RU2132383C1 - ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS ШТАММА В:4:Р1:15, БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pМ-6, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НВМ 64, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ - Google Patents
ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS ШТАММА В:4:Р1:15, БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pМ-6, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НВМ 64, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2132383C1 RU2132383C1 SU5001752A SU5001752A RU2132383C1 RU 2132383 C1 RU2132383 C1 RU 2132383C1 SU 5001752 A SU5001752 A SU 5001752A SU 5001752 A SU5001752 A SU 5001752A RU 2132383 C1 RU2132383 C1 RU 2132383C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- strain
- neisseria meningitidis
- outer membrane
- mol
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 134
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 title claims abstract description 73
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 35
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 16
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 title description 13
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 30
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 20
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 20
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 19
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 claims description 10
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 claims description 6
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 9
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 101000846901 Drosophila melanogaster Fat-body protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 4
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- TXWRERCHRDBNLG-UHFFFAOYSA-N cubane Chemical compound C12C3C4C1C1C4C3C12 TXWRERCHRDBNLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003977 lipoyl group Chemical group S1SC(C([H])([H])C(C(C(C(=O)[*])([H])[H])([H])[H])([H])[H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- AZXKALLRCOCGBV-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-(propan-2-ylamino)hexan-1-one Chemical compound CCCCC(NC(C)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 AZXKALLRCOCGBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical class S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001050984 Apple stem grooving virus (strain Korea) Putative movement protein Proteins 0.000 description 1
- 101001050983 Apple stem grooving virus (strain P-209) Probable movement protein Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001121580 Enterobacteria phage PRD1 Adsorption protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 101710108485 Envelope phospholipase F13 Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000976806 Genea <ascomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 208000034762 Meningococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710107904 NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit 9 Proteins 0.000 description 1
- 241000588654 Neisseria cinerea Species 0.000 description 1
- 241000588651 Neisseria flavescens Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 108700008924 Neisseria meningitidis lpdA Proteins 0.000 description 1
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 1
- 241000947238 Neisseria meningitidis serogroup C Species 0.000 description 1
- 241000588645 Neisseria sicca Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101001125164 Parietaria judaica Probable non-specific lipid-transfer protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710132845 Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 101000580771 Pseudomonas phage phi6 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010046119 hemolin Proteins 0.000 description 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
- C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
- C12Y108/01004—Dihydrolipoyl dehydrogenase (1.8.1.4), i.e. lipoamide-dehydrogenase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение касается метода выделения нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, имеющий мол.м. 64000 дальтон, который располагается на внешней мембране N. meningitidis так же, как и рекомбинантной ДНК, полученной на ее основе. Целью изобретения является идентификация нуклеотидной последовательности, кодирующей высококонсервативный протеин, производства этого протеина с высокой чистотой. Изобретение может быть использовано в способах диагностики и в изготовлении вакцин с широким спектром иммунозащиты. 6 с. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Description
Изобретение касается области генетической инженерии и биотехнологии. Более точно, изобретение касается нуклеотидной последовательности, полученной от патогенной бактерии Neisseria meningitidis нуклеотидная последовательность которой кодирует белок внешней мембраны указанной бактерии. Указанный белок клонируется и экспрессируется в хозяине - E. coli. Характеристики этого белка, а также его способность индуцировать иммунологически активные антитела (бактерицидные антитела) в своем естественном хозяине, позволяет использовать его для приготовления вакцин против патогенных штаммов указанного микроорганизма.
Грам-отрицательная бактерия N. meningitidis, по мировой статистике, вызывает каждый третий случай бактериального менингита. Она была впервые описана Антоном Вайксельбаумом в 1887 году (см. I. Devoe, 1982, Microbiol. Revs. 46: 162 - 190), и до сих пор единственным естественным хозяином этой бактерии остается человек.
В отношении метаболизма и серологической дифференциации этого микроорганизма в первой половине XX века были обнаружены некоторые существенные аспекты. Первые безуспешные попытки получения вакцинных препаратов основывались на капсулярном полисахариде. (E. Kabat и др. 1945, J. Exp. Med. 80: 299 - 307). Согласно химическому составу этого капсулярного полисахарида бактерия N. meningitidis серогруппирована на A, B, C, 29-E, H, I, K, J, W-135, X, Y или Z, и основной процент заболеваний вызывается группами A, C, Y, W-135 и B. Неинкапсулированные штаммы не связывают с этим заразным заболеванием.
С использованием различных способов очистки этих полисахаридов (E. Cotschlich и др. 1969, J. Exp. Med. 129: 1349 - 1365) было показано, что первые четыре полисахарида (ПС) являются хорошими иммуногенами и индукторами бактерицидных антител у человека (там же, 1367 - 1384). Присутствие этого вида антител ранее связывали с невосприимчивостью к инфекции (там же, 1307 - 1326). В настоящее время для серотипов A, C и W-135 хорошо изучены моно-, би- и тетравелентные вакцины (F. Ambrosch и др. 1983, Bulletin of the Who 61: 317 - 323; I. Vodopija и др. 1983, Infect. Immunol. 42: 599 - 604; M. Cadoz и др., 1985, Vaccine 3: 340 - 342; H. Peltola и др., 1985, Peliatrios 76: 91 - 96).
Эти вакцины разрешены для их применения на людях в различных странах (Centers for Desease Control, 1985, Morbid. Mortal. Weeklyheport 34: 255 - 259) и некоторые из них имеются в продаже от различных фирм и производителей (Connaught Laboratories, США; Smith Kline-RI, T Бельгия, Institute Merieux, Франция; Behringwerke Aktiengesellscchaft, Германия; Instituto Sieroterapico e vaccino genea Toscano "Sclavo", Италия, Swiss Serum and Vaccine Institute, Berne, Швейцария, и другие).
Однако традиционная вакцина против N. meningitidis серогруппы C не вызывает достаточных уровней бактерицидных антител у детей младше двух лет, которые являются основными жертвами этой болезни. Было продемонстрировано, что титр специфических антител против N. meningitidis у детей младше 4 лет после трех лет вакцинации сходен у вакцинированных и невакцинированных детей (H. Kayhty и др., 1980, J. of Infect. Dis. 142: 861 - 868). Так никакого иммунитета не было обнаружено против N. meningitidis после 8 лет вакцинации у молодых людей (N. Rautonen и др., 1986, J. of Immund, 137: 2670 - 2675).
Полисахарид, соответствующий N. meningitidis серогруппы B, является слабо иммуногенным (E. Cotschlich и др., 1969, J. Exp. Med. 129; 1349 - 1365) и вызывает слабую реакцию 1 М низкой специфичности (W. Zdlinger и др., 1979, J. Clin. Inoest. 63: 836 - 848). Имеется несколько теорий, касающихся этой проблемы, такие как перекрестная реактивность между B-полисахаридом и структурами мозга плода, антигенными структурами, модифицированными в растворе и чувствительностью к нейроаминидазе (C. Moreno и др., 1985, Infect. Immunol. 47: 527 - 533). Недавно была получена химическая модификация ПС "B", которая вызывала реакцию у хозяина (H. Jennings и др. 1988, пат. США N 4.727.136; F. Ashton и др. , 1989, Microb. Pathogen. 6: 455 - 458), однако безопасность этой вакцины для людей не была продемонстрирована.
Из-за отсутствия эффективной вакцины против N. meningitidis "B", и вследствие того, что опасность эндемии низка и ограничена, в основном, детьми, обязательная иммунизация полисахаридами не рекомендуется (C. Frash, 1989, Clin. Microbiol. Revs. 2: 134 - 138), за исключением эпидемических случаев.
Поскольку после Второй Мировой войны эта болезнь в большинстве случаев вызывалась N. meningitidis типа B, то вакцины против серогруппы B приобрели особое значение.
Компоненты внешней мембраны N. meningitidis включают фосфолипиды, липополисахариды (ЛПС или эндотоксины), пили-протеины и др. Различные иммунотипы ЛПС были описаны для N. meningitidis (W. Zollinger and R. Mandrell, 1977, Infect. Immun. 18: 424 - 433; C.M. Tsai и др., 1983 J. Bacteriol, 155: 498 - 504) и была исследована иммуногенность с использованием нетоксичных производных (H. Jennings и др., 1984, Infest. Immund. 43: 407 - 412), однако, их вариабельность (H. Schneider и др., 1984, Inf. Immunol. 45: 544 - 549) и пирогенность (когда ЛПС присоединен к липиду A) являются ограничивающими факторами до сих пор.
