RU2125606C1 - Способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения - Google Patents
Способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2125606C1 RU2125606C1 RU94045821A RU94045821A RU2125606C1 RU 2125606 C1 RU2125606 C1 RU 2125606C1 RU 94045821 A RU94045821 A RU 94045821A RU 94045821 A RU94045821 A RU 94045821A RU 2125606 C1 RU2125606 C1 RU 2125606C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plant
- plants
- synthetase
- virus
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 40
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 35
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 83
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 23
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 14
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 9
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 7
- 241000710179 Potato virus S Species 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000834 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 3
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 101150113223 pppA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000710175 Carlavirus Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000710007 Potexvirus Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Time Recorders, Dirve Recorders, Access Control (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения резистентного к вирусу трансгенного растения. Генетически сконструированную ДНК-последовательность, кодирующую полипептид, обеспечивающий устойчивость растения к вирусу 2,5 А-синтетазы, вводят в клетки растений. Регенеранты, экспрессирующие полипептид, отбирают. Способ позволяет получить растение, резистентное к многим вирусам. 3 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к способу получения трансгенного растения, проявляющего резистентность к многим вирусам, который содержит генетически сконструированную ДНК-последовательность, содержащую фрагмент, кодирующий полипептид, имеющий активность 2,5A-синтетазы.
В литературе описано несколько методов конструирования вирус-резистентных растений. Наиболее близким к способу по изобретению является способ получения резистентных к вирусу трансгенных растений путем экспрессии белка оболочки соответствующего растительного вируса в указанных растениях (Beachy et aL, Annu. Rev. Phytopathol., 28 (1990), 451-474).
Существенная вирусная резистентность к нескольким растительным вирусам продемонстрирована путем экспрессии специфической вирусной антисмысловой РНК в трансгенных растениях (Cuozzo et aL, Bio/Technology, 6 (1988), 549- 557; Hemenway et al. , EMBO J.7 (1988), 1273-1280). Вирусная антисмысловая РНК проявляет свою функцию либо гибридизацией со специфическими последовательностями вирусной ДНК или РНК, тем самым блокируя последующие реакции, которые важны для вирусного размножения, либо активностью рибозима, которая приводит к специфическому расщеплению вирусной РНК после гибридизации с указанной вирусной РНК. Основным недостатком вышеупомянутых методов конструирования вирус-резистентных трансгенных растений является то, что указанные трансгенные растения резистентны только к одному вирусу или специфической группе вирусов.
Путь метаболизма 2,5A-олигоаденилата является частью системы антивирусного ответа, индуцируемой интерферонами в клетках млекопитающих (Lengyel, Annu. Rev. Biochem., 51 (1982), 251-282). Некоторые компоненты пути метаболизма 2,5A обнаружены также в организмах (помимо млекопитающих) птиц, рептилий и амфибий, насекомых, в дрожжах и даже в бактериях (Stark et al., Nature, 278 (1979), 471-473; Cayley et al" Biochem. Biophys. Res. Corn., 108 (1982), 1243-1250; Laurence et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, (1984), 2322-15 2326).
В растениях антивирусный фактор (АВФ), производство которого стимулировано вирусным заражением, частично очищен, и его ген, как оказалось, гомологичен человеческому интерферону; Sela et al., in: Plant Resistance To Viruses: Ciba Symp., 133 (1987), 109-119. Обработка вирусом табачной мозаики (ВТМ) зараженных протопластов табака с помощью человеческого интерферона привела к ингибированию ВТМ-репликации; Sela et al., Meth. in Enzymology, 119 (1986), 744-752. Кроме того, продемонстрировано, что 2,5A может ингибировать ВТМ-репликацию в растениях табака; Devash et al., J. Biol. Chem., 259 (1984), 3482-3486. ДНК-последовательности, гомологичные человеческой 2,5A-синтетазе, также обнаружены в геномной ДНК табака; Sela et а1.. (1987), (см. выше).
Однако в литературе о растениях отсутствуют сведения о 2,5A-зависимой РНКазе, которая является частью пути метаболизма 2,5A-олигоаденилата у млекопитающих. Это позволяет сделать вывод, что 2,5A не ингибирует вирусную инфекцию в растениях посредством 2,5A-зависимой эндонуклеазы; Devash et al., Biochemistry, 24 (1985), 593-599.
Кроме того, описано, что интерферон, продуцируемый в трансгенных растениях, не ингибирует вирусное размножение; De Zoeten et al. Virology, 172 (1989), 213-222.
В основном, известный уровень техники не позволяет сделать вывод о том, что путь метаболизма 2,5А-олигоаденилата может быть использован в качестве основы для конструирования трансгенных растений, проявляющих резистентность к многим вирусам.
Таким образом, технической задачей настоящего изобретения является создание трансгенного растения, проявляющего резистентность к многим вирусам, с использованием частей пути метаболизма 2,5А-олигоаденилата.
