RU2007720C1 - Method of acute leukosis diagnosis - Google Patents
Method of acute leukosis diagnosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2007720C1 RU2007720C1 SU4947487A RU2007720C1 RU 2007720 C1 RU2007720 C1 RU 2007720C1 SU 4947487 A SU4947487 A SU 4947487A RU 2007720 C1 RU2007720 C1 RU 2007720C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- acute leukemia
- patients
- acute
- content
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title claims abstract 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 claims description 39
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 20
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 6
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 abstract description 15
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 208000009527 Refractory anemia Diseases 0.000 description 4
- 206010072684 Refractory cytopenia with unilineage dysplasia Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 3
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 3
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000000058 Anaplasia Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010027906 Monocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000007541 Preleukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033501 Refractory anemia with excess blasts Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016586 myelodysplastic syndrome with excess blasts Diseases 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid tungsten Chemical compound [W].OP(O)(O)=O DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно гематологии, и может быть использовано для ранней диагностики острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом (МДС). The invention relates to medicine, namely to hematology, and can be used for early diagnosis of acute leukemia in patients with myelodysplastic syndrome (MDS).
Наиболее распространенным и применяемым в клинической практике способом диагностики острого лейкоза у больных МДС является исследование пунктатов костного мозга. При этом ведущим признаком в диагностике острого лейкоза является содержание бластных элементов в костном мозге. Диагностика острого лейкоза основывается на данных морфологического исследования субстрата костного мозга, при наличии в котором более 30% бластов устанавливают диагноз острого лейкоза. The most common and used in clinical practice method for the diagnosis of acute leukemia in patients with MDS is the study of bone marrow punctures. In this case, the leading sign in the diagnosis of acute leukemia is the content of blast elements in the bone marrow. Diagnosis of acute leukemia is based on data from a morphological study of bone marrow substrate, in the presence of which more than 30% of blasts are diagnosed with acute leukemia.
При содержании бластов в пунктате костного мозга менее 30% , но более 10% диагностируют так называемый малопроцентный острый лейкоз. When the blast content in bone marrow puncture is less than 30%, but more than 10%, the so-called low-percentage acute leukemia is diagnosed.
При содержании бластов в костном мозге менее 10% диагноз острого лейкоза, как правило, не ставят. У больных с различными нарушениями гемопоэза, в том числе и с незначительным бластозом, диагностируют миелодиспластический синдром. Однако, у части этих больных нельзя исключить наличие ранней стадии острого лейкоза, но доказать морфологически, что обнаруженные в небольшом количестве бласты являются патологическим лейкозным клоном клеток, не представляется возможным. When the blast content in the bone marrow is less than 10%, the diagnosis of acute leukemia, as a rule, is not made. Myelodysplastic syndrome is diagnosed in patients with various hematopoiesis disorders, including those with minor blastosis. However, the presence of an early stage of acute leukemia cannot be ruled out in some of these patients, but it is not possible to prove morphologically that a small number of blasts are a pathological leukemic cell clone.
Применение иммунных клеточных маркеров для идентификации бластных клеток не всегда дает положительные результаты, так как изменения в экспрессии мембранных антигенов затрудняют интерпретацию полученных данных. Метод проточной цитофлюориметрии и электронно-микроскопических исследований не обладает достаточной степенью достоверности, требует дорогостоящих реактивов и оборудования, а также высокой техники исполнителя, что не всегда возможно в клинической практике. The use of immune cell markers to identify blast cells does not always give positive results, since changes in the expression of membrane antigens make it difficult to interpret the obtained data. The method of flow cytofluorimetry and electron microscopy studies does not have a sufficient degree of reliability, requires expensive reagents and equipment, as well as high-tech performer, which is not always possible in clinical practice.
Предлагается использовать биохимические параметры для утверждения, что выявленное минимальное увеличение бластов (менее 10% ) является лейкозным клоном клеток. Использование биохимических подходов в диагностике начальной, ранней стадии острого лейкоза основывается на выявлении специфических особенностей обмена опухолевых клеток, а также на выявлении субстанций, продуцируемых трансформированными клетками в плазму. It is proposed to use biochemical parameters to assert that the detected minimal increase in blasts (less than 10%) is a leukemic cell clone. The use of biochemical approaches in the diagnosis of the initial, early stage of acute leukemia is based on the identification of specific features of the exchange of tumor cells, as well as on the identification of substances produced by transformed cells into plasma.
