RU2126051C1 - Method of determining antilysozyme activity of microorganisms - Google Patents
Method of determining antilysozyme activity of microorganisms Download PDFInfo
- Publication number
- RU2126051C1 RU2126051C1 RU97101325A RU97101325A RU2126051C1 RU 2126051 C1 RU2126051 C1 RU 2126051C1 RU 97101325 A RU97101325 A RU 97101325A RU 97101325 A RU97101325 A RU 97101325A RU 2126051 C1 RU2126051 C1 RU 2126051C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- culture
- lysozyme
- optical density
- suspension
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims abstract description 45
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims abstract description 45
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 claims description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 8
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 abstract description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 239000011369 resultant mixture Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N pyocyanin Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CC=CC2=O YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000034970 Heterotopic Ossification Diseases 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 241000097929 Porphyria Species 0.000 description 1
- 208000010642 Porphyrias Diseases 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004555 blood preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для прогнозирования реконвалесцентного бактерионосительства, микробиологического мониторинга антропогенного загрязнения окружающей среды, диагностики дисбиозов, изучения влияния лекарственных препаратов и биологически активных веществ на персистентные характеристики микроорганизмов. The invention relates to microbiology and can be used to predict convalescence bacteriocarriers, microbiological monitoring of anthropogenic environmental pollution, diagnose dysbiosis, study the effect of drugs and biologically active substances on the persistent characteristics of microorganisms.
Известен электрооптический способ определения антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов путем измерения степени гидратации бактериальных клеток после взаимодействия с лизоцимом [1]. Known electro-optical method for determining the antilysocyme activity (ALA) of microorganisms by measuring the degree of hydration of bacterial cells after interaction with lysozyme [1].
Однако указанный способ трудоемок, требует наличия специальной регистрирующей аппаратуры. Также существенным недостатком указанного способа является то, что возможна регистрация лишь начальных этапов взаимодействия лизоцима с бактериальной клеткой. However, this method is time-consuming, requires special recording equipment. Another significant disadvantage of this method is that it is possible to register only the initial stages of the interaction of lysozyme with a bacterial cell.
Известен способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов, при котором исследуемые штаммы бактерий засевают на плотную питательную среду с определенной концентрацией лизоцима в агаре и после инкубации в течение 24 ч выросшие исследуемые культуры убивают парами хлороформа в течение 30 мин. Затем на колонии исследуемых культур вторым слоем заливают питательную агаровую среду с 0,5 мл 20-миллиардной взвеси предварительно убитой хлороформом тест-культуры Micrococcus lysodeikticus (штамм N 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Эффект инактивации лизоцима определяют по наличию зоны мутности вокруг антилизоцимактивных штаммов. Количественную оценку антилизоцимной активности исследуемого штамма производят по максимальной концентрации лизоцима в среде, которая инактивируется данным штаммом [2]. There is a method for determining the antilysocyme activity of microorganisms, in which the studied bacterial strains are seeded on a solid nutrient medium with a certain concentration of lysozyme in agar and after incubation for 24 hours, the grown test cultures are killed in chloroform in pairs for 30 minutes. Then a nutrient agar medium with 0.5 ml of a 20 billion suspension of Micrococcus lysodeikticus test culture previously killed with chloroform (strain N 2665 GISK named after L.A. Tarasevich) was poured onto the colony of the studied cultures with a second layer. The effect of inactivation of lysozyme is determined by the presence of a zone of turbidity around the antilysocinative strains. A quantitative assessment of the antilysocyme activity of the studied strain is made according to the maximum concentration of lysozyme in the medium, which is inactivated by this strain [2].
Однако, учитывая отсутствие четкости зон лизиса бактерий [3] и нередкое окрашивание геля бактериальными продуктами (например, пиоцианином Pseudomonas aeruginosa), визуальная оценка АЛА часто затруднена. Недостатками метода являются также низкая чувствительность и длительное время, требующееся для определения антилизоцимной активности. However, given the lack of clarity of bacterial lysis zones [3] and the frequent gel staining with bacterial products (eg, Pseudomonas aeruginosa pyocyanin), visual assessment of ALA is often difficult. The disadvantages of the method are also low sensitivity and the long time required to determine antilysocyme activity.
Наиболее близким к заявленному способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ определения антилизоцимной активности бактерий, согласно которому исследуемую культуру выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант, смешивают его с лизоцимом и суспензией тест-культуры Micrococcus lysodeikticus, инкубируют смесь, параллельно готовят две контрольные пробы, антилизоцимную активность культуральной жидкости исследуемого штамма рассчитывают по оптической плотности опытной смеси и обоих контролей, затем показатель антилизоцимной активности исследуемой культуры сравнивают с показателями антилизоцимной активности референс-штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК N 151 и определяют концентрацию лизоцима, которую способна инактивировать исследуемая культура [4]. The closest to the claimed method according to the purpose and combination of essential features is a method for determining the antilysocyme activity of bacteria, according to which the test culture is grown in a liquid nutrient medium, the supernatant is separated, mixed with lysozyme and a suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture, the mixture is incubated, two control are prepared in parallel samples, antilysocyme activity of the culture fluid of the studied strain is calculated by the optical density of the test mixture and both controls, then showing Atelier of antilysocyme activity of the studied culture is compared with indicators of antilysocyme activity of the reference strain Klebsiella pneumoniae GISK N 151 and determine the concentration of lysozyme, which is able to inactivate the studied culture [4].
Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков. Известно, что при длительном хранении штаммов бактерий уровень АЛА последних может изменяться [5]. В связи с этим необходим постоянный контроль АЛА референс-штамма либо культивирование его на средах с антибиотиками, что делает данный способ длительным и трудоемким. В известном способе проводится однократное измерение оптической плотности в опыте и контроле, что ведет к большой погрешности при количественной оценке АЛА микроорганизмов. Также в способе-прототипе используется дополнительный контроль с супернатантом штамма, показывающий полное подавление лизоцима, что делает указанный способ трудоемким. В известном способе выращивание культур микроорганизмов осуществляют на минимальной питательной среде. Однако известно, что минимальные среды пригодны для культивирования отдельных групп бактерий. Кроме того, при совместном культивировании плазмидных и бесплазмидных штаммов в лимитированных по субстрату условиях происходит вытеснение плазмидсодержащих клеток из смешанной популяции [6]. Последнее обстоятельство представляется существенным, принимая во внимание клональную гетерогенность популяций по антилизоцимному признаку [7, 8] и плазмидный характер антилизоцимной активности [9]. However, this method has several significant disadvantages. It is known that with prolonged storage of bacterial strains, the level of ALA of the latter can change [5]. In this regard, constant monitoring of the ALA reference strain or culturing it on media with antibiotics is required, which makes this method long and laborious. In the known method, a single measurement of optical density is carried out in the experiment and control, which leads to a large error in the quantitative assessment of ALA of microorganisms. Also in the prototype method, additional control is used with the supernatant of the strain, showing complete suppression of lysozyme, which makes this method laborious. In the known method, the cultivation of cultures of microorganisms is carried out on a minimum nutrient medium. However, it is known that minimal media are suitable for the cultivation of certain groups of bacteria. In addition, when plasmid and plasmid-free strains are co-cultured under substrate-limited conditions, plasmid-containing cells are displaced from the mixed population [6]. The latter circumstance seems to be significant, taking into account the clonal heterogeneity of populations by antilysocyme trait [7, 8] and the plasmid nature of antilysocyme activity [9].
Заявляемый способ решает задачу ускорения и упрощения определения антилизоцимной активности микроорганизмов и повышения точности количественной оценки АЛА. The inventive method solves the problem of accelerating and simplifying the determination of antilysocyme activity of microorganisms and improving the accuracy of the quantitative assessment of ALA.
Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения антилизоцимной активности микроорганизмов исследуемую культуру микроорганизма выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант и смешивают его с лизоцимом, параллельно готовят контроль, опытную пробу и контроль смешивают с суспензией тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и определяют антилизоцимную активность по оптической плотности полученных смесей, при этом в качестве контроля используют смесь питательного бульона с лизоцимом, осуществляют инкубирование супернатанта с лизоцимом, вводят инкубированную смесь в предварительно обработанную трилоном Б тест-культуру и проводят измерение оптической плотности опытной пробы и контроля через 30 и 150 с, затем рассчитывают антилизоцимную активность по формуле
где A - антилизоцимная активность, мкг инактивированного лизоцима /мл супернатанта • ед. оптической плотности бульонной культуры;
V1- объем раствора лизоцима исходной концентрации;
V2- объем супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;
C - исходная концентрация лизоцима;
Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;
ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с;
ΔDк - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с.To solve this problem, in the inventive method for determining the antilysocyme activity of microorganisms, the studied microorganism culture is grown in a liquid nutrient medium, the supernatant is separated and mixed with lysozyme, a control is prepared in parallel, an experimental test and control are mixed with a suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture and optical antilysocyme activity is determined by optical the density of the mixtures obtained, while a control uses a mixture of nutrient broth with lysozyme, incubate supernat ing with lysozyme incubation mixture is introduced into pretreated Trilon B test culture, and measure the optical density of test sample and control at 30 and 150 s, then antilysozyme activity was calculated by the formula
where A - antilysocyme activity, mcg of inactivated lysozyme / ml supernatant • units optical density of the broth culture;
V 1 is the volume of lysozyme solution in the initial concentration;
V 2 - the volume of the supernatant of the broth culture of the studied strain;
C is the initial concentration of lysozyme;
Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;
ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 s;
ΔD to - change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 s.
Новым в заявленном способе является то, что
- в качестве контроля используют смесь питательного бульона с лизоцимом;
- суспензию тест-культуры Micrococcus lysodeikticus предварительно обрабатывают трилоном Б;
- осуществляют инкубирование супернатанта с лизоцимом с последующим введением инкубированной смеси в обработанную трилоном Б тест-культуру;
- измерение оптической плотности опытной пробы и контроля проводят через 30 и 150 с;
- рассчитывают антилизоцимную активность микроорганизмов по формуле:
где A - антилизоцимная активность, мкг инактивированного лизоцима /мл супернатанта • ед. оптической плотности бульонной культуры;
V1 - объем раствора лизоцима исходной концентрации;
V2 - объем супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;
C - исходная концентрация лизоцима;
Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;
ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с;
ΔDк - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с.New in the claimed method is that
- as a control using a mixture of nutrient broth with lysozyme;
- a suspension of the test culture Micrococcus lysodeikticus is pre-treated with Trilon B;
- carry out the incubation of the supernatant with lysozyme, followed by the introduction of the incubated mixture into the test culture treated with Trilon B;
- measurement of the optical density of the experimental sample and control is carried out after 30 and 150 s;
- calculate the antilysocyme activity of microorganisms according to the formula:
where A - antilysocyme activity, mcg of inactivated lysozyme / ml supernatant • units optical density of the broth culture;
V 1 is the volume of lysozyme solution in the initial concentration;
V 2 - the volume of the supernatant of the broth culture of the studied strain;
C is the initial concentration of lysozyme;
Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;
ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 s;
ΔD to - change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 s.
