RU2130187C1

RU2130187C1 - Method of assay of antirabies virus-neutralizing antibodies

Info

Publication number: RU2130187C1
Application number: RU97116427A
Authority: RU
Inventors: И.Ф. Вишняков; В.В. Недосеков; К.Н. Груздев; В.М. Балышев; В.И. Жестерев; Т.Ф. Горшкова
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1997-10-01
Publication date: 1999-05-10

Abstract

FIELD: veterinary virology. SUBSTANCE: method involves assay of antirabies virus-neutralizing antibodies by method of inhibition of fluorescence foci. Analyzed serum is mixed with an equal volume of attenuated strain of rabies virus TC-80 and incubated at 37 C for 90 min. Then reaction mixture is added to transplanted culture of saiga kidney cells, cell culture is fixed and antirabies immunoglobulins labeled with FITZ are applied. Reaction is estimated by inhibition of fluorescence foci in cell culture. Invention provides safety, sensitive and rapid method of assay of antirabies virus-neutralizing antibodies in vitro which shows correlation with titration results in experiments in white mice. EFFECT: improved method of assay, decreased cost. 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу определения антирабических вируснейтрализующих антител методом ингибиции фокусов флуоресценции и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и в ветеринарных лабораториях. The invention relates to the field of veterinary virology, and in particular to a method for determining anti-rabies virus-neutralizing antibodies by inhibition of fluorescence foci and can be used in research institutes and in veterinary laboratories.

Известны, более 15 методов in vivo и in vitro для определения антирабических вируснейтрализующих антител (Blancou J.J., Sureau P., 1985; Ботвинкин А. Д., 1988; Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., 1991; Сологуб Т.В., Никишин И.В., 1992; и др.). Наиболее распространенными до сих пор являются различные модификации реакции нейтрализации in vivo - на мышах, разработанной Webster & Dawson (1935 г.). Однако, несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного теста, он имеет некоторые недостатки: использование инфекционного вируса "CVS", проведение опыта в виварных помещениях в течение 15-21 суток, относительно дорогая стоимость животных. В связи с этим комитет экспертов ВОЗ по бешенству с 1973 г., в своих докладах подчеркивает важность разработки тестов in vitro (СТД ВОЗ: 523, 709, 824). Для относительной оценки уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке животных применяется иммуносорбентный метод - ELISA (Guillemin P., Tixier G. (1981), Nicholson Karl G. (1982), Smith J. S. (1984), Karamany R.M. (1988), Ботвинкин А.Д. (1988), Lyng Jorn; Bentzon M. Weis; Fitzgerald E.A. (1989), Сазанова Э.Я. (1991)). Этот тест может выполняться в практических условиях, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Однако, кроме вируснейтрализующих антител, этот метод определяет также различные антитела других типов, при этом отсутствует их корреляция с тестом нейтрализации in vivo на мышах. Прототипом настоящего изобретения являются методы ингибиции фокусов флуоресценции, выполненные на различных культурах клеток с разными штаммами вируса бешенства J. G. Debbie et al., (1972) - использовали штамм ERA в культуре клеток ВНК-21; Smith J. S., Yager P. A., Baer G.M., (1973) - использовали штамм "CVS-11", культивируемый в культуре клеток BHK-21/S13; Louie R. E. et al., (1975), Zalan E., Wilson С., Pukitis D., (1979) - штамм "CVS-27" в ВНК. Аналогичные штаммы и культуры клеток применяли при постановке реакции Seroka D. Labunska E. (1981); Kurz J. et al. (1986); Lyng J., Bentzon M. , Fitzgerald E.A. (1989) и др. Zavadova J., Svrcek S., Madar M., Durove A. (1996) использовали штамм Внуково 32/107, культивируемый в ВНК-21/с13. Принцип постановки реакций у перечисленных авторов идентичен и заключается в том, что разведения образцов сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37^oC в течение 90 минут, после этого реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37^oC, затем культуру клеток фиксируют, наносят антирабические иммуноглобулины конъюгированные с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и проводят учет реакции. Однако авторы оценивают полученные результаты как не полностью коррелирующие с результатами реакции нейтрализации на мышах. В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет. Целью предполагаемого изобретения является разработка способа определения антирабических вируснейтрализующих антител in vitro, имеющего корреляцию с результатами титрования на белых мышах.More than 15 in vivo and in vitro methods are known for determining anti-rabies virus-neutralizing antibodies (Blancou JJ, Sureau P., 1985; Botvinkin A.D., 1988; Sazanova E.Ya., Kuznetsova SV, 1991; Sologub T. V., Nikishin I.V., 1992; and others.). The most common so far are various modifications of the in vivo neutralization reaction - in mice, developed by Webster & Dawson (1935). However, despite the advantages of this test, proven by time and practice, it has some disadvantages: the use of the CVS infectious virus, conducting an experiment in vivar rooms for 15-21 days, and the relatively expensive cost of animals. In this regard, the WHO expert committee on rabies since 1973, in its reports, emphasizes the importance of developing in vitro tests (WHO STD: 523, 709, 824). For a relative assessment of the level of virus-neutralizing antibodies in the serum of animals, the immunosorbent method is used - ELISA (Guillemin P., Tixier G. (1981), Nicholson Karl G. (1982), Smith JS (1984), Karamany RM (1988), Botvinkin A.D. . (1988), Lyng Jorn; Bentzon M. Weis; Fitzgerald EA (1989), Sazanova E.Ya. (1991). This test can be performed in a practical environment and results can be obtained within hours. However, in addition to virus-neutralizing antibodies, this method also determines various antibodies of other types, while there is no correlation with the in vivo neutralization test in mice. The prototype of the present invention are methods of inhibiting fluorescence foci performed on different cell cultures with different strains of rabies virus JG Debbie et al., (1972) - used the ERA strain in the cell culture of BHK-21; Smith JS, Yager PA, Baer GM, (1973) - used the strain "CVS-11", cultivated in a cell culture of BHK-21 / S13; Louie RE et al., (1975), Zalan E., Wilson C., Pukitis D., (1979) - strain "CVS-27" in the KSS. Similar strains and cell cultures were used in the formulation of the reaction of Seroka D. Labunska E. (1981); Kurz J. et al. (1986); Lyng J., Bentzon M., Fitzgerald EA (1989) et al. Zavadova J., Svrcek S., Madar M., Durove A. (1996) used the Vnukovo strain 32/107 cultured in BHK-21 / c13. The principle of the reaction for the above authors is identical and consists in the fact that dilutions of serum samples are mixed with an equal volume of the virus and incubated at 37 ^° C for 90 minutes, after which the reaction mixture is introduced into the corresponding cell culture and incubated for 72 hours at 37 ^° C. then the cell culture is fixed, anti-rabies immunoglobulins conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC conjugate) are applied and the reaction is recorded. However, the authors evaluate the results as not fully correlating with the results of the neutralization reaction in mice. In the domestic literature there are no materials and results of such studies. The aim of the alleged invention is to develop a method for determining anti-rabies virus-neutralizing antibodies in vitro, which correlates with the results of titration in white mice.

