RU2042360C1 - Набор для выявления хламидийной инфекции - Google Patents
Набор для выявления хламидийной инфекции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2042360C1 RU2042360C1 SU5054095A RU2042360C1 RU 2042360 C1 RU2042360 C1 RU 2042360C1 SU 5054095 A SU5054095 A SU 5054095A RU 2042360 C1 RU2042360 C1 RU 2042360C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- chlamydia
- trachomatis
- kit
- preparations
- Prior art date
Links
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 29
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 26
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 claims description 25
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 19
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 9
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 101100508406 Caenorhabditis elegans ifa-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 11
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 13
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000000143 urethritis Diseases 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 208000007893 Salpingitis Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 208000025609 Urogenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006374 Uterine Cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 206010008323 cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011362 coarse particle Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- -1 monosubstituted sodium phosphate Chemical class 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Набор используется в медицине, биотехнологии, диагностике хламидийной инфекции. Сущность изобретения: набор предназначен для выявления хламидийной инфекции методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием поликлональных антител к поверхностным антигенам Chlamydin trachomatis и получению антител данной специфичности. Способ получения антител включает иммунизацию кур, выделение антител из желтков яиц и двухстадийную очистку. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.
Description
По частоте распространения из болезней, передающихся половым путем, наиболее серьезную проблему представляют урогенитальные хламидиозы, вызываемые Chlamydia trachomatis. Это самая распространенная венерическая болезнь нашего времени. Хламидиоз является основной причиной многочисленных заболеваний и дисфункций репродуктивной системы: уретритов, сальпингитов, простатитов, цервицитов, эпидидимитов и др. У женщин с заболеваниями урогенитального тракта хламидии выявляют в 50-60% случав, у мужчин с первичным диагнозом негонококкового уретрита от 40 до 54% Хламидии выявляются также при смешанных инфекциях у 20-40% больных трихомониазом, до 40% у больных гонореей. По последним данным, именно хламидиоз и связанные с ним патологические изменения мочеполовых путей во много раз повышают вероятность инфицирования вирусом иммунодефицита при половом контакте.
Существующие эффективные лекарственные препараты в большинстве случаев при правильно поставленном диагнозе в короткие сроки приводят к полному излечению хламидиоза. В этих условиях на первый план выходит проблема диагностики. Не только "венерический" анамнез, но и любые недиагносцированные персистирующие лихорадочные состояния являются обоснованным поводом для анализа на присутствие хламидийной инфекции. Обнаружение хламидийной инфекции гарантия успешного лечения.
Традиционным методом обнаружения C. trachomatis является выделение возбудителя путем его пассирования на перевиваемой культуре клеток млекопитающих. Метод достаточно трудоемок, занимает от 4-х до 7 суток, дорог и требует привлечения высококвалифицированного персонала. К тому же образцы, предназначенные для исследования, хранятся при 4оС не долее 24 ч. Поэтому метод не получил широкого распространения в клинической практике.
Метод неспецифической окраски по Романовскому-Гимза, применяющийся до сих пор в отечественных лабораториях для диагностики хламидиозов, не выдерживает критики в связи с низким числом выявляемых случаев инфекции.
Метод ДНК-гибридизации, отличающийся высокой специфичностью и чувствительностью, не пользуется популярностью в клинике из-за исключительной дороговизны и сложности.
В последние годы в крупных клинических лабораториях широкое распространение получил метод иммуноферментного анализа (ИФА). К основным преимуществам ИФА следует отнести высокую производительность и возможность автоматизации проведения анализа. ИФА выгодно использовать при необходимости исследования больших партий образцов (свыше 50 в сутки). Основным недостатком метода является отсутствие контроля за специфичностью анализа и качеством образца. Доказано наличие перекрестной реакции между поликлональными антихламидийными антителами, используемыми в ИФА, и липополисахаридами видов Acinetobacter, E. coli, Klebsiellа. При этом неизбежно появление ложноположительных результатов, особенно в цервикальных пробах. Чувствительность ИФА-диагностики составляет лишь 60-70%
Известны коммерческие ИФА-диагностикумы для обнаружения хламидий: CHLAMYDIAZYME, Abbot Laboratories (обнаружение Chlamydia trachomatis); IDEIA Chlamydia Test, Novo Biolabs, Inc. (обнаружение C. psittaci).
Известны коммерческие ИФА-диагностикумы для обнаружения хламидий: CHLAMYDIAZYME, Abbot Laboratories (обнаружение Chlamydia trachomatis); IDEIA Chlamydia Test, Novo Biolabs, Inc. (обнаружение C. psittaci).