Известен биохимический способ исследования крови, принятый за прототип и выявляющий изменения содержания липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК) и специфической активности ДНК-связывающих белков при развернутой стадии острого лейкоза. A known biochemical method for blood testing, adopted as a prototype and detecting changes in the content of lipid-bound sialic acids (LSC) and the specific activity of DNA-binding proteins in the advanced stage of acute leukemia.
Недостатком этого способа является поздняя констатация отклонений от нормы биохимических показателей ЛСК и СА ДСБ, определяемых в развернутой стадии острого лейкоза, где отмечаются большие изменения показателей относительно нормы. The disadvantage of this method is the late identification of deviations from the norm of biochemical parameters of LSC and CA DSB, determined in the expanded stage of acute leukemia, where there are large changes in indicators relative to the norm.
Указаний о возможности использования минимальных изменений этих показателей одновременно с изменением ДНК для ранней диагностики острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом нет. There are no indications of the possibility of using minimal changes in these parameters simultaneously with DNA changes for the early diagnosis of acute leukemia in patients with myelodysplastic syndrome.
Цель изобретения - раннее выявление острого лейкоза у больных миеолодиспластическим синдромом. The purpose of the invention is the early detection of acute leukemia in patients with myelodysplastic syndrome.
Поставленная цель достигается тем, что у больных миелодиспластическим синдромом с наличием минимального патологического клона клеток (менее 10% бластов) определяют в сыворотке (плазме) крови содержание липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК), специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ). а также дополнительно определяют содержание ДНК, и при одновременном изменении всех трех показателей, причем содержание ЛСК увеличивается до 0,2 г/л и более, ДНК - до 7,5 мкг/мл и более, а специфической активности ДНК-связывающих белков снижаются до 14 ед. /мг белка и более, диагностируют острый лейкоз. This goal is achieved by the fact that in patients with myelodysplastic syndrome with a minimal pathological cell clone (less than 10% of blasts), the content of lipid-bound sialic acids (LSC) and the specific activity of DNA-binding proteins (CA-DR) are determined in the blood serum (plasma). and also additionally determine the DNA content, and with a simultaneous change in all three indicators, the content of LSC increases to 0.2 g / l or more, DNA to 7.5 μg / ml or more, and the specific activity of DNA-binding proteins decreases to 14 units / mg protein or more, acute leukemia is diagnosed.
Определение содержания липидно-связанных сиаловых кислот в крови проводят по методу Katopodis. The determination of lipid-bound sialic acid in the blood is carried out according to the Katopodis method.
К 150 мл дистиллированной воды добавляют 50 мкл сыворотки крови, перемешивают в течение 5 с и пробирки помещают в лед. Экстракцию липидной фракции проводят 3 мл охлажденной смеси хлороформа и метанола при соотношении 2: 1 об. /об. в течение 30 с, затем в эти же пробирки приливают 0,5 мл охлажденной дистиллированной воды и пробирки перемешивают в течение 30 с. После проведения экстракции пробирки центрифугируют 5 мин при комнатной температуре при 2500 об. /мин и верхний слой отсасывают. Затем к 1 мл верхнего слоя добавляют 50 мкл фосфорно-вольфрамовой кислоты (1 г/мл). После пятиминутного осаждения пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об. /мин при комнатной температуре, супернатант удаляют. Осадок растворяют в 1 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл резорцинового реагента. Пробы затем помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, охлаждают и добавляют 3 мл смеси бутилацетата и н-бутилового спирта при соотношении 85: 15 об. /об. , перемешивают и центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 мин при 2500 об. /мин. Верхний слой отсасывают и определяют в нем оптическую плотность на спектрофотометре Сф-4 при длине волны 580 нм. Расчет количества сиаловых кислот проводят по калибровочной кривой. 50 μl of blood serum are added to 150 ml of distilled water, stirred for 5 s and the tubes are placed on ice. The extraction of the lipid fraction is carried out with 3 ml of a cooled mixture of chloroform and methanol at a ratio of 2: 1 vol. /about. for 30 s, then 0.5 ml of chilled distilled water is poured into the same tubes and the tubes are mixed for 30 s. After the extraction, the tubes are centrifuged for 5 min at room temperature at 2500 rpm. / min and the top layer is aspirated. Then, 50 μl of tungsten phosphoric acid (1 g / ml) is added to 1 ml of the upper layer. After five minutes of sedimentation, the tubes are centrifuged for 5 min at 2000 vol. / min at room temperature, the supernatant is removed. The precipitate was dissolved in 1 ml of distilled water and 1 ml of resorcinol reagent was added. The samples are then placed in a boiling water bath for 15 minutes, cooled and 3 ml of a mixture of butyl acetate and n-butyl alcohol are added at a ratio of 85: 15 vol. /about. , stirred and centrifuged at room temperature for 5 min at 2500 rpm. / min The upper layer is aspirated and the optical density is determined in it on an Sf-4 spectrophotometer at a wavelength of 580 nm. The calculation of the amount of sialic acids is carried out according to the calibration curve.