Согласно настоящему изобретению предлагается способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения, включающий генетическое конструирование ДНК-последовательности, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, с активностью 2,5A-синтетазы, обеспечивающий устойчивость к вирусу, введение полученной ДНК в клетки растений, получение регенерантов и отбор регенерантов, экспрессирующих указанный полипептид. Отличием от указанного известного способа (Ann. Rev. Phytopatholog., 28. (1990), 451-490) является то, что конструируют ДНК-последовательность, содержащую фрагмент, кодирующий полипептид с активностью 2,5А-синтетазы.
Обычно генетически сконструированную ДНК последовательность предварительно встраивают в вектор под управлением промотора, позволяющего осуществить ее экспрессию в данном трансгенном растении.
Как правило, вектор представляет собой pHТТ2-5+ (DSM N 6815). (Вектор депонирован в соответствии с требованиями Будапештского договора в "Deutsche Sammiung fur Microorganismen (DSM)" под депозитарным номером DSM 6815).
Предпочтительно введение ДНК в клетки растений осуществляют путем трансфекции с использованием системы Agrobacterium.
Полученное трансгенное растение, проявляющее резистентность к многим вирусам, содержит генетически сконструированную ДНК-последовательность, кодирующую по крайней мере один полипептид, имеющий активность 2,5A-синтетазы, причем указанный полипептид после экспрессии способен активировать эндонуклеазу, вызывающую разрушение вирусной РНК.
Термин "резистентность ко многим вирусам" относится к трансгенным растениям, которые в основном резистентны к вариетету вирусных групп, таких как потекc-, карла- и тобамовирусы.
Термин "генетически сконструированная ДНК-последовательность" относится к ДНК- последовательности, которой манипулируют методами генной инженерии, такими как методы рекомбинантных ДНК.
Термин "полипептид, имеющий активность 2,5-синтетазы" относится к любому полипептиду, который способен ферментативно синтезировать 5'-дефосфорилированные или фосфорилированные 2,5-олигонуклеотиды с тремя или более остатками аденозина, например, 2,5A3, который является тримером аденилата, связанного 2',5'-фосфодиэфирными связями, и дефосфорилирован у своего 5'-окончания.
Термин "эндонуклеаза, вызывающая разрушение вирусной РНК" относится к гетерологичной или гомологичной эндонуклеазе, которая способна разрушать вирусную РНК путем ферментативного расщепления. Указанная эндонуклеаза активируется с помощью 2,5A, который синтезируется полипептидом, имеющим активность 2,5A-синтетазы.
Предпочтительно, чтобы указанная ДНК-последовательность или по крайней мере одна часть указанной ДНК-последовательности была гомологична или гетерологична указанному трансгенному растению.
Возможно также, чтобы указанная ДНК-последовательность являлась химерной ДНК-последовательностью.
Как правило, указанная ДНК-последовательность дополнительно кодирует по крайней мере один селектируемый маркер и/или по крайней мере один дополнительный полипептид, такой, как указанная эндонуклеаза.
Обычно ДНК-последовательность, кодирующую указанный полипептид, получают из млекопитающего гена, растительного гена или гена микроорганизма, либо она является синтетическим геном.
В частности, ДНК-последовательность, кодирующая указанный полипептид, представляет собой ген крысиной 2,5A-синтетазы (см. фиг. 1).
При этом предпочтительно, чтобы указанная эндонуклеаза представляла собой растительную РНКазу L.
Экспрессию указанного полипептида осуществляют под управлением индуцируемого или конститутивного промотора, функционирующего в растениях и позволяющего осуществлять индуцированную и/или повышенную экспрессию указанного полипептида. Примерами таких промоторов являются промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, промотор рисового актина, промотор rbc S от различных видов, промотор TR2' Agrobacter, промотор гена фазеолина или промотор NOS. В предпочтительном варианте настоящего изобретения экспрессию 2,5A-синтезирующего полипептида осуществляют под управлением промотора 35S вируса мозаики цветной капусты.
Трансгенное растение является однодольным или двудольным растением. В частности, трансгенное растение, например, представляет собой табак, рис, пшеницу, ячмень, кукурузу, томат, огурец, сою, сладкий картофель, виноград, капусту, сахарную свеклу, хлопчатник, чай, подсолнечник, землянику, розу, хризантему, перец сладкий или картофель.
Из полученного трансгенного растения, проявляющего резистентность к многим вирусам, можно получить размножающийся материал.
Термин "размножающийся материал" относится к интактным растениям, либо дифференцированной или недифференцированной растительной ткани, такой как корень, стебель, лист, каллюс, протопласт, суспензионные культуры и семена.
Предлагаемый согласно изобретению способ предусматривает введение генетически сконструированной ДНК-последовательности, кодирующей по крайней мере один полипептид, имеющий активность 2,5A-синтетазы, в генетический материал соответствующего растения.
Термин "генетический материал" относится к нуклеарному геному растительной клетки, органоидному геному растительной клетки или экстрахромосомной форме.
