RU2132386C1 - Method of human recombinant gamma-interferon preparing - Google Patents
Method of human recombinant gamma-interferon preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2132386C1 RU2132386C1 RU97110634A RU97110634A RU2132386C1 RU 2132386 C1 RU2132386 C1 RU 2132386C1 RU 97110634 A RU97110634 A RU 97110634A RU 97110634 A RU97110634 A RU 97110634A RU 2132386 C1 RU2132386 C1 RU 2132386C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- urea
- gamma
- protein
- cooh
- Prior art date
Links
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 title abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 32
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 21
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- GQPVFBDWIUVLHG-UHFFFAOYSA-N [2,2-bis(hydroxymethyl)-3-(2-methylprop-2-enoyloxy)propyl] 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(CO)(CO)COC(=O)C(C)=C GQPVFBDWIUVLHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229920003145 methacrylic acid copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 claims description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 9
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 6
- -1 K-1 cation Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 abstract description 7
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical class [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHLMOSXCXGLMMN-CLTUNHJMSA-M [(1s,5r)-8-methyl-8-propan-2-yl-8-azoniabicyclo[3.2.1]octan-3-yl] 3-hydroxy-2-phenylpropanoate;bromide Chemical compound [Br-].C([C@H]1CC[C@@H](C2)[N+]1(C)C(C)C)C2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 LHLMOSXCXGLMMN-CLTUNHJMSA-M 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу получения рекомбинантого иммунного интерферона (интерферон-гамма; ИНФ-γ) человека. Предлагаемый способ позволяет легко масштабировать процесс выделения и очистки данного биологически активного вещества. The invention relates to biotechnology, in particular, to a method for producing recombinant immune interferon (interferon-gamma; INF-γ) of a person. The proposed method allows you to easily scale the process of isolation and purification of this biologically active substance.
ИНФ-γ является полуфункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы (иммунный интерферон), обладает иммуностимулирующей, противоопухолевой и антивирусной активностями. Создание микроорганизмов-продуцентов человеческого ИНФ-γ позволило получать биологически активный рекомбинантный белок в количестве, необходимом как для проведения широких структурно-функциональных исследований, так и для использования в медицинской практике. За рубежом созданы лекарственные препараты на основе рекомбинантного ИНФ-γ для лечения иммунных, онкологических и тяжелых вирусных заболеваний (иммуномакс, иммунерон и др.). В связи с этим разработка эффективных способов получения рекомбинантного ИНФ-γ является актуальной. INF-γ is a semi-functional protein produced by cells of the immune system (immune interferon), has immunostimulating, antitumor and antiviral activities. The creation of microorganisms producing human INF-γ made it possible to obtain a biologically active recombinant protein in an amount necessary for both conducting broad structural and functional studies and for use in medical practice. Abroad, drugs based on recombinant INF-γ have been created for the treatment of immune, oncological and severe viral diseases (immunomax, immuneron, etc.). In this regard, the development of effective methods for producing recombinant INF-γ is relevant.
Известны способы [1-3] получения рекомбинантного ИНФ-γ человека, но все они трудоемки, дорогостоящи, описаны для аналитических количеств белка и трудно масштабируемы; к тому же рекомбинантный иммунный интерферон человека, синтезирующийся в клетках Escherichia coli, образует при суперпродукции нерастворимые тела включения, осаждающиеся при центрифугировании разрушенных бактериальных клеток совместно с обломками клеточных стенок. Разрушение ультразвуком в среде, не содержащей денатурирующих агентов, или ферментативный лизис E.coli сопровождается активацией мембраносвязанной протеазы, способной к ограниченному гидролизу гамма-интерферона по последовательности, содержащей подряд четыре основных аминокислоты в концевой части молекулы [1,4]. Known methods [1-3] for producing recombinant human INF-γ, but they are all laborious, expensive, described for analytical amounts of protein and difficult to scale; in addition, the recombinant human immune interferon synthesized in Escherichia coli cells forms insoluble inclusion bodies during superproduction, which are precipitated by centrifugation of the destroyed bacterial cells together with cell wall debris. Ultrasound destruction in a medium without denaturing agents or enzymatic lysis of E. coli is accompanied by activation of a membrane-bound protease capable of limited hydrolysis of gamma interferon in a sequence containing four basic amino acids in a row at the end of the molecule [1,4].
Наиболее близким к заявленному способу является способ [5; прототип], позволяющий получить интактный нативный ИНФ-γ, который включает несколько стадий: химический лизис клеток штамма-продуцента E.coli и одновременная солюбилизация ИНФ-γ из телец включения раствором 7М гуанидинхлорида; удаление нерастворившихся компонентов центрифугированием; 10-кратное разбавление целевой фракции буфером pH 9,5 и отделение образующегося осадка белков центрифугированием; фракционирование белков на силикагеле (NuGel-952 AC); и, наконец, аффинная хроматография на сорбенте с моноклональными антителами. Полученный продукт находится в растворе 20 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1M NaCl и 1М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представляет собой белок с молекулярной массой 18000, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составляет 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составляет 107 ед./мг белка.Closest to the claimed method is the method [5; prototype], which allows to obtain an intact native INF-γ, which includes several stages: chemical lysis of cells of the producer strain E. coli and simultaneous solubilization of INF-γ from inclusion bodies with 7M guanidine chloride solution; removal of insoluble components by centrifugation; 10-fold dilution of the target fraction with pH 9.5 buffer and separation of the resulting protein precipitate by centrifugation; silica gel fractionation of proteins (NuGel-952 AC); and finally, affinity chromatography on a sorbent with monoclonal antibodies. The resulting product is in a solution of 20 mm sodium phosphate buffer containing 1M NaCl and 1M guanidine chloride (or 50% ethylene glycol), and is a protein with a molecular weight of 18000, homogeneous by electrophoresis. The yield of 25 g of cells is 8 mg (25-32% of the content in the cell extract). The biological activity of the drug in inhibiting the cytopathic effect is 10 7 units / mg protein.