Определение специфической активности ДНК-связывающих белков (СА ДСБ) проводят флюориметрическим методом. Determination of the specific activity of DNA-binding proteins (CA DSB) is carried out by the fluorimetric method.
К образцам сыворотки крови (разведение (1: 1)-(1: 8) объемом 25 мкл добавляют по 20 мкл смеси, содержащей 7 нмоль блеомицина, 1 мкг ДНК плазмиды РРВ, 5 мм β -меркаптоэтанола в 50 мкл натрий-боратного буфера (рН 9,5). Смесь инкубируют 30 мин при 37оС. Аликвоты (50 мкл) добавляют к 450 мкл денатурирующего буфера (0,09 М Na3PO4 : 0,01 M ЕДТА : 0,01 M NaCl, рН 12,1), а затем приливают по 25 мкл этидиум бромида (56 мкм). Флюоресценцию ДНК определяют на флюорометре фирмы "Gitachi" при экстинкции 530 нм и эмиссии 590 нм.To blood serum samples (dilution (1: 1) - (1: 8) with a volume of 25 μl, 20 μl of a mixture containing 7 nmol of bleomycin, 1 μg of DNA of plasmid PPB, 5 mm of β-mercaptoethanol in 50 μl of sodium borate buffer ( .
Определяют процент угнетения деградации ДНК, индуцированной блеомицином, как функцию концентрации белка в сыворотке. Значения IC50получают пробит-анализом 5 концентраций белка, имеющих результатом ингибицию в интервале 10-80% . Рассчитывают значения специфической активности (ед. /мг белка), учитывая, что 1 ед. ингибирной активности эквивалентна количеству белка, требующегося для получения 50% ингибиции деградации ДНК, индуцированной блеомицином. Белок в сыворотке крови определяют методом Лоури.The percentage of suppression of DNA degradation induced by bleomycin is determined as a function of serum protein concentration. IC 50 values are obtained by probit analysis of 5 protein concentrations, resulting in inhibition in the range of 10-80%. Calculate the values of specific activity (units / mg protein), given that 1 unit ingibiric activity is equivalent to the amount of protein required to obtain 50% bleomycin-induced DNA degradation inhibition. Protein in blood serum is determined by the Lowry method.
Для определения уровня ДНК кровь у больных берут на гепарине (конечная концентрация 25 ед. /мл) и центрифугируют при 3000 об. /мин при 4оС. С целью депротеинизации к образцам плазмы объемом 0,2 мл добавляют равный объем 20% -ного раствора NaCl и помещают в кипящую водяную баню на 3 мин. После охлаждения пробы центрифугируют при 3000 об. /мин 30 мин. Концентрацию ДНК измеряют по флюоресценции комплекса ДНК-бис-бензимид (Hoechst 33258 "Serva") на флюориметре фирмы "Hitachi" при экстинции 365 нм и эмиссии 470 нм. В кюветы вносят 2,5 мл буфера, содержащего 1,3 М NaCl из 0,05 М Na-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 1,3 М NaCl и 25 мкл раствора бисбензимида (60 мкг/мл), далее добавляют несколько раз по 20 мкл супернатанта исследуемой плазмы и снимают показания флюоресценции. Затем в эту же кювету вносят коммерческую ДНК тимуса теленка по 250 нг и измеряют флюоресценцию при тех же длинах волн. Коммерческую ДНК, используемую в качестве стандарта, предварительно прогревают при 100оС в 10% -ном растворе NaCl в течение 3 мин.To determine the level of DNA, blood from patients is taken on heparin (final concentration of 25 units / ml) and centrifuged at 3000 rpm. / min at 4 ° C. In order to deproteinization, samples of plasma volume of 0.2 ml of an equal volume of 20% NaCl solution and placed in a boiling water bath for 3 min. After cooling, the samples are centrifuged at 3000 rpm. /
Расчет концентрации ДНК производят по формуле, составленной следующим образом: неизвестному количеству ДНК супернатанта А соответствует флюоресценция С, а поскольку известное количество ДНК тимуса теленка В добавляли в ту же самую кювету, что и анализируемые образцы, то суммарному содержанию ДНК 4 В + А будет соответствовать флюоресценция Д. Следовательно
А/С = (В+А)/Д.Calculation of DNA concentration is carried out according to the formula composed as follows: an unknown amount of supernatant A DNA corresponds to fluorescence C, and since a known amount of calf B thymus DNA was added to the same cuvette as the analyzed samples, the total DNA content of 4 B + A would correspond D. fluorescence therefore
A / C = (B + A) / D.
