Claims (35)
1. Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа млекопитающего, включающий последовательное проведение следующих этапов:1. The method of obtaining tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymatous organ of a mammal, including the sequential carrying out of the following steps:
а) получение донорского материала в виде донорского органа или его части;a) obtaining donor material in the form of a donor body or part thereof;
б) фрагментацию донорского материала;b) fragmentation of donor material;
в) замораживание фрагментов и их последующее оттаивание;c) freezing of fragments and their subsequent thawing;
г) первоначальное измельчение фрагментов;d) initial grinding of fragments;
д) децеллюляризацию измельченных частиц;e) decellularization of crushed particles;
е) лиофилизацию измельченных частиц;e) lyophilization of the crushed particles;
ж) замораживание измельченных частиц;g) freezing the crushed particles;
з) последующее измельчение замороженных частиц до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм с получением образцов искомого матрикса;h) the subsequent grinding of the frozen particles to a size in the range from 50 to 300 μm to obtain samples of the desired matrix;
при этом сначала выполняют фрагментацию донорского материала, затем последовательно замораживают и оттаивают полученные фрагменты, далее проводят их первоначальное измельчение, после чего осуществляют децеллюляризацию измельченных частиц, затем выполняют их лиофилизацию и последующее измельчение в замороженном состоянии.at the same time, the donor material is first fragmented, then the obtained fragments are frozen and thawed, then their initial grinding is carried out, and then the crushed particles are decellularized, then they are lyophilized and subsequently crushed in a frozen state.
2. Способ по п. 1, в котором указанным млекопитающим является человек.2. The method according to claim 1, wherein said mammal is a human.
3. Способ по п. 2, в котором донорский орган представляет собой орган человека.3. The method according to p. 2, in which the donor organ is a human organ.
4. Способ по п. 1, в котором донорский орган является органом человека с диагностированной смертью мозга или биологической смертью.4. The method according to claim 1, wherein the donor organ is a human organ diagnosed with brain death or biological death.
5. Способ по п. 1, в котором при получении донорского материала сохраняют кровенаполнение его сосудов.5. The method according to p. 1, in which upon receipt of donor material retain the blood filling of its vessels.
6. Способ по п. 1, в котором донорский орган представляет собой печень, почку, легкое, поджелудочную железу, селезенку.6. A method according to claim 1, wherein the donor organ is a liver, kidney, lung, pancreas, spleen.
7. Способ по п. 1, в котором донорский материал представляет собой печень или ее часть и, по меньшей мере, 35% объема донорского материала поражено жировым гепатозом.7. The method according to claim 1, wherein the donor material is a liver or a portion thereof and at least 35% of the volume of donor material is affected by fatty hepatosis.
8. Способ по п. 7, в котором поражение жировым гепатозом составляет от 35% до 75% объема донорского материала.8. The method according to p. 7, in which the defeat of fatty hepatosis is from 35% to 75% of the volume of donor material.
9. Способ по п. 1, в котором при фрагментации донорского материала формируют фрагменты размером от 10 мм до 15 мм.9. The method according to claim 1, wherein during fragmentation of donor material fragments ranging in size from 10 mm to 15 mm are formed.
10. Способ по п. 1, в котором замораживание фрагментов донорского материала проводят при температуре от -30°С до -80°С.10. A method according to claim 1, wherein the freezing of fragments of donor material is carried out at a temperature of from -30 ° C to -80 ° C.
11. Способ по п. 1, в котором для сохранения после замораживания перед оттаиванием фрагменты выдерживают предпочтительно от 1 до 40 суток.11. A method according to claim 1, wherein for preserving after freezing, prior to thawing, the fragments are preferably kept from 1 to 40 days.
12. Способ по п. 1, в котором хранение фрагментов проводят при температуре от -30°С до -80°С.12. The method according to claim 1, in which the storage of fragments is carried out at a temperature of from -30 ° C to -80 ° C.
13. Способ по п. 1, в котором оттаивание фрагментов проводят при температуре от 35°С до 40°С.13. The method according to p. 1, in which the thawing of the fragments is carried out at a temperature of from 35 ° C to 40 ° C.
14. Способ по п. 1, в котором этап в) замораживание фрагментов и их последующее оттаивание повторяют, по меньшей мере, однократно.14. The method according to claim 1, wherein step c) freezing the fragments and their subsequent thawing is repeated at least once.
15. Способ по п. 1, в котором при первоначальном измельчении фрагментов получают частицы с размером от 0,5 мм до 5 мм.15. A method according to claim 1, wherein upon initial grinding of the fragments, particles with a size of from 0.5 mm to 5 mm are obtained.
16. Способ по п. 1, в котором децеллюляризацию измельченных частиц проводят путем последовательной инкубации в растворах детергентов с повышающейся концентрацией при перемешивании со скоростью от 2 до 500 оборотов в минуту.16. A method according to claim 1, wherein the decellularization of the crushed particles is carried out by successive incubation in solutions of detergents with increasing concentration with stirring at a speed of from 2 to 500 revolutions per minute.
17. Способ по п. 16, в котором в качестве растворов детергентов последовательно используют:17. The method according to p. 16, in which as solutions of detergents consistently use:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);a) 400-500 ml of a solution of PBS containing 1% Triton X 100 and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;b) 400-500 ml of PBS solution containing 2% Triton X 100 and 0.1% SDS;
в) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.c) 400-500 ml of PBS solution containing 3% Triton X 100 and 0.1% SDS.
18. Способ по п. 1, в характеризующийся тем, что после децеллюляризации проводят отмывку децеллюляризированных фрагментов от детергентов путем инкубации с 400-500 мл раствора PBS при их перемешивании с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки, сохраняя скорость перемешивания, которая применялась в процессе децеллюляризации.18. The method according to claim 1, characterized in that after decellularization, decellularized fragments are washed from detergents by incubating with 400-500 ml of PBS solution while mixing them with a threefold replacement of the solution with a fresh solution of the same composition once a day, while maintaining the stirring rate that was used in the decellularization process.
19. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при лиофилизации фрагментов их сначала замораживают в течение 4-8 часов при температуре от -40°С до -50°С, затем выдерживают при давлении от 2 Па до 100 Па с повышением температуры до 30-35°С в течение 18-48 часов.19. The method according to claim 1, characterized in that, when lyophilizing the fragments, they are first frozen for 4-8 hours at a temperature of from -40 ° C to -50 ° C, then kept at a pressure of from 2 Pa to 100 Pa with increasing temperature up to 30-35 ° C for 18-48 hours.
20. Способ по п. 1, в котором замораживание частиц перед их последующим измельчением до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм проводят до температуры жидкого азота.20. The method according to p. 1, in which the freezing of the particles before their subsequent grinding to a size in the range from 50 to 300 microns is carried out to the temperature of liquid nitrogen.
21. Способ по п. 1, в котором измельченный продукт до частиц размером в диапазоне от 50 до 300 мкм стерилизуют γ-облучением в дозе 15 кГр.21. A method according to claim 1, in which the crushed product to a particle size in the range from 50 to 300 microns is sterilized by γ-irradiation at a dose of 15 kGy.
22. Способ по п. 20, в котором после стерилизации продукт хранят при температуре от 4°С до 6°С.22. The method according to p. 20, in which, after sterilization, the product is stored at a temperature of from 4 ° C to 6 ° C.
23. Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа, полученный по любому из пп. 1-22.23. Tissue-specific matrix for tissue engineering parenchymatous organ, obtained according to any one of paragraphs. 1-22