Недостатком способа-прототипа является то, что одновременное разрушение клеток и солюбилизация ИНФ-γ не дают возможности использовать одно из преимуществ образования телец включения, заключающееся в легком отделении балластных водорастворимых белков бактериальной цитоплазмы от нерастворимого целевого продукта простым центрифугированием. Использование иммунного сорбента для очистки белка очень дорого, нетехнологично, трудно масштабируемо. Требуется дополнительный сложный анализ конечного продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител. The disadvantage of the prototype method is that the simultaneous destruction of cells and the solubilization of INF-γ does not allow one of the advantages of the formation of inclusion bodies, which consists in the easy separation of the ballast water-soluble proteins of the bacterial cytoplasm from the insoluble target product by simple centrifugation. The use of an immune sorbent for protein purification is very expensive, low-tech, and difficult to scale. An additional complex analysis of the final product is required for the absence of the oncogenic material of the parent myeloma cell used in the preparation of monoclonal antibodies.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка технологического легкомасштабируемого способа получения высокоочищенного нефрагментированного ИНФ-γ человека. The technical task of the invention is the development of technological easily scalable method for producing highly purified unfragmented INF-γ person.
Для сохранения возможности удаления водорастворимых белков и сохранения интактным рекомбинантого иммунного интерферона человека может быть использовано введение в буфер для механической дезинтеграции ультразвуком клеток продуцента солей цинка и меди, которые, как показано в [4], присутствуя в среде в низких концентрациях, ингибируют разрушающую гамма-интерферон мембраносвязанную протеазу E.coli. To preserve the possibility of removing water-soluble proteins and preserve the intact recombinant human immune interferon, the producer of zinc and copper salts, which, as shown in [4], being present in the medium at low concentrations, inhibit destructive gamma interferon membrane-bound protease of E. coli.
Солюбилизирующие свойства хлорида гуанидина, одного из наиболее сильных и часто используемых для растворения тел включения денатурирующих агентов, могут быть смоделированы смесями мочевины и хлористого лития [6], которые, в отличие от гуанидина, могут быть использованы для более селективной экстракции продукта. Кроме того, ренатурация из растворов мочевины происходит более эффективно, чем из растворов гуанидина [6]. The solubilizing properties of guanidine chloride, one of the most powerful and often used for dissolving inclusion bodies of denaturing agents, can be modeled by mixtures of urea and lithium chloride [6], which, unlike guanidine, can be used for more selective extraction of the product. In addition, renaturation from urea solutions occurs more efficiently than from guanidine solutions [6].
Таким образом, поставленная цель достигается тем, что разрушение клеток продуцента, содержащего рекомбинантый ИНФ-γ в виде телец включения, проводят в буферном растворе в присутствии солей цинка и меди, ингибирующих мембраносвязанную протеазу, разрушающую ИНФ-γ, солюбилизацию продукта осуществляют смесью мочевины и хлористого лития, а хроматографию проводят на катионообменнике CO-OH-Биохром К-1 с повышенной обменной емкостью, представляющем собой сополимер метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита. Thus, the goal is achieved in that the destruction of producer cells containing recombinant INF-γ in the form of inclusion bodies is carried out in a buffer solution in the presence of zinc and copper salts that inhibit the membrane-bound protease that destroys INF-γ, and the product is solubilized with a mixture of urea and chloride lithium, and chromatography is performed on a CO-OH-Biochrom K-1 cation exchanger with an increased exchange capacity, which is a copolymer of methacrylic acid and pentaerythritol dimethacrylate.
Разрушение клеток в буферном растворе позволяет простым центрифугированием клеточного экстракта отделить большую массу балластных клеточных белков E. coli от нерастворимого целевого продукта, находящегося в тельцах включения, при этом соли цинка и меди позволяют предотвратить протеолитическую деструкцию целевого белка. Применение для солюбилизации ИНФ-γ из телец включения менее сильного чем гуанидинхлорид денатурирующего агента - мочевины, обеспечивает более эффективную ренатурацию белка [6]. Использование для хроматографической очистки сорбента COOH-Биохром К-1 значительно упрощает и удешевляет способ по сравнению с использованием иммунного сорбента. К тому же этот сорбент выгодно отличается от широко используемой в препаративной хроматографии белков КМ-целлолозы своей высокой обменной емкостью и способностью выдерживать высокие давления (до 70 атм). При этом применение COOH-Биохрома К-1 допускает использование оборудования для хроматографии низкого и среднего давления, и, следовательно, не дает заметного увеличения стоимости проведения стадии хроматографии. The destruction of cells in a buffer solution allows simple centrifugation of the cell extract to separate a large mass of E. coli ballast cell proteins from the insoluble target product located in the inclusion bodies, while zinc and copper salts prevent the proteolytic destruction of the target protein. The use of the denaturing agent urea, which is less powerful than guanidine chloride, for the solubilization of INF-γ from Taurus provides a more efficient protein renaturation [6]. The use of COOH-Biochrom K-1 sorbent for chromatographic purification significantly simplifies and reduces the cost of the method compared to the use of an immune sorbent. In addition, this sorbent compares favorably with KM cellulose proteins widely used in preparative chromatography for their high exchange capacity and ability to withstand high pressures (up to 70 atm). Moreover, the use of COOH-Biochrome K-1 allows the use of low and medium pressure chromatography equipment, and therefore does not significantly increase the cost of the chromatography step.