Применяемые методики не сложны. Каждая из указанных методик занимает по времени около двух часов, требует небольшого количества исследуемого материала - 0,2-0,5 мл крови, используются в основном доступные, отечественные реактивы и отечественное оборудование. Чувствительность и достоверность тестов выше 90% . The applied methods are not complicated. Each of these methods takes about two hours in time, requires a small amount of the studied material - 0.2-0.5 ml of blood, mostly affordable, domestic reagents and domestic equipment are used. The sensitivity and reliability of the tests is above 90%.
Эти методики апробированы у доноров (контрольная группа) и у больных острым лейкозом. These techniques have been tested in donors (control group) and in patients with acute leukemia.
Заявляемый способ диагностики был использован для выявления ранней стадии острого лейкоза у больных миелодиспластическим синдромом. The inventive diagnostic method was used to identify the early stage of acute leukemia in patients with myelodysplastic syndrome.
В ходе изучения предлейкозных состояний в Ленинградском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови проводилось всестороннее клинико-лабораторное обследование больных с миелодиспластическим синдромом (МДС). Под наблюдением находилось 107 больных с МДС, у 17 из них в пунктатах костного мозга было выявлено небольшое ( < 10% ) содержание бластов. During the study of pre-leukemia conditions at the Leningrad Research Institute of Hematology and Blood Transfusion, a comprehensive clinical and laboratory examination of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) was performed. A total of 107 patients with MDS were under observation, 17 of them showed a small (<10%) blast content in bone marrow punctate.
Признаки лейкемизации процесса по клинико-лабораторным тестам были выявлены у больных МДС с рефрактерной анемией и избытком бластов (РАИБ). Результаты исследования выявили изменения клинического статуса, появление моно-, ди-, панцитопении с лимфоцитозом и/или моноцитозом, дисгемопоэз с признаками анаплазии клеток всех трех ростков кроветворения, с небольшим увеличением бластов (6,7 ±0,56% ), атипичное интрамодуллярное расположение скоплений бластов - по данным трепанобиопсии, снижение цитохимических показателей активности ряда ферментов в зрелых клетках нейтрофильного ряда, нарушение созревания органоидов цитоплазмы клеток на ультраструктурном уровне и др. изменения. Clinical laboratory tests showed signs of leukemia in patients with MDS with refractory anemia and excess blasts (RAIB). The results of the study revealed changes in clinical status, the appearance of mono-, di-, pancytopenia with lymphocytosis and / or monocytosis, dyshemopoiesis with signs of cell anaplasia of all three hematopoiesis cells, with a slight increase in blasts (6.7 ± 0.56%), atypical intramodular location clusters of blasts - according to trepanobiopsy, a decrease in the cytochemical indicators of the activity of a number of enzymes in mature cells of the neutrophilic series, impaired maturation of organelles of the cytoplasm of cells at the ultrastructural level, and other changes.
