[go: up one dir, main page]

RS66884B1 - Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca - Google Patents

Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca

Info

Publication number
RS66884B1
RS66884B1 RS20250535A RSP20250535A RS66884B1 RS 66884 B1 RS66884 B1 RS 66884B1 RS 20250535 A RS20250535 A RS 20250535A RS P20250535 A RSP20250535 A RS P20250535A RS 66884 B1 RS66884 B1 RS 66884B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
rodent
gene
light chain
segments
Prior art date
Application number
RS20250535A
Other languages
English (en)
Inventor
Chunguang Guo
Faith Harris
Vera Voronina
John Mcwhirter
Natasha Levenkova
Lynn Macdonald
Naxin Tu
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS66884B1 publication Critical patent/RS66884B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na pritoritet SAD privremene patentne prijave serijski broj 62/417,845, podnete 4. novembra 2016, i SAD privremene patentne prijave serijski broj 62/567,932, podnete 10. oktobra 2017.
OSNOVA
[0002] Humana antitela su klasa terapeutika sa najbržim rastom. Od tehnologija koje se trenutno koriste za njihovu proizvodnju, razvoj transgenih životinja (npr., glodara) konstruisanih sa gentičkim materijalom koji kodira humana antitela, u celini ili delimično, izavala je revoluciju u oblasti humanih terapeutskih monoklonskih antitela za tretman različitih bolesti. Ipak, potreban je razvoj poboljšanih in vivo sistema za stvaranje humanih monoklonskih antitela koji maksimizuju repertoare humanih antitela u transgenim životinjama domaćinima.
REZIME
[0003] Ovde su opisani poboljšani in vivo sistemi za identifikaciju i razvoj novog antitela i terapeutika zasnovanih na antitelu koji se mogu koristiti za tretman različitih bolesti koje pogađaju ljude. Kao što je ovde opisano, ovde opisani glodari imaju konstruisane lokuse λ lakog lanca imunoglobulina (Ig) koji eksprimiraju, proizvode ili sadrže repertoare antitela koji se karakterišu lakim lancima koji imaju humane Vλ regione, su korisni, na primer, za eksploataciju različitih humanih Vλ sekvenci u identifikaciji i razvoju novih terapeutika zasnovanih na antitelu. U nekim primerima izvođenja, glodari opisani ovde obezbeđuju poboljšane in vivo sisteme za razvoj antitela i/ili terapeutika zasnovanih na antitelu za primenu na ljude. U nekim primerima izvođenja, glodari opisani ovde obezbeđuju poboljšane in vivo sisteme za razvoj antitela i/ili terapeutika zasnovanih na antitelu koji sadrže humane Vλ domene koji se karakterišu poboljšanom performansom u poređenju sa antitelima i/ili terapeuticima zasnovanim na antitelu dobijenim iz postojećih in vivo sistema koji sadrže sekvence humanog Vλ regiona.
[0004] U određenim aspektima, ovde je obezbeđen postupak dobijanja nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog lamda lakog lanca i/ili nukleinske kiseline koja kodira varjabilni domen humanog teškog lanca koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetički modifikovanog glodara sa antigenom, gde genetski modifikovan glodar ima genom klicine linije koji obuhvata:
(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena;
(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena;
(iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena;
(iv) jedan ili više enhensera (Eλ) λ lakog lanca imunoglobulina pacova;
(v) tri humana Eλs; i
(v) segment Cλ gena glodara,
gde (i) – (vi) su endogeni lokusi imunoglobulinskog λ lakog lanca; gde (i) i (ii) su sposobni da se rearanžiraju da bi formirali rearanžirane humane gene λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa segmentima gena konstantnog regiona od (iii) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde (i) i (ii) su takođe sposobni da se reraranžiraju da bi formirali rearanžirane gene humanog λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa glodarskim Cλ segmentom gena od (vi) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina; i
(vii) konstruisani lokus teškog lanca koji obuhvata inserciju jednog ili više segmenta humanog VHgena, jednog ili više segmenta humanog DHgena i jednog ili više segmenta humanog JHgena sposobnih da se rearanžiraju da bi formirali rearanžirane gene humanog varjabilnog regiona teškog lanca koji su eksprimovani zajedno sa segmentom gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobilina glodara;.
(b) održavanja glodara u uslovima dovoljnim da glodar proizvede imuni odgovor na antigen; i
(c) regeneracije nukleinske kiseline koja kodira varjabilni domen humanog lamda lakog lanca i/ili nukleinske kiseline koja kodira varjabilni domen humanog teškog lanca iz glodara, ili ćelije iz glodara.
[0005] U izvesnim aspektima, ovde je takođe obezbeđen postupak stvaranja sekvence varjabilnog domena humanog lamda lanca i/ili sekvence varjabilnog domena humanog teškog lanca koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog glodara sa antigenom, gde genetski modifikovan glodar ima genom klicine linije koji obuhvata:
(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena;
(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena;
(iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena;
(iv) jedan ili više enhensera (Eλ) λ lakog lanca imunoglobulina glodara;
(v) tri humana Eλs; i
(vi) Cλ genska segmenta pacova,
gde (i)-(vi) su na endogenom lokusu λ lakog lanca imunoglobulina;
gde su (i) i (ii) u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane λ varjabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa konstantnim regionom genskih segmenata (iii) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde su (i) i (ii) takođe u stanju da se reanžiraju da formiraju rearanžirane λ varjabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa segmentima Cλ gena glodara (vi) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina; i (vii) konstruisanje lokusa teškog lanca koje obuhvata inserciju jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više segmenata humanog DHgena, i jednog ili više segmenata JHhumanog gena koji su u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane varjabilne regione teškog lanca humanog gena koji se eksprimuju zajedno sa glodarskim genskim segmentima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina; i
(b) određivanje sekvence varjabilnog domena humanog lambda lakog lanca i/ili sekvence varjabilnog domena humanog teškog lanca antitela koje specifično: (i) vezuje antigen i (ii) stvoreno je od strane genetski modifikovanog glodara.
[0006] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19, najmanje 20, najmanje 21, najmanje 22, najmanje 23, najmanje 24 ili najmanje 25 humanih Vλ segmenata gena.
[0007] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 5 do 25, 5 do 24, 5 do 23, 5 do 22, 5 do 21, 5 do 20, 5 do 19, 5 do 18, 5 do 17, 5 do 16, 5 do 15, 5 do 14, 5 do 13, 5 do 12, 5 do 11, 5 do 10, 5 do 9, 5 do 8, 5 do 7, ili 5 do 6 segmenata humanog Vλ gena. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni miševi sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 10 do 70, 10 do 69, 10 do 68, 10 do 67, 10 do 66, 10 do 65, 10 do 64, 10 do 63, 10 do 62, 10 do 61, 10 do 60, 10 do 59, 10 do 58, 10 do 57, 10 do 56, 10 do 55, 10 do 54, 10 do 53, 10 do 52, 10 do 51, 10 do 50, 10 do 49, 10 do 48, 10 do 47, 10 do 46, 10 do 45, 10 do 44, 10 do 43, 10 do 42, 10 do 41, 10 do 40, 10 do 39, 10 do 38, 10 do 37, 10 do 36, 10 do 35, 10 do 34, 10 do 33, 10 do 32, 10 do 31, 10 do 32, 10 do 31, 10 do 30, 10 do 29, 10 do 28, 10 do 27, 10 do 26, 10 do 25, 10 do 24, 10 do 23, 10 do 22, 10 do 21, 10 do 20, 10 do 19, 10 do 18, 10 do 17, 10 do 16, 10 do 15, 10 do 14, 10 do 13, 10 do 12, ili 10 do 11 segmenata humanog Vλ gena.
[0008] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 6 do 25, 7 do 25, 8 do 25, 9 do 25, 10 do 25, 11 do 25, 12 do 25, 13 do 25, 14 do 25, 15 do 25, 16 do 25, 17 do 25, 18 do 25, 19 do 25, 20 do 25, 21 do 25, 22 do 25, 23 do 25, ili 24 do 25 segmenata humanog Vλ gena. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 11 do 70, 12 do 70, 13 do 70, 14 do 70, 15 do 70, 16 do 70, 17 do 70, 18 do 70, 19 do 70, 20 do 70, 21 do 70, 22 do 70, 23 do 70, 24 do 70, 25 do 70, 26 do 70, 27 do 70, 28 do 70, 29 do 70, 30 do 70, 31 do 70, 32 do 70, 33 do 70, 34 do 70, 35 do 70, 36 do 70, 37 do 70, 38 do 70, 39 do 70, 40 do 70, 41 do 70, 42 do 70, 43 do 70, 44 do 70, 45 do 70, 46 do 70, 47 do 70, 48 do 70, 49 do 70, 50 do 70, 51 do 70, 52 do 70, 53 do 70, 54 do 70, 55 do 70, 56 do 70, 57 do 70, 58 do 70, 59 do 70, 60 do 70, 61 do 70, 62 do 70, 63 do 70, 64 do 70, 65 do 70, 66 do 70, 67 do 70, 68 do 70, ili 69 do 70 segmenata humanog Vλ gena.
[0009] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 6 do 24, 7 do 23, 8 do 22, 9 do 21, 10 do 20, 11 do 19, 12 do 18, 13 do 17, 14 do 16, ili 15 do 16 segmenata humanog Vλ gena. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 11 do 69, 12 do 68, 13 do 67, 14 do 66, 15 do 65, 16 do 64, 17 do 63, 18 do 62, 19 do 61, 20 do 60, 21 do 59, 22 do 58, 23 do 57, 24 do 56, 25 do 55, 26 do 54, 27 do 53, 28 do 52, 29 do 51, 30 do 50, 31 do 49, 32 do 48, 33 do 47, 34 do 48, 35 do 47, 36 do 46, 37 do 45, 38 do 44, 39 do 43, 40 do 42, ili 41 do 42 segmenata humanog Vλ gena.
[0010] U određenim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 5, 16 ili 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena. U određenim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 10, 27 ili 40 segmenata humanog Vλ gena. U određenim primerima izvođenja, segmenti humanog Vλ gena uključuju uzastopne segmente humanog Vλ gena kako se poemnuti segmenti humanog Vλ gena pojavljuju u humanom lokus lakog lanca Igλ humane ćelije.
[0011] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži najmanje 5 segmenata humanog Jλ gena (npr., ali se ne ograničavajući na, 5 segmenata humanog Jλ gena, 6 segmenata humanog Jλ gena, 7 segmenata humanog Jλ gena, 8 segmenata humanog Jλ gena, itd.). U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži najmanje 4 humana gena Cλ regiona (npr., ali se ne ograničavajući na, 4 humana gena Cλ regiona, 5 humanih gena Cλ regiona, 6 humanih gena Cλ regiona, 7 humanih gena Cλ regiona, 8 humana gena Cλ regiona, itd.). U određenim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže lokus lakog lanca Igλ koji sadrži najmanje 25 segmenata humanog Vλ gena, najmanje 5 segmenata humanog Jλ gena i najmanje 4 humana gena Cλ regiona na endogenom alelu lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže samo jedan mišji (npr., mišji ili pacovski) gen Cλ regiona (npr., mišji gen Cλ1 regiona ili mišji segment Cλ1 gena) na endogenom lokusu glodarskog lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, pomenuti lokus lakog lanca Igλ dodatno sadrži humani Eλ region (ili sekvencu) koja se karakteriše sa tri elementa sekvence.
[0012] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže segmente humanog Vλ, Jλ i Cλ gena na endogenom lokusu glodarskog lakog lanca Igλ u prirodnoj ili konfiguraciji klicine linije. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže segmente humanog Vλ, Jλ i Cλ gena na endogenom lokusu glodarskog lakog lanca Igλ u konfiguraciji koja se ne pojavljuje u prirodi u humanom lokusu λ lakog lanca imunoglobulina genoma klicine linije humane ćelije.
[0013] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže sekvencu DNK na endogenom lokusu glodarskog lakog lanca Igλ koja uključuje više humanih Vλ, Jλ i Cλ kodirajućih sekvenci rasutih (ili jednih pored drugih, povezanih, itd.) sa nekodirajućom sekvencom humanog λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže sekvencu DNK na endogenom mišjem lokusu lakog lanca Igλ koji uključuje više humanih Vλ, Jλ i Cλ kodirajućih sekvenci rasutih sa nekodirajućim sekvencom λ lakog lanca imunoglobulina glodara (npr. miša).