Пили-структуры, необходимые клеткам для их фиксации к слизистой оболочке носоглотки (D. Stephens и др., 1983, J. Infect. Dis., 148: 369 - 376), имеют антигенные различия у разных штаммов (J.Greenblatt и др., 1988, Infect. Immun. 56: 2356 - 2362) наряду с несколькими общими эпитопами (D. Stephens и др., 1988, The J. Infect Dis. 158: 332 - 343). В настоящее время имеются некоторые сомнения в отношении эффективности вакцины, основанной на этих структурах. Однако, было получено все же несколько таких типов вакцин с неизвестными результатами в отношении их применения на людях (C. Brinton, 1988, патент США N 4.769.240).
Недавно внимание переключилось на другие белки внешней мембраны этой бактерии. У этих белковых комплексов имеется множество иммунологических типов.
Штаммы N. meningitidis подразделяются на серотипы согласно присутствию специфических эпитопов в мажоритарном белке P1/P2 и на подтипы согласно другим эпитопам в белке P1 (C. Frasch и др., 1985, Rev. Infect. Dis. 7: 504-510).
Опубликовано несколько статей и патентных заявок, касающихся вакцин, основанных на "коктейле" из этих белков, с предварительным селективным удалением эндотоксинов с использованием биосовместимых детергентов. Иммуногенность этих коктейлей у животных и людей продемонстрировали следующие авторы: (W. Zollinger и др., 1979, J. Clin. Invest. 63: 836-848; C. Frasch и M. Peppler, 1982, Infect. Immun. 37: 271-280; E. Benverg и др., 1983, Infect. Immun. 40: 369-380, E. Kosenquist и др., 1983, NIPH Annals 6: 139-149; L. Wanq и C. Frasch, 1984, Infect. Immun. 46: 408-414; C. Moreno и др., 1985, Infect. Immun. 47: 527-533; E. Wedege и Froholm, 1986, Infect. Immun. 51: 571-578; C. Frasch и др., 1988, The J. Infect. Dis. 158: 710-718; M. Lifely и Z. Wang, 1988, Infect. Immun. 56: 3221-3227; J. Poolman и др., 1988, - в кн. J. Poolman и др. (изд.) "Gonococci and Meningococci" Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, the Netherlands, стр. 159-165; E. Rosenquist и др., 1988, J. Clin. Microbiol. 26: 1543-1548), включая результаты массовых полевых исследований в Кейптауне, ЮАР, в 1981 (C. Frasch, 1985, Eur. J. Clin. Microbiol. 4: 533-536); в Икике, Чили, в 1987 г. (W. Zollinger, 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center), и на Кубе в 1986 и 1988 годах (G. Sierra, 1988, Proceedings of the Sixth International Pathogenic Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center). Однако, за исключением последнего случая, бактерицидные антитела, индуцируемые этими препаратами, были ограничены антителами к тем же самым (по серотипу) штаммам или родственным им.
На одну из таких вакцин указывается в патенте США N 4.601.903, которая ограничивается одним из типов N. meningitidis, вызывающих менингит (серотип 2), с широким диапазоном действия, однако у пациентов часто выделяли и другие серотипы, такие как серотипы 4 (Куба, от 1981 до 1983, H. Abdillahi и др. , 1988, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7: 293-296, Финляндия, от 1976 по 1987, H. Kayhty и др., 1989, Scand. J. Infect. Dis. 21: 527-535), 8 (Австралия от 1971 по 1980, F. Ashton и др., 1984, Can. J. Med. Biol. 30: 1289-1291) и 15 (Норвегия от 1982 по 1984, L. Froholm и др., 1985, Proceedings of the 4-th Int. Symp. on Path. Neisseria American Society for Microbiology; Чили с 1985 по 1987, S. Ruiz и др., 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. Neisseria Conf. Callaway Gardens Conference Center), а также штаммы неидентифицированного серотипа (F. Ashton и др., 1980, Can. J. Microbiol. 26: 1480-1488, Австралия с 1971 по 1980, F. Ashton и др., 1984, Can. J. Med. Biol. 30: 1289-1291; Финляндия с 1976 по 1987, H. Kayhty и др., 1989, Scan. J. Infect. Dis. 21: 527-535).
Кубинская вакцина, полученная в 1988 году в "Сентро Насиональ де Биопрепарадос" (см. заявку EP N 301 992), оказалась весьма эффективной. Она основана на антигенном комплексе высокого молекулярного веса. Эта вакцина обладает широким диапазоном перекрестной реактивности с другими штаммами, продуцирует и поддерживает бактерицидные антитела в иммунизированном хозяине.
Однако методики получения этого типа вакцины начинаются с размножения в подходящей среде высокопатогенного микроорганизма, со связанным с этим биологическим риском непосредственной работы с бактерией. Кроме того, этот вид препаратов содержит липосахариды, являющиеся загрязнителями, которые, хотя и могут повысить эффективность вакцины, в то же время создают нежелательные побочные эффекты ввиду их сильной пирогенности. Также в разных партиях препарата нельзя контролировать изменения содержания минорных антигенных компонентов, которые образуют часть препарата, что затрудняет соблюдение важных параметров, касающихся реактогенности и иммуногенности.
По этой причине постоянно увеличивается интерес к идентификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих высококонсервированные белки во всех штаммах, и еще более - к идентификации белков, индуцирующих бактерицидные антитела, которые являются общими для большинства патогенных N.meningitidis, чтобы получить вакцинные препараты с широким спектром защиты.
Имеется несколько белков высокого молекулярного веса, присутствующих в небольших количествах во внешней мембране N.meningitidis, когда этот микроорганизм выращивают в традиционной культурной среде, но дает сильную реакцию у инфицированных особей (J. Black и др., 1986, Infect. Immun. 54: 710-713; L. Aoun и др., 1988, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 139: 203-212) и/или усиливают их реакцию при особых условиях культивирования (J. Van Putten и др., 1987, Antoine van Leenwenhock 53: 5557-5564; A.Schryvers и L.Morris, 1988. Mol. Microbiol., 2: 281-288, и Inf. Immun. 56: 1144-1149). Некоторые из этих белков являются высококонсервированными у различных штаммов, в частности у тех, которые отвечают за усвоение железа микроорганизмами, что делает их интересными кандидатами на приготовление вакцины (L.Mocca и др., 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. Neisseria Conference Callaway Gardens Conference Center; C.Frash, 1989, Clin. Microbiol. Revs. 2: 134-138).
В дополнение к чистым белкам, полученным из микроорганизмов или штаммов соответствующих видов (например, белок размером 36 кДа, Т. Митцнер и С. Морзе, патент США N 4.681.761), было клонировано и экспрессировано несколько родственных генов. Среди этих белков есть следующие:
- протеаза IgAI (J.Koomey и S.Falkow, 1984, Inf. Imm. 43: 101-107);
- протеин P1 (A. Barlow и др., 1987, Inf. Imm. 55: 2734-2740, и 1989, Mol. Microbiol., 3: 131-139);
- протеин P5a (T.Kawula и др., 1988, Inf. Imm. 56: 380-386);
- протеин P5c (T.Olyhoek и M.Achtman, 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. N. Conference Callaway Gardens Conf. Cent.);
- протеин P4 (K.Klugman и др., 1989, Inf. Imm. 57: 2066-2071);
- протеин P2 (K.Murakami и др., 1989, Inf. Imm. 57: 2318-2323) и от N. gonorrhoeae, которая кодирует белки с перекрестной реактивностью с их соответствующими белками от N.meningitidis;
- антиген H.8 (W.Black и J.G.Cannon, 1985, Inf. Imm. 47: 322-325);
- макромолекулярный комплекс (W.Tsai и C.Wilde, 1988, Proceedings oh the 6th Int. Path. Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center);
- белок размером 37 кДа, репрессируемый в присутствии железа (S.Berish и др. , 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center).
- протеаза IgAI (J.Koomey и S.Falkow, 1984, Inf. Imm. 43: 101-107);
- протеин P1 (A. Barlow и др., 1987, Inf. Imm. 55: 2734-2740, и 1989, Mol. Microbiol., 3: 131-139);
- протеин P5a (T.Kawula и др., 1988, Inf. Imm. 56: 380-386);
- протеин P5c (T.Olyhoek и M.Achtman, 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. N. Conference Callaway Gardens Conf. Cent.);
- протеин P4 (K.Klugman и др., 1989, Inf. Imm. 57: 2066-2071);
- протеин P2 (K.Murakami и др., 1989, Inf. Imm. 57: 2318-2323) и от N. gonorrhoeae, которая кодирует белки с перекрестной реактивностью с их соответствующими белками от N.meningitidis;
- антиген H.8 (W.Black и J.G.Cannon, 1985, Inf. Imm. 47: 322-325);
- макромолекулярный комплекс (W.Tsai и C.Wilde, 1988, Proceedings oh the 6th Int. Path. Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center);
- белок размером 37 кДа, репрессируемый в присутствии железа (S.Berish и др. , 1988, Proceedings of the 6th Int. Path. Neisseria Conference. Callaway Gardens Conference Center).