Выявленные цитологические признаки, особенно выраженные явления анаплазии бластов, указывали на тенденцию к лейкемизации процесса. По мере усугубления нарушений гемопоэза увеличивалась частота появления биохимических маркеров лейкемизации - уменьшение специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке крови, значительное повышение липидно-связанных сиаловых кислот и содержания ДНК в плазме крови. Identified cytological signs, especially pronounced phenomena of blast anaplasia, indicated a tendency to leukemization of the process. With the aggravation of hematopoiesis disorders, the frequency of appearance of biochemical markers of leukemia increased - a decrease in the specific activity of DNA-binding proteins in blood serum, a significant increase in lipid-bound sialic acids and DNA content in blood plasma.
Сопоставление клинических показателей с биохимическими параметрами представлено в таблице. A comparison of clinical indicators with biochemical parameters is presented in the table.
Как видно из данных таблицы: у 17 больных с МДС содержание бластов колеблется от 5,0 до 9,8% , составляя в среднем 6,7 ±0,56% . As can be seen from the table: in 17 patients with MDS, the content of blasts ranges from 5.0 to 9.8%, averaging 6.7 ± 0.56%.
Повышение уровня ЛСК в сыворотке крови обнаружено у всех 17 больных МДС в (N 0,1-0,2 г/л), повышение уровня ДНК в плазме крови - у 13 больных (N 2,8-7,5 мкг/мл) и снижение специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке крови (N 14,1-25,5 ед. /мг) - у 15 больных. An increase in serum LSC was found in all 17 patients with MDS in (N 0.1-0.2 g / l), an increase in plasma DNA levels in 13 patients (N 2.8-7.5 μg / ml) and a decrease in the specific activity of DNA-binding proteins in blood serum (N 14.1-25.5 units / mg) in 15 patients.
В зависимости от количества измененных биохимических показателей (три показателя, два, один) больные условно разделены на три группы. Depending on the number of altered biochemical parameters (three indicators, two, one), patients are conditionally divided into three groups.
У 12 больных имело место одновременное нарушение всех трех биохимических параметров. При этом у 10 из них (наблюдения 1-10) диагностирован острый лейкоз, подтвержденный посмертно патологоанатомическими данными; у 2 больных (наблюдения 11, 12) также диагностирована ранняя стадия острого лейкоза, начата интенсивная полихимиотерапия острого лейкоза и лечение их продолжается. In 12 patients, there was a simultaneous violation of all three biochemical parameters. Moreover, 10 of them (observations 1-10) were diagnosed with acute leukemia, confirmed posthumously by pathological data; in 2 patients (
У остальных 5 из 17 больных МДС с изменением только двух биохимических параметров (наблюдения 3-16) или с изменением только одного биохимического теста (наблюдение 17) до настоящего времени трансформации в острый лейкоз не наблюдается. In the remaining 5 of 17 patients with MDS with a change in only two biochemical parameters (observations 3-16) or with a change in only one biochemical test (observation 17), so far no transformation into acute leukemia has been observed.
Следует отметить, что в отличие от развернутой стадии острого лейкоза, где имеют место выраженные изменения ЛСК и СА ДСБ по сравнению с нормой, у больных миелодиспластическим синдромом (с минимальным бластозом костного мозга) любое одновременное минимальное изменение уровня содержания ЛСК, СА ДСБ и ДНК позволяет выявить раннюю стадию острого лейкоза. It should be noted that in contrast to the unfolded stage of acute leukemia, where there are pronounced changes in the BFK and CA of the DSB compared with the norm, in patients with myelodysplastic syndrome (with minimal bone marrow blastosis), any simultaneous minimal change in the level of the content of the BFK, SA of the DSB and DNA allows identify the early stage of acute leukemia.
При этом констатация изменений биохимических параметров имела место за 6-17 мес до установления диагноза острого лейкоза. Moreover, a statement of changes in biochemical parameters took place 6-17 months before the diagnosis of acute leukemia.
П р и м е р 1. Выписка из истории болезни N 713/87. У больной Г. с рефрактерной анемией в пунктате костного мозга 4/VIII-86 г. - содержится 5% миелобластов. В VIII 1986 г. впервые выявлено одновременное изменение трех биохимических показателей: ЛСК 0,28 г/л; ДНК 7,6 мкг/мл; СА ДСБ 7,2 ед. /мг белка. Далее в XI-86 г. усугубляются нарушения биохимических тестов: отмечается увеличение ЛСК до 0,34 г/л; ДНК - до 7,84 мкг/мл; уменьшение СА ДСБ - до 6,95 нд. /мг белка. Т. е. биохимические показатели приближаются к изменениям, характерным для острого лейкоза. Было высказано предположение, что у больной - начальная стадия острого лейкоза. Однако, на основании международной ФАБ-классификации миелодисплазий было право поставить только диагноз рефрактерной анемии с избытком бластов (РАИБ). PRI me
Больная умирает 17.01.87 г. , патологоанатомически подтвержден диагноз острого лейкоза. The patient dies on January 17, 87; the diagnosis of acute leukemia is confirmed pathologically.