Предлагаемый способ получения и очистки рекомбинантного иммунного интерферона человека, образующего в клетках E.coli нерастворимые тела включения, состоит из нескольких последовательных этапов:
1. Клетки продуцента разрушают ультразвуком в буфере, содержащем соли меди и цинка, ингибирующие мембраносвязанную протеазу, способную деградировать гамма-интерферон. В качестве продуцента может быть использован любой генетически трансформированный штамм E.coli, накапливающий иммунный интерферон в виде тел включения. В данном случае выделение проводится из штамма E. coli MH1 [pIFN-γ-trp2], в котором экспрессия гена гамма-интерферона контролируется промотором триптофанового оперона E.coli. Уровень биосинтеза иммунного интерферона при конститутивном синтезе составляет порядка 10% от общего белка клетки и около 50% - при индукции триптофанового промотора [7].The proposed method for the preparation and purification of recombinant human immune interferon, which forms insoluble inclusion bodies in E. coli cells, consists of several successive steps:
1. Producer cells are destroyed by ultrasound in a buffer containing salts of copper and zinc, inhibiting the membrane-bound protease capable of degrading gamma interferon. As a producer, any genetically transformed E. coli strain that accumulates immune interferon in the form of inclusion bodies can be used. In this case, the isolation is carried out from the E. coli MH1 strain [pIFN-γ-trp2], in which the expression of the gamma interferon gene is controlled by the promoter of the tryptophan operon of E. coli. The level of biosynthesis of immune interferon during constitutive synthesis is about 10% of the total protein of the cell and about 50% during the induction of tryptophan promoter [7].
2. Нерастворимую форму гамма-интерферона собирают центрифугированием суспензии разрушенных ультразвуком клеток и промывают 4М раствором мочевины для удаления примесных белков. 2. The insoluble form of gamma-interferon is collected by centrifugation of a suspension of cells destroyed by ultrasound and washed with 4M urea solution to remove impurity proteins.
3. Иммунный интерферон солюбилизируют в 8М мочевине, содержащей хлористый литий в концентрации большей либо равной 5М в слабощелочной среде (предпочтительнее при pH 9,5). 3. The immune interferon is solubilized in 8M urea containing lithium chloride at a concentration of greater than or equal to 5M in a slightly alkaline medium (preferably at pH 9.5).
4. Растворенный ремомбинантый белок обессоливают гель-фильтрацией в 8М мочевине, pH 9,5, или диализом против 8М мочевины, pH 9,5. 4. Dissolved rembinant protein is desalted by gel filtration in 8M urea, pH 9.5, or dialysis against 8M urea, pH 9.5.
5. Раствор обессоленного белка наносят на колонку с катионообменником COOH-Биохромом К-1 с высокой ионообменной емкостью и высокой сорбционной способностью по белку, уравновешенную буфером в 8М мочевине с pH 9,5 (оптимальном значении pH для хроматографической очистки гамма-интерферона). Нагрузка на сорбент может достигать 100 мг суммарного белка на мл носителя. Иммунный интерферон, имеющий изоэлектрическую точку выше 9,5, хорошо удерживается на сорбенте COOH-Биохром К-1, в то время как основная масса примесей обнаруживается в проскоке. 5. A solution of desalted protein is applied to a column with a COOH-Biochrom K-1 cation exchanger with a high ion-exchange capacity and high protein sorption capacity, balanced with 8M urea buffer with a pH of 9.5 (optimal pH value for chromatographic purification of gamma-interferon). The load on the sorbent can reach 100 mg of total protein per ml of carrier. Immune interferon having an isoelectric point above 9.5 is well retained on the COOH-Biochrom K-1 sorbent, while the bulk of the impurities are found in the breakthrough.
6. Сорбированные белки элюируют в градиенте концентрации хлористого натрия (от 0 до 1М). Фракции, содержащие по результатам гель-электрофореза целевой белок, объединяют и диализуют против 8М мочевины, pH 6.0. 6. Sorbed proteins elute in a concentration gradient of sodium chloride (from 0 to 1M). Fractions containing the target protein by gel electrophoresis are combined and dialyzed against 8M urea, pH 6.0.
7. Диализованный раствор иммунного интерферона наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1, уравновешенную 8М мочевиной, pH 6,0. Сорбировавшиеся белки элюируют в градиенте хлористого натрия (от 0 до 1М). Фракции, содержание гамма-интерферон, объединяют и диализуют против 2М мочевины в ацетате натрия, pH 6,0, затем против буфера без мочевины при pH 6,0. 7. A dialyzed solution of immune interferon is applied to a COOH-Biochrom K-1 column balanced with 8M urea, pH 6.0. Sorbed proteins elute in a gradient of sodium chloride (from 0 to 1M). Fractions containing gamma-interferon are combined and dialyzed against 2M urea in sodium acetate, pH 6.0, then against a buffer without urea at pH 6.0.