Термин "введение" относится к методу, который способен ввести (интродуцировать) указанную генетически сконструированную ДНК-последовательность в указанный генетический материал растительной клетки. Предпочтительными примерами указанного метода являются Agrobacterium-опосредованный перенос, растительным вирусом опосредованный перенос, микроинъекция, микропрожектильная бомбардировка, электропорация, ПЭГ-опосредованная трансформация и трансформация растительных протопластов со стабильными векторами на основе вирусов.
Ниже приводится описание представленных фигур.
Фиг. 1. Конструирование плазмиды pHТТ2-5A+. Фрагмент EcoRI. содержащий кДНК гена крысиной 2,5A-синтетазы, отрезают от плазмиды pSK2-5A+, липкие концы заполняют и полученный фрагмент лигируют в сайт BamHI вектора pHТТ202 с использованием линкеров BamHI. Это позволяет получить вектор pHТТ2-5A+, содержащий ген крысиной 2,5A-синтетазы под управлением промотора CaMV 35S.
Фиг. 2. Назерн-блоттинг целой РНК из трансгенных табачных растений, трансформированных с геном 2,5A-синтетазы. 10 мкг целой РНК на каждую дорожку зондируют с помощью [32P]-меченой кДНК 2,5A-синтетазы. Дорожки 1-5 являются линиями трансгенного табака, а дорожка 6 является кДНК крысиной 2,5A-синтетазы.
Фиг. 3. Эффект различно фосфорилированных форм 1 мкМ тримеров 2,5A (A) и тетрамеров 2,5A (B) на трансляцию in vitro РНК ВТМ (вируса табачной мозаики) в экстракте пшеничных зачатков. 0,8 мкг ВТМ-РНК транслируют m vitro. [35S] -меченые белки, полученные из 5 мкл проб, преципицируют на стекловолокнистых фильтрах, после чего измеряют введенную радиоактивность: 
без 2,5A, 
pppAn, 
ppAn, □ - pAn, Δ - An, 
без РНК.
Фиг. 4. Влияние различных тримеров 2,5A на скорость разрушения РНК ВТМ в экстракте пшеничных зачатков. ВТМ-РНК выделяют из проб экстракта пшеничных зачатков, содержащего 1 мкМ тримеров 2,5A, подвергают Назерн-блоттингу и гибридизируют с [32P]-меченой кДНК ВТМ. Величину РНК оценивают из авторадиографических снимков при помощи лазерной денситометрии: 
без 2,5A, 
pppA3, 
A3.
Фиг. 5. Связывание 2,5A с белками экстракта растительных клеток. [32P] -меченую 2,5A ковалентно структурируют с белками клеточных экстрактов методом NaIO4-окисления и разделяют с помощью 12% электрофореза в полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия. Дорожка 1 представляет лизат ретикулоцитов кролика (получен в соответствии с работой Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)), дорожка 2 представляет экстракт мышиных L-клеток с немеченой 2,5A, дорожка 3 представляет экстракт мышиных L-клеток, дорожка 4 представляет лизат ретикулоцитов кролика (Amersham), дорожка 5 представляет экстракт картофельных листьев и дорожка 6 представляет экстракт картофельных листьев с немеченой 2,5A.
Фиг. 6. Эффект "сердцевины" тримера 2,5A на белковый синтез в табачных протопластах. [14C] -меченый белковый гидролизат прибавляют в культуру табачных протопластов, после чего измеряют общую радиоактивность клеток: 
без 2,5A, 
1 мкМ A3.
Фиг. 7. Размножение PVX в трансгенных растениях, содержащих ген 2,5A-синтетазы. Интактные растения инфицируют 10 мкг/мл PVX и пробы листьев анализируют TRFIA с использованием антител 21XD2 и конъюгата европия 21XD2. Концентрацию вирусов определяют по величине флуоресценции европия в секунду: 
контроль SRI, 
4N1, □ - 4N5, + - 4N11, * -4N12.
Фиг. 8. Размножение PVS в трансгенных табачных растениях, содержащих ген 2,5A-синтетазы. Интактные растения инфицируют 10 мкг/мл PVS и пробы листьев анализируют методом ELISA (ферментным иммуносорбентным анализом) с использованием антител S4A4 и конъюгата пероксидазы из хрена S4A4. Концентрацию вирусов определяют по оптической плотности цветной реакции при 450 нм: 
контроль SRI, 
трансгенные растения с геном 2,5A-синтетазы в "смысловой" ориентации, - - фон ELISA.
Фиг. 9. Размножение PVX в дисках листьев трансгенных растений, содержащих ген 2,5A-синтетазы. Листья инфицируют 10 мкг/мл PVX, диски диаметром 8 мм штампуют и содержат в стерильной воде. Диски анализируют как PVX-инфицированные интактные растения (см. фиг. 7): 
контроль SRI, 
4N10, + - 41112.
Фиг. 10. Концентрация вирусов (PVX) в выращенных в поле трансгенных картофельных растениях, содержащих ген 2,5A-синтетазы. Интактные растения инфицируют соком, собранным с PVX-инфицированных табачных растений.