Для непосредственного обнаружения хламидий в образцах, полученных от пациентов, используют моноклональные или поликлональные антитела к специфическим антигенам C. trachomatis, меченные флуоресцентным красителем. При этом обнаруживаются внеклеточные возбудители (элементарные тельца) и возбудители, локализованные в цитоплазме (ретикулярные тельца).
Главным достоинством метода ИФА, кроме простоты и скорости проведения, является возможность оценить качество клинического материала, представленного для анализа, и оценка ряда цитологических аспектов, например, внутриклеточной локализации возбудителя.
Существуют несколько коммерческих ИФ-диагностических наборов для клинической практики: Syva Microtrak, Chlamydia Direst IF bioMerieux, Pathfinder, Kallestad, Chlamyset Antigen FА. Последний выбран нами в качестве прототипа для первого объекта. Набор Chlamyset Antigen FA состоит из следующих компонентов: флуоресцентного реагента, представляющего собой моноклональные антитела, меченные флуоресцентной меткой, и смешанного со специфическим красителем, растворителя (дистиллированная вода); покрывающей жидкости.
Объектом предлагаемого изобретения является иммунофлуоресцентный набор, не уступающий лучшим западным образцам. При создании набора основное внимание уделялось максимально широкому выбору специфических антигенов C. trachomatis. Были разработаны методы выделения этих антигенов и оптимальные условия иммунизации для получения высокоспецифических поликлональных антител основных компонентов набора.
Главными отличительными чертами рассматриваемого набора являются:
1. Высокая чувствительность системы из-за способности распознавать большой спектр специфических антигенов клеточной стенки C. trachomatis.
1. Высокая чувствительность системы из-за способности распознавать большой спектр специфических антигенов клеточной стенки C. trachomatis.
2. Стабильность и устойчивость биокомпонентов набора при длительном хранении.
3. Отсутствие ложноположительных результатов в силу ряда особенностей применяемых в наборе специфических иммуноглобулинов из куриного яичного желтка (IgY): низкая антигенная гомология IgY с антителами млекопитающих, отсутствие взаимодействия с белком A Staphylococcus aureus и т.д.
Специфические антитела распознают обе формы клеточного цикла хламидий элементарные и ретикулярные тельца. Обнаруживаются как живые, так и мертвые возбудители.
В случае обнаружения C. trachomatis в клинических образцах с помощью предлагаемого набора не требуется подтверждения результатов другими методами.
В состав диагностического набора входят:
1. антитела куриные к поверхностным антигенам C. trachomatis, лиофилизированные;
2. антитела козлиные к иммуноглобулинам курицы, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, лиофилизированные;
(и дополнительно может содержать)
3. стекла предметные с деколированными лунками для приготовления мазков;
4. зонды металлические с тампонами для взятия мазков.
1. антитела куриные к поверхностным антигенам C. trachomatis, лиофилизированные;
2. антитела козлиные к иммуноглобулинам курицы, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, лиофилизированные;
(и дополнительно может содержать)
3. стекла предметные с деколированными лунками для приготовления мазков;
4. зонды металлические с тампонами для взятия мазков.
В качестве второго объекта принят способ получения моноклональных антител к Сhlamydia trachomatis (патент РСТ, 86/02355, С 07 К 15/00, 1986). Способ заключается в том, что крыс иммунизируют культурой клеток Chlamydia trachomatis, селезенку иммунизированных крыс используют для получения гибридных клеток. Из культуральной жидкости выделяют антитела к Chlamydia trachomatis путем аффинной хроматографии.
Другим объектом изобретения является способ получения поликлональных куриных антител к поверхностным антигенам C. trachomatis c использованием приемов иммунизации кур и очистки антител путем экстракции декстрансульфатом или ПЭГ 6000 с последующей хроматографией на фенил-сефарозе или другом сорбенте с аналогичной функциональной группой. Способ заключается в том, что кур иммунизируют культурой Chlamydia trachomatis L2, выращенной в желточных мешках куриных эмбрионов. После иммунизации собирают яйца кур. Желтки собранных яиц отделяют, гомогенизируют в физиологическом растворе, осаждают липидную фракцию путем добавления декстрансульфата до конечной концентрации 0,5-1% или полиэтилегликоля молекулярной массы 4-6 тыс. (ПЭГ 4000-6000), центрифугирования и хроматографии полученного супернатанта на фенил-сефарозе или другом сорбенте с аналогичной функциональной группой. При этом:
а) процент разведения желтка при гомогенизации не существенен;
б) концентрация полиэтиленгликоля и декстрансульфата общепринята;
в) методика проведения хроматографии на фенил-сефарозе общепринята.