Чистота продукта, определенная гель-электрофорезом в полиариламидном геле в полностью денатурирующих условиях, составляет не менее 98%. Белок после электрофореза обнаруживается в виде одной полосы с молекулярной массой около 17 кД без низкомолекулярных фрагментов. Этот белок дает положительную реакцию с моноклональными антителами к иммунному интерферону человека в Вестерн-блоте. Продукт элюируется одним пиком при обращенно-фазовой хроматографии на Octadecyl = Si100 Polyol в градиенте ацетонитрила в трифторуксусной кислоте. Противовирусная активность, определенная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита в монослойной культуре фибробластов легкого человека L68, составляет 2 • 107 ед./мг. Выход готового продукта составляет около 12 мг из 20 г клеток (22-25% от содержания в исходном экстракте).The purity of the product, determined by gel electrophoresis in a polyarylamide gel under completely denaturing conditions, is at least 98%. Protein after electrophoresis is detected in the form of a single band with a molecular weight of about 17 kD without low molecular weight fragments. This protein gives a positive reaction with monoclonal antibodies to human immune interferon in Western blot. The product elutes at one peak by reverse phase chromatography on Octadecyl = Si100 Polyol in an acetonitrile gradient in trifluoroacetic acid. Antiviral activity, determined by suppressing the cytopathic effect of the encephalomyocarditis virus in a monolayer culture of human lung fibroblasts L68, is 2 • 10 7 units / mg. The yield of the finished product is about 12 mg from 20 g of cells (22-25% of the content in the original extract).
Сорбент COOH-Биохром К-1, удобный для масштабирования хроматографической стадии очистки белков, включая рекомбинатный иммунный интерферон человека, получают в результате сополимеризации метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита в н-бутаноле в присутствии динитрилазобисизомасляной кислоты в качестве инициатора. Для получения гранулированного сорбента реакционную смесь вводят при комнатной температуре в водный раствор хлористого натрия в присутствии поливинилового спирта при интенсивном перемешивании, затем смесь прогревают при 70oC в течение 5 ч. По завершении реакции отмытые гранулы рассеивают на ситах, выделяя фракцию с размером 60 - 120 мкм, и определяют характеристики сорбента общепринятыми методами. Синтезированный по описанному способу катионообменник, получивший название COOH-Биохром К-1, имеет предел исключения по декстрану 5•105D, полную обменную емкость 0,5 мг-экв/мл, адсорбционную емкость по бычьему сывороточному альбумину 110 мг/мл, объем порового пространства 0,5 - 0,6, pK кислотных групп от 5 до 6, максимальное рабочее давление - до 70 атм. Сорбент COOH-Биохром К-1 имеет сертификат для применения при очистке и выделении препаратов медицинского назначения, в том числе лекарственных препаратов.Sorbent COOH-Biochrom K-1, convenient for scaling the chromatographic stage of protein purification, including recombinant human immune interferon, is obtained by copolymerization of methacrylic acid and pentaerythritol dimethacrylate in n-butanol in the presence of dinitrilazobisisobutyric acid as an initiator. To obtain a granular sorbent, the reaction mixture is introduced at room temperature into an aqueous solution of sodium chloride in the presence of polyvinyl alcohol with vigorous stirring, then the mixture is heated at 70 o C for 5 hours. After the reaction, the washed granules are scattered on a sieve, isolating a fraction with a size of 60 - 120 microns, and determine the characteristics of the sorbent by conventional methods. The cation exchanger synthesized by the described method, called COOH-Biochrom K-1, has a dextran exclusion limit of 5 • 10 5 D, a total exchange capacity of 0.5 mEq / ml, an adsorption capacity for bovine serum albumin of 110 mg / ml, volume pore space 0.5 - 0.6, pK of acid groups from 5 to 6, maximum working pressure - up to 70 atm. Sorbent COOH-Biochrom K-1 has a certificate for use in the purification and isolation of medical products, including drugs.
Новым по сравнению со способом-прототипом является разобщение стадий разрушения клеток штамма-продуцента и солюбилизации целевого рекомбинантного белка, синтезирующегося в тельцах включения, что позволяет простым центрифугированием суспензии разрушенных клеток отделить от целевого продукта основную массу растворимых внутриклеточных белков и в дальнейшем для очистки использовать легко масштабируемую хроматографию на катионообменнике вместо дорогостоящего сорбента с моноклональными антителами. Использование низких концентраций (20 мМ) солей цинка и меди в среде для разрушения клеток позволяет избежать значительной протеолитической деградации белковой молекулы ИНФ-γ и в совокупности с эффективным процессом ренатурации рекомбинантного ИНФ-γ из раствора мочевины, более слабого денатурата чем гуанидинхлорид, обеспечивает высокий выход недеградированного целевого продукта. New in comparison with the prototype method is the separation of the stages of destruction of the cells of the producer strain and the solubilization of the target recombinant protein synthesized in inclusion bodies, which allows a simple centrifugation of the suspension of destroyed cells to separate the bulk of soluble intracellular proteins from the target product and then use easily scalable for cleaning chromatography on a cation exchanger instead of an expensive sorbent with monoclonal antibodies. The use of low concentrations (20 mM) of zinc and copper salts in the cell disruption medium avoids significant proteolytic degradation of the protein molecule INF-γ and, together with the effective process of renaturation of recombinant INF-γ from a solution of urea, weaker denatured alcohol than guanidine chloride, provides a high yield undegraded target product.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурой графического изображения, где представлен электрофоретический анализ белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в процессе очистки рекомбинатного интерферона-гамма:
дорожка 1 - белок-маркер, мол. масса 14400;
дорожка 2 - клеточный экстракт штамма-продуцента E.coli MH-1 (pIFN-γ-trp2);
дорожка 3 - супернатант после центрифугирования клеточного экстракта;
дорожка 4 - осадок после центрифугирования клеточного экстракта (тельца включения);
дорожка 5 - отмывка телец включения 4М мочевиной;
дорожка 6 - раствор телец включения в 8М мочевине с 5М литием хлористым, pH 9,5;
дорожка 7 - обессоленный раствор телец включения;
дорожка 8 - препарат после первой хроматографической очистки;
дорожка 9 - препарат после второй хроматографической очистки.The present invention is illustrated by the figure of a graphic image, which presents an electrophoretic analysis of proteins in a 12.5% polyacrylamide gel under denaturing conditions during the purification of recombinant interferon-gamma:
lane 1 - protein marker, mol. mass 14400;
lane 3 - supernatant after centrifugation of the cell extract;
lane 4 - precipitate after centrifugation of the cell extract (inclusion body);
lane 5 - washing Taurus inclusion 4M urea;
lane 6 - solution of inclusion bodies in 8M urea with 5M lithium chloride, pH 9.5;
lane 8 — preparation after the first chromatographic purification;
lane 9 - preparation after the second chromatographic purification.
