RU2154831C1 - Method for applying radioimmunochemical analysis - Google Patents
Method for applying radioimmunochemical analysis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2154831C1 RU2154831C1 RU99124711/14A RU99124711A RU2154831C1 RU 2154831 C1 RU2154831 C1 RU 2154831C1 RU 99124711/14 A RU99124711/14 A RU 99124711/14A RU 99124711 A RU99124711 A RU 99124711A RU 2154831 C1 RU2154831 C1 RU 2154831C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- analysis
- samples
- majority
- scintillation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 22
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 45
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 20
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 20
- CZWCKYRVOZZJNM-UHFFFAOYSA-N Prasterone sodium sulfate Natural products C1C(OS(O)(=O)=O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone sulfate Chemical compound C1[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N 0.000 description 18
- 229950009829 prasterone sulfate Drugs 0.000 description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 25-Hydroxycholecalciferol Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 3
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000003212 lipotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloroethane Chemical compound CC(Cl)(Cl)Cl UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N carbon tetrachloride Substances ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229940089401 xylon Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам количественного анализа биологически (физиологически) активных веществ в пробах различной природы, а именно к способам радиоиммунохимического анализа с использованием тритиевой метки. The invention relates to methods for the quantitative analysis of biologically (physiologically) active substances in samples of various nature, and in particular to methods of radioimmunochemical analysis using a tritium label.
Способы радиоиммунохимического анализа известны и для их реализации многими фирмами выпускаются готовые наборы реагентов. Так, известно множество сходных по процедуре выполнения способов радиоиммунохимического анализа стероидов с использованием тритиевой метки, систематизированных в справочном пособии "Методы определения гормонов" (Резников А.Г., Киев: Наукова думка, 1980 г. ). Например, известен описанный на стр. 319 указанной книги способ определения тестостерона, суть которого заключается в приготовлении реакционной смеси (в данном примере этот этап состоит из эфирной экстракции исследуемого вещества (антигена) из плазмы или сыворотки крови, смешивании в отдельных реакционных сосудах определенных количеств экстракта исследуемых проб, проб, содержащих известное количество антигена (стандартов), с антигеном, меченным тритием и антисывороткой), инкубации реакционной смеси (в течение 30 мин при встряхивании на водяной бане при 37oC и затем в течение часа при 2-4oC), выделения продуктов реакции (путем сорбции активированным углем, покрытым декстраном не связавшегося с антителом антигена с последующим осаждением сорбента посредством центрифугирования), переносе выделенных продуктов реакции в жидкий сцинтиллятор (0,5 см супернатанта из каждого реакционного сосуда переносят в соответствующий флакон, содержащий 10 мл жидкого сцинтиллятора ЖС8), регистрации информационного параметра (измеряют в каждом флаконе частоту (скорость счета) сцинтилляций, вызванных тритием, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика), производят построение калибровочной зависимости анализа (например, путем определения зависимости процента связывания меченого антигена в пробах стандартах от содержания исследуемого вещества в этих пробах), по которой определяют содержание исследуемого вещества в анализируемых пробах.Methods of radioimmunochemical analysis are known and for their implementation many firms produce ready-made sets of reagents. So, there are many similar methods of radioimmunochemical analysis of steroids similar to the procedure for using steroids using a tritium label systematized in the reference manual "Methods for determining hormones" (Reznikov A.G., Kiev: Naukova Dumka, 1980). For example, the method for determining testosterone described on page 319 of the specified book is known, the essence of which is to prepare the reaction mixture (in this example, this stage consists of the ether extraction of the test substance (antigen) from plasma or blood serum, mixing certain amounts of extract in separate reaction vessels test samples, samples containing a known amount of antigen (standards), with antigen labeled with tritium and antiserum), incubation of the reaction mixture (for 30 minutes with shaking on a steam bath at 37 o C and then for an hour at 2-4 o C), the selection of reaction products (by adsorption of activated carbon coated with dextran not bound to the antibody antigen, followed by precipitation of the sorbent by centrifugation), transferring the reaction products to a liquid scintillator (0.5 cm of the supernatant from each reaction vessel is transferred to the corresponding bottle containing 10 ml of ZhS8 liquid scintillator), registration of the information parameter (the frequency (count rate) of scintillations in each bottle is measured, GOVERNMENTAL tritium with a liquid scintillation counter), producing construct calibration curve analysis (e.g., by determining the percent binding of the labeled antigen standards in assays of the content of the analyte in these samples) for determining the content of an analyte in unknown samples.
Еще известен способ радиоиммунохимического анализа 25-ОН-витамина Д3 (диагностический набор реагентов для этого анализа выпускается фирмой "BYK", Германия, каталожный N 1800, копия каталожного описания прилагается), суть которого также заключается в приготовлении реакционной смеси, ее инкубации, выделении продуктов реакции и их переносе в жидкий сцинтиллятор, регистрации информационного параметра, построении калибровочной зависимости, с помощью которой определяют содержание исследуемого вещества в пробе. Another known method of radioimmunochemical analysis of 25-OH-vitamin D3 (a diagnostic set of reagents for this analysis is produced by the company "BYK", Germany, catalog No. 1800, a copy of the catalog description is attached), the essence of which also consists in the preparation of the reaction mixture, its incubation, isolation of products reactions and their transfer to a liquid scintillator, registration of an information parameter, construction of a calibration dependence, with the help of which the content of the analyte in the sample is determined.
