RU2031939C1

RU2031939C1 - Method of preparing of nutrient media base for microorganism cultivation

Info

Publication number: RU2031939C1
Application number: RU93016879A
Authority: RU
Inventors: Е.С. Гиршович; И.Ю. Сахаров; Г.А. Герасимова; Н.В. Козлова; А.А. Артюков; Ф.Е. Литвин
Original assignee: Научно-производственный центр "Гидробиос" Минздрава Российской Федерации
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 1995-03-27

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: for preparing of nutrient media preparing animal raw is hydrolyzed with collagenase preparation from trade crab hepatopancreas. Process is carried out at pH 7.0-9.5 and temperature 40-50 C for 3-6 h. EFFECT: improved method of nutrient media preparing. 3 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, получаемые по данному способу основы могут быть использованы в микробиологии, ветеринарии, медицине и т.п. The invention relates to medical biotechnology, the bases obtained by this method can be used in microbiology, veterinary medicine, medicine, etc.

Известны способы приготовления основ питательных сред для культивирования микроорганизмов путем ферментативного гидролиза животного сырья, например с помощью щелочных протеаз, таких как трипсин и папаин (см. "The Oxoid Manual of Culture Media Ingredients and Other Laboratory Services", Hampshire, 1982. Liver Digest Neutralised, code L27, p. 239; Tryptose, code L47, p. 244; Peptone Bacteriological, code L37 p. 240). В результате использования этих ферментов получают высококачественные основы питательных сред с высокой коммерческой ценностью. Known methods for preparing the basics of culture media for the cultivation of microorganisms by enzymatic hydrolysis of animal feed, for example using alkaline proteases such as trypsin and papain (see "The Oxoid Manual of Culture Media Ingredients and Other Laboratory Services", Hampshire, 1982. Liver Digest Neutralised , code L27, p. 239; Tryptose, code L47, p. 244; Peptone Bacteriological, code L37 p. 240). As a result of the use of these enzymes, high-quality nutrient media bases with high commercial value are obtained.

Однако использование в больших количествах остродефицитных протеаз сильно ограничивает возможности использования этих способов. Так, из-за отсутствия сырьевой базы в нашей стране такой препарат, как папаин не производится вовсе, а другая щелочная протеаза - трипсин, является дорогостоящим препаратом медицинского назначения и производится в недостаточных количествах. However, the use of large quantities of acute deficient proteases greatly limits the possibilities of using these methods. So, due to the lack of a raw material base in our country, such a drug as papain is not produced at all, and another alkaline protease, trypsin, is an expensive medical product and is produced in insufficient quantities.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является получение перевара Хоттингера - основы широкого спектра бактериологических питательных сред, путем ферментативного гидролиза животного сырья с помощью панкреатина, содержащегося в поджелудочной железе крупного рогатого скота (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О. М.: Медицина, 1982. The closest to the proposed technical essence is to obtain Hottinger digest - the basis of a wide range of bacteriological nutrient media, by enzymatic hydrolysis of animal raw materials using pancreatin contained in the pancreas of cattle (Handbook of microbiological and virological research methods. Edited by M. Birger. O. M.: Medicine, 1982.

По этому способу мясо, очищенное от жира и сухожилий, нарезают кусками примерно 1-2 см, опускают небольшими порциями в емкость с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей водопроводной воды и кипятят 45 мин. Мясо вынимают из бульона и пропускают через мясорубку. В бульоне устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш, охлаждают до 40^оС, затем добавляют измельченную поджелудочную железу или сухой панкреатин. После установления рН 7,8-8,0 смесь переносят в бутыль с плотной резиновой пробкой, добавляют хлороформ, несколько раз перемешивают и оставляют на 7-16 дн при комнатной температуре.According to this method, meat, cleaned of fat and tendons, is cut into pieces of about 1-2 cm, dipped in small portions into a container with a double amount (relative to the meat) of boiling tap water and boiled for 45 minutes. The meat is removed from the broth and passed through a meat grinder. The broth is adjusted to pH 8.0, minced meat is dropped there, cooled to 40 ^° C, then crushed pancreas or dry pancreatin are added. After setting the pH to 7.8-8.0, the mixture is transferred to a bottle with a tight rubber stopper, chloroform is added, it is mixed several times and left for 7-16 days at room temperature.

