RU2039986C1

RU2039986C1 - Immunofluorescent method for concurrently determining antigens

Info

Publication number: RU2039986C1
Authority: RU
Inventors: А.П. Осипов; О.А. Пантелеев
Original assignee: Институт иммунобиотехнологии
Priority date: 1992-03-23
Filing date: 1992-03-23
Publication date: 1995-07-20

Abstract

FIELD: biological engineering; immunology. SUBSTANCE: method involves immobilization of antibodies and their treatment with marked antigen in the presence of the antigen to be determined. Antibody immobilization and their treatment is carried out in flow-through mode using fluorimetric cuvette with an optical path length being 0.005-0.1 mm. Variation coefficient of the results of analysis is equal to 10-15% EFFECT: enhanced accuracy in detecting the presence of antigens.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера флуоресцентных меток. The invention relates to biotechnology and can be used to determine biologically active substances using fluorescent labels as a marker.

Сущность конкурентного метода заключается в следующем. Используют меченый антиген, идентичный тому, который определяют в исследуемом препарате, и антисыворотку против данного антигена. В раствор, содержащий известное количество меченого антигена и недостаток по отношению к этому количеству специфических антител, добавляют раствор определяемого антигена. В результате конкуренции за связанные с находящимися в недостатке антителами доля меченых антигенов в составе иммунных комплексов понижается при увеличении содержания в растворе определяемого антигена. После установления в системе равновесия образовавшиеся иммунные комплекcы отделяют от cвободных компонентов одним из стандартных методов и измеряют флуоресценцию раствора или осадка. Количество исследуемого антигена определяют по калибровочной кривой. The essence of the competitive method is as follows. Use a labeled antigen identical to that determined in the study drug and antiserum against this antigen. A solution of a detectable antigen is added to a solution containing a known amount of labeled antigen and a disadvantage with respect to this number of specific antibodies. As a result of competition for antibodies associated with deficiencies, the proportion of labeled antigens in the composition of immune complexes decreases with an increase in the content of the detected antigen in the solution. After equilibrium is established in the system, the formed immune complexes are separated from the free components by one of the standard methods and the fluorescence of the solution or precipitate is measured. The amount of test antigen is determined by a calibration curve.

Наиболее близким к предлагаемому методу является конкурентный твердофазный способ проведения иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), согласно которому антитела против определяемого антигена адсорбционно иммобилизуют на поверхности водонерастворимого полимерного носителя (например, из полистирола, поливинилхлорида и т.д.) путем инкубации носителя в течение 2 ч в растворе антител с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Полученный носитель обрабатывают раствором, содержащим некоторое избыточное по отношению к антителам фиксированное количество определяемого антигена, меченного флуоресцентной меткой, например флуоресцеинизотиоцианатом, и неизвестное количество определяемого антигена, инкубируют в течение 1-24 ч (время установления равновесия в системе, которое зависит от природы антигена, концентрации компонентов, температуры, перемешивания и т.п.). Образующийся иммунный комплекс отделяют от растворимых компонентов реакции и многократно промывают водой для удаления несвязывающихся с носителем меченых и немеченых антигенов. Регистрируют флуоресцентный сигнал меченого соединения непосредственно с твердой поверхностью или предварительно переводя меченый компонент в раствор, десорбируя метку с поверхности носителя и определяя интенсивность флуоресценции раствора. В результате конкуренции между меченым и немеченым антигеном за связывание с активными центрами антител на полимерном носителе увеличение содержания немеченого антигена в образце приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции. Closest to the proposed method is a competitive solid-phase method for conducting immunofluorescence analysis (ELISA), according to which antibodies against the detected antigen are adsorptively immobilized on the surface of a water-insoluble polymer carrier (for example, from polystyrene, polyvinyl chloride, etc.) by incubating the carrier for 2 hours in antibody solution, followed by washing unbound antibodies. The resulting carrier is treated with a solution containing a certain excess of a fixed amount of the detectable antigen labeled with a fluorescent label, e.g. fluorescein isothiocyanate, and an unknown amount of the detectable antigen, incubated for 1-24 hours (equilibrium in the system, which depends on the nature of the antigen, component concentration, temperature, mixing, etc.). The resulting immune complex is separated from the soluble components of the reaction and repeatedly washed with water to remove labeled and unlabeled antigens that do not bind to the carrier. The fluorescent signal of the labeled compound is recorded directly with a solid surface or by first transferring the labeled component into the solution, desorbing the label from the surface of the carrier and determining the fluorescence intensity of the solution. As a result of competition between the labeled and unlabeled antigen for binding to the active sites of antibodies on a polymer carrier, an increase in the content of unlabeled antigen in the sample leads to a decrease in the fluorescence intensity.