а) процент разведения желтка при гомогенизации не существенен;
б) концентрация полиэтиленгликоля и декстрансульфата общепринята;
в) методика проведения хроматографии на фенил-сефарозе общепринята.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Пример получения антител.
1. Выбор антигена.
В настоящее время описано 15 сероваров C. trachomatis, каждый из которых может иметь этиологическое значение в урогенитальной патологии. Антигенные компоненты, присущие серовару L2 (Infect. Immun. 1981, v. 31, p. 1161) представлены также и в других сероварах, что делает возможным использование штаммов серовара L2 для иммунизации животных и получения антител с широкой специфичностью в пределах вида C. trachomatis.
2. Получение хламидийного антигена для иммунизации кур.
В качестве антигена использовали культуру C. trachomatis L2 (Институт вирусологии им. Ивановского), пассированную в желточном мешке куриных эмбрионов. Контроль за продукцией хламидий осуществляли с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (моноклональные антитела "Сhlamyset", Orion). Желточные мешки, содержащие большое количество хламидий, гомогенизировали, готовили 40% -ную суспензию в 0,15 М растворе хлористого натрия, забуференном 0,01 М фосфата натрия, рН 7,4 (ФСБ). Суспензию центрифугировали при 900 g, 5оС 15 мин, удаляли слой липидов и дебрис, после чего вновь центрифугировали в том же режиме. Хламидии осаждали при 20.000 g, 5оС в течение 45 мин, ресуспендировали в ФСБ с 0,1% азида натрия и выдерживали при 5оС в течение 72 ч, что обеспечивало полную инактивацию хламидий.
Для удаления азида натрия повторяли центрифугирование при 20.000 g в течение 45 мин. Готовый для иммунизации хламидий антиген в виде 1%-ной суспензии в ФСБ хранили при минус 20оС.
3. Иммунизация кур хламидийным антигеном.
Для иммунизации использовали 140-дневных кур породы белый леггорн. Предварительно всех отобранных кур проверяли на наличие хламидийной инфекции (C. psittaci и C. trachomatis) с помощью непрямого иммунофлуоресцентного теста ("Chlamydia-Spot IF-Kit", bioMeriеux). Иммунизацию проводили внутримышечно в киль по 2 мл антигена с полным адъювантом Фрейнда (Difco). Иммунизацию трижды повторяли с интервалом 7 сут. Возможно использование другой схемы иммунизации. Титр антител из желточных мешков определяли иммуноферментным методом (см. раздел 4.1)).
4. Очистка куриных антител из желточного мешка
Стадии очистки IgY-антител включали следующие этапы:
1) преципитация лецитина декстрансульфатом 150 тыс. (конечная концентрация 0,5-1%) или полиэтиленгликолем 4-6 тыс. (конечная концентрация 2,5-10%);
2) гидрофобная хроматография IgY-антител на фенил-сефарозе;
3) гель-фильтрация антител на сефакриле S-300 (эта стадия не является обязательной).
Стадии очистки IgY-антител включали следующие этапы:
1) преципитация лецитина декстрансульфатом 150 тыс. (конечная концентрация 0,5-1%) или полиэтиленгликолем 4-6 тыс. (конечная концентрация 2,5-10%);
2) гидрофобная хроматография IgY-антител на фенил-сефарозе;
3) гель-фильтрация антител на сефакриле S-300 (эта стадия не является обязательной).
Количественное определение IgY на всех стадиях очистки проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в 96-луночных микроплатах (PVC microplate, activated; Flow Lab. ). Тестируемые фракции разводили до концентрации белка 50-100 мкг/мл в 0,15 М растворе хлористого натрия, забуференном 0,02 М раствором Трис-HСl, рН 7,4 (ТСБ). Эти разведенные фракции вносили по 100 мкл в лунки микроплат и сорбировали при 5oС в течение 16-18 ч, после чего платы трижды промывали ТСБ. Для блокировки неспецифических участков связывания в лунки вносили по 200 мкл 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на ТСБ, платы инкубировали при 37оС 60 мин, с последующей трехкратной промывкой ТСБ, содержащим 0,05% Твин-20. Затем платы заливали раствором IgG человека в ТСБ в концентрации 25 мкг/мл и инкубировали при 37оС в течение 2 ч. По окончании инкубации платы трижды промывали ТСБ с твином и заливали конъюгатом антител против IgG человека с пероксидазой хрена (ИЭМ им. Гамалея), приготовленного в рабочем разведении в ТСБ с твином и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с конъюгатом проводили при 37оС в течение 2 ч. После трехкратной отмывки ТСБ с твином в лунки вносили по 100 мкл субстрата (АВТS, Sigma, 200 мкг/мл в 0,1 М натрий-цитратном буферном растворе, рН 4,0). Платы помещали на встряхиватель и выдерживали при комнатной температуре 10-15 мин до появления зеленой окраски. Учет результатов проводили путем регистрации оптической плотности на многоканальном фотометре "Мультискан МСС" при длине волны 405 нм.