Пробы листьев анализируют методом ELISA с использованием иммунодиагностического набора для PVX (Boehringer Mannheim). Концентрацию вирусов определяют по оптической плотности цветной реакции при 405 нм. Контр. = контрольный клон; R101, R102, R104, R106, R107 и R2 = трансгенные клоны.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Дополнительные пояснения в отношении методов молекулярной биологии, применяемых в данном изобретении, можно найти в работе Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (см. выше).
Пример 1.
A. Конструирование гена 2.5A. содержащего плазмиду pHТТ2-5A+. кДНК крысиной 2,5A-синтетазы выделяют из кДНК-библиотеки крысиного гиппокампа в векторе λ gt10 в соответствии с протоколами Amersham, используя кДНК мышиной 2,5A-синтетазы в качестве зонда. кДНК субклонируют в сайт EcoRI вектора экспрессии pBluescript SK+ (Stratagene). Полученную плазмиду называют pSK2-5A.
Для трансформации табачных растений кДНК крысиной 2,5A-синтетазы субклонируют в растительный экспрессирующий вектор pHТТ202. кДНК отрезают от pSK2-5A с помощью EcoR1. липкие концы наполняют и кДНК клонируют в BamH1-линеаризованную плазмиду pHТТ202 с использованием синтетических линкеров BamHI (фиг. 1). Полученную плазмиду pHТТ2-5A+ используют для трансформации клеток Agrobacterium.
B. Трансформация Agrobacterium плазмидой pHТТ2-5A+
Плазмида pHТТ202 в большей степени основана на последовательности плазмиды pBR322. Векторы клонирования на основе pBR322 обычно не мобилизуются из клетки-хозяина в другую бактерию, однако они содержат "основу мобилизации", сайт bom. Когда функции "хелпера", кодируемые генами mob хелперных плазмид, обеспечены, векторы клонирования на основе pBR322 также мобилизуются. Для этой цели используют спаривание двух родителей на основе системы, описанной Van Haute et al., EMBO J. 2 (1983), 411-417.
Плазмида pHТТ202 в большей степени основана на последовательности плазмиды pBR322. Векторы клонирования на основе pBR322 обычно не мобилизуются из клетки-хозяина в другую бактерию, однако они содержат "основу мобилизации", сайт bom. Когда функции "хелпера", кодируемые генами mob хелперных плазмид, обеспечены, векторы клонирования на основе pBR322 также мобилизуются. Для этой цели используют спаривание двух родителей на основе системы, описанной Van Haute et al., EMBO J. 2 (1983), 411-417.
E. coli- содержащую плазмиду pHТТ2-5A+ (ampR, spc/strR) спаривают на L-чашках с E. coli хелперным штаммом GJ23, который содержит плазмиду R64drd11 1 α -типа (tetR, strR) для необходимых функций tra и вторую хелперную плазмиду pGJ28 (kanR, neoR), обеспечивающую функции mod в условиях in trans с тем, чтобы комплементировать трансмиссию плазмид mob bom+ на основе pBR.
Клетки с хелперными плазмидами отбирают на L-чашках, содержащих 5 ампициллин, тетрациклин и канамицин. Эти клетки совместно культивируют в L-бульоне со штаммом C58C1 Agrobacterium tumefaciens. содержащим Ti-плазмиду pGV2260 (rifR, cbR), когда гены, отвечающие за туморогенез в растительных клетках, замещены последовательностями плазмиды pBR322. Конъюгированные клетки Agrobacterium отбирают на чашках, содержащих рифампицин, спектиномицин и стрептомицин. Поскольку вектор на основе pBR322 нельзя реплицировать в Agrobacterium, только Agrobacteria, когда рекомбинация между pBR322 с последовательностью pGV2260 и pHТТ202 привела в образованию совместно интегрированной молекулы, могут вырасти на селективных чашках. С целью подтверждения того, что Т-ДНК рекомбинантных плазмид содержит ген 2,5A-синтетазы, выделяют полную ДНК полученных Agrobacteria (Dhaese et al., Nycl. Acids Res. , 7, (1979), 1837-1849) и анализируют блоттинг-методом по Саузерну.
Пример 2.
Трансформация табачных растений с помощью гена 2,5A-синтетазы.
Трансгенные растения SRI Nicotiana tabacum получают путем Agrobacterium-опосредованного переноса (Zambryski, Annu. Rev. Genet. 22 (1988), 1-30). Метод основан на том явлении, что Agrobacterium устойчиво переносит сегмент своей Ti-плазмиды в растительный геном после взаимодействия с ранеными растительными клетками. Сегмент, называемый "Т-ДНК", определяется его сохранившимися граничными последовательностями. Генетическую информацию между граничными последовательностям можно заменить без воздействия на эффективность переноса Т-ДНК.