Основными недостатками метода являются его многостадийность и длительность. Проведение анализа в несколько стадий, включающих разделение иммуносорбента и жидкой фазы, промывку и последующий перевод метки в раствор, приводит к методическому усложнению способа и увеличению продолжительности анализа, снижает его точность из-за вероятности случайных ошибок и возможной десорбции меченого компонента с иммуносорбента, делает чрезвычайно трудной возможность полной автоматизации анализа. Для обеспечения максимальной чувствительности и воспроизводимости анализ следует проводить в равновесном режиме. Для определения времени достижения равновесия в системе, которое зависит прежде всего от природы антигена, необходимо в каждом конкретном случае провести серию дополнительных экспериментов с различными периодами инкубации реагентов, что приводит как к увеличению продолжительности анализа, так и непроизводительному расходу реагентов. The main disadvantages of the method are its multi-stage and duration. The analysis in several stages, including the separation of the immunosorbent and the liquid phase, washing and subsequent transfer of the label into the solution, leads to a methodical complication of the method and an increase in the duration of the analysis, reduces its accuracy due to the likelihood of accidental errors and possible desorption of the labeled component from the immunosorbent, makes difficult opportunity to fully automate the analysis. To ensure maximum sensitivity and reproducibility, the analysis should be carried out in equilibrium. To determine the time to reach equilibrium in the system, which depends primarily on the nature of the antigen, it is necessary in each case to carry out a series of additional experiments with different incubation periods of the reagents, which leads to an increase in the duration of the analysis and unproductive consumption of reagents.

Кроме того, так как анализ является гетерогенным, то ввиду наличия диффузионных затруднений при взаимодействии антигена с иммобилизованными на твердом носителе антителами, время установления равновесия в системе составляет обычно несколько часов. Поэтому сам анализ является длительным и занимает несколько часов. In addition, since the analysis is heterogeneous, due to the presence of diffusion difficulties in the interaction of the antigen with antibodies immobilized on a solid support, the time to establish equilibrium in the system is usually several hours. Therefore, the analysis itself is lengthy and takes several hours.

Предлагаетcя способ проведения флуоресцентного иммуноанализа, предусматривающий иммобилизацию антител и обработку их меченым антигеном в присутствии определяемого антигена, иммобилизацию и обработку ведут в проточном режиме с использованием проточной флуориметрической кюветы с длиной оптического пути (толщиной) 0,005-0,1 мм. A method is proposed for conducting fluorescence immunoassay, which involves immobilizing antibodies and treating them with a labeled antigen in the presence of a detectable antigen, immobilizing and processing in a flow mode using a flow fluorimetric cell with an optical path length (thickness) of 0.005-0.1 mm.

Анализ осуществляют следующим образом. The analysis is as follows.