4.1. Преципитация лецитина
Были апробированы методы преципитации с применением декстрансульфата и полиэтиленгликоля 4000-6000. В первом случае желточные мешки гомогенизировали в четырех объемах ФСБ, к 10 мл эмульсии прибавляли 0,8 мл 10%-ного раствора декстрансульфата 150 тыс. (Loba Chemie) и 2 мл 1 М раствора хлористого кальция. Смесь выдерживали при комнатной температуре 15 мин, центрифугировали при 6000 об./мин 10 мин при 5оС супернатант диализовали против ФСБ и хранили при 5оС с добавлением 0,1% азида натрия.
Были апробированы методы преципитации с применением декстрансульфата и полиэтиленгликоля 4000-6000. В первом случае желточные мешки гомогенизировали в четырех объемах ФСБ, к 10 мл эмульсии прибавляли 0,8 мл 10%-ного раствора декстрансульфата 150 тыс. (Loba Chemie) и 2 мл 1 М раствора хлористого кальция. Смесь выдерживали при комнатной температуре 15 мин, центрифугировали при 6000 об./мин 10 мин при 5оС супернатант диализовали против ФСБ и хранили при 5оС с добавлением 0,1% азида натрия.
В соответствии с прописью второго метода желточные мешки гомогенизировали с четырьмя объемами ФСБ, к эмульсии прибавляли 10%-ный раствор полиэтиленгликоля 4-6 тыс. (Loba Chemie) до конечной концентрации 3% Смесь помещали на магнитную мешалку и выдерживали при комнатной температуре 1 ч и далее при 5оС в течение 16-18 ч. Преципитат удаляли центрифугированием при 10.000 об. /мин, 5оС, в течение 45 мин, к супернатанту добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,1% Препарат хранили при 5оС.
В модельных экспериментах показано, что оба метода позволяют количественно отделять IgY-антитела от лецитина и не влияют на активность антител. В дальнейшей работе, однако, в силу большей экономичности предпочтение было отдано методу ПЭГ-преципитации.
4.2. Хроматография IgY-антител на фенил-сефарозе.
Препарат антител после удаления лецитина наносили на колонку с фенил-сефарозой (Pharmacia LKB), уравновешенную ФСБ.
Хроматографию проводили при 5оС. Объем колонки подбирали из расчета 1 мл сефарозы на 2 мг белка. Скорость нанесения 25 мл/ч. После нанесения материала колонку промывали ФСБ, а затем 1/10 ФСБ. Эффективность промывки контролировали по оптической плотности элюата при 280 нм. Элюцию антител проводили дистиллированной водой. Собранный белок лиофилизировали.
4.3. Гель-фильтрация IgY-антител на сефакриле S-300.
Полученный на фенил-сефарозе белковый материал растворяли в 1 мл ФСБ и наносили на колонку с сефакрилом S-300 (Pharmacia LKB) размером 2,5 х 90 см, уравновешенную ФСБ. Хроматографию проводили при 5оС. Скорость потока 15 мл/ч. Белковые пики регистрировали по оптической плотности при 280 нм. Было найдено, что белок, выходящий с колонки в объеме, соответствующем молекулярной массе 150-180 kD, специфически взаимодействует с IgG антителами человека в ИФА и по электрофизическим свойствам совпадает с IgY-антителами.
Приведенная трехстадийная схема очистки куриных антител позволила получить нативный препарат иммуноглобулинов желточного мешка, степень чистоты которого составляла от 90 до 95% Выход IgY составлял около 0,5 мг из одного яйца.
П р и м е р 2. Подтверждение специфичности полученных антител.
Для оценки специфичности полученных куриных антител был использован иммуноферментный анализ, позволяющий количественно охарактеризовать перекрестные реакции антител с различными группами антигенов, а также иммунофлуоресцентная микроскопия модельных препаратов культуры HeLa, зараженной определенными инфекционными агентами.