Поставленная цель достигается тем, что используют вакцинный штамм ТС-80, адаптированный к культуре клеток почки сайги (ПС), на которой проводят инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 72 часов, с последующим определением титра вируснейтрализующих антител по ингибиции фокусов флуоресценции
Примеры конкретного выполнения
Пример 1
Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, подвергали инактивации в условиях водяной бани при 56^oC в течение 30 мин. Затем готовили двухкратные разведения сывороток на среде Игла MEM в объеме 100 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равными объемами культурального вируса бешенства шт. ТС-80, содержащим 100 - 1000 БОЕ₅₀. Приготовленную таким образом смесь вирус-сыворотка инкубировали в течение 90 мин при 37^oC в CO₂-инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа и вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную на полистироловых пластинах, предварительно удалив из лунок культуральную среду.This goal is achieved by using the vaccine strain TS-80, adapted to saiga kidney cell culture (PS), on which the virus-serum reaction mixture is incubated for 72 hours, followed by determination of the titer of neutralizing antibodies to inhibit fluorescence foci
Case Studies
Example 1
Test sera obtained from vaccinated animals were inactivated in a water bath at 56 ^° C. for 30 minutes. Then, two-fold dilutions of sera were prepared on Eagle MEM medium in a volume of 100 μl. Diluted sera are mixed with equal volumes of rabies culture virus pc. TS-80 containing 100 - 1000 PFU ₅₀ . The virus-serum mixture prepared in this way was incubated for 90 min at 37 ^° C in a CO ₂ incubator containing 5% carbon dioxide and introduced into a one-day intact PS cell culture grown on polystyrene plates, having previously removed the culture medium from the wells.

Пластины помещали в CO₂-инкубатор на 72 часа. Контролями служили: лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) сывороткой и отрицательной (нормальной), а также интакной культурой клеток.Plates were placed in a CO ₂ incubator for 72 hours. The controls were: wells with the used dose of the virus, a mixture of the virus with obviously positive (specific) serum and negative (normal), as well as intact cell culture.

