RU2022013C1

RU2022013C1 - Method for producing pectinesterase

Info

Publication number: RU2022013C1
Authority: RU
Inventors: Т.П. Широчина; В.Е. Филиппова; К.А. Калунянц; А.А. Кочеткова; Е.Ф. Шаненко
Original assignee: Московская государственная академия пищевых производств
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1989-07-26
Publication date: 1994-10-30

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves treating the solution of complex pectolytic ferment preparation in cathode space of diaphragm electrolyzer at a current density of 0,05-30,00 mА/cm² to pH 10.5-11.5, holding out, separation of sediment, bringing pH to 4.5-5.5 and extracting the target product. Solution of complex pectolytic ferment preparation is treated with aqueous solution of sodium salt of inorganic acid in a concentration of 0.3-2.0% . In above-mentioned pH interval the pectinesterase is stable and its yield is 56-67%. EFFECT: method ensures removal of alkali-labial proteins including polygalacturonasa with maximum preservation of pectinesterase in solution. 3 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству очищенного фермента пектинэстеразы (ПЭ), применяемого в кондитерской промышленности при производстве низкокалорийной продукции. The invention relates to biotechnology, namely the production of a purified enzyme pectin esterase (PE), used in the confectionery industry in the production of low-calorie products.

Цель изобретения - повышение выхода ПЭ. The purpose of the invention is to increase the yield of PE.

Способ заключается в обработке раствора комплексного пектолитического ферментного препарата в катодном прост- ранстве диафрагменного электролизера при плотности тока 0,05-30,00 мА/см² до достижения рН 10,5-11,5, выдерживании, отделении осадка, доведении рН до 4,5-5,5 и выделении целевого продукта, причем против раствора комплексного пектолитического ферментного препарата используют водный раствор натриевой соли неорганической кислоты в концентрации 0,3-2,0%.The method consists in processing a solution of a complex pectolytic enzyme preparation in the cathode space of a diaphragm electrolyzer at a current density of 0.05-30.00 mA / cm ² until reaching a pH of 10.5-11.5, aging, separating the precipitate, adjusting the pH to 4 5-5.5 and the selection of the target product, moreover, against the solution of the complex pectolytic enzyme preparation, an aqueous solution of the sodium salt of an inorganic acid in a concentration of 0.3-2.0% is used.

Обработку комплексного пектолитического ферментного препарата изменением рН до 10,5-11,5 проводят для инактивации и осаждения присутствующей в препарате полигалактуроназы (ПГ). Наложение постоянного электрического тока обеспечивает равномерный во всем объеме сдвиг рН ферментного раствора, изменение заряда белков, их агрегацию и выпадение в осадок, что обеспечивает удаление щелочелабильных белков, в том числе ПГ, при максимальном сохранении ПЭ в растворе. Processing a complex pectolytic enzyme preparation by changing the pH to 10.5-11.5 is carried out to inactivate and precipitate the polygalacturonase (PG) present in the preparation. The application of a constant electric current ensures a uniform pH shift of the enzyme solution throughout the entire volume, a change in the charge of the proteins, their aggregation and precipitation, which ensures the removal of alkaline labile proteins, including PG, with maximum PE storage in solution.

В указанном интервале рН ПЭ стабильная, и выход ее составляет 56-67%. In the indicated range, the pH of PE is stable, and its yield is 56-67%.

При рН ниже 10,5 уровень ПГ активности не удовлетворяет требованиям, предъявляемым потребителем к ферментному препарату ПЭ, так как содержание ПГ значительно превышает значение 0,5%. At a pH below 10.5, the level of GHG activity does not meet the requirements of the consumer for the enzyme preparation PE, since the GHG content significantly exceeds the value of 0.5%.

При рН выше 11,5 возрастает степень инактивации ПЭ в растворе по сравнению с рН 10,5-11,5, и таким образом уменьшается выход ПЭ в конечном препарате. At a pH above 11.5, the degree of inactivation of PE in solution increases compared to pH 10.5–11.5, and thus the yield of PE in the final preparation decreases.

Выбор плотности тока от 0,05 до 30 м А/см² необходим для того, чтобы ПЭ в растворе сохранилась в активном состоянии. При этом не наблюдается изменения структуры белковой молекулы, процесс идет равномерно, и температура ферментного раствора не превышает 35^оС, т.е. лежит в зоне термостабильности ПЭ.The choice of current density from 0.05 to 30 m A / cm ^{2 is} necessary so that the PE in the solution is preserved in the active state. Thus no change of structure of the protein molecule, the process goes uniformly, and the enzyme solution temperature does not exceed ^{35 °} C, e.g. lies in the zone of thermal stability of PE.