1. Иммуноферментный анализ специфичности IgY-антител
В качестве антигенов использовали как суспензии микроорганизмов, так и фракционированные компоненты микробных клеток. Применявшиеся в работе штаммы и их характеристики представлены в табл. 1. Свежие культуры смывали с агаровой среды холодным ТСБ, содержащим 0,1% азида натрия. Культуры центрифугировали при 10.000 об./мин 5оС в течение 30 мин, трижды промывали в холодном ТСБ и ресуспендировали в том же буферном растворе. Бульонные культуры микоплазм и уреаплазм центрифугировали при 12.000 об./мин 5оС в течение 60 мин, после чего промывали, как описано выше. Препараты клеток S. aureus, содержащих белок А (Стафилококковый реагент, НИИЭМ им. Пастера, Ленинград; Пансорбин, Sigma), суспендировали в дистиллированной воде, центрифугировали, как предыдущие бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% NP-40, после чего дважды промывали в ТСБ, содержащем 1,5 мМ хлористого натрия, и суспендировали в этом же буферном растворе. Оптическую плотность суспензий микрооорганизмов доводили с помощью стеклянного стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича) до концентрации, соответствующей 10 млн. микробных тел в 1 мл.
В качестве антигенов использовали как суспензии микроорганизмов, так и фракционированные компоненты микробных клеток. Применявшиеся в работе штаммы и их характеристики представлены в табл. 1. Свежие культуры смывали с агаровой среды холодным ТСБ, содержащим 0,1% азида натрия. Культуры центрифугировали при 10.000 об./мин 5оС в течение 30 мин, трижды промывали в холодном ТСБ и ресуспендировали в том же буферном растворе. Бульонные культуры микоплазм и уреаплазм центрифугировали при 12.000 об./мин 5оС в течение 60 мин, после чего промывали, как описано выше. Препараты клеток S. aureus, содержащих белок А (Стафилококковый реагент, НИИЭМ им. Пастера, Ленинград; Пансорбин, Sigma), суспендировали в дистиллированной воде, центрифугировали, как предыдущие бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% NP-40, после чего дважды промывали в ТСБ, содержащем 1,5 мМ хлористого натрия, и суспендировали в этом же буферном растворе. Оптическую плотность суспензий микрооорганизмов доводили с помощью стеклянного стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича) до концентрации, соответствующей 10 млн. микробных тел в 1 мл.
В качестве фракцинированных антигенных компонентов микробных клеток использовались липополисахариды энтеробактерий и других грамотрицательных микроорганизмов/ а также преператы белков/ входящих в состав наружной мембраны (outer membrain proteins, OMP).
Положительным контролем во всех экспериментах служил хламидийный антиген/ полученный из культуры C. trachomatis L2, пассированный в желточном мешке куриного эмбриона (Ismunit), а также культура C. trachomatis L2, полученная пассированием на мышиных фибробластах L929 и инактивированная в 0/1 -ном растворе азида натрия. Коммерческий антиген использовался в концентрации по белку 10 мкг/мл/ суспензия C. trachomatis L2 в концентрации/ аналогичной для описанных выше бактериальных культур.
Анализ кривых титрования хламидийных IgY в ИФА позволяет сделать следующие выводы:
1) хламидийнае антитела с равной эффективностью взаимодействуют с антигеном L2 производства Ismunit/ так и с убитой культурой C. trachomatis L2, полученной пассированием на мышиных фибробластах; титр антител составляет в среднем 1:25000;
2) IgY-антитела не взаимодействуют с клетками S.aureus, что обусловлено отсутствием белок А-специфического рецептора в молекуле IgY;
3) перекрестные реакции IgY-антител с клетками E.coli, нейсерий (N.gonorrhoeae и B. catarrhalis)/ G.vaginalis, C.albicans, а также с микоплазмами (M.hominis и U.urealyticum) практически отсутствуют;
4) не обнаружено значимых иммунологических перекрестов между IgY-антигенами и LPS-антигеном E. coli и A.calcoaceticus, а также OMP-антигеном N. gonorrhoeae и В. catarrhalis.
1) хламидийнае антитела с равной эффективностью взаимодействуют с антигеном L2 производства Ismunit/ так и с убитой культурой C. trachomatis L2, полученной пассированием на мышиных фибробластах; титр антител составляет в среднем 1:25000;
2) IgY-антитела не взаимодействуют с клетками S.aureus, что обусловлено отсутствием белок А-специфического рецептора в молекуле IgY;
3) перекрестные реакции IgY-антител с клетками E.coli, нейсерий (N.gonorrhoeae и B. catarrhalis)/ G.vaginalis, C.albicans, а также с микоплазмами (M.hominis и U.urealyticum) практически отсутствуют;
4) не обнаружено значимых иммунологических перекрестов между IgY-антигенами и LPS-антигеном E. coli и A.calcoaceticus, а также OMP-антигеном N. gonorrhoeae и В. catarrhalis.
2. Изучение специфичности хламидийных IgY-антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции.