Таким образом изменения биохимических показателей за 6 месяцев предшествовали установлению диагноза острого лейкоза. Thus, changes in biochemical parameters for 6 months preceded the diagnosis of acute leukemia.
П р и м е р 2. Выписка из истории болезни N 540/87. PRI me
У больного Б. с рефракторной анемией в костном мозге 17/IV-87 г. выявлено 9,8% бластов. Биохимические показатели в этот период имели изменения, близкие к таковым при остром лейкозе: ЛСК 0,40 г/л; СА ДСБ 8,2 ед. /мг белка; ДНК 12,1 мкг/мл. In patient B. with refractory anemia in
Эти биохимические параметры свидетельствовали о наличии у больного острого лейкоза. Но согласно общепринятым международным критериям диагностики в клинике был установлен диагноз РАИБ. Диагноз острого лейкоза становится возможным 08.12.87 г. , когда в костном мозге содержание бластов возросло до 24,0% . Больной умер в IV-88 г. , диагноз острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) подтвержен патологоанатомически. These biochemical parameters indicated the presence of acute leukemia in the patient. But according to generally accepted international diagnostic criteria, the clinic was diagnosed with RAIB. The diagnosis of acute leukemia becomes possible 08.12.87, when the content of blasts in the bone marrow increased to 24.0%. The patient died in IV-88, the diagnosis of acute myeloid leukemia (AML) was confirmed pathologically.
В данном наблюдении одновременное изменение биохимических показателей, характерное для острого лейкоза, обнаружено за 8 месяцев до установления диагноза острого лейкоза. In this observation, a simultaneous change in biochemical parameters characteristic of acute leukemia was detected 8 months before the diagnosis of acute leukemia.
П р и м е р 3. Выписка из истории болезни 982/87. У больного А. с рефрактерной анемией в костном мозге 21/III-87 г. выявлено в пунктате костного мозга 7,0% миелобластов. Уровень содержания биохимических параметров в этот же период вреени оказался измененным: ЛСК 0,28 г/л; СА ДСБ 10,4 ед. /мл белка; ДНК 9,5 мкг/мл. Эти данные в совокупности с бластозом костного мозга позволяли диагностировать у больного раннюю стадию острого лейкоза. PRI me
Однако в клинике в III-87 г. был установлен диагноз РАИБ. Далее, 20.06.87 г. в костном мозге содержание бластов достигло 24% , что позволило установить диагноз острого лейкоза. Больной умер 27.07.88 г. , диагноз острого лейкоза подтвержден патологоанатомическими данными. However, in the clinic in III-87 was diagnosed with RAIB. Further, on 20.06.87, the content of blasts in the bone marrow reached 24%, which made it possible to establish a diagnosis of acute leukemia. The patient died on July 27, 88, the diagnosis of acute leukemia was confirmed by pathological data.
Одновременное изменение трех биохимических тестов при минимальном бластозе отмечалось за 10 мес до устагновления диагноза острого лейкоза. A simultaneous change in three biochemical tests with minimal blastosis was noted 10 months before the diagnosis of acute leukemia.