Использование этих белков в качестве активных вакцинирующих препаратов не сообщалось ранее, или же испытания на индуцируемые ими бактерицидные антитела дали отрицательный результат, как в случае мышиных моноклональных антител против H.8 (J.Woods и др., 1987, Infect. Immun., 55: 1927-1928).
До сего момента белок P1, находящийся во внешней мембране N.meningitidis, является одним из наиболее хорошо охарактеризованных и изученных антигенов. Этот белок не представляет варианбельности внутри одного штамма. Однако имеется более 17 типов белков P1 у Neisseria, которые имеют отличия в трех различных областях, что и явилось основанием для классифицирования Neisseria на разные подтипы. Этот белок является очень иммуногенным у людей (W. D. Zollinger и R.E.Mandrell, 1983, Med. Trop., 43: 143-147), вызывающим защитные антитела (E.Wedege и L.O.Froholm, 1986, Infect. Immun. 51: 571-578; K. Saukkonen и др., 1987, Micr. Path., 3, 261-267), что придает ему особое значение для приготовления вакцин.
Некоторые подтипы белков P1 клонировали в E.coli, исходя из геномных библиотек (А. К.Барлов и др., 1989, Мол. Микроб. 3: 131-139), или с использованием цепной реакции полимеразы (С. Бутчер, Седьмая Междунар. Конференц. по Нейсерии; Р. Зайд, патентная заявка WO 90/06696; Брайн Мак-Гиннесс и др., 1990, Ж. Эксп. Мед. 171: 1871-1882, М.С.Ж. Мейден и др., 7-я Межд. Конф. по Нейсерии, Берлин, 9-14 сент. 1990 и 1991, Молек. Микр. 3: 727, Дж. Сукер и др. , 7-я Межд. Конф. по Нейсерии, Берлин, 9-14 сент. 1990). Однако, до сих пор не имеется генетической конструкции, способной продуцировать этот белок с высокими уровнями экспрессии. Сообщалось лишь о низких уровнях экспрессии (Д. А. Вайт и др., 1990, Мол. Микроб. 4: 769-776) или о его экспрессии в Bacillus subtilis, лигированным с белком A внешней мембраны E.coli (omp A) (Е. Ваальштром и др., 7-я Межд. Конф. по Нейсерии, Берлин).
Можно подтвердить, что до сих пор не было выделено антигена, который был бы общим для всех типов и серогрупп N.meningitidis и был способен продуцировать бактерицидные антитела. По этой причине антиген такого типа, конъюгированный или лигированный к другим белкам или полисахаридам, представляющим иммунологический интерес, представлял бы собой кандидата для бивалентного вакцинного препарата.
Изобретение касается нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, имеющий молекулярный вес около 64 кДа. Эта последовательность была обнаружена у всех серотипов N.meningitidis и всех исследованных серогруппах, что было проверено нуклеиновокислотной гибридизацией. Вестерн-блоттингом, дот-блоттингом и твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA).
Технической задачей изобретения является идентификация нуклеотидной последовательности, которая кодирует высококонсервированный белок и является общей для большинства патогенных штаммов Neisseria (название P64к), с целью получения рекомбинантным методом белка, который имел бы высокую степень чистоты в коммерчески полезных количествах таким образом, чтобы его можно было применять в диагностических способах и как составную часть вакционного препарата широкого спектра защиты.
На уровне генетической информации (ДНК и РНК) изобретение обеспечивает рекомбинантный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин P64к Neisseria meningitidis, причем указанный протеин P64к в основном имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. В предпочтительном выполнении указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая протеин P64к N.meningitidis, в основном состоит из нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1. Далее рекомбинантный полинуклеотид может включать нуклеотидную последовательность клонирующего или экспрессионного вектора.
Изобретение также обеспечивает трансформированный микроорганизм, содержащий рекомбинантный полинуклеотид, как он определен выше, предпочтительно трансформированный микроорганизм, который способен экспрессировать протеин P64к N.meningitidis. В особенно предпочтительном выполнении изобретения трансформированным микроорганизмом является штамм E.coli, например штамм E.coli HB101, трансформированный экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин P64к N.meningitidis, например экспрессионный вектор pM-6.
Изобретение также обеспечивает рекомбинантное белковое вещество, включающее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности по меньшей мере части протеина P64к N.meningitidis, причем указанный протеин P64к в основном имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1. Указанное белковое вещество может в основном состоять из протеина P64к, или быть легированным протеином или белково-полисахаридным конъюгатом, включающим аминокислотную последовательность протеина P64к N.meningitidis.
Изобретение далее обеспечивает вакцинирующую композицию, включающую рекомбинантный протеин, как он определен выше, вместе с подходящим носителем, разбавителем или адъювантом. Частное выполнение изобретения обеспечивает вакцинную композицию, включающую липоамид-дегидрогеназу или ацетил-трансферазу, которая способна индуцировать антитела, которые могут связывать протеин P64к N. meningitidis вместе с подходящим носителем, разбавителем или адъювантом.
Дополнительно изобретение обеспечивает моноклональное антитело, созданное против рекомбинантного белкового вещества, как оно определено выше, или против липоамид-дегидрогеназы или ацетил-трансферазы, и способное связывать протеин P64к N.meningitidis.
Изобретение также обеспечивает способ получения протеина P64к, имеющего в основном аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, который предусматривает стадии трансформирования микроорганизма экспрессионный вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный протеин P64к, или указанный легированный протеин, культивирование трансформированного микроорганизма для получения экспрессии указанного протеина P64к, или указанного лигированного протеина, и выделение указанного продукта экспрессии.
Новым аспектом настоящего изобретения является ген, выделенный из N. meningitidis штамма B:4:P1.15, который назван M-6 и имеет в качестве основной своей характеристики стабильность в векторах E.coli. Этот ген не оказывает нежелательного воздействия на хозяина, позволяя получать выходы свыше 25% от общего белка (соотношение P64к от общего белка штамма-хозяина). С другой стороны, гибридизацией по Саузерну и Вестерн-болту (Е.Саузерн, 1975, J. Mol.Biol. 98: 503-527 и В.Брюнет, 1981, Анал. Биохем., 12: 195-203), было продемонстрировано, что протеин P64к присутствует у всех следующих штаммов N.meningitidis:
N.Meningitidis A N.Meningitidis B:9
N.Meningitidis B:1 N.Meningitidis B:11
N.Meningitidis B:2 N.Meningitidis B:15
N.Meningitidis B:4 N.Meningitidis B:4:P1.15
N.Meningitidis B:5 N.Meningitidis C
N.Meningitidis B:8 N.Meningitidis B:15:P1.16
N.Meningitidis N.Meningitidis B:15:P1.16(H44/76)
N.Meningitidis B: T(121/85)
N.Meningitidis B: T(71/86)
N.Meningitidis B: T(210/86), а также у
N.Mucsa, N.subflave и N.gonorrhoeae.
N.Meningitidis A N.Meningitidis B:9
N.Meningitidis B:1 N.Meningitidis B:11
N.Meningitidis B:2 N.Meningitidis B:15
N.Meningitidis B:4 N.Meningitidis B:4:P1.15
N.Meningitidis B:5 N.Meningitidis C
N.Meningitidis B:8 N.Meningitidis B:15:P1.16
N.Meningitidis N.Meningitidis B:15:P1.16(H44/76)
N.Meningitidis B: T(121/85)
N.Meningitidis B: T(71/86)
N.Meningitidis B: T(210/86), а также у
N.Mucsa, N.subflave и N.gonorrhoeae.
Этот белок не присутствует у N.cinerea, N.lactamica, N.sicca и N.flavescens, однако они не представляют интереса ввиду их непатогенности.