Для постановки РНИФ с хламидийными IgY-антителами готовили серию препаратов из культуры клеток HeLa, зараженной штаммами N. gonorrhoeae, G. vaginalis, M. hominis и U. uruealyticum. С этой целью клетки HeLa культивировали в среде N 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой на покровных стеклах в чашках Петри в течение 2 суток до получения субконфлюентного монослоя, после чего к клеткам добавляли свежую культуру одного из перечисленных выше микроорганизмов, суспендированных в среде N 199. Посевная доза каждого из штаммов составляла 10 млн. клеток в 1 мл среды. Культивирование продолжали в течение 2 сут. затем препараты фиксировали 96%-ным этиловым спиртом. В качестве положительного контроля использовали клетки HeLa, зараженные штаммом С. trachomatis L2. Для получения контаминированной культуры трипсинизированную суспензию клеток HeLa (50 тыс. клеток в мл) в свежей среде N 199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки смешивали с 20%-ной взвесью инфицированных штаммом L2 желточных мешков куриных эмбрионов (на 10 мл клеточной суспензии брали 0,5 мл взвеси желточных мешков), центрифугировали при 3.000 g в течение 45 мин при комнатной температуре, клетки ресуспендировали в исходном объеме свежей среды и помещали в чашки Петри с покровными стеклами. Культивирование проводили при 37оС в течение 3 сут, после чего препараты фиксировали в 96%-ном этиловом спирте.
Для проведения РНИФ использовали хламидийные IgY, полученные методом ПЭГ-преципитации, с титром 1:25.600 (определен в ИФА). Антитела разводили в ФСБ, содержащем 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, и наносили в объеме 50 мкл на фиксированные препараты культуры HeLa на покровных стеклах. Стекла помещали во влажную камеру и выдерживали при комнатной температуре 15 мин. Затем препараты промывали в проточной водопроводной воде, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Анти-IgY-ФИТЦ-конъюгат с титром 1: 204.800 (определен в ИФА) разводили 1:100 в ФСБ, содержащем 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5 мкг/мл бромистого этидия (Serva). Обработку препаратов конъюгатом проводили в тех же условиях, что и первичными антителами. Готовые препараты анализировали с помощью люминесцентного микроскопа Laboval 2a-fl (Carl Zeiss Jena) при увеличении 600 х 1350х. Для контроля контаминации культуры HeLa исследуемыми микроорганизмами препараты обрабатывали специфическими антителами гонококковыми, гарднереллезными и микоплаз- менными с последующим проявлением вторичными антителами. Результаты РНИФ представлены в табл. 2. Положительная реакция с хламидийными IgY-антителами наблюдалась только в препаратах HeLa, содержащих хламидии.
Суммируя данные по изучению специфичности хламидийных IgY-антител в ИФА и РНИФ, следует заключить, что в исследованных модельных системах IgY-антитела проявляют высокую избирательность; перекрестные иммунологические реакции, которые могли бы стать причиной ложно-положительных результатов, не выявлены.
П р и м е р 3. Иллюстрация использования набора.
Во флаконы с хламидийными антителами и ФИТЦ-мечеными козлиными антителами добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое, тщательно перемешивая при комнатной температуре в течение 2 мин. Растворенные препараты хранят при температуре 4оС не более 10 суток.
Стандартный образец хламидийной культуры (СОП) растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды.
На деколированную лунку предметного стекла для приготовления мазков, входящего в набор, наносят 30 мкл СОП, равномерно распределяют по поверхности лунки, подсушивают на воздухе и фиксируют в 96%-ном спирте этиловом ректификованном в течение 5 мин.
Для приготовления препаратов из зараженной хламидиями клеточной культуры используют линию HeLa, пассируемую в среде N 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в концентрации 10% Клинический материал от больных забирают, используя зонды металлические с тампонами для приготовления мазков, входящие в состав набора.
Клетки выращивали на покровных стеклах в чашках Петри в СО-инкубаторе при 37оС содержании СО в инкубаторе, равном 5% и влажности, равной 90% в течение 2 суток до формирования субконфлюентного монослоя. Для заражения клеток HeLa хламидиями готовят 10%-ную взвесь на среде N 199 желточных мешков куриных эмбрионов, в которых пассировали штамм С. trachomatis L2. Титр хламидий в суспензии должен составлять не менее 10 LD50/0,03 мл. Перед заражением клеток 10%-ную взвесь желточных мешков выдерживают при 4оС в течение 2 ч для осаждения грубодисперсных частиц. В чашках Петри с культурой НеLa удаляют половину объема питательной среды и заменяют ее на равный объем 10% -ной взвеси желточных мешков. Чашки Петри помещают в СО-инкубатор на 2 ч. Среду удаляют, клетки промывают один раз стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и заливают свежей питательной средой с сывороткой крупного рогатого скота в концентрации 10% Чашки Петри с культурой клеток помещают в СО-инкубатор на 2 суток. Среду удаляют, клетки на покровных стеклах фиксируют в 96%-ном спирте этиловом ректификованном в течение 5 мин. Препараты не зараженных хламидиями клеток HeLa на покровных стеклах готовят в аналогичных условиях.
