RU2139349C1 - Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethylthio)-acetyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid and 3-(carboxymethylthio)- -propionyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid - Google Patents
Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethylthio)-acetyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid and 3-(carboxymethylthio)- -propionyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2139349C1 RU2139349C1 RU96104261/13A RU96104261A RU2139349C1 RU 2139349 C1 RU2139349 C1 RU 2139349C1 RU 96104261/13 A RU96104261/13 A RU 96104261/13A RU 96104261 A RU96104261 A RU 96104261A RU 2139349 C1 RU2139349 C1 RU 2139349C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acid
- adca
- carboxymethylthio
- propionyl
- acetyl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 14
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 title abstract 3
- CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N adipyl-7-aminodesacetoxycephalosporanic acid Natural products CC1=C(N2[C@H](SC1)[C@H](NC(=O)CCCCC(O)=O)C2=O)C(O)=O CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N 0.000 title abstract 3
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 45
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- -1 2- (carboxyethylthio) acetyl Chemical group 0.000 claims description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 abstract description 19
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 abstract description 17
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- RKWPEWMDPJMQAB-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-4-oxo-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound SC(=O)C(C)CC(O)=O RKWPEWMDPJMQAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 101150091913 cefE gene Proteins 0.000 description 43
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 19
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 description 14
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 8
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 description 6
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 101150022041 penDE gene Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 101150097026 facA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 2
- 240000002228 Cynara humilis Species 0.000 description 2
- 235000005921 Cynara humilis Nutrition 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1 JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589746 Pseudomonas sp. SE83 Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 2
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical group OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIMWXHQLMOKTMT-UHFFFAOYSA-N 5-oxo-5-sulfanylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC(S)=O QIMWXHQLMOKTMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKEXHDRGMPOQQN-RZVRUWJTSA-N N[C@H](C(=O)O)CCCC(=O)O.N[C@@H](CCCC(=O)O)C(=O)O Chemical compound N[C@H](C(=O)O)CCCC(=O)O.N[C@@H](CCCC(=O)O)C(=O)O PKEXHDRGMPOQQN-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000284696 Penicillium rubens Wisconsin 54-1255 Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N dichloramine Chemical group ClNCl JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.OC(=O)CCCCC(O)=O YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область изобретения и краткое описание известного уровня техники
Данное изобретение относится к процессу биосинтеза для получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).The scope of the invention and a brief description of the prior art
This invention relates to a biosynthesis process for the preparation and isolation of 7-aminodetacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA).
Беталактамные антибиотики образуют наиболее важную группу антибиотических соединений с длительной историей клинического применения. В этой группе выделяются пенициллины и цефалоспорины. Эти вещества природно продуцируются нитчатыми грибами Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum соответственно. Betalactam antibiotics form the most important group of antibiotic compounds with a long history of clinical use. Penicillins and cephalosporins are released in this group. These substances are naturally produced by the filamentous fungi Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum, respectively.
В результате применения методов улучшения классического штамма уровня продукции антибиотиков Penicillium chrisogenum и Acremonium chrisogenum значительно увеличены за последние десятилетия. С увеличением знаний о метаболических путях биосинтеза, приводящих к продукции пенициллинов и цефалоспоринов, и приходом генной инженерии стали доступны новые средства повышения продуктивности штаммов и получения производных соединений in vivo. As a result of applying methods to improve the classic strain, the antibiotic production levels of Penicillium chrisogenum and Acremonium chrisogenum have been significantly increased over the past decades. With an increase in knowledge of the metabolic pathways of biosynthesis leading to the production of penicillins and cephalosporins, and the advent of genetic engineering, new tools have become available to increase the productivity of strains and obtain derivatives of compounds in vivo.
Большая часть ферментов, участвующих в биосинтезе беталактамов, уже идентифицирована, и клонированы соответствующие им гены, что можно найти у Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 -264 (путь биосинтеза и ферменты), и Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461 - 495 (клонирование генов). Most of the enzymes involved in the biosynthesis of betalactams have already been identified and their corresponding genes have been cloned, as can be found in Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (biosynthesis pathway and enzymes), and Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (gene cloning).
Первые два этапа в биосинтезе пенициллина у P. chrisogenum являются конденсацией трех аминокислот, L-5-амино-5- карбоксипентановой кислоты (L-α-аминоадипиновой кислоты) (A), L-цистеина (C) и L-валина (V) в трипептид LLD - ACV с последующей циклизацией этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную беталактамную структуру. The first two steps in penicillin biosynthesis in P. chrisogenum are the condensation of three amino acids, L-5-amino-5-carboxypentanoic acid (L-α-aminoadipic acid) (A), L-cysteine (C) and L-valine (V) to LLD tripeptide - ACV followed by cyclization of this tripeptide to form isopenicillin N. This compound contains a typical betalactam structure.
Третий этап включает замену гидрофильной боковой цепи из L- 5амино-5-карбоксипентановой кислоты на гидрофобную боковую цепь путем воздействия фермента ацетилтрансферазы (AT). При промышленном способе производства пенициллина G боковой цепью выбора является фенилуксусная кислота (ФУ). В ЕР-А-0 532 341 раскрыто применение в качестве сырья для производства адипата (5- карбоксипентаноата). Включение этого субстрата приводит к образованию пенициллинового производного с 5-карбоксипентаноиловой боковой цепью, а именно 5-карбоксипентаноил-6- аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацетилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97 -99). Ферментативная реакция обмена, опосредуемая AT, происходит внутри клеточной органеллы, микротельца, что было описано в ЕР-А-0 488 180. The third step involves replacing the hydrophilic side chain of L-5-amino-5-carboxypentanoic acid with a hydrophobic side chain by exposure to the enzyme acetyltransferase (AT). In an industrial process for the production of penicillin G, the side chain of choice is phenylacetic acid (FU). EP-A-0 532 341 discloses the use as a raw material for the production of adipate (5-carboxypentanoate). The inclusion of this substrate leads to the formation of a penicillin derivative with a 5-carboxypentanoyl side chain, namely 5-carboxypentanoyl-6-aminopenicillanic acid. This inclusion is due to the fact that acetyltransferase has proven broad substrate specificity (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97-99). An enzymatic exchange reaction mediated by AT occurs within the cell organelle, the microbodies, as described in EP-A-0 488 180.
Цефалоспорины значительно более дорогостоящи, чем пенициллины. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем ряда химических превращений. Другой причиной является то, что до сих пор ферментации могут подвергаться только цефалоспорины с D-5-амино-5-карбоксипентаноиловой боковой цепью. Цефалоспорин C, несомненно, наиболее важный исходный материал в этом отношении, очень хорошо растворим в воде при любом pH, что подразумевает длительные и дорогие процессы выделения с использованием громоздкой и дорогостоящей колоночной хроматографии. Цефалоспорин C, полученный таким образом, необходимо превращать в терапевтически применяемые цефалоспорины с помощью ряда химических и ферментативных превращений. Cephalosporins are significantly more expensive than penicillins. One of the reasons for this is that some cephalosporins (e.g. cephalexin) are obtained from penicillins through a series of chemical transformations. Another reason is that so far only cephalosporins with a D-5-amino-5-carboxypentanoyl side chain can be fermented. Cephalosporin C, undoubtedly the most important starting material in this regard, is very soluble in water at any pH, which implies lengthy and expensive isolation processes using bulky and expensive column chromatography. The cephalosporin C thus obtained must be converted into therapeutically useful cephalosporins by a series of chemical and enzymatic transformations.