В этом способе приготовление реакционной смеси заключается во внесении в реакционные сосуды 25 мкл экстракта исследуемых проб или стандартных образцов, входящих в количестве 6 шт. в комплект набора, добавлении в каждый из сосудов 10 мкл меченного тритием 25-ОН-витамина Д3 и 100 мкл связывающего белка (антител против 25-ОН-витамина Д3 в фосфатном буфере). Инкубация приготовленной реакционной смеси осуществляется в течение часа при температуре 4oC. Выделение продуктов реакции производится в течение 4 мин при температуре 4oC с помощью суспензии активированного угля, внесенной в количестве 100 мкл в каждый из реакционных сосудов, с последующим отделением активированного угля связавшего непрореагировавшие продукты посредством центрифугирования реакционных сосудов. Затем 400 мкл супернатанта, содержащего продукты реакции (комплексы антиген-антитело), из каждого реакционного сосуда переносят соответственно во флаконы, содержащие жидкий сцинтиллятор, и далее регистрируют информационный параметр - измеряют частоту сцинтилляций, вызванных тритием в каждом из флаконов. После этого производят построение калибровочной зависимости анализа - например, зависимости частоты сцинтилляций от содержания определяемого вещества в пробе, используя для этой цели результаты измерения частоты сцинтилляций в пробах стандартах, содержащих известное количество определяемого вещества. Затем с помощью калибровочной зависимости определяют содержание исследуемого вещества в анализируемых пробах.In this method, the preparation of the reaction mixture consists in introducing into the reaction vessels 25 μl of the extract of the studied samples or standard samples included in the amount of 6 pcs. in the kit, add to each vessel 10 μl of tritium-labeled 25-OH-vitamin D3 and 100 μl of binding protein (antibodies against 25-OH-vitamin D3 in phosphate buffer). Incubation of the prepared reaction mixture is carried out for one hour at a temperature of 4 o C. The selection of reaction products is carried out for 4 minutes at a temperature of 4 o C using a suspension of activated carbon, introduced in an amount of 100 μl into each of the reaction vessels, followed by separation of the activated carbon binder unreacted products by centrifugation of the reaction vessels. Then 400 μl of the supernatant containing the reaction products (antigen-antibody complexes) from each reaction vessel is transferred respectively to bottles containing a liquid scintillator, and then an information parameter is recorded - the frequency of scintillations caused by tritium in each bottle is measured. After that, the calibration dependence of the analysis is constructed — for example, the dependence of the scintillation frequency on the content of the analyte in the sample, using for this purpose the results of measuring the scintillation frequency in samples of standards containing a known amount of the analyte. Then, using the calibration dependence, the content of the analyte in the analyzed samples is determined.
Известен также способ радиоиммунохимического анализа дегидроэпиандростерона-сульфата (DHEA-S) (прототип). There is also known a method of radioimmunochemical analysis of dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) (prototype).
Диагностический набор реагентов для этого анализа (копия описания набора и процедуры анализа прилагаются) выпускается фирмой Radioassay Systems Laboratories Inc. (США). A diagnostic reagent kit for this analysis (a copy of the kit description and analysis procedures are included) is available from Radioassay Systems Laboratories Inc. (USA).
Этот анализ также включает приготовление реакционной смеси, ее инкубацию, выделение продуктов реакции и их перенос в жидкий сцинтиллятор, регистрацию информационного параметра, построение калибровочной зависимости, с помощью которой определяют количественное содержание исследуемого вещества в пробе. This analysis also includes preparation of the reaction mixture, its incubation, isolation of reaction products and their transfer to a liquid scintillator, registration of an information parameter, construction of a calibration dependence, with the help of which the quantitative content of the test substance in the sample is determined.
Приготовление реакционной смеси в данном случае заключается во внесении в реакционные сосуды 0,5 мл предварительно разбавленной в 4000 раз сыворотки или плазмы исследуемой крови или стандартных образцов, входящих в количестве 7 шт. в комплект набора, добавлении 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату и добавлении 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата во все сосуды. The preparation of the reaction mixture in this case consists in introducing into the reaction vessels 0.5 ml of serum or plasma of the test blood previously diluted 4,000 times or of standard samples in the amount of 7 pcs. in the kit kit, adding 0.1 ml of antiserum to dehydroepiandrosterone sulfate and adding 0.1 ml of tritium-labeled dehydroepiandrosterone sulfate to all vessels.
Подготавливают также пробу, не содержащую связывающую систему (антисыворотку), для учета неспецифического связывания (NSB) меченого дегидроэпиандростерона-сульфата, что позволяет в дальнейшем учесть это неспецифическое связывание при построении калибровочной зависимости и улучшить точность анализа. Инкубация выполняется в течение от 1 до 24 ч в водяной бане при температуре 4oC при периодическом перемешивании.A sample is also prepared that does not contain a binding system (antiserum) for taking into account the nonspecific binding (NSB) of labeled dehydroepiandrosterone sulfate, which allows us to take this non-specific binding into account in the construction of the calibration dependence and improve the accuracy of the analysis. Incubation is performed for 1 to 24 hours in a water bath at a temperature of 4 o C with periodic stirring.
Выделение продуктов реакции осуществляется после инкубации путем добавления в реакционные сосуды 0,2 мл охлажденной до 4oC суспензии активированного угля, покрытого декстраном, интенсивного перемешивания в течение 20 с и выдержки полученной смеси в течение 20 мин при температуре 4oC с последующим осаждением сорбента центрифугированием в течение 15 мин.The reaction products are isolated after incubation by adding 0.2 ml of a suspension of activated carbon coated with dextran to a reaction vessel cooled to 4 ° C, vigorously stirring for 20 s and holding the resulting mixture for 20 min at 4 ° C, followed by precipitation of the sorbent centrifugation for 15 minutes
Далее весь супернатант из реакционных сосудов декантируют соответственно во флаконы с жидким сцинтиллятором и производят в каждом из флаконов регистрацию информационного параметра - частоты сцинтилляций - CPM (счет за минуту) с помощью жидкостного сцинтилляционного бета-счетчика. Next, the entire supernatant from the reaction vessels is decanted, respectively, into bottles with a liquid scintillator and the information parameter — scintillation frequency — CPM (count per minute) is recorded in each bottle using a liquid scintillation beta counter.
