RU2058154C1

RU2058154C1 - Adjuvant

Info

Publication number: RU2058154C1
Application number: RU92012922A
Authority: RU
Inventors: Н.С. Мамков; А.И. Дудников; В.В. Михалишин; В.Ю. Савельев; В.И. Шипилов; Г.П. Ильина; Н.А. Косульникова; Г.А. Черкасова
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1996-04-20

Abstract

FIELD: veterinary. SUBSTANCE: proposed adjuvant has emulsifier ЭПОЛ - a product of esterification of oleic and stearic acids mixture with polyglycerol and oily base. ЭПОЛ is dissolved in oily base at defined ratios and mixture is sterilized. Prepared adjuvant is a clear, oily, yellow liquid. EFFECT: improved method of adjuvant preparing. 4 tbl

Description

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а более конкретно к масляным адъювантам, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных. The invention relates to veterinary virology, and more particularly to oil adjuvants, and can be used in research and biological industry in the development and production of immunizing drugs for the diagnosis and prevention of infectious diseases in various types of farm animals.

При изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение в основном следующие адъюванты: минеральные сорбенты в сочетании с сапонином для изготовления сорбированных вакцин и масляные адъюванты для эмульсионных. In the manufacture of means for the specific prophylaxis of infectious diseases of animals, the following adjuvants were used mainly: mineral sorbents in combination with saponin for the manufacture of sorbed vaccines and oil adjuvants for emulsion ones.

Исследования свидетельствуют о преимуществах и перспективе использования эмульсионных препаратов, которые готовят с использованием масляных адъювантов. Studies show the benefits and prospects of using emulsion preparations that are prepared using oil adjuvants.

Изготовление эмульсионных препаратов является результатом смешивания двух взаимно нерастворимых фаз масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антигены (антиген), путем их энергичного перемешивания (эмульгирования). The manufacture of emulsion preparations is the result of mixing two mutually insoluble phases of the oil (oil adjuvant) and water phases containing antigens (antigen) by vigorous mixing (emulsification).

При этом в зависимости от состава масляного адъюванта может быть получена эмульсия различных типов: "вода в масле" (обратная), "масло в воде" (прямая) или "вода-масло-вода" (множественная). In this case, depending on the composition of the oil adjuvant, an emulsion of various types can be obtained: "water in oil" (reverse), "oil in water" (direct) or "water-oil-water" (multiple).

Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широко используют эмульсии обратного типа, для получения которых используют адъюванты следующего состава, мас. For the immunization of farm animals, the reverse emulsions are most widely used, for the preparation of which adjuvants of the following composition are used, wt.

1. Минеральное масло Байоль 85
Арлацел А (неполный адъювант Фрейнда) 15 2. Масляная основа 85 Безводный ланолин 15 3. Масляная основа 84-89 Безводный ланолин 10-14 Холестерин 1-2
В качестве масляной основы обычно используют вазелиновое, парфюмерное, вакцинное масло или масло для противоящурных биопрепаратов.1. Mineral oil Bayol 85
Arlacel A (Freund's incomplete adjuvant) 15 2. Oil base 85 Anhydrous lanolin 15 3. Oil base 84-89 Anhydrous lanolin 10-14 Cholesterol 1-2
As an oil base, petroleum jelly, perfume, vaccine oil, or anti-FMD biopreparations are usually used.

Общими недостатками вышеуказанных адъювантов являются сильная реактогенность для крупного и мелкого рогатого скота и высокая вязкость (выше 2000 мм²/с) полученных с их использованием препаратов.Common disadvantages of the above adjuvants are the strong reactogenicity for cattle and small cattle and the high viscosity (above 2000 mm ² / s) obtained with their use of drugs.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результаты к изобретению при использовании является адъювант, содержащий масляную основу и эмульгатор ВНИИЖ смесь полиглицериноалканоатов на основе непредельных жирных кислот при следующем соотношении компонентов, мас. Эмульгатор ВНИИЖ 10-15 Масляная основа 85-90
В качестве масляной основы используют масло для противоящурных биопрепаратов.The closest in technical essence and the achieved results to the invention when used is an adjuvant containing an oil base and emulsifier VNIIZh a mixture of polyglyceryl alkanoates based on unsaturated fatty acids in the following ratio of components, wt. Emulsifier ARRIAH 10-15 Oil base 85-90
As an oil base, oil is used for anti-FMD biologics.