Промежуточная 7-АДЦК в настоящее время производится с помощью химического получения производных пенициллина G. Необходимые этапы химического процесса получения 7-АДЦК включают расширение пятичленной структуры пенициллинового кольца до 6- членной структуры цефалоспоринового кольца. Однако фермент экспандаза из нитчатой бактерии Streptomyces clavuligerus может осуществлять подобное расширение кольца. При введении в P. chrysogenum он может превращать пенициллиновую кольцевую структуру в цефалоспориновую кольцевую структуру, как описано у Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283 - 289; и в ЕР-А- 0 532 341 и ЕР-А- 0 540 210. Фермент экспандаза хорошо охарактеризован (ЕР-А- 0 366 354) как биохимически, так и функционально, так же как и соответствующий ему ген. Были описаны как физические карты гена cefE (ЕР-А- 0 233 715), последовательность ДНК, так и исследования по трансформации P.chrysogenum с помощью cefE. Еще одним источником подходящего фермента расширения кольца является нитчатая бактерия Nocardia lactamdurans (первоначально Streptomyces lactamdurans). Описаны как биохимические свойства этого фермента, так и последовательность ДНК гена (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453 - 458 соответственно). Intermediate 7-ADCA is currently being produced by chemically preparing penicillin G derivatives. The necessary steps in the chemical process for producing 7-ADCA include expanding the five-membered structure of the penicillin ring to the 6-membered structure of the cephalosporin ring. However, the enzyme expandase from the filamentous bacterium Streptomyces clavuligerus can effect such ring expansion. When introduced into P. chrysogenum, it can convert the penicillin ring structure to a cephalosporin ring structure, as described by Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289; and in EP-A-0 532 341 and EP-A-0 540 210. The expandase enzyme is well characterized (EP-A-0 366 354) both biochemically and functionally, as well as its corresponding gene. Physical maps of the cefE gene (EP-A-0 233 715), a DNA sequence, and studies of P. chrysogenum transformation using cefE have been described. Another source of a suitable ring expansion enzyme is the filamentous bacterium Nocardia lactamdurans (originally Streptomyces lactamdurans). Both the biochemical properties of this enzyme and the DNA sequence of the gene are described (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993 ), 453 - 458, respectively).
Более конкретно в ЕР-А-0 532 341 раскрывается использование фермента экспандазы в P. chrysogenum в сочетании с 5- карбоксипентаноиловой боковой цепью в качестве сырьевого источника, который используется как субстрат для ацетилтрансферазного фермента в P. chrysogenum. Это приводит к образованию 5- карбоксипентаноил-6-АПК, которая превращается с помощью фермента экспандазы, введенного в штамм P. chrysogenum, с получением 5- карбоксипентаноил-7-АДЦК. В конце предполагается удаление 5- карбоксипентаноиловой боковой цепи, дающее 7-АДЦК в качестве конечного продукта. В патентной заявке ЕР-А- 0 540 210 описывается сходный процесс получения 7-АЦК, включающий дополнительные этапы превращения 3-метильной боковой цепи кольца АДЦК в 3-атоксиметильную боковую цепь. Однако в вышеуказанных патентных заявках не раскрывается эффективный и экономически эффективный процесс, потому что прежде всего не была решена проблема своевременной экспрессии фермента экспандазы в клетке, сопутствующей экспрессии фермента ацетилтрансферазы. More specifically, EP-A-0 532 341 discloses the use of the expandase enzyme in P. chrysogenum in combination with the 5-carboxypentanoyl side chain as a feed source, which is used as a substrate for the acetyltransferase enzyme in P. chrysogenum. This leads to the formation of 5-carboxypentanoyl-6-APA, which is converted by the expandase enzyme introduced into the P. chrysogenum strain to give 5-carboxypentanoyl-7-ADCA. In the end, the removal of the 5-carboxypentanoyl side chain is expected to give 7-ADCA as the final product. EP-A-0 540 210 describes a similar process for the preparation of 7-ACC, including the additional steps of converting the 3-methyl side chain of the ADCC ring into a 3-atoxymethyl side chain. However, the above patent applications do not disclose an effective and cost-effective process, because the problem of timely expression of the expandase enzyme in the cell, concomitant expression of the acetyltransferase enzyme, was not solved in the first place.
В отличие от этого данное изобретение представляет эффективный способ продукции 7-АДЦК, при котором экспандаза и ацетилтрансфераза экспрессируются одновременно. In contrast, this invention provides an efficient method for the production of 7-ADCA, in which expandase and acetyltransferase are expressed simultaneously.
Кроме того, применение нового предшественника боковой, а именно 3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты, также раскрыто в этом изобретении. Этот предшественник очень эффективно включается P. chrysogenum в соответствующие пенициллины, кольцо которых расширяется с помощью последующего действия фермента экспандазы. In addition, the use of a new precursor of lateral, namely 3'-carboxymethylthiopropionic acid, is also disclosed in this invention. This precursor is very efficiently incorporated by P. chrysogenum into the corresponding penicillins, the ring of which expands by the subsequent action of the expandase enzyme.
К тому же до сих пор не был описан эффективный способ выделения производного 7-АДЦК из жидкой ферментационной среды перед его диацилированием. Данное изобретение представляет эффективную процедуру экстракции растворителем для выделения производного 7-АДЦК. In addition, an effective method for isolating a 7-ADCA derivative from a liquid fermentation medium before its diacylation has not yet been described. This invention provides an effective solvent extraction procedure for isolating the 7-ADCA derivative.
С помощью данного изобретения обеспечивается эффективный завершенный процесс получения 7-АДЦК, включающий этапы реакции, не раскрытые и не предложенные в прототипах до сих пор. Using this invention provides an effective complete process for producing 7-ADCC, including reaction steps not disclosed and not proposed in the prototypes so far.
Также путем применения данного изобретения и аналогично описанию, данному в ЕР-А-0540210, может быть получена 7-АЦК по завершенному эффективному процессу таким образом. Also, by applying the present invention and similarly to the description given in EP-A-0540210, 7-ACC can be obtained by completing an effective process in this way.
Краткое описание фигур. A brief description of the figures.
Фиг.1: функциональная карта плазмиды pVcTNE. Figure 1: functional map of the plasmid pVcTNE.
Фиг.2: функциональная карта плазмиды pMcTSE. Figure 2: functional map of the plasmid pMcTSE.
Фиг.3: функциональная карта плазмиды pMcTNde. Figure 3: functional map of the plasmid pMcTNde.
Фиг.4: функциональная карта плазмиды pGNETA. Figure 4: functional map of the plasmid pGNETA.
Фиг.5: функциональная карта плазмиды pGSETA. Figure 5: functional map of the plasmid pGSETA.
Фиг.6: функциональная карта плазмиды pANETA. 6: functional map of the plasmid pANETA.
Фиг.7: функциональная карта плазмиды pASETA. 7: functional map of the plasmid pASETA.
Фиг. 8: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше) (нижние строки) в сравнении с последовательностью продукта I ПЦР (верхние строки). FIG. 8: DNA sequence of cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., Supra) (lower lines) compared to the sequence of PCR product I (upper lines).
Краткое описание перечня последовательностей
Последовательности ИД NN с 1 по 13: олигонуклеотиды, использованные в конструировании кассеты экспрессии P. chrysogenum для генов cefE Streptomyces clavuligerus и Nocardia lactamdurans.Summary of Sequence Listing
Sequences of
Последовательность ИД N 14: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше).
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение, таким образом, представляет способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем:
a) трансформации штамма Penicillium chrysogenum с помощью гена экспандазы под транскрипционной и трансляционной регуляцией сигналов экспрессии нитчатого гриба;
b) выращивания указанного штамма в ферментере в культуральной среде и добавления к указанной культуральной среде 3'- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира, подходящих для получения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-6-аминопенициллановой кислоты (2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-6-АПК), кольцо которых in situ расширяется с образованием 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АЛЦК;
с) выделения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК из жидкой ферментационной среды;
d) децилирования указанной 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК; и
е) выделения кристаллической 7-АДЦК.SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention thus provides a process for the preparation and isolation of 7-aminodetacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) by:
a) transforming the Penicillium chrysogenum strain using the expandase gene under the transcriptional and translational regulation of filamentous fungal expression signals;
b) growing said strain in a fermenter in a culture medium and adding 3'-carboxymethylthiopropionic acid or a salt or ester thereof suitable for preparing 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-6-aminopenicillanic acid ( 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-6-APA), the ring of which in situ expands to form 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ALTC;
c) isolating 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA from a liquid fermentation medium;
d) decylating said 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA; and
e) isolation of crystalline 7-ADCC.
Предпочтительно стадия (е) является стадией фильтрации. Preferably, step (e) is a filtration step.
Предпочтительно экспрессия гена экспандазы находится под транскрипционной и трансляционной регуляцией соответствующих контролирующих элементов АТ-гена, что обеспечивает одновременную координацию экспрессии указанных генов. Preferably, the expression of the expandase gene is under the transcriptional and translational regulation of the corresponding control elements of the AT gene, which ensures simultaneous coordination of the expression of these genes.