После этого по данным измерения частоты сцинтилляций в пробах-стандартах производят построение калибровочной зависимости анализа - зависимости процента связывания меченого дегидроэпиандростерона-сульфата от содержания дегидроэпиандростерона-сульфата в исследуемой пробе (процент связывания - отношение частоты сцинтилляций в пробе к частоте сцинтилляций в пробе с отсутствием исследуемого вещества (нулевой стандарт). При расчете процента связывания учитывается неспецифическое связывание (NSB) путем вычитания из величины частоты сцинтилляций для какой-либо пробы величины частоты сцинтилляций для пробы неспецифического связывания. Учет NSB позволяет улучшить точность анализа, если при построении калибровочной кривой используется та или иная гипотеза о ходе реакций, происходящих при анализе, например, гипотеза о соответствии реакций закону масс-действия. After that, according to the scintillation frequency measurement data in standard samples, a calibration dependence of the analysis is constructed - the dependence of the percentage of labeled dehydroepiandrosterone sulfate on the content of dehydroepiandrosterone sulfate in the test sample (percentage of binding is the ratio of the scintillation frequency in the sample to the scintillation frequency in the sample with no (zero standard). When calculating the percent binding, nonspecific binding (NSB) is taken into account by subtracting the scint scintillation frequency for any sample for non-specific binding assay. NSB accounting allows improving the accuracy of the analysis if a certain hypothesis about the course of reactions occurring during the analysis is used to construct the calibration curve, for example, the hypothesis that the reactions correspond to the law of mass action.
Далее по данным измерения частоты сцинтилляций в исследуемых пробах определяют процент связывания метки для этих проб и с помощью построенной калибровочной зависимости определяют содержание дегидроэпиандростерона-сульфата в этих пробах. Further, according to the measurement of the scintillation frequency in the studied samples, the percentage of label binding for these samples is determined and the content of dehydroepiandrosterone sulfate in these samples is determined using the constructed calibration dependence.
Все способы радиоиммунохимического анализа с использованием трития чувствительны к явлению, обусловленному тем, что сцинтилляционная эффективность жидкого сцинтиллятора существенно зависит от состава вводимой в сцинтиллятор пробы. Это явление называется тушением (гашением) сцинтилляций и заключается в том, что количество фотонов в световых вспышках (сцинтилляциях), возникающих при возбуждении сцинтиллятора бета-частицами, излучаемыми в ходе распада радионуклида, содержащегося в меченых пробах, существенно зависит от состава пробы. Обычно при отсутствии тушения сцинтиллянионная эффективность составляет 5-20 фотонов на кэВ поглощенной энергии в зависимости от качества сцинтиллятора. Таким образом, для бета-частиц трития, который является низкоэнергетическим излучателем (максимальная энергия 18,6 кэВ. средняя энергия 5,6 кэВ) наиболее яркие сцинтилляции сопровождаются изотропным излучением примерно 100-400 фотонов в телесный угол 4 π. All methods of radioimmunochemical analysis using tritium are sensitive to the phenomenon due to the fact that the scintillation efficiency of a liquid scintillator substantially depends on the composition of the sample introduced into the scintillator. This phenomenon is called scintillation quenching (quenching) and consists in the fact that the number of photons in light flashes (scintillations) arising from the excitation of the scintillator by beta particles emitted during the decay of the radionuclide contained in the labeled samples substantially depends on the composition of the sample. Usually, in the absence of quenching, the scintillation efficiency is 5–20 photons per keV of absorbed energy, depending on the quality of the scintillator. Thus, for tritium beta particles, which is a low-energy emitter (maximum energy 18.6 keV. Average energy 5.6 keV), the brightest scintillations are accompanied by isotropic emission of about 100-400 photons at a solid angle of 4 π.
Отсутствие тушения случай редкий, поскольку насыщение сцинтиллятора кислородом воздуха, происходящее при обычных условиях работы, существенно снижает сцинтилляционную эффективность. Иногда различают химическое и цветовое тушение. Первое обусловлено уменьшением вероятности излучательных переходов в сцинтилляторе под влиянием тех или иных веществ, содержащихся в пробе, а второе - поглощением излучаемых сцинтиллятором фотонов окрашенными примесями в пробе. В результате на практике акт сцинтилляции, вызванной тритием, сопровождается излучением от одного до нескольких десятков фотонов. В случае сцинтиллятора на основе толуола сцинтилляционная эффективность несколько выше, чем у сцинтиллятора на основе диоксана, но в толуоловые сцинтилляторы сложно вводить водосодержащие пробы из-за образования суспензий. В диоксановые сцинтилляторы можно вводить до 10-15% воды без опасности разделения фаз. Сильнейшими тушителями сцинтилляций являются ароматические галлоиды (хлороформ, трихлорэтан, хлор-n-ксилон), спирты, кетоны. The absence of quenching is a rare case, since the saturation of the scintillator with atmospheric oxygen, which occurs under normal operating conditions, significantly reduces the scintillation efficiency. Chemical and color quenching are sometimes distinguished. The first is due to a decrease in the probability of radiative transitions in the scintillator under the influence of certain substances contained in the sample, and the second is due to the absorption of photons emitted by the scintillator by colored impurities in the sample. As a result, in practice, the act of scintillation caused by tritium is accompanied by radiation from one to several tens of photons. In the case of a toluene-based scintillator, the scintillation efficiency is slightly higher than that of a dioxane-based scintillator, but it is difficult to introduce water-containing samples into toluene scintillators due to the formation of suspensions. Up to 10-15% of water can be introduced into dioxane scintillators without the danger of phase separation. The strongest scintillation quenchers are aromatic galloids (chloroform, trichloroethane, chloro-n-xylon), alcohols, ketones.
Регистрацию информационного параметра в пробах осуществляют либо с помощью одного фотоприемника, либо с помощью двух, соединенных со схемой отбора совпадений, либо с помощью трех - соединенных со схемой отбора мажоритарных совпадений (сигнал на выходе этой схемы возникает в случае, когда хотя бы два из трех фотоприемников зарегистрировали фотоны сцинтилляции). The registration of the information parameter in the samples is carried out either using one photodetector, or using two connected to the coincidence selection circuit, or using three connected to the majority coincidence selection circuit (the signal at the output of this circuit occurs when at least two of the three photodetectors recorded scintillation photons).
Для регистрации сцинтилляций при реализации радиоиммунохимического анализа с использованием трития в качестве фотоприемников применяют исключительно фотоэлектронные умножители (ФЭУ) особо высокого качества - тритиевые ФЭУ, на основе которых создают тот или иной жидкостной сцинтилляционный счетчик. To record scintillations during the implementation of radioimmunochemical analysis using tritium, exclusively photoelectronic multipliers (PMTs) of especially high quality are used as photodetectors - tritium PMTs, on the basis of which one or another liquid scintillation counter is created.