В результате получают жидкий гидролизат с содержанием 1,1-1,2% общего азота, 0,65-0,7% аминного азота, степень расщепления 55-60%. The result is a liquid hydrolyzate with a content of 1.1-1.2% of total nitrogen, 0.65-0.7% of amine nitrogen, the degree of cleavage of 55-60%.

Недостатком данного способа является большая длительность процесса, а также использование в больших количествах остродефицитного дорогостоящего препарата медицинского назначения - панкреатина. The disadvantage of this method is the long duration of the process, as well as the use in large quantities of an acute deficit expensive medical product - pancreatin.

Целью изобретения является получение основ питательных сред без снижения их качества с помощью щелочных протеаз, выделенных из нового сырьевого источника. The aim of the invention is to obtain the basics of nutrient media without reducing their quality using alkaline proteases isolated from a new raw material source.

Поставленная цель достигается тем, что измельченное животное сырье подвергают ферментативному гидролизу при рН 7,0-9,5 в течение 3-6 ч при 40-50^оС в присутствии препарата - коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых крабов, с последующим высушиванием гидролизата.The goal is achieved in that the crushed animal material was subjected to enzymatic hydrolysis at pH 7,0-9,5 for 3-6 hours at 40-50 ^{° C} in the presence of the drug - collagenase from the hepatopancreas of commercial crabs, followed by drying the hydrolyzate.

Коллагеназа представляет собой комплекс протеолитических ферментов, выделенных из гепатопанкреаса промысловых крабов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ, в том числе и белков (Sakharov I. , Litvin F.: Comp. Biochem. Physiol., 1990, v. 97B, p. 407-410). Collagenase is a complex of proteolytic enzymes isolated from the hepatopancreas of commercial crabs that catalyze the breakdown of intramolecular bonds of organic substances, including proteins (Sakharov I., Litvin F .: Comp. Biochem. Physiol., 1990, v. 97B, p. 407 -410).

Получаемый целевой продукт отвечает требованиям, предъявляемым к качеству аналогичных препаратов как по физико-химическим, так и биологическим характеристикам. The resulting target product meets the requirements for the quality of similar drugs in terms of physico-chemical and biological characteristics.

Приведенные выше технологические параметры обусловлены специфическими свойствами коллагеназы промысловых крабов, подобраны экспериментальным путем и являются оптимальными. В частности, проведение процесса ферментативного гидролиза при температуре выше 50^оС неосуществимо из-за инактивации фермента, а снижение рабочей температуры ниже 40^оС приводит к увеличению длительности процесса до 2 нед.The above technological parameters are due to the specific collagenase properties of commercial crabs, are selected experimentally and are optimal. In particular, conducting the enzymatic hydrolysis process at temperatures above 50 ° ^C is not feasible due to enzyme inactivation, and lower working temperature below ^{40 °} C results in an increase in the processing time up to 2 weeks.

В предлагаемом способе удается сократить длительность процесса гидролиза до 3-6 ч вместо 7-16 сут по способу-прототипу и заменить остродефицитные щелочные протеазы доступным ферментным препаратом, имеющим в нашей стране крупномасштабную сырьевую базу. Кроме того, используемый в предлагаемом способе ферментный препарат - коллагеназу промысловых крабов, получают из неутилизируемых отходов пищевой промышленности, что повышает рентабельность отрасли. In the proposed method, it is possible to reduce the duration of the hydrolysis process to 3-6 hours instead of 7-16 days by the prototype method and replace acute deficient alkaline proteases with an available enzyme preparation having a large-scale raw material base in our country. In addition, the enzyme preparation used in the proposed method, collagenase from commercial crabs, is obtained from non-utilizable wastes of the food industry, which increases the profitability of the industry.

Изобретение соответствует критерию "существенные отличия", так как не обнаружены известные технические решения, имеющие признаки, сходные с отличительными признаками указанного способа. The invention meets the criterion of "significant differences", since there are no known technical solutions having features similar to the distinguishing features of this method.