Этот протеин, имеющий молекулярный вес около 64 кДа, может быть локализован с помощью электронного микроскопа на внешней мембране N.meningitidis. Поэтому он является экспонированным антигеном, благоприятным для его использования в приготовлении вакцины. Этот протеин распознавался экспериментами по Вестерн-блот-иммуноидентификации в сыворотке выздоравливающих и вакцинированных традиционной кубинской вакциной "Ва-Менгок-БЦ" (Сентро Насиональ де Биопрепарадос, Гавана, Куба). Этот аспект гарантирует иммуногенность антигена и в то же время подтверждает его присутствие в белковой фракции высокого молекулярного веса, содержащейся в этой вакцине, которая отвечает за длительную иммунную реакцию на заболевание.
Другим новым аспектом изобретения является то, что этот протеин, являющийся объектом изобретения, продуцирует антитела с широким бактерицидным спектром (различные серогруппы, серотипы и подтипы), т.е. имеет характеристику, которая ранее не сообщалась ни для одного белка от N.meningitidis.
Высокие уровни этого протеина, полученные у E.coli, делают его важным кандидатом для усовершенствования иммуногенности, когда он экспрессируется как протеин, лигированный с другими протеинами. Также можно усилить экспрессию посредством передачи повышенной стабильности и совместимости в молекулярной структуре во время процессов транскрипции и трансляции. Будучи принадлежащим Neisseria, этот протеин может быть также легирован с другими протеинами Neisseria с целью получения вакцинных препаратов против этого микроорганизма с повышенной иммунногенностью. Эти лигированные протеины также являются объектами настоящего изобретения.
С другой стороны было неожиданного обнаружено, что ген M-6, полученный из геномной библиотекам штамма N.meningitidis B:4:P1.15, продемонстрировал значительную гомологию с последовательностями липоамид-дигидрогеназ и ацетил-трансфераз других микроорганизмов и высших организмов. Присутствие общих антигенных детерминантов позволяет использовать эти другие родственные белки в качестве иммуногенов, способных сообщить защиту посредством индуцирования бактерицидных антител, которые распознают антигенные детерминанты, общие с протеином Р64к. Поэтому в объем настоящего изобретения также включается использование этих липоамид-дегидрогеназ и ацетил-трансфераз (выделенных не от N. meningitidis) или их производных, таких как пептиды, фрагменты ферментной деградации конструкции, полученные легированием с другими белками или конъюгацией с протеинами, полисахаридами или липидами, или посредством инсерции в такие комплексы, как липосомы или везикулы и т.д., для целей вакцинирования.
Важным объектом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, кодирующая ген М-6 (SEQ IDNO:1 в списке последовательностей), продуктом которой является протеин Р64к.
Этот ген был извлечен из генома штамма B385, выделенного на Кубе (N.meningitidis B: 4: P1.15), с помощью конструкции из геномной библиотеки в фаге EMBI 3.
Рекомбинантная ДНК, включающая ген М-6, представляет собой другой объект изобретения, который включает фаг лямбда, плазмиду pM-3 и экспрессионный вектор для экспрессии в бактериях.
В частности, для внутриклеточной экспрессии E.coli M-6 ген клонировали под триптофановым промотором с использованием его собственного сигнала терминации транскрипции и соединительного фрагмента между М-6 и клонирующим E. coli, который добавляет следующую нуклеотидную последовательность к концу 5: ATG CTAGAT AAA AGA (SEQ IDNO2).
N-терминал протеина Р64к, кодированного геном М-6, вставленным в плазмиду pM-6, который добавляет 5 аминокислот к N-терминалу исходного протеина.
Другим объектом настоящего изобретения являются микроорганизмы, полученные посредством трансформирования штамма E.coli HB 101 вектором pM-6, которые характеризуются высокими уровнями экспрессии протеина Р64к, хорошей жизнеспособностью и высокой стабильностью.
Трансформированный клон E. coli был обозначен HBM64 (см. фиг. 2), и представляет более высокие уровни экспрессии Р64к (на 25% по отношению к общему белку клетки) (фиг. 6).
Процедура, описанная в настоящем изобретении, благодаря уровням экспрессии этого продукта, позволяет достичь оптимальной чистоты для использования этого протеина для людей.
С другой стороны, антиген, полученный из выделенной последовательности, может быть очень полезен при получении различных типов потенциальных вакцинных препаратов, таких как бивалентные вакцины с широким спектром действия, например протеин-полисахаридные конъюгаты, лигированные протеины и т.д.
Примеры
Далее приводятся примеры для лучшей иллюстрации изобретения, которые, однако, не ограничивают его объемы.
Далее приводятся примеры для лучшей иллюстрации изобретения, которые, однако, не ограничивают его объемы.
Пример 1.
Для выделения геномной ДНК из N.meningitidis B:4:P1.15 клетки выращивали в среде Мюллера-Хинтона (OXOID, Лондон). Биомассу из 100 мл культуры ресуспендировали в 8 мл Трис (гидроксиметил-аминометан) 100 мМ, ЭДТК 1 мМ, pH 8. Клетки обрабатывали лизоцимом (10 мг/мл), с последующим добавлением 200 мкл самоперевариваемой проназы (20 мг/мл) и 1.1 мл 10% додецилсульфата натрия. Смесь инкубировали при 37oC в течение часа, а затем ее обрабатывали фенол-хлоформом (об/об), и остатки фенола удаляли с использованием 2-бутанола. Наконец, ДНК осаждали абсолютным спиртом, и РНК удаляли рибонуклеазой A (Сигма, Лондон).
ДНК размером около 60 кб/тыс.оснований/ подвергали частичному перевариванию ферментом SAU3A, с получением популяции фрагментов размером примерно 15 кб. Эту мажоритарную фракцию выделили и очистили посредством разделения на агарозном геле (Т. Маниатис и др., 1982, Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство. Коулд Спринг Харбор Лаб.: (Нью-Йорк). Для создания геномной библиотеки в основном следовали процессу, описанному Маниатисом (см. там же). 4 мкг очищенной ДНК лигировали к 8 мкг ВамН1-переваренной плазмиде EMBL-3. Продукт лигирования был упакован и фаги, наконец, разместили (посеяли) на штамме E.coli C66P2.
Эту библиотеку скринировали посредством иммуноидентификации - (Р.Янг и Р. Дэвис, 1983, PNAS США 80:1194-1198) с использованием сыворотки кролика, полученной препаратом протеинов, принадлежащих внешней мембране штамма N. meningitidis B: 4: P1.15. Клоны анализировали вестерн-блотингом (Бурнет, 1981), и обнаруживали экспрессию протеина Р64к с молекулярным весом около 70 кДа. Полученный рекомбинатный фаг был обозначен 31. Вестерн-блотинг проводили также с использованием смеси сыворотки от выздоравливающих от менингококковой инфекции, свободной от антител от E.coli, с получением того же результата, что и с использованием сыворотки гипериммунизированных кроликов.
Этот эксперимент был повторен с использованием сыворотки от нескольких здоровых людей, и полученный сигнал был отрицательным против рекомбинантного протеина Р64к.
Пример 2.
Для субклонирования в бактериях инсерт размером 17 кб, соответствующий выделенному из библиотеки фагу, клонировали в плазмиде pUC18 после отделения от плеч фага с использованием фермента SaI 1. Это привело к конструкции pM-1 (фиг. 2), которую подвергали рестрикционному анализу (фиг. 3).
Фрагмент SaI I-Hind III размером около 6 кб реклонировали в плазмиде pUC 18 и получили конструкцию pM-7 (фиг. 2). Чтобы получить более точное положение (локализацию) гена, кодирующего протеин P64к, осуществляли делеции с помощью ферментов Cla I, EcoR I и Hind II. Полный фрагмент гена M-6 был, наконец, локализован как EcoR I-Hind III инсерт, соответствующий конструкции pM-3 (фиг. 2)
Во всех конструкциях присутствие гена было подтверждено распознаванием этого протеина посредством иммуноидентификации колоний и вестерн-блоттингом с использованием сыворотки гипериммунизированных кроликов.
Во всех конструкциях присутствие гена было подтверждено распознаванием этого протеина посредством иммуноидентификации колоний и вестерн-блоттингом с использованием сыворотки гипериммунизированных кроликов.
Последовательность инсерта в pM-3 была определена по способу Зангера (Ф. Зангер и др., 1977, PNAS США 74: 5463-5467).
Из полученной последовательности был получен дедукцией приблизительный молекулярный вес протеина, кодируемого этим геном.
С целью получения конструкции для высокой экспрессии протеина P64к плазмиду pM-3 (фиг. 2) выпрямили (линеаризовали) ферментом EcoR I и провели последовательные супрессии гена, инкубируя образцы с нуклеазами ExO III и SI.