[0014] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari se karakterišu ekspresijom antitela iz endogenog lokusa glodarskog lakog lanca Igλ u genomu klicine linije pomenutih glodara, pri čemu antitela sadrže humane Vλ domene i humane ili glodarske Cλ domene. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari se karakterišu povećanom upotrebom humanih Vλ regiona iz konstruisanih lokusa λ lakog lanca imunoglobulina (npr., 60:40 κ:λ odnos) u poređenju sa jednim ili više referentno konstruisanih ili glodara divljeg tipa (npr., ali se ne ograničavajući na, 95:5 κ:λ odnos).
[0015] Takođe je opisana ćelija glodara ili tkivo glodara čiji genom sadrži:
(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena,
(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena,
(iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena;
(iv) jedan ili više enhensera (Eλ) λ lakog lanca imunoglobulina glodara;
(v) tri humana Eλs; i
(vi) segmenat Cλ gena glodara,
gde (i)-(vi) su na endogenom lokusu λ lakog lanca imunoglobulina;
gde (i) i (ii) su u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane λ varjabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa konstantnim regionom genskih segmenata (iii) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde (i) i (ii) su takođe u stanju da se reanžiraju da formiraju rearanžirane λ varjabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa segmentima Cλ gena glodara (vi) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina; i
(vii) konstruisanje lokusa teškog lanca koje obuhvata inserciju jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više segmenata humanog DHgena, i jednog ili više segmenata JHhumanog gena koji su u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane varjabilne regione humanog gena teškog lanca koji se eksprimuju zajedno sa glodarskim genskim segmentima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.
[0016] Endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina korišćenih glodara dodatno sadrži tri humana Eλs. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dodatno sadrži jedan humani Eλ koji karakteriše prisustvo tri elementa sekvence. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dodatno sadrži jedan humani Eλ koji se karakteriše prisustvom tri elementa sekvence koji deluju (ili funkcionišu) na modularni način.
[0017] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulinska sadrži dva glodarska Eλs. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži dva glodarska Eλs. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina ovde obezbeđen sadrži dva mišja Eλs. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži mišji Eλ i mišji Eλ3-1. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina ne sadrži (ili mu nedostaje) mišji Eλ2-4. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži dva Eλs pacova.
[0018] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju endogenih sgmenata Vλ i Jλ gena, u celini ili delimično. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju segmenata Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2 gena i segmenata Vλ1-Jλ3- Cλ3-Jλ1 gena. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju segmenata Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P gena i segmenata Vλ1-Vλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1 gena. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina ovde obezbeđen sadrži deleciju glodarakog Eλ2-4. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju Vλ2, Vλ3, Jλ2, Cλ2, Jλ4P, Cλ4P, Eλ2-4, Vλ1, Jλ3, Jλ3P, Cλ3 i Jλ1. U nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži Cλ1, Eλ i Eλ3-1 kao jedine prisutne mišje segmente gena ili elemente sekvence.
[0019] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju segmenata humanog Vλ gena Vλ4-69 do Vλ3-1, najmanje parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena, parova segmenata Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6, humanog Jλ genskog segmenta Jλ7 i glodarskog Cλ1 genskog segmenta. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju segmenata humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ3-1, najmanje parova humanog Jλ-Cλ genskog segmenta Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6, humanog Jλ genskog segmenta Jλ7 i glodarskog Cλ1 genskog segmenta. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju segmenata humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, najmanje parova humanog Jλ-Cλ genskog segmenta JλI-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6, humanog Jλ genskog segmenta Jλ7 i glodarskog Cλ1 genskog segmenta. U nekim određenim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje između humanih Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, humanih nekodirajućih DNK koji se prirodno pojavljuju između parova humanog Jλ-Cλ genskog segmenta Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6, i humane nekodirajuće DNK koja se prirodno pojavljuje ushodno (ili 5’) od humanog Jλ segmenta gena Jλ7.
[0020] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je ili sadrži mišji (npr., mišji ili pacovski) Cλ genski segment. U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je ili sadrži pacovski Cλ genski segment. U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je ili sadrži mišji Cλ genski segment. U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je mišji Cλ1 genski segment.
[0021] U nekim primerima izvođenja, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa mišjim Cλ genom izabranim iz grupe koja se sastoji od mišjeg Cλ1, mišjeg Cλ2 i mišjeg Cλ3. U nekim određenim primerima izvođenja, mišji Cλ1 gen je ili sadrži SEQ ID NO:1. U nekim određenim primerima izvođenja, mišji Cλ2 gen je ili sadrži SEQ ID NO:3. U nekim određenim primerima izvođenja, mišji Cλ3 gen je ili sadrži SEQ ID NO:5. U nekim određenim primerima izvođenja, mišji Cλ gen sadrži sekvencu koja je identična sa mišjim Cλ1 genom.
[0022] U nekim primerima izvođenja, pacovski Cλ gen sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa pacovskim Cλ genom izabranim iz grupe koja se sastoji od pacovskog Cλ1, pacovskog Cλ2, pacovskog Cλ3 i pacovskog Cλ4 gena. U nekim određenim primerima izvođenja, pacovski Cλ1 gen je ili sadrži SEQ ID NO:7. U nekim određenim primerima izvođenja, pacovski Cλ2 gen je ili sadrži SEQ ID NO:9. U nekim određenim primerima izvođenja, pacovski Cλ3 gen je ili sadrži SEQ ID NO:11. U nekim određenim primerima izvođenja, pacovski Cλ4 gen je ili sadrži SEQ ID NO:13.
[0023] U nekim primerima korišćenog glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara, genoma klicine linije ili genoma pomenutog glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara dodatno sadrži (i) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani za konstantni region teškog lanca glodarskog imunoglobulina; ili (ii) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa konstantnim regionom teškog lanca glodarskog imunoglobulina, i endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani sa Cκ regionom glodarskog imunoglobulina.
[0024] U nekim primerima izvođenja, inserirani jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata zamenjuju glodarske VH, DHgenske segmente. U određenim primerima izvođenja, insercija uključuje humane nekodirajuće DNK koji se prirodno javljaju između humanih VH, DHi JHsegmenata, i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca glodarskog imunoglobulina je endogeni konstantni region teškog lanca glodarskog imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži inserciju humanih VHgenskih segmenata od VH3-74 do VH6-1, humanih DHgenskih segmenata od DH1-1 do DH7-27, i humanih JHgenskih segmenata JH1-JH6. U određenim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje (nalazi) između humanih VH3-74 do VH6-1, humanu nekodirajuću DNK koja se noramlno pojavljuje (nalazi) između humanih DH1-1 do DH7-27, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno pojavljuje (nalazi) između humanih JH1-JH6. U nekim primerima izvođenja, lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži inserciju svih funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata, svih funkcionalnih humanih DHgenskih segmenata, i svih funkcionalnih humanih JHgenskih segmenata.
[0025] U nekim primerima izvođenja, lokus teškog lanca imunoglobulina nema endogeni nehumani Adam6 gen. U nekim primerima izvođenja, lokus teškog lanca imunoglobulina dodatno sadrži inserciju jednog ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više nehumanih Adam6 polipeptida. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koja kodira jedan ili više glodarskih Adam6 polipetida su inserirane između prvog i drugog humanog VHgenskog segmenta. U nekim primerima izvođenja, prvi humani VHgenski segment je humani VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je humani VH6-1. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koja kodira jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida su inserirane između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida su inserirane umesto humanog Adam6 pseudogena.
[0026] U nekim primerima izvođenja, inserirani jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata zamenjuju Vκ i Jκ genske segmente glodara. U nekim određenim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se normalno pojavljuje između humanih Vκ i Jκ genskih segmenata, i njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, Cκ region glodarskog imunoglobulina je endogeni Cκ region glodara. U nekim primerima izvođenja, lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju proksimalne Vκ duplikacije, u celini ili delimično, lokusa humanog κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju humanih Vκ genskih segmenata od Vκ2-40 do Vκ4-1 i humanih Jκ genskih segmenata od Jκ1-Jκ5. U nekim određenim primerima izvođenja, insecija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vκ2-40 do Vκ4-1, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Jκ1-Jκ5.
[0027] U nekim primerima izvođenja glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kako je ovde korišćeno, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara je heterozigotno ili homozigotno u odnosu na lokus teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano (npr., endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano).
[0028] U nekim primerima izvođenja glodar, ćelija glodara ili tkiva glodara kako je ovde korišćeno, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara je heterozigotno ili homozigotno u odnosu na lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano (npr., endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano).
[0029] U nekim primerima izvođenja glodara, ćelija glodara ili tkiva glodara kako je ovde
1
korišćeno, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara je heterozigotno ili homozigotno u odnosu na lokus λ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano (npr., endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano).
[0030] U nekim primerima izvođenja miša, mišje ćelije ili mišjeg tkiva ovde korišćenih, genom klicine linije pomenutog miša, mišje ćelije ili mišjeg tkiva dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više ne-humanih Adam6 polipeptida, i životinja je heterozigotna ili homozigotna za pomenutu inserciju.
[0031] U nekim primerima izvođenja, ćelija glodara je limfocit glodara. U nekim primerima izvođenja, ćelija glodara je izabrana od B ćelije, dendritske ćelije, makrofaga, monocita i T ćelije.
[0032] U nekim primerima izvođenja, ćelija glodara je embrionalana matična ćelija (ES) glodara. U određenim primerima izvođenja, glodarska ES ćelija je mišja ES ćelija (npr., od 129 soja, C57BL soja, BALB/c ili njihova smeša). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarska embrionalana stem ćelija je mišja embrionalna stem ćelija i smeša je 129 i C57BL sojeva. U nekim određenim primerima izvođenja, glodarska embrionalna stem ćelija je mišja embrionalna stem ćelija i smeša je 129, C57BL i BALB/c sojeva.
[0033] U nekim primerima izvođenja, upotreba mišje ES ćelije opisane ovde da bi se stvorio glodar je opisana. U određenim primerima izvođenja, glodarska ES ćelija je mišja ES ćelija i korišćena je da stvori miša koji sadrži konstruisani lokus λ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, glodarska ES ćelija je pacovska ES ćelija i korišćena je za stvaranje pacova koji sadrži konstruisani lokus λ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano.
[0034] U nekim primerima izvođenja, tkivo glodara je izabrano od adipoznog tkiva, mokraćne bešike, mozga, dojke, kostne srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želudca, timusa, testisa, jajne ćelije, i njihove kombinacije.
[0035] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđena ćelija stvorena, generisana, proizvedena ili dobijena od izolovane ćelije ili tkiva glodara kao što je ovde korišćeno.
[0036] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je embrion glodara stvoren, generisan, proizveden, ili dobijen od glodarske ES ćelije kao što je ovde opisano. U izvesnim izvođenjima, embrion glodara je mišji embrion; u nekim izvođenjima, embrion je pacova.
[0037] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je komplet koji sadrži glodara, ćeliju glodara, tkivo glodara, imortalizovanu ćeliju glodarsku ES ćeliju, ili embrion glodara kao što je ovde opisano.
[0038] Komplet kao što je ovde opisan za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitelo ili njegov fragment) za terapiju ili dijagnozu je opisan.
[0039] Komplet kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitelo ili njegov fragment) za tretman, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja je opisan.
[0040] Takođe opisan je postupak za stvaranje glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina, pri čemu postupak sadrži (a) uvođenje DNK fragmenta u embrionalanu matičnu ćeliju glodara, pomenuti DNK fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja uključuje (i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, (ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i (iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena, gde su (i)-(iii) operativno vezani za nehumani segment Cλ gena, i gde nukleotidna sekvenca dalje se sastoji iz jednog ili više enhensera (Eλ) humanog λ lakog lanca imunoglobulina; (b) dobijanje embrionalne matične ćelije glodara stvorene u (a); i (c) stvaranje životinje glodara korišćenjem embrionalne matične ćelije glodara iz (b).