Предпочтительно 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК выделяют из жидкой ферментационной среды путем экстрагирования фильтрата среды органическим растворителем, несмешиваемым с водой при pH ниже примерно 4.5 и обратным экстрагированием тех же самых веществ водой при pH от 4 до 10. Preferably, 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are isolated from the liquid fermentation medium by extraction of the medium filtrate with an organic solvent immiscible with water at a pH below about 4.5 and back extraction of the same substances with water at a pH from 4 to 10.
Кроме того, представлены вектор рекомбинантной ДНК, содержащий ДНК, кодирующую экспендазу, функционально связанную с транскрипционными и трансляционными контролирующими элементами АТ- гена P. chrysogenum или gpdA гена A. nidulans, и клетки-хозяева, трансформированные такой ДНК. In addition, a recombinant DNA vector is provided that contains expendase-coding DNA operably linked to the transcriptional and translational control elements of the P. chrysogenum AT gene or gpdA of the A. nidulans gene, and host cells transformed with such DNA.
Детальное описание изобретения
Данное изобретение относится к использованию функциональных генных конструкций в P. chrysogenum для расширения in vivo структуры пенициллинового кольца в сочетании с использованием нового субстрата для ферментов биосинтеза для образования производного ключевого промежуточного соединения в биосинтезе цифалоспоринов, 7-аминодезациотоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет химическое такое строение, которое дает возможность эффективной экстракции растворителем, обеспечивая таким образом экономически привлекательный процесс выделения.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
This invention relates to the use of functional gene constructs in P. chrysogenum to expand the in vivo structure of the penicillin ring in combination with the use of a new substrate for biosynthesis enzymes to form a derivative of a key intermediate in the biosynthesis of cyfalosporins, 7-aminodisaciotoxicefalosporanic acid or 7-ADCA. This derivative has a chemical structure that enables efficient solvent extraction, thereby providing an economically attractive isolation process.
Трансформация P. chrysogenum может, в принципе, достигаться с помощью различных средств доставки ДНК, такими как опосредуемое PEG-Ca поглощение протопластов, электропорация или методы обстрела частицами и отбором трансформантов. Смотрите, например, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Применение доминантных и недоминантных маркеров селекции было описано (Van den Hondel, выше). Были описаны маркеры селекции как гомологичного (происходящие из P. chrysogenum) и гетерологичного (происходящие не из P. chrysogenum) происхождения. Transformation of P. chrysogenum can, in principle, be achieved using various DNA delivery vehicles, such as PEG-Ca mediated uptake of protoplasts, electroporation, or particle bombardment and selection of transformants. See, for example, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). The use of dominant and non-dominant selection markers has been described (Van den Hondel, supra). Selection markers have been described as homologous (originating from P. chrysogenum) and heterologous (originating not from P. chrysogenum) origin.
Применение различных маркеров селекции трансформантов, гомологичных или гетерологичных, в присутствии или в отсутствие векторных последовательностей, физически связанных или нет с неселектируемой ДНК, при селекции трансформантов хорошо известно. The use of various selection markers of transformants, homologous or heterologous, in the presence or absence of vector sequences, physically or not physically associated with non-selectable DNA, in the selection of transformants is well known.
Предпочтительно для селекции трансформантов P. chrysogenum используется гомологичный маркер селекции, чтобы ограничить количество гетерологичной ДНК, вводимой в P. chrysogenum. Наиболее предпочтительно использовать доминантный маркер селекции, который может селективно удаляться из трансформированного штамма, например, ген amdS A. nidulans или других нитчатых грибов (Европейская патентная заявка N 94 201 896.1). Эти предпочтительные характеристики маркера селекции трансформанта P. chrysogenum очень благоприятны для процесса и для процедур регистрации продукта, так как в процессе не участвуют маркеры, связанные с антибиотикоустойчивостью, или не будут вводиться в окружающую среду. Preferably, a homologous selection marker is used to select P. chrysogenum transformants to limit the amount of heterologous DNA introduced into P. chrysogenum. It is most preferable to use a dominant selection marker that can be selectively removed from the transformed strain, for example, the amdS gene of A. nidulans or other filamentous fungi (European patent application N 94 201 896.1). These preferred characteristics of the P. chrysogenum transformant selection marker are very favorable for the process and for product registration procedures, since the markers associated with antibiotic resistance are not involved or will not be introduced into the environment.
При наиболее предпочтительном воплощении маркер селекции amdS, который может селективно удаляться из штамма, дает возможность повторных циклов трансформации с использованием той же самой доминантной селекции снова и снова. Это свойство освобождения от маркера селекции у новых штаммов P. chrysogenum, экспрессирующих экспандазу, является определяющим для быстрой разработки высокопродуктивных штаммов по программе улучшения промышленных штаммов. In the most preferred embodiment, the amdS selection marker, which can be selectively removed from the strain, allows repeated transformation cycles using the same dominant selection again and again. This property of releasing from the selection marker in new P. chrysogenum strains expressing expansion, is crucial for the rapid development of highly productive strains under the program for improving industrial strains.
Способность к реакции расширения кольца, опосредуемая ферментом экспандазой, вводится и экспрессируется таким путем в P. chrysogenum, например, штамме Wisconsin 54-1255. Эта реакция расширения кольца происходит также и в их мутантах, дающих увеличенный выход беталактамов. Должно быть понятно, что в этом случае характеристики среды должны быть слегка адаптированы для получения эффективного роста. The ability of the ring expansion reaction mediated by the expandase enzyme is introduced and expressed in this way in P. chrysogenum, for example, strain Wisconsin 54-1255. This ring expansion reaction also occurs in their mutants, giving an increased yield of betalactams. It should be understood that in this case, the characteristics of the medium must be slightly adapted to obtain effective growth.
Кроме того, ген cefE помещается под транскрипционный и трансляционный контроль соответствующих контролирующих ген элементов нитчатого гриба, предпочтительно происходящих из ацилтрансферазного (AT) гена P. chrysogenum, что дает возможность их экспрессии в оптимальных временных рамках, синхронизированных с действием самого фермента ацетилтрансферазы. Эти меры являются решающими для эффективности реакции расширения кольца в пенициллиновой молекуле. In addition, the cefE gene is placed under transcriptional and translational control of the corresponding gene-controlling elements of the filamentous fungus, preferably originating from the acyltransferase (AT) gene of P. chrysogenum, which makes it possible to express them in optimal time frames synchronized with the action of the acetyltransferase enzyme itself. These measures are crucial for the effectiveness of the ring expansion reaction in the penicillin molecule.
В дополнение к синхронизированной экспрессии генов, кодирующих экспандазу и трансферазу, могло быть благоприятным для разработки экономичного процесса производства совместное расположение части экспандазных ферментов с ацетилтрансферазой в микротельцах (внутриклеточная локализация ацетилтрансферазы). При этих предпочтительных осуществлениях будет очень сильно снижаться количество пенициллиновых побочных продуктов, которые не допускаются в конечном продукте 7-АДЦК регистрационными органами. In addition to the synchronized expression of genes encoding expandase and transferase, it could be favorable to develop a cost-effective production process by co-locating a portion of the expandase enzymes with acetyltransferase in microbodies (intracellular localization of acetyltransferase). With these preferred embodiments, the amount of penicillin by-products that are not allowed in the final product of the 7-ADCA by the registration authorities will be greatly reduced.
Резюмируя, в данном изобретении раскрывается, как действие фермента экспандазы, введенного в P. chrysogenum, может быть нацелено на расширение пенициллинового кольца на основе синхронизированной экспрессии. In summary, this invention discloses how the action of the expandase enzyme introduced into P. chrysogenum can be aimed at expanding the penicillin ring based on synchronized expression.
По этому изобретению промежуточные беталактамные соединения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7- АДЦК продуцируются P. chrysogenum с помощью добавления 3- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира. Подходящими солями, например, являются соли натрия или калия. Они же эффективно выделяются из среды путем простой экстракции растворителем, например, следующим образом. According to this invention, the intermediate betalactam compounds 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are produced by P. chrysogenum by adding 3-carboxymethylthiopropionic acid or its salt or ester. Suitable salts, for example, are sodium or potassium salts. They are effectively isolated from the medium by simple extraction with a solvent, for example, as follows.