Счетчики с применением одного фотоприемника после разработки корреляционных методов, основанных на анализе совпадений, реально не используются и представляют исторический интерес, поскольку, хотя и обладают самой высокой эффективностью регистрации, но имеют плохую помехоустойчивость и наряду с полезными сигналами регистрируют шумы фотоприемника, которые могут быть на несколько порядков более интенсивными, чем сигналы, вызванные пробой, регистрируются также паразитные однофотонные процессы в пробе, которые зачастую присутствуют из-за окислительных или других процессов, сопровождающихся хемилюминисценцией. Сегодня в мире промышленно выпускается только один прибор такого типа - "TRIATLER". After developing correlation methods based on coincidence analysis, counters using a single photodetector are not really used and are of historical interest because, although they have the highest detection efficiency, they have poor noise immunity and along with useful signals register photodetector noise, which can be several orders of magnitude more intense than the signals caused by the breakdown, parasitic single-photon processes in the breakdown are also recorded, which are often present due to and oxidizing or other processes accompanied by chemiluminescence. Today in the world only one device of this type is manufactured industrially - "TRIATLER".
Счетчики на основе двух фотоумножителей с отбором совпадений нашли наиболее широкое применение - все некоррелированные процессы (в т.ч. шумы фотоумножителей, хемилюминесценция пробы) при такой регистрации сцинтилляций исключаются, а частота сигналов на выходе схемы отбора совпадений отражает только те процессы, которые были зарегистрированы одновременно обоими фотоумножителями, т.е. те процессы, в которых было излучено более одного фотона, эти фотоны попали на оба фотоумножителя и были зарегистрированы обоими фотоумножителями. Такой прием позволяет свести все паразитные процессы к пренебрежению малым величинам, но эффективность регистрации сцинтилляций (доля сцинтилляций зарегистрированной прибором от числа распадов трития в пробе) оказывается ниже, чем при регистрации с помощью одного фотоприемника и составляет для нетушенных проб (стандартов на основе меченного тритием толуолового сцинтиллятора, барботированного азотом) 60-62%. Counters based on two photomultipliers with coincidence sampling are most widely used - all non-correlated processes (including photomultiplier noise, chemiluminescence of the sample) are excluded with such scintillation registration, and the frequency of signals at the output of the coincidence sampling circuit reflects only those processes that were detected simultaneously by both photomultipliers, i.e. those processes in which more than one photon was emitted, these photons hit both photomultipliers and were detected by both photomultipliers. This technique allows us to reduce all parasitic processes to neglecting small quantities, but the scintillation detection efficiency (the fraction of scintillations recorded by the device on the number of tritium decays in the sample) is lower than when recording with a single photodetector and amounts to for non-quenched samples (standards based on tritium-labeled toluene scintillator nitrogen sparged) 60-62%.
В таком счетчике все сцинтилляции, в которых был излучен один фотон, принципиально не могут быть зарегистрированы, кроме того, поскольку самые лучшие из известных фотоумножителей имеют квантовую эффективность фотокатода около 20% (т. е. в среднем для образования одного фотоэлектрона, который вызовет сигнал на выходе фотоумножителя, надо 5 фотонов), то не регистрируется и часть многофотонных сцинтилляций. При наличии тушителей в пробе среднее количество фотонов в сцинтилляции уменьшается и вероятность ее регистрации тоже уменьшается, причем уменьшается гораздо быстрее, чем в случае регистрации сцинтилляций одним фотоприемником. In such a counter, all scintillations in which one photon was emitted cannot be detected fundamentally, in addition, since the best known photomultipliers have a photocathode quantum efficiency of about 20% (i.e., on average, to produce one photoelectron, which will cause a signal at the output of the photomultiplier, 5 photons are needed), some of the multiphoton scintillations are not recorded either. In the presence of quenchers in the sample, the average number of photons in the scintillation decreases and the probability of its registration also decreases, and decreases much faster than in the case of scintillation detection with a single photodetector.
В ЗАО ВНИИМП-ВИТА были разработаны и выпускаются не имеющие аналогов установки для регистрации сцинтилляций на основе трех фотоприемников (Бета-1, Бета-2) с блоком отбора мажоритарных совпадений. Они обеспечивают эффективность регистрации нетушенных проб несколько большую, чем достигается при использовании двух фотоприемников, а главное менее чувствительны к наличию тушителей в пробе, поскольку вероятность регистрации сцинтилляции "хотя бы двумя фотоприемниками из трех" выше, чем двумя фотоприемниками. VNIIMP-VITA CJSC has developed and produces unmatched installations for scintillation detection based on three photodetectors (Beta-1, Beta-2) with a majority coincidence selection unit. They ensure the efficiency of recording of non-quenched samples somewhat more than is achieved using two photodetectors, and most importantly, are less sensitive to the presence of quenchers in the sample, since the probability of recording scintillation by “at least two photodetectors from three” is higher than by two photodetectors.
При реализации радиоиммунологического анализа тушением, связанным с содержанием в пробе исследуемого вещества, обычно можно пренебречь (если не экстраполировать калибровочную зависимость за пределы, определяемые пробами-стандартами), поскольку на калибровочную зависимость уже "оказало влияние" тушение, вызванное исследуемым веществом при измерении проб стандартов; сходное тушение будет наблюдаться при измерении неизвестных проб. Однако при измерении неизвестных проб в них могут содержаться тушители, отсутствующие в пробах стандартах. Таким образом, различное тушение сцинтилляций в исследуемых пробах приводит к различной доле зарегистрированных сцинтилляций и влияет на точность анализа. Степень этого влияния зависит от того, что за вещества и в каких концентрациях присутствуют в исследуемых пробах. В некоторых случаях тушением можно пренебречь, а в некоторых оно способно привести к полностью недостоверным результатам анализа, как например, в случае исследования гормонального обмена при токсогенных воздействиях липотропными и нервно-паралитическими ядами, при исследованиях танатогенеза. In the implementation of radioimmunological analysis, quenching associated with the content of the test substance in a sample can usually be neglected (if the calibration dependence is not extrapolated beyond the limits determined by the standard samples), since the quenching caused by the test substance when measuring standards samples has already "influenced" ; similar quenching will be observed when measuring unknown samples. However, when measuring unknown samples, they may contain quenchers that are not in the standards. Thus, different quenching of scintillations in the studied samples leads to a different proportion of recorded scintillations and affects the accuracy of the analysis. The degree of this influence depends on what kind of substances and in what concentrations are present in the studied samples. In some cases, quenching can be neglected, and in some it can lead to completely inaccurate analysis results, such as in the case of hormonal metabolism studies with toxogenic effects by lipotropic and nerve palsies, in studies of thanatogenesis.