Известно использование в качестве субстрата для лизоцима бактериальных клеток Micrococcus lysodeikticus [3,10] . Авторами экспериментально установлено повышение чувствительности микрококка к литическому действию фермента под влиянием трилона Б. It is known to use Micrococcus lysodeikticus bacterial cells as a substrate for lysozyme [3,10]. The authors experimentally established an increase in the sensitivity of micrococcus to the lytic action of the enzyme under the influence of Trilon B.
Трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты; C10H14O8N2Na2 • 2H2O, М 372.3; ГОСТ 10652-73) - белый кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде и щелочах; pH водного раствора около 6. Известно использование трилона Б в текстильной, кожевенной, пищевой, бумажной, лакокрасочной промышленности, в производстве металлов, каучука, в цветной кинематографии, для очистки нефти, воска, жиров, для разделения редкоземельных элементов, для смягчения воды, очистки и получения ряда элементов, соединений и смесей, в качестве ингибитора окислительных процессов и др. [11]. В медицине трилон Б используют при гиперкальциемии, при патологической оссификации скелета, суставов, мышц, почек, стенок вен, при склеродермии, порфирии, в качестве антикоагулянта при консервировании крови [12].Trilon B (disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid; C 10 H 14 O 8 N 2 Na 2 • 2H 2 O, M 372.3; GOST 10652-73) - a white crystalline powder, highly soluble in water and alkalis; The pH of the aqueous solution is about 6. It is known to use Trilon B in the textile, leather, food, paper, paint and varnish industries, in the production of metals, rubber, in color cinematography, for refining oil, wax, fats, for separating rare earth elements, for softening water, and for cleaning and obtaining a number of elements, compounds and mixtures, as an inhibitor of oxidative processes, etc. [11]. In medicine, Trilon B is used for hypercalcemia, for pathological ossification of the skeleton, joints, muscles, kidneys, and vein walls, for scleroderma, porphyria, and as an anticoagulant for blood preservation [12].
Использование трилона Б для обработки взвеси микрококка с целью повышения его чувствительности к литическому действию лизоцима в источниках патентной и научно-технической литературы не обнаружено. The use of Trilon B for processing suspension of micrococcus in order to increase its sensitivity to the lytic effect of lysozyme was not found in the sources of patent and scientific literature.
Проводился следующий эксперимент. The following experiment was conducted.
В опытной серии суточную агаровую культуру М. lysodeikticus убивали парами хлороформа, смывали, дважды отмывали фосфатным буфером с трилоном Б и один раз фосфатным буфером без трилона Б. В контроле взвесь микрококка трижды отмывали фосфатным буфером без трилона Б. Оптическую плотность суспензий тест-культур доводили до 0,300. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм). Ход анализа: к 2,0 мл суспензии субстрата добавляли 0,5 мл раствора лизоцима (20 мкг/мл) и измеряли оптическую плотность реакционной смеси через 30 и 150 с против 0,2 М фосфатного буфера ( ΔD ). В опытной серии изменение оптической плотности составило 0.080±0.001 против 0.069±0.005 в контроле (P<0.05). In the experimental series, the daily agar culture of M. lysodeikticus was killed with chloroform vapors, washed, washed twice with phosphate buffer with Trilon B and once with phosphate buffer without Trilon B. In the control, the micrococcus suspension was washed three times with phosphate buffer without Trilon B. The optical density of the suspensions of the test cultures was adjusted up to 0,300. The measurements were carried out on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm). Analysis progress: 0.5 ml of lysozyme solution (20 μg / ml) was added to 2.0 ml of the suspension of the substrate, and the optical density of the reaction mixture was measured after 30 and 150 s against 0.2 M phosphate buffer (ΔD). In the experimental series, the change in optical density was 0.080 ± 0.001 versus 0.069 ± 0.005 in the control (P <0.05).
Таким образом, за счет повышения чувствительности тест-культуры М. lysodeikticus к литическому действию лизоцима увеличивается точность количественного определения АЛА, что обеспечивает повышение достоверности определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Thus, by increasing the sensitivity of the test culture of M. lysodeikticus to the lytic effect of lysozyme, the accuracy of quantitative determination of ALA increases, which increases the reliability of determining the antilysocyme activity of microorganisms.
Известно измерение оптической плотности суспензии тест-культуры M. lysodeikticus, лизоцима и супернатанта исследуемой культуры для определения АЛА микроорганизмов. Однако в известном способе-прототипе [4] проводится однократное измерение оптической плотности в опыте и контроле, что ведет к большой погрешности при количественной оценке АЛА микроорганизмов. It is known to measure the optical density of a suspension of a test culture of M. lysodeikticus, lysozyme and the supernatant of the test culture to determine the ALA of microorganisms. However, in the known prototype method [4], a single measurement of the optical density in the experiment and control is carried out, which leads to a large error in the quantitative assessment of ALA of microorganisms.