Жидкая питательная среда отфильтровывается и к фильтрату добавляется не смешиваемый с водой органический растворитель. pH устанавливается так, чтобы проэкстрагировать цефалоспорин из водного слоя. Диапазон pH должен находиться ниже 4.5; предпочтительно в интервале от 4 до 1, более предпочтительно - от 2 до 1. Таким образом цефалоспорин отделяется от многих посторонних примесей, присутствующих в ферментационной среде. Предпочтительно используется небольшой объем органического растворителя, что дает концентрированный раствор цефалоспорина, и таким образом достигается снижение объемных скоростей потоков. Вторая возможность состоит в полной экстракции жидкой питательной среды при pH, равном 4 и ниже. Предпочтительно жидкая питательная среда экстрагируется в интервале от 4 до 1 органическим растворителем, несмешиваемым с водой. The liquid culture medium is filtered off and an organic solvent not miscible with water is added to the filtrate. The pH is adjusted to extract cephalosporin from the aqueous layer. The pH range should be below 4.5; preferably in the range from 4 to 1, more preferably from 2 to 1. Thus, cephalosporin is separated from many foreign impurities present in the fermentation medium. A small volume of an organic solvent is preferably used, which gives a concentrated solution of cephalosporin, and thus a reduction in volumetric flow rates is achieved. The second possibility is the complete extraction of the liquid nutrient medium at a pH of 4 or lower. Preferably, the liquid culture medium is extracted in the range of 4 to 1 with an organic solvent immiscible with water.
Может использоваться любой растворитель, который не взаимодействует с молекулой цефалоспорина. Подходящими растворителями, например, являются бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, подобные бутанолу, и т.д. Предпочтительно используются 1-бутанол или изобутанол. Any solvent that does not interact with the cephalosporin molecule can be used. Suitable solvents, for example, are butyl acetate, ethyl acetate, methyl isobutyl ketone, alcohols like butanol, etc. Preferably, 1-butanol or isobutanol is used.
Затем цефалоспорин экстрагируется обратно водой при pH от 4 до 10, предпочтительно от 6 до 9. И снова конечный объем сильно снижается, выделение может проводиться при температурах от 0 до 50oC и предпочтительно при температурах окружающей среды.Then cephalosporin is extracted back with water at a pH of from 4 to 10, preferably from 6 to 9. And again, the final volume is greatly reduced, the selection can be carried out at temperatures from 0 to 50 o C and preferably at ambient temperatures.
Водный раствор цефалоспорина, полученный таким образом, обрабатывается подходящим ферментом для удаления 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропиониловой боковой цепи и получения желаемой 7-АДЦК. The cephalosporin aqueous solution thus obtained is treated with a suitable enzyme to remove the 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl side chain and obtain the desired 7-ADCA.
Предпочтительно используется иммобилизированный фермент, чтобы было возможно использовать этот фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов была подробно описана в ЕР-А-0222462. pH водного раствора имеет значение, равное, например, от pH 4 до pH 9, при котором реакция деградации цефалоспорина минимизирована, а желаемое превращение с помощью фермента оптимально. Таким образом, фермент добавляется к водному раствору цефалоспорина при поддержании в то же время pH на соответствующем уровне с помощью, например, добавления неорганического основания, такого, как раствор гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием. Другая возможность состоит в применении иммобилизованного фермента в колонке с фиксированным или ожиженным слоем или использовании фермента в растворе и удалении продуктов с помощью мембранной фильтрации. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешиваемого с водой. An immobilized enzyme is preferably used so that it is possible to reuse this enzyme. The methodology for producing such particles and immobilizing enzymes has been described in detail in EP-A-0222462. The pH of the aqueous solution has a value equal, for example, from
Подходящие ферменты, например, получаются из микроорганизма Pseudomonas SY77, имеющего мутацию в одной или более позиций: 62, 177, 178 и 179. Также могут использоваться ферменты из других микроорганизмов Pseudomonas, предпочтительно Pseudomonas SY77, имеющих произвольно мутацию в одной или более позиций, соответствующих позициям 62, 177, 178 и 179 у Pseudomonas SY77. Suitable enzymes, for example, are derived from a Pseudomonas SY77 microorganism having a mutation in one or more positions: 62, 177, 178 and 179. Enzymes from other Pseudomonas microorganisms, preferably Pseudomonas SY77, having a mutation in one or more positions corresponding to one can also be used.
После доведения pH до примерно от 0.1 до 1.5 слои разделяются и pH водного слоя доводится до примерно 2 - 5. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается. After adjusting the pH to about 0.1 to 1.5, the layers are separated and the pH of the aqueous layer is adjusted to about 2-5. The crystalline 7-ADCA is then filtered off.
Деацилирование может также выполняться химически известным способом, например, через образование иминохлоридной боковой цепи путем добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10oC и затем изобутанола при температуре окружающей среды или ниже.Deacylation can also be carried out in a chemically known manner, for example, through the formation of an iminochloride side chain by adding phosphorus pentachloride at a temperature below 10 ° C. and then isobutanol at ambient temperature or below.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения. The following examples are offered by way of illustration, but not limitation.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспрессия гена cefE Streptomyces и Nocardia в Penicillium chrysogenum.EXAMPLES
Example 1
Expression of the cefE Streptomyces and Nocardia gene in Penicillium chrysogenum.
а. Общие процедуры клонирования гена и генной трансформации. a. General procedures for gene cloning and gene transformation.
В данной заявке используются обычные методики, используемые в процедурах клонирования гена. Эти методики включают полимеразные цепные реакции (ПЦР), синтез синтетических олигонуклеотидов, анализ нуклеотидной последовательности ДНК, ферментативное лигирование и рестрикцию ДНК, субклонирование вектора в E. coli, трансформацию и селекцию трансформантов, выделение и очистку ДНК, характеристику ДНК с помощью блот-анализа по Саузерну и меченых 32P зондов, мечение ДНК 32P путем случайного примирования. Все эти методики очень хорошо известны в этой области технологии и соответственно описаны во многих источниках. Смотрите, например, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, U.S.A. (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPher-son et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).This application uses the usual techniques used in gene cloning procedures. These techniques include polymerase chain reactions (PCR), synthesis of synthetic oligonucleotides, DNA nucleotide sequence analysis, enzymatic ligation and DNA restriction, subcloning of the vector in E. coli, transformation and selection of transformants, DNA isolation and purification, DNA characterization using blot analysis by blot analysis Southern and 32 P-labeled probes, labeling 32 P DNA by random priming. All these techniques are very well known in this field of technology and are accordingly described in many sources. See, for example, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPherson et al., PCR, a Practical Approach , IRL Press (1991).
Общие процедуры, использованные при трансформации нитчатых грибов и селекции трансформантов, включают получение протопластов грибов, перенос ДНК и режим регенерации протопластов, очистку и определение свойств трансформантов. Все эти процедуры хорошо известны в этой области знаний и очень хорошо документированы в: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds. ), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992). General procedures used in the transformation of filamentous fungi and selection of transformants include the preparation of fungal protoplasts, DNA transfer and protoplast regeneration mode, and the purification and determination of the properties of transformants. All of these procedures are well known in the art and are very well documented in: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992).
Более конкретное применение технологии клонирования генов и генной трансформации в отношении Penicillium chrysogenum очень хорошо документально отражено у Bennett and Lasure (выше) и Finkelstein и Ball (выше). A more specific application of gene cloning and gene transformation technology for Penicillium chrysogenum is very well documented by Bennett and Lasure (above) and Finkelstein and Ball (above).
- Синтетические олигонуклеотиды ДНК синтезированы с использованием коммерческого синтезатора ДНК (Applied Biosystems, CA,U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителя. - Synthetic DNA oligonucleotides synthesized using a commercial DNA synthesizer (Applied Biosystems, CA, U.S.A.) In accordance with the manufacturer's instructions.
- ПЦР выполняется с использованием коммерческого автоматического аппарата для ПЦР (Perkin Elmer, U.S.A.) и ДНК- полимеразы (Perkin Elmer, U.S.A.) по инструкциям производителя. - PCR is performed using a commercial automatic PCR apparatus (Perkin Elmer, U.S.A.) and DNA polymerase (Perkin Elmer, U.S.A.) according to the manufacturer's instructions.