При разработке конкретных методик радиоиммунохимических анализов и диагностических наборов принимаются меры по снижению влияния неспецифических факторов в пробе на результаты анализа. Так, в первых двух описанных аналогах этому способствует усложнение этапа пробопригоговлелия анализа - экстракция анализируемого вещества из биопробы, однако при этом, как правило, надо определять экстракционный выход, кроме того, многие вещества соэкстрагируются вместе с исследуемым и затем вызывают дополнительное тушение в пробе (в частности, ряд липотропных веществ). В прототипе снижению влияния пробы на результат анализа способствует ее разбавление в 4000 раз. Разбавление снижает чувствительность анализа, не всегда может практиковаться и, кроме того, при наличии сильных тушителей точность все равно может оказаться недостаточной. When developing specific methods of radioimmunochemical analyzes and diagnostic kits, measures are taken to reduce the influence of nonspecific factors in the sample on the analysis results. So, in the first two described analogs, this is facilitated by the complication of the sample sampling stage - extraction of the analyte from the biological sample, however, in this case, as a rule, it is necessary to determine the extraction yield, in addition, many substances are coextracted with the test and then cause additional quenching in the sample (in in particular, a number of lipotropic substances). In the prototype, the reduction of the influence of the sample on the result of the analysis contributes to its dilution of 4000 times. Dilution reduces the sensitivity of the analysis, cannot always be practiced, and, in addition, with strong quenchers, the accuracy may still be insufficient.
Таким образом несмотря на наличие множества известных модификаций способа радиоиммунохимического анализа с использованием трития, касающихся используемых реагентов, последовательности внесения реагентов и проб при приготовлении реакционной смеси, методов инкубации и выделения продуктов реакции, типа жидкого сцинтиллятора, методов регистрации информационного параметра, построения калибровочной зависимости, не изменяющих данный способ анализа по существу, способ имеет недостаток, свойственный всем его модификациям, заключающийся в недостаточной точности из-за зависимости тушения сцинтилляций в исследуемых пробах от их состава. Thus, despite the presence of many known modifications of the method of radioimmunochemical analysis using tritium, regarding the reagents used, the sequence of introducing reagents and samples during the preparation of the reaction mixture, incubation methods and isolation of reaction products, such as a liquid scintillator, methods for recording an information parameter, constructing a calibration dependence, changing this analysis method essentially, the method has a disadvantage inherent in all its modifications, which consists in lack of precision due to the dependence of quenching the scintillation in the test samples of their composition.
Предлагаемое изобретение решает задачу повышения точности анализа путем уменьшения (исключения) влияния явления тушения сцинтилляций в исследуемой пробе на результат анализа. The present invention solves the problem of increasing the accuracy of the analysis by reducing (eliminating) the effect of the scintillation quenching phenomenon in the test sample on the analysis result.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе радиоиммунохимического анализа с использованием трития, включающем приготовление реакционной смеси, ее инкубацию, выделение продуктов реакции и их перенос в жидкий сцинтиллятор, регистрацию информационного параметра, построение калибровочной зависимости, с помощью которой определяют количественное содержание исследуемого вещества в пробе, согласно предлагаемому изобретению с использованием трех фотоприемников, соединенных со схемой отбора мажоритарных и тройных совпадений, определяют для различных проб с известным содержанием исследуемого вещества интенсивности М и Т соответственно мажоритарных и тройных совпадений сигналов фотоприемников, рассчитывают параметр A по формуле A=(М+2Т)3/27Т для каждой измеренной пробы, строят калибровочную зависимость по рассчитанным значениям, а в качестве информационного параметра для пробы с неизвестным содержанием исследуемого вещества используют величину A, определенную для этой пробы.The solution of this problem is achieved by the fact that in the method of radioimmunochemical analysis using tritium, which includes preparing the reaction mixture, incubating it, isolating the reaction products and transferring them to a liquid scintillator, recording an information parameter, constructing a calibration dependence, with the help of which the quantitative content of the test substance is determined in the sample according to the invention using three photodetectors connected to a majority and triple selection scheme is the same minutes, was determined for various samples with a known content of the test substance intensity M and T respectively majority and triple coincidence photodetector signals calculated parameter A by the formula A = (M + 2T), 3 / 27T for each measured sample, a calibration dependence on the calculated values, and as an information parameter for a sample with an unknown content of the test substance, the value A determined for this sample is used.
Таким образом, сущность настоящего изобретения заключается в том, что благодаря вышеописанному техническому решению повышается точность путем уменьшения (исключения) влияния явления тушения сцинтилляций на результат анализа. Thus, the essence of the present invention lies in the fact that due to the above-described technical solution, accuracy is improved by reducing (eliminating) the effect of the scintillation quenching phenomenon on the analysis result.
Изложенная сущность изобретения поясняется на примере конкретного анализа дегидроэпиандростерона-сульфата в пробах сыворотки крови с помощью диагностического набора реагентов фирмы RSL DHEA-S(3H)KIT.The essence of the invention is illustrated by the example of a specific analysis of dehydroepiandrosterone sulfate in blood serum samples using the RSL DHEA-S ( 3 H) KIT diagnostic reagent kit.
Приготовление реакционной смеси выполняется путем внесения в отдельные реакционные сосуды 0,5 мл предварительно разбавленной в 4000 раз сыворотки исследуемой крови (нативную сыворотку крови разбавляют в 200 и затем еще в 20 раз используя разбавитель из комплекта диагностического набора) или стандартных образцов, содержащих соответственно 0,02 нг/мл, 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,5 нг/мл, 1 нг/мл дегидроэпиандростерона-сульфата. Preparation of the reaction mixture is carried out by introducing into the individual reaction vessels 0.5 ml of serum of the test blood previously diluted 4000 times (the native blood serum is diluted 200 and then another 20 times using the diluent from the diagnostic kit) or standard samples containing 0, respectively. 02 ng / ml, 0.05 ng / ml, 0.1 ng / ml, 0.2 ng / ml, 0.5 ng / ml, 1 ng / ml dehydroepiandrosterone sulfate.
