RU2014084C1

RU2014084C1 - Method for preparation of virion herpetic vaccine

Info

Publication number: RU2014084C1
Authority: RU
Inventors: Игорь Феликсович Баринский; Раиса Яковлевна Подчерняева; Игорь Юрьевич Саркисов; Нина Александровна Шубина
Original assignee: Игорь Феликсович Баринский; Раиса Яковлевна Подчерняева; Игорь Юрьевич Саркисов; Нина Александровна Шубина
Priority date: 1991-12-28
Filing date: 1991-12-28
Publication date: 1994-06-15

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: microspheres as the beads 100-300 microns in size, mainly asymmetric 100-800 microns porous beads from denaturated collagen are used for virulent cell growth to prepare herpes simplex vaccine. The microspheres are mixed with a growth medium at a rate 5- 60 g/min and the resulting mixture is kept as the suspension. EFFECT: increased effectiveness. 3 cl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для производства вирионных инактивированных герпетических вакцин и диагностических препаратов. The invention relates to medicine, in particular to virology, and can be used for the production of virion inactivated herpetic vaccines and diagnostic preparations.

Известен способ получения субъединичной герпетической вакцины, заключающийся в том, что в роллерной бутыле на ее стеклянной поверхности в постоянно перемешиваемой среде Игла с 10% сывороткой эмбрионов телят выращивают монослой клеток MRC5. Клеточный монослой инфицируют вирусом простого герпеса (ВПГ-1), штамм Troisbell, с дозой 5,0 БОЕ/кл и после 24 ч инкубации при 37^оС проводят получение вирусного антигена, на основе которого готовят вакцину против простого вируса герпеса ВПГ-1 (см. патент США N 4816250, кл. 424-89, 1989).There is a method of obtaining a subunit herpetic vaccine, which consists in the fact that a monolayer of MRC5 cells is grown in a roller bottle on its glass surface in a constantly mixed medium. A needle with 10% serum of calf embryos is grown. The cell monolayer infected with herpes simplex virus (HSV-1) strain Troisbell, with a dose of 5.0 PFU / cell and 24 h after incubation at ³⁷ ° C virus antigen preparation is carried out, based on which the prepared vaccine against herpes simplex virus HSV-1 ( see U.S. Patent No. 4,816,250, CL 424-89, 1989).

В этом способе клетки и вирусы выращивают на поверхности роллерной бутыли, являющейся стационарным макроносителем. Ограниченная удельная поверхность макроносителя не обеспечивает достаточно больших урожаев клеток и вируса, что снижает эффективность процесса культивирования вируса этим способом и делает его технологически невыгодным при промышленном производстве вакцинных препаратов. In this method, cells and viruses are grown on the surface of a roller bottle, which is a stationary macrocarrier. The limited specific surface of the macrocarrier does not provide sufficiently large yields of cells and the virus, which reduces the efficiency of the process of cultivating the virus in this way and makes it technologically disadvantageous in the industrial production of vaccine preparations.

Известен способ культивирования клеток для получения вирусных препаратов на микроносителях, представляющих собой множество сферических микрочастиц (см. проспект фирмы "Pharmacia" "Microcarrier cell culture. Principles, methods", 1986, с. 26-31). A known method of culturing cells to obtain viral preparations on microcarriers, representing a lot of spherical microparticles (see prospectus of the company "Pharmacia" "Microcarrier cell culture. Principles, methods", 1986, S. 26-31).

Культивирование клеток на сферических микрочастицах значительно повышает удельную поверхность взаимодействия клеток с носителем, что увеличивает эффективность этого процесса, особенно, когда в процессе выращивания микрочастицы поддерживают в ростовой среде во взвешенном состоянии, как это имеет место в способе, описанном в Crepsi С., Immamura T. et al. "Biotechnol. Bioeng. ", 1981, v. 23, 12, 2673. Однако не известен положительный результат применения этого способа для получения герпетических вакцин. До настоящего времени во всех известных способах получения герпетических вакцин клетки и вирусы выращивались на стационарном макроносителе в роллерных бутылях. Culturing cells on spherical microparticles significantly increases the specific surface of the interaction of cells with the carrier, which increases the efficiency of this process, especially when microparticles are suspended in the growth medium during the growth process, as is the case with the method described in Crepsi C., Immamura T . et al. "Biotechnol. Bioeng.", 1981, v. 23, 12, 2673. However, the positive result of using this method to obtain herpetic vaccines is not known. To date, in all known methods for the preparation of herpetic vaccines, cells and viruses have been grown on a stationary macrocarrier in roller bottles.