Сущность предлагаемого изобретения раскрывается в следующих примерах. The essence of the invention is disclosed in the following examples.
Пример 1. Получение карбоксильного катионита COOH-Биохром К-1. Example 1. Obtaining a carboxyl cation exchanger COOH-Biochrom K-1.
В стеклянной емкости на 500 мл готовят раствор метакриловой кислоты (23 ч) (70 мол %) и диметакрилата пентаэритрита (32 ч) (30 мол %) в н-бутиловом спирте (200 ч). В раствор вводят инициатор - динитрилазобисизомасляной кислоты (1,7 ч). В термостатируемый реактор, снабженный механической мешалкой, холодильником и трубкой для барботирования аргона, помещают раствор дистиллированной воды (700 ч), содержащий поливиниловый спирт (5 ч) и хлористый натрий (90 ч), и вводят реакционную смесь, приготовленную в стеклянной емкости, при непрерывном перемешивании со скоростью 300 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, далее включают обогрев реактора до 70oC. Процесс сополимеризации проводят в течение 5 ч. Гранулы отмывают горячей дистиллированной водой от поливинилового спирта, затем изопропанолом - от мономеров и растворителя и дистиллированной водой от изопропанола. Гранулы рассеивают на ситах, выделяя фракцию с размером 60-120 мкм. Выход продукта составляет 96% от количества метакриловой кислоты, взятой в реакцию.In a 500 ml glass container, a solution of methacrylic acid (23 h) (70 mol%) and pentaerythritol dimethacrylate (32 h) (30 mol%) in n-butyl alcohol (200 h) is prepared. The initiator, dinitrilazobisisobutyric acid (1.7 h), is introduced into the solution. A distilled water solution (700 h) containing polyvinyl alcohol (5 h) and sodium chloride (90 h) was placed in a temperature-controlled reactor equipped with a mechanical stirrer, a refrigerator, and a tube for bubbling argon, and the reaction mixture prepared in a glass container was introduced at continuous stirring at a speed of 300 rev / min for 15 minutes at room temperature, further include heating the reactor to 70 o C. copolymerization process is carried out for 5 hours. The pellets were washed with hot distilled water from the polyvinyl alcohol, ATEM isopropanol - from monomers and solvents and distilled water from isopropanol. The granules are dispersed on sieves, separating a fraction with a size of 60-120 microns. The product yield is 96% of the amount of methacrylic acid taken into the reaction.
Катионит представляет собой сферические гранулы белого цвета и имеет следующие характеристики:
- предел исключения по декстранам 500 • 103D;
- полная обменная емкость 0,5 мг-экв/мл;
- адсорбционная емкость по бычьему сывороточному альбумину 110 мг/мл;
- объем порового пространства 0,5 - 0,6;
- pK кислотных групп от 5 до 6;
- максимальное рабочее давление 70 атм.Cation exchange resin is a white spherical granule and has the following characteristics:
- dextran exclusion limit 500 • 10 3 D;
- full exchange capacity of 0.5 mEq / ml;
- adsorption capacity for bovine serum albumin 110 mg / ml;
- the volume of the pore space of 0.5 - 0.6;
- pK acid groups from 5 to 6;
- maximum working pressure of 70 atm.
Катиониту присвоено название COOH-Биохром К-1. The cation exchange resin is named COOH-Biochrom K-1.
Пример 2. Получение высокоочищенного рекомбинантного иммунного интерферона человека. Example 2. Obtaining highly purified recombinant human immune interferon.
Все процедуры проводят при 4oC.All procedures are carried out at 4 o C.