- Процедуру hGC ПЦР (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) использовали, чтобы сделать возможной амплификацию кодирующих областей гена cefE хромосомной ДНК N. lactamdurans и S. clavuligerus. - The hGC PCR procedure (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) was used to enable amplification of the coding regions of the cefE gene of the chromosomal DNA of N. lactamdurans and S. clavuligerus.
- Ферменты рестрикции и другие ферменты для модификации ДНК получены из BRL (MD, U.S.A.) и использовались в соответствии с инструкциями производителя. - Restriction enzymes and other enzymes for DNA modification obtained from BRL (MD, U.S.A.) and used in accordance with the manufacturer's instructions.
Вектор Е. coli pBluescript получен от Stratagene (СА, U.S.A.). Vector E. coli pBluescript obtained from Stratagene (CA, U.S.A.).
- Другие использованные химреактивы все имеют аналитическую чистоту и получены от разных поставщиков. - The other chemicals used are all of analytical purity and obtained from different suppliers.
- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК выполняли с использованием аппарата для автоматического анализа последовательности ДНК (Applied Biosystem), основанного на детекции, специфичной для флюоресцентной метки в соответствии с инструкциями производителя. - DNA nucleotide sequence analysis was performed using an apparatus for automatic DNA sequence analysis (Applied Biosystem) based on detection specific for the fluorescent label in accordance with the manufacturer's instructions.
b. Культивирование микроорганизмов
Streptomyces clavuligerus АТСС 27 064 выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).b. Microorganism cultivation
Streptomyces clavuligerus ATCC 27,064 is grown in trypsinized soy broth (Difco). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the cefE gene (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).
Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 также выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Coque et al., выше). Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 is also grown in trypsinized soy broth (Difco). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the cefE gene (Coque et al., Supra).
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28 089) выращивается в полной среде YPD (YPD; 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения 5' и 3' регуляторных областей гена penDE, необходимых для экспрессии гена cefE. Penicillium chrysogenim АТСС 28 089 также используется в качестве хозяина для гена cefE в экспериментах по трансформации. Пригодны также другие штаммы Penicillium chrysogenum, включая мутанты штамма Wisconsin 54-1255, дающие увеличенный выход беталактамов. В зависимости от использованного маркера селекции трансформанта могут использоваться штаммы P. chrysogenum, содержащие мутации в гене pyrG, niaD или facA. Эти мутантные штаммы могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в этой области технологии (Cantoral, Bio/technol. 5(1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519). Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28 089) is grown in complete YPD medium (YPD; 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose). The chromosomal DNA of this strain was used to isolate the 5 'and 3' regulatory regions of the penDE gene necessary for expression of the cefE gene. Penicillium chrysogenim ATCC 28 089 is also used as the host for the cefE gene in transformation experiments. Other strains of Penicillium chrysogenum are also suitable, including mutants of the Wisconsin strain 54-1255 giving an increased yield of betalactams. Depending on the transformant selection marker used, P. chrysogenum strains containing mutations in the pyrG, niaD or facA gene can be used. These mutant strains can be obtained using methods well known in the art (Cantoral, Bio / technol. 5 (1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).
Культивирование P. chrysogenum для образования протопластов, используемых при трансформации, также производилось в среде YPD. Cultivation of P. chrysogenum for the formation of protoplasts used in transformation was also performed in YPD medium.
Хорошо известно, что процедуры образования протопластов и регенерации могут слегка отличаться в зависимости от конкретного использования штамма Penicillium chrysogenum и примененной процедуры селекции трансформанта. It is well known that protoplast formation and regeneration procedures may vary slightly depending on the specific use of the Penicillium chrysogenum strain and the transformant selection procedure used.
Е. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene и NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) сохранялись и культивировались с помощью использования стандартной среды для культивирования Е. coli, (Sambrook, выше). E. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene and NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) were preserved and cultured using standard E. coli culture medium (Sambrook, supra).
с.Конструирование кассет экспрессии cefE
Кассеты экспрессии cefE перечислены в таблице 1 (см. в конце описания), которая также объясняет номенклатуру, которая была использована для этих плазмид.C. Construction of cefE expression cassettes
CefE expression cassettes are listed in Table 1 (see end of description), which also explains the nomenclature that was used for these plasmids.
Опубликованные нуклеотидные последовательности гена cefE S.clavuligerus (Kovacevic, выше); гена cefE N. lac tamdurans (Coque, выше); гена gpdA A. nidulans (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); гена penDE P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) были использованы для создания синтетических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице II (см. в конце описания). Published nucleotide sequences of the S. clavuligerus cefE gene (Kovacevic, supra); cefE gene N. lac tamdurans (Coque, supra); A. nidulans gpdA gene (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); penDE gene P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) were used to create the synthetic oligonucleotides listed in the table II (see the end of the description).
с1. Конструирование плазмид экспрессии cefE Е. coli, pMCTSE и pMCTNE
ПЦР, 1: cefE N. lactamdurans
В первой ПЦР с использованием хромосомной ДНК N. lactamdurans и олигонуклеотидов 1 и 2 была получена открытая рамка считывания cefE N. lactamdurans в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт XbaI на 3'-конце.c1. Construction of E. coli cefE expression plasmids, pMCTSE and pMCTNE
PCR, 1: cefE N. lactamdurans
In the first PCR using N. lactamdurans chromosomal DNA and
ПЦР, 2: cefE S. clavuligerus
Во второй ПЦР с использованием хромосомной ДНК S. clavuligerus и олигонуклеотидов 3 и 4 была получена открытая рамка считывания cefE S. clavuligerus в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, также содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт рестрикции XbaI на 3'-конце.PCR 2: cefE S. clavuligerus
In the second PCR using S. clavuligerus chromosomal DNA and
С целью получения экспрессии генов cefE в Е. coli и определения характеристик продуктов ПЦР с помощью анализа последовательности ДНК продукты ПЦР 1 и 2 клонировали в векторе pMCTNde, производный от рМС-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Плазмида pMCTNde была получена из pMC5-8 (Европейская патентная заявка N 0351029) путем встройки фрагмента, кодирующего tac промотор, с последующим сайтом RBS и клонирующим сайтом NdeI (фигура 3). In order to obtain expression of cefE genes in E. coli and characterize PCR products using DNA sequence analysis,
Продукты ПЦР 1 и 2 расщепляли с помощью NdeI и XbaI и лигировали в расщепленный NdeI-XbaI вектор pMCTNde. Смесь лигирования использовали для трансформации Е. coli WK6. Трансформанты отбирали по резистентности к хлорамфениколу. Эти трансформанты используют для изоляции плазмидной ДНК. Вставку кассеты экспрессии cefE сначала анализировали с помощью расщепления рестрикционным ферментом на предсказанную генерацию рестрикционных фрагментов. Плазмиды, содержащие предсказанные сайты для рестрикционных ферментов, окончательно проанализированы с помощью автоматического анализа последовательности ДНК.
Последовательность ДНК открытой рамки считывания cefE S. clavuligerus в плазмиде pMCTSE (фигура 2) была на 100% идентична опубликованной последовательности (Kovacevic, выше). The open-reading DNA sequence of cefE S. clavuligerus in plasmid pMCTSE (Figure 2) was 100% identical to the published sequence (Kovacevic, supra).
Последовательность ДНК (фигура 8) всех клонов, которые были проанализированы, содержащая открытую рамку считывания cefE N. lactamdurans, отличалась от опубликованной последовательности (Coque, выше). The DNA sequence (Figure 8) of all clones that were analyzed containing the open reading frame of cefE N. lactamdurans was different from the published sequence (Coque, supra).