[0041] Takođe je opisan postupak stvaranja glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina je opisan, gde konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više segmenata humanog Jλ gena i jednog ili više segmenata humanog Cλ gena, gde jedan ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata su operativno vezani sa mišjem i/ili humanim Cλ genskim segmentom, i gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dodatno sadrži jedan ili više glodarskih enhansera λ lakog lanca imunoglobulina (Eλ), i jedan ili više humana enhansera λ lakog lanca imunoglobulina (Eλ), pri čemu postupak sadrži modifikovanje genoma klicine linije miša tako da on sadrži konstruisani lokus λ lakog lanca imunoglobulina koji uključuje inserciju jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više segmenata humanog Jλ gena i jednog ili više segmenata humanog Cλ gena, pri čemu humani Vλ i Jλ genski segmenti su operativno vezani sa mišjim i humanim Cλ genskim segmentom, i gde konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dodatno sadrži jedan ili više glodarskih enhansera λ lakog lanca imunoglobulina (Eλ), i jedan ili više humana enhansera λ lakog lanca imunoglobulina (Eλ), čime se stvara pomenutu glodar.
[0042] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara ovde opisanog, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje Vλ4-69 do Vλ3-1, Vλ5-52 do Vλ3-1 ili Vλ3-27 do Vλ3-1. U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je ovde opisano, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje Vλ5-52 do Vλ1-40 i/ili Vλ3-27 do Vλ3-1. U nekim određenim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je opisano, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vλ5-52 do Vλ1-40 i/ili Vλ3-27 do Vλ3-1. U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je opisano, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i jedan ili više segmenata humanog Cλ gena uključuje parove segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i segment humanog Jλ7 gena. U nekim određenim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je opisano, parovi segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6- Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanog Jλ i Cλ gena, i segment humanog Jλ7 gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7.
[0043] U nekim određenim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je opisano, insercija segmenata humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1 uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između segmenata humanog Vλ gena, insercija parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena, i insercija segmenta humanog Jλ7 gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7.
[0044] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je opisano, segment Cλ gena glodara je mišji segment Cλ1 gena.
[0045] U nekim slučajevima postupka stvaranja miša ovde opisanog, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više rekombinatnih mesta specifičnih za mesto. U nekim određenim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je ovde opisano, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više setova rekombinacionih mesta specifičnih za mesto koji se rekombinuju sa istom rekombinazom. U nekim slučajevima izvođenja postupka stvaranja glodara, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više setova rekombinacionih mesta specifičnih za mesto koji se rekombinuju sa različitim rekombinazama.
[0046] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara kako je ovde opisano, DNK fragment je uveden u glodarsku embrionalnu matičnu ćeliju čiji genom klicine linije sadrži (i) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca glodarskog imunoglobulina; ili (ii) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa konstantnim regionom
1
teškog lanca glodarskog imunoglobulina, i endogeni lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno povezani sa imunoglobulinskim Cκ regionom glodara.
[0047] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara ovde opisanim, DNK fragment je uveden u mišju embrionalnu matičnu ćeliju čiji genom klicine linije sadrži (i) divlji tip endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina; ili (ii) divlji tip endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina i divlji tip endogenog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina; i gde postupak dodatno sadrži korak ukrštanje miša stvorenog, generisanog, proizvedenog ili dobijenog od pomenute embrionalne matične ćelije glodara sa drugim mišem.
[0048] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara ovde opisanim, modfikovanje genoma klicine linije glodara tako da sadrži konstruisani lokus λ lakog lanca imunoglobulina je izvedeno u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara čiji genom klicine linije dodatno sadrži (i) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segment su operatvino vezani sa konstantnim regionom teškog lanca glodarskog imunoglobulina; ili (ii) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa konstantnim regionom teškog lanca glodarskog imunoglobulina, i endogeni lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani sa imunoglobulinskim Cκ regionom glodara.
[0049] U nekim određenim primerima izvođenja postupka stvaranja glodara ovde opisanim, insercija jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, humane nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih JHgenskih segmenata. U nekim određenim slučajevima postupka stvaranja glodara ovde opisanim, insercija jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih VK genskih segmenata i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata.
[0050] U nekim slučajevima postupka stvaranja glodara ovde opisanim, modifikovanje genoma klicine linije glodara tako da sadrži konstruisani imunoglobulinski lokus λ lakog lanca je izvedeno u embrionalnoj matičnoj ćeliji glodara čiji genom klicine linije sadrži (i) divlji tip endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca; ili (ii) divlji tip endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca i divlji tip endogenog imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca; i gde postupak dodatno sadrži korak ukrštanja miša stvorenog, generisanog, proizvedenog ili dobijenog od pomenute glodarske embrionalne matične ćelije sa drugim glodarom.
[0051] U nekim primerima izvođenja, miš kao što je ovde korišćeno ima genom klicine linije koji sadrži divlji tip IgH i Igκ lokusa, homozigotne ili heterozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, pri čemu homozigotni ili heterozigotni humanizovani IgH lokus sadrži inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu, ili homozigotni ili heterozigotni humanizovani IgH lokus (sa ili bez insercije Adam6-kodriajuće sekvence) i homozigotni ili heterozigotni inaktivirani Igκ lokus.
[0052] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je glodar stvoren, generisan, proizveden, dobijen ili koji se može dobiti iz postupka kao što je ovde korišćeno.
[0053] Takođe je opisan postupak za proizvodnju antitela u glodaru kako je opisano, pri čemu postupak sadrži korake (a) imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) održavanje glodara pod uslovima dovoljnim da glodar proizvodi imuni odgovor na antigen od interesa, i (c) rekuperacije antitela iz glodara, ili ćelije glodara, koje se vezuje za antigen od interesa. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni domen humanog lambda lakog lanca.
[0054] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za proizvodnju nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog lambda lakog lanca u glodaru kako je ovde opisano, pri čemu postupak sadrži korake (a) imunizovanja glodara kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) održavanje glodara pod uslovima dovoljnim da glodar proizvodi imuni odgovor na antigen od interesa, i (c) rekuperaciju nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog lambda lakog lanca iz glodara, ili ćelije glodara. U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži rekuperovanje nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog teškog lanca iz glodara, ili ćelije glodara.
[0055] U nekim primerima izvođenja postupka za proizvodnju antitela ili nukleinske kiseline u glodaru, ćelija glodara je B ćelija. U nekim primerima izvođenja postupka proizvodnje antitela ili nukleinske kiseline u glodaru, ćelija glodara je hibridom.
[0056] U nekim primerima izvođenja postupka proizvodnje antitela u mišu, antitelo rekuperaovano iz glodara, ili ćelije glodara, koje vezuje antigen od interesa sadrži varijabilni
1
domen humanog teškog lanca i varijabilni domen humanog lambda lakog lanca.
[0057] U nekim primerima izvođenja postupkaza proizvodnju antitela ili nukleinske kiseline u glodaru, varijabilni domen humanog teškog lanca uključuje rearanžirani segment humanog VHgena izabran iz grupe koja se sastoji od VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 i VH6-1.
[0058] U nekim primerima izvođenja postupka za proizvodnju antitela ili nukleinske kiseline u glodaru, varijabilni domen humanog lambda lakog lanca uključuje rearanžirani segment humanog Vλ gena izabran iz grupe koja se sastoji od Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 i Vλ3-1.
[0059] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za indukovanje antigenspecifičnog imunog odgovora kod glodara, pri čemu postupak sadrži korake (a) imunizacije glodara kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) održavanje glodara pod uslovima dovoljnim da glodar proizvodi imuni odgovor na antigen od interesa.
[0060] Takođe je opisan glodar čiji genom klicine linije sadrži homozigotni endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži inserciju (i) segmenta humanog Vλ gena Vλ4-69 do Vλ3-1, Vλ5-52 do Vλ3-1, Vλ3-27 do Vλ3-1, ili Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, (ii) parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6, (iii) segmenta humanog Jλ gena Jλ7, i (iv) tri humana enhansera imunoglobulinskog λ lakog lanca (ili enhansera humanog imunoglobulinskog λ lakog lanca koji ima tri elementa sekvence); gde (i)-(iv) su međusobno operativno povezani i insercija je ushodno od segmenta Cλ gena glodara, i gde endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca nema glodarski endogeni imunoglobulinski Eλ2-4.
[0061] U nekim primerima izvođenja, korišćen je glodar čiji genom klicine linije sadrži homozigotni endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži: (i) segmente humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1; (ii) parove segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6; (iii) segment humanog Jλ gena Jλ7 i (iv) tri humana enhansera imunoglobulinskog λ lakog lanca (humani inhenseri imunoglobulinskog λ lakog lanca koji imaju tri elementa sekvence) gde su (i)‑(iv) operativno vezani jedan za drugi i (i)‑(iii) su ushodno od (ili 5’) nehumanog segmenta Cλ gena, i gde endogenom lokusu imunoglobulinskog λ lakog lanca nedostaju endogeni nehumani imunoglobulinski Eλ2‑4,
1
humanni segmenti Vλ gena Vλ5‑52 do Vλ1‑40 i Vλ3‑27 do Vλ3‑1 obuhvata humanu nekodirajuću DNK koja je prirodno javlja između humanih segmenata Vλ gena, humanih parova segmenata Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena, i humani Jλ genski segment Jλ7 uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7.
[0062] U nekim određenim primerima izvođenja korišćeni glodar, Cλ gen glodara (ili segment gena) je mišji CJ1 gen (ili segment gena). U nekim određenim primerima izvođenja korišćenog glodara, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca dodatno sadrži endogen enhansere imunoglobulinskog λ lakog lanca glodarskog Eλ i Eλ3-1. U nekim određenim primerima izvođenja korišćenog glodara, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži deleciju endogenih glodarskih segmenata Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P gena i Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1 segmenata gena.
[0063] Takođe je opisan je glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr., antitelo ili njegov fragment) za terapiju ili dijagnozu.
[0064] Takođe je opisan glodar, ćelija ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji medikamnta za tretman, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0065] Takođe je opisana upotreba glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara kao što je ovde opisano u proizvodnji i/ili razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba kao medikament.
[0066] Takođe je opisana upotreba glodara ili ćelije kao što je ovde opisano u proizvodnji i/ili razvoju antitela ili njegovog fragmenta.
[0067] U različitim primerima izvođenja, korišćeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano je miš, ćelija miša ili tkivo miša; u nekim primerima izvođenja, pacov, ćelija pacova ili tkivo pacova. U nekim primerima izvođenja, miš, ćelija miša ili tkivo miša kao što je ovde opisano sadrži gentičku osnovu koja uključuje 129 soj, BALB/c soj, C57BL/6 soj, mešoviti 129xC57BL/6 soj ili njihove kombinacije.
[0068] Kao što je korišćeno u ovoj prijavi, termini "oko" i "približno" korišćeni su kao ekvivalentni. Bilo koji brojevi korišćeni u ovoj prijavi sa ili bez oko ili približno pokrivaju bilo koje normalne fluktuacije koje se podrazumevaju od strane stručnjaka u relevantnoj tehnici.
1
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0069] Crtež uključen ovde, koji je sastavljen od sledećih Slika, je samo dat u ilustrativne svrhe i nije ograničavajući.