Через проточную флуориметрическую кварцевую кювету с длиной оптического пути 0,005-0,1 мм последовательно пропускают раствор специфических антител против определяемого антигена, буферный раствор и раствор, содержащий меченный флуоресцентной меткой определяемый антиген и свободный антиген, со скоростью не менее 0,3 мл/мин. Измеряют максимальную величину интенсивности флуоресценции, по величине которой по стандартной кривой рассчитывают искомую концентрацию определяемого антигена в растворе. A solution of specific antibodies against a detectable antigen, a buffer solution and a solution containing a detectable antigen and a free antigen labeled with a fluorescent label are sequentially passed through a flowing fluorimetric quartz cuvette with an optical path length of 0.005-0.1 mm at a rate of at least 0.3 ml / min. The maximum value of the fluorescence intensity is measured, according to the value of which, the standard concentration of the determined antigen in solution is calculated from the standard curve.

На первой стадии при прокачивании раствора антител через кювету происходит их адсорбционная иммобилизация на внутренних стенках кюветы. В качестве материала стенок кюветы могут быть использованы кварц, полистирол, поливинилтолуол или другие полимерные материалы. При прокачивании через кювету раствора с анализируемым и меченым образцом происходит сорбция меченого антигена на стенках кюветы, сопровождающаяся увеличением сигнала флуоресценции с поверхности кюветы. Так как толщина кюветы относительно мала (0,005-0,1 мм), а в объем проточной кюветы непрерывно вводятся новые порции меченого антигена с постоянной концентрацией, то сигнал, обусловленный меткой в растворе, будет постоянен и относительно мал (интенсивность флуоресценции пропорцио- нальна толщине слоя, через который проходит возбуждающий свет, а ее можно сделать относительно малой). С другой стороны, благодаря взаимодействию меченого антигена с антителами на поверхности стенок кюветы происходит постоянное накопление меченого антигена на стенках кюветы, приводящее к возрастанию интенсивности флуоресценции во времени. При толщине кюветы не больше 0,1 мм фоновый сигнал (соответствующий интенсивности флуоресценции в начальный момент времени и обусловленный меченым антигеном, находящимся в объеме кюветы) будет значительно меньше сигнала, обусловленного меченым антигеном, связанным на поверхности кюветы с антигеном. At the first stage, when pumping a solution of antibodies through a cuvette, they adsorb immobilized on the inner walls of the cuvette. As the material of the walls of the cell can be used quartz, polystyrene, polyvinyltoluene or other polymeric materials. When pumping a solution with an analyzed and labeled sample through a cuvette, sorption of the labeled antigen on the walls of the cuvette occurs, accompanied by an increase in the fluorescence signal from the surface of the cuvette. Since the thickness of the cuvette is relatively small (0.005-0.1 mm), and new portions of labeled antigen with a constant concentration are continuously introduced into the volume of the flow cell, the signal due to the label in the solution will be constant and relatively small (the fluorescence intensity is proportional to the thickness the layer through which the exciting light passes, and it can be made relatively small). On the other hand, due to the interaction of labeled antigen with antibodies on the surface of the walls of the cuvette, there is a constant accumulation of labeled antigen on the walls of the cuvette, leading to an increase in the fluorescence intensity over time. If the cell thickness is not more than 0.1 mm, the background signal (corresponding to the fluorescence intensity at the initial time and due to the labeled antigen in the cell volume) will be significantly less than the signal due to the labeled antigen bound to the surface of the cell with the antigen.