По окончании срока инкубации монослой клеток подвергали фиксации 12,5% раствором формалина в течение 15 минут при -4^oC.At the end of the incubation period, the cell monolayer was fixed with a 12.5% formalin solution for 15 minutes at -4 ^o C.

После фиксации панели отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с 0,05% содержанием Твина-20 и наносили конъюгат антирабических иммуноглобулинов с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Пластины с ФИТЦ-конъюгатом инкубировали в течение 30 мин, после чего панели трижды подвергались отмывке от несвязавшегося конъюгата в ЗФР с 0,05% содержанием Твина-20. After fixing, the panels were washed with buffered saline (PBS) with a 0.05% Tween-20 content and a conjugate of rabies immunoglobulins with fluorescein isothiocyanate (FITC) was applied. FITC conjugate plates were incubated for 30 min, after which the panels were washed three times from an unbound conjugate in PBS with 0.05% Tween-20 content.

Тест-препараты просматривали на инвертированном люминесцентном микроскопе Olympus IMT-2. Отсутствие флуоресцирующих фокусов (при условии наличия последних в препаратах с контролем вируса и нормальной сывороткой) указывает на наличие в тест-материале специфических антирабических вируснейтрализующих антител. Титром антител в испытуемом материале является предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление флуоресцирующих фокусов, т.е. нейтрализация вируса. Test preparations were viewed on an Olympus IMT-2 inverted luminescent microscope. The absence of fluorescent foci (provided the latter are present in preparations with virus control and normal serum) indicates the presence of specific anti-rabies virus-neutralizing antibodies in the test material. The antibody titer in the test material is the limiting dilution of serum at which complete suppression of fluorescent foci is observed, i.e. neutralization of the virus.

Пример 2
Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично методике, описанной выше. По истечении срока инкубирования образцы сывороток вносили в лунки полистироловых панелей. После этого в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 500 тыс. клеток/см³ с расчетом по 50 тыс. клеток на лунку, после чего пластины помещают в CO₂-инкубатор на 72 часа. Последующие этапы реакции проводились согласно предыдущей методике. При проведении работы результаты обоих примеров были аналогичны.Example 2
The preparation of the test sera followed by the preparation of the virus-serum mixture was carried out similarly to the procedure described above. At the end of the incubation period, serum samples were added to the wells of polystyrene panels. After that, 100 μl of a suspension of PS cell culture at a concentration of 500 thousand cells / cm ^{3 was} calculated in each well of the panels with a calculation of 50 thousand cells per well, after which the plates were placed in a CO ₂ incubator for 72 hours. Subsequent reaction steps were carried out according to the previous procedure. During the work, the results of both examples were similar.

Результаты исследования сыворотки крови реакцией нейтрализации на мышах и предлагаемым нами способом в культуре клеток ПС были идентичны. В таблице 1 приведены результаты, полученные в комиссионном опыте при определении вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, лошадей и собак. The results of the study of blood serum by the neutralization reaction in mice and the method we proposed in the culture of PS cells were identical. Table 1 shows the results obtained in the commission experience in determining virus-neutralizing antibodies in the blood serum of cattle, horses and dogs.

Тест ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток ПС прост в исполнении, безопасен в виду использования вакцинного штамма ТС-80, обладает большей производительностью, экономически эффективен и может быть использован при определении напряженности иммунитета у вакцинированных животных. The fluorescence focus inhibition test in PS cell culture is simple to perform, safe due to the use of the TS-80 vaccine strain, has greater productivity, is cost-effective, and can be used to determine immunity in vaccinated animals.

Полученные результаты исследования сывороток крови показывают, что предлагаемый способ позволяет определять титр вируснейтрализующих антител in vitro (в культуре клеток ПС), соответствующий результатам реакции нейтрализации на мышах. Данный способ прост в исполнении, экспрессен, безопасен, высокочувствителен и в силу полного соответствия с результатами реакции нейтрализации in vivo может полностью заменить тест нейтрализации на мышах. The obtained results of the study of blood serum show that the proposed method allows to determine the titer of virus-neutralizing antibodies in vitro (in the culture of PS cells), corresponding to the results of the neutralization reaction in mice. This method is simple to execute, expressed, safe, highly sensitive and, due to its full compliance with the results of the in vivo neutralization reaction, can completely replace the neutralization test in mice.

Claims

A method for determining anti-rabies virus-neutralizing antibodies, including the interaction of the components of the reaction mixture of the virus with specific serum, evaluated by the inhibition of fluorescence foci in a cell culture, characterized in that they use an attenuated strain of rabies virus TC-80 adapted to a highly transplantable saiga kidney cell culture that is highly sensitive to this strain.