Снижение плотности тока менее 0,05 м А/см² ведет к замедлению или прекращению электролиза, и либо требуемое значение рН вообще не может быть достигнуто, либо достигается за счет значительного увеличения продолжительности процесса в несколько раз, что влечет за собой падение ПЭ активности в процессе обработки и становится экономически нецелесообразным.A decrease in current density of less than 0.05 m A / cm ² leads to a slowdown or termination of electrolysis, and either the desired pH value cannot be achieved at all, or is achieved due to a significant increase in the duration of the process by several times, which entails a drop in PE activity in processing process and becomes economically impractical.

Увеличение плотности тока свыше 30 м А/см² приводит к слишком быстрому изменению рН. В осадок помимо балластных белков выпадает ПЭ, снижается выход фермента. Кроме того, из-за высокой силы тока происходит перегрев ферментного раствора, что ведет к дополнительной инактивации ПЭ.An increase in current density above 30 m A / cm ² leads to a too rapid change in pH. In addition to ballast proteins, PE precipitates, and the enzyme yield decreases. In addition, due to the high current strength, the enzyme solution overheats, which leads to additional inactivation of PE.

Для осуществления процесса электрохимической обработки ферментного раствора со смещением рН до 10,5-11,5 необходимо процесс вести так, чтобы электролиз проводился против раствора солей неорганических кислот в концентрации 0,3-2,0%. При концентрации солей ниже 0,3% процессы электролитического изменения рН ферментного раствора или резко замедляются, или не идут совсем. При увеличении концентрации солей выше 2,0% неоправданно увеличивается расход реагентов, и в атмосферу выделяется повышенное количество газов. To carry out the process of electrochemical processing of an enzyme solution with a pH shift of 10.5–11.5, it is necessary to conduct the process so that electrolysis is carried out against a solution of inorganic acid salts at a concentration of 0.3–2.0%. When the salt concentration is below 0.3%, the processes of electrolytic changes in the pH of the enzyme solution either sharply slow down or do not go at all. With an increase in salt concentration above 2.0%, the consumption of reagents unreasonably increases, and an increased amount of gases is released into the atmosphere.

Раствор, содержащий комплекс пектолитических ферментов, из которого выделяют ПЭ, готовят экстракцией поверхностной культуры, содержащей пектолитические ферменты, или растворением готовых ферментных препаратов, полученных при поверхностном или глубинном культивиро- вании, или используют непосредственно культуральную жидкость, полученную после отделения биомассы. A solution containing a complex of pectolytic enzymes from which PE is isolated is prepared by extraction of a surface culture containing pectolytic enzymes, or by dissolving the finished enzyme preparations obtained by surface or deep cultivation, or directly using the culture fluid obtained after separation of the biomass.

Исходный ферментный раствор помещают в катодную камеру диафрагменного электролизера. В анодную камеру заливают раствор соли неорганической кислоты массовой концентрацией 0,3-2,0%, обеспечивающий смещение рН ферментного раствора в щелочную зону и протекание тока плотностью 0,05-30,00 мА/см². При электролитической обработке ферментного раствора рН ферментного раствора смещается в щелочную зону, и процесс электрообработки прекращают при достижении рН 10,5-11,5. Обработанный ферментный раствор выдерживают при температуре 4-35^о/С (оптимально 25-30^оС) в течение 0,5-4,0 ч (оптимально 1,5-2,5 ч), и сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией. Фильтрат, практически не содержащий ПГ, подкисляют соляной кислотой до рН 4,5-5,5 и ПЭ выделяют из раствора известным способом.The initial enzyme solution is placed in the cathode chamber of the diaphragm electrolyzer. A solution of an inorganic acid salt with a mass concentration of 0.3-2.0% is poured into the anode chamber, which provides a shift in the pH of the enzyme solution to the alkaline zone and the flow of current with a density of 0.05-30.00 mA / cm ² . During electrolytic processing of the enzyme solution, the pH of the enzyme solution is shifted to the alkaline zone, and the process of electric processing is stopped when the pH reaches 10.5-11.5. The treated enzyme solution is kept at a temperature of ^about 4-35 / C (optimum 25-30 ^{° C)} for 0.5-4.0 hours (optimally 1.5-2.5 h), and the formed precipitate is removed by centrifugation or filtration. The filtrate, practically free of PG, is acidified with hydrochloric acid to a pH of 4.5-5.5 and PE is isolated from the solution in a known manner.

