RU2019123609A

RU2019123609A - Способ секвенирования на основе одного флуоресцентного красителя

Info

Publication number: RU2019123609A
Application number: RU2019123609A
Authority: RU
Inventors: Эркай ЛЮ; Ао ЧЭНЬ; Вэньвэй ЧЖАН; Сюнь СЮЙ
Original assignee: Еги Тек (Шэнь Чжэнь) Ко., Лимитед
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2021-02-01
Also published as: WO2018121587A1; CA3049667A1; US20190330693A1; EP3564387A4; CN110114476A; EP3564387A1; RU2019123609A3; CN110114476B; AU2017385424A1; AU2017385424B2; RU2760737C2; US11466318B2

Claims

1. Способ секвенирования молекулы нуклеиновой кислоты, включающий стадии:

(1) предоставления молекулы нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, которая прикреплена к основе, или прикрепления молекулы нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, к основе;

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и четырех соединений для того, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу; в которой четыре соединения представляют собой соответственно производные нуклеотидов A, (T/U), C и G, и обладают способностью комплементарного спаривания оснований; и каждое из четырех соединений имеет гидроксильную группу (-OH) в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы, которую защищают защитной группой; и первое соединение и третье соединение неспособны испускать флуоресцентный сигнал (например, не несут флуорофор), второе соединение способно испускать флуоресцентный сигнал (например, несут флуорофор), и четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал или испускает тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение (например, несет флуорофор, где флуорофор является таким же, как флуорофор во втором соединении; или флуорофор имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор во втором соединении);

(3) отжига праймера с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, где праймер служит в качестве начальной растущей нити нуклеиновой кислоты, и вместе с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, образует дуплекс, прикрепленный к основе;

(4) выполнения реакции полимеризации нуклеотидов с использованием полимеразы в условиях, позволяющих полимеразе осуществлять полимеризацию нуклеотидов, тем самым встраивая одно из четырех соединений на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты;

(5) (i) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал; или

(ii) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение и позволяет четвертому соединению испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение (например, посредством модификации четвертого соединения для того, чтобы нести флуорофор, где флуорофор представляет собой то же, что и флуорофор второго соединения, или имеет тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); после этого, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет третьему соединению испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение (например, посредством модификации третьего соединения для того, чтобы нести флуорофор, который представляет собой то же самое, что и флуорофор второго соединения, или имеет тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения) и способна удалять флуоресцентный сигнал четвертого соединения (например, удаляя флуорофор на четвертом соединении или гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором на четвертом соединении); и

(7) удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, способ дополнительно включает стадии:

(8) проведения обработки дуплекса или выращенной нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка способна удалять защитную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы в соединении, встроенном на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, и удаления флуоресцентного сигнала на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты, если присутствует; и

(9) удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии; и

(10) добавления полимеразы для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов и указанных четырех соединений для того, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу, и затем проведения стадий с (4) до (7);

необязательно, способ дополнительно включает следующую стадию (11):

(11) повторения стадий (8)-(10) один или несколько раз.

2. Способ по п. 1, включающий стадии:

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого, второго, третьего и четвертого соединений, которые имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу:

где Base1, Base2, Base3 и Base4 представляют 4 различных основания, и их выбирают из A, (T/U), C и G;

R₁ независимо выбирают из -H, монофосфатной группы (-PO₃H₂), дифосфатной группы (-PO₃H-PO₃H₂), трифосфатной группы (-PO₃H-PO₃H-PO₃H₂) и тетрафосфатной группы (-PO₃H-PO₃H-PO₃H-PO₃H₂);

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b и R_5b независимо представляют собой реакционноспособные группы, способные выполнять реакцию биоортогонального расщепления;

R_5a представляет собой реакционноспособную группу, способную выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования;

L1 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует;

L2 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует;

Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал;

R_7a представляет собой флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал (Dye₁), или реакционноспособную группу, способную выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования, или один элемент пары связывания;

и, Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

необязательно, между R_5b и R_7a, имеет место реакционноспособная группа R₈, способная выполнять третью реакцию биоортогонального лигирования;