Получают сыворотку от кроликов, иммунизированных СОП. Титр хламидийных антител, определенный с СОП иммуноферметным анализом, должен быть не ниже 1: 25600.
На фиксированные препараты клеток HeLa, зараженных штаммом Chlamydia trachomatis L2, микропипеткой наносят 30 мкл иммунной кроличьей сыворотки в разведении 1:100 в ФСБ. Стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.
Стекла промывают в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Контрольные препараты зараженных хламидиями клеток HeLa обрабатывают неимунной кроличьей сывороткой (см. выше),
Готовят разведение антител, начиная с разведения 1:2 до 1:32 в объеме 0,5 мл на ФСБ.
Готовят разведение антител, начиная с разведения 1:2 до 1:32 в объеме 0,5 мл на ФСБ.
На фиксированные препараты микропипеткой наносят 30 мкл раствора антител, стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.
Стекла промывают в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
На препараты микропипеткой наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченых козлиных антител, стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.
Стекла промывают.
На высушенные препараты наносят каплю водно-глицериновой смеси (к 1,0 мл дистиллированной воды добавляют 2,0 мл глицерина и перемешивают до получения однородного раствора), препараты накрывают покровными стеклами и микроскопируют в люминесцентном микроскопе типа ЛЮМАМ (ЛОМО) с водно-эммерсионым объективом (900х) и светофильтром типа ФСl-2 или ФСl-4.
* ФСБ: натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 0,36 г;
натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,15 г;
натрий хлористый 0,85 г;
Растворяют в 100,00 мл дистиллированной воды при перемешивании, рН 7,2 + 0,1. Коррекцию рН проводят раствором едкого натрия в концентрации 0,1 моль/л или соляной кислотой в концентрации 1 моль/л.
натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,15 г;
натрий хлористый 0,85 г;
Растворяют в 100,00 мл дистиллированной воды при перемешивании, рН 7,2 + 0,1. Коррекцию рН проводят раствором едкого натрия в концентрации 0,1 моль/л или соляной кислотой в концентрации 1 моль/л.
Реакция непрямой иммунофлуоресценции считается положительной, если в мазке наблюдается ярко-зеленое свечение хламидий. Титр антител, определенный с СОП, должен быть не менее 1:16. В препаратах культуры HeLa, зараженной хламидиями, должно наблюдаться ярко-зеленое свечение элементарных и ретикулярных телец, расположенных отдельно, на поверхности клеток или внутриклеточно. Клетки должны светиться оранжевым цветом. В препаратах культуры HeLa, не зараженной хламидиями, а также в культуре НеLa, зараженной хламидиями и обработанной кроличьей хламидийной сывороткой, зеленое свечение должно отсутствовать. Результат реакции иммунофлуоресценции с зараженной хламидиями культурой HeLa, обработанной неиммунной кроличьей сывороткой, должен быть положительным.
Клинические образцы были испытаны одновременно методом культуры клеток и предлагаемым набором. Чувствительность анализа составила около 90% специфичность 97% При сравнении с двумя коммерческими ИФ препаратами Orion Chlamyset и Chlamydia Direct IF bioMerieux получены идентичные результаты. Производилась проверка антител, входящих в состав набора, на наличие перекреста с антигенами возбудителей основных урогенитальных заболеваний. Перекрест не обнаружен ни с одним из данных видов микроорганизмов.
Испытания эффективности набора проводились на базе ряда клинических лабораторий. Для сравнения использовались моноклональные люминесцирующие антитела Chlamyset фирмы Orion, Финляндия. Хламидийная этиология заболеваний была установлена у 81% обследованных больных, из них в 94% с помощью предлагаемого набора и в 89% случаев с помощью финского набора Chlamyset. Причем у 5 из 102 больных хламидийная инфекция диагностирована только при помощи диагностикума Chlamyset, в то время, как у 9 пациентов положительный результат получен только с рассматриваемым набором.
Набор может быть использован не только для клинической диагностики, но и для определения антибиотикоустойчивости возбудителя путем обнаружения хламидийных телец в клеточной культуре, инфицированной клинической пробой и инкубированной с соответствующим антибиотиком.
Полученные клинико-лабораторные данные свидетельствуют о высокой диагностической эффективности рассматриваемого набора.