Выбор интервала толщины кюветы 0,005-0,1 мм обусловлен следующими причинами. При работе кюветы общий сигнал флуоресценции складывается из двух составляющих сигнала флуоресценции от адсорбированного на стенках кюветы меченого препарата и сигнала от меченого препарата, находящегося в растворе, причем последний сигнал тем меньше, чем меньше толщина кюветы. Так, например, в случае анализа белков расчет показывает, что при размерах кюветы 10 мм х 10 мм х 0,01 мм объем кюветы составляет 1 мкл, поэтому при концентрации анализируемого белкового препарата 1-10 мкг/мл в объеме кюветы постоянно находится 1-10 нг вещества, что значительно меньше максимальной удельной адсорбционной емкости поверхности кюветы (которая, например, в случае кварца или полистирола составляет ≈500 нг белка на см²).The choice of the interval of the thickness of the cell 0.005-0.1 mm due to the following reasons. During the operation of the cuvette, the total fluorescence signal consists of two components of the fluorescence signal from the labeled preparation adsorbed on the walls of the cuvette and the signal from the labeled preparation in solution, the last signal the smaller, the smaller the thickness of the cuvette. So, for example, in the case of protein analysis, the calculation shows that with a cell size of 10 mm x 10 mm x 0.01 mm, the volume of the cell is 1 μl, therefore, at a concentration of the analyzed protein preparation of 1-10 μg / ml, 1- 10 ng of substance, which is significantly less than the maximum specific adsorption capacity of the cell surface (which, for example, in the case of quartz or polystyrene is ≈500 ng of protein per cm ² ).

Использование кюветы с толщиной более 0,1 мм нецелесообразно, так как, во-первых, при больших концентрациях определяемого антигена сигнал, обусловленный меткой в растворе, становится сравнимым или больше сигнала адсорбиро- ванного меченого антигена, во-вторых, скорость взаимодействия меченого соединения с антителами сильно замедляется вследствие образования диффузионных ограничений при взаимодействии антигена из раствора с иммобилизованными на поверхности антителами. The use of a cuvette with a thickness of more than 0.1 mm is impractical, because, firstly, at high concentrations of the antigen being detected, the signal due to the label in the solution becomes comparable to or greater than the signal of the adsorbed labeled antigen, and secondly, the rate of interaction of the labeled compound with antibodies slows down significantly due to the formation of diffusion restrictions during the interaction of the antigen from the solution with antibodies immobilized on the surface.

Значение нижней границы толщины кюветы 0,005 мм обусловлено необходимостью создания большого давления насоса для прокачивания раствора через проточную кювету и уменьшением скорости прокачивания раствора через кювету при постоянном давлении перистальтического насоса. The value of the lower boundary of the cell thickness of 0.005 mm is due to the need to create a large pump pressure to pump the solution through the flow cell and to decrease the speed of pumping the solution through the cell at a constant pressure of the peristaltic pump.

Проведение стадий иммобилизации и обработки в проточном режиме позволяет существенно упростить методику проведения анализа. Несколько отдельных стадий (инкубацию носителя с антителами, промывку, инкубацию с определяемым и меченым антигеном, промывку) заменяют простым прокачиванием соответствующих растворов через кювету. Использование проточной кюветы с толщиной, не превышающей 0,1 мм, позволяет, во-первых, существенно снизить время установления равновесия в иммунохимической реакции (до нескольких минут), так как при прокачивании раствора через кювету происходит интенсивное перемешивание раствора и снижаются диффузионные затруднения реакции, во-вторых, осуществлять непрерывную регистрацию кинетики накопления меченого соединения на стенках кюветы, так как ввиду малой толщины кюветы сигнал, обусловленный меткой в растворе, значительно меньше сигнала флуоресцентно меченного соединения, непосредственно связанного с твердой фазой. Carrying out the stages of immobilization and processing in the flow mode can significantly simplify the analysis methodology. Several separate stages (incubation of the carrier with antibodies, washing, incubation with detectable and labeled antigen, washing) are replaced by simple pumping of the appropriate solutions through a cuvette. The use of a flow cell with a thickness not exceeding 0.1 mm allows, firstly, to significantly reduce the time to establish equilibrium in the immunochemical reaction (up to several minutes), since when pumping the solution through the cell, the solution is intensively mixed and the diffusion difficulties of the reaction are reduced, secondly, to continuously record the kinetics of accumulation of the labeled compound on the walls of the cuvette, since, due to the small thickness of the cuvette, the signal due to the label in the solution is much smaller than the flux signal Orescently labeled compound directly bonded to the solid phase.