Затем в каждый из реакционных сосудов добавляют 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату из комплекта набора, после чего в каждый из сосудов добавляют 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата. Подготавливают также пробу неспецифического связывания путем внесения в реакционный сосуд 0,6 мл разбавителя и 0,1 мл меченного тритием дегидроэпиандростерона-сульфата. Приготавливают "нулевой" стандартный образец (образец, не содержащий исследуемого вещества - 0,0 нг/мл) путем внесения в реакционный сосуд 0,5 мл разбавителя и 0,1 мл антисыворотки к дегидроэпиандростерону-сульфату. Далее выполняют инкубацию приготовленной реакционной смеси в водяной бане при температуре 4oC при периодическом помешивании. Инкубацию проводят не менее 1 ч, но и не более 24 ч. После инкубации выделяют продукты реакции путем добавления в каждый реакционный сосуд 0,2 мл охлажденной до 4oC суспензии активированного угля, покрытого декстраном (входит в комплект набора), интенсивного перемешивания в течение 20 с, например, с помощью смешивателя для радиоиммунохимического анализа СВ1, выпускаемого ЗАО "ВНИИМП-ВИТА", выдержки полученной смеси в течение 20 мин при температуре 4oC, с последующим осаждением сорбента центрифугированием в течение 15 мин (в качестве центрифуги можно использовать центрифугу ЦЛП-3-3,5 с адаптерами на 100 радиоиммунологических пробирок, выпускаемыми ЗАО "ВНИИМП-ВИТА").Then, 0.1 ml of antiserum to dehydroepiandrosterone sulfate from the kit kit is added to each of the reaction vessels, after which 0.1 ml of tritium-labeled dehydroepiandrosterone sulfate is added to each vessel. A nonspecific binding test is also prepared by adding 0.6 ml of diluent and 0.1 ml of tritium-labeled dehydroepiandrosterone sulfate to the reaction vessel. A “zero” standard sample is prepared (a sample containing no test substance — 0.0 ng / ml) by adding 0.5 ml of diluent and 0.1 ml of antiserum to dehydroepiandrosterone sulfate to the reaction vessel. Next, perform the incubation of the prepared reaction mixture in a water bath at a temperature of 4 o C with periodic stirring. Incubation is carried out for at least 1 hour, but no more than 24 hours. After incubation, the reaction products are isolated by adding 0.2 ml of a suspension of activated carbon coated with dextran (included in the kit) to each reaction vessel, cooled to 4 ° C, vigorously stirring for 20 s, for example, using a mixer for radioimmunochemical analysis of CB1 manufactured by VNIIMP-VITA, holding the resulting mixture for 20 minutes at 4 ° C, followed by sedimentation of the sorbent by centrifugation for 15 minutes (as a centrifuge, but use the TsLP-3-3.5 centrifuge with adapters per 100 radioimmunological tubes manufactured by VNIIMP-VITA CJSC).
Далее весь супернатант из каждого реакционного сосуда декантируют в соответствующий флакон с жидким сцинтиллятором. В качестве жидкого сцинтиллятора используется промышленно выпускаемый сцинтиллятор на основе диоксана марки ЖС8-И в количестве 15 мл. Затем с помощью установки Бета-2, содержащей три фотоприемника (фотоэлектронные умножители ФЭУ-39А, размещенные под углом 120o друг к другу, фотокатоды которых обращены к флакону с пробой), соединенные со схемой отбора мажоритарных и тройных совпадений (мажоритарный элемент - микросхема КР1533ЛП3, а трехвходовая схема совпадений - микросхема КР1533ЛА4) определяют интенсивности М и Т соответственно мажоритарных и тройных совпадений сигналов фотоприемников для каждой из проб, перенесенных в жидкий сцинтиллятор.Next, the entire supernatant from each reaction vessel is decanted into the corresponding bottle with a liquid scintillator. As a liquid scintillator, an industrially produced ZhS8-I type dioxane scintillator is used in an amount of 15 ml. Then, using the Beta-2 installation, which contains three photodetectors (FEU-39A photomultiplier tubes placed at an angle of 120 ° to each other, the photocathodes of which are facing the sample bottle), connected to the selection scheme for majority and triple matches (the majority element is the KR1533LP3 chip , and the three-input coincidence scheme — the KR1533LA4 chip) determines the intensities M and T, respectively, of the majority and triple coincidences of the photodetector signals for each of the samples transferred to the liquid scintillator.
Пусть вероятности регистрации сцинтилляции в пробе равны P1, P2, P3 соответственно для первого, второго и третьего фотоприемников. Тогда вероятность регистрации мажоритарных совпадений сцинтилляций Pм (вероятность регистрации сцинтилляций не менее чем двумя фотоприемниками из трех) равна:
Pм = P1P2(1-P3) + P1P3(1-P2) + P2P3(1-P1) + P1P2P3,
а вероятность регистрации сцинтилляций тремя фотоприемниками (тройных совпадений) Pт равна:
Pт = P1, P2, P3
Если при заводской регулировке установки выполнить условие P1 = P2 = P3 = P (например, путем подбора напряжения питания каждого фотоприемника так, чтобы обеспечивалась равная чувствительность фотоприемников), получим:
Pм = P2(3-2P);
Pт = P3
Если активность трития в исследуемой пробе равна A, то интенсивность мажоритарных М и тройных Т совпадений сигналов фотоприемников соответственно будет:
М = AP2(3-2P) (1)
Т = AP3;
Решение системы уравнений (1) дает:
A = (М+2Т)3/27Т2 (2)
Величина параметра A, рассчитанного по формуле (2), не зависит от величины P и, следовательно, не зависит от степени тушения сцинтилляций в пробе.Let the probabilities of scintillation registration in the sample be equal to P 1 , P 2 , P 3 for the first, second, and third photodetectors, respectively. Then the probability of detecting majority coincidences of scintillations Pm (the probability of detecting scintillations by at least two out of three photodetectors) is:
Pm = P 1 P 2 (1-P 3 ) + P 1 P 3 (1-P 2 ) + P 2 P 3 (1-P 1 ) + P 1 P 2 P 3 ,
and the probability of scintillation detection by three photodetectors (triple coincidences) Pt is equal to:
Pt = P 1 , P 2 , P 3
If, at the factory adjustment of the installation, the condition P 1 = P 2 = P 3 = P is fulfilled (for example, by selecting the supply voltage of each photodetector so that the photodetector sensitivity is equal), we obtain:
Pm = P 2 (3-2P);
Pt = P 3
If the tritium activity in the test sample is equal to A, then the intensity of the majority M and triple T matches of the photodetector signals, respectively, will be:
M = AP 2 (3-2P) (1)
T = AP 3 ;
The solution of the system of equations (1) gives:
A = (M + 2T) 3 / 27T 2 (2)
The value of parameter A calculated by formula (2) does not depend on the value of P and, therefore, does not depend on the degree of quenching of scintillations in the sample.