Таким образом одновременное, даже минимальное по отношению к норме, изменение биохимических параметров, таких как уровень липидно-связанных сиаловых кислот, ДНК и специфической активности ДНК-связывающих белков в сыворотке (плазме) крови у больных миелодисплапстическим синдромом при наличии минимального патологического клона клеток (6,7 ±0,56) позволяет диагностировать раннюю стадию острого лейкоза. (56) Лабораторное дело. 1988. N 6, с. 38-40. Thus, a simultaneous, even minimal in relation to normal, change in biochemical parameters, such as the level of lipid-bound sialic acids, DNA and the specific activity of DNA-binding proteins in blood serum (plasma) in patients with myelodysplastic syndrome in the presence of a minimal pathological cell clone (6 , 7 ± 0.56) allows you to diagnose the early stage of acute leukemia. (56) Laboratory work. 1988.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4947487 RU2007720C1 (en) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Method of acute leukosis diagnosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4947487 RU2007720C1 (en) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Method of acute leukosis diagnosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007720C1 true RU2007720C1 (en) | 1994-02-15 |
Family
ID=21580342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4947487 RU2007720C1 (en) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Method of acute leukosis diagnosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2007720C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2169368C1 (en) * | 2000-10-31 | 2001-06-20 | Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова | Method for determining indications in favor of alpha-interferon treatment to be administered to chronic myeloleukemia patients |
| RU2210772C1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-08-20 | Нижегородская медицинская академия | Method for predicting acute leukosis |
| RU2212037C2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-09-10 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method for determining immunodepressant therapy tactics in the cases of myelodysplastic syndrome |
| RU2213975C2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-10-10 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method for predicting myelodysplastic syndrome development course |
| RU2657840C1 (en) * | 2017-08-24 | 2018-06-15 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы | Method of diagnosis of myelodysplastic syndrome |
| RU2806591C2 (en) * | 2021-12-30 | 2023-11-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for diagnosing acute leukemia and kits for its implementation |
-
1991
- 1991-06-19 RU SU4947487 patent/RU2007720C1/en active
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2212037C2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-09-10 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method for determining immunodepressant therapy tactics in the cases of myelodysplastic syndrome |
| RU2213975C2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-10-10 | Кировский НИИ гематологии и переливания крови | Method for predicting myelodysplastic syndrome development course |
| RU2169368C1 (en) * | 2000-10-31 | 2001-06-20 | Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова | Method for determining indications in favor of alpha-interferon treatment to be administered to chronic myeloleukemia patients |
| RU2210772C1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-08-20 | Нижегородская медицинская академия | Method for predicting acute leukosis |
| RU2657840C1 (en) * | 2017-08-24 | 2018-06-15 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы | Method of diagnosis of myelodysplastic syndrome |
| RU2806591C2 (en) * | 2021-12-30 | 2023-11-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for diagnosing acute leukemia and kits for its implementation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3783808B2 (en) | Leukocyte classification and counting reagent | |
| CA1191079A (en) | Metachromatic dye sorption means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes | |
| US6197523B1 (en) | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer and/or hematologic progenitor cells in whole blood | |
| US5175109A (en) | Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| US4500509A (en) | Metachromatic dye sorption and fluorescent light emmisive means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes | |
| GB2074749A (en) | Individual leukocyte determination by means of differential metachromatic dye sorption | |
| US5252460A (en) | In vitro detection of ova, parasites, and other formed elements in stool | |
| WO1985005179A1 (en) | Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes | |
| WO2019223406A1 (en) | Method for predicting prognosis of blood disease by using erythrocyte dna damage signals and application thereof | |
| EP0183717B1 (en) | Single dye replacement for romanowsky plural dye variable compositions in human biopsy specimen constituent identifications | |
| US4853210A (en) | Method of staining cells with a diazo dye and compositions thereof | |
| Burmester et al. | Evaluation of a rapid method for the determination of plasma fibrinogen | |
| US4714606A (en) | Method of staining and identifying cells and compositions thereof | |
| RU2007720C1 (en) | Method of acute leukosis diagnosis | |
| Freni et al. | Centrifugation techniques and reagent strips in the assessment of microhaematuria. | |
| US4640897A (en) | Immunoanalysis of basophil-containing blood fraction for diagnosing parasitoses and allergies | |
| EP0229512B1 (en) | Method of identifying polymethine stained lymphocyte subpopulations and compositions thereof | |
| US6146901A (en) | Composition for manipulating optical and electrical properties of particles to achieve target values for such properties and methods for using the composition | |
| EP0259833B1 (en) | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| US5698398A (en) | Control compositions for determination of molecular cytogenetic abnormalities with DNA probes | |
| Tsuda et al. | Fluorescence polarization with FDA in leukaemic cells: a clear difference between myelogenous and lymphocytic origins | |
| JP2553606B2 (en) | Method for separating and using density-specific blood cells | |
| US3476514A (en) | Cancer cytoscreening | |
| JP2001503053A (en) | Cell controls to check enzyme activity | |
| US4390518A (en) | Method for the determination of leukemic cells |