П р и м е р 1. В катодную камеру диафрагменного электролизера наливают водную вытяжку поверхностной культуры Asрergillus foetidus М-45, в анодную камеру наливают 0,3%-ный водный раствор NaCl и подводят постоянный электрический ток плотностью 1,5 мА/см². Через 4 мин рН ферментного раствора достигает 10,5, и процесс электролитической обработки прекращают, ферментный раствор сливают из камеры, выдерживают при 35^оС в течение 0,5 ч, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и в надосадочной жидкости рН доводят до 5,5 раствором НСl. После обработки содержание
ПЭ = 5,3 ед/мл,
ПГ = 620 ед/мл.Example 1. In the cathode chamber of a diaphragm electrolyzer, an aqueous extract of a surface culture of Aspergillus foetidus M-45 is poured, a 0.3% aqueous NaCl solution is poured into the anode chamber, and a constant electric current of 1.5 mA / cm ^{2 is} supplied . After 4 minutes the pH of the enzyme solution reaches 10.5, and electrolytic processing is stopped, the enzyme solution is drained from the chamber, maintained at 35 ^{° C} for 0.5 hours, the resulting precipitate was removed by centrifugation and the supernatant pH adjusted to 5.5 with a solution of Hcl. After processing the content
PE = 5.3 u / ml
PG = 620 units / ml.

Выход ПЭ = 67,2%,
ПГ = 0,32%,
остаточная ПГ = 28%.PE yield = 67.2%,
GH = 0.32%,
residual GHG = 28%.

Величина остаточной ПГ характеризует изменение относительной вязкости 1% -ного пектинового раствора под действием возможных следов ПГ комплекса и должна варьироваться в препаратах ПЭ высокого качества в интервале от 0 до 40%. The value of residual GHG characterizes a change in the relative viscosity of a 1% pectin solution under the influence of possible traces of the GHG complex and should vary in high-quality PE preparations in the range from 0 to 40%.

П р и м е р 2. В катодную камеру диафрагменного электролизера заливают водную вытяжку поверхностной культуры А. foetidus М-45, а анодную камеру заливают 2,0% -ный водный раствор NaCl и подводят постоянный электрический ток плотностью 0,5 мА/см². Через 60 мин рН ферментного раствора достигает 11,5, и раствор сливают. Затем его выдерживают при 4^оС в течение 4 ч и отделяют сформировавшийся осадок фильтрацией, рН фильтрата устанавливают 4,5 с помощью раствора НСl. После обработки содержание
ПЭ = 4,6 ед/мл,
ПГ = 490 ед/мл.PRI me R 2. Into the cathode chamber of a diaphragm electrolyzer pour water extract of the surface culture of A. foetidus M-45, and the anode chamber is filled with a 2.0% aqueous solution of NaCl and direct current with a density of 0.5 mA / cm ² . After 60 minutes, the pH of the enzyme solution reaches 11.5, and the solution is drained. Then it was allowed to stand at ⁴ ° C for 4 hours and the formed precipitate was separated by filtration, the filtrate was adjusted pH 4.5 with HCl. After processing the content
PE = 4.6 u / ml
PG = 490 u / ml.

Выход ПЭ = 57,1%,
ПГ = 0,06%,
остаточная ПГ = 10%
Полученный препарат высокого качества.PE yield = 57.1%,
GH = 0.06%,
residual GHG = 10%
The resulting preparation is of high quality.

П р и м е р 3. Для электролитической обработки используют водную вытяжку поверхностной культуры А. foetidus и обрабатывают ее аналогично способу, описанному в примере 1, но в качестве анолита используют 1%-ный раствор NaCl. Процесс электролитической обработки проводят током плотностью 10,0 мА/cм² и прекращают его при достижении рН 11,0. Перед отделением осадка раствор выдерживают при 25^оС в течение 1,5 ч и рН раствора доводят с помощью НСl до рН 4,8.PRI me R 3. For electrolytic treatment using an aqueous extract of the surface culture of A. foetidus and process it similarly to the method described in example 1, but as anolyte using a 1% solution of NaCl. The electrolytic treatment process is carried out with a current density of 10.0 mA / cm ² and stop it when the pH reaches 11.0. Before separating the precipitate solution was kept at ²⁵ ° C for 1.5 h and the pH was adjusted with HCl to pH 4.8.

После обработки содержание
ПЭ = 5,5 ед/мл,
ПГ = 480 ед/мл.After processing the content
PE = 5.5 u / ml
GH = 480 units / ml.

Выход ПЭ = 62,7%,
ПГ = 0,01%,
остаточная ПГ = 6%.PE yield = 62.7%,
GH = 0.01%
residual GHG = 6%.