(3) отжига праймера с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, где праймер служит в качестве начальной растущей нити нуклеиновой кислоты и образует дуплекс, прикрепленный к основе вместе с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию;

(5) (i) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, и R_7a представляет собой Dye₁, удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал; или

(ii) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал и R_7a представляет собой реакционноспособную группу, способную выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования, или представляет собой один элемент пары связывания, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение и позволяет R_7a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со или выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования со средством (например, другим элементом пары связывания или соединением, которое способно выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R_7a), несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); после этого, удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

где другой элемент пары связывания, несущий флуорофор, имеет структуру: R_7b-L-Dye₁; где R_7b представляет собой другой элемент пары связывания, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₁ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет другую структуру, но тот же спектр испускания, что и Dye; или

соединение, способное выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R_7a и несущее флуорофор, имеет следующую структуру: R_7b-L-Dye₁; где R_7b представляет собой группу, способную выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R_7a, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₁ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет другую структуру, но тот же спектр испускания, что и Dye;

(6) проведение обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении осуществлять первую реакцию биоортогонального лигирования со средством, несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий структуру, отличную от, но имеющий тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения), тем самым флуорофор в средстве вводят в третье соединение и заставляют третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка (i) позволяет R_5b в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым удаляя флуорофор в четвертом соединении, или (ii) позволяет R₈ в четвертом соединении вступать в реакцию с соединением, несущим гасящую группу, чтобы осуществлять третью реакцию ортогонального лигирования, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye1 в четвертом соединении; и

предпочтительно, способ дополнительно включает следующие стадии:

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a и R_4b осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым позволяя соединению, встроенному на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, иметь свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и, удаляя флуорофор на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a или R_4b), если присутствует;

(9) удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии;

(10) добавления полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого соединения, второго соединения, третьего соединения и четвертого соединения, тем самым образуя реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу, и последующего выполнения стадий (4)-(7);

предпочтительно, способ дополнительно включает стадию:

3. Способ по п. 1, который включает следующие стадии:

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого, второго, третьего и четвертого соединений, имеющих структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b и R_4c независимо представляют собой реакционноспособные группы, способные выполнять реакцию биоортогонального расщепления;

R_5a представляет собой один элемент первой пары связывания;

R_6a представляет собой (i) один элемент второй пары связывания и представляет собой один элемент третьей пары связывания; или

представляет собой (ii) только один элемент третьей пары связывания; и R_6a представляет собой Dye₁ или R_6a также связывают с -L3-Dye₁;

L3 представляет собой линкерную группу или отсутствует;

Dye и Dye₁ представляют флуорофоры, способные испускать флуоресцентный сигнал; и оба они имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

необязательно имеет место реакционноспособная группа R₈, способная выполнять реакцию биоортогонального лигирования между R_4c и R_6a;

(5) (i) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, R_6a представляет собой один элемент второй пары связывания, и между тем, оно также представляет собой один элемент третьей пары связывания, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение и позволяет R_6a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со средством (например, другим элементом второй пары связывания), несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий структуру, отличную от, но имеющий тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); после этого, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

другой элемент второй пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания и L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; или

(ii) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, R_6a представляет собой только один элемент третьей пары связывания, и R_6a представляет собой Dye₁ или также соединяют с -L3-Dye₁, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении специфически связываться с другим элементом первой пары связывания, несущим флуорофор, вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка (i) способна заставлять R_6a в четвертом соединении специфически связываться с другим элементом третьей пары связывания, несущим гасящую группу для того, чтобы гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂ в четвертом соединении, или (ii) способна заставлять R₈ в четвертом соединении для того, чтобы осуществлять реакцию ортогонального лигирования с соединением, несущим гасящую группу, чтобы гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂ в четвертом соединении,

другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет структуру: R_5b-L5-Dye₃; где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания и L5 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₃ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеет ту же структуру, что и флуорофор во втором соединении, или имеет другую структуру, но тот же спектр испускания; и,

другой элемент третьей пары связывания, несущий гасящую группу, имеет структуру: R_6c-L6-Que; где R_6c представляет собой другой элемент второй пары связывания и L6 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye₁ или Dye₂; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b или R_4c осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, что делает соединение, встроенное на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, содержащим свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу) и удаляя флуорофор на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a, R_4b или R_4c), если присутствует;