Полученные фрагменты отделяли от остальных участков вектора pUC 18 посредством вырезания рестрикционным ферментом Hind III и клонировали лигированным к стабилизаторному фрагменту (EPA-0.416.673), с использованием Xbа-тупого адаптера для консервирования сайта Хbа I стабилизаторного гена:
5' C T A G A T A A A A G A 3' (SEQ ID NO:4)
3' T A T T T T T C T 5' (SEQ ID NO:5).
5' C T A G A T A A A A G A 3' (SEQ ID NO:4)
3' T A T T T T T C T 5' (SEQ ID NO:5).
Конструкции, в которых лигированный фрагмент совпадал с рамкой считывания, отбирались посредством иммуноидентификации с использованием сыворотки гипериммунизированных кроликов.
Инсертные последовательности были установлены с использованием способа Зангера (Ф. Зангер и др., 1977, PNAS США 74: 5463-5467). Из полученных последовательностей был получен дедукцией средней молекулярный вес протеина, кодированного этим геном.
Область слияния между протеинами была локализована в генных последовательностях. В клоне pILM-25 (фиг. 4) АTГ гена, предопределенного последовательностью инсерта ДНК, выделенного из библиотеки, совпала с сайтом лигирования.
Фрагмент Nco I - Xba I, соответствующий стабилизирующей пептид-кодирующей последовательности, был удален делецией из pIIM-25 с получением нелигированного протеина, экспрессированного под триптофановым промотором с его природным терминатором из N.meningitidis B:4:PI.15 согласно конструкции pM-6 (фиг. 1).
Плазмиду pM-6 трансформировали в различных штаммах E.coli, таких как W 3110, JA-221, HB-101, LE-392 и MC-1061, и сравнивали экспрессию протеина p64к. Наилучшие результаты были получены со штаммами W3110, JA-221 и HB-101. Эти штаммы выбрали для масштабирования (оценки) ферментации, были получены уровни экспрессии до 25% общего клеточного белка.
Пример 3.
Для подтверждения правильной экспрессии клонированного гена H-терминальную область интактного протеина подвергали деградационному способу Эдмана (П. Эдман, 1950, "Акта Хем. Сканд., 4: 283-293). Эта методика позволила выяснить последовательность (первичную структуру) этой области молекул.
Протеин P64к был обессолен посредством гель-фильтрационной хроматографии (РД-10, фармация), элюирован водой и исследован мониторингом при длине волны 280 нм. Белковую фракцию концентрировали до 0.5 нМ/л. Один мкл этого раствора фильтровали через ПВДФ (поливинилиден-дифторид) (Миллипор)фильтр, предварительно активированный метанолом.
Проводили деградацию Эдмана с использованием Автоматического Секвенатора Кнауера, модель 810, в соединении с системой HPLC (высокопроизводительная жидкостная хроматография) так, чтобы обнаружить фенил-тиогидантоиновые производные аминокислот (PTH-аминокислоты). Стандартной процедурой секвенирования была процедура согласно рекомендациям производителя указанного оборудования. Разделение PTH-аминокислот осуществляли на колонке для обращенно-фазовой хроматографии C-18 (5 мкм) 250 мм х 2 мм (Мерцк), элюировали ацетонитрилом с градиентом (Б-буфер) в ацетате натрия (А-буфер), приготовленный по рекомендациям изготовителя, с потоком 200 мкл/мин при 42oC. PTH-аминокислоты обнаруживали при 269 нм.
Обработку данных и регистрирование осуществляли в автоматическом интеграторе Шимадзу, модель CP-6a, с использованием программы обработки данных посредством вычитания двух последовательных хроматограмм, для облегчения оценки деградационных циклов Эдмана. Идентификация последовательности получена посредством хроматографической оценки соответствующего проанализированного цикла и подтверждена хроматографией, полученной вычитанием, позволяющим определять 25 остатков.
Пример 4.
Для того, чтобы продемонстрировать, что протеин P64к распознается сывороткой пациентов, вакцинированных препаратом Ва-Менгок-БЦ (Сентро Насиональ де Препарадос, Гавана, Куба) осуществляли вестерн-блоттинг, со смесью 12 сывороток от взрослых (иммунизированных двумя дозами кубинской вакцины), которые были разведены в растворе, содержащем обезжиренное молоко (Oxoid, Лондон).
Эксперимент включал:
рекомбинантный протеин P64к, очищенный из штамма E.coli HB-101, трансформированного плазмидной pM-6;
супернатанат разорванных ультразвуком клеток нетрансформированного штамма E.coli HB-101;
реакция обнаруживалась посредством конъюгата протеин A-коллоидное золото.
рекомбинантный протеин P64к, очищенный из штамма E.coli HB-101, трансформированного плазмидной pM-6;
супернатанат разорванных ультразвуком клеток нетрансформированного штамма E.coli HB-101;
реакция обнаруживалась посредством конъюгата протеин A-коллоидное золото.
Было показано, что протеин P64к распознается пулом сывороток.
Пример 5.
Бактерицидное испытание против B385 (B:4:PI.15) было проведено согласно процедуре, описанной Ларриком и др. (Сканд. Ж. Иммунол., 32, 1990, 121-128) с модификациями. Для этой цели была создана смесь:
а) суспензии бактерий, культивировавшихся при особых условиях (1-5 единиц образования колоний/1);
б) сбалансированный солевой раствор Гея;
в) сыворотка (3-4 недельного) кролика в качестве источника комплемента;
г) пул сывороток от мышей, иммунизированных против протеина P64к в Алюминий-Гидроксидном Геле (AHG) и инактивировали при 56oC в течение 30 мин. Иммунизацию мышей проводили согласно иммунизационной схеме - 3 дозы по 20 г. Пропорции, использованные в вышеупомянутой смеси, были 1:2:1:1 в общем объеме 125 л. Смесь инкубировали при 37oC в течение 1 часа и высевали в свежий Агар Мюллера-Хинтона (Оксоид, Лондон) с добавлением 5% сыворотки теленка (КубаВет, Гавана). Подсчет выживших колоний проводили через 18 часов инкубирования чашек в атмосфере 5% CO2 при 37oC.
а) суспензии бактерий, культивировавшихся при особых условиях (1-5 единиц образования колоний/1);
б) сбалансированный солевой раствор Гея;
в) сыворотка (3-4 недельного) кролика в качестве источника комплемента;
г) пул сывороток от мышей, иммунизированных против протеина P64к в Алюминий-Гидроксидном Геле (AHG) и инактивировали при 56oC в течение 30 мин. Иммунизацию мышей проводили согласно иммунизационной схеме - 3 дозы по 20 г. Пропорции, использованные в вышеупомянутой смеси, были 1:2:1:1 в общем объеме 125 л. Смесь инкубировали при 37oC в течение 1 часа и высевали в свежий Агар Мюллера-Хинтона (Оксоид, Лондон) с добавлением 5% сыворотки теленка (КубаВет, Гавана). Подсчет выживших колоний проводили через 18 часов инкубирования чашек в атмосфере 5% CO2 при 37oC.
Бактерицидный титр рассматривали как максимальное сывороточное разбавление, необходимое для вызывания 50% ингибирования клеточного роста, по отношению к той же самой смеси без тестовой сыворотки. Было обнаружено, что разбавление сыворотки 1:20 все еще поддерживает бактерицидное воздействие. В качестве отрицательного контроля (небактерицидного при разбавлении 1:2) использовали пул сывороток от мышей, иммунизированных AHG, и пул сывороток от мышей, иммунизированных рекомбинантной вакциной против гепатита B (Куба). Бактерицидный эффект был специфичным по отношению анти-P64к антител.
Пример 6.
Осуществляли бактерицидный тест против различных штаммов N.meningitidis с использованием:
1. Аммониево-сульфатного преципитата супернатанта, собранного из культуры клеток гибридомы, которые секретировали моноклональные антитела, специфичные против P64к (анти-P64к)/ анализируемый образец.
1. Аммониево-сульфатного преципитата супернатанта, собранного из культуры клеток гибридомы, которые секретировали моноклональные антитела, специфичные против P64к (анти-P64к)/ анализируемый образец.
2. Аммониево-сульфатного преципитата супернатанта, собранного из гибридомных клеток, секретирующих моноклональные антитела, специфичные против PI. 15 протеина, присутствующего в штамме N. meningitidis B385 (анти-PI. 15)/положительный контроль системы. Максимальные исследованные разведения составляли всегда 1:16. В таблице указаны максимальные разведения, которые дали бактерицидный эффект согласно примеру 5 (см. в конце текста).