По результатам определения параметра A для всех проб стандартов определяют их коэффициенты связывания B/Bo (%) (с учетом параметра ANSB, определенного для пробы неспецифического связывания), используя в качестве CPM для каждой стандартной пробы величину параметра A для этой пробы, и затем строят калибровочную зависимость B/Bo (%) = f(C) коэффициента связывания B/Bo (%) от концентрации C исследуемого вещества. Калибровочная зависимость может быть построена, например, с использованием интерполяционного кубического сплайна (этот широко распространенный метод и его алгоритм приведены, в частности, в инструкции оператора установки Бета-2 тА0.005.012И). С помощью построенной калибровочной зависимости находят содержание определяемого вещества дегидроэпиандростерона-сульфата в каждой из исследуемых проб, вычисляя для каждой из них параметр A на основании величин М и Т, определенных для этой пробы. Далее для исследуемой пробы вычисляют коэффициент связывания B/Bo (%) для этой пробы, используя в качестве CPM для данной пробы величину параметра A для этой пробы. Полученный коэффициент связывания откладывают на оси ординат и считывают с помощью калибровочной зависимости искомое содержание определяемого вещества в пробе на оси абсцисс.Based on the results of determining the parameter A for all samples of the standards, their B / Bo binding coefficients (%) are determined (taking into account the NSB parameter A determined for the non-specific binding sample), using the parameter A value for this sample as the CPM for each standard sample, and then construct the calibration dependence B / Bo (%) = f (C) of the binding coefficient B / Bo (%) on the concentration C of the test substance. A calibration dependence can be constructed, for example, using an interpolation cubic spline (this widely used method and its algorithm are given, in particular, in the instruction manual for the Beta-2 installation tA0.005.012I). Using the constructed calibration dependence, the content of the analyte dehydroepiandrosterone sulfate is found in each of the studied samples, calculating for each of them the parameter A based on the values of M and T determined for this sample. Next, for the test sample, the B / Bo binding coefficient (%) for this sample is calculated using the value of parameter A for this sample as CPM for this sample. The obtained binding coefficient is laid on the ordinate axis and the desired content of the analyte in the sample on the abscissa axis is read using a calibration curve.
Проведенные испытания полностью подтвердили преимущества заявленного способа перед известными. The tests fully confirmed the advantages of the claimed method over the known.
Так, в силу практической независимости результата анализа от величины тушения сцинтилляций в пробе существенно повышается точность анализа. Это можно характеризовать следующими значениями. So, due to the practical independence of the analysis result from the quenching of scintillations in the sample, the accuracy of the analysis is significantly increased. This can be characterized by the following values.
Образец контрольной сыворотки, содержащей 100 нг/мл дегидроэпиандростерона-сульфата, был разделен на 6 аликвот. В аликвоты был добавлен реальный тушитель - четыреххлористый углерод в концентрациях, обычно наблюдаемых в крови в динамике развития токсогенного шока при отравлении этим веществом. A control serum sample containing 100 ng / ml of dehydroepiandrosterone sulfate was divided into 6 aliquots. A real quencher was added to aliquots - carbon tetrachloride in concentrations usually observed in the blood in the dynamics of the development of toxogenic shock during poisoning with this substance.
Далее эти контрольные аликвоты были подвергнуты следующим анализам:
1) традиционным способом с регистрацией в качестве информационного параметра интенсивности мажоритарных совпадений на установке Бета-2;
2) предлагаемым способом с регистрацией мажоритарных М и тройных Т совпадений на установке Бета-2 и расчетом информационного параметра A по формуле A = (М+2Т)3/27Т2.Further, these control aliquots were subjected to the following analyzes:
1) in the traditional way with registration as an information parameter of the intensity of majority coincidences at the Beta-2 installation;
2) by the proposed method with registration of majority M and triple T matches on the Beta-2 installation and calculation of the information parameter A according to the formula A = (M + 2T) 3 / 27T 2 .
При традиционном способе были получены следующие значения: информационный параметр изменялся в пределах 4041 [CPM] до 151 [CPM] (т.е. в 26 раз) по мере увеличения содержания тушителя в пробе. В тех же пробах при предлагаемом способе параметр A изменялся в пределах 4408 - 5560 (т.е. на 20%). Соответственно этому определение содержания дегидроэпиандростерона-сульфата традиционным способом было совершенно недостоверным (результат колебался от 250 - 4000 нг/мл при истинном содержании 100 нг/мл), в то время как при реализации предлагаемого способа это содержание составило 90-130 нг/мл, т.е. ошибка составила от -10 до 30%, что является высокоточным результатом для подобного измерения. In the traditional method, the following values were obtained: the information parameter varied within 4041 [CPM] to 151 [CPM] (ie, 26 times) as the quencher content in the sample increased. In the same samples with the proposed method, parameter A varied between 4408 and 5560 (i.e., by 20%). Accordingly, the determination of the content of dehydroepiandrosterone sulfate in the traditional way was completely unreliable (the result ranged from 250 - 4000 ng / ml with a true content of 100 ng / ml), while when implementing the proposed method this content was 90-130 ng / ml, t .e. the error was from -10 to 30%, which is a highly accurate result for such a measurement.