4. Способ по п. 1, включающий стадии:

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого соединения, второго соединения, третьего соединения и четвертого соединения, имеющего структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой (i) один элемент первой пары связывания и представляет собой один элемент второй пары связывания; или

представляет собой (ii) только один элемент второй пары связывания, и R_6a представляет собой Dye₁ или R_6a также связывают с -L3-Dye₁;

Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал; Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

необязательно имеет место реакционноспособная группа R₈, способная выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования между R_4c и R_6a;

(5) (i) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, R_6a представляет собой один элемент первой пары связывания и представляет собой один элемент второй пары связывания, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение, и позволяет R_6a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со средством (например, другим элементом первой пары связывания), несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); после этого, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет структуру: R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент первой пары связывания и L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет структуру, отличающуюся от Dye, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; или

(ii) если четвертое соединение не испускает тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, R_6a представляет собой только один элемент второй пары связывания и R_6a представляет собой Dye₁ или R_6a также связывают с -L3-Dye₁, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении осуществлять первую реакцию биоортогонального лигирования со средством, несущим флуорофор (например, тот же флуорофор, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий спектр испускания, тот же или по существу тот же, что и спектр испускания флуорофора второго соединения), тем самым вводя флуорофор в средстве в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка (i) способна заставлять R_6a в четвертом соединении специфически связываться с другим элементом второй пары связывания, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂ в четвертом соединении, или (ii) способна заставлять R₈ в четвертом соединении выполнять вторую реакцию ортогонального лигирования с соединением, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂, в четвертом соединении; где

другой элемент второй пары связывания, несущий гасящую группу, имеет структуру: R_6c-L'-Que; где R_6c представляет собой другой элемент второй пары связывания, L' независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye₁ или Dye₂; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b, R_4c осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым позволяя соединению, встроенному на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, иметь свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и удаления флуорофора на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a, R_4b или R_4c), если присутствует;

(10) добавления полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого соединения, второго соединения, третьего соединения и четвертого соединения, тем самым образуя реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу, и затем выполнения стадий (4)-(7);

5. Способ по п. 1 включающий стадии:

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и первого соединения, второго соединения, третьего соединения и четвертого соединения, имеющего структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно, чтобы тем самым формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал (Dye₁), реакционноспособную группу, способную выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования, и/или один элемент второй пары связывания;

L1 независимо представляют собой линкерную группу или отсутствуют;

L2 независимо представляют собой линкерную группу или отсутствуют;

Dye и Dye₁ представляют флуорофоры, способные испускать флуоресцентный сигнал; и Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

(5)(i) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, и R_6a представляет собой Dye₁, удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, цепь или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал; или

(ii) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал и R_6a представляет собой реакционноспособную группу, способную выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования, или один элемент второй пары связывания, проведения обработки дуплекса или растущей нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение, и позволяет R_6a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со или выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования со средством (например, другим элементом второй пары связывания или соединением, способным выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_6a), несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий спектр испускания, тот же или по существу тот же, что и спектр испускания флуорофора второго соединения); после этого удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

другой элемент второй пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_6b-L'-Dye₁; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L' независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₁ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет структуру, отличную от Dye, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; или

соединение, способное выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_6a и несущее флуорофор, имеет следующую структуру: R_6b-L'-Dye₁; где R_6b представляет собой группу, способную выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_6a, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₁ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет структуру, отличную от Dye, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении специфически связываться с другим элементом первой пары связывания, несущим флуорофор, чтобы вводить флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; где обработка (i) позволяет R_4c в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления для того, чтобы удалять флуорофор в четвертом соединении, или (ii) позволяет R₈ в четвертом соединении осуществлять вторую реакцию ортогонального лигирования с соединением, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ в четвертом соединении; где

другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_5b-L-Dye₂; где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, где флуорофор представляет собой то же, что и флуорофор второго соединения, или имеет спектр испускания, тот же или по существу тот же, что и флуорофор второго соединения; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a и R_4b осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым позволяя соединению, встроенному на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, иметь свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и удаления флуорофора на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a или R_4b), если присутствует;