Известен способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины "Lupidon H" (из ВПГ-I) и "Lupidon G" (из ВПГ-2), в котором вирусы выращивают на куриных эмбрионах (см. Scriba M. ж. "Med. Microbiol. Immunol. ", 1982, v. 171, р. 33-42). Выращивание вирусов простого герпеса 1 и 2 типов на куриных эмбрионах нетехнологично и потому не получило распространения. Кроме того, вакцина, полученная этим способом, содержит следы куриных белков, которые могут вызывать аллергические осложнения у вакцинированных людей. A known method of manufacturing an inactivated virion herpetic vaccine "Lupidon H" (from HSV-I) and "Lupidon G" (from HSV-2), in which viruses are grown on chicken embryos (see Scriba M. Zh. "Med. Microbiol. Immunol . ", 1982, v. 171, p. 33-42). The cultivation of herpes simplex viruses of types 1 and 2 on chicken embryos is not technologically advanced and therefore is not widespread. In addition, the vaccine obtained by this method contains traces of chicken proteins that can cause allergic complications in vaccinated people.

Известен способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины, созданной в научной лаборатории фирмы "Еli-Lilly" (Индианаполис, США) из ВПГ-1, выращенного в роллерных бутылях на стационарных носителях в культуре первичных почек кролика (см. Wise T.G. et al "I. Infect. Dis.", 1977, v. 136, р. 706-711). A known method of manufacturing an inactivated virion herpetic vaccine, created in the scientific laboratory of the company "Eli-Lilly" (Indianapolis, USA) from HSV-1, grown in roller bottles on stationary carriers in a culture of primary rabbit kidneys (see Wise TG et al "I. Infect. Dis. ", 1977, v. 136, p. 706-711).

Из-за технических трудностей получения большого количества антигена этим способом фирма прекратила выпуск вакцины. Due to technical difficulties in obtaining large amounts of antigen in this way, the company stopped producing vaccines.

За прототип принят способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины из вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, выращенных на поверхности роллерных сосудов, являющейся стационарным макроносителем, на культуре почек кролика (см. Андонов П. и др. "Вопросы вирусологии, 1979, N 6, с. 665-671). Поскольку в этом способе клетки и вирусы выращивают на стационарном макроносителе при постоянном перемешивании ростовой среды, то ему присущи те же недостатки, что и вышеописанным способом (ссылки 1, 5), а именно недостаточно высокий урожай вирусов и низкая производительность процесса выращивания, что делает невыгодным крупномасштабное, промышленное производство вакцины. The prototype adopted a method of manufacturing an inactivated virion herpetic vaccine from herpes simplex viruses of types 1 and 2 grown on the surface of roller vessels, which is a stationary macrocarrier, on a rabbit kidney culture (see Andonov P. et al. "Questions of Virology, 1979, No. 6, pp. 665-671). Since in this method cells and viruses are grown on a stationary macrocarrier with constant stirring of the growth medium, it has the same disadvantages as the method described above (references 1, 5), namely, the virus harvest is not high enough and low productivity of the growing process, which makes large-scale, industrial production of vaccines disadvantageous.