Таким образом, весь процесс определения сводится к прокачиванию раствора реагентов через проточную кювету флуориметра и непрерывной регистрации интенсивности флуоресценции в той же реакционной ячейке. Thus, the entire determination process boils down to pumping the reagent solution through the flow cell of the fluorimeter and continuously recording the fluorescence intensity in the same reaction cell.

Необходимо отметить, что кювета может быть как многоразового использования, так и одноразового. Кювета многоразового использования изготавливается из кислотостойкого материала, например кварца, и подвергается промывке кислотой для восстановления адсорбционных свойств, кювета одноразового использования может быть изготовлена из полимеров, например из полистирола. В варианте сменной кюветы одноразового использования возможна предварительная адсорбция соответствующих специфических антител на стенках кюветы. В таком случае определение антигена в анализируемой жидкости осуществляется в одну стадию путем введения анализируемой пробы в раствор в присутствии меченого антигена. It should be noted that the cell can be both reusable and disposable. The reusable cell is made of an acid-resistant material, such as quartz, and is washed with an acid to restore adsorption properties, the single-use cell can be made of polymers, for example, polystyrene. In the case of a disposable disposable cell, preliminary adsorption of the corresponding specific antibodies on the walls of the cell is possible. In this case, the determination of the antigen in the analyzed liquid is carried out in one stage by introducing the analyzed sample into the solution in the presence of labeled antigen.

Предложенный подход является универсальным и может быть применен для проведения анализа не только по конкурентной схеме, но и другим, в том числе в сандвич-варианте анализа поливалентных антигенов при использовании флуоресцентно меченых антител. Анализ в этом случае также можно осуществить в одну стадию без разделения реагентов путем введения в кювету анализируемого образца и флуоресцентно меченных антител и последующей непрерывной регистрацией кинетики комплексообразования меченых антител с антигенами, специфически адсорбированными на поверхности иммуносорбента. The proposed approach is universal and can be applied for analysis not only according to a competitive scheme, but also different, including in the sandwich version of the analysis of polyvalent antigens using fluorescently labeled antibodies. The analysis in this case can also be carried out in one step without separation of the reagents by introducing into the cuvette the analyzed sample and fluorescently labeled antibodies and subsequent continuous recording of the complexation kinetics of the labeled antibodies with antigens specifically adsorbed on the surface of the immunosorbent.

Источник света и фотоэлектрический умножитель в флуориметре могут располагаться как по одну сторону от одной из плоскостей кюветного отделения (например, под углом 90^о), так и по разные стороны (например, под углом 270^о), что позволяет при использовании светодиодов, фотодиодов и микропроцессорной техники проводить одновременные измерения в нескольких ячейках на различные антигены.The light source and the photoelectric multiplier in a fluorimeter may be located both on one side of one of the planes of the sample compartment (e.g., at an angle of ⁹⁰⁾ and on opposite sides (e.g., at an angle of ²⁷⁰ °), which allows the use of LEDs, photodiodes, and microprocessor technology to carry out simultaneous measurements in several cells for various antigens.

Таким образом, основным отличительным признаком предлагаемого способа является осуществление иммобилизации и обработки антителами, определяемым и меченым антигеном в проточной системе путем пропускания растворов через проточную кювету толщиной 0,005 мм 0,1 мм. Thus, the main distinguishing feature of the proposed method is the implementation of immobilization and antibody treatment, defined and labeled antigen in the flow system by passing solutions through a flow cell with a thickness of 0.005 mm 0.1 mm

Использование тонкослойной проточной кюветы обеспечивает достижение технического результата, который сводится к уменьшению числа стадий до одной и сокращению времени проведения анализа. The use of a thin-layer flow cell ensures the achievement of a technical result, which reduces to reducing the number of stages to one and reducing the analysis time.

П р и м е р 1. Получение стандартной кривой определения IgG человека с использованием флуоресцеиновой метки. PRI me R 1. Obtaining a standard curve for the determination of human IgG using a fluorescein tag.