Как видно, моноклональные анти-P64к антитела обладают значительными бактерицидными титрами против различных серогрупп (A, B и C), серотипов (4, 14, 13, 15 и NT) и подтипов (7, 15, 16 и NT) бактерий.
Пример 7.
Лигированные протеин M-14 (P64к и PI.15)
Чтобы получить генетическую конструкцию для высокой экспрессии, которая содержала бы вариабельные эпитопы протеина PI.15 (протеина внешней мембраны N. meningitidis B:4:PI.15), лигированного к протеину P64к, клонировали ген, кодирующий протеин PI.15, с использованием цепной реакции полимеразы (PCR). Следующую последовательность (область)(см. I в конце текста), содержащую вариабельные иммунодетерминанты протеина PI. 15 вставили в MIuI сайт гена M-6, кодирующего P64к, после получения его тупых концов с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы I (см. последовательность I в конце описания). Сайты для лигирования гена PI.15 с М-6 приведены в конце текста.
Чтобы получить генетическую конструкцию для высокой экспрессии, которая содержала бы вариабельные эпитопы протеина PI.15 (протеина внешней мембраны N. meningitidis B:4:PI.15), лигированного к протеину P64к, клонировали ген, кодирующий протеин PI.15, с использованием цепной реакции полимеразы (PCR). Следующую последовательность (область)(см. I в конце текста), содержащую вариабельные иммунодетерминанты протеина PI. 15 вставили в MIuI сайт гена M-6, кодирующего P64к, после получения его тупых концов с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы I (см. последовательность I в конце описания). Сайты для лигирования гена PI.15 с М-6 приведены в конце текста.
Полученный лигированный протеин (M-14) был экспрессирован в E.coli с использованием плазмидного вектора под триптофановым промотором до уровней свыше 10% общего клеточного белка. Этот протеин распознавался моноклональными антителами и антителами против PI.15 и P64к при вестерн-блоттинге.
Пример 8.
Конъюгация полисахарид/P64к.
Протеин P64к был конъюгирован с полисахаридом от Haemophilus influenzae с использованием метода редуктивного аминирования. Полисахарид Haemophilus influenzae (Полирибозил-рибитол-фосфат, PPP) очищали холодным фенольным методом, описанным Фрашем, 1990 (в: "Бактериальные вакцины", 1990, Алан Р.Лисс, Инк. , стр. 123-145). Конечное загрязнение PRP протеинами или нуклеиновыми кислотами было менее 1%. Этот полисахарид был деградирован с использованием метода Париха (Parikh и др., 1974, в: "Methods in EnzymoI. 34B: 77-102) с периодатом натрия в PPP (соотношение по весу 1:5), растворенном в 0.1 M ацетата натрия (pH 4.5). Инкубирование осуществляли в темноте в течение 30 минут при перемешивании. Излишек периодата удаляли посредством добавления рибитола. Соединения очень низкого молекулярного веса удаляли диализом (Медицелл Интернешнал Лтд. Мембрейн, Лондон). Полученные олигосахариды имели свободные альдегидные группы, способные к реакции с первичными аминами (напр. , лизиновые остатки в протеинах). Конъюгат получали смешиванием протеина и полисахарида в весовом соотношении 1:1 с добавлением цианоборгидрида натрия и подверганием смеси инкубированию, сначала 48 часов при 4oC, а затем при 37oC в течение 24 часов. Комплекс высокого молекулярного веса, который содержит полученный конъюгат в соотношении протеин/полисахарид 1:2.3, мог быть отделен от нереактивных загрязнителей посредством HPLC.
Пример 9.
Бивалентный вакцинный препарат против вируса гепатита "B" и N.meningitidis. Для получения бивалентного вакционного препарата смешивали различные количества протеина Р64к и Поверхностного Антигена гепатита "B" (торговое наименование - Вакуна Рекомбинанте контра ла Гепатитис "B" "Хебер Биотек", Гавана, Куба. Эти антигены примешали к алюминий-гидроксидному гелю в количестве 2 мг на дозу и инокулировали BaI /с мышам с весом тела 20 г тремя дозами по 0,5 мл каждая.
Испытывали различные варианты:
1. Р64к 20 мкг (Р20).
1. Р64к 20 мкг (Р20).
2. HB9Ag 20 мкг (H20).
3. Р64к 10 мкг + HBsAg 10 мкг (P10:H10).
4. Р64к 15 мкг + HBsAg 5 мкг (P15:H5).
5. Плацебо (Al/OH/3).
Через семь дней после иммунизации первыми дозами применяли вторую дозу. Третью дозу давали через 14 дней после второй. Семью днями позже брали кровь и отделяли сыворотку у каждого иммунизированного животного. Титры антител против Р64к протеина измеряли твердофазным ELISA с использованием Р64к в количестве 5 мг/мл для покрытия полистирольной чашки. Титры антител против HBsAg определяли посредством коммерческой ELISA (Органон Текника, Бокстел). Фиг. 5 показывает динамику реакции антител против протеина Р64к с использованием сыворотки, разведенной до 1/10 000. В реакцию против Р64к не вмешивался другой антиген. Фиг. 6 показывает титры против HBsAg после каждой дозы. Титры против этого белка не уменьшались в присутствии Р64к в препарате. Высокие титры получены против обоих антигенов в том же самом вакцинном препарате.
Пример 10.
Была создана компьютерная программа для поиска и обнаружения гомологий между Р64к и другими белками (EMBL - Европейская лаборатория молекулярной биологии - Дата-Бейс, т.е. информационный фонд EMBL). В результате поиска было обнаружено, что имеется гомология одного сегмента последовательно Р64к с сегментами последовательности N. gonorrhoeae. Было установлено, что эта последовательность является характеризующей как у N.gonorrhoeae, так и у N. Meningitidis (F.F. Correia, S. Jnouye и M. Jnouye, 1988, J. Biol. Chem. 263, N 25. 12194-12198).
Другая область с высокой гомологией была найдена у двух белков Пируват-Дегидрогеназного комплекса от штамма E.coli K:12:
а) ацетилтрансферазы от E.coli и белка Р64к внешней мембраны N.meningitidis.
а) ацетилтрансферазы от E.coli и белка Р64к внешней мембраны N.meningitidis.
Гомология существует между сегментом, включающий 100 аминокислот, повторяющимся в начале аминокислотной последовательности Ацетилтрансферазы ("Липоил-домен", включая "Липоил-связывающий сайт") (P.E. Stephens и др., 1983, Eur. J. Biochem 133, 481-489) и областью, расположенной в первых III аминокислотах Р64к (см. II в конце текста описания).
б) Липоамид-дегидрогеназа от E.coli и протеин Р64к внешней мембраны N. meningitidis.
Гомология существует между Липоамид-дегидрогеназой от E.coli (этот белок имеет 473 аминокислоты, P. E. Stephens и др., 1983, Eur, J. Biochem, 133, 481-489) и протеином Р64к, особенно в сегменте (см. III в конце текста), который представляет почти весь протеин, за исключением области с гомологией с "Липоил-доменом" Ацетилтрансферазы (см. III в конце описания), где: (-1-): Аденин-связывающий сайт (ГАД); (-2-): окислительно-восстановительная активная дисульфидная область; (-3): активный сайт гистидина.
Депонированные штаммы:
Клон E. coli HB101, содержащий плазмиду pM3 (pUC 18-плазмида, содержащая 4,1 кб ДНК-фрагмент N. meningitidis, штамма B:4:P1.15, клонированный между EcOR I и Hind III сайтами) был депонирован в августе 1991 в Баарне (Нидерланды), в Центральном Бюро культур грибков (CBS) и получил депозитарный номер CBS 4,8,5.91.
Клон E. coli HB101, содержащий плазмиду pM3 (pUC 18-плазмида, содержащая 4,1 кб ДНК-фрагмент N. meningitidis, штамма B:4:P1.15, клонированный между EcOR I и Hind III сайтами) был депонирован в августе 1991 в Баарне (Нидерланды), в Центральном Бюро культур грибков (CBS) и получил депозитарный номер CBS 4,8,5.91.
Список последовательностей.
Последовательность: N 1 (см. в конце текста).
Тип последовательности: нуклеотиды с соответствующими аминокислотами.
Длина последовательности: 1830 пар оснований (бр).
Количество нитей: одна.