Задачей, на которую направлено заявляемое изобретение, является создание высокотехнологичного и высокопроизводительного способа получения герпетической вирионной инактивированной вакцины, пригодного для промышленного крупномасштабного ее производства. The task to which the claimed invention is directed is the creation of a high-tech and high-performance method for producing herpetic virionic inactivated vaccine suitable for industrial large-scale production.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения вирионной герпетической вакцины, заключающемся в образовании монослоя чувствительных клеток на носителе, помещенном в перемешиваемую ростовую среду, выращивании вируса, предварительно адаптированного к данной клеточной культуре, путем внесения инфицирующего материала, адсорбции вирусов на клетках, инкубировании инфицированных клеток в среде поддержки, сборе, очистки и инактивации вируса, смешивании его с адъювантом и лиофилизации, согласно изобретению в качестве носителя используют микрочастицы с размером 100-1300 мкм и концентрацией в ростовой среде 3,0-5,0 мг/мл, которые в процессе образования монослоя клеток и выращивания вируса поддерживают в среде во взвешенном состоянии путем перемешивания среды со скоростью 5-60 об/мин, при этом образование монослоя клеток ведут в течение 48,0-72,0 ч и перед постоянным перемешиванием осуществляют для прикрепления клеток к носителю периодическое их перемешивание в течение 1,0-2,0 мин первые 4,0-20,0 ч с интервалами 30-50 мин, а при выращивании вируса инфицированный материал вносят в дозе 0,05-0,1 БОЕ/кл, адсорбцию вирусов на клетках ведут в течение 1,0-2,0 ч, инкубирование инфицированных клеток проводят в течение 24,0-72,0 ч. The essence of the invention lies in the fact that in a method for producing a virion herpetic vaccine, which consists in the formation of a monolayer of sensitive cells on a carrier placed in a mixed growth medium, growing a virus previously adapted to this cell culture by introducing infectious material, adsorption of viruses on cells, incubation infected cells in a medium of support, collection, purification and inactivation of the virus, mixing it with adjuvant and lyophilization, according to the invention as a carry For the use of microparticles with a size of 100-1300 μm and a concentration in the growth medium of 3.0-5.0 mg / ml, which during the formation of a monolayer of cells and growing the virus are maintained in suspension in the medium by mixing the medium at a speed of 5-60 r / min, while the formation of a monolayer of cells is carried out for 48.0-72.0 hours and before constant stirring, they are periodically mixed for attachment of cells to the carrier for 1.0-2.0 minutes for the first 4.0-20.0 hours at intervals of 30-50 minutes, and when the virus is grown, the infected material is introduced into Oz 0.05-0.1 PFU / cell, the adsorption of viruses on the cells is carried out for 1.0-2.0 h, incubating the infected cells was carried out for 24,0-72,0 h.

Использование в качестве носителя микрочастиц с размером 100-1300 мкм и концентрацией в ростовой среде 3,0-5,0 мг/мл, а также поддерживание их в процессе образования монослоя клеток и выращивания вирусов во взвешенном состоянии путем перемешивания среды со скоростью 5-60 об/мин, позволяет повысить урожайность вирусов за счет значительного увеличения поверхности контакта для роста монослоя клеток и репродуцировать их в более высоких титрах - 6,5-10,0 lg ТЦД₅₀ вместо 4,5-5,0 lg ТЦД₅₀ при применении стационарного макроносителя в известных методах выращивания вирусов. Особенно высокоэффективным является способ получения вакцины, при котором микроносители представляют собой пористые частицы асимметричной произвольной формы с размером от 100-800 мкм, изготовленные на основе денатурированного коллагена (желатины) с размером пор 50-80 мкм. Использование таких частиц обеспечивает высокую удельную поверхность, что позволяет резко увеличить выход клеточной биомассы. Оригинальная их структура обеспечивает существенное уменьшение механического повреждения клеток и вирусов при перемешивании за счет возможности применения низких скоростей перемешивания порядка 5-20 об/мин. Также упрощаются и ускоряются процессы снятия клеток с вирусами.The use as a carrier of microparticles with a size of 100-1300 μm and a concentration in the growth medium of 3.0-5.0 mg / ml, as well as maintaining them during the formation of a monolayer of cells and growing viruses in suspension by mixing the medium at a speed of 5-60 rpm, allows you to increase the productivity of viruses due to a significant increase in the contact surface for the growth of the monolayer of cells and reproduce them in higher titers - 6.5-10.0 lg TCD ₅₀ instead of 4.5-5.0 lg TCD ₅₀ when using stationary macrocarrier in known methods grown I viruses. Particularly highly effective is the method for producing the vaccine, in which the microcarriers are porous particles of asymmetric arbitrary shape with a size of 100-800 microns, made on the basis of denatured collagen (gelatin) with a pore size of 50-80 microns. The use of such particles provides a high specific surface area, which can dramatically increase the yield of cell biomass. Their original structure provides a significant reduction in mechanical damage to cells and viruses during mixing due to the possibility of using low mixing speeds of the order of 5-20 rpm. The processes of removing cells with viruses are also simplified and accelerated.

Подбор конкретных режимов образования монослоя клеток и выращивания вирусов позволил применить микроносители различных типов при изготовлении именно вирионной герпетической вакцины. The selection of specific modes of formation of a monolayer of cells and the cultivation of viruses allowed the use of various types of microcarriers in the manufacture of virion herpetic vaccines.