Аминокислотная последовательность, произведенная из опубликованного гена cefE N. lactamdurans, имеет пролин в положении 41 (смотрите Посл. ИД N 14). Этот пролин опущен в клонах, которые получены при ПЦР 1. Эта плазмида названа pMCTNE (фигура 1). The amino acid sequence derived from the published cefE gene of N. lactamdurans has a proline at position 41 (see Last ID No. 14). This proline is omitted in clones obtained by
с2. Конструирование плазмид экспрессии cefE P. chrysogenum
ПЦР, 3: промотор gpdA
При этой третьей ПЦР с использованием плазмидной ДНК pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124), содержащей ген hph E. coli под контролем промотора gpdA A. nidulans и олигонуклеотиды 5 и 6, был получен промотор gpdA в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащий единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.c2. Construction of plasmids for expression of cefE P. chrysogenum
PCR 3: gpdA promoter
In this third PCR using plasmid DNA pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124) containing the E. coli hph gene under the control of the A. nidulans gpdA promoter and
ПЦР, 4: AT промотор
В четвертой ПЦР хромосомная ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотиды 7 и 8 были использованы для получения AT промоторного фрагмента, равного 1.5 kb, который также содержит единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.PCR 4: AT promoter
In the fourth PCR, P. chrysogenum chromosomal DNA and
ПЦР, 5: AT терминатор и 3'-конец гена cefE N. lactamdurans
В пятой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область (AT) penDE с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 9 и 10 и 11 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР содержат, таким образом, 3'-концевую последовательность гена cefE с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).PCR 5: AT terminator and 3'-end of the cefE N. lactamdurans gene
In the fifth PCR, a 0.5 kb terminator region (AT) of penDE was obtained using the chromosomal DNA of P. chrysogenum and
Олигонуклеотиды сконструированы таким образом, что единственный сайт BspEl встраивается на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SreI введен на 3'-конце продукта ПЦР. Oligonucleotides are designed such that a single BspEl site is inserted at the 5'-end of the PCR product and a single SreI site is introduced at the 3'-end of the PCR product.
ПЦР, 6: AT терминатор и 3'-конец гена cefE S. clavuli-gerus
В этой шестой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область penDE (AT) с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 12 и 10 и 13 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР, таким образом, содержат 3'-концевую последовательность гена cefE S. clavuligerus с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).PCR 6: AT terminator and 3'-end of the cefE gene of S. clavuli-gerus
In this sixth PCR, a 0.5 kb penDE terminator region (AT) was obtained using P. chrysogenum chromosomal DNA and
Олигонуклеотиды сконструированы так, что единственный сайт рестрикции BqlI вводится на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SpeI получается на 3'-конце этого продукта ПЦР. Oligonucleotides are designed so that a single BqlI restriction site is introduced at the 5'-end of the PCR product and a single SpeI site is obtained at the 3'-end of this PCR product.
С целью получения экспрессии генов cefE в P. chrysogenum промотор gpdA и фрагмент промотора AT лигировали к фрагментам cefE из плазмид pMCTNE и pMCTSE. Эти лигированные фрагменты клонировали в вектор pBluescript II KS. In order to obtain expression of cefE genes in P. chrysogenum, the gpdA promoter and the AT promoter fragment were ligated to cefE fragments from plasmids pMCTNE and pMCTSE. These ligated fragments were cloned into the pBluescript II KS vector.
Продукт ПЦР 3 расщепляли EcoRI и NdeI. pMCTNE и pMCTSE расщепляли с помощью NdeI и XbaI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Кодирующие фрагменты 0.9 kb cefE очищали из агарозного геля. Промоторный фрагмент EcoRI- NdeI лигировали вместе с фрагментами NdeI-XbaI cefE в расщепленный EcoRI-XbaI вектор pBluescript II KS. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSE и pGNE. The
Для получения оптимальной экспрессии генов cefE в Р. chrysogenum мы выбираем клонирование сигнальной последовательности терминации AT после генов cefE в плазмидах экспрессии Penicillium, упомянутых выше. To obtain optimal expression of cefE genes in P. chrysogenum, we select the cloning of the AT termination signal sequence after cefE genes in the Penicillium expression plasmids mentioned above.
pGNETA-pGNEWA
Продукты ПЦР 5 расщепляли с помощью BspEI и SpeI и лигировали в расщепленный BspEI и SpeI вектор pGNE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Плазмиды, выделенные из этих трансформантов, охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGNEWA и pGNETA (фигура 4).pGNETA-pGNEWA
pGSENA-pGSEWA
Продукты ПЦР 6 расщепляли с помощью BqlI и SpeI и лигировали в расщепленный BqlI и SpeI вектор pGSE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Выделенные из этих трансформантов плазмиды также охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSEWA и pGSETA (фигура 5).pGSENA-pGSEWA
pANETA, pANEWA и pASETA и pASEWA
Плазмиды pGNETA, pGNEWA, pGSETA и pGSEWA рacщeпляли с помощью EcoRI и NdeI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и из геля очищали фрагменты 4.5 kb.pANETA, pANEWA and pASETA and pASEWA
Plasmids pGNETA, pGNEWA, pGSETA and pGSEWA were digested with EcoRI and NdeI. Restriction fragments were separated by agarose gel electrophoresis and 4.5 kb fragments were purified from the gel.
Продукт ПЦР 4 расщепляли с помощью EcoRI и NdeI и лигировали с очищенными фрагментами, упомянутыми выше. После трансформации лигированных смесей в Е. coli НВ101 трансформанты отбирали по резистентности к ампициллину. The
Трансформанты подращивали и выделяли их плазмиды и характеризовали с помощью анализа фрагментов рестрикции и окончательно - с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены желаемые конструкции, а именно: pANETA (фигура 6), pANEWA, pASETA (фигура 7) и pASEWA. Transformants were grown and their plasmids were isolated and characterized by analysis of restriction fragments and, finally, by DNA sequence analysis. Thus, the desired designs were obtained, namely: pANETA (figure 6), pANEWA, pASETA (figure 7) and pASEWA.
d. Трансформация P. chrysogenum
Использована процедура трансформации протопластов, опосредуемой Ca-PEG.d. Transformation of P. chrysogenum
The protoplast transformation procedure mediated by Ca-PEG was used.
Следуя процедурам, описанным у Cantoral (смотрите выше), Gouka et al. (J. Biotechn., смотрите выше) и Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., смотрите выше) для трансформации штаммов P. chrysogenum использовали целую плазмиду или очищенный полигенный экспрессирующий кластер cefE (лишенный векторных последовательностей Е. coli) с генами pyrG, niaD, facA или amdS (Beri et al. , Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) соответственно в качестве маркеров селекции. Following the procedures described by Cantoral (see above), Gouka et al. (J. Biotechn., See above) and Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., See above) for the transformation of P. chrysogenum strains, a whole plasmid or purified cefE expressing cluster (lacking E. coli vector sequences) with pyrG, niaD, facA or amdS genes (Beri et al., Curr Genet. 11 (1987), 639-641), respectively, as selection markers.
Путем использования гомологичных маркеров селекции pyrG, niaD или facA в очищенной форме, лишенных векторных последовательностей Е. coli, были получены трансформированные штаммы P. chrysogenum, которые не содержат генов резистентности бактерий. Using homologous selection markers of pyrG, niaD or facA in purified form lacking E. coli vector sequences, transformed P. chrysogenum strains that do not contain bacterial resistance genes were obtained.
В Европейской патентной заявке N 94201896.1 описывается способ получения рекомбинантных штаммов, лишенных генов маркеров селекции. Этот метод был успешно использован на трансформантах P. chrysogenum, содержащих ген amdS A. nidulans в качестве доминантного маркера селекции. European Patent Application No. 94201896.1 describes a method for producing recombinant strains lacking selection marker genes. This method has been successfully used on P. chrysogenum transformants containing the A. nidulans amdS gene as a dominant selection marker.
В таком случае единственными элементами гетерологичного происхождения являются кодирующая область cefE 0.9 kb и произвольно промоторная область gpdA 0.9 kb. In this case, the only elements of heterologous origin are the coding region of cefE 0.9 kb and the randomly promoter region of gpdA 0.9 kb.
е. Анализ трансформантов
Трансформанты P. chrysogenum очищают путем повторного культивирования на селективной среде. Единичные устойчивые колонии использованы для приготовления устойчивых косяков для получения спор и для проверки на трансформанты, содержащие кассету экспрессии cefE. Кипячение фрагмента свежего мицелия трансформантов на агаровой пластинке использовали для получения достаточного количества матричной ДНК для эффективной проверки сотен трансформантов на присутствие гена cefE при использовании метода ПЦР. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Действуя таким образом, установили эффективность трансформации.e. Analysis of transformants
Transformants of P. chrysogenum are purified by re-cultivation on selective medium. Single resistant colonies were used to prepare resistant shoals for obtaining spores and for testing for transformants containing the cefE expression cassette. Boiling of a fragment of fresh mycelium of transformants on an agar plate was used to obtain a sufficient amount of template DNA to effectively test hundreds of transformants for the presence of the cefE gene using the PCR method. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Acting in this way, they established the effectiveness of the transformation.