Трансформацию табачных растений с помощью гена 2,5A-синтетазы осуществляют в соответствии с работой Horsch et al., Science, 227, (1985), 1229-1231. Листья SRI N. tabacum растений, выращенных на среде MS/2 (Murashige and Skoog, Phys. Plant, 18 (1962), 437-497) в стерильных условиях при температуре 24oC в течение 16-часовых фотопериодов, помещают вверх дном в среду сахарозы КЗ-400 мМ (Nagy and Maliga, Z. Pflanzenphysiology, 78 (1976), 453-455) и разрезают на части размером 0,5-1 кв. см так, чтобы все края были отрезаны. Agrobacterium с совместным интегратом Т-ДНК, выращенным в минимальной питательной среде М9 (Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1989), см.выше), добавляют в среду сахарозы КЗ-400 мМ, и чашки сохраняют в течение трех дней при тех же условиях, что и для растений. Диски листьев промывают и переносят вверх дном в твердую среду LS (Linsmaier and Skoog, Phys. Plant., (1965), 100-127), содержащую Клафоран для уничтожения Agrobacteria, бензиламинопурин (БАП) для индуцирования корней из дисков листьев и канамицин для отбора на трансформированные клетки, поскольку сегмент плазмиды pHТТ2-5A+, совместно интегрированный в Т-ДНК плазмиды pGV2260, также содержит ген nos-npt2. придающий устойчивость к канамицину для трансформированных клеток. После появления корней их отрезают и высевают на аналогичную среду без БАП. Полностью укорененные растения сохраняют на среде MS/2 при условиях, описанных выше.
С целью проверки того, что растения являются действительно трансформированными, полные ДНК и РНК из тканей листьев выделяют в соответствии с методом Dellaporta et al., Plant. Mol. Biol. Rep., 1 (1983), 19-21, и Verwoerd et al., Nucl. Acids Res., 17 (1989), 2362, соответственно. Блоттинг-анализы по Назерну и Саузерну осуществляют в соответствии с протоколами Amersham с использованием [32P]-меченой кДНК 2,5A-синтетазы в качестве зонда (фиг. 2).
Пример 3.
Идентификация активности 2,5A-зависимой РНКазы.
Исследования по воздействию различных 2,5-олигоаденилатных форм под влиянием вируса табачной мозаики (ВТМ) во время трансляции in vitro в экстракте пшеничных зачатков (ЭПЗ) показывают, что нефосфорилированные три- и тетрамеры 2,5A могут эффективно ингибировать трансляцию РНК ВТМ в ЭПЗ (фиг. 3). Скорости разрушения РНК ВТМ во время трансляции in vitro в присутствии и отсутствии 2,5A анализируют путем взятия проб из трансляционной смеси и выделения РНК, как описано в работе Toots et al., Mol. Biol. (USSR), 22 (1988), 1473-1481. После электрофореза в агарозно/формамидном геле и блоттинга по Назерну концентрацию РНК в пробах оценивают путем сканирования авторадиограмм [32P] -меченных фильтров с помощью лазерного денситометра. Прибавление "сердцевины" тримера 2,5A приводит к быстрому разрушению РНК ВТМ, тогда как скорость разрушения РНК ВТМ намного ниже в контрольных экспериментах с применением и без применения трифосфорилированной 2,5A (фиг. 4). В заключение, ингибирующее влияние "сердцевины" 2,5A на трансляцию in vitro в растительном бесклеточном экстракте вызвано быстрым разрушением субстрактной РНК.
С целью идентификации 2,5A-связывающих белков в растительных экстрактах, 2,5A лигируют к [32P] pCp, как описано в работе Knight et al., Methods in Enzymology, 79 (1981), 216-227. [32P]-меченую 2,5A ковалентно структурируют с белками картофельных клеточных экстрактов методом NalO4-окисления в соответствии с работой Wreschner et al., Eur. J. Biochem., 124 (1982), 261-268. Специфичность связывания контролируют сравнительным анализом, согласно которому немеченую 2,5A прибавляют в избытке в реакционные смеси. Реакционные смеси разделяют гель-электрофорезом в 12% полиакриламиде с додецилсульфатом натрия.
Белок размером 70 кД идентифицируют в экстрактах картофельных листьев, которые специфическим образом связываются с меченой 2,5A (фиг. 5). Специфичность связывания показана в конкурентном анализе, где немеченая 2,5A полностью замещает [32Р] 2,5A в картофельных P экстрактах (фиг. 5).
Поскольку 2,5A-индуцированное ингибирование трансляции in vitro в ЭПЗ вызвано быстрым разрушением РНК ВТМ, 2,5A связывающий белок массой 70 кД из растительного экстракта представляет собой 2,5A-активированную растительную эндорибонуклеазу.
Также исследуют воздействие 2,5A на белковый синтез в протопластах SRI N. tabacum. Протопласты получают в соответствии с описанием в работе Horkanen et al., "Biotechnology in tropical crop improvement: proceedings of the international biotechnology workshop", (1988), из лиственного мезофилла растений, выращенных в стерильных условиях, и сохраняют в среде сахарозы КЗ-400 мМ. После прибавления [14C]-меченого аминокислотного гидролизата пробы собирают из смеси протопластов для анализа концентрации белков, синтезированных de novo. Белки преципицируют трихлоруксусной кислотой и измеряют инкорпорированную радиоактивность. 2,5A эффективно ингибирует белковый синтез в табачных протоплатах (фиг. 6), что еще раз показывает влияние 2,5A в качестве ингибитора белкового синтеза в растительных системах in vivo.