Двухэтапная инактивация вирусов формалином: в течение 68,0-76,0 ч при 37^оС и в течение 7 сут при 4^оС при соотношении объемов 1:2000 формалина и вируссодержащей суспензии, полученной в результате замораживания-оттаивания клеток, позволяет сохранить антигенность препарата, ее стабильность при надежном обезвреживании инфекционности вируса. Кроме того, установлено, что герпетическая вакцина, полученная заявляемым способом, обладает более высокой иммуногенностью за счет меньшего механического повреждения вирусов, что увеличивает ее клиническую эффективность по сравнению с герпетическими вакцинами, полученными известными способами, иммуногенность которых на 1,5 lg меньше, чем у вакцины, полученной известным способом.Alternative viral inactivation with formalin: within 68,0-76,0 hours at 37 ^{° C} and for 7 days at ⁴ ° C at a volume ratio of 1: 2000 formalin and virus-containing suspension of the resulting freeze-thawing the cells, allows to keep the antigenicity drug, its stability with reliable neutralization of the infectiousness of the virus. In addition, it was found that the herpetic vaccine obtained by the claimed method has a higher immunogenicity due to less mechanical damage to viruses, which increases its clinical effectiveness compared to herpetic vaccines obtained by known methods, the immunogenicity of which is 1.5 lg less than vaccines obtained in a known manner.

Возможность осуществления изобретения приведена на примере изготовления герпетической вакцины с инактивированными штаммами двух вирусов простого герпеса: УС(ВПГ-1) и ВН(ВПГ-2), адаптированных серийным пассированием к культуре первичных клеток фибробластов куриного эмбриона (ККЭ). В качестве клеток могут быть также использованы перевиваемые линии клеток почек зеленой мартышки - Vero и 4647. The possibility of carrying out the invention is given by the example of the manufacture of a herpetic vaccine with inactivated strains of two herpes simplex viruses: CSS (HSV-1) and BH (HSV-2), adapted by serial passaging to the culture of primary cells of chicken embryo fibroblasts (CCE). As cells, transplantable green monkey kidney cell lines Vero and 4647 can also be used.

Суспензию диспергированных клеток вносят в культуральные емкости биореактора в конечной концентрации (1,0- 1,5)˙10⁶ кл/мл для ККЭ и (0,2-0,8)˙10⁶ кл/мл для линий Vero и 4647.A suspension of dispersed cells is introduced into the culture vessels of the bioreactor in a final concentration of (1.0-1.5) × 10 ⁶ cells / ml for CCE and (0.2-0.8) × 10 ⁶ cells / ml for Vero and 4647 lines.

В качестве микроносителей могут быть использованы микроносители отечественного производства: Цитолар-2-денатурированный коллаген с размером частиц 140±30 мкм, Цитопол - синтетический полимер (поливиниловый спирт с желатиновым покрытием) с размером частиц до 200 мкм, и Цитогель - пористые микрочастицы асимметричной произвольной формы размером 100-800 мкм на основе денатурированного коллагена с размером пор 50-80 мкм. В качестве микроносителя могут быть использованы также микроносители зарубежного производства - Цитодекс-3, представляющий собой гранулы геля поперечно сшитого декстрана, покрытого коллагеном с размером частиц 133-1215 мкм. Концентрация микрочастиц носителя составляет 3,0-5,0 мг/мл. As microcarriers, microcarriers of domestic production can be used: Cytolar-2-denatured collagen with a particle size of 140 ± 30 μm, Cytopol - a synthetic polymer (polyvinyl alcohol with a gelatin coating) with a particle size of up to 200 μm, and Cytogel - porous microparticles of asymmetric arbitrary shape 100-800 microns in size based on denatured collagen with a pore size of 50-80 microns. As microcarriers can also be used microcarriers of foreign manufacture - Cytodex-3, which is a granule gel of cross-linked dextran coated with collagen with a particle size of 133-1215 microns. The concentration of carrier microparticles is 3.0-5.0 mg / ml.

Для культивирования клеток ККЭ используют ростовую среду 199 с 0,5% раствора гидролизата лактальбумина, содержащую до 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота (СКРС). Для клеток 4647 используют среду Игла с 7% СКРС с глутомином (1,2 мг/мл) и НЕРЕS (10 мМ). В среду добавляют антибиотики линкомицин (100 мкг/мл) или гентамицина сульфат в конечной концентрации, не превышающей 40 мкг/мл. To cultivate the cells of the cells of the cells, the growth medium 199 is used with a 0.5% solution of lactalbumin hydrolyzate containing up to 10% of warmed cattle serum (SCRS). For 4647 cells, Eagle medium with 7% SCRS with glutomine (1.2 mg / ml) and HEPES (10 mM) are used. Antibiotics lincomycin (100 μg / ml) or gentamicin sulfate are added to the medium at a final concentration not exceeding 40 μg / ml.