Недостатком прототипа является его высокая реактогенность. The disadvantage of the prototype is its high reactogenicity.

В задачу создания предлагаемого изобретения входила разработка адъюванта и иммунизирующего препарата на его основе, обладающих низкой реактогенностью. The task of creating the present invention included the development of an adjuvant and an immunizing drug based on it having low reactogenicity.

Поставленная задача решена тем, что известный адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, в соответствии с изобретением содержит в качестве эмульгатора ЭПОЛ продукт этерификации смеси олеиновой и стеариновой кислот с полиглицерином при следующем соотношении ингредиентов, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа 90-94
ЭПОЛ представляет собой смесь моно- и диэфиров общей формулы:
НО(-СН₂СНОНСН₂О-)nОСН₃₃С₁₇ (моноэфир)
С₁₇Н₃₃СОО(-СН₂СНОНСН₂О-)_nОСН₃₃С₁₇ (диэфир), где n 5.The problem is solved in that the known adjuvant, including an emulsifier and an oil base, in accordance with the invention contains as an emulsifier EPOL the product of the esterification of a mixture of oleic and stearic acids with polyglycerol in the following ratio of ingredients, wt. EPOL 6-10 Oil base 90-94
EPOL is a mixture of mono - and diesters of the general formula:
HO (-CH ₂ CHONCH ₂ O-) nOSH ₃₃ C ₁₇ (monoester)
С ₁₇ Н ₃₃ СОО (-CH ₂ ССОНСН ₂ О-) _n ОСН ₃₃ С ₁₇ (diester), where n 5.

ЭПОЛ имеет следующие физико-химические показатели: Внешний вид и цвет Мазеобразная
масса от желтого
до коричневого
цвета Эфирное число, нг КОН/г 130-150 Кислотное число, нг КОН/г Не более 8 Плотность, г/см³ 0,980 Вязкость, мПа.с 1200 ГЛБ 5-6
Гарантийный срок хранения не менее 1 года.EPOL has the following physicochemical parameters: Appearance and color
weight from yellow
to brown
colors Ether number, ng KOH / g 130-150 Acid number, ng KOH / g Not more than 8 Density, g / cm ³ 0.980 Viscosity, MPa.s 1200 HLB 5-6
Guaranteed shelf life of at least 1 year.

ЭПОЛ хорошо сочетается с жирными минеральными и растительными маслами, растворяется в органических растворителях. EPOL is well combined with fatty mineral and vegetable oils, soluble in organic solvents.

ЭПОЛ не является токсичным, относится к 4 классу веществ, малоопасных для развития острых отравлений. Расчетная величина ОБУВ для воздуха рабочей зоны равна 10 мг/м³ (заключение НИИ гигиены труда и профзаболеваний N 06.01-14-13 от 12.01.90). Известно использование ЭПОЛа в косметических изделиях в качестве эмульгатора типа "вода в масле".EPOL is not toxic, belongs to the 4th class of substances, low risk for the development of acute poisoning. The calculated size of the SHOV for the air of the working area is 10 mg / m ³ (conclusion of the Scientific Research Institute of Occupational Health and Occupational Diseases N 06.01-14-13 of 12.01.90). It is known to use EPOL in cosmetic products as an emulsifier of the "water in oil" type.

По сравнению с прототипом предлагаемый адъювант отличается тем, что содержит в качестве эмульгатора ЭПОЛ при следующем соотношении ингредиентов, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа 90-94
По результатам опытов на лабораторных и сельскохозяйственных животных впервые обнаружены новые свойства эмульгатора ЭПОЛ: он не разрушает вирус, не обладает токсичностью, его использование в составе вакцины приводит к снижению ее реактогенности. Снижение реактогенности адъюванта обусловлено высокой молекулярной массой ЭПОЛа и низким содержанием свободных жирных кислот.Compared with the prototype of the proposed adjuvant is different in that it contains as an emulsifier EPOL in the following ratio of ingredients, wt. EPOL 6-10 Oil base 90-94
According to the results of experiments on laboratory and farm animals, for the first time new properties of the EPOL emulsifier were discovered: it does not destroy the virus, does not have toxicity, its use in the composition of the vaccine leads to a decrease in its reactogenicity. The decrease in the reactogenicity of the adjuvant is due to the high molecular weight of EPOL and the low content of free fatty acids.