Slika 1 prikazje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, primera strategije za konstrukciju konstruisanog endogenog lokusa lakog lanca Igλ kod glodara karakterisanog prisustvom više humanih Vλ, Jλ i Cλ kodirajućih sekvenci koje su operativno međusobno vezane i operativno vezane sa glodarskim Cλ regionom (ili glodarskim Cλ genom). Kao što je prikazano, pet zasebnih targeting vektora (6286, 6571, 6596, 6597 i 6680) su prikazani sa različitim količinama gentičkog materijala od humanog lokusa lakog lanca Igλ i sekvencijalno su inserirani u endogeni glodarski (npr., mišji) lokus lakog lanca Igλ (prikazan na vrhu). Prvi targeting vektor (6286) je inseriran nishodno od glodarskog Cλ1 regiona i konstruisan da sadrži modularni humani Igλ enhanser (Eλ) region (ili sekvencu) karakterisani sa tri elementa sekvence. Drugi targeting vektor (6571) je inseriran ushodno od glodarskog Cλ1 regiona i konstruisan je da sadrži pet funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanog Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena (Humani Jλ1-Cλ1-Jλ2-Cλ2-Jλ3-Cλ3-Jλ4-Cλ4-Jλ5-Cλ5-Jλ6-Cλ6- Jλ7). Treći (6596) i četvrti (6597) targeting vektor uključuju dodatne setove dodatnih segmenata humanog Vλ gena (jedanaest i devet, respektivno) koji sekvencijalno dodatju sadržaj ukupnom segmentu humanog Vλ gena endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igλ nakon uspešnog targetinga prvog targeting vektora. Oba targeting vektora uključuju regione preklapanja (pravougaonici ispunjeni prugama) na 3’ krajevima da bi se olakšala homologa rekombinacija sa 5’ krajem prethodnog targeting vektora po njegovoj integraciji u endogeni mišji lokus lakog lanca Igλ. Alternativni peti targeting vektor (6680) je takođe prikazan koji ima isti gentički materijal kao 6597 targeting vektor izuzev što ovaj alternativni targeting vektor uključuje 5’ homologu ruku koja ima sekvencu koja je identična sa sekvencom 5’ (ili ushodno) od glodarskog segmenta Vλ2 gena, čime se olakšava delecija endogenih Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4PCλ4P- Eλ2-4-Vλ1-jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1 genskih segmenata nakon homologe rekombinacije sa targeting vektorom. Ukoliko nije drugačije naznačeno, zatvoreni simboli označavaju glodarske genske segmente i/ili sekvence, dok otvoreni simboli označavaju humane genske segmente i/ili sekvence. Mesta prepoznavanja rekombinacije specifična za mesto (npr., loxP, Frt) flankirajuće selekcione kasete (HYG: gen za rezistenciju na
1
higromicin [HYGR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora; NEO: gen za rezistenciju na neomicin [NEOR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora) su takođe prikazani. Izabrana mesta spajanja nukleotida su markirana sa linijom ispod svakog spoja i svaka je označena sa SEQ ID NO.
Slika 2 prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, primera glodarskih alela Igλ lakog lanca nakon sekvencijalne insercije targeting vektora opisane u Primeru 1.
6597 alel: alel Igλ lakog lanca koji sadrži 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanog Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena operativno vezan za glodarski Cλ region (npr., mišji Cλ1 region), i čiji lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje endogen Vλ-Jλ-Cλ genske segmente, tri (tj., E2.4, E i E3.1) endogen Igλ enhanser regione (ili sekvence) i modularni humani Igλ enhanser region (ili sekvencu) karakterisanu sa tri elementa sekvence. 6680 alel: alel Igλ lakog lanca nakon selecije specifične za mesto endogenih Vλ-Jλ-Cλ genskih segmenata i Igλ enhansera Eλ2-4, čiji alel Igλ lakog lanca sadrži 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanih Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena operatvno vezan sa glodarskim Cλ regionom (npr., mišji Cλ1 region), čiji lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje dva (tj., E i E3.1) endogena Igλ enhanser regiona (ili sekvence) i modularni humani Igλ enhanser region (ili sekvencu, videti prethodno). Ukoliko nije drugačije naznačeno, zatvoreni simboli označavaju glodarske genske segmente i/ili sekvence, dok otvoreni simboli označavaju humane genske segmente i/ili sekvence. Mesta prepoznavanja rekombinacije specifična za mesto (npr., Frt) flankrajuće selekcione kasete (HYG: gen za rezistenciju na higromicin [HYGR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora) su prikazani. Isprekidane linije označavaju deletirani region između dva ilustrovana Igλ alela. Izabrane lokacije spoja nukleotida su markirana sa linijom ispod svakog spoja i svaki je označen sa SEQ ID NO.
Slika 3 prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, alternativnog primera strategije za konstrukciju konstruisanog endogenog lokusa lakog lanca Igλ kod glodara karakterisanog sa prisustvom više humanih Vλ, Jλ i Cλ kodirajućih sekvenci koje su operativno međusobno vezane i operativno vezane sa glodarskim Cλ regionom. Kao što je prikazano, dva različita targeting vektora su prikazana sa različitim količinama gentičkom materijala od humanog lokusa lakog lanca Igλ i simultano su inserirani u konstruisani glodarski (npr., mišji) lokus lakog lanca Igλ (prikazan na vrhu) koji sadrži pet segmenata humanog Vλ gena, humani Jλ-Cλ klaster, i mišji Cλ1 gen. 6596 targeting vektor je modfikovan da bi se uklonila neomicin
1
selekciona kaseta i inkorporisale preklapajuće sekvence (pravougaonici ispunjeni prugama) na 5’ i 3’ krajevima da obezbede regione homologije da olakšaju rekombinaciju sa odgovarajućom humanom sekvencom. Drugi targeting vektor je dizajniran da sadrži preklapajući region na 3’ kraju kostrukta (pravougaonici ispunjeni prugama) koji deli homologiju sekvence sa modifikovanim 6596 targeting vektorom (trimovani-6596 targeting vektor), koji olakšava homologu rekombinaciju sa 5’ krajem trimovanog-6596 targeting vektora. Ova dva targeting vektora uključuju dodatne setove dodatnih segmenata humanog Vλ gena (jedanaest i devet, respektivno) koji sekvencijalno dodaju ukupnom sadržaju segmenat humanog Vλ gena endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igλ nakon uspešnog targetinga prvog targeting vektora. Drugi targeting vektor uključuje 5’ homologu ruku koja ima sekvencu koja je identična sa sekvencom 5’ (ili ushodno) od glodarskog Vλ2 genskog segmenta, čime se olakšava delecija endogenih Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P-Eλ2-4-Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1 genskih segmenata nakon homologe rekombinacije sa targeting vektorom. Dva targeting vektora su ko-electroporisani sa vodećim RNKs (gRNK) da bi se olakšala integracija konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ, koji su obeleženi sa strelicom blizu lokacije svake sekvence i svajka je označena sa SEQ ID NO. Ukoliko nije drugačije naznačeno, zatvoreni simboli označavaju glodarske genske segmente i/ili sekvence, dok otvoreni simboli označavaju humane genske segmente i/ili sekvence. Meta prepoznavanja rekombinacije specifična za mesto (npr., loxP, Frt) flankirajućih selekcionih kaseta (HYG: gen za rezistenciju na higromicin [HYGR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora; NEO: gen za rezistenciju na neomicin [NEOR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora) su takođe prikazani. Izabrana mesta spojeva nukleotida su markirana sa linijom ispod svakog spoja i svako je označeno sa SEQ ID NO.
Slika 4 prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, divljeg tipa i primera konstruisanih glodarskih alela Igλ lakog lanca glodara korišćenih u eksperimentima opisanim u Primeru 3. Alel divljeg tipa: divlji tip mišjeg lokusa lakog lanca Igλ (videti takođe, npr., Slika 2 od SAD Patenta br. 9,006,511); 6571 alel: alel Igλ lakog lanca koji sadrži 5 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanih Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena operativno povezan sa glodarskim Cλ regionom (npr., mišji Cλ1 region), i čiji lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje endogen Vλ-Jλ-Cλ genske segmente, tri endogena Igλ enhanser regiona (ili sekvence) i modularni humani Igλ enhanser region (ili sekvencu, videti prethodno).
6597 alel: videti prethodno; 6680 alel: videti prethodno. Izabrana mesta spojeva
2
nukleotida su markirana ispod svakog spoja i svako je naznačeno sa SEQ ID NO. Slike 5A i 5B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju pojedinačne ćelijski gejtovane splenocite (A) koje prikazuju ekspresiju CD19 (y-osa) i CD3 (xosa), i apsolutni broj ćelija po slezini (B) sakupljen od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT).
Slike 6A i 6B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju zrele i prelazne B ćelije u splenocitama gejtovane na CD19+ (A) prikazuju ekspresiju IgD (yosa) i IgM (x-osa), i apsolutni broj ćelija po slezini (B) sakupljen po mišu homozigotnom za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT). Subpopulacije B ćelija su naznačene na svakom tačkastom plotu (npr., zrele, prelazne).
Slike 7A i 7B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju mišju Igλ (mIgλ, y-osa), mišju Igκ (mIgκ, x-osa) ili humanu Igλ, (hIgλ, y-osa) ekspresiju u CD19+-gejtovanim splenocitama sakupljenim od miševa homozigotnih ta inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT).
Slike 8A i 8B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju pojedinačnom ćelijom-gejtovanu kostnu srž (A) prikazuje ekspresiju CD19 (y-osa) i CD3 (x-osa), i apsolutni broj ćelija po femuru (B) sakupljene od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT).
Slike 9A i 9B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju CD19+IgM<low>B220<int>-gejtovanu kostnu srž (A) prikazuje ekspresiju c-kit (y-osa) i CD43 (x-osa), i apsolutni broj ćelija po femuru (B) sakupljene od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT). Subpopulacije specifičnih B ćelija su označene na svakoj tački plota (npr., pro-B, pre-B).
Slike 10A i 10B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju CD19+-gejtovanu kostnu srž (A) prikazuje ekspresiju IgM (y-osa) i B220 (x-osa), i apsolutni broj ćelija po femuru (B) sakupljene od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divlji tip mladunaca iz istog okota (WT). Subpopulacije specifičnih B ćelija su naznačene na svakoj tački plota (npr., nezrele, zrele, pre- i pro-B).
Slike 11A i 11B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju nezrelu kostnu srž (CD19+IgM<+>B220<int>-gejtovane) koji prikazuju ekspresiju mišjeg Igλ (mIgλ, y-osa), mišjeg Igκ (mIgκ, x-osa) ili humanog Igλ (hIgλ, y-osa) od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT).
Slike 12A i 12B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju zrelu kostnu srž (CD19+IgM<+>B220<+>-gejtivanu) koji prikazuju mišji Igλ (mIgλ, y-osa), mišji Igκ (mIgκ, x-osa) ili humani Igλ (hIgλ, y-osa) od miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divljeg tipa mladunaca iz istog okota (WT).
Slika 13 reprezentativnu srednju vrednost procenta Igκ-eksprimirajućih (% κ C) i humanih Igλ-eksprimirajućih (% hum λ C) B ćelija u jetri, nezrele kostne srži (nezrela BM) i zrele kostne srži (zrela BM) od izabranih konstruisanih mišjih sojeva kao što je opisano ovde. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti sa takođe naznačenom standardnom devijacijom. 6680HO/VIHO/Adam6 HO: konstruisani mišji soj koji sadrži homozigotni konstruisani lokus lakog lanca Igλ dizajniran sa sadrži 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanog Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena operatvino vezan sa glodarskim Cλ regionom (npr., mišji Cλ1 region), čiji lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje dva endogena Igλ enhanser regiona (ili sekvence) i modularni humani Igλ enhanser region (ili sekvencu, videti prethodno); i homozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, čiji homozigotni humanizovani IgH lokus je sadržao inseriranu glodarsku Adam6-kodriajuću sekvencu (videti, npr., SAD Patent br. 8,642,835 i 8,697,940; 6889HO/VI HO/Adam6 HO: konstruisani mišji soj koji sadrži homozigotni konstruisani lokus lakog lanca Igλ koji sadrži 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, četiri funkcionalna para segmenata humanog Jλ-Cλ gena i segment humanog Jλ7 gena operatvino vezan sa glodarskim Cλ regionom (npr., mišjim Cλ1 regionom), čiji lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje dva endogena Igλ enhanser regiona (ili sekvence) i modularni humani Igλ enhanser region (ili sekvencu, videti prethodno); i homozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, čiji homozigotni humanizovani IgH lokus je sadržao inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu (videti, npr., SAD Patent br.
8,642,835 i 8,697,940). Broj miševa za svaku prikazanu kohortu genotipa uključuje najmanje tri i do osam životinja po grupi.
Slike 14A i 14B prikazuju reprezentativne imunoblotove (Western blotovi) SDS-PAGE pod neredukujućim uslovima korišćenjem seruma izolovanog iz konstruisanih miševa homozigotnih za inserciju 6680 targeting vektora (6680HO) i divlji tip ladunaca iz istog okota (WT) označavajući ekspresiju mišjih (B, desna slika) ili humanih (A, leva slika) λ lakih lanaca; svaki uzorak je stavljen na staze u zapremini od 1.5ml seruma. PHS: pulovani humani serum sa zapreminom od 0.25ml (Labquip Ltd Cat#9101A). Molekulske težine u Kd su označene desno od svake slike gela. Slika 15A prikazuje upotrebu reprezentativnog humanog Vλ (vrh) i humanog Jλ (dno) genskog segmenta u humanim Cλ-prajmovanim sekvencama amplifikovanim od RNK izolovane iz splenocita sakupljenih od 6889HET miševa (n=5).