В заявляемом способе проводится двукратное измерение оптической плотности исследуемой смеси через 30 и 150 с, что позволяет более точно судить о литической активности остаточной концентрации лизоцима по степени лизиса суспензии тест-культуры. In the inventive method, a two-fold measurement of the optical density of the test mixture is carried out after 30 and 150 s, which makes it possible to more accurately judge the lytic activity of the residual lysozyme concentration by the degree of lysis of the test culture suspension.
Интервал времени, через который проводится измерение оптической плотности исследуемой смеси, авторами установлен экспериментально. Проведенные авторами исследования показали, что измерение оптической плотности реакционной смеси является наиболее целесообразным через 30 и 150 с ( см.табл.1). Измерение оптической плотности реакционной смеси ранее чем через 30 с после начала гидролиза субстрата невозможно вследствие необходимости настройки спектрофотометра. Длительное измерение изменения оптической плотности реакционной смеси нецелесообразно, поскольку скорость ферментативной реакции максимальна лишь в начальный период, а потом, по мере истощения субстрата либо фермента, при различных концентрациях компонентов скорость реакции выравнивается [13]. The time interval through which the optical density of the studied mixture is measured is determined experimentally by the authors. The studies conducted by the authors showed that measuring the optical density of the reaction mixture is most appropriate after 30 and 150 s (see table 1). Measurement of the optical density of the reaction mixture earlier than 30 s after the start of hydrolysis of the substrate is impossible due to the need to adjust the spectrophotometer. A long-term measurement of the change in the optical density of the reaction mixture is impractical, since the rate of the enzymatic reaction is maximum only in the initial period, and then, as the substrate or enzyme is depleted, at different concentrations of the components, the reaction rate is leveled [13].
Как видно из табл. 1, измерение оптической плотности реакционной смеси через более длительный интервал чем 150 с после начала лизиса не выявляет значительных различий изменения оптической плотности в опыте и контроле, поэтому авторы предлагают, как наиболее оптимальный интервал определения изменения оптической плотности реакционной смеси через 30 - 150 с. As can be seen from the table. 1, the measurement of the optical density of the reaction mixture over a longer interval than 150 s after the start of lysis does not reveal significant differences in the change in optical density in the experiment and control, therefore, the authors propose as the most optimal interval for determining the change in the optical density of the reaction mixture after 30 - 150 s.
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Бактериальную массу исследуемых культур стандартной бактериологической петлей засевают в 3 мл жидкой питательной среды (для каждого вида микроорганизмов используют соответствующий тип питательной среды) и культивируют при 37oC 24-96 ч. На спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) измеряют оптическую плотность бульонной культуры против питательного бульона (Y). Супернатант отделяют от бактериальных клеток центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин.The bacterial mass of the studied cultures is seeded with a standard bacteriological loop in 3 ml of liquid nutrient medium (the appropriate type of nutrient medium is used for each type of microorganism) and cultivated at 37 ° C for 24-96 hours. Optical density is measured on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm) broth culture versus nutrient broth (Y). The supernatant is separated from the bacterial cells by centrifugation for 15 minutes at 3000 rpm.
Для определения антилизоцимной активности микроорганизмов в качестве тест-культуры используют суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм N 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Выросшие бактериальные клетки тест-штамма убивают хлороформом в течение 60 мин, смывают, фильтруют через крупнопористый фильтр, дважды отмывают 1/15 М фосфатным буфером (калия фосфата однозамещенного [KH2PO4 - 7.72 г, натрия фосфата двузамещенного [Na2HPO4 • 2H2O - 1.78 г, воды дистиллированной - до 1000 мл; pH 6.0-6.2) с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилоном Б) (0.372 г/л буфера) и один раз 1/15 М фосфатным буфером, после чего оптическую плотность суспензии микрококка доводят до 0.300.To determine the antilysocyme activity of microorganisms, the daily agar culture of Micrococcus lysodeikticus (strain N 2665 GISK named after L.A. Tarasevich) is used as a test culture. The grown bacterial cells of the test strain are killed with chloroform for 60 minutes, washed off, filtered through a large-pore filter, washed twice with 1/15 M phosphate buffer (potassium phosphate monosubstituted [KH 2 PO 4 - 7.72 g, sodium phosphate disubstituted [Na 2 HPO 4 • 2H 2 O - 1.78 g, distilled water - up to 1000 ml; pH 6.0-6.2) with disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (Trilon B) (0.372 g / l of buffer) and once with 1/15 M phosphate buffer, after which the optical density of the suspension micrococcus brought to 0.300.
На 1/15 М фосфатном буфере готовят раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. On 1/15 M phosphate buffer, a lysozyme solution with a concentration of 20 μg / ml is prepared.
