. The * sign indicates that the amino acid is the same in all compared proteins; the + sign indicates that the amino acid coincides in at least one of the proteins compared to MP-52.
На фиг. 2 представлены нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые применяются в настоящем изобретении, и сравнение этих последовательностей с известными членами TGF- β -семейства. M обозначает A или C; S обозначает C или G; R обозначает A или G; K обозначает G или T, "2a" обозначает последовательность праймера OD, "2b" обозначает последовательность праймера OID. In FIG. 2 shows the nucleotide sequences of oligonucleotide primers that are used in the present invention, and a comparison of these sequences with known members of the TGF-β family. M is A or C; S is C or G; R is A or G; K is G or T, "2a" is the OD primer sequence, "2b" is the OID primer sequence.
На фиг. 3 представлен вестерн-блоттинг, показывающий, что только в случае рекомбинантных вирусов, однако, не в случае вирусов дикого типа (без интегрированной чужеродной ДНК), появляются специфические для MP-52 полосы. M обозначает предварительно окрашенный маркер по молекулярной массе протеина с указанными кажущимися молекулярными массами (Cibco BRL # 26041-020), 1 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной MP-52-кДНК) при восстанавливающих (1% β- меркаптоэтанола) условиях, 2 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной ДНК) при восстанавливающих (1% β -меркаптоэтанола) условиях, 3 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекции с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной MP-52 кДНК) при невосстанавливающих условиях, 4 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной ДНК) при невосстанавливающих условиях. In FIG. Figure 3 presents western blotting, showing that only in the case of recombinant viruses, however, not in the case of wild-type viruses (without integrated foreign DNA), MP-52 specific bands appear. M denotes a pre-stained protein molecular weight marker with the indicated apparent molecular weights (Cibco BRL # 26041-020), 1 denotes a cell culture supernatant (100 μl) after infection with recombinant viruses (with MP-52 cDNA inserted) during reconstituting (1% β-mercaptoethanol) conditions; 2 denotes a cell culture supernatant (100 μl) after infection with wild-type viruses (without inserted foreign DNA) under reducing (1% β-mercaptoethanol) conditions; 3 denotes a supernatant ultury cells (500 .mu.l) after infection by recombinant viruses (with inserted MP-52 cDNA) under non-reducing conditions, 4 is the supernatant liquid of the cell culture (500 .mu.l) after infection with wild-type viruses (without the inserted foreign DNA) under nonreducing conditions.
На фиг. 4 представлена плазмида pABWN. In FIG. 4 shows the plasmid pABWN.
На фиг. 5 представлен разрез всего имплантата (после имплантации в течение 26 дней), окрашенный согласно Von Kossa. Минерализованная ткань отчетливо выделяется - черная - по сравнению с окружающей мышечной тканью. In FIG. 5 shows a section of the entire implant (after implantation for 26 days), stained according to Von Kossa. Mineralized tissue stands out clearly - black - compared to the surrounding muscle tissue.
На фиг. 6 представлен вырез из имплантата (после имплантации в течение 26 дней), окрашенный согласно Mass on Goldner. 1 обозначает край из остеобластов (в оригинале розовый), 2 обозначает остеоид (в оригинале красный), 3 обозначает минерализованную костную ткань (в оригинале зеленая) с остеоцитами (в оригинале розовые), 4 обозначает костный мозг (в оригинале от светло-розового до оранжевого). In FIG. Figure 6 shows an implant cutout (after implantation for 26 days) stained according to Mass on Goldner. 1 denotes the osteoblast edge (pink in the original), 2 denotes an osteoid (red in the original), 3 denotes mineralized bone tissue (green in the original) with osteocytes (pink in the original), 4 denotes bone marrow (in the original light pink to orange).
Claims (9)
(б) нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности из п. (а) в силу вырожденности генетического кода, соответствующая нуклеотидной последовательности, которая кодирует протеин согласно последовательности 1DNO.2 или функциональные части из нее, приведенной в графической части,
(в) нуклеотидную последовательность, гибридизирующуюся с одной из последовательностей из п.п. (а, (б) при условии, что молекула ДНК по п. (в) кодирует, по меньшей мере, полностью часть зрелого протеина TGF-β-семейства, приведенную в графической части.1. A DNA molecule encoding a protein of the TGF-β family and containing: (a) a part encoding a mature protein and, if necessary, other functional parts, of the nucleotide sequence of SEQ 1DNO.1, shown in the graphic part,
(b) the nucleotide sequence corresponding to the sequence of paragraph (a) due to the degeneracy of the genetic code, the corresponding nucleotide sequence that encodes a protein according to the 1DNO.2 sequence or the functional parts thereof, shown in the graphic part,
(c) a nucleotide sequence hybridizing with one of the sequences from p. (a, (b) provided that the DNA molecule according to (c) encodes at least completely a portion of the mature protein of the TGF-β family, shown in the graphic part.
10.08.93 по пп.1, 4, 6 - 8, 9;
09.06.94 по пп.2 - 4, 5.Priority on points:
08/10/93 according to claims 1, 4, 6 - 8, 9;
06/09/94 according to claims 2 - 4, 5.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4326829 | 1993-08-10 | ||
| DEP4326829.3 | 1993-08-10 | ||
| DEP4418222.8 | 1994-05-25 | ||
| DEP4420157.5 | 1994-06-09 | ||
| DE4420157A DE4420157B4 (en) | 1993-08-10 | 1994-06-09 | New growth / differentiation factor of the TGF-β family |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000113937/15A Division RU2246315C2 (en) | 1993-08-10 | 1994-08-09 | NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96104372A RU96104372A (en) | 1998-10-27 |
| RU2157406C2 true RU2157406C2 (en) | 2000-10-10 |
Family
ID=25928480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96104372A RU2157406C2 (en) | 1993-08-10 | 1994-08-09 | NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2157406C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2681502C2 (en) * | 2013-03-11 | 2019-03-06 | Джензим Корпорейшн | Structured anti-tgf-beta antibodies and antigen-binding fragments |
-
1994
- 1994-08-09 RU RU96104372A patent/RU2157406C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WALE et al., Handbook of experimental pharmacology, 1990, v.95, pp.211 - 248. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2681502C2 (en) * | 2013-03-11 | 2019-03-06 | Джензим Корпорейшн | Structured anti-tgf-beta antibodies and antigen-binding fragments |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2169171C (en) | New growth/differentiation factor of the tgf-beta family | |
| US5411941A (en) | Heterodimeric osteogenic factor | |
| WO1989009605A1 (en) | Bone-inducing protein | |
| CZ287715B6 (en) | DNA sequence, recombinant DNA molecule containing thereof, process for preparing protein from the group of TGF-beta substances, pharmaceutical preparation containing such protein, antibody or fragment thereof and its use | |
| EP0394418A4 (en) | Osteogenic factors | |
| EP1948689B1 (en) | High activity growth factor mutants | |
| US7642237B2 (en) | Growth/differentiation factor of the TGF-β family | |
| US9012401B2 (en) | Growth factor mutants with improved biological activity | |
| RU2157406C2 (en) | NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY | |
| RU2246315C2 (en) | NEW GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR OF TGF-β-FAMILY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION | |
| US7025959B1 (en) | MP121, a growth/differentiation factor of the TGF-β family | |
| KR100261823B1 (en) | Novel Growth / Differentiation Factors of TGF-β Group | |
| MXPA94006061A (en) | New growth/differentiation factor of the tgf- beta family | |
| JP3504259B2 (en) | Osteoinductive composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130810 |