Дополнительно было проведено сравнительное исследование ряда стероидных гормонов в сыворотке крови при различной патологии с помощью предлагаемого и традиционного методов с использованием промышленных диагностических наборов, меченных тритием, с альтернативными методами на основе диагностических наборов, меченных йодом-125. Методы на основе йода-125 также имея ряд недостатков, свободны от ошибки вызываемой тушением. При этом было установлено, что результаты, полученные известными способами с применением трития, отличаются до 5 раз от результатов, полученных предлагаемым способом. Наибольшее различие было именно в пробах, где наблюдалось тушение: гемолизированных, с метаболическим ацидозом, причем величина тушения, контролируемая по отношению М/Т, для каждой пробы, меченной тритиемб не превышала 4, т.е. тушение было весьма умеренным, а его влияние на результат с учетом формы калибровочной зависимости значительным. Различие результатов предлагаемого способа от альтернативного с использованием йода-125 составило не более 17%, что является небольшой величиной для данных видов анализов. In addition, a comparative study of a number of steroid hormones in blood serum was carried out for various pathologies using the proposed and traditional methods using industrial diagnostic kits labeled with tritium, with alternative methods based on diagnostic kits labeled with iodine-125. Methods based on iodine-125 also having a number of disadvantages, are free from the error caused by quenching. It was found that the results obtained by known methods using tritium differ up to 5 times from the results obtained by the proposed method. The greatest difference was precisely in the samples where quenching was observed: hemolysed, with metabolic acidosis, and the quenching value, controlled by the M / T ratio, for each sample labeled with tritiemb did not exceed 4, i.e. quenching was very moderate, and its influence on the result, taking into account the shape of the calibration dependence, is significant. The difference between the results of the proposed method from the alternative using iodine-125 was not more than 17%, which is a small value for these types of analyzes.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124711/14A RU2154831C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Method for applying radioimmunochemical analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124711/14A RU2154831C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Method for applying radioimmunochemical analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2154831C1 true RU2154831C1 (en) | 2000-08-20 |
Family
ID=20227325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99124711/14A RU2154831C1 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Method for applying radioimmunochemical analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2154831C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1425549A1 (en) * | 1986-12-10 | 1988-09-23 | Институт биоорганической химии АН БССР | Method of radioimmunological analysis of antigens |
| SU1681279A1 (en) * | 1989-04-24 | 1991-09-30 | Институт Прикладной Физики Ан Бсср | Method for measuring dielectric permittivity of liquids |
| RU2009505C1 (en) * | 1992-02-04 | 1994-03-15 | Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Method of luminescent immunoanalysis |
| RU2009606C1 (en) * | 1992-05-28 | 1994-03-15 | Коновалов Сергей Иванович | Device for limiting charging current for network power supply |
-
1999
- 1999-11-23 RU RU99124711/14A patent/RU2154831C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1425549A1 (en) * | 1986-12-10 | 1988-09-23 | Институт биоорганической химии АН БССР | Method of radioimmunological analysis of antigens |
| SU1681279A1 (en) * | 1989-04-24 | 1991-09-30 | Институт Прикладной Физики Ан Бсср | Method for measuring dielectric permittivity of liquids |
| RU2009505C1 (en) * | 1992-02-04 | 1994-03-15 | Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Method of luminescent immunoanalysis |
| RU2009606C1 (en) * | 1992-05-28 | 1994-03-15 | Коновалов Сергей Иванович | Device for limiting charging current for network power supply |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. RSL DHEA-S( 3 H) KIT. Radiossay systems Loboratories, Jnc. Cayalog Number 300., Carson, California, 1990. 2. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190323969A1 (en) | Zinc transporter 8 antibody chemiluminescence immunoassay kit and preparation method thereof | |
| Forest et al. | Evaluation of the analytical performance of the Boehringer Mannheim Elecsys® 2010 immunoanalyzer | |
| Booker et al. | Enzymatic immunoassay vs. gas/liquid chromatography for determination of phenobarbital and diphenylhydantoin in serum | |
| Gutcho et al. | Simultaneous radioassay of serum vitamin B12 and folic acid. | |
| CN109470868B (en) | Immunoassay method and system for hepatitis C virus antibody | |
| AU7755987A (en) | Determination of analyte concentration using two labelling markers | |
| CA2048302A1 (en) | Solubilization reagent for biological test samples | |
| US4231750A (en) | Methods for performing chemical assays using fluorescence and photon counting | |
| Keyfi et al. | Evaluation of 25-OH vitamin D by high performance liquid chromatography: validation and comparison with electrochemiluminescence | |
| CN111007269A (en) | Total I type collagen amino-terminal extension peptide chemiluminescence immunoassay kit and preparation method thereof | |
| Curry et al. | A systems approach to fluorescent immunoassay: general principles and representative applications. | |
| Li et al. | Rapid enzymatic determination of urinary oxalate. | |
| JP3719932B2 (en) | Scintillation proximity test | |
| US4452903A (en) | Assay method and reagent kit means for lipid-containing body fluid | |
| Chen et al. | Determination of bisphenol‐A levels in human amniotic fluid samples by liquid chromatography coupled with mass spectrometry | |
| De Boever et al. | Solid-phase chemiluminescence immunoassay for progesterone in unextracted serum. | |
| CN110618261A (en) | Chemiluminescence immunoassay kit for quantitatively detecting digoxin and preparation method thereof | |
| Degorce | HTRF®: Pioneering technology for high-throughput screening | |
| RU2154831C1 (en) | Method for applying radioimmunochemical analysis | |
| JPS61202142A (en) | Analyzing method and apparatus using absorbance | |
| Weaver et al. | Correlations on radioimmunoassay, fluorescence polarization immunoassay, and enzyme immunoassay of cannabis metabolites with gas chromatography/mass spectrometry analysis of 11-nor-Δ9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine specimens | |
| EP0318491A1 (en) | Determination of analyte concentration using two labelling markers | |
| Sidki et al. | Direct determination of phenobarbital in serum or plasma by polarization fluoroimmunoassay | |
| Plebani et al. | Fluorescence energy transfer immunoassay of digoxin in serum. | |
| JP3228791B2 (en) | Measuring method of antigen or antibody in sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051124 |