предпочтительно способ дополнительно включает стадию:

6. Способ по п. 1, включающий стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент второй пары связывания, необязательно, R_6a представляет собой Dye₁ или также связывают в -L3-Dye₁;

Dye и Dye₁ представляют флуорофоры, способные испускать флуоресцентный сигнал; и оба имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

(5)(i) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение и позволяет R_6a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со средством (например, другим элементом второй пары связывания), несущим флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор во втором соединении); после этого, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

где другой элемент второй пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания и L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; между тем, R_6b представляет собой один элемент третьей пары связывания; или

(ii) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении для того, чтобы специфически взаимодействовать с/связываться с другим элементом первой пары связывания, несущим флуорофор, тем самым вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и обработка (i) позволяет R_6b специфически взаимодействовать с/связываться с другим элементом R_6c третьей пары связывания, тем самым диссоциируя конъюгат между R_6b и R_6a и заставляя четвертое соединение терять его флуорофор, или (ii) позволяет R₈ в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального лигирования с соединением, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂, в четвертом соединении; где

другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_5b-L5-Dye₃; где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания и L5 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₃ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, где флуорофор имеет ту же структуру, что и флуорофор во втором соединении, или имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор во втором соединении;

(7) удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе d, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

7. Способ по п. 1, включающий стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент первой пары связывания, необязательно, R_6a представляет собой Dye₁ или также связывают в -L3-Dye₁;

(5)(i) если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение, второе соединение и третье соединение и позволяет R_6a в четвертом соединении специфически взаимодействовать со/связываться со средством (например, другим элементом первой пары связывания), несущим флуорофор (например, флуорофор, который имеет ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет структуру, отличную от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); после этого удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс и растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

где другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент первой пары связывания и L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеет ту же структуру, что и Dye, или флуорофор имеет структуру, отличную от, но тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; между тем, R_6b представляет собой один элемент второй пары связывания; или

(ii) если четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс и растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении осуществлять первую реакцию биоортогонального лигирования со средством, несущим флуорофор (например, такой же флуорофор, как флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий спектр испускания, такой же или по существу такой же, как у флуорофора второго соединения), тем самым вводя флуорофор в средстве в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и обработка (i) позволяет R_6b специфически взаимодействовать с/связываться с другим элементом R_6c второй пары связывания, тем самым диссоциируя конъюгат между R_6b и R_6a и заставляя четвертое соединение терять его флуорофор, или (ii) позволяет R₈ в четвертом соединении осуществлять вторую реакцию биоортогонального лигирования с соединением, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye₁ или Dye₂, в четвертом соединении; где

другой элемент второй пары связывания, несущий гасящую группу, имеет следующую структуру: R_6c-L'-Que; где R_6c представляет собой другой элемент второй пары связывания, L' независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гастить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye₁ или Dye₂;

8. Набор, содержащий четыре соединения (т. е. первое, второе, третье и четвертое соединения), в котором:

четыре соединения представляют собой производные нуклеотидов A, (T/U), C и G, соответственно, и обладают способностью комплементарного спаривания оснований; и,

каждое из четырех соединений имеет гидроксильную группу (-OH) в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы, которое защищают защитной группой; и защитную группу можно удалять;

первое соединение и третье соединение неспособны испускать флуоресцентный сигнал (например, не несут флуорофор), второе соединение способно испускать флуоресцентный сигнал и четвертое соединение неспособно испускать флуоресцентный сигнал или способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение (например, несет флуорофор, где флуорофор является таким же, как флуорофор во втором соединении, или флуорофор имеет структуру, отличающуюся от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор во втором соединении); и,

третье соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, при обработке (например, за счет того, что третье соединение несет тот же флуорофор, что и флуорофор второго соединения, или за счет того, что третье соединение несет флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения);

где, если четвертое соединение не испускает тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, флуоресцентный четвертого соединения можно удалять при обработке (например, посредством удаления флуорофора или посредством гашения флуоресцентного сигнала, испускаемого флуорофором);

если четвертое соединение не испускает флуоресцентный сигнал, четвертое соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, после первой обработки (например, за счет того, что четвертое соединение несет тот же флуорофор, что и флуорофор второго соединения, или за счет того, что четвертое соединение несет флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения); и флуоресцентный сигнал четвертого соединения можно удалять после второй обработки (например, посредством удаления флуорофора или посредством гашения флуоресцентного сигнала, испускаемого флуорофором).

9. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентрый сигнал;

и Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но имеют один и тот же или по существу один и тот же спектр испускания;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий структуру, отличную от, но тот же или по существу тот же спектр испускания, что и у второго соединения), который способен выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор в третье соединение, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, которое позволяет R_5b в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым удаляя флуорофор в четвертом соединении;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, имеющий структуру, отличающуюся от, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения), который способен выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R_7a в четвертом соединении, или способен к специфическому связыванию с R_7a, тем самым вводя флуорофор в четвертое соединение, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее гаситель, которое способно выполнять третью реакцию биоортогонального лигирования с R₈ в четвертом соединении, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый четвертым соединением.

10. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b и R_4c независимо представляют собой реакционноспособную группу, способную выполнять реакцию биоортогонального расщепления;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и имеющий ту же структуру, что Dye, или имеющий структуру, отличную от Dye, но имеющий тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; R_6b в R_6b-L4-Dye₂ способен специфически взаимодействовать с/специфически связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₂) в четвертое соединение, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_5b-L5-Dye₃, где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L5 представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₃ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, предпочтительно, имеющий ту же структуру, что и флуорофор второго соединения (или имеющий структуру, отличную от флуорофора второго соединения, но имеющий тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор во втором соединении); R_5b в R_5b-L5-Dye₃ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye) в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_6b-L6-Que, где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L6 представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye; R_6b в R_6b-L6-Que способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя гасящую группу (Que) в четвертое соединение и гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором (Dye) в четвертом соединении;

11. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_5a представляет собой реакционноспособную группу, которая способна выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования;

R_6a представляет собой (i) один элемент первой пары связывания, и представляет собой один элемент второй пары связывания; или

представляет собой (ii) только один элемент второй пары связывания; и R_6a представляет собой Dye₁ или R_6a связывают с -L3-Dye₁;

Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал; Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру, или имеют различные структуры, но тот же или по существу тот же спектр испускания;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, который имеет ту же структуру, что Dye, или имеет структуру, отличную от Dye, но имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; R_6b в R_6b-L4-Dye₂ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₂) в четвертое соединение, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, который является таким же, как флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения), которое способно выполнять реакцию биоортогонального лигирования с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_6c-L'-Que, где R_6c представляет собой другой элемент второй пары связывания, L' представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, которая способна гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye; R_6c в указанном R_6c-L'-Que способен специфически взаимодействовать с/специфически связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя гасящую группу (Que) в четвертое соединение и гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором (Dye) в четвертом соединении;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее гаситель, который позволяет R₈ в четвертом соединении выполнять третью реакцию биоортогонального лигирования, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый в четвертом соединении.

12. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b, и R₆ независимо представляют собой реакционноспособную группу, способную выполнять реакцию биоортогонального расщепления;

R_6a представляет собой флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал (Dye₁), реакционноспособную группу, которая способна выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования, и/или один элемент второй пары связывания;

Dye и Dye₁ представляют флуорофоры, способные испускать флуоресцентный сигнал; и Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру, или имеют различные структуры, но тот же или по существу тот же спектр испускания;

необязательно, набор дополнительно содержит R_6b-L-Dye₁; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₁ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал, который имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет другую структуру, но тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; R_6b в R_6b-L-Dye₁ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₁) в четвертое соединение для того, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

необязательно, набор дополнительно содержит средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, который представляет собой то же самое, что и флуорофор во втором соединении, или флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения), которое способно выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_6a в четвертом соединении для того, чтобы вводить флуорофор в четвертое соединение для того, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_5b-L-Dye₂, где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, который предпочтительно представляет собой тот же флуорофор, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения; R_5b в R_5b-L-Dye₂ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₂) в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее гаситель, которое способно выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R₈ в четвертом соединении для того, чтобы гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый четвертым соединением;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, которое позволяет R_4c в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления для того, чтобы удалять флуорофор в четвертом соединении.

13. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент второй пары связывания, необязательно, R_6a представляет собой Dye₁ или связан с -L3-Dye₁;

Dye и Dye₁ представляют флуорофоры, способные испускать флуоресцентный сигнал; и Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но тот же или по существу тот же спектр испускания;

необязательно, набор дополнительно содержит R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал, который имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет другую структуру, но тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; R_6b в R_6b-L4-Dye₂ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₁) в четвертое соединение для того, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит другой элемент второй пары связывания, который способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6b для того, чтобы диссоциировать конъюгат, образуемый посредством R_6a и R_6b, тем самым заставляя четвертое соединение терять флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_5b-L5-Dye₃, где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L5 представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₃ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, который предпочтительно представляет собой тот же флуорофор, что и флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения; R_5b в R_5b-L5-Dye₃ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₃) в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

14. Набор по п. 8, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент первой пары связывания, необязательно, R_6a представляет собой Dye₁ или связан с -L3-Dye₁;

Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал; Dye и Dye₁ имеют одну и ту же структуру или имеют различные структуры, но тот же или по существу тот же спектр испускания;

предпочтительно, набор дополнительно содержит R_6b-L4-Dye₂; где R_6b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L4 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye₂ представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, который имеет ту же структуру, что и Dye, или имеет другую структуру, но тот же или по существу тот же спектр испускания, что и Dye; R_6b в R_6b-L4-Dye₂ способен специфически взаимодействовать с/связываться с R_6a в четвертом соединении, тем самым вводя флуорофор (Dye₁) в четвертое соединение для того, чтобы заставлять четвертое соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, который является таким же, как флуорофор второго соединения, или флуорофор, который имеет тот же или по существу тот же спектр испускания, что и флуорофор второго соединения), который способен выполнять первую реакцию биоортогонального лигирования с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, несущее гаситель, который способен выполнять вторую реакцию биоортогонального лигирования с R₈ в четвертом соединении, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый четвертым соединением;

предпочтительно, набор дополнительно содержит средство, которое позволяет R_4c в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым удаляя флуорофор в четвертом соединении.

15. Способ секвенирования молекулы нуклеиновой кислоты, включающий стадии:

(2) добавления праймера для инициации полимеризации нуклеотидов, полимеразы для осуществления полимеризации нуклеотидов и четырех соединений для того, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазу раствора и твердую фазу; где четыре соединения представляют собой производные нуклеотидов A, (T/U), C и G соответственно, и обладают способностью комплементарного спаривания оснований; и каждое из четырех соединений имеет гидроксильную группу (-OH) в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы, которую защищают защитной группой; и первое соединение и третье соединение неспособны испускать флуоресцентный сигнал (например, не несут флуорофор), второе соединение и четвертое соединение способны испускать один и тот же флуоресцентный сигнал (например, несут один и тот же флуорофор);

(3) отжиг праймера с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, где праймер служит в качестве начальной растущей нити нуклеиновой кислоты, и вместе с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, образует дуплекс, прикрепленный к основе;

(5) удаления фазы раствора реакционной системы на предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет третьему соединению испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение (например, посредством модификации третьего соединения для того, чтобы нести флуорофор, который представляет собой то же самое, что и флуорофор второго соединения) и способна удалять флуоресцентный сигнал четвертого соединения (например, удаляя флуорофор на четвертом соединении или гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором на четвертом соединении); и

(8) проведения обработки дуплекса или выращенной нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка способна удалять защитную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы в соединении, встроенном на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, и удаления флуоресцентного сигнала на дуплексе или растущей нить нуклеиновой кислоты, если присутствует; и

(10) добавления полимеразы для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов и указанных четырех соединений для того, чтобы формировать реакционную систему, содержащую фазую раствора и твердую фазу, и затем проведения стадий с (4) до (7);

предпочтительно, способ дополнительно включает стадию (11):