Для адсорбции антител к IgG человека на стенках кюветы через проточную кювету флуориметра толщиной 0,16 мм прокачивают 1 мл раствора антител кролика против IgG человека в ФБС (0,05 М фосфатный буфер, рН 7,2, 0,14 М NaCl). Концентрация IgG составляет 10 мкг/мл, скорость прокачивания 20 мл/ч. Для промывки кюветы прокачивают 1 мл ФБС. To adsorb antibodies to human IgG on the walls of the cuvette, 1 ml of a solution of rabbit anti-human IgG antibodies in PBS is pumped through a 0.16 mm thick fluorimeter cuvette (0.05 M phosphate buffer, pH 7.2, 0.14 M NaCl). The concentration of IgG is 10 μg / ml, the pumping rate of 20 ml / h. To wash the cuvette, 1 ml of PBS is pumped.

Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный флуоресцеином IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции.A solution of 1 ml of PBS containing fluorescein-labeled human IgG (concentration 3 × 10 ⁻⁸ M) and a standard concentration of human IgG are passed through a cuvette. The maximum fluorescence intensity is measured.

Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации IgG человека в образце. A standard curve of the observed maximum fluorescence intensity versus human IgG concentration in the sample is constructed.

П р и м е р 2. Определение концентрации IgG в растворе с использованием меченного флуоресцеином антигена. PRI me R 2. Determination of the concentration of IgG in solution using fluorescein-labeled antigen.

Для определения концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,3 М NaCl), содержащего меченный флуоресцеином IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) добавляют 0,2 мл раствора IgG человека (с концентрацией 120 нМ, полученной путем разбавления раствора со стандартной концентрацией, определенной по оптической плотности), 1 мл полученного раствора пропускают через кювету согласно примеру 1. Концентрация IgG, определенная по калибровочной кривой, составляет 115 нМ.To determine the concentration of human IgG in the sample, 0.2 ml are added to 0.8 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7.2, 0.3 M NaCl) containing fluorescein-labeled human IgG (concentration 3 × 10 ^-8 M) ml of a human IgG solution (with a concentration of 120 nM obtained by diluting a solution with a standard concentration determined by optical density), 1 ml of the resulting solution was passed through a cuvette according to Example 1. The concentration of IgG determined from the calibration curve was 115 nM.

Кювету отмывают 2% -ным раствором бихромата калия в серной кислоте. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов, определенный для одной серии определений, составляет 10-15%
П р и м е р 3. Определение концентрации тироксина в растворе.The cuvette is washed with a 2% solution of potassium dichromate in sulfuric acid. The immobilization of antibodies and the determination of IgG in the same solution are repeated. The coefficient of variation of the results, defined for one series of definitions, is 10-15%
PRI me R 3. Determination of the concentration of thyroxine in solution.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют антитела кролика против тироксина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл ФБС, содержащего меченный флуоресцеином тироксин в концентрации 10^-8 М и стандартную концентрацию тироксина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации тироксина в образце.Rabbit anti-thyroxin antibodies were immobilized on the walls of a flow cell with a thickness of 0.01 mm according to Example 1. 1 ml of PBS containing fluorescein-labeled thyroxin at a concentration of 10 ^-8 M and a standard concentration of thyroxine were passed through the cuvette. A standard curve of the observed maximum fluorescence intensity versus thyroxine concentration in the sample is constructed.

Для определения содержания тироксина в неизвестном образце сыворотки крови 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый тироксин в концентрации 10^-8 (0,06 М, рН 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции (через интервал времени ≈2 мин), концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов анализа для одной серии измерений ≈15%
П р и м е р 4. Определение концентрации инсулина.To determine the thyroxine content in an unknown serum sample, 0.2 ml of the sample is added to 0.8 ml of phosphate buffer containing labeled thyroxin at a concentration of 10 ^-8 (0.06 M, pH 7.2, 0.18 M NaCl) and 1 ml of the resulting solution is passed through a flow cell. The maximum fluorescence intensity is measured (after a time interval of ≈2 min), the concentration is calculated according to a standard curve. Coefficient of variation of the analysis results for one series of measurements ≈15%
PRI me R 4. Determination of the concentration of insulin.