Slika 15B prikazuje upotrebu reprezentativnog humanog Vλ genskog segmenta u mišjim Cλ-prajmovanim sekvencama amplifikovanim od RNK izolovane iz splenocita sakupljenih od 6889HET miševa (n=5).
Slika 15C prikazuje upotrebu reprezentativnog humanog Vλ (vrh) i humanog Jλ (dno) genskog segmenta u humanim Cλ-prajmovanim sekvencama amplifikovanim od RNK izolovane iz splenocita sakupljenih od 6889HO/VI HO/Adam6 HO miševa (n=6). Slika 15D prikazuje upotrebu reprezentativnog humanog Vλ genskog segmenta u mišjim Cλ-prajmovanim sekvencama amplifikovanim od RNK izolovane iz splenocita sakupljenih od 6889HO/VI HO/Adam6 HO miševa (n=6).
Slike 16A i 16B prikazuju reprezentativne ukupne IgG (A) i antigen-specifične IgG (B) titre u serumu na dane 0 i 22 sakupljene od imunizovanih miševa heterozigotnih za inserciju 6597 (6597HET, n=6) ili 6680 (6680HET, n=6) targeting vektora i imunizovanih kontrola divljeg tipa (WT, n=6).
Slike 17A-C prikazuju reprezentativne titre humanog λ lakog lanca (hIgλ, left), mišjeg λ lakog lanca (mIgλ, middle) i mišjeg κ lakog lanca (mIgκ, desno) u antigenspecifičnom IgG u serumu na dane 0 i 22 sakupljene od imunizovanih miševa heterozigotnih za inserciju 6597 (6597HET, n=6) ili 6680 (6680HET, n=6) targeting vektora i imunizovanih kontrola divljeg tipa (WT, n=6).
Slike 18A i 18B pokazuju reprezentativne konturne plotove koji označavaju pojedinačnom ćelijom-gejtovane splenocite (levo) prikazujući ekspresiju CD19 (yosa) i CD3 (x-osa), i ukupne B ćelije po slezini (desno) sakupljene od miševa homozigotnih za inserciju 6889 targeting vektora (6889HO VI HO Adam6 HO) i referentnih konstruisanih miševa (VI). 6889HO/VI HO/Adam6 HO: videti prethodno; VI: konstruisani mišji soj koji sadrži homozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, čiji homozigotni humanizovani IgH lokus je sadržao inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu (videti, npr., SAD Patent br. 8,642,835 i 8,697,940;). Žive splenocite od pojedinačne ćelije su definisane bojenjen za vijabilnost (Thermo Fisher).
Slika 19 pokazuje reprezentativne konturne plotove koji označavaju ekspresiju humanog Igλ (hIgλ, y-osa) i mišjeg Igκ (mIgκ, x-osa) u CD19+-gejtovanim splenocitama sakupljenim od miševa homozigotnih za inserciju 6889 targeting vektora
2
(6889HO VI HO Adam6 HO) i referentnih konstruisanih miševa (VI). 6889HO/VI HO/Adam6 HO: videti prethodno; VI: videti prethodno.
Slika 20 pokazuje reprezentativne konturne plotove koji označavaju pojedinačnom ćelijom-gejtovane limfocite iz kostne srži koje prikazuju ekspresiju IgM (y-osa) i B220 (x-osa) sakupljene iz femura miševa hmozigotnih za inserciju 6889 targeting vektora (6889HO VI HO Adam6 HO) i referentnih konstruisanih miševa (VI).
6889HO/VI HO/Adam6 HO: videti prethodno; VI: videti prethodno. Nezrele i zrele subpopulacije B ćelija su označene na svakom konturnom plotu.
Slika 21 pokazuje reprezentativne konturne plotove koji označavaju nezrelu (CD19<+>IgM<+>B220<int>-gejtovana, leva kolona) i zrelu (CD19<+>IgM<+>B220<+>-gejtovanu, desna kolona) kostnu srž koja pokazuje ekspresiju humanog Igλ (hIgλ, y-osa) i mišjeg Igκ (mIgκ, x-osa) od miševa homozigotnih za inserciju 6889 targeting vektora (6889HO VI HO Adam6 HO) i referentnih konstruisanih miševa (VI). 6889HO/VI HO/Adam6 HO: videti prethodno; VI: videti prethodno.
KRATAK OPIS IZABRANIH SEKVENCI U LISTINGU SEKVENCI
[0070]
Mišja Cλ1 DNK (SEQ ID NO:1):
Mišja Cλ2 DNK (SEQ ID NO:3):
Mišja Cλ3 DNK (SEQ ID NO:5):
Cλ1 DNK pacova (SEQ ID NO:7):
2
Cλ2 DNK pacova (SEQ ID NO:9):
Cλ3 DNK pacova (SEQ ID NO:11):
Cλ4 DNK pacova (SEQ ID NO:13):
Cλ4 aminokiselina pacova (SEQ ID NO:14):
2
DEFINICIJE
[0071] Obim predmetnog pronalaska je definisan priključenim patentnim zahtevima i nije ograničen određenim primerima izvođenja opisanim ovde.
[0072] Generalno, termini korišćeni ovde su u skladu sa njihovim podrazumevanim značenjem u tehnici, ukoliko nije jasno drugačije naznačeno. Eksplicitne definicije određenih termina su obezbeđene u nastavku; značenja ovih i drugih termina u naročitim skulajevima u ovoj specifikaciji biće jasna stručnjacima iz konteksta. Dodatne definicije za sledeće i druge termine su date u ovojh specifikaciji.
[0073] Primena: kao što je ovde korišćeno, uključuje primenu kompozicije na subjekta ili sistem (npr., na ćeliju, organ, tkivo, organizam, ili relevantnu komponentu ili set njegovih komponenti). Stručnjak će shvatiti da put primene može varirati u zavisnosti od, na primer, subjekta ili sistema na koji se primenjuje kompozicija, prirode kompozicije, svrhe primene, itd. Na primer, u određenim primerima izvođenja, primena na životinjskog subjekta (npr., na čoveka ili glodara) može biti bronhijalna (uključujući bilo koju bronhijalnu instilaciju), bukalna, enteralna, interdermalna, intra-arterijalna, intradermalna, intragastrična, intramedularna, intramuskularna, intranazalna, intraperitonealna, intratekalna, intravenska, intraventrikularna, mukozalna, nazalna, oralna, rektalna, potkožna, sublingvalna, topikalna, trahealna (uključujući sa intratrahealnom instilacijom), transdermalna, vaginalna i/ili vitrealna. U nekim primerima izvođenja, primena može uključivati intermitentno doziranje. U nekim primerima izvođenja, primena može uključivati kontinuirano doziranje (npr., perfuziju) najmanje izabrani vremenski period.
[0074] Poboljšavanje: kao što je ovde korišćeno, uključuje prevenciju, smanjenje ili olakšavanje stanja, ili poboljšanje stanja subjekta. Poboljšanje uključuje ali ne zahteva kompletni oporavak ili kompletnu prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja.
[0075] Približno: primenjeno na jednu ili više vrednosti od interesa, uključuje vrednost koj aje slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim primerima izvođenja, termin "približno" ili "oko" odnosi se na opseg vrednosti koje spadaju unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kom smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednsoti ukoliko nije drugačije navedeno ili drugačije evidentno iz konteksta (osim gde bi takav broj prešao 100% moguće vrednosti).
[0076] Biološki aktivno: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na karakteristiku bilo kog
2
sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr., u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološki efekat unutar tog organizma za koj se smatra da je biološki aktivan. U određenim primerima izvođenja, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli najmanje jednu biološku aktivnost sa proteinom ili polipeptidom tipično se označava kao "biološki aktivan" deo.
[0077] Uporedivo: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na dva ili više sredstava, entiteta, situacija, setova uslova, itd. Koji ne moraju biti međusobno identični ali su dovoljno slični da omoguće poređenje između tako da se mogu racionalno izvući zaključci na osnovu uočenih razlika ili sličnosti. Stručnjaci će shavatiti, u kontekstu, koji je stepen identičnosti neophodan u bilo kojim datim okolnostima za dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, setova uslova, itd., da bi se smatrali uporedivim.
[0078] Konzervativno: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na slučajeve kada se opisuju supstitucije konzervativnih aminokiselina, uključujući supstituciju aminokiselinskog ostatka sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski promeniti funkcionalne osobine od interesa za protein, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju: alifatične bočene lance kao što su glicin (Gly, G), alanin (Ala, A), valin (Val, V), leucin (Leu, L), i izoleucin (Ile, I); alifatičnihidroksil bočni lanci kao što su serin (Ser, S) i treonin (Thr, T); bočni lanci koji sadrže amid kao što je asparagin (Asn, N) i glutamin (Gln, Q); aromatične bočne lance kao što je fenilalanin (Phe, F), tirozin (Tyr, Y), i triptofan (Trp, W); bazne bočne lance kao što je lizin (Lys, K), arginin (Arg, R), i histidin (His, H); kisele bočne lance kao što je asparaginska kiselina (Asp, D) i glutaminska kiselina (Glu, E); i bočne lance koji sadrže sumpor kao što su cistein (Cys, C) i metionin (Met, M). Supstitucije grupa konzervativnih aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin (Val/Leu/Ile, V/L/I), fenilalanin/tirozin (Phe/Tyr, F/Y), lizin/arginin (Lys/Arg, K/R), alanin/valin (Ala/Val, A/V), glutamat/aspartat (Glu/Asp, E/D), i asparagin/glutamin (Asn/Gln, N/Q). U nekim primerima izvođenja, supstitucij akonzervativne aminokiseline može biti supstitucija bilo kog nativnog ostataka u proteinu sa alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alalnin skening mutagenzi. U nekim primerima izvođenja, napravljana je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log-likelihood matrix opisanom u Gonnet, G.H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. U nekim primerima izvođenja, susptitucij je umereno konzervativnasupstitucija gde supstitucija ima ne-negativnu vrednost u PAM250 log-likelihood matrix.
[0079] Kontrola: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na podrazumeva značenje u tehnici za
2
"kontrolu" koje je standard sa kojim se porede rezultati. Tipično, kontrole se koriste da pomognu integritetu u eksperimentima izolovanjem promenljivih da bi se napravio zaključak o takvim promenljivim. U nekim primerima izvođenja, kontrola je reakcija ili analiza koja se izvodi istovremeno sa test reakcijom ili analizom da bi se obezbedio komparator. "Kontrola" takođe uljučuje "kontrolnu životinju." "Kontrolna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je različita od one opisane ovde, ili bez modifikacije (tj., životinja divljeg tipa). U jednom eksperimentu, "test" (tj., promenljiva koja se testira) je primenjena. U drugom eksprimentu, "kontrola," varijabla koja se testira nije primenjena. U nekim primerima izvođenja, kontrola je istorijska kontrola (tj., iz testa ili analize prethodno izvedene, ili količina ili rezultat koji je prethodno poznat). U nekim primerima izvođenja, kontrola je ili sadrži štampani ili na drugi način sačuvan zapis. Kontrola može biti pozitivna kontrola ili negativna kontrola.
[0080] Izvedeno iz: kada se koristi u odnosu na rearanžirani varijabilni region gena ili varijabilni domen "izveden iz" nerearanžiranog varijabilnog regiona i/ili nerearanžiranog varijabilnog regiona genskih segmenata odnosi se na sposonost da se prati sekvenca rearanžiranog varijabilnog regiona gena ili varijabilnog domena unazad do seta nerearanžiranog variajbilnog regiona genskih segmenata koji su rearanžirani da bi se formirao varijabilni region gena koji eksprimira varijabilni domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, splajs razlike i somatske mutacije). Na primer, rearanžirani varijabilni region gena koji ima somatsku mutaciju ne menja činjenicu da je izveden iz nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona.