В биореакторы объемом 200-1500 мл загружают микроноситель и питательную среду. Для прикрепления клеток на микроносителе на начальном этапе культивирования используют среду в объеме 25% от конечного объема, периодически помешивания после засева клеток в течение 1,0-2,0 мин с интервалом 30-50 мин в течение первых 4-6 ч для Цитогеля и в течение первых 16-20 ч для остальных носителей. После завершения процесса прикрепления клеток к микрочастицам носителя объем среды доводят до конечного и обеспечивают постоянное перемешивание среды в реакторе, например, мешалками со скоростью 5-20 об/мин для Цитогеля и со скоростью 40-60 об/мин для остальных микроносителей в течение 48-72 ч для поддерживания микрочастиц в среде во взвешенном состоянии. В течение этого времени клетки активно размножаются на микроносителе и образуют монослой. Причем индекс пролиферации для клеток Vero на Цитогеле составил 10,0 lg ТЦД₅₀, на Цитоларе - 2-8,0 lg ТЦД₅₀, на Цитодексе - 3-9,0 lg ТЦД₅₀, а для клеток ККЭ на Цитогеле составил 6,6 lg ТЦД₅₀, на Цитоларе - 2-3,9 lg ТЦД₅₀, на Цитодексе - 3-4,0 lg ТЦД₅₀. После образования монослоя клеток питательную среду роста удаляют, а микроносители с клетками оставляют в реакторе и вносят инфицирующий материал либо штамм УС (ВПГ-1), либо штамм ВН (ВПГ-2) в объеме 1/3-1/4 от объема среды роста в дозе 0,05-0,1 БОЕ/кл. Адсорбцию вирусов на клетках проводят при 37^оС в режиме постоянного перемешивания микрочастиц в течение 1,5±0,5 ч. После чего жидкость с неадсорбированным вирусом сливают и сосуды заполняют поддерживающей средой. Инкубирование инфицированных клеток проводят в течение 24-72 ч до развития ЦПД в клетках на 80-90%. Далее осуществляют слив вируссодержащей жидкости, замораживание ее при минус 20^оС для разрушения клеток и оттаивание. Затем в нее вносят формалин в конечной концентрации 1:2000. Инактивацию вируса формалином проводят двухэтапно в течение 68,0-76,0 ч при 37^оС и в течение 7 сут при 4^оС, что позволяет сохранить антигенность препарата.The microcarrier and the nutrient medium are loaded into bioreactors with a volume of 200-1500 ml. To attach the cells to the microcarrier at the initial stage of cultivation, medium is used in a volume of 25% of the final volume, stirring periodically after seeding for 1.0-2.0 minutes with an interval of 30-50 minutes for the first 4-6 hours for Cytogel and during the first 16-20 hours for other carriers. After the process of attaching cells to the microparticles of the carrier is completed, the medium volume is brought to the final one and the medium is constantly stirred in the reactor, for example, with agitators at a speed of 5-20 rpm for Cytogel and at a speed of 40-60 rpm for other microcarriers for 48 72 hours to keep the microparticles in suspension in the medium. During this time, cells actively multiply on the microcarrier and form a monolayer. Moreover, the proliferation index for Vero cells on Cytogel was 10.0 lg TCD ₅₀ , on Cytolar - 2-8.0 lg TCD ₅₀ , on Cytodex - 3-9.0 lg TCD ₅₀ , and for KKE cells on Cytogel was 6.6 lg TCD ₅₀ , on Cytolar - 2-3.9 lg TCD ₅₀ , on Cytodex - 3-4.0 lg TCD ₅₀ . After the monolayer of cells is formed, the growth medium is removed, and the microcarriers with the cells are left in the reactor and the infectious material is introduced either with the US strain (HSV-1) or the BH strain (HSV-2) in the amount of 1 / 3-1 / 4 of the volume of the growth medium at a dose of 0.05-0.1 PFU / cell. Virus adsorption was performed on the cells at ³⁷ ° C in a constant stirring of the microparticles within 1.5 ± 0.5 h. Then the virus liquid with nonadsorbed emptied and filled vessels supporting medium. Incubation of infected cells is carried out for 24-72 hours before the development of CPP in the cells by 80-90%. Further carried drain virus-containing fluid, freezing it at -20 ^{° C} to disrupt the cells and thawing. Then formalin is added to it at a final concentration of 1: 2000. Inactivation of virus with formalin-step is performed for 37 hours at 68,0-76,0 ^{° C} and for 7 days at ⁴ ° C, thus preserving the antigenicity of the preparation.