20 г биомассы E.coli MH1 [pIFN-γ-trp2] с содержанием иммунного интерферона (в виде нерастворимых тел включения) в количестве 10% от суммарного клеточного белка суспендируют в 40 мл 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 2 мМ ZnCl2, 2 мМ CuCl2 (буфер А) до получения однородной суспензии. Клетки разрушают ультразвуком при полной мощности излучателя (УЗДН-2Т) в течение 25-20 с (5 раз с 2-3-минутными интервалами между озвучиваниями) до снижения оптической плотности суспензии при 600 нм по меньшей мере в 2 раза. К смеси добавляют равный объем буфера А, гомогенизируют ее озвучиванием и центрифугируют в течение 30-60 мин при 10000 об/мин на центрифуге J2-21 в роторе JA-14. После центрифугирования супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий иммунный интерферон, заливают 100 мл 4М мочевины, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5, и гомогенизируют смесь озвучиванием в течение 25-30 с. Суспензию центрифугируют при 10000 об/мин 30-40 мин и собирают осадок, содержащий рекомбинантный гамма-интерферон.20 g of biomass of E. coli MH1 [pIFN-γ-trp2] with the content of immune interferon (in the form of insoluble inclusion bodies) in the amount of 10% of the total cellular protein is suspended in 40 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM ZnCl 2 , 2 mm CuCl 2 (buffer A) to obtain a homogeneous suspension. Cells are destroyed by ultrasound at full emitter power (UZDN-2T) for 25-20 s (5 times with 2-3 minute intervals between scoring) to reduce the optical density of the suspension at 600 nm by at least 2 times. An equal volume of buffer A is added to the mixture, homogenized by sounding, and centrifuged for 30-60 minutes at 10,000 rpm in a J2-21 centrifuge in a JA-14 rotor. After centrifugation, the supernatant is discarded, and the pellet containing immune interferon is poured into 100 ml of 4M urea, 50 mM Tris-HCl, pH 9.5, and the mixture is homogenized by sonication for 25-30 s. The suspension is centrifuged at 10,000 rpm for 30-40 minutes and a precipitate containing recombinant gamma interferon is collected.
Иммунный интерферон экстрагируют из осадка 100 мл 8М мочевины в 50 мМ трис-HCl, pH 9,5, 5M LiCl путем гомогенизации смеси озвучиванием в течение 20-30 с и последующего перемешивания в течение ночи. Суспензию центрифугируют 40 мин при 18000 об/мин, собирают супернатант, содержащий экстрагированные белки, и подвергают обессоливанию на Биогеле P2 (Bio-Rad, США; размер колонки 5 х 75 см) в 8М мочевине, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5. Фракции с рекомбинантным иммунным интерфероном, имеющие электропроводность менее 1 мСм, объединяют и наносят на колонку с COOH-биохромом К-1 (2 х 4 см, объем 12,6 мл), уравновешенную 8М мочевиной, 50 мМ трис-HCl, pH 9,5. Колонку промывают до снижения оптической плотности элюата при 280 нм до исходного значения, затем элюируют сорбированные белки в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 1 М. Анализ фракций на содержание рекомбинантного иммунного интерферона проводят гель-электрофорезом белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях по [8]. Фракции, содержащие гамма-интерферон, объединяют и диализуют против 8М мочевины, 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение ночи. После диализа раствор наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1 (2 х 4 см), уравновешенную 8М мочевиной, 50 мМ ацетатом натрия, pH 6,0 и проводят хроматографию, как описано выше, но при pH 6,0. Собранный продукт диализуют последовательно против 2М мочевины, 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение 16 ч, затем против 50 мМ ацетата натрия, pH 6,0, в течение 16 ч. Полученный продукт анализируют общепринятыми методами. Материальный баланс процесса представлен в табл. 1 (табл. 1-3 см. в конце описания). Immune interferon is extracted from the precipitate with 100 ml of 8M urea in 50 mM Tris-HCl, pH 9.5, 5M LiCl by homogenizing the mixture by sonication for 20-30 s and subsequent stirring overnight. The suspension is centrifuged for 40 min at 18,000 rpm, the supernatant containing the extracted proteins is collected and subjected to desalination on Biogel P2 (Bio-Rad, USA; column size 5 x 75 cm) in 8 M urea, 50 mM Tris-HCl,
Выход продукта составляет 615 мкг/г биомассы, чистота - не менее 98%, противовирусная активность, определенная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита в монослойной культуре клеток L68 человека, 2 • 107 ед/мг. При гель-электрофорезе в полностью денатурирующих условиях белок проявляется в виде одной полосы с молекулярной массой порядка 17000Д, реагирующую с моноклональными антителами к иммунному интерферону человека в Вестерн-блоте.The product yield is 615 μg / g biomass, purity - not less than 98%, antiviral activity, determined by suppressing the cytopathic effect of the encephalomyocarditis virus in a monolayer culture of human L68 cells, 2 • 10 7 units / mg. During gel electrophoresis under completely denaturing conditions, the protein appears as a single band with a molecular weight of about 17000 D, reacting with monoclonal antibodies to human immune interferon in the Western blot.
Пример 3. Влияние концентрации хлористого лития на солюбилизацию рекомбинантного иммунного интерферона в растворах мочевины. Example 3. The effect of the concentration of lithium chloride on the solubilization of recombinant immune interferon in urea solutions.