[0081] Disrupcija: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na rezultat događaja homologe rekombinacije sa DNK molekulom (npr., sa endogenom homologom sekvencom kao što je gen ili lokus gena). U nekim primerima izvođenja, disrupcija može postići ili predstavljati inserciju, deleciju, supstituciju, zamenu, missens mutaciju, ili pomeranje okvira DNK sekvence (sekvenci), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Insercije mogu uključivati inserciju celih gena ili fragmenata gena, npr., egzona, koji mogu biti drugog porekla od endogen sekvence (npr., heterologa sekvenca). U nekim primerima izvođenja, disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr., polipeptida kodiranog sa genom). U nekim primerima izvođenja, disrupcija može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvođenja, disrupcija može izmeniti sekvencu gena ili kodiranog proizvoda gena (npr., kodiranog polipeptida). U nekim primerima izvođenja, disrupcija može skratiti ili fragmentisati gen ili kodirani proizvod gena (npr., kodirani polipeptid). U nekim primerima izvođenja, disrupcija može produžiti gen ili kodirani proizvod gena. U nekim takvim primerima izvođenja, disrupcija može postići sastavljanje
2
fuzionog polipeptida. U nekim primerima izvođenja, disrupcija može uticati na nivo, ali ne na aktivnost, gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvođenja, disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne na nivo, gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvođenja, disrupcija ne mora imati nikakav značajan efekat na nivo gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvođenja, disrupcija ne mora imati nikakav značajan efekat na aktivnost gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvođenja, disrupcija ne mora imati nikakav značajan efekat ni na nivo ni na aktivnost na nivo gena ili proizvoda gena.
[0082] Određivanje, merenje, evaluacija, procena, analiza i analiziranje: se ovde koriste naizmenično u odnosu na bilo koji oblik merenja, i uključuje određivanje da li je element prisutan ili nije. Ovi termini uključuju i kvantitativne i/ili kvalitativne odrednice. Analiziranje može biti relativno ili apsolutno. "Analiziranje prisustva" može biti određivanje količine nečega prisutnog i/ili određivanje da li je ili nije prisutno ili odsutno.
[0083] Endogeni lokus ili endogeni gen: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na genski lokus koji s enalazi u roditeljskom ili referentnom organizmu pre introdukcije disrupcije, delecije, zamene, izmene, ili modifikacije kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus ima sekvencu koja se nalazi u prirodi. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus je lokus divljeg tipa. U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus je konstruisani lokus. U nekim primerima izvođenja, referentni organizam je organizam divljeg tipa. U nekim primerima izvođenja, referentni organizam je konstruisani organizam. U nekim primerima izvođenja, referentni organizam je organizam uzgojen u laboratoriji (bilo da je divljeg tipa ili konstruisan).
[0084] Endogeni promotor: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na promotor koji je u prirodi povezan, npr., u organizmu divljerg tipa, sa endogenim genom.
[0085] Konstruisan: kao što je ovde korišćeno odnosi se, generalno, na to da je manipulisan od strane čoveka. Na primer, u nekim primerima izvođenja, polinukleotid se može smatrati "konstruisanim" kada dve ili više sekvenci koje nisu povezane u tom redosledu u prirodi su manipulisane od strane čoveka da budu direktno međusobno povezane u konstruisanom polinukleotidu. U nekim određenim takvim primerima izvođenja, konstrisani polinukelotid može sadržati regulatornu sekvencu koja se nalazi u prirodi u operativnoj vezi sa prvom kodirajućom sekvencom ali ne u operativnoj sa drugom kodirajućom sekvencom, je povezana od strane čoveka tako da je operativno vezana sa drugom kodirajućom sekvencom. Alternativno, ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, prva i druga sekvenca nukleonske kiseline pri čemu svak kodira polipeptidne elemente ili domene koji u prirodi nisu međusobno vezani mogu biti međusobno vezani u jednom konstruisanom polinukleotidu. Uporedivo sa tim, u nekim primerima izvođenja, ćelija ili organizam se mogu smatrati "konstruisanim" ukoliko su manipulisani tako da je izmenjena njihova gentička informacija (npr., novi gentički materijal koji prethodno nije bio prisutan je introdukovan, ili je prethodno prisutni gentički materijal izmenjen ili uklonjen). Kao što je uobičajena praksa i podrazumeva se od strane stručnjaka, potostvo konstruisanog polinukelotida ili ćelije tipično se označavaju kao "konstruisani" iako je stavrna manipulacija izvedena na prethodnom entitetu. Dodatno, što će stručnjaci shvatiti, različite metodologije su dostupne preko kojih se "konstruisanje" kao što je ovde opisano može postići. Na primer, u nekim primerima izvođenja, "konstruisanje" može uključivati selekciju ili dizajn (npr., sekvenci nukleinske kiseline, polipeptidnih sekvenci, ćelija, tkiva, i/ili organizama) preko upotrebe kompjuterskih sistema programiranih da izvedu analizu ili poređenje, ili na drugi način analiziraju, preporuče, i/ili izaberu sekvence, izmene, itd.). Alternativno, ili dodatno, U nekim primerima izvođenja, "konstruisanje" može uključivati upotrebumetodologije in vitro hemijske sinteze i/ili tehnologije rekombinantne nukleinske kiseline kao što su, na primer, amplifikacija nukleinske kiseline (npr., preko lančane reakcije polimeraze) hibridizacija, mutacija, transformacija, transfekcija, itd., i/ili bilo koja od različitih metodologija kontrolisanog parenja. Kao što će biti jasno stručnjacima, različite takve ustanovljene tehnologije (npr., za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija, itd.) su dobro poznate u tehnici i opisane su u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i/ili razmatrane u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 i Principles of Gen Manipulation: An Introduction do Gentic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. i S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994.
[0086] Funkcionalno: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na oblik ili fragment entiteta (npr., gen ili segment gena) koji pokazuje određenu osobinu (npr., formira deo kodirajuće sekvence) i/ili aktivnosti. Na primer, u kontekstu imunoglobulina, varijabilni domeni su kodirani jedinstvenim genskim segmenatima (tj., V, D i/ili J) koji su sastaljeni (ili rekombinovani) da bi formirali funkcionalne kodirajuće sekvence. Kada su prisutni u genomu, genski segmenati su organizovani u klastere, iako se dešavaju varijacije. "Funkcionalni" genski segment je genski segment predstavljen u eksprimiranoj sekvenci (tj., varijabilni domen) za koji je odgovarajuća genomska DNK izolovana (tj., klonirana) i identifikovana po sekvenci. Neke sekvence imunoglobulinskog genskog segmenta sadrže otvorene okvire čitanja i smatraju se funkcionalnim iako nisu predstavljene u eksprimiranom repertoaru, dok druge sekvence imunoglobulinskog genskog segmenta sadrže mutacije (npr., tačkaste mutacije, insercije, delecije, itd.) što rezultuje u stop kodonu i/ili skraćenoj sekvenci koja posledično čini sekvence takvog genskog segmenta nesposobnim da izvode osobinu/osobine
1
i/ili aktivnost/aktivnosti sa nemutiranom sekvencom(sekvencama). Takve sekvence nisu predstavljene u eksprimiranim sekvencama i, stoga, kategorizovane su kao pseudogeni.
[0087] Gen: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na DNK sekvencu u hromozomu koja kodira proizvod (npr., RNK proizvod i/ili polipeptidni proizvod). U nekim primerima izvođenja, gen uključuje kodriajuću sekvencu (tj., sekvencu koja kodira određeni proizvod). U nekim primerima izvođenja, gen uključuje nekodirajuću sekvencu. U nekimodređenim primerima izvođenja, gen može uključivati i kodirajuću (npr., egzonsku) i nekodirajuću (npr., intronsku) sekvencu. U nekim primerima izvođenja, gen može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci (npr., promotore, enhansere, itd.) i/ili intronske sekvence koje, na primer, mogu kontrolisati ili uticati na jedan ili više aspekata ekspresije gena (npr., ekspresija specifična za tip ćelije, inducibilna ekspresija, itd.). U svrhu jasnoće, napominjemo da, kao što je korišćeno u predmetnom opisu, termin "gen" se generalno osnosi na deo nukelinske kiseline koja kodira polipeptid ili njegov fragment; termin može izborno obuhvatati regulatorne sekvence, što će stručnjacima biti jasno iz konteksta. Nije namera da ova definicija isključuje primenu termina "gen" na ne-protein-kodirajuće ekspresione jedinice već pre da razjasni da, u većini slučajeva, termin kao što je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na polipeptid-kodirajuću nukleinsku kiselinu.
[0088] Heterologan: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na sredstvo ili entitet iz različitog izvora. Na primer, kada se koristi u odnosu na polipeptid, gen, ili genski proizvod prisutan u određenoj ćeliji ili organizmu, termin objašnjava da relevantni polipeptid, gen, ili genski proizvod: 1) je konstruisan od strane čoveka; 2) je introdukovan u ćeliju ili organizam (ili njegov prekursor) posredstvom čoveka (npr., preko genetičkog inženjeringa); i/ili 3) nije prirodno porizveden od strane ili prisutan u relevantnoj ćeliji ili organizmu (npr., relevantnom tipu ćelije ili tipu organizma). "Heterologan" takođe uključuje polipeptid, gen ili genski proizvod koji je normalno prisutan u određenoj nativnoj ćeliji ili organizmu, ali je izmenjen ili modifikovan, na primer, mutacijom ili stavljanjem pod kontrolu ne-prirodno povezanih i, u nekim primerima izvođenja, ne-endogenih regulatornih elemenata (npr., promotora).
[0089] Ćelija domaćin: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na ćeliju u koju je introdukovana nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci će ankon čitanja ovog opisa shvatiti da se takvi termini ne odnose samo na određenu ćeliju subjekta, već su takođe korišćeni u odnosu na potomstvo takve ćelije. Kako se određene modifikacije mogu desiti u narednim generacijama ili usled mutacije ili sredinskih uticaja, takva progenija ne mora, zaista, biti identična sa roditeljskom ćelijom, ali je i dalje uključena unutar obima fraze "ćelija domaćin." U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je ili sadrži prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Generalno, ćelija domaćin je bilo koja ćelija koja je pogodna za primanje i/ili proizvodnju
2
heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na carstvo u kom je klasifikovana ćelija. Primeri ćelija uključuju one od prokariota i eukariota (jedna ćelija ili više ćelija), bakterijskih ćelija (npr., sojeva Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelija mikobakterija, ćelija gljiva, ćelija kvasca (npr., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, itd.), ćelija biljaka, ćelija insekata (npr., SF-9, SF-21, bakulovirus-inficirane ćelije insekata, Trichoplusia ni, itd.), ćelije glodara, humane ćelije, ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim primerima izvođenja, ćelija je humana, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova, ili mišja ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija je eukariotska i izabran je od sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), retinalne ćelije, Vero, CV1, bubrega (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, ćelija tumora, i ćelijska linija izvedena iz prethodno pomenutih ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr., retinalna ćelija koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6® ćelija). U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je ili sadrži izolovanu ćeliju. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je deo tkiva. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je deo organizma.
[0090] Identičnost: kao što je ovde korišćeno u vezi sa poređenjem sekvenci, odnosi se na identičnost kao što je određena određenim brojem različitih algoritama poznatih u tehnici koji se mogu koristiti da se izmeri identičnost nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence. U nekim primerima izvođenja, identičnosti opisane ovde su određene korišćenjem ClustalW v. 1.83 (sporog) poravnanja koji koristi open gap penalty od 10.0, extend gap penalty od 0.1, i koristi Gonnet similarity matrix (MACVEKTOR™ 10.0.2, MacVektor Inc., 2008).
[0091] In vitro: kao što je ovde korišćeno odnosi se na događaje koji se odigravaju u veštačkoj sredini, npr., u epruveti ili reakcionom sudu, u kulturi ćelija, itd., pre nego unutar multi-celularnog organizma.
[0092] In vivo: kao što je ovde korišćeno odnosi se na događaje koji se dešavaju unutar multicelularnog organizma, kao što j ečovek i/ili pacov. U kontekstu sistema zasnovanih na ćeliji, termin se može koristiti da se odnosi na događaje koji se dešavaju unutar žive ćelije (nasuprot, na primer, in vitro sistemima).