Затем проводят осветление материала при низкоскоростном центрифугировании, получая полуфабрикат моновакцины. После контроля на стерильность и иммуногенность производят сведение моновакцин в дивакцинную серию, добавление сахарозно-желатинного стабилизатора, розлив вакцины по ампулам и лиофилизацию, в результате которой продлевается срок годности вакцины до 2 лет. Then, clarification of the material is carried out at low speed centrifugation, obtaining a semi-finished monovaccine. After checking for sterility and immunogenicity, monovaccines are reduced to a divacinous series, the sucrose-gelatin stabilizer is added, the vaccine is dispensed into ampoules and lyophilization, as a result of which the shelf life of the vaccine is extended to 2 years.

Ниже приводится характеристика герпетической дивакцины, полученной заявляемым способом:
Объем вакцины в ампуле 0,3 мл; количество белка - не более 500 мкг/мл (предел 2000 мкг/мл); белок сыворотки крупного рогатого скота - не более 0,5 мкг/мл; концентрация остаточного формалина - не более 0,045; содержание стабилизатора: сахарозы - не более 7,5%, желатозы не более 1%; остаточная влажность - не более 2,5%; рН 7,5 ±0,2; препарат стерилен; препарат специфически безвреден; препарат не токсичен; препарат способен индуцировать синтез вируснейтрализующих антител у животных. Индекс нейтрализации ВПГ-1 (шт. УС) - 3,0 lg ТЦД₅₀/мл ВПГ-2 (шт. ВН) - 1,75 lg ТЦД₅₀/мл.The following is a description of the herpetic divacin obtained by the claimed method:
The volume of the vaccine in the vial is 0.3 ml; the amount of protein is not more than 500 μg / ml (limit 2000 μg / ml); cattle serum protein - not more than 0.5 μg / ml; the concentration of residual formalin is not more than 0.045; stabilizer content: sucrose - not more than 7.5%, gelatose not more than 1%; residual humidity - not more than 2.5%; pH 7.5 ± 0.2; the drug is sterile; the drug is specifically harmless; the drug is not toxic; the drug is able to induce the synthesis of virus-neutralizing antibodies in animals. The neutralization index of HSV-1 (pcs. US) is 3.0 lg TCD ₅₀ / ml; HSV-2 (pcs. HV) is 1.75 lg TCD ₅₀ / ml.

Claims

1. METHOD FOR PRODUCING A VIRION HERPETIC VACCINE, including the formation of a monolayer of sensitive cells on a carrier in a mixed growth medium, infection of a monolayer, adsorption of viruses on cells, incubation of infected cells in a support medium, collection, purification and inactivation of the virus, followed by its mixing with ada lyophilization, characterized in that microparticles with a size of 100 - 1300 μm and a concentration of 3.0 - 5.0 mg / ml are used as a carrier, the medium is mixed at a speed of 5 - 60 rpm, in order to form a monolayer, the cells are cultured for 48 - 72 hours, and in the range from 4 to 20 hours the medium is stirred periodically after 30 - 50 minutes for 1 - 2 minutes, the monolayer is infected at a dose of 0.05 - 0.1 PFU / cells, adsorption is carried out for 1 to 2 hours, and incubation for 24 to 72 hours.

2. The method according to claim 1, characterized in that the microparticles of the carrier are made of a porous material based on denatured collagen with a size of 50 - 80 microns and have an arbitrary asymmetric shape with a size of 100 - 800 microns.

3. The method according to claim 1, characterized in that the virus obtained by freezing and subsequent thawing of the cells is used for inactivation, and the inactivation is carried out by formalin in two stages - first for 68 - 76 hours at 37 ^° C and then for 7 day at 4 ^o With a ratio of formalin and virus 1: 2000.

4. The method according to claim 2, characterized in that the cultivation on porous particles is carried out with a stirring speed of 5 to 20 rpm