Полученный препарат высокого качества. The resulting preparation is of high quality.

В табл. 1 представлены данные, где в качестве раствора комплексного пектолитического ферментного препарата используют раствор Пектофоетидина П10х, выделенный из поверхностной культуры гриба А.foetidus. In the table. 1 shows data where, as a solution of a complex pectolytic enzyme preparation, a solution of Pectofoetidin P10x isolated from a surface culture of A.foetidus fungus is used.

В табл. 2 представлены данные, где в качестве раствора комплексного ферментного препарата используют культуральную жидкость, полученную при глубинном культивировании А. Joetidus - продуцента пектолитических ферментов. In the table. Figure 2 presents data where, as a solution of a complex enzyme preparation, the culture fluid obtained by deep cultivation of A. Joetidus, a producer of pectolytic enzymes, is used.

В табл.3 представлены данные, где в качестве комплексного пектолитического ферментного препарата используют раствор Пектофоетидина ГЗх. Table 3 presents data where a solution of Pectofoetidin Gxx is used as a complex pectolytic enzyme preparation.

Как видно из данных, описанных в примерах и приведенных в табл.1-3, предложенный способ получения ПЭ со следовыми количествами ПГ может быть использован для всех видов комплексных ферментных растворов. As can be seen from the data described in the examples and given in tables 1-3, the proposed method for producing PE with trace amounts of GHG can be used for all types of complex enzyme solutions.

Использование способа позволяет увеличить выход ПЭ до 56-67%, стабилизировать выход фермента из раствора комплексного пектолитического ферментного препарата и таким образом обеспечить более равномерный по составу конечный препарат; удешевить процесс за счет уменьшения расхода щелочи, использования экономически более дешевого и экологически более чистого процесса электролитической обработки, что в свою очередь ведет к уменьшению промышленных стоков и сокращению расходов на их очистку; использование ферментного препарата ПЭ в кондитерском производстве обеспечивает значительное снижение стоимости продукции; обработка высокометоксилированного цитрусового пектина, применяемого при получении мармеладов, ПЭ позволяет получить пектин, который желирует изделия до требуемой консистенции в присутствии меньшего количества сахара. Сокращение расхода последнего в мармеладах достигает 50%, и, соответственно, обеспечиваются значительная зкономия сахара, удешевление мармелада. Низкокалорийные, менее сладкие кондитерские изделия предназначены для широкого круга потребителей в соответствии с рекомендациями Института питания. Это является дополнительной профилактикой против ожирения; кроме того, само производство ПЭ по предлагаемому способу можно сделать замкнутым, безотходным, экологически чистым, если электроактивированный раствор соли, имеющий рН 1,1-1,5, использовать для обработки трудногидролизуемого сырья, которую обычно проводят при подготовке питательных сред для культивирования микроорганизмов на тех же микробиологических производствах. Using the method allows to increase the yield of PE to 56-67%, to stabilize the output of the enzyme from the solution of the complex pectolytic enzyme preparation and thus provide a more uniform composition of the final preparation; reduce the cost of the process by reducing the consumption of alkali, using an economically cheaper and more environmentally friendly process of electrolytic treatment, which in turn leads to a reduction in industrial effluents and a reduction in the cost of their treatment; the use of the enzyme preparation PE in the confectionery industry provides a significant reduction in the cost of production; processing highly methoxylated citrus pectin used in the preparation of marmalade, PE allows you to get pectin, which gels products to the desired consistency in the presence of less sugar. Reducing the consumption of the latter in marmalades reaches 50%, and, accordingly, provides significant savings in sugar, cheaper marmalade. Low-calorie, less sweet confectionery products are intended for a wide range of consumers in accordance with the recommendations of the Institute of Nutrition. This is an additional prevention against obesity; in addition, the production of PE according to the proposed method can be made closed, waste-free, environmentally friendly, if an electroactivated salt solution having a pH of 1.1-1.5 is used to treat difficult-hydrolyzable raw materials, which are usually carried out in the preparation of culture media for the cultivation of microorganisms on the same microbiological industries.

Claims

METHOD FOR PRODUCING PECTINESTERASE, which involves treating a solution of a complex pectolytic enzyme preparation to an alkaline pH, keeping it, separating the precipitate, adjusting the pH of the solution to 4.5-5.5 and isolating the target product, characterized in that, in order to increase the yield of the target product, processing complex pectolytic enzyme preparation is carried out in the cathode compartment of a diaphragm electrolytic cell at a current density of 0.05 - 30.00 mA / cm ² versus the aqueous solution of the sodium salt of an inorganic acid in conc ntratsii 0.3 - 2.0%.