В качестве масляной основы используют минеральное масло для противоящурных биопрепаратов или минеральное масло для универсального адъюванта, при использовании которых получены аналогичные результаты. As the oil base, mineral oil is used for anti-FMD biologics or mineral oil for a universal adjuvant, using which similar results were obtained.

Вышеуказанные отличия предлагаемого адъюванта от прототипа являются существенными, так как они являются достаточными во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата, указанного в задаче создания изобретения. The above differences of the proposed adjuvant from the prototype are significant, since they are sufficient in all cases to achieve the technical result provided by the invention specified in the task of creating the invention.

Признаки, отличающие предлагаемый адъювант от прототипа, не выявлены в других известных решениях при изучении данной и смежных областей знаний. Signs that distinguish the proposed adjuvant from the prototype are not identified in other known solutions in the study of this and related fields of knowledge.

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый адъювант, достигается технический результат, заключающийся в снижении реактогенности адъюванта и полученного на его основе иммунизирующего препарата, что подтверждено результатами многочисленных исследований, сведения о которых приведены ниже. Through the use of a new combination of known and distinctive features characterizing the proposed adjuvant, a technical result is achieved consisting in reducing the reactogenicity of the adjuvant and the immunizing preparation obtained on its basis, which is confirmed by the results of numerous studies, the details of which are given below.

П р и м е р 1. PRI me R 1.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 6 Масляная основа 94
Адъювант готовят следующим образом. Навеску ЭПОЛа растворяют в минеральном масле для ящурных биопрепаратов или минеральном масле для универсального адъюванта в оптимальных отношениях. Полученный раствор стерилизуют известными методами: либо нагреванием в сушильном шкафу при 120-130^оС в течение 2 ч, либо путем стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок "СФ", ЕКS, JAM -150 и т.п. при комнатной температуре. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость желтого цвета, допускается слабая опалесценция. Адъювант разливают в стерильные флаконы и хранят при комнатной температуре до момента использования.The composition of the adjuvant, wt. EPOL 6 Oil base 94
The adjuvant is prepared as follows. A portion of EPOL is dissolved in mineral oil for foot-and-mouth disease biological products or mineral oil for universal adjuvant in optimal ratios. The resulting solution was sterilized by known methods, either by heating in an oven at 120-130 ^{° C} for 2 hours, or by sterilizing filtration by using plates of stamps "SF" EKS, JAM -150 and the like at room temperature. The resulting adjuvant is a clear, oily yellow liquid; slight opalescence is allowed. The adjuvant is poured into sterile vials and stored at room temperature until use.

П р и м е р 2. PRI me R 2.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 8 Масляная основа 92
Адъювант готовят так, как описано в примере 1.The composition of the adjuvant, wt. EPOL 8 Oil base 92
An adjuvant is prepared as described in example 1.

П р и м е р 3. PRI me R 3.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 10 Масляная основа 90
Адъювант готовят так, как описано в примере 1.The composition of the adjuvant, wt. EPOL 10 Oil base 90
An adjuvant is prepared as described in example 1.

Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта были подготовлены пять смесей ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты. Оптимальный состав предлагаемого адъюванта определили в результате изучения физических свойств (вязкость, устойчивость), полученных на его основе иммунизирующих эмульсий из вируса ящура А₂₂, который использован в качестве модельного образца, что никоим образом не ограничивает объем изобретения.For experimental verification of the proposed adjuvant were prepared five mixtures of ingredients, three of which showed optimal results. The optimal composition of the proposed adjuvant was determined by studying the physical properties (viscosity, stability) obtained on the basis of immunizing emulsions from foot and mouth disease virus A ₂₂ , which is used as a model sample, which in no way limits the scope of the invention.

Вакцины получали путем смешивания ящурного антигена и предлагаемого адъюванта в отношении 1:1 в размельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин при 5000 об/мин. Vaccines were obtained by mixing foot-and-mouth antigen and the proposed adjuvant in a 1: 1 ratio in a tissue grinder PT-2 for 5 min at 5000 rpm

Вязкость образцов эмульсионных вакцин определяли с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-2 при 20^оС и выражали в мм²/с.The viscosity of the emulsion vaccine samples were determined using a capillary viscometer IWF-2 at ²⁰ ° C and expressed in mm ² / s.