16. Способ по п. 15 дополнительно включает стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_5a представляет собой реакционноспособную группу, способную выполнять реакцию биоортогонального лигирования;

Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал; и второе и четвертое соединения содержат один и тот же флуорофор;

(5) удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, дуплекс или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал; или

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении осуществлять реакцию биоортогонального лигирования со средством, несущим флуорофор (например, флуорофор, такой же как флуорофор второго соединения), тем самым флуорофор в средстве вводят в третье соединение и заставляют третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка позволяет R_5b в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым удаляя флуорофор в четвертом соединении; и

17. Способ по п. 15 включает стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент второй пары связывания;

L3 независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует;

Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал; и, второе и четвертое соединение имеют один и тот же флуорофор;

(3) отжиг праймера с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, где праймер служит в качестве начальной растущей нити нуклеиновой кислоты и образует дуплекс, прикрепленный к основе вместе с молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении специфически связываться с другим элементом первой пары связывания, несущим флуорофор, вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка способна заставлять R_6a в четвертом соединении специфически связываться с другим элементом второй пары связывания, несущим гасящую группу, чтобы гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye в четвертом соединении, где

другой элемент первой пары связывания, несущий флуорофор, имеет структуру: R_5b-L-Dye; где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, и L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, и является таким же, как флуорофор во втором соединении; и,

другой элемент второй пары связывания, несущий гасящую группу, имеет структуру: R_6b-L6'-Que; где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, и L' независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b или R_4c осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, делая соединение, встроенное на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, имеющим свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и удаляя флуорофор на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a, R_4b или R_4c), если присутствует;

18. Способ по п. 15 включает стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_6a представляет собой один элемент пары связывания;

Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал; и второе и четвертое соединение имеет один и тот же флуорофор;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение, и позволяет R_5a в третьем соединении осуществлять реакцию биоортогонального лигирования со средством, несущим флуорофор (например, флуорофор, такой же как флуорофор второго соединения), тем самым вводя флуорофор в средстве в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и указанная обработка способна заставлять R_6a в четвертом соединении специфически связываться с другим элементом пары связывания, несущим гасящую группу, тем самым гася флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофором Dye в четвертом соединении; где

другой элемент пары связывания, несущий гасящую группу, имеет структуру: R_6b-L'-Que; где R_6b представляет собой другой элемент пары связывания, L' независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, способную гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b, R_4c осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым позволяя соединению, встроенному на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, иметь свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и удаляя флуорофор на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a, R_4b или R_4c), если присутствует;

19. Способ по п. 15 включает стадии:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a, R_4b и R₆ независимо представляют собой реакционноспособные группы, способные выполнять реакцию биоортогонального расщепления;

R_5a представляет собой один элемент пары связывания;

(5) удаления фазы раствора реакционной системы из предыдущей стадии, сохранения дуплекса, прикрепленного к основе, и обнаружения того, цепь или растущая нить нуклеиновой кислоты испускает флуоресцентный сигнал;

(6) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка не оказывает эффекта на первое соединение и второе соединение и позволяет R_5a в третьем соединении специфически связываться с другим элементом пары связывания, несущим флуорофор, чтобы вводить флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; где обработка позволяет R₆ в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления для того, чтобы удалять флуорофор в четвертом соединении, где

другой элемент пары связывания, несущий флуорофор, имеет следующую структуру: R_5b-L-Dye; где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L независимо представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, где флуорофор представляет собой то же, что и флуорофор второго соединения; и

(8) проведения обработки дуплекса или растущей нити нуклеиновой кислоты на предыдущей стадии в реакционной системе, содержащей фазу раствора и твердую фазу, где обработка позволяет R_3a, R_3b, R_3c, R_3d, R_4a и R_4b осуществлять реакцию биоортогонального расщепления, тем самым позволяя соединению, встроенному на 3'-конце растущей нити нуклеиновой кислоты, иметь свободную гидроксильную группу в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы (другими словами, превращая -OR_3a, -OR_3b, -OR_3c или -OR_3d (если присутствует) в свободную гидроксильную группу), и удаляя флуорофор на дуплексе или растущей нити нуклеиновой кислоты (другими словами, удаляя флуорофор, прикрепленный к R_4a или R_4b), если присутствует;

