RU2006134574A - Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea - Google Patents

Abstract

1. Способ конструирования рекомбинантной бактерии, включающийa) получение экзогенного фрагмента ДНК, который имеет в своем составе по крайней мере 2 сайта минимум по 30 п.о. в длину каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Panteoa,b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Panteoa, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, and exo из фага лямбда, иc) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией Pantoea ananatis SC17(0).3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген в указанной рекомбинантной бактерии модифицирован инактивацией или удалением.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген кодирует белок, который участвует в процессе расщепления целевого вещества или в процессе переноса целевого вещества в клетку.5. Способ конструирования библиотеки фрагментов ДНК, включающийa) введение набора фрагментов ДНК, которые частично идентичны целевому гену на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, в бактерию, отличающееся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, и exo фага лямбда, иb) отбор бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанные фрагменты ДНК.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанные фрагменты ДНК содержат регуляторный элемент для экспрессии гена, выбранный из группы, состоящей из п�

Claims (18)

1. Способ конструирования рекомбинантной бактерии, включающий

a) получение экзогенного фрагмента ДНК, который имеет в своем составе по крайней мере 2 сайта минимум по 30 п.о. в длину каждый, идентичных сайтам, расположенным в целевом гене на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Panteoa,

b) введение указанного линейного фрагмента ДНК в бактерию, принадлежащую к роду Panteoa, причем указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, and exo из фага лямбда, и

c) отбор рекомбинантной бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанный линейный фрагмент ДНК или линейный фрагмент ДНК встроен в целевой ген.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией Pantoea ananatis SC17(0).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген в указанной рекомбинантной бактерии модифицирован инактивацией или удалением.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой ген кодирует белок, который участвует в процессе расщепления целевого вещества или в процессе переноса целевого вещества в клетку.

5. Способ конструирования библиотеки фрагментов ДНК, включающий

a) введение набора фрагментов ДНК, которые частично идентичны целевому гену на хромосоме бактерии, принадлежащей к роду Pantoea, в бактерию, отличающееся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что является устойчивой к продуктам генов gam, bet, и exo фага лямбда, и

b) отбор бактерии, в которой указанный целевой ген заменен на указанные фрагменты ДНК.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанные фрагменты ДНК содержат регуляторный элемент для экспрессии гена, выбранный из группы, состоящей из промотора, сайта связывания рибосомы (RBS), оператора и их сочетания.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный регуляторный элемент содержит в своем составе рандомизированную последовательность.

8. Способ конструирования бактерии по п.1, включающий

a) замену природных регуляторных элементов указанного целевого гена на указанные фрагменты ДНК, и

b) отбор бактерии с оптимизированным уровнем экспрессии указанного целевого гена отличающийся тем, что целевой ген кодирует белок, который участвует в биосинтезе и метаболизме целевого вещества, или в выведение целевого вещества из указанной бактерии.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аминокислоты.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.

11. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная бактерия является бактерией-продуцентом нуклеиновой кислоты.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из инозина, гуанозина, ксантозина и аденозина.

13. Бактерия, принадлежащая к роду Pantoea, полученная способом по п.8.

14. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанные природные регуляторные элементы содержат участок размером в 35 пар оснований из промотора указанного гена.

15. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанный ген является геном yhfK.

16. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что указанный участок размером в 35 пар оснований выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO; 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и их сочетания.

17. Способ получения L-аминокислоты, включающий

a) выращивание бактерии по п.13 в питательной среде, и

b) выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.