П р и м е р 1. 1 кг мясокостного фарша гренландского тюленя заливают водой, нагревают до 45-50^оС, устанавливают рН 7,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 6 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.EXAMPLE EXAMPLE 1 1 kg of minced meat and bone harp seal poured water, heated to 45-50 ^{° C,} adjusted to pH 7.5, added at the rate of collagenase crab 450-900 IU / kg feed and the hydrolysis is carried out for 6 hours At the end of the hydrolysis, the ballast proteins are removed from the liquid enzymatic hydrolyzate, filtered, the physicochemical quality indices are determined and dried in a spray dryer.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60%. Liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.6-0.7% of amine nitrogen, 1.1-1.4% of total nitrogen, the degree of cleavage up to 60%.

П р и м е р 2. 1 кг мясного фарша крупного рогатого скота заливают водой, нагревают до 45-50^оС, устанавливают рН 8,0, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 6 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.PRI me R 2. 1 kg of minced cattle meat is poured with water, heated to 45-50 ^about With, set the pH to 8.0, add crab collagenase at a rate of 450-900 IU / kg of raw material and carry out hydrolysis for 6 h. At the end of the hydrolysis, the ballast proteins are removed from the liquid enzymatic hydrolyzate, filtered, the physicochemical quality indicators are determined, and dried in a spray dryer.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,5-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60%. Liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.5-0.7% of amine nitrogen, 1.1-1.4% of total nitrogen, the degree of cleavage up to 60%.

П р и м е р 3. 1 кг мясокостного фарша гренландского тюленя заливают водой, нагревают до 40-45^оС, устанавливают рН 9,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 4 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.EXAMPLE EXAMPLE 3 1 kg of minced meat and bone harp seal poured water, heated to 40-45 ^{° C,} adjusted to pH 9.5, added at the rate of collagenase crab 450-900 IU / kg feed and the hydrolysis is carried out for 4 hours At the end of the hydrolysis, the ballast proteins are removed from the liquid enzymatic hydrolyzate, filtered, the physicochemical quality indices are determined and dried in a spray dryer.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 0,9-1,2% общего азота, степень расщепления до 65%. Liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.6-0.7% of amine nitrogen, 0.9-1.2% of total nitrogen, the degree of splitting up to 65%.

П р и м е р 4. 1 кг мясного фарша крупного рогатого скота заливают водой, нагревают до 40-45^оС, устанавливают рН 8,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 3 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.PRI me R 4. 1 kg of minced cattle meat is poured with water, heated to 40-45 ^about C, set to pH 8.5, add crab collagenase at a rate of 450-900 IU / kg of raw material and hydrolysis is carried out for 3 h. At the end of the hydrolysis, the ballast proteins are removed from the liquid enzymatic hydrolyzate, filtered, the physicochemical quality indicators are determined, and dried in a spray dryer.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,4-0,7% аминного азота, 0,9-1,2% общего азота, степень расщепления до 65%. Liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.4-0.7% of amine nitrogen, 0.9-1.2% of total nitrogen, the degree of splitting up to 65%.

П р и м е р 5. Способ осуществляют как описано в примере 1, но гидролиз проводят в течение 2,5 ч. PRI me R 5. The method is carried out as described in example 1, but the hydrolysis is carried out for 2.5 hours

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,2-0,3% аминного азота, 0,7-0,9% общего азота, что свидетельствует о недостаточном расщеплении исходного сырья. The liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.2-0.3% of amine nitrogen, 0.7-0.9% of total nitrogen, which indicates insufficient splitting of the feedstock.

П р и м е р 6. Способ осуществляют как описано в примере 1, но гидролиз проводят в течение 6,5 ч. PRI me R 6. The method is carried out as described in example 1, but the hydrolysis is carried out for 6.5 hours

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60% . Такие же показатели качества были получены при проведении гидролиза в течение 3-6 ч, т.е. увеличение времени гидролиза свыше этого срока нецелесообразно. Liquid enzymatic hydrolyzate obtained by the proposed method contains 0.6-0.7% of amine nitrogen, 1.1-1.4% of total nitrogen, the degree of cleavage up to 60%. The same quality indicators were obtained during hydrolysis for 3-6 hours, i.e. an increase in hydrolysis time beyond this period is impractical.