Супернатант исследуемых культур микроорганизмов объемом 0.9 мл смешивают с 0.1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубируют 60-120 мин при 37oC. Затем 0.5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавляют к 2.0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измеряют оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) против 1/15 М фосфатного буфера.The supernatant of the investigated cultures of microorganisms with a volume of 0.9 ml is mixed with 0.1 ml of the prepared lysozyme solution and incubated for 60-120 min at 37 o C. Then, 0.5 ml of the mixture of supernatant and lysozyme is added to 2.0 ml of the suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture and the absorbance of the mixture is measured after 30 and 150 s on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm) against 1/15 M phosphate buffer.
В контрольной пробе смесь питательного бульона с лизоцимом в соотношении 9: 1 также добавляют к 2.0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измеряют оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) против 1/15 М фосфатного буфера. In the control sample, a 9: 1 mixture of nutrient broth with lysozyme was also added to 2.0 ml of a suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture and the absorbance of the mixture was measured after 30 and 150 s on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm) versus 1/15 M phosphate buffer.
Антилизоцимную активность исследуемой культуры рассчитывают по формуле:
где A - антилизоцимная активность, мкг инактивированного лизоцима /мл супернатанта • ед. оптической плотности бульонной культуры;
V1- объем (0.1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);
V2- объем (0.9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;
C - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);
Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;
ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с [D0(30'') - D0(150'')];
ΔDк - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с [Dк(30'') - Dк(150'')].The antilysocyme activity of the studied culture is calculated by the formula:
where A - antilysocyme activity, mcg of inactivated lysozyme / ml supernatant • units optical density of the broth culture;
V 1 is the volume (0.1 ml) of the lysozyme solution at the initial concentration (20 μg / ml);
V 2 - volume (0.9 ml) of the supernatant of the broth culture of the studied strain;
C is the initial concentration of lysozyme (20 μg / ml);
Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;
ΔD 0 - change in the optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 s [D 0 (30 ") - D 0 (150")];
ΔD k - change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 s [D to (30 ") - D to (150")].
Пример 1. У штамма Stapbylococcus haemolyticus, выделенного из гнойного содержимого при дренировании абсцесса была определена антилизоцимная активность. Example 1. In a strain of Stapbylococcus haemolyticus isolated from purulent contents during drainage of an abscess, antilysocyme activity was determined.
Для этого бактериальную массу исследуемой культуры стандартной бактериологической петлей посеяли в 3 мл мясо-пептонного бульона и культивировали при 37oC 24 ч. На спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) измерили оптическую плотность бульонной культуры против питательного бульона (Y): она составила 1.821. Супернатант отделили от бактериальных клеток центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин.For this, the bacterial mass of the culture under study was seeded with a standard bacteriological loop in 3 ml of meat-peptone broth and cultured at 37 ° C for 24 hours. The optical density of the broth culture against nutrient broth (Y) was measured on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm): it amounted to 1.821. The supernatant was separated from the bacterial cells by centrifugation for 15 min at 3000 rpm.
В качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм N 2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Выросшие бактериальные клетки тест-культуры убили хлороформом в течение 60 мин, смыли, профильтровали через крупнопористый фильтр, дважды отмыли 1/15 М фосфатным буфером (калия фосфата однозамещенного [KH2PO4] - 7.72 г, натрия фосфата двузамещенного [Na2HPO4•2H2O] - 1.78 г, воды дистиллированной - до 1000 мл; pH 6.0-6.2) с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилоном Б) (0.372 г/л буфера) и один раз 1/15 М фосфатным буфером, после чего оптическую плотность суспензии микрококка довели до 0.300.The daily culture agar Micrococcus lysodeikticus (strain N 2665 GISK named after L.A. Tarasevich) was used as a test culture. The grown bacterial cells of the test culture were killed with chloroform for 60 minutes, washed, filtered through a large-pore filter, washed twice with 1/15 M phosphate buffer (potassium phosphate monosubstituted [KH 2 PO 4 ] - 7.72 g, sodium phosphate disubstituted [Na 2 HPO 4 • 2H 2 O] - 1.78 g, distilled water - up to 1000 ml; pH 6.0-6.2) with disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (Trilon B) (0.372 g / l of buffer) and once with 1/15 M phosphate buffer, followed by optical the micrococcus suspension density was adjusted to 0.300.
На 1/15 М фосфатном буфере приготовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. A solution of lysozyme with a concentration of 20 μg / ml was prepared on 1/15 M phosphate buffer.
Супернатант исследуемых культур микроорганизмов объемом 0.9 мл смешали с 0.1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60 мин при 37oC. Затем 0.5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавили к 2.0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измерили оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) против 1/15 М фосфатного буфера.The supernatant of the studied cultures of microorganisms with a volume of 0.9 ml was mixed with 0.1 ml of the prepared lysozyme solution and incubated for 60 min at 37 ° C. Then, 0.5 ml of the mixture of the supernatant and lysozyme was added to 2.0 ml of the suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture and the absorbance of the mixture was measured after 30 and 150 s on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm) against 1/15 M phosphate buffer.
В контрольной пробе смесь питательного бульона с лизоцимом в соотношении 9: 1 также добавили к 2.0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измерили оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) против 1/15 М фосфатного буфера. In the control sample, a 9: 1 mixture of nutrient broth with lysozyme was also added to 2.0 ml of a suspension of the Micrococcus lysodeikticus test culture and the absorbance of the mixture was measured after 30 and 150 s on an SF-46 spectrophotometer (wavelength 540 nm) versus 1/15 M phosphate buffer.