Отбор трансформантов также выполняли, применяя биологические исследования. Трансформанты подращивали на агаризованной среде, которая содержала предшественника боковой цепи выбора. Е. coli ESS2231 использовали в качестве индикаторной бактерии в кроющем слое агара, который содержал Бактопеназу, чтобы было возможно отдифференцировать продукцию пенициллина и цефалоспорина по методам, хорошо известным в этой области науки и описанным, например, у Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64. The selection of transformants was also performed using biological studies. Transformants were grown on an agar medium that contained a side chain precursor of choice. E. coli ESS2231 was used as an indicator bacterium in the top coat of agar that contained Bactopenase so that it was possible to differentiate the production of penicillin and cephalosporin according to methods well known in the art and described, for example, by Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64.
Споры используют для посева P. chrysogenum в культуральную среду, как описано в разделе d. После 72 часов культивирования (при 25oC) из мицелия выделяют хромосомную ДНК. ДНК расщепляют рестрикционным ферментом с распознаваемой последовательность в 6 п.о., подобным EcoRI или PstI.Spores are used for plating P. chrysogenum in culture medium as described in section d. After 72 hours of cultivation (at 25 ° C.), chromosomal DNA is isolated from the mycelium. DNA is digested with a restriction enzyme with a recognized 6 bp sequence similar to EcoRI or PstI.
Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны Gene screen (New England nuclear). Блоттинг по Саузерну проводили гибридизацией с меченным 32P продуктом ПЦР 2 в качестве пробы для последовательностей гена cefE. Мечение 32P очищенного продукта ПЦР 2 достигается с помощью мечения случайным примированием в присутствии α32P ЦТФ при использовании коммерческого набора для мечения (Boeringer Mannheim).DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis and transferred to Gene screen (New England nuclear) nylon membranes. Southern blotting was performed by hybridization with a 32 P-labeled
Трансформанты, содержащие кодирующую последовательность cefE, испытаны на экспрессию продукта гена cefE, называемую здесь экспандазной активностью. Transformants containing the cefE coding sequence were tested for expression of the cefE gene product, referred to herein as expandase activity.
Отобранные трансформанты культивируются в среде для продукции пенициллина (смотрите пример 2). Selected transformants are cultured in penicillin production medium (see example 2).
В эксперименте по оценке протекания процесса во времени образцы мицелия отбирали через 48, 72 и 96 часов ферментации. Готовятся экстракты мицелия, и экспандазная активность определяется в неочищенных экстрактах, как описано у Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Трансформанты с экспандазной активностью испытывали на ацилтрансферазную активность также методами, описанными у Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682. In an experiment to evaluate the progress of the process over time, mycelium samples were taken after 48, 72 and 96 hours of fermentation. Mycelium extracts are prepared and the expandase activity is determined in the crude extracts as described by Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Transformants with expandase activity were also tested for acyltransferase activity by the methods described by Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682.
По этим анализам отбирали трансформанты с различными уровнями ацилтрансферазной и экспандазной ферментативной активности для ферментативной продукции производных 7-АДЦК. Transformants with different levels of acyltransferase and expandase enzymatic activity for the enzymatic production of 7-ADCA derivatives were selected from these analyzes.
Пример 2
Ферментативное получение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и их выделение
P. chrysogenum штамм Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089) трансформируется с помощью одной из конструкций ДНК, как описано в примере 1, и засевается в концентрации 2•106 конидий/мл в посевную среду, состоящую из г/л:
глюкозы - 30
(NH4)2SO4 - 10
KH2PO4 - 10
раствора микроэлементов I
(MgSO4•7H2O - 25
FeSO4•7H2O - 10
CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
Na2SO4 - 50
MnSO4•H2O - 2
CaCl2•2H2O - 5)
10 (мл/л) (pH до стерилизации 6.5).Example 2
Enzymatic preparation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA and their isolation
P. chrysogenum strain Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) is transformed using one of the DNA constructs, as described in example 1, and inoculated at a concentration of 2 • 10 6 conidia / ml in a seed medium consisting of g / l:
glucose - 30
(NH 4 ) 2 SO 4 - 10
KH 2 PO 4 - 10
trace element I
(MgSO 4 • 7H 2 O - 25
FeSO 4 • 7H 2 O - 10
CuSO 4 • 5H 2 O - 0.5
ZnSO 4 • 7H 2 O - 2
Na 2 SO 4 - 50
MnSO 4 • H 2 O - 2
CaCl 2 • 2H 2 O - 5)
10 (ml / l) (pH before sterilization 6.5).
Посевную культуру инкубируют в течение 48-72 часов при 25- 30oC и затем используют для засева 10-20 объемов производственной среды, содержащей (г/л):
лактозы - 80
мальтозы - 20
CaSO4 - 4
мочевины - 3
(MgSO4•7H2O - 2
KH2PO4 - 7
NaCl - 0,5
(NH4)2SO4 - 6
FeSO4•7H2O - 0,1
3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты раствора микроэлементов II - 5
(CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
MnSO4•H2O - 2
Na2SO4 - 50),
10 (мл/л) (pH до стерилизации 5.5 - 6.0). Затем инкубация продолжается в течение еще 96 - 120 часов.The seed culture is incubated for 48-72 hours at 25-30 o C and then used for sowing 10-20 volumes of the production medium containing (g / l):
lactose - 80
maltose - 20
CaSO 4 - 4
urea - 3
(MgSO 4 • 7H 2 O - 2
KH 2 PO 4 - 7
NaCl - 0.5
(NH 4 ) 2 SO 4 - 6
FeSO 4 • 7H 2 O - 0.1
3'-carboxymethylthiopropionic acid trace element II - 5
(CuSO 4 • 5H 2 O - 0.5
ZnSO 4 • 7H 2 O - 2
MnSO 4 • H 2 O - 2
Na 2 SO 4 - 50),
10 (ml / l) (pH before sterilization 5.5 - 6.0). Then, incubation continues for another 96 to 120 hours.
В конце производственной ферментации мицелий отделяется центрифугированием или фильтрованием и 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК анализируется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с обращенной фазой. Использован аппарат ВЭЖХ Beckman System Gold, состоящий из программируемой системы для растворителей модели 168, автоматического пробоотборника модели 507, диодно-сетчатого детектора модели 168 и системы для данных Gold system (5.10). В качестве стационарной фазы используются две (2) катриджных колонки Chrom-spher С18 (100 х 3 мм, Chrompack) в ряд. Подвижная фаза состоит из линейного градиента от 100% 0.07 М фосфатного буфера pH 4.8 до 25% ацетонитрила и 75% фосфатного буфера pH 4.8 через 15 минут при скорости потока, равной 0.5 мл/мин. Продукция 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК определяется количественно при 260 нм при использовании синтетических 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК в качестве веществ для сравнения. At the end of production fermentation, the mycelium is separated by centrifugation or filtration, and 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA are analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) on a reverse phase column. The Beckman System Gold HPLC apparatus was used, consisting of a model 168 solvent system, model 507 auto-sampler, model 168 diode-grid detector, and model Gold data system (5.10). As the stationary phase, two (2) Chrom-spher C18 cartridge columns (100 x 3 mm, Chrompack) are used in a row. The mobile phase consists of a linear gradient from 100% 0.07 M phosphate buffer pH 4.8 to 25% acetonitrile and 75% phosphate buffer pH 4.8 after 15 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min. The production of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is quantified at 260 nm using synthetic 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA as substances for comparison .
Идентичность пиков подтверждается путем сравнения кривых ультрафиолетового и ЯМР спектров. The identity of the peaks is confirmed by comparing the curves of the ultraviolet and NMR spectra.
После отфильтровывания жидкой питательной среды к фильтрату добавляется примерно 0.1 объема 1-бутанола. Значение pH доводится до 2 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты и смесь перемешивается в течение 5 минут при комнатной температуре. После разделения органический слой или выпаривается или используется далее для химического деацилирования (пример 3) или обратно экстрагируется объемом воды, равным 0.33, с pH 8 и далее используется для ферментативного деацилирования (примеры 4 и 5). After filtering the liquid culture medium, approximately 0.1 volume of 1-butanol is added to the filtrate. The pH is adjusted to 2 with dilute hydrochloric acid and the mixture is stirred for 5 minutes at room temperature. After separation, the organic layer is either evaporated or used further for chemical deacylation (example 3) or is back extracted with a water volume of 0.33 with a pH of 8 and then used for enzymatic deacylation (examples 4 and 5).