Устойчивость эмульсионных препаратов определяли путем визуального наблюдения за расслоением 20 см³ образца эмульсии при 37^оС. Устойчивость характеризовали временем ее хранения до начала выделения водной фазы. Кроме того, определялась устойчивость эмульсии центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Стабильными считали эмульсии, устойчивые к центрифугированию и не выделяющие водной фазы в течение 3 месяцев и более.Stability of emulsion preparations was determined by visual observation of the bundle 20 cm ³ sample of the emulsion at 37 ° ^C. The stability characterized by its storage time prior to separation of the aqueous phase. In addition, the stability of the emulsion was determined by centrifugation for 30 min at 3000 rpm. Emulsions that are resistant to centrifugation and do not emit an aqueous phase for 3 months or more were considered stable.

Результаты исследований приведены в табл. 1. The research results are given in table. 1.

Из табл. 1 следует, что оптимальный состав предлагаемого адъюванта следующий, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа (образцы 2, 3, 4, 7, 8, 9) 90-94
В этом случае устойчивость эмульсий сохраняется в течение 3 месяцев и более, а вязкость не превышает 98 мм²/с, что обеспечивает легкую инъецируемость препаратов. Повышение содержания эмульгатора не улучшает свойств эмульсии, а уменьшение до 5% приводит к снижению устойчивости (образцы 1 и 6).From the table. 1 it follows that the optimal composition of the proposed adjuvant is as follows, wt. EPOL 6-10 Oil base (samples 2, 3, 4, 7, 8, 9) 90-94
In this case, the stability of the emulsions is maintained for 3 months or more, and the viscosity does not exceed 98 mm ² / s, which ensures easy injectability of the preparations. An increase in the content of the emulsifier does not improve the properties of the emulsion, and a decrease of up to 5% leads to a decrease in stability (samples 1 and 6).

Эффективность предлагаемого адъюванта в сравнении с прототипом и аналогами проверена в ряде опытов также в составе эмульсионной противоящурной вакцины А₂₂.The effectiveness of the proposed adjuvant in comparison with the prototype and analogues tested in a number of experiments also in the composition of emulsion FMD vaccine A ₂₂ .

Реактогенность адъювантов определяли количественным методом на белых мышах и качественным на свиньях и крупном рогатом скоте. The reactogenicity of adjuvants was determined quantitatively on white mice and qualitatively on pigs and cattle.

Белым мышам массой около 20 г в область подошвы одной из задних конечностей вводили образцы адъювантов в дозе 0,05 мл. На каждый образец использовали не менее 10 мышей. Через 10 дней животных забивали, конечности обрезали по скакательный сустав и взвешивали. Реактогенность определяли как процент прироста массы в результате воспалительной реакции по формуле
Реактогенность

1

100% где М_о сумма масс опытных лапок;
М_к сумма масс контрольных лапок.White mice weighing about 20 g in the area of the sole of one of the hind limbs were injected with samples of adjuvants in a dose of 0.05 ml. At least 10 mice were used for each sample. After 10 days, the animals were sacrificed, limbs were trimmed along the hock and weighed. Reactogenicity was defined as the percentage of weight gain as a result of an inflammatory reaction according to the formula

Reactogenicity

1

100% where M is _the sum of the masses of the experimental paws;
M _{to the} sum of the masses of the control legs.

Реактогенность адъювантов на свиньях и крупном рогатом скоте оценивали по наблюдениям за клиническим состоянием, температурой тела и по результатам патолого-анатомического исследования через 10 дней после введения вакцин, содержащих различные адъюванты. Крупному рогатому скоту препараты вводили подкожно, а свиньям внутримышечно в область шеи. The reactogenicity of adjuvants in pigs and cattle was evaluated by observing the clinical condition, body temperature and the results of pathological anatomical studies 10 days after the administration of vaccines containing various adjuvants. In cattle, preparations were administered subcutaneously, and in pigs intramuscularly in the neck.

В табл. 2 и 3 приведены результаты оценки реактогенности предлагаемого адъюванта и эмульсионной вакцины на его основе в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных. In the table. 2 and 3 show the results of evaluating the reactogenicity of the proposed adjuvant and emulsion vaccine based on it in experiments on laboratory and farm animals.