[0093] Izolovano: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na supstancu i/ili entitet koji je (1) razdvojen od najmanje nekih od komponenata sa kojima je povezan kada je inicijalno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju), i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen, i/ili proizveden od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se razdvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% drugih komponenata sa kojima su bili inicijalno povezani. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su razdvojena od 10% do 100%, 15%-100%, 20%-100%, 25%-100%, 30%-100%, 35%-100%, 40%- 100%, 45%-100%, 50%-100%, 55%-100%, 60%-100%, 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%, 96%-100%, 97%-100%, 98%-100%, ili 99%-100% drugih komponenata sa kojima su bili inicijalno povezani. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su razdvojena od 10% do 100%, 10%-99%, 10%- 98%, 10%-97%, 10%-96%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 10%-20%, ili 10%-15% drugih komponenata sa kojima su bili inicijalno povezani. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su razdvojena od 11% do 99%, 12%-98%, 13%-97%, 14%-96%, 15%-95%, 20%-90%, 25%-85%, 30%-80%, 35%-75%, 40%-70%, 45%-65%, 50%-60%, ili 55%-60% drugih komponenata sa kojima su bili inicijalno povezani. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čista. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su 80%- 99%, 85%-99%, 90%-99%, 95%-99%, 96%-99%, 97%-99%, ili 98%-99% čista. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su 80%-99%, 80%-98%, 80%-97%, 80%-96%, 80%-95%, 80%-90%, ili 80%-85% čista. U nekim primerima izvođenja, izolovana sredstva su 85%-98%, 90%-97%, ili 95%-96% čista. U nekim primerima izvođenja, supstanca je "čista" ukoliko je suštinski oslobođena od drugih komponenti. U nekim primerima izvođenja, što će shvatiti stručnjaci, supstanca se još uvek može smatrati "izolovanom" ili čak "čistom", nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponetana kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenata (npr., pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim primerima izvođenja, procenat izolacije ili čistoća supstance je izračunata bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenata. Na primer, u nekim primerima izvođenja, biološki polimer kao što je polipeptid ili polinukleotid koji se javlja u prirodi smatra se "izolovanim" kada: a) po svom poreklu ili izvoru iz kog je izveden nije povezan sa nekim ili svima od komponenata koji ga prate u njegovom nativnom stanju u prirodi; b) suštinski je oslobođen od drugih polipeptida ili nukleinskih kiselina iste vrste iz vrste koja ga proizvodi u prirodi; ili c) je eksprimiran od strane ili je na drugi način povezan sa komponentama iz ćelije ili drugog ekspresionog sistema koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Stoga, na primer, u nekim primerima izvođenja, polipeptid koji je hemijski sintetisan,
4
ili je sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od onog koji ga proizvodi u prirodi, smatra se "izolovanim" polipeptidom. Alternativno, ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati "izolovanim" polipeptidom do stepena da je razdvojen od drugih komponenti: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojima je povezan kada je inicijalno proizveden.
[0094] Lokus ili lokusi: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na specifičnu lokaciju (lokacije) gena (ili značajne sekvence), DNK sekvence, sekvence koja kodira polipeptid, ili položaja na hromozomu genoma organizma. Na primer, "imunoglobulinski lokus" se može odnositi na specifičnu lokaciju segmenta gena imunoglobulina (npr., V, D, J ili C), imunoglobulinskog genskog segmenta DNK sekvence, kodriajuće sekvence imunoglobulinskog genskog segmenta, ili položaja imunoglobulinskog genskog segmenta na hromozomu genoma organizma koji je identifikovan gde se nalazi takva sekvenca. "Imunoglobulinski lokus" može sadržati regulatorni element imunoglobulinskog genskog segmenta, uključujući, ali se ne ograničavajući na, enhanser, promotor, 5’ i/ili 3’ regulatornu sekvencu ili region, ili njihovu kombinaciju. "Imunoglobulinski lokus" može sadržati DNK koja se nomalno nalazi između genskih segmenata u lokusu divljeg tipa, ali samoj DNK nedostaje imunoglobulinski genski segment (npr., imunoglobulinska DNK sekvenca koja se prirodno nalazi između grupe V genskih segmenata i grupe J genskih segmenata, imunoglobulinska DNK sekvenca koja se prirodno nalazi između grupe J genskih segmenata i gena konstantnog regiona, ili imunoglobulinska DNK sekvenca koja se prirodno nalazi 3’ od gena konstantnog regiona). Stručnjaci će shvatiti da hromozomi mogu, u nekim primerima izvođenja, sadržati stotine ili čak hiljade gena i demonstriraju fizičku ko-lokalizaciju sličnih gentskih lokusa kada se porede između različitih vrsta. Takvi genski loci mogu se opisati kao da imaju deljenu sinteniju.
[0095] Ne-humana životinja: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na bilo koji kičmenjački organizam koji nije čovek. Korišćena ne-humana životinja je glodar. U nekim primerima izvođenja je pacov ili miš.
[0096] Nukelinska kiselina: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja je ili može biti inkorporirana u oligonukleotidni lanac. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je jedinjenje i/ili supstanca koja je ili može biti inkorporirana u oligonukleotidni lanac preko fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" odnose se na individualne ostatke nukleinske kiseline (npr., nukleotidi i/ili nukleozidi); U nekim primerima izvođenja, "nukleonska kiselina" odnosi se na oligonukleotidni lanac koji sadrži individualne ostatake nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je ili sadrži RNK; u nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je ili sadrži DNK. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili sastoji se od jednog ili više prirodnih ostataka nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili sastoji se od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, analog nukleinske kiseline razlikuje se od "nukleinske kiseline" po tome da ne koristi fosfodiestarski osnovni lanac. Na primer, u nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili sastoji se od jedne ili više "peptid nukleinskih kiselina", koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u osnovnom lancu. Alternativno, ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" ima jedan ili više fosforotioatih i/ili 5’-N-fosforoamiditnih veza umesto fosfodiestarskih veza. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili sastoji se od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr., adenozin, timidin, guanozin, citid, uridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin, i deoksicitidin). U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je, sadrži, ili sastoji se od jednog ili više nukelozidnih analoga (npr., 2-aminoaadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolopirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, C-5 propinil-citidin, C-5 propiniluridin, 2-aminoadenozin, C5-bromouridin, C5-fluorouridin, C5-jodouridin, C5-propinil-uridin, C5-propinil-citidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazaadenozin, 7-deazaguanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksoguanozin, O(6)-metilguanin, 2-tiocitidin, metilovane baze, interkalirane baze, i njihove kombinacije). U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr., 2’-fluororiboza, riboza, 2’-deoksiriboza, arabinoza, i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više introna. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više egzona. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je pripremljena sa jednim ili više od izolacija iz prirodnog izvora, enzimske sinteze polimerizacijom na osnovu komplementarnog šablona (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu, i hemijskom sintezom. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je najmanje, npr., ali se ne ograničavajući na, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više ostataka dugačak. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je jednolančana; u nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" je dvolančana. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" ima enzimsku aktivnost.
[0097] Operativno vezan: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na jukstapoziciju gde su opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na njihov nameravani način. Na primer, nerearanžirani genski segmenti varijabilnog regiona su "operativno vezani" sa regionom kontinuiranog konstantnog regiona ukoliko su nerearanžirani genski segmenti varijabilnog regiona sposobni za rearanžman da formiraju gen varijabilnog regiona koji je eksprimiran zajedno sa genom konstantnog regiona kao polipeptidni lanac antigen vezujućeg proteina. Kontrolna sekvenca "operativno vezana" sa kodirajućom sekvencom je vezana na takav način da je ekspresija kodirajuće sekvence postignuta pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. "Operativno vezane" sekvence uključuju i sekvence za kontrolu ekspresije koje su neprekidne sa genom od interesa i sekvence koje kontrolišu ekspresiju koje deluju u trans ili na udaljenosti da kontrolišu gen od interesa (ili sekvence od interesa). Termin "sekvenca koja kontroliše ekspresiju" uključuje polinukelotidne sekvence, koje su neophodne da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. "Sekvence koje kontrolišu ekspresiju" uključuju: odgovarajuću inicijaciju trakskripcije, terminaciju, sekvence promotora i enhansera; efikasna obrada RNK kao što je splajsing i poliadenilacioni signali; sekvence koje stabilizuju citoplazmatičnu iRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost polipeptida; i kada je poželjno, sekvence koje poboljšavaju sekreciju polipeptida. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promotor, mesto vezivanje ribozoma i sekvenca za terminaciju transkripcije, dok kod eukariota takve kontrolne sekvence tipično uključuju promotore i sekvencu terminacije transakripcije. Namera je da termin "kontrolne sekvence" uključuje komponente čije je prisustvo esencijalno za ekspresiju i obradu, i može takođe uključiti dodatne komponente čije prisustvo je prednost, na primer, lider sekvence i sekvence fuzionih partnera.
[0098] Fiziološki uslovi: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na značenje koje se podrazumeva u tehnici u odnosu na uslove pod kojima ćelije ili organizmi žive i/ili se reprodukuju. U nekim primerima izvođenja, termin uključuje uslove eksternog ili internog miljea koji se mogu desiti u prirodi za organizam ili ćelijski sistem. U nekim primerima izvođenja, fiziološki uslovi su oni uslovi prisutni unutar tela čoveka ili ne-humane životinje, naročito one uslove prisutni na i/ili unutar hirurškog mesta. Fiziološki uslovi tipično uključuje, npr., temperaturni opseg od 20-40°C, atmosferski pritisak od 1, pH od 6-8, koncentracija glukoze od 1-20mM, koncentracija kiseonika na atmosferskim nivoima, i gravitacija kao što se sreće na zemlji. U nekim primerima izvođenja, uslovi u laboratoriji su manipulisani i/ili održani na fiziološkim uslovima. U nekim primerima izvođenja, fiziološki uslovi se sreću u organizmu.
[0099] Polipeptid: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se javlja u prirodi. U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se ne javlja u prirodi. U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži delove koji se javljaju u prirodi međusobno zasebno (tj., od dva ili više različitih organizama, na primer, humani i nehumani delovi). U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je konstruisana tako da je dizajnirana i/ili proizvedena posredstvom čoveka. U nekim primerima izvođenja, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa sekvencom koja se ne javlja u prirodi (npr., sekvenca koja je konstruisana po tome što je dizajnirana i/ili proizvedena posredstvom čoveka da kodira pomenuti polipeptid).
[0100] Rekombinant: kao što je ovde korišćeno, namera je da se odnosi na polipeptide koji su dizajnirani, konstruisani, pripremljeni, eksprimirani, stvoreni ili izolovani rekombinantnim načinom, kao što su polipeptidi eksprimirani korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćinu, polipeptidi izolovani iz rekombinanta, kombinatorijalne humane polipeptidne biblioteke (Hoogenboom, H. R., 1997, TIB Tech.
15:62-70; Azzazy, H. i W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J. V. i J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H., i P. Chames, 2000, Immunol. Todan 21:371-8), antitela izolovan iz životinje (npr., miša) koji su transgeni za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res.
20:6287-95; Kellermann, S-A. i L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. et al., 2000, Immunol. Todan 21:364-70; Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8) ili polipeptidi pripremljeni, eksprimirani, stvoreni ili izolovani bilo kojim drugim načinima koji uključuju međusobni splajsing izabranih elemenata sekvence. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od takvih izabranih elemenata sekvence se nalazi u prirodi. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od takvih izabranih elemenata sekvence je dizajnirana in silico. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više takvih izabranih elemenata sekvence rezultat je mutagebeze (npr., in vivo ili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr., iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, u nekim primerima izvođenja, rekombinantni polipeptid se sastoji od sekvenci koje se nalaze u genomu izvornog organizma od interesa (npr., čovek, miš, itd.). U nekim primerima izvođenja, rekombinantni polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je rezultat mutageneze (npr., in vitro ili in vivo, na primer, u glodaru), tako da aminokiselinske sekvence rekombinantnih polipeptida su sekvence koje, iako potiču od i povezane su sa polipeptidnim sekvencama, ne moraju biti prirodno prisutne unutar genoma glodarske životinje in vivo.
[0101] Referenca: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na standard ili kontrolno sredstvo, životinju, kohortu, individuu, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost sa kojom se poredi sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa. U nekim primerima izvođenja, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je testirana i/ili određena suštinski istovremeno sa testiranjem ili određivanjem sredstva, životinje, kohorte, individue, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. U nekim primerima izvođenja, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je istorijska referenca, izborno ugrađenom u opipljivom medijumu. U nekim primerima izvođenja, referenca se može odnosti na kontrolu. "Referenca" takođe uključuje "referentnu životinju." "Referentna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisana, modifikaciju koja je različita od one opisane ovde ili bez modifikacije (tj., životinja divljeg tipa). Tipično, što će stručnjaci razumeti, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je određena ili karakterizovana pod uslovima koji se mogu uporediti onima korišćenim za određivanje ili karakterizovanje sredstva, životinje (npr., sisara), kohorte, individue, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti.