Пример 3
Деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК
К смеси 3 г (8 ммолей) 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК, 3.5 мл (36 ммолей) N,N- диметиланилина 13 мл метиленхлорида и 2.6 мл (21 ммоль) триметилхлорсилана добавляются при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут реакционную смесь охлаждают до примерно -50oC и добавляют 1.8 г (8.5 ммоля) пентахлорида фосфора, все сразу. Температура поддерживается на уровне -40oC в течение двух часов и затем реакционную смесь охлаждают до -65oC. Затем ее обрабатывают 12 мл (137 ммолей) изобутанола с такой скоростью, чтобы температура не повышалась свыше -40oC. После дополнительного перемешивания в течение двух часов раствор выливают в 15 мл воды и потом сразу добавляют 5 мл 4.5 N аммиака. pH доводится до 4 путем медленного добавления твердого бикарбоната аммония. После охлаждения до 5oC смесь фильтруют и кристаллическую 7-АДЦК промывают 5 мл водного ацетона (1:1) и отделяют.Example 3
Deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADC
To a mixture of 3 g (8 mmol) of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA, 3.5 ml (36 mmol) of N, N-dimethylaniline, 13 ml of methylene chloride and 2.6 ml (21 mmol) of trimethylchlorosilane at room temperature. After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was cooled to about -50 ° C and 1.8 g (8.5 mmol) of phosphorus pentachloride were added, all at once. The temperature is maintained at -40 o C for two hours and then the reaction mixture is cooled to -65 o C. Then it is treated with 12 ml (137 mmol) of isobutanol at such a rate that the temperature does not rise above -40 o C. After further stirring for two hours the solution is poured into 15 ml of water and then 5 ml of 4.5 N ammonia are immediately added. The pH is adjusted to 4 by slowly adding solid ammonium bicarbonate. After cooling to 5 ° C., the mixture was filtered and the crystalline 7-ADCA was washed with 5 ml of aqueous acetone (1: 1) and separated.
Пример 4
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием мутантной ацилазы Pseudomonas SY77
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется в одну энзиматическую стадию с использованием специфической ацилазы, которая производится из ацилазы Pseudomonas SY77 путем направленного на определенную область мутагенеза. Конструирование и идентификация мутантной ацилазы Pseudomonas SY77 с улучшенной активностью в отношении 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионильной боковой цепи было описано в ЕР-А-0453048. В мутанте тирозин в положении 178 в α- субъединице ацилазы Pseudomonas SY77 был заменен на гистидин. Мутантная ацилаза продуцируется в Е. coli. Клетки собираются путем центрифугирования и снова суспендируются в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4, содержащем 140 мМ NaCl. Затем клетки разрушают ультразвуком. После удаления клеточных остатков собирают супернатанты, обладающие ацилазной активностью. Дальнейшую очистку ацилазы выполняли с помощью ряда этапов хроматографии:
(1) ионообменной хроматографии на О-сефарозе с быстрым потоком при pH 8. 8;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия на фенилсефарозе;
(3) гельпроникающей хроматографии на колонке сефакрила S200HR.Example 4
Enzymatic deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA using the mutant acylase Pseudomonas SY77
The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out in one enzymatic step using a specific acylase, which is produced from Pseudomonas SY77 acylase by directed to a specific area of mutagenesis. The construction and identification of the Pseudomonas SY77 mutant acylase with improved activity on the 2- (carboxyethylthio) acetyl and 3- (carboxymethylthio) propionyl side chains has been described in EP-A-0453048. In the mutant, tyrosine at
(1) ion exchange chromatography on O-Sepharose with a fast flow at
(2) chromatography of hydrophobic interaction on phenylsepharose;
(3) gel permeation chromatography on a Sephacryl S200HR column.
Очищенную ацилазу иммобилизировали на частицах, состоящих из смеси желатина и хитозана. Частицы обрабатывали глутаральдегидом непосредственно перед добавлением фермента. Purified acylase was immobilized on particles consisting of a mixture of gelatin and chitosan. Particles were treated with glutaraldehyde just before the enzyme was added.
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК проводится в реакторе с мешалкой. Сначала в реактор добавляют водный раствор цефалоспорина. Затем температуру раствора доводят до 30oC при постоянном перемешивании и pH фиксируется на 8 с помощью гидроксида калия. Затем добавляется иммобилизированный фермент и превращение начинается. Во время превращения pH в реакторе непрерывно контролируется и поддерживается на 8. 3'-карбоксиметилтиопропионовая кислота, которая выделяется во время реакции, титруется КОН. Количество КОН, которое добавляется, суммируется и регистрируется на записывающем устройстве с плоским стендом. Превращение контролируется путем отбора образцов из реактора, которые анализируются на 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и 7-АДЦК с помощью ВЭЖХ, как описано в примере 2.The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out in a stirred reactor. First, an aqueous solution of cephalosporin is added to the reactor. Then the temperature of the solution was adjusted to 30 o C with constant stirring and the pH was fixed at 8 with potassium hydroxide. Then the immobilized enzyme is added and the conversion begins. During the conversion, the pH in the reactor is continuously monitored and maintained at 8. 3'-carboxymethylthiopropionic acid, which is released during the reaction, is titrated with KOH. The amount of KOH that is added, added, and recorded on a flat-panel recorder. The conversion is controlled by sampling from the reactor, which are analyzed for 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA and 7-ADCC using HPLC, as described in example 2.
Когда реакция завершена, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием и pH фильтрата доводится до 1, тогда как фильтрат содержит бутилацетат. Слои разделяются, и pH водной фазы, которая содержит 7-АДЦК, доводится до 3. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается. When the reaction is complete, the immobilized enzyme is removed by filtration and the pH of the filtrate is adjusted to 1, while the filtrate contains butyl acetate. The layers are separated, and the pH of the aqueous phase, which contains 7-ADCA, is adjusted to 3. The crystalline 7-ADCA is then filtered off.
Пример 5
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием ацилазы Pseudomonas SE83
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется, как и в примере 4, однако с использованием ацилазы Pseudomonas SE83 в качестве ацилазы с получением того же самого результата.Example 5
Enzymatic deacylation of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA using Pseudomonas SE83 acylase
The conversion of 2- (carboxyethylthio) acetyl- and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA is carried out as in Example 4, however using Pseudomonas SE83 acylase as the acylase to obtain the same result.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP93202259 | 1993-07-30 | ||
EP93202259.3 | 1993-07-30 | ||
EP93203696.5 | 1993-12-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU96104261A RU96104261A (en) | 1998-05-10 |
RU2139349C1 true RU2139349C1 (en) | 1999-10-10 |
Family
ID=8214015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU96104261/13A RU2139349C1 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethylthio)-acetyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid and 3-(carboxymethylthio)- -propionyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2139349C1 (en) |
-
1994
- 1994-07-29 RU RU96104261/13A patent/RU2139349C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100336174B1 (en) | Efficient method for preparing 7-ADCA via 2- (carboxyethylthio) acetyl-7-ADCA and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA | |
RU2230790C2 (en) | Method for widening 5-membered ring of compound beta-lactam to 6-membered cephem | |
EP0711348B1 (en) | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca | |
JP2000342289A (en) | Isolation of gene for biologically synthesizing penicillin | |
US5919680A (en) | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G | |
JP2954601B2 (en) | Methods for isolating and using biosynthetic or regulatory genes to increase secondary metabolite production | |
RU2139349C1 (en) | Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 2-(carboxyethylthio)-acetyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid and 3-(carboxymethylthio)- -propionyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid | |
RU2139350C1 (en) | Method of effective production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid through 3-(carboxyethylthio)-propionyl-7-amino- -deacetoxycephalosporanic acid | |
EP0716698B1 (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
EP0444758A1 (en) | Method for modification of ACV synthetase and use of the modified enzyme for production of beta-lactam antibiotics | |
EP1675946A1 (en) | Process for producing penicillin | |
JPH09503907A (en) | Effective method for producing 7-ADCA via 2- (carboxyethylthio) acetyl-7-ADCA and 3- (carboxymethylthio) propionyl-7-ADCA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050730 |