Идентифицировав 2,5A-зависимую активность РНКазы в картофеле и табаке, можно сделать вывод о том, что существует путь метаболизма в растениях, который частично напоминает интерферон-индуцированный путь метаболизма млекопитающих, который вызывает вирусную резистентность.
Пример 4.
Размножение картофельных вирусов X и S и вируса табачной мозаики в 2.5A трансгенных растениях.
С целью исследования размножения различных вирусов в трансгенных растениях, экспрессирующих 2,5A-синтетазу, осуществляют различные эксперименты по заражению. Растения, растущие на среде MS/2, переносят на почву за две недели до заражения. С целью заражения 2-3 нижних листа обрабатывают карборундом, 10 мкг/мл вируса вручную инокулируют на поверхность листьев и карборунд промывают через 30 минут стерильной водой. Растения сохраняют в течение 16-часовых фотопериодов на один месяц.
Пробы собирают путем отбора одного из маленьких верхних листьев каждый пятый день и замораживания их в жидком азоте. Пробы листьев гомогенизируют в ступке, прибавляя 1 мл буфера для иммуноанализа на грамм лиственного материала. Для обнаружения картофельного вируса X (PVX) используют моноклональные антитела 21XD2 и фтороиммуноанализ с разрешением по времени (TRFIA), как описано в работе Sober et al., J. gen. Virol., 69 (1988), 1799-1807, и Sinijarv et al., J. gen. Virol., 69 (1988), 991- 998, соответственно. Концентрацию PVS измеряют методом DAS-ELISA с использованием моноклональных антител S4A4 (Sinijarv et al., 1988, выше).
Через один месяц после заражения с использованием 10 мкг/мл PVX все трансгенные растения содержат поддающиеся определению уровни PVX, однако вирусная концентрация намного ниже, чем в контрольных растениях (фиг. 7). Кроме того, в этих растениях обнаруживаемое размножение PVX начинается на 1-2 недели позднее, нежели в контрольных растениях.
Через один месяц после заражения 10 мкг/мл PVS все трансгенные табачные линии показывают полную резистентность к заражению PVS и 5 содержат едва лишь обнаруживаемый уровень PVS (фиг. 8).
Осуществляют также заражение дисков листьев с помощью PVX и дополнительно с помощью ВТМ. Листья трансгенных табачных линий заражают, как описано выше. Диски диаметром 8 мм штампуют из листьев и хранят вверх дном в стерильной воде при температуре 24oC в течение от 16-часовых фотопериодов до пяти дней. Диски замораживают в жидком азоте и гомогенизируют. Заражение 10 мкг/мл PVX дает результаты, аналогичные тем, которые наблюдают у интактных растений. Диски листьев некоторых трансгенных табачных линий содержат меньше вируса, а определяемое размножение картофельных вирусов начинается намного раньше, нежели в интактных растениях. Концентрация ВТМ в дисках листьев через пять дней после заражения показывает явное ингибирование вирусного размножения в отношении контрольных растений.
Пример 5.
Обнаружение 2.5 - олигоаденилатов в трансгенных растениях
С целью определения концентрации 2,5A в трансгенных растениях SRI табака, экспрессирующих 2,5A-синтетазу, получают экстракты листьев от зараженных и незараженных вирусом растений. Сравнительный анализ проводят в сравнении с немеченой 2,5A из растительных экстрактов с помощью 2,5A[32P]pCp. Мышиный экстракт клеток линии L используют в качестве источника для 2,5A-связывающей эндорибонуклеазы L (РНКазы L). Смесь меченой 2,5A, экстракта L-клеток и экстракта листьев инкубируют в течение 90 минут на льду. Белки из смеси преципитируют на нитроцеллюлозных фильтрах, после чего подсчитывают радиоактивность фильтров и фильтрата. Смесь без растительного экстракта используют в качестве положительного контроля, тогда как в качестве отрицательного контроля используют смесь, в которой 10-7 М тримера немеченой 2,5A полностью замещают меченую 2,5A.
С целью определения концентрации 2,5A в трансгенных растениях SRI табака, экспрессирующих 2,5A-синтетазу, получают экстракты листьев от зараженных и незараженных вирусом растений. Сравнительный анализ проводят в сравнении с немеченой 2,5A из растительных экстрактов с помощью 2,5A[32P]pCp. Мышиный экстракт клеток линии L используют в качестве источника для 2,5A-связывающей эндорибонуклеазы L (РНКазы L). Смесь меченой 2,5A, экстракта L-клеток и экстракта листьев инкубируют в течение 90 минут на льду. Белки из смеси преципитируют на нитроцеллюлозных фильтрах, после чего подсчитывают радиоактивность фильтров и фильтрата. Смесь без растительного экстракта используют в качестве положительного контроля, тогда как в качестве отрицательного контроля используют смесь, в которой 10-7 М тримера немеченой 2,5A полностью замещают меченую 2,5A.