На стенках проточной кюветы толщиной 0,02 мм иммобилизуют антитела кролика против инсулина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл раствора, содержащего меченный флуоресцеином инсулин в концентрации 2 ˙ 10^-8 М и стандартную концентрацию свободного инсулина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции (через промежуток времени 2 мин) от концентрации инсулина в образце.Rabbit anti-insulin antibodies were immobilized on the walls of a flow cell 0.02 mm thick according to Example 1. 1 ml of a solution containing fluorescein-labeled insulin at a concentration of 2 × 10 ^-8 M and a standard concentration of free insulin was passed through the cuvette. A standard curve is constructed that shows the observed maximum fluorescence intensity (after 2 minutes) on the insulin concentration in the sample.

Для определения содержания инсулина в неизвестном образце 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый инсулин в концентрации 2 ˙ 10^-8 М (0,06 М, рН 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции (через интервал времени ≈2 мин), концентрацию рассчитывают по стандартной кривой. Коэффициент вариации результатов анализа ≈15
П р и м е р 5. Определение IgG человека с использованием меченного родамином В антигена.To determine the insulin content in an unknown sample, 0.2 ml of the sample is added to 0.8 ml of phosphate buffer containing labeled insulin at a concentration of 2 ˙ 10 ^-8 M (0.06 M, pH 7.2, 0.18 M NaCl) and 1 ml of the resulting solution was passed through a flow cell. The maximum fluorescence intensity is measured (after a time interval of ≈2 min), the concentration is calculated according to a standard curve. Coefficient of variation of the analysis results ≈15
PRI me R 5. Determination of human IgG using rhodamine B-labeled antigen.

На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный родамином В IgG человека (концентрация 3 ˙ 10^-8 М) и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют интенсивность флуоресценции во времени (длина волны возбуждения 550 нм, длина волны испускания 585 нм).On the walls of a flow fluorimetric cuvette with a thickness of 0.01 mm immobilized according to Example 1 rabbit antibodies against human IgG. A solution of 1 ml of PBS containing labeled human rhodamine B IgG (concentration 3 × 10 ^-8 M) and a standard concentration of human IgG are passed through a cuvette. The fluorescence intensity is measured over time (excitation wavelength 550 nm, emission wavelength 585 nm).

Для определения неизвестной концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,18М NaCl), содержащего меченный родамином В IgG человека, добавляют 0,2 мл раствора IgG человека (с концентрацией 120 нМ, полученной путем разбавления раствора со стандартной концентрацией, определенной по оптической плотности). 1 мл полученного раствора пропускают через кювету, обработанную раствором антител против IgG человека согласно примеру 1. Концентрация раствора IgG, определенная по калибровочной кривой, составляет 110 нМ. To determine the unknown concentration of human IgG in the sample, 0.2 ml of human IgG solution (with a concentration of human IgG) is added to 0.8 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7.2, 0.18 M NaCl) containing rhodamine labeled human IgG 120 nM obtained by diluting a solution with a standard concentration determined by optical density). 1 ml of the resulting solution was passed through a cuvette treated with an anti-human IgG antibody solution according to Example 1. The concentration of the IgG solution, determined from the calibration curve, was 110 nM.

Кювету отмывают 2%-ным раствором бихромата калия в серной кислоте и промывают буфером. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов для одной серии определений составляет 10-15%
П р и м е р 6. Определение IgG с использованием дансильной метки.The cuvette is washed with a 2% solution of potassium dichromate in sulfuric acid and washed with a buffer. The immobilization of antibodies and the determination of IgG in the same solution are repeated. The coefficient of variation of the results for one series of determinations is 10-15%
PRI me R 6. Determination of IgG using Danil label.