Были получены следующие значения оптической плотности:
Dо(30'') = 0.266. Dо(150'') = 0.252. ΔD0 = 0.266 - 0.252 = 0.014; Dк(30'') = 0.263, Dк(150'') = 0.221, ΔDк = 0.263 - 0.221 = 0.042.The following absorbance values were obtained:
D about (30``) = 0.266. D about (150``) = 0.252. ΔD 0 = 0.266 - 0.252 = 0.014; D to (30``) = 0.263, D to (150 '') = 0.221, ΔD to = 0.263 - 0.221 = 0.042.
По степени лизиса суспензии тест-культуры рассчитали АЛА исследуемого штамма по формуле
мкг инактивированного лизоцима /мл супернатанта • ед. оптической плотности бульонной культуры.According to the degree of lysis of the suspension of the test culture, the ALA of the studied strain was calculated by the formula
μg inactivated lysozyme / ml supernatant • units. optical density of the broth culture.
Пример 2. Для сравнения точности определения антилизоцимной активности известным способом и заявляемым были отобраны штаммы микроорганизмов с одинаковыми значениями антилизоцимной активности, определенной способом-прототипом. Величина признака составляла 0.38. При определении у данных штаммов бактерий АЛА заявляемым способом были получены различные значения (табл.2). Это связано с тем, что в формуле расчета АЛА в заявляемом способе проводят пересчет на величину оптической плотности бульонной культуры, которая выражает количество биомассы тестируемого штамма. Так как известно, что количество метаболитов (в данном случае антилизоцимного фактора) находится в прямой зависимости от количества биомассы, которая в свою очередь определяется видом микроорганизма и составом питательной среды, заявляемый способ существенно повышает точность количественного определения АЛА. Example 2. To compare the accuracy of determination of antilysocyme activity in a known manner and the claimed strains of microorganisms were selected with the same values of antilysocyme activity determined by the prototype method. The value of the trait was 0.38. When determining these ALA bacteria strains by the claimed method, various values were obtained (Table 2). This is due to the fact that in the formula for calculating the ALA in the inventive method, they are converted to the optical density of the broth culture, which expresses the amount of biomass of the tested strain. Since it is known that the number of metabolites (in this case, the antilysocyme factor) is directly dependent on the amount of biomass, which in turn is determined by the type of microorganism and the composition of the nutrient medium, the claimed method significantly increases the accuracy of the quantitative determination of ALA.
Пример 3. У 52 штаммов микроорганизмов из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург) была определена антилизоцимная активность с использованием заявляемого способа и способа-прототипа. Сравнительный анализ результатов определения АЛА микроорганизмов различными способами представлен в таблице 3. Example 3. In 52 strains of microorganisms from the collection of the Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Orenburg), antilysocyme activity was determined using the proposed method and the prototype method. A comparative analysis of the results of the determination of ALA of microorganisms in various ways is presented in table 3.
Как видно из таблицы, использование заявляемого способа позволило уменьшить количество измерений за счет того, что в заявляемом способе отсутствует контроль (используемый в способе-прототипе) с супернатантом штамма без лизоцима, показывающий полное подавление лизоцима. Для постановки этого контроля необходимо произвести количество измерений, равное количеству исследуемых штаммов, чтобы воспроизвести оптическую плотность каждого отдельного образца. Количество измерений во втором контроле в способе-прототипе равно числу измерений в заявляемом способе, поскольку в этом контроле культуральная жидкость заменена на стерильную питательную среду, используемую для выращивания микроорганизмов в обоих способах. As can be seen from the table, the use of the proposed method allowed to reduce the number of measurements due to the fact that in the claimed method there is no control (used in the prototype method) with the supernatant of the strain without lysozyme, showing complete suppression of lysozyme. To set this control, it is necessary to make the number of measurements equal to the number of strains studied in order to reproduce the optical density of each individual sample. The number of measurements in the second control in the prototype method is equal to the number of measurements in the claimed method, since in this control the culture fluid is replaced by a sterile nutrient medium used for growing microorganisms in both methods.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет ускорить, упростить и повысить точность количественного определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Thus, the proposed method allows you to speed up, simplify and improve the accuracy of the quantitative determination of antilysocyme activity of microorganisms.
Источники информации, в которых содержатся сведения об аналогах изобретения
1. Луда А.П., Сирота А. Н. Электрооптический метод выявления антилизоцимной активности микроорганизмов //Факторы естественного иммунитета. - Куйбышев, 1983.- С. 73-77.Sources of information that contain information about analogues of the invention
1. Luda A.P., Sirota A. N. Electro-optical method for detecting antilysocyme activity of microorganisms // Factors of natural immunity. - Kuibyshev, 1983.- S. 73-77.
2. Бухарин 0.В., Васильев Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов.- Томск: Изд-во Том. ун-та, 1985.- С. 177. 2. Bukharin 0.V., Vasiliev N.V., Usvyatsov B.Ya. Lysozyme of microorganisms. - Tomsk: Vol. Univ., 1985.- S. 177.
3. Каграманова К.А., Ермольева 3.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима //Антибиотики. - 1966.- Т. 11, N 10.- С. 917-919. 3. Kagramanova K.A., Ermolyeva 3.V. Comparative characteristics of methods for determining lysozyme activity // Antibiotics. - 1966.- T. 11, N 10.- S. 917-919.