Подготовку и промывку тел включения рекомбинантного иммунного интерферона проводят как описано в примере 2. Осадок промытых тел включения, полученных из 10 г биомассы штамма-продуцента, суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, из суспензии отбирают пробы по 0,5 мл в пробирки для микроцентрифугирования и собирают осадок центрифугированием в течение 2 мин при 12000 об/мин. Осадок растворяют в 1 мл растворов мочевины и хлористого лития различной концентрации (см. таблицу 2) при pH 9,5 в течение 30 мин при комнатной температуре. Экстрагированные белки подвергают электрофорезу в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях, относительное содержание рекомбинантного иммунного интерферона человека определяют сканированием геля после окраски белка Кумасси ярко-голубым G250. Концентрацию белка в экстрактах определяют методом Лоури. The preparation and washing of the inclusion bodies of the recombinant immune interferon is carried out as described in Example 2. The precipitate of the washed inclusion bodies obtained from 10 g of the biomass of the producer strain is suspended in 50 ml of distilled water, 0.5 ml samples are taken from the suspension in microcentrifugation tubes and the precipitate is collected by centrifugation for 2 minutes at 12,000 rpm. The precipitate is dissolved in 1 ml of urea and lithium chloride solutions of various concentrations (see table 2) at a pH of 9.5 for 30 minutes at room temperature. The extracted proteins are subjected to electrophoresis on a 12.5% polyacrylamide gel under completely denaturing conditions, the relative content of recombinant human immune interferon is determined by scanning the gel after staining the Coomassie protein with bright blue G250. The protein concentration in the extracts is determined by the Lowry method.
Результаты опыта представлены в таблице 2. The results of the experiment are presented in table 2.
По результатам анализа для практического использования выбран раствор 6М LiCl в 6-8М мочевине, т.к. при указанной концентрации соли достигаются наибольший выход целевого продукта и его наибольшее содержание в экстракте. According to the results of the analysis for practical use, a solution of 6M LiCl in 6-8M urea was selected, because at the indicated salt concentration, the highest yield of the target product and its highest content in the extract are achieved.
Пример 4. Влияние pH на хроматографию рекомбинантного иммунного интерферона человека на катионите COOH-Биохром К-1. Example 4. The effect of pH on the chromatography of recombinant human immune interferon on cation exchange resin COOH-Biochrom K-1.
Процедуру выделения рекомбинантного иммунного интерферона человека до стадии первой хроматографии проводят как описано в примере 2. Затем отбирают 5 проб обессоленного ИНФ-γ с содержанием белка 50 мг (содержание целевого белка 10%, т.е. 5 мг) и доводят pH раствора отдельных проб путем добавления раствора щелочи или кислоты до значения водородного показателя от 10,5 до 6,5. Подготовленные пробы наносят на колонку с COOH-Биохромом К-1 (0,9 х 1,5 см, V=1 мл), уравновешенную соответствующим каждой пробе буферным раствором с 8М мочевиной. Колонку промывают до снижения оптической плотности элюата при 280 нм до исходного значения, затем элюируют сорбированные белки в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 1М в буфере с 8М мочевиной и соответствующим pH. Анализ фракций на содержание целевого белка проводят гель-электрофорезом белков в 12,5%-ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях. The procedure for isolating recombinant human immune interferon to the first chromatography step is carried out as described in Example 2. Then, 5 samples of desalted INF-γ with a protein content of 50 mg (target protein content of 10%, i.e. 5 mg) are taken and the pH of the solution of individual samples is adjusted by adding a solution of alkali or acid to a pH value of 10.5 to 6.5. The prepared samples are applied to a COOH-Biochrom K-1 column (0.9 x 1.5 cm, V = 1 ml), balanced with each sample with a buffer solution with 8M urea. The column is washed until the optical density of the eluate at 280 nm is reduced to the initial value, then sorbed proteins are eluted in a linear gradient of sodium chloride concentration from 0 to 1 M in a buffer with 8 M urea and the corresponding pH. The analysis of fractions for the content of the target protein is carried out by gel electrophoresis of proteins in a 12.5% polyacrylamide gel under completely denaturing conditions.
Результаты опытов представлены в таблице 3. The results of the experiments are presented in table 3.
Из данных таблицы 3 видно, что при pH 9,5 происходит наилучшая (в 7 раз) очистка целевого белка и с большим выходом (42,7%). При значениях pH выше и ниже 9,5 содержание интерферона -γ в элюате снижается, а также снижается и степень его очистки в ходе хроматографии на COOH-Биохроме К-1. From the data of table 3 it is seen that at pH 9.5 the best (7 times) purification of the target protein occurs and with a large yield (42.7%). At pH values above and below 9.5, the content of interferon -γ in the eluate decreases, and the degree of its purification during chromatography on COOH-Biochrome K-1 also decreases.
Таким образом, разрушение клеток штамма-продуцента, содержащего рекомбинантный целевой блок в тельцах включения, в водной среде и солюбилизации целевого белка после предварительного удаления растворимых клеточных белков позволяет использовать для получения высокоочищенного ИНФ-γ простую, хорошо воспроизводимую и легко масштабируемую 2-х стадийную хроматографическую очистку на катионообменнике COOH-Биохром К-1. Добавление в буфер для разрушения клеток небольших концентраций (20 мМ) солей цинка и меди позволяет избежать значительной протеолитической деградации ИНФ-γ и в совокупности с эффективным процессом ренатурации рекомбинантного белка из мочевины, более слабого денатуранта чем гуанидинхлорид, обеспечивает высокий выход недеградированного целевого продукта. Использование в способе доступного отечественного денатурирующего реагента и легко синтезируемого катионообменника позволяет успешно масштабировать процесс. Thus, the destruction of the cells of the producer strain containing the recombinant target block in inclusion bodies in an aqueous medium and the solubilization of the target protein after preliminary removal of soluble cell proteins makes it possible to use a simple, well reproducible, and easily scalable 2-stage chromatographic chromatography to obtain highly purified INF-γ cleaning on a COOH-Biochrom K-1 cation exchanger. The addition of small concentrations (20 mM) of zinc and copper salts to the cell destruction buffer avoids significant proteolytic degradation of INF-γ and, together with the effective process of renaturation of the recombinant protein from urea, a weaker denaturing agent than guanidine chloride, provides a high yield of non-degraded target product. The use of an affordable domestic denaturing reagent and an easily synthesized cation exchanger in the method allows to successfully scale the process.