[0102] Zamena: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na proces preko koga je "zamenjena" sekvenca nukleinske kiseline (npr., gen) koja se nalazi u lokusu domaćina (npr., u genomu) je uklonjena iz tog lokusa, i različita, "zamenska" nukleinska kiselina je locirana na njenom mestu. U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline i zamenske sekvence nukleinske kiseline su međusobno uporedive u tome, na primer, da su međusobno homologe i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr., protein-kodirajuće elemente, regulatorne elemente, itd.). U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline uključuje jedan ili više od promotora, enhansera, splajs donor mesta, splajs akceptorskog mesta, introna, egzona, netranslatirani region (UTR); U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je homolog ili varijanta (npr., mutant) zamenjene sekvence nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ortolog ili homolog zamenjene sekvence. U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži sekvencu humane nukleinska kiseline. U nekim primerima izvođenja, uključujući slučajeve gde sekvenca zamenjene nukleinske kiseline je ili sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži glodarsku sekvencu (npr., sekvenca miša ili pacova). U nekim primerima izvođenja, uključujući slučajeve gde sekvenca zamenjene nukleinske kiseline je ili sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je ili sadrži humanu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline je varijanta ili mutant (tj., sekvenca koja sadrži jednu ili više razlika sekvence, npr., supstitucije, u poređenju sa zmanjenom sekvencom) zamenjene sekvence. Sekvenca nukleinske kiseline tako postavljena može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvora sekvence nukleinske kiseline da bi se dobila sekvenca tako postavljena (npr., promotori, enhanser, 5’- ili 3’-netranslatirani regioni, itd.). Na primer, u različitim primerima izvođenja, zamena je supstitucija endogene sekvence sa heterologom sekvencom koja rezultuje u proizvodnji genskog proizvoda iz sekvence nukleinske kiseline tako postavljene (koja sadrži heterologu sekvencu), ali ne ekspresiju endogene sekvence; zamena je od endogene genomske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sličnu funkciju kao polipeptid koji kodira endogena sekvenca (npr., endogena genomska sekvenca kodira glodarski polipeptid varijabilnog domena, u celini ili delimično, i DNK fragment kodira jedan ili više humanih polipeptida varijabilnog domena, u celini ili delimično). U različitim primerima izvođenja, endogeni glodarski imunoglobulinski genski segment ili njegov fragment je zamenjen sa humanim imunoglobulinskim genskim segmentom ili njegovim fragmentom.
[0103] Suštinski: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na kvalitativno stanje koje pokazuje potpuni ili skoro potpuni stepen karakteristike ili osobine od interesa. Stručnjak u oblasti bioloških nauka shvatiće da se biološki i hemijski fenomen retko, ukoiko uopšte, odvijaju se do završetka i/ili se odvijaju do kraja ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Termin "suštinski" je stoga ovde korišćen da obuhvati potencijalni nedostatak kompletnosti koji je inherentan za mnoge biološke i hemijske fenomene.
[0104] Suštinska homologija: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinske kiseline. Kao što će stručnjaci shvatiti, dve sekvence se generalno smatraju "suštinski homologim" ukoliko sadrže homologe ostatake u odgovarajućim položajima. Homologi ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologi ostaci mogu biti ne-identični ostaci sa odgovarajuće sličnim strukturnim i/ili funkcionalnim karakteristikama. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima, određene aminokiseline su tipično klasifikovane kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" aminokiseline, i/ili kao da imaju "polarne" ili "ne-polarne" bočne lance. Supstitucija aminokiseline sa drugom istog tipa može se često smatrati "homologom" supstitucijom. Tipične aminokiselinske karakterizacije su rezimirane u tabeli u nastavku.
4
Alanin Ala A Nepolarna Neutralna 1.8 Arginin Arg R Polarna Pozitivna -4.5 Asparagin Asn N Polarna Neutralna -3.5 -Asparaginska kiselina Asp D Polarna Negativna 3.5 Cistein Cys C Nepolarna Neutralna 2.5 Glutaminska kiselina Glu E Polarna Negativna -3.5 Glutamin Gln Q Polarna Neutralna -3.5 Glicin Gly G Nepolarna Neutralna -0.4 -Histidin His H Polarna Pozitivna 3.2 Izoleucin Ile I Nepolarna Neutralna 4.5 Leucin Leu L Nepolarna Neutralna 3.8
Lizin Lys K Polarna Pozitivna -3.9 Metionin Met M Nepolarna Neutralna 1.9 Fenilalanin Phe F Nepolarna Neutralna 2.8 Prolin Pro P Nepolarna Neutralna -1.6 Serin Ser S Polarna Neutralna -0.8 Treonin Thr T Polarna Neutralna -0.7 Triptofan Trp W Nepolarna Neutralna -0.9 Tirozin Tyr Y Polarna Neutralna -1.3 Valin Val V Nepolarna Neutralna 4.2
Anbivalentne aminokiseline 3-slova 1-slovo
Asparagin ili
Asx B asparaginska kiselina
Glutamin ili
Glx Z glutaminska kiselina
Leucin ili Izoleucin Xle J Nespecifična ili
nepoznata Xaa X aminokiselina
[0105] Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence aminokiselina ili nukleinske kiseline mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što je BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gapped BLAST, i PSI-BLAST za aminoksielinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. i B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Gens i Proteins, Wiley, 1998; i Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods i Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998. Dodatno identifikaciji homologih sekvenci, programi pomenuti prethodno tipično obezbeđuju indikaciju stepena homologije. U nekim primerima izvođenja, dve sekvence se smatraju suštinski homologim ukoliko najmanje, npr., ali se ne ograničavajući na, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više od njihovih odgovarajućih ostataka je homologo duž relevantnog niza ostataka. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz je kompletna sekvenca. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz is najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz uključuje neprekidne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz uključuje diskontinuirane ostatke duž kompletne sekvence, na primer, nesusedne ostatke dovedene u kontakt sa konformacionim savijanjem polipeptida ili njegovog dela. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz je najmanje, npr., ali se ne ograničavajući na, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ili više ostataka.
[0106] Suštinska identičnost: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na poređenje sekvenci aminokiselina ili nukleinske kiseline. Kao što će stručnjaci shvatiti, dve sekvence se generalno smatraju "suštinski identičnim" ukoliko sadrže identične ostatke u odgovarajućim položajima. Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence aminokiselina ili nukleinske kiseline mogu se porediti korišćenjem različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gapped BLAST, i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. i B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Gens i Proteins, Wiley, 1998; i Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods i Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998. Dodoatno identifikaciji identičnih sekvenci, prethodno pomenuti programi tipično obezbeđuju indikaciju stepena identičnosti. U nekim primerima izvođenja, dve sekvence se smatraju suštinski identičnim ukoliko najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili viš eod njihovih odgovarajućih ostataka su identični duž relevantnog niza ostataka. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz ostataka je kompletna sekvenca. U nekim primerima izvođenja, relevantni niz ostataka je, npr., ali se ne ograničavajući na, najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ili više ostataka.
[0107] Targeting konstrukt ili targeting vektor: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na polinukleotidni molekul koji sadrži targeting region. Targeting region sadrži sekvencu koj aje identična ili suštinski identična u target ćeliji, tkivu ili životinji i obezbeđeuje integraciju targeting konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje preko homologe rekombinacije. Targeting regioni koji targetiraju korišćenjem mesta prepoznavanja rekombinaze speciifčne za mesto (npr., loxP ili Frt mesta) takođe su uključeni i opisani ovde. U nekim primerima izvođenja, targeting konstrukt kao što je ovde opisan dodatno sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili gena od naročitog interesa, selektabilni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence, i druge sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu preko egzogene adicije proteina koji pomažu ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim primerima izvođenja, targeting konstrukt kao što je ovde opisano dodatno sadrži gen od interesa u celini ili delimično, pri čemu gen od interesa je heterologni gen koji kodira polipeptid, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein koji je kodiran sa endogenom sekvencom. U nekim primerima izvođenja, targeting konstrukt kao što je ovde opisano dodatno sadrži humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira polipeptid, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao polipeptid koji je kodiran sa endogenom sekvencom. U nekim primerima izvođenja, targeting konstrukt (ili targeting vektor) može sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja je manipulisan aod strane čoveka. Na primer, u nekim primerima izvođenja, targeting konstrukt (ili targeting vektor) može se konstruisati da sadrži konstruisani ili rekombinantni polinukleotid koji sadrži dve ili više sekvenci koje nisu međusobno vezane u tom redosledu u prirodi već manipulisane od strane čovek da budu direktno međusono povezane u konstruisanom ili rekombinantnom polinukleotidu.
[0108] Transgen ili transgeni konstrukt: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na sekvencu nukelinske kiseline (koja kodira npr., polipeptid od interesa, u celini ili delimično) koji je introdukovan u ćeliju od strane čoveka kao što je postupcima opisanim ovde. Transgen može biti delimično ili potpuno heterolog, tj., stran, transgenoj životinji ili ćeliji u koju je introdukovan. Transgen može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci i bilo koju drugu nukleinsku kiselinu, kao što su introni ili promotori, koji mogu biti neophodni za ekspresiju izabrane sekvence nukelinske kiseline.
[0109] Transgena životinja, transgena ne-humana životinja ili Tg+: su korišćeni naizmenično i odnose se na glodara koji se ne javlja u prirodi u kome jedna ili više od ćelija
4
glodara sadrži heterologu nukleinsku kiselinu i/ili gen koji kodira polipeptid od interesa, u celini ili delimično. Na primer, u nekim primerima izvođenja, "transgena životinja" ili "transgena ne-humana životinja" odnosi se na glodara koji sadrži transgen ili transgeni konstrukt kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, heterologna nukleinska kiselina i/ili gen je introdukovan u ćeliju, direktno ili indirektno introdukcijom u prekursorsku ćeliju, putem namerne genetičke manipulacije, kao što je mikroinjekcija ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Termin genetička manipulacija ne uključuje tehnike klasičnog ukrštanja, već je pre usmeren na introdukciju rekombinantnih DNK molekula (ili više njih). Ovaj molekul može biti integrisan unutar hromozoma, ili može biti ekstrahromozomski replicirajuća DNK. Termin "Tg+" uključuje životinje koje su heterozigoti ili homozigoti za heterolognu nukleinsku kiselinu i/ili gen, i/ili životinje koje imaju jednu ili više kopija heterologne nukleinske kiseline i/ili gena.
[0110] Varijanta: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na entitet koji pokazuje značajanu strukturnu identičnost sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u prisustvu ili nivou jedogn ili više hemijskih delova u poređenju sa referentnim entitetom. U mnogim primerima izvođenja, "varijanta" se takođe funkcionalnao razlikuje od svog referentnog entiteta. Generalno, da li je određeni entitet ispravno smatran "varijantom" referentnog entiteta zasnovano je na njegovom stepenu strukturne identičnosti sa referentnim entitetom. Kao što će stručnjacima biti jasno, bilo koji biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. "Varijanta", po definiciji, je distinktni hemijski entitet koji ima zajednički jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Kao par primera, polipeptid može imati karakteristični element sekvencu koja se sastoji od više aminokiselina sa obeleženim položajima u međusobnom odnosu u lineranom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili doprinosi određenoj biološkoj funkciji, ili nukleinska kiselina može imati karakteristični elemenat sekvence koji se sastoji od mnoštva nukleotidnih ostataka koji imaju označene položaje u međusobnom odnosu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. U sledećem primeru, "varijanta polipeptida" se može razlikovati od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u aminokiselinskoj sekvenci i/ili jedne ili više razlika u hemijskim delovima (npr., ugljenim hidratima, lipidima, itd.) koji su kovalentno vezani za polipeptidnu kičmu. U nekim primerima izvođenja, "varijanata polipeptida" pokazuje ukupnu identičnost sekvence sa referentnim polipeptidom koja je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ili 99%. Alternativno, ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, "varijanta polipeptida" ne deli najmanje jedan karakteristični elemenat sekvence sa referentnim polipeptidom. U nekim primerima izvođenja, referentni polipeptid ima jednu ili više