4. Авторское свидетельство СССР N 1537689, МПК 5 C 12 N 15/00, C 12 Q 1/00, 23.01.90. (прототип)
5. Немцова Н. В. Питательная среда для хранения шигелл //Персистенция микроорганизмов.- Сб. научн. трудов. - Куйбышев: КМИ, 1987.- С. 68-71.4. Copyright certificate of the USSR N 1537689, IPC 5 C 12
5. Nemtsova N. V. Nutrient medium for storing shigella // Persistence of microorganisms.- Sat. scientific labor. - Kuibyshev: KMI, 1987.- S. 68-71.
6. Ермоленко 3. M., Литвинов В.В., Колесниченко И.Ф., Самойленко В. А. Сохранение плазмид в клетках кишечной палочки при периодическом и непрерывном культивировании //Журн. микробиол.- 1982.- N 4.- С. 64-68. 6. Ermolenko 3. M., Litvinov V.V., Kolesnichenko I.F., Samoilenko V.A. Preservation of plasmids in E. coli cells during periodic and continuous cultivation // Zh. microbiol. - 1982.- N 4.- S. 64-68.
7. Бухарин О.В., Борисов С.Д., Езепчук Ю.В. и др. Антилизоцимная активность менингококков //Журн. микробиол.- 1991.- N 7.- С. 17-20. 7. Bukharin O. V., Borisov S. D., Jezepchuk Yu.V. and other antilysocyme activity of meningococci // Journal. microbiol. - 1991.- N 7.- S. 17-20.
8. Бухарин О.В., Немцева Н.В., Валышев А.В. Популяционная характеристика факторов персистенции кишечных палочек, выделенных из различных экониш //Бюлл. экспер. биол. мед.- 1996.- N 9.- С. 356-358. 8. Bukharin OV, Nemtseva N.V., Valyshev A.V. Population characteristics of persistent Escherichia coli factors isolated from various econiches // Bull. an expert. biol. honey .- 1996.- N 9.- S. 356-358.
9. Соколов В. Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук.- Челябинск, 1989. 9. Sokolov V. Yu. The mechanism of antilysocyme activity of bacteria: Abstract. diss. ... cand. honey. Sciences. - Chelyabinsk, 1989.
10. Gorin G., Wang S. F., Papapavlou L. Assay of lysozyme by its lytic action on M. lysodeikticus cells //Anal. Blochem.- 1971.- Vol. 39, N 1.- P. 113-127. 10. Gorin G., Wang S. F., Papapavlou L. Assay of lysozyme by its lytic action on M. lysodeikticus cells // Anal. Blochem.- 1971.- Vol. 39, N 1.- P. 113-127.
11. Краткая химическая энциклопедия. Ред. кол. И.Л. Кнунянц (отв. ред.) и др. - M.: Советская энциклопедия.- Т. 2.- 1963.- С. 671. 11. Brief chemical encyclopedia. Ed. count I.L. Knunyants (ed.) And others .-- M .: Soviet Encyclopedia.- T. 2.- 1963.- S. 671.
12. Большая медицинская энциклопедия: [в 30-ти т. АМН СССР]. Гл. ред. Б. В. Петровский. - 3-е изд. - M.: Советская энциклопедия. - Т. 28.- 1986.- С. 371-372. 12. Big medical encyclopedia: [in 30 volumes of the USSR Academy of Medical Sciences]. Ch. ed. B.V. Petrovsky. - 3rd ed. - M .: Soviet Encyclopedia. - T. 28.- 1986.- S. 371-372.
13. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ.- М.: Мир, 1990.- С. 131-142. 13. Keleti T. Fundamentals of enzymatic kinetics: Per. from English.- M.: Mir, 1990.- S. 131-142.