Claims (3)
1. НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ, содержащий антитела к поверхностным антигенам Chlamydia trachomatis, отличающийся тем, что дополнительно содержит козлиные антитела к иммуноглобулинам кур, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, а в качестве антител содержит поликлональные антитела с титром в ИФА 1:25000, полученные из желтков яиц кур, иммунизированных штаммом Chlamydia trachomatis12 и очищенных путем экстракции полиэтиленгликолем или декстрансульфатом с последующей хроматографией на фенилсефарозе.
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит стекла с деколированными лунками.
3. Набор по пп.1 и 2, отличающийся тем, что дополнительно содержит металлические зонды для приготовления мазков.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5054095 RU2042360C1 (ru) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Набор для выявления хламидийной инфекции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5054095 RU2042360C1 (ru) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Набор для выявления хламидийной инфекции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2042360C1 true RU2042360C1 (ru) | 1995-08-27 |
Family
ID=21609230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5054095 RU2042360C1 (ru) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Набор для выявления хламидийной инфекции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2042360C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2485972C1 (ru) * | 2011-11-15 | 2013-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных |
| RU2526131C2 (ru) * | 2008-04-30 | 2014-08-20 | Шанхай Зерун Биотек Ко., Лтд. | Белки лизиса клеток vero, способ их получения и набор для определения белков клетки-хозяина для клеток vero, содержащий белки лизиса |
| RU2562176C1 (ru) * | 2014-11-22 | 2015-09-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) | Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения днк |
-
1992
- 1992-07-06 RU SU5054095 patent/RU2042360C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chlamycet Antigen FA, 38145-5, Orion Diagnostica, Espoo Finland. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2526131C2 (ru) * | 2008-04-30 | 2014-08-20 | Шанхай Зерун Биотек Ко., Лтд. | Белки лизиса клеток vero, способ их получения и набор для определения белков клетки-хозяина для клеток vero, содержащий белки лизиса |
| RU2485972C1 (ru) * | 2011-11-15 | 2013-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных |
| RU2562176C1 (ru) * | 2014-11-22 | 2015-09-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) | Способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения днк |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vanrompay et al. | Serotyping of European isolates of Chlamydia psittaci from poultry and other birds | |
| McKINNEY et al. | Recognition of a new serogroup of Legionnaires disease bacterium | |
| Verminnen et al. | Evaluation of a recombinant enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Chlamydophila psittaci antibodies in turkey sera | |
| Taylor et al. | Detection of experimental Chlamydia trachomatis eye infection in conjunctival smears and in tissue culture by use of fluorescein-conjugated monoclonal antibody | |
| US20100119549A1 (en) | Chlamydial antigens as reagents for diagnosis and treatment of chlamydial infection and disease | |
| KR101306610B1 (ko) | 로소니아 인트라셀룰라리스 진단 방법 | |
| CN112760294A (zh) | 犬i型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体、双抗夹心elisa试剂盒和应用 | |
| Dharakul et al. | Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by latex agglutination using lipopolysaccharide-specific monoclonal antibody. | |
| Barnes et al. | Detection of multiple serovars of Chlamydia trachomatis in genital infections | |
| Perez-Martinez et al. | Bovine chlamydial abortion: serodiagnosis by modified complement-fixation and indirect inclusion fluorescence tests and enzyme-linked immunosorbent assay | |
| RU2042360C1 (ru) | Набор для выявления хламидийной инфекции | |
| AU6663494A (en) | Chlamydia vaccine and process | |
| US20030003508A1 (en) | Serological diagnostic method with rickettsia pulicis bacterium | |
| WO2013097616A1 (zh) | 一种鉴定抗体敏感性和克隆细胞株的方法及试剂盒 | |
| Takahashi et al. | Immunotyping of Chlamydia psittaci by indirect immunofluorescence antibody test with monoclonal antibodies | |
| US5008186A (en) | Detection of unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease | |
| Edelstein | Detection of antibodies to Legionella | |
| Bencina et al. | Indirect immunoperoxidase assay for the detection of antibody in chicken Mycoplasma infections | |
| EP0827591A1 (en) | Method for diagnosing a patient for chlamydia | |
| EP0264434B1 (en) | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease | |
| Berkhoff et al. | Fluorescent antibody test in diagnosis of ulcerative enteritis | |
| RU2769578C1 (ru) | Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение | |
| KR101341994B1 (ko) | 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드 | |
| RU2305842C1 (ru) | Гемагглютинационный тест на основе рекомбинантного антигена для серодиагностики сифилиса | |
| MATSUNO et al. | Antigenic analysis of feline and bovine Chlamydia psittaci with monoclonal antibodies |