Топология: линейная.
Тип молекулы: геномная ДНК.
Исходный организм-источник: N. meningitidis группы B.
Непосредственный экспертиментальный источник: штамм B:4:P.1:15, выделенный на Кубе.
Признаки: от 1 до 1830 бр - зрелый протеин.
Свойства: ген, кодирующий протеин Р64к из внешней мембраны N.meningitides.
Последовательность: N 2
Тип последовательности: нуклеотиды.
Тип последовательности: нуклеотиды.
Длина последовательности: 15 оснований
ATGCTAGATA AAAGA (15).
ATGCTAGATA AAAGA (15).
Последовательность: N 3
Тип последовательности: аминокислоты.
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 25 аминокислот.
Тип молекулы: N-терминал последовательности протеина Р64к из внешней мембраны
Последовательность: N 4
Тип последовательности: нуклеотиды.
Последовательность: N 4
Тип последовательности: нуклеотиды.
Длина последовательности: 12 оснований
CTAGATAAAA GA (12)
Последовательность: N 5
Тип последовательности: нуклеотиды.
CTAGATAAAA GA (12)
Последовательность: N 5
Тип последовательности: нуклеотиды.
Длина последовательности: 8 оснований
TCTTTTAT (8)
Последовательность: N 6 (см. в конце текста).
TCTTTTAT (8)
Последовательность: N 6 (см. в конце текста).
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 221 аминокислота.
Тип молекулы: последовательность, включающая вариабельные облаcти протеина Р64к.
Последовательность: N 7
Тип последовательности: аминокислоты.
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 6 аминокислот.
Тип молекулы: последовательность, соответствующая сайту лигирования между N-терминалом Р64к и Р1.15
Последовательность: N 8
Тип последовательности: нуклеотиды.
Последовательность: N 8
Тип последовательности: нуклеотиды.
Длина последовательности: 19 оснований.
Тип молекулы: последовательность, соответствующая лигированию N-терминала гена M-6 и гена P1.15
Последовательность: N 10
Тип последовательности: 18 оснований.
Последовательность: N 10
Тип последовательности: 18 оснований.
Тип молекулы: последовательность, соответствующая лигированию C-терминала от гена M-6 и гена P1.15
GAAGCCAACG CGATAGAA (18)
Последовательность: N 11 (см. в конце текста).
GAAGCCAACG CGATAGAA (18)
Последовательность: N 11 (см. в конце текста).
Тип последовательности: III аминокислот
Тип молекулы: Р64к N-терминал, включающий область гомологии с "липоил-связывающим сайтом" от Ацетилтрансферазы E.coli.
Тип молекулы: Р64к N-терминал, включающий область гомологии с "липоил-связывающим сайтом" от Ацетилтрансферазы E.coli.
Последовательность: N 12 (см. в конце текста).
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 112 аминокислот.
Тип молекулы: "липоил-связывающий сайт" от E.coli Ацетилтрансферазы.
Последовательность: N 13 (см. в конце текста).
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 481 аминокислота.
Тип молекулы: фрагмент Р64к, включающий область гомологии с липоамид-дегидрогеназой от E.coli.
Последовательность: N 14 (см. в конце текста).
Тип последовательности: аминокислоты.
Длина последовательности: 472 аминокислоты.
Тип молекулы: сегмент E.coli липоамид-дегидрогеназы с гомологией с протеином Р64к.
Claims (11)
1. Фрагмент ДНК, кодирующий белок внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15 мол.м. 64 кДа, полученный путем молекулярного клонирования фрагментов геномной ДНК Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15, содержащий 1850 п.н. и имеющий структуру, соответствующую последовательности нуклеотидов 1 - 1797 SEQ ID N 01, представленной на фиг.1.
2. Белок внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15 мол. м. 64 кДа, полученный при культивировании штамма Escherichia coli НВМ 64, трансформированного рекомбинантной плазмидой pM6, который вызывает при иммунизации образование специфических бактерицидных антител и имеет структуру, соответствующую последовательности аминокислот 1 - 599, представленной на фиг.1.
3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pM-6, используемая для экспрессии белка внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15 мол.м. 64 кДа в клетках штамма Escherichia coli НВМ 64, содержащая: E coR I - Hind III - фрагмент векторной плазмиды pv C18; фрагмент ДНК под контролем триптофанового промотора, соответствующий последовательности белка внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15, имеющий собственный терминатор транскрипции.
4. Штамм бактерий Escherichia coli НВМ 64, содержащий рекомбинантную плазмиду pM-6, используемый для получения белка внешней мембраны Neisseria meningitidis мол.м. 64 кДа.
5. Способ получения белка внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15, заключающийся в том, что рекомбинантной плазмидной ДНК pM-6, содержащей фрагмент ДНК, соответствующий последовательности белка внешней мембраны Neisseria meningitidis штамма B : 4 : P1.15, трансформируют клетки Escherichia coli НВ101 с получением штамма E.coli НВМ 64, который культивируют до обеспечения заданного уровня экспрессии указанного белка и выделяют целевой продукт из культуральной среды.
6. Вакционная композиция, содержащая антиген из белка внешней мембраны бактерий Neisseria meningitidis и приемлемые добавки, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит белок внешней мембраны Neisseria meningitidis мол.м. 64 кДа по п.2.
7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что белок с мол.м. 64 кДа дополнительно соединен с другим иммуногенным белком.
8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что белок с мол.м. 64 кДа дополнительно соединен с белком внешней мембраны P1.15 Neisseria meningitidis.
9. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что белок с мол.м. 64 кДа дополнительно соединен с поверхностным антигеном вируса гепатита B (Hbs Ag).
10. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что белок с мол.м. 64 кДа дополнительно соединен с небелковым антигеном.
11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что белок с мол.м. 64 кДа дополнительно соединен с полисахаридом H.influenzal.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU90145A CU22302A1 (es) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales |
| CU145/90 | 1990-09-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2132383C1 true RU2132383C1 (ru) | 1999-06-27 |
Family
ID=5459451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5001752A RU2132383C1 (ru) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS ШТАММА В:4:Р1:15, БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pМ-6, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НВМ 64, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5286484A (ru) |
| EP (1) | EP0474313B1 (ru) |
| JP (1) | JP3253327B2 (ru) |
| AR (1) | AR245778A1 (ru) |
| AT (1) | ATE152175T1 (ru) |
| AU (1) | AU657487B2 (ru) |
| CA (1) | CA2050749C (ru) |
| CU (1) | CU22302A1 (ru) |
| DE (1) | DE69125769T2 (ru) |
| ES (1) | ES2103295T3 (ru) |
| FI (1) | FI103511B (ru) |
| GR (1) | GR3024127T3 (ru) |
| IL (1) | IL99401A (ru) |
| NO (1) | NO913524D0 (ru) |
| RU (1) | RU2132383C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2299906C2 (ru) * | 2000-02-28 | 2007-05-27 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс С.Р.Л. | Гетерологичная экспрессия белков neisseria |
| RU2325184C2 (ru) * | 2002-08-30 | 2008-05-27 | Чирон Срл | Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий |
| RU2379052C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2010-01-20 | Чирон С.Р.Л. | Вакцинация менингококковыми конъюгатами |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7118757B1 (en) * | 1988-12-19 | 2006-10-10 | Wyeth Holdings Corporation | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| AT402367B (de) * | 1990-10-11 | 1997-04-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische zubereitung auf basis von lys-plasminogen |
| US5439808A (en) * | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| US5798260A (en) * | 1994-06-24 | 1998-08-25 | Children's Hospital And Medical Center | Escherichia coli O157:H7 epithelial adhesin |
| US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
| US6287574B1 (en) | 1995-03-17 | 2001-09-11 | Biochem Pharma Inc. | Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis |
| US5747287A (en) * | 1995-04-28 | 1998-05-05 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| CU22559A1 (es) * | 1996-01-17 | 1999-05-03 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión |
| DE69738525T2 (de) * | 1996-09-04 | 2009-02-19 | Takara Bio Inc., Otsu | Pilz-antigene und verfahren zu deren herstellung |
| CN1224708C (zh) * | 1998-01-14 | 2005-10-26 | 启龙股份公司 | 脑膜炎奈瑟氏球菌抗原 |
| CN1245512C (zh) * | 1998-04-29 | 2006-03-15 | 惠氏控股有限公司 | 含重组菌毛蛋白的抗淋病奈瑟氏球茵或脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗 |
| MX343744B (es) * | 1998-05-01 | 2016-11-22 | J Craig Venter Inst Inc | Antigenos de neisseria meningitidis y composiciones que los contienen. |
| US6693186B2 (en) * | 1998-09-01 | 2004-02-17 | Antex Biologics Inc | Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof |
| US6756493B1 (en) * | 1998-09-01 | 2004-06-29 | Antex Biologics, Inc. | Nucleic acid sequence and uses thereof |
| EP1144998A3 (en) * | 1998-10-09 | 2002-08-07 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
| CA2347849C (en) * | 1998-10-22 | 2013-06-25 | The University Of Montana | Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof |
| DE69839740D1 (de) | 1998-10-22 | 2008-08-28 | Univ Montana | Vakzine enthaltend Omp85 Proteine von Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis |
| EP1535928B1 (en) * | 1998-10-22 | 2008-07-16 | The University of Montana | Vaccine compositions comprising Omp85 proteins of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis |
| US6610306B2 (en) | 1998-10-22 | 2003-08-26 | The University Of Montana | OMP85 protein of neisseria meningitidis, compositions containing the same and methods of use thereof |
| WO2001081422A1 (en) * | 2000-04-20 | 2001-11-01 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Secretory tyrosine phosphatases from mycobacteria |
| CU23077A1 (es) * | 2000-12-06 | 2005-08-17 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal que contiene factor de crecimiento transformante (tgf-alfa). su uso en la terapia de enfermedades malignas |
| CU23245A1 (es) | 2001-07-16 | 2007-10-17 | Inst De Medicina Tropical Pedr | CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS |
| GB0121591D0 (en) | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
| US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
| US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| DE60336555D1 (de) | 2002-06-21 | 2011-05-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Pegylierte glykoformen von faktor vii |
| ES2575014T3 (es) * | 2002-08-02 | 2016-06-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Composiciones de vacuna contra Neisseria que comprenden una combinación de antígenos |
| MXPA05003863A (es) * | 2002-10-11 | 2005-09-08 | Chiron Srl | Vacunas polipeptidicas para amplia proteccion contra lineas hipervirulentas de meningococos. |
| EP1582217A1 (en) * | 2002-11-14 | 2005-10-05 | Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros | Method of obtaining conjugate vaccines and vaccine compositions containing same |
| NZ542094A (en) | 2003-03-14 | 2008-12-24 | Neose Technologies Inc | Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains |
| EP1613261A4 (en) | 2003-04-09 | 2011-01-26 | Novo Nordisk As | INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| CA2552892C (en) | 2004-01-08 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
| EP1771066A2 (en) | 2004-07-13 | 2007-04-11 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1 |
| WO2006031811A2 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
| SI2586456T1 (sl) | 2004-10-29 | 2016-05-31 | Ratiopharm Gmbh | Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF) |
| CU23297A1 (es) | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| US9029331B2 (en) | 2005-01-10 | 2015-05-12 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| CU23578A1 (es) | 2005-09-16 | 2010-09-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Proteína de la cápsida del virus dengue inductora de respuesta protectora y composición vacunal |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| JP2009544327A (ja) | 2006-07-21 | 2009-12-17 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化 |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| CU23630A1 (es) | 2006-10-30 | 2011-02-24 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae |
| EA017770B1 (ru) | 2007-04-03 | 2013-03-29 | Биодженерикс Аг | Способы лечения с использованием гликопэгилированного g-csf |
| EP2170919B8 (en) | 2007-06-12 | 2016-01-20 | ratiopharm GmbH | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
| JP5619630B2 (ja) | 2008-02-27 | 2014-11-05 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 結合型第ｖｉｉｉ因子分子 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0301992B1 (en) * | 1987-07-30 | 1995-05-24 | Centro Nacional De Biopreparados | Vaccine against group B Neisseria meningitidis, gammaglobulin and transfer factor |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4459286A (en) * | 1983-01-31 | 1984-07-10 | Merck & Co., Inc. | Coupled H. influenzae type B vaccine |
-
1990
- 1990-09-07 CU CU90145A patent/CU22302A1/es unknown
-
1991
- 1991-09-03 FI FI914129A patent/FI103511B/fi active
- 1991-09-04 IL IL9940191A patent/IL99401A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-05 CA CA002050749A patent/CA2050749C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-05 US US07/754,918 patent/US5286484A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-05 AU AU83683/91A patent/AU657487B2/en not_active Ceased
- 1991-09-06 ES ES91202291T patent/ES2103295T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-06 EP EP91202291A patent/EP0474313B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-06 NO NO913524A patent/NO913524D0/no unknown
- 1991-09-06 AT AT91202291T patent/ATE152175T1/de active
- 1991-09-06 DE DE69125769T patent/DE69125769T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-06 AR AR91320611A patent/AR245778A1/es active
- 1991-09-06 RU SU5001752A patent/RU2132383C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-09-07 JP JP25587291A patent/JP3253327B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-07-16 GR GR970401777T patent/GR3024127T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0301992B1 (en) * | 1987-07-30 | 1995-05-24 | Centro Nacional De Biopreparados | Vaccine against group B Neisseria meningitidis, gammaglobulin and transfer factor |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2299906C2 (ru) * | 2000-02-28 | 2007-05-27 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс С.Р.Л. | Гетерологичная экспрессия белков neisseria |
| RU2304617C2 (ru) * | 2000-02-28 | 2007-08-20 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс С.Р.Л. | Гибридная экспрессия белков neisseria |
| RU2325184C2 (ru) * | 2002-08-30 | 2008-05-27 | Чирон Срл | Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий |
| RU2379052C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2010-01-20 | Чирон С.Р.Л. | Вакцинация менингококковыми конъюгатами |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI103511B1 (fi) | 1999-07-15 |
| EP0474313A3 (en) | 1993-02-24 |
| DE69125769T2 (de) | 1997-11-27 |
| EP0474313B1 (en) | 1997-04-23 |
| JP3253327B2 (ja) | 2002-02-04 |
| US5286484A (en) | 1994-02-15 |
| IL99401A0 (en) | 1992-08-18 |
| FI914129A7 (fi) | 1992-03-08 |
| FI914129A0 (fi) | 1991-09-03 |
| IL99401A (en) | 2003-12-10 |
| ES2103295T3 (es) | 1997-09-16 |
| JPH06169779A (ja) | 1994-06-21 |
| FI103511B (fi) | 1999-07-15 |
| AU8368391A (en) | 1992-03-12 |
| CA2050749C (en) | 2002-07-02 |
| AU657487B2 (en) | 1995-03-16 |
| NO913524D0 (no) | 1991-09-06 |
| DE69125769D1 (de) | 1997-05-28 |
| GR3024127T3 (en) | 1997-10-31 |
| CU22302A1 (es) | 1995-01-31 |
| AR245778A1 (es) | 1994-02-28 |
| CA2050749A1 (en) | 1992-03-08 |
| ATE152175T1 (de) | 1997-05-15 |
| EP0474313A2 (en) | 1992-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2132383C1 (ru) | ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS ШТАММА В:4:Р1:15, БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pМ-6, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НВМ 64, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ | |
| KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
| US7786286B2 (en) | Proteinase K resistant surface protein of Neisseria meningitidis | |
| JP3215109B2 (ja) | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 | |
| FI113009B (fi) | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta | |
| US6558677B2 (en) | Vaccine against gram negative bacteria | |
| CN108774628B (zh) | 合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途 | |
| Tagawa et al. | Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus | |
| JPH11501003A (ja) | ノンタイプアブルヘモフィルスの高分子量表面タンパク | |
| CN101448522A (zh) | 包含蛋白质nmb0938的药物组合物 | |
| CN100549027C (zh) | Nmb0928蛋白及其在药物制剂中的用途 | |
| IL111102A (en) | Proteins, peptides and oligopeptides of BRANHAMELLA CATARRHALIS extra-membrane protein, nucleic acids encoding them, method of preparation and use as vaccine formulations | |
| KR20080108576A (ko) | Ｎｍｂ0606 단백질을 포함하는 약학적 조성물 | |
| NO304188B1 (no) | Nukleotidsekvens som koder for et ytre membranprotein fra Neisseria meningitt | |
| CN100387718C (zh) | 抗蛋白酶k降解的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白 | |
| AU762316B2 (en) | Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis | |
| CN101443037A (zh) | 包含蛋白质nma0939的药物组合物 | |
| EP0815234B1 (en) | Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis | |
| HK1014991B (en) | Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090907 |
|
| REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: MM4A Effective date: 20090907 |