Claims (1)
где A - антилизоцимная активность, мкг инактивированного лизоцима/мл супернатанта • ед. оптической плотности бульонной культуры;
V1 - объем раствора лизоцима исходной концентрации;
V2 - объем супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;
C - исходная концентрация лизоцима;
Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;
ΔDo - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с;
ΔDк - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с.The method for determining the antilysocyme activity of microorganisms, namely, that the studied microorganism culture is grown in a liquid nutrient medium, the supernatant is separated and mixed with lysozyme, a control is prepared in parallel, a test sample and a control are mixed with a suspension of the Micrococcus Lysodeikticus test culture and optical antilysocyme activity is determined by optical the density of the mixtures obtained, characterized in that as a control using a mixture of nutrient broth with lysozyme, incubate the supernatant with izotsimom administered mixture was incubated on the pretreated Trilon B test culture, and measure the optical density of test sample and control at 30 and 150 s, then antilysozyme activity was calculated by the formula
where A - antilysocyme activity, mcg of inactivated lysozyme / ml supernatant • units optical density of the broth culture;
V 1 is the volume of lysozyme solution in the initial concentration;
V 2 - the volume of the supernatant of the broth culture of the studied strain;
C is the initial concentration of lysozyme;
Y is the optical density of the broth culture of the studied strain, units optical density;
ΔD o the change in optical density of the suspension of the test culture in the experiment between 30 and 150 s;
ΔD to - change in optical density of the suspension of the test culture in the control between 30 and 150 s.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97101325A RU2126051C1 (en) | 1997-01-27 | 1997-01-27 | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97101325A RU2126051C1 (en) | 1997-01-27 | 1997-01-27 | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2126051C1 true RU2126051C1 (en) | 1999-02-10 |
| RU97101325A RU97101325A (en) | 1999-02-27 |
Family
ID=20189429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97101325A RU2126051C1 (en) | 1997-01-27 | 1997-01-27 | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2126051C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2452960C2 (en) * | 2011-05-03 | 2012-06-10 | Учреждение Российской академии наук Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Method for prediction of developing bacterial complication of staphylococcal aetiology following influenza |
| RU2567642C1 (en) * | 2014-10-15 | 2015-11-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of determination of antilysozymic activity of staphylococcus |
| RU2704423C1 (en) * | 2018-12-28 | 2019-10-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук | Bacterial strain bifidobacterium longum icis-505 - producer of biologically active substances possessing antipersistent activity with respect to opportunistic and pathogenic bacteria and yeast fungi |
| RU2786802C1 (en) * | 2022-06-30 | 2022-12-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining the activity of lysozyme in the oral fluid |
-
1997
- 1997-01-27 RU RU97101325A patent/RU2126051C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Бухарин О.В. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1984, N2, с. 27-28. Gorin G., Wang S.F., Papapavlou L. Assay of lysozyme by its lytic action of M. Lysodeikticus cells. Anal. Biochem., 1971 v. 39, N1, р.113-127. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2452960C2 (en) * | 2011-05-03 | 2012-06-10 | Учреждение Российской академии наук Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Method for prediction of developing bacterial complication of staphylococcal aetiology following influenza |
| RU2567642C1 (en) * | 2014-10-15 | 2015-11-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of determination of antilysozymic activity of staphylococcus |
| RU2704423C1 (en) * | 2018-12-28 | 2019-10-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук | Bacterial strain bifidobacterium longum icis-505 - producer of biologically active substances possessing antipersistent activity with respect to opportunistic and pathogenic bacteria and yeast fungi |
| RU2786802C1 (en) * | 2022-06-30 | 2022-12-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining the activity of lysozyme in the oral fluid |
| RU2809015C1 (en) * | 2023-09-11 | 2023-12-05 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Башкирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of differential diagnostics of oral cavity dysbiosis in patients with chronic biliary-dependent pancreatitis with different execretory activity |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6046021A (en) | Comparative phenotype analysis of two or more microorganisms using a plurality of substrates within a multiwell testing device | |
| IE60699B1 (en) | A test set and a process for the determination of antibiotics in milk and a novel streptococcus thermophilus strain to be used therein. | |
| Endo et al. | Phospholipid-requiring bacterial enzyme. II. Role of phospholipid in the uridine diphosphate galactose: lipopolysaccharide α-3-galactosyl transferase reaction | |
| RU2126051C1 (en) | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms | |
| Galindo et al. | Microbial sensor for penicillins using a recombinant strain of Escherichia coli | |
| Thornton et al. | STUDIES ON OXIDATION-REDUCTION IN MILK I. OXIDATION-REDUCTION POTENTIALS AND THE MECHANISM OF REDUCTION | |
| Ahlmann et al. | Continuous on-line monitoring of intracellular enzyme activity | |
| Cowan | Micromethod for the methyl red test | |
| Kemp | Microcalorimetric studies of tissue cells and bacteria | |
| Fowler et al. | Effects of Dimethylsulfoxide on the Lactose Operon in Escherichia coli | |
| RU2086652C1 (en) | Method of l-proline quantitative determination | |
| Schär et al. | Hyphomicrobium bacterial electrode for determination of monomethyl sulfate | |
| RU2823522C1 (en) | STRAIN OF RHODOCOCCUS FASCIANS VKM Ac-2996 IS BIORECEPTOR ELEMENT OF BIOSENSOR FOR DETERMINING BIOCHEMICAL OXYGEN CONSUMPTION | |
| SU1537689A1 (en) | Strain of klebsiella pneumoniae bacteria used as reference strain in determining antilysozyme activity of bacteria, and method of determining antilysozyme activity of bacteria | |
| RU2823520C1 (en) | Arthrobacter halodurans strain vkm ac-2997 is a bioreceptor element of biosensor for determining biochemical oxygen consumption | |
| RU2830250C1 (en) | Method for stimulating lipolytic activity of lactococcus lactis bacteria | |
| Backelin et al. | A new test method for demonstrating B-lactamase activity among mycobacteria and nocardia | |
| SU1335569A1 (en) | Method of determining antibiotic activity of substances | |
| JP2890128B2 (en) | Yeast viable cell count method | |
| RU2835603C1 (en) | Lyophilized biopreparation of yeast for rapid monitoring of degree of water contamination with organic substances | |
| Trufanov et al. | A RESAZURIN REDUCTION-BASED ASSAY FOR EVALUATION OF METABOLIC ACTIVITY OF PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AUREOFACIENS | |
| Clark et al. | THE DIFFERENTIATION OF BACTERIA OF THE COLON-AEROGENES FAMILY [with DISCUSSION] | |
| SU1231077A1 (en) | Method of estimating concentration of bacteria in suspension | |
| JP3142953B2 (en) | Rapid detection of microorganisms | |
| SU1693058A1 (en) | Method of determination of dna activity of microorganisms |