20. Набор, содержащий четыре соединения (т. е. первое, второе, третье и четвертое соединения), в котором:

каждое из четырех соединений имеет гидроксильную группу (-OH) в 3'-положении рибозы или дезоксирибозы, которую защищают защитной группой; и защитную группу можно удалять;

первое соединение и третье соединение неспособны испускать флуоресцентный сигнал (например, не несут флуорофор и второе соединение и четвертое соединение способны испускать один и тот же флуоресцентный сигнал (например, несут один и тот же флуорофор); и,

третье соединение способно испускать тот же флуоресцентный сигнал, что и второе соединение, при обработке (например, несет тот же флуорофор, что и второе соединение), и флуоресцентный четвертого соединения можно удалять при обработке (например, посредством удаления флуорофора или посредством гашения флуоресцентного сигнала, испускаемого флуорофором).

21. Набор по п. 20, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

R_5a представляет собой реакционноспособную группу, которая способна выполнять реакцию биоортогонального лигирования;

Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал; и второе и четвертое соединения содержат один и тот же флуорофор;

предпочтительно, набор дополнительно содержит: средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, такой же как второе соединение), которое способно выполнять реакцию биоортогонального лигирования с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор в третье соединение, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и/или средство, которое способно выполнять реакцию биоортогонального расщепления с R_5b в четвертом соединении, тем самым удаляя флуорофор четвертого соединения.

22. Набор по п. 20, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

предпочтительно, набор дополнительно содержит: R_5b-L-Dye, где R_5b представляет собой другой элемент первой пары связывания, L представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye представляет флуорофор, способный испускать флуоресцентный сигнал, который предпочтительно представляет собой флуорофор, такой же как флуорофор второго соединения; и/или набор дополнительно содержит R_6b-L'-Que, где R_6b представляет собой другой элемент второй пары связывания, L' представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, которая способна гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye.

23. Набор по п. 20, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV), соответственно:

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал; и, второе и четвертое соединения содержат один и тот же флуорофор;

предпочтительно, набор дополнительно содержит: средство, несущее флуорофор (например, флуорофор, такой же как флуорофор второго соединения), которое способно выполнять реакцию биоортогонального лигирования с R_5a в третьем соединении, тем самым вводя флуорофор в третье соединение для того, чтобы заставлять третье соединение испускать флуоресцентный сигнал; и/или, набор дополнительно содержит R_6b-L'-Que, где R_6b представляет собой другой элемент пары связывания, L' представляет собой линкерную группу или отсутствует; Que представляет гасящую группу, которая способна гасить флуоресцентный сигнал, испускаемый посредством Dye.

24. Набор по п. 20, где первое, второе, третье и четвертое соединения имеют структуры формулы (I), формулы (II), формулы (III) и формулы (IV):

где Base1, Base2, Base3 и Base4 представляют 4 различных основания, и их выбирают из A, (T/U), C и G, соответственно;

R₂ независимо выбирают из -H и -OH;

предпочтительно, набор дополнительно содержит: R_5b-L-Dye, где R_5b представляет собой другой элемент пары связывания, L представляет собой линкерную группу или отсутствует; Dye представляет флуорофор, который способен испускать флуоресцентный сигнал, и предпочтительно представляет собой флуорофор, такой же как флуорофор второго соединения; и/или набор дополнительно содержит средство, которое позволяет R₆ в четвертом соединении осуществлять реакцию биоортогонального расщепления для того, чтобы удалять флуорофор в четвертом соединении.

25. Набор по любому одному из пп. 8-14 или 20-24, который дополнительно содержит: средство и/или устройство для извлечения молекулы нуклеиновой кислоты из образца; средство для предварительной обработки молекулы нуклеиновой кислоты; основу для прикрепления молекулы нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию; средство для прикрепления (например, ковалентного или нековалентного прикрепления) молекулы нуклеиновой кислоты, подлежащей секвенированию, к основе; праймер для инициации полимеризации нуклеотидов; полимеразы для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов; один или несколько буферных растворов; один или несколько промывающих растворов; или любое их сочетание.