Как видно из табл. 2 и 3, предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают значительно меньшей реактогенностью, чем известные. As can be seen from the table. 2 and 3, the proposed adjuvant and vaccines based on it have significantly less reactogenicity than the known ones.

Из опытов на мышах (табл. 2) следует, что реактогенность предлагаемого адъюванта в 1,8-3,6 раза ниже, чем у адъюванта-прототипа. From experiments on mice (table. 2) it follows that the reactogenicity of the proposed adjuvant is 1.8-3.6 times lower than that of the prototype adjuvant.

Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что вакцина с предлагаемым адъювантом вызывает на месте введения у крупного рогатого скота значительно меньшую воспалительную реакцию, чем вакцины с адъювантом-прототипом. Кроме того, она не вызывает образования абсцессов и повышения температуры тела у животных. The data table. 3 indicate that the vaccine with the proposed adjuvant causes a significantly lower inflammatory response at the site of administration in cattle than vaccines with the adjuvant prototype. In addition, it does not cause the formation of abscesses and fever in animals.

В опыте на свиньях были изучены иммуногенная активность и реактогенность вакцин с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом. Препараты вводили в дозе 1 мл внутримышечно в область шеи в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000 (по 4 головы на каждое разведение). Вакцины разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Через 10 дней после вакцинации всех привитых и 2 контрольных животных заражали 10000 ИД₅₀/0,2 мл гомологичным вирусом в слизистую языка. Через 8 дней после заражения учитывали результаты и оценивали реактогенность по месту введения (табл. 4).In the pig experiment, the immunogenic activity and reactogenicity of the vaccines with the proposed adjuvant and prototype adjuvant were studied. The drugs were administered at a dose of 1 ml intramuscularly into the neck at a dilution of 1:10, 1: 100, 1: 1000 (4 heads for each dilution). The vaccines were diluted with a “Placebo” using a similar adjuvant. 10 days after vaccination, all vaccinated and 2 control animals were infected with 10,000 ID ₅₀ / 0.2 ml homologous virus into the mucous membrane of the tongue. 8 days after infection, the results were taken into account and reactogenicity was evaluated at the injection site (Table 4).

Как видно из табл. 4, вакцина с предлагаемым адъювантом создает у свиней напряженный иммунитет, не уступая при этом вакцине с масляным адъювантом-прототипом. As can be seen from the table. 4, the vaccine with the proposed adjuvant creates intense immunity in pigs, not inferior to the vaccine with the oil adjuvant prototype.

Кроме того, при патолого-анатомическом исследовании в месте введения вакцины с предлагаемым адъювантом не отмечено воспалительных реакций, тогда как у 7 из 12 животных, привитых вакциной с адъювантом-прототипом, установлено образование гранулем. In addition, during pathological and anatomical studies at the injection site with the proposed adjuvant, no inflammatory reactions were noted, while in 7 out of 12 animals vaccinated with the vaccine with the adjuvant prototype, the formation of granulomas was established.

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый адъювант обладает более низкой реактогенностью по сравнению с прототипом, наряду с высокой иммуностимулирующей активностью. Кроме того, препараты, полученные с использованием предлагаемого адъюванта, стабильны и легко инъецируемы. From the above it follows that the proposed adjuvant has a lower reactogenicity compared to the prototype, along with high immunostimulating activity. In addition, drugs obtained using the proposed adjuvant are stable and easily injectable.

Экономический эффект от использования предлагаемого адъюванта будет складываться из уменьшения потерь мяса ввиду незначительных изменений на месте введения препаратов, изготовленных с его использованием. The economic effect of the use of the proposed adjuvant will consist of a reduction in meat losses due to minor changes at the injection site of preparations made using it.

Предлагаемый адъювант найдет применение при изготовлении и применении средств диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных. The proposed adjuvant will find application in the manufacture and use of diagnostic tools and specific prophylaxis of infectious diseases in various types of farm animals.

Claims

ADJUVANT, comprising an emulsifier and an oil base, characterized in that as an emulsifier it contains an EPOL product of the esterification of a mixture of oleic and stearic acids with polyglycerol in the following ratio of ingredients, wt.

EPOL 6 10
Oil base