Для оценки основ питательных сред, полученных по предлагаемой технологии, по биологическим показателям они были использованы для приготовления бактериологических питательных сред. Контроль качества жидких и плотных питательных сред с этими основами проводился в соответствии с "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям" Минздрава СССР. - М.: 1980 г., и включал следующие тесты:
чувствительность роста;
эффективность роста;
показатель стабильности основных свойств микроорганизмов.To assess the basics of culture media obtained by the proposed technology, according to biological indicators, they were used to prepare bacteriological culture media. The quality control of liquid and dense nutrient media with these bases was carried out in accordance with the "Methodological recommendations for the control of nutrient media for biological indicators" of the USSR Ministry of Health. - M .: 1980, and included the following tests:
growth sensitivity;
growth efficiency;
an indicator of the stability of the basic properties of microorganisms.

В работе использованы тест-штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича: Corynebacterium xerosis 1911; Streptococcus pyogenes Dick 1; Shigella flexneri 1a N 8516; Salmonella typhi H 901 ГДР/ГИСК; Shigella sonney "S form"; Staphylococcus aureus 209p; Escherichia coli. In the work used test strains of gram-positive and gram-negative microorganisms obtained from GISK them. L.A. Tarasevich: Corynebacterium xerosis 1911; Streptococcus pyogenes Dick 1; Shigella flexneri 1a N 8516; Salmonella typhi H 901 GDR / GIS; Shigella sonney "S form"; Staphylococcus aureus 209p; Escherichia coli.

В качестве контроля были использованы среды на основе ферментативного гидролизата Хоттингера производства Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. As a control, we used media based on the Hottinger enzymatic hydrolyzate produced by the Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology N.F. Gamalei.

Чувствительность жидких и плотных питательных сред в отношении тест-штаммов микроорганизмов приведена в табл. 1 и 2. The sensitivity of liquid and solid nutrient media in relation to test strains of microorganisms is given in table. 1 and 2.

Как видно из приведенных данных, жидкие и плотные среды с использованием основ, полученных по предлагаемому способу, в отношении большинства испытанных тест-штаммов микроорганизмов более чувствительным (5 штаммов из 7 испытанных), а в отношении Salm. typhi и Sh. Sonney не уступают по чувствительности при сравнении с контрольной средой. Эта разница прослеживается более четко на жидких средах с предлагаемыми основами, чувствительность которых в отношении испытанных тест-штаммов микроорганизмов на порядок выше, чем контрольной среды. As can be seen from the above data, liquid and solid media using the bases obtained by the proposed method are more sensitive to most tested test strains of microorganisms (5 strains out of 7 tested), and to Salm. typhi and Sh. Sonney is not inferior in sensitivity when compared with the control environment. This difference can be traced more clearly on liquid media with the proposed bases, the sensitivity of which with respect to the tested test strains of microorganisms is an order of magnitude higher than that of the control medium.

Более детальное изучение плотных сред с основами, приготовленными по предлагаемой технологии, в отношении тест-штаммов Грам микроорганизмов показано (табл. 3), что при посевной дозе 100 микробных тел на экспериментальных средах вырастает такое же или большее количество колоний, чем на контрольной среде. A more detailed study of dense media with the bases prepared according to the proposed technology for test strains of Gram microorganisms shows (Table 3) that with a sowing dose of 100 microbial bodies, the same or more colonies grow on experimental media than on a control medium.

Колонии тест-штаммов микроорганизмов, вырастающие на экспериментальных средах, не уступают по размерам колониям, выраставшим на контрольной среде с гидролизатом Хоттингера. Colonies of test strains of microorganisms growing on experimental media are not inferior in size to the colonies growing on a control medium with a Hottinger hydrolyzate.

Культуры тест-штаммов, полученные на экспериментальных средах, были испытаны на сохранение основных культуральных, тинкториальных, морфологических и биохимических свойств, характерных для данного вида. Все испытанные тест-штаммы сохраняли свои культуральные, тинкториальные морфологические и биохимические свойства. The cultures of test strains obtained on experimental media were tested to preserve the basic cultural, tinctorial, morphological and biochemical properties characteristic of this species. All tested test strains retained their cultural, tinctorial morphological and biochemical properties.

Claims

METHOD FOR PRODUCING A NUTRIENT BASIS FOR CULTIVATION OF MICRO-ORGANISMS by hydrolysis of animal feed under the action of a proteolytic enzyme, characterized in that a collagenase preparation from the hepatopancreas of commercial crab is used as a proteolytic enzyme, and the hydrolysis is carried out at 40-50 ^° C and pH 7.0 - 9 5 for 3 to 6 hours