Результаты показывают, что незараженные трансгенные растения, экспрессирующие 2,5A-синтетазу, содержат малое (если только оно есть) обнаруживаемое количество 2,5A аналогично тому, что наблюдается у контрольных растений и трансгенных растений, несущих ген 2,5A-синтетазы в антисмысловой ориентации. (Таблица 1). Это вызвано тем, что 2,5A-синтетаза экспрессируется как неактивный фермент, который может быть активирован двухцепочечной РНК. Когда трансгенные растения, экспрессирующие 2,5A-синтетазу, заражены PVX, 2,5A становится обнаруживаемой и ее внутриклеточные концентрации даже более высокие, чем в контрольных смесях. Такое повышение уровня содержания 2,5A не обнаруживается в контрольных SRI-растениях. Повышение уровня содержания 2,5A в трансгенных растениях приводит к ингибированию PVX-, PVS-и ВТМ-размножения.
Из представленных данных видно, что двухцепочечные реплицирующие промежуточные продукты РНК PVX способны активировать неактивную 2,5A-синтетазу, что приводит к синтезу внутриклеточной 2,5A.
Пример 6.
Определение заражения PVX в трансгенных растениях картофеля.
Полевое испытание.
Интактные растения картофеля, содержащие ген 2,5A-синтетазы, заражают соком, собранным с PVX-зараженных табачных растений и выращенных в поле.
Пробы листьев анализируют через пять недель после заражения методом ELISA с использованием иммунодиагностического комплекса для PVX (Boehringer Mannheim). Вирусную концентрацию определяют по оптической плотности цветной реакции при 405 нм (см. фиг. 10).
Концентрация PVX в растениях, содержащих ген 2,5A-синтетазы, заметно снижается по сравнению с контрольными растениями.
Claims (4)
1. Способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения, включающий генетическое конструирование ДНК-последовательности, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, обеспечивающий устойчивость к вирусу, введение полученной ДНК в клетки растений, получение регенерантов и отбор регенерантов, экспрессирующих указанный полипептид, отличающийся тем, что конструируют ДНК-последовательность, содержащую фрагмент, кодирующий полипептид с активностью 2,5 A-синтетазы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что генетически сконструированную ДНК-последовательность предварительно встраивают в вектор под управлением промотора, позволяющего осуществить ее экспрессию в данном трансгенном растении.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что вектор представляет собой pHTT2-5+ (DSM N 6815).
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение в клетки растений осуществляют путем трансфекции с использованием Agrobacterium.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92104676.9 | 1992-03-18 | ||
| EP92104676 | 1992-03-18 | ||
| PCT/EP1992/002217 WO1993019187A1 (en) | 1992-03-18 | 1992-09-24 | Transgenic plants displaying multiple virus resistance and a process for their production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94045821A RU94045821A (ru) | 1997-05-27 |
| RU2125606C1 true RU2125606C1 (ru) | 1999-01-27 |
Family
ID=8209445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94045821A RU2125606C1 (ru) | 1992-03-18 | 1992-09-24 | Способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0632835B1 (ru) |
| JP (1) | JPH07504820A (ru) |
| AT (1) | ATE199397T1 (ru) |
| AU (1) | AU669130B2 (ru) |
| BR (1) | BR9207103A (ru) |
| CA (1) | CA2132096A1 (ru) |
| DE (1) | DE69231711T2 (ru) |
| ES (1) | ES2155062T3 (ru) |
| FI (1) | FI944315L (ru) |
| GR (1) | GR3035873T3 (ru) |
| HU (1) | HU218356B (ru) |
| NO (1) | NO943439L (ru) |
| PL (1) | PL171446B1 (ru) |
| RU (1) | RU2125606C1 (ru) |
| UA (1) | UA29438C2 (ru) |
| WO (1) | WO1993019187A1 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5866787A (en) * | 1993-03-08 | 1999-02-02 | Cleveland Clinic Foundation | Transgenic plants co-expressing a functional human 2-5A system |
| CA2135307A1 (en) * | 1993-03-08 | 1994-09-15 | Robert H. Silverman | Animal 2-5a-dependent rnases and encoding sequences therefor |
| US5861300A (en) * | 1993-03-08 | 1999-01-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Antiviral transgenic plants, vectors, cells and methods |
| US5877019A (en) * | 1993-03-08 | 1999-03-02 | Cleveland Clinic Foundation | Animal 2-5A-dependent RNases and encoding sequences therefor |
| BR9507425A (pt) * | 1994-02-18 | 1997-09-16 | Cleveland Clinic Foundation | Planta transgênica planta de tabaco transgênica vetor de transformaç o de planta célula de planta planta de tabaco diferenciada célula bacteriana planta de tabaco Processo para produzir geneticamente plantas transformadas construç o sequência de nucleotídeo isolada e sequência de aminoácido |