Литература
1. Патент США 4604284, кл. A 61 K 37/02, опубл. 05.08.86.Literature
1. US patent 4604284, CL. A 61 K 37/02, publ. 08/05/86.
2. Патент США 4751078, кл. A 61 K 45/02, опубл. 14.06.88. 2. US patent 4751078, cl. A 61 K 45/02, publ. 06/14/88.
3. Патент США 4617378, кл. C 07 K 15/26, опубл. 14.10.86. 3. US patent 4617378, cl. C 07
4. K. Sugumura, N.Higashi.//J.Bacteriol.-1988, v.170, N8, p. 3650-3654. 4. K. Sugumura, N. Higashi. // J. Bacteriol. 1988, v. 170, N8, p. 3650-3654.
5. Патент США 4681930, кл. C 07 K 15/26, опубл. 21.07.87. 5. US patent 4681930, CL C 07
6. M.Matsubara, D.Nohara, Т.Sakai//Chem. Pharm.Bull., 1992, v.40, N2, p. 550-552. 6. M. Matsubara, D. Nohara, T. Sakai // Chem. Pharm.Bull., 1992, v. 40, N2, p. 550-552.
7. E. D.Sverdlov, S.A.Tsarev, R.A.Krikbaev, I.P.Chernov, V.M.Rostapshov //FEBS Lett., 1987, v.212, p.233-236. 7. E. D. Sverdlov, S. A. Tsarev, R. A. Krikbaev, I. P. Chernov, V. M. Rostapshov // FEBS Lett., 1987, v. 212, p. 233-236.
8. V.K.Laemmli //Nature (London), 1970, v. 227, p. 680-685.1 8. V.K. Laemmli // Nature (London), 1970, v. 227, p. 680-685.1
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97110634A RU2132386C1 (en) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | Method of human recombinant gamma-interferon preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97110634A RU2132386C1 (en) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | Method of human recombinant gamma-interferon preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97110634A RU97110634A (en) | 1999-05-20 |
| RU2132386C1 true RU2132386C1 (en) | 1999-06-27 |
Family
ID=20194535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97110634A RU2132386C1 (en) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | Method of human recombinant gamma-interferon preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2132386C1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA023379B1 (en) * | 2011-06-21 | 2016-05-31 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарма Ген" | STRAIN ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)-pIE-GAMMA AND METHOD FOR OBTAINING PREPARATION OF NATIVE RECOMBINANT HUMAN GAMMA INTERFERON |
-
1997
- 1997-06-20 RU RU97110634A patent/RU2132386C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2596408C2 (en) | Method of purifying human granulocyte-colony stimulating factor from recombinant e.coli | |
| HU202554B (en) | Process for lipophyl protheines | |
| EP0313343B2 (en) | Method of purifying protein | |
| EP0933083A1 (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| CN102850450A (en) | Purification method of pegylated recombinant human granulocyte colony stimulating factor | |
| US7169917B2 (en) | Purification of plasmid DNA by hydrophobic interaction chromatography | |
| JP2517100B2 (en) | Purification method of protein having human granulocyte colony-stimulating factor activity | |
| EP0252588A2 (en) | Process for the isolation and purification of P. falciparum CS protein expressed in recombinant E. coli, and its use as a vaccine | |
| RU2132386C1 (en) | Method of human recombinant gamma-interferon preparing | |
| CA2084186C (en) | Purification of human interleukin-4 secreted from a escherichia coli mutant | |
| JPS62259596A (en) | Purification of hybrid protein | |
| US6869934B2 (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| CA2002446A1 (en) | Method for the isolation of purification of cu/zn superoxide dismutase | |
| JP2828988B2 (en) | Novel DNA and its production method, novel plasmid having the same, novel polypeptide and its production method, and novel antitumor agent comprising the polypeptide | |
| RU2478644C2 (en) | Method for preparing pharmacologically acceptable mixture of substances containing low-molecular ingredients of cell wall peptidoglycane of gram-negative bacteria and possessing immunostimulatory activity | |
| Klyushnichenko et al. | Methods of preparation of recombinant Cytokine proteins: III. free-flow electrophoresis and chromatography in the production of mutant human recombinant tumor necrosis factor-α | |
| JPH0724596B2 (en) | Method for purifying interferon | |
| RU2101292C1 (en) | Method of isolation of recombinant human tumor necrosis alpha-factor | |
| Mesrob et al. | PURIFICATION OF MILK‐CLOTTING PROTEASE FROM BACILLUS MESENTERICUS STRAIN 76 | |
| JP3040190B2 (en) | Protein purification method | |
| KR0140263B1 (en) | Method for Purifying Recombinant Human Interferon Beta | |
| CN116410295A (en) | Purification method of escherichia coli expression | |
| RU2234513C2 (en) | Method for preparing interleukin-1-beta preparation | |
| JPS59225195A (en) | Purification of interleukin 2 | |
| JPS58140093A (en) | Production method of α-interferon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100805 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100805 Effective date: 20110715 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160621 |