На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный диметиламинонафталин-5-сульфо- нилхлоридом (ДАНС) IgG человека (концентрация 5 ˙ 10^-8 М), и стандартную концентрацию IgG человека. Измеряют интенсивность флуоресценции во времени (длина волны возбуждения 360 нм, длина волны испускания 514 нм).On the walls of a flow fluorimetric cuvette with a thickness of 0.01 mm immobilized according to Example 1 rabbit antibodies against human IgG. A solution of 1 ml of PBS containing labeled human dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride (DANS) (concentration 5 × 10 ⁻⁸ M) and a standard concentration of human IgG are passed through a cuvette. The fluorescence intensity is measured over time (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 514 nm).

Для определения неизвестной концентрации IgG человека в образце к 0,8 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,2, 0,18М NaCl), содержащего данс-IgG человека, добавляют 0,2 мл раствора IgG человека, концентрацию которого необходимо определить. 1 мл полученного раствора пропускают через кювету, обработанную согласно примеру 1. По калибровочной кривой определяют неизвестную концентрацию раствора. To determine the unknown concentration of human IgG in the sample, 0.2 ml of human IgG solution, the concentration of which is necessary, is added to 0.8 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7.2, 0.18 M NaCl) containing human dans-IgG to determine. 1 ml of the resulting solution was passed through a cuvette treated according to Example 1. An unknown concentration of the solution was determined from the calibration curve.

Кювету отмывают 2%-ным раствором бихромата калия в серной кислоте. Повторяют иммобилизацию антител и определение IgG в том же растворе. Коэффициент вариации результатов для одной серии определений составляет 10-15%
Таким образом, предлагаемый метод может быть использован для количественного определения как низкомолекулярных соединений (гаптенов), так и высокомолекулярных, в том числе белков, гормонов, стероидов и т.д.The cuvette is washed with a 2% solution of potassium dichromate in sulfuric acid. The immobilization of antibodies and the determination of IgG in the same solution are repeated. The coefficient of variation of the results for one series of determinations is 10-15%
Thus, the proposed method can be used for the quantitative determination of both low molecular weight compounds (haptens) and high molecular weight compounds, including proteins, hormones, steroids, etc.

Предложенный метод приводит к существенному упрощению иммунофлуоресцентного анализа, сокращению числа его стадий, времени проведения. Метод может быть использован и в научном эксперименте для наблюдения за ходом протекания реакции антиген-антитело без какого-либо возмущающего воздействия на компоненты иммунохимической системы с целью изучения кинетических и термодинамических параметров, характеризующих лиганд-рецеп- торные взаимодействия. На основе предложенного метода могут быть созданы коммерческие наборы реагентов, позволяющие осуществлять иммунофлуоресцентный анализ в автоматическом режиме, что приведет к значительному удешевлению стоимости проведения единичного анализа. The proposed method leads to a significant simplification of immunofluorescence analysis, reducing the number of stages, time. The method can be used in a scientific experiment to monitor the progress of the antigen-antibody reaction without any disturbing effect on the components of the immunochemical system in order to study the kinetic and thermodynamic parameters characterizing ligand-receptor interactions. Based on the proposed method, commercial sets of reagents can be created that allow for immunofluorescence analysis in an automatic mode, which will lead to a significant reduction in the cost of a single analysis.

Claims

METHOD FOR COMPETITIVE IMMUNO-FLUORESCENT DETERMINATION OF ANTIGENS, which involves immobilizing specific antibodies on a solid phase, treating them with a known amount of fluorescently-labeled antigen and registering the fluorescence intensity on a solid phase, characterized in that the immobilization of antibodies and the processing of their antibodies by antigen are carried out through a fluorimetric cuvette with an optical path length of 0.005 0.1 mm, while processing immobilized antibodies and reg Solid phase fluorescence intensity is carried out simultaneously.