| CA2222696C (en) * | 1995-05-31 | 2005-01-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Virus resistant plants expressing animal cell-derived (2'-5') oligoadenylate synthetase and ribonuclease l and a method for creating the same |
| US5990388A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-23 | Research Corporation Technologies, Inc. | Resistance to viruses and viroids in transgenic plants and animals expressing dsRNA-binding protein |
-
1992
- 1992-09-24 DE DE69231711T patent/DE69231711T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-24 BR BR9207103A patent/BR9207103A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-09-24 CA CA002132096A patent/CA2132096A1/en not_active Abandoned
- 1992-09-24 AT AT92920421T patent/ATE199397T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 PL PL92305225A patent/PL171446B1/pl unknown
- 1992-09-24 AU AU26613/92A patent/AU669130B2/en not_active Ceased
- 1992-09-24 ES ES92920421T patent/ES2155062T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 JP JP5516191A patent/JPH07504820A/ja active Pending
- 1992-09-24 WO PCT/EP1992/002217 patent/WO1993019187A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-24 RU RU94045821A patent/RU2125606C1/ru active
- 1992-09-24 UA UA94105927A patent/UA29438C2/ru unknown
- 1992-09-24 EP EP92920421A patent/EP0632835B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 HU HU9402670A patent/HU218356B/hu not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-15 NO NO943439A patent/NO943439L/no unknown
- 1994-09-16 FI FI944315A patent/FI944315L/fi unknown
-
2001
- 2001-05-15 GR GR20010400726T patent/GR3035873T3/el not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Btachy et al., Annu. Rev. Phytopathol., v.29, p. 451 - 474, 1990. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO943439L (no) | 1994-11-11 |
| DE69231711T2 (de) | 2001-07-05 |
| WO1993019187A1 (en) | 1993-09-30 |
| HU218356B (hu) | 2000-08-28 |
| JPH07504820A (ja) | 1995-06-01 |
| RU94045821A (ru) | 1997-05-27 |
| PL171446B1 (pl) | 1997-04-30 |
| FI944315A0 (fi) | 1994-09-16 |
| AU2661392A (en) | 1993-10-21 |
| CA2132096A1 (en) | 1993-09-19 |
| GR3035873T3 (en) | 2001-08-31 |
| NO943439D0 (no) | 1994-09-15 |
| FI944315L (fi) | 1994-09-16 |
| UA29438C2 (ru) | 2000-11-15 |
| EP0632835A1 (en) | 1995-01-11 |
| ATE199397T1 (de) | 2001-03-15 |
| AU669130B2 (en) | 1996-05-30 |
| HU9402670D0 (en) | 1994-11-28 |
| EP0632835B1 (en) | 2001-02-28 |
| HUT70265A (en) | 1995-09-28 |
| ES2155062T3 (es) | 2001-05-01 |
| BR9207103A (pt) | 1995-12-19 |
| DE69231711D1 (de) | 2001-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5268526A (en) | Overexpression of phytochrome in transgenic plants | |
| Newell et al. | Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) with Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin | |
| JPH06343469A (ja) | デオキシリボ核酸 | |
| US5656466A (en) | Process for preparing virus-resistant transgenic plant | |
| JP3320064B2 (ja) | 抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用 | |
| JP2010524474A (ja) | 改変プロモーターを使用する植物老化の操作 | |
| JPH11507232A (ja) | 機能的ヒト２−５ａ系を同時発現するトランスジェニック植物 | |
| RU2125606C1 (ru) | Способ получения резистентного к вирусу трансгенного растения | |
| CN108192920A (zh) | 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法 | |
| US6015942A (en) | Transgenic plants exhibiting heterologous virus resistance | |
| CA2184741A1 (en) | Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants | |
| EP1190039A2 (en) | Gene encoding short integuments and uses thereof | |
| Hensgens et al. | Translation controls the expression level of a chimaeric reporter gene | |
| Pugliesi et al. | Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens in the interspecific hybrid Helianthus annuus× Helianthus tuberosus | |
| US5589625A (en) | Transgenic plants displaying multiple virus resistance and a process for their production | |
| CN114591409B (zh) | TaDTG6蛋白在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CA2204023A1 (en) | Processes for modifying plant flowering behaviour | |
| KR100255474B1 (ko) | 형질전환된 벼 고엽고 바이러스 저항성 벼 및 그 제조방법 | |
| EP0585554B1 (en) | Process for preparing a transgenic plant expressing phytolacca antiviral protein | |
| Okamoto et al. | Photoresponses of transgenic Arabidopsis overexpressing the fern Adiantum capillus-veneris PHY1 | |
| US20030018995A1 (en) | Plants with a modified flower and seed development | |
| Burke et al. | Selection procedure for identifying transgenic cells, embryos, and plants without the use of antibiotics | |
| SI9200069A (en) | Light regulated gene expression in the transgenic plants | |
| PL186761B1 (pl) | Sposób otrzymywania roślin odpornych na wirus Y ziemniaka /PVY/ | |
| JP2004049143A (ja) | 感染誘導性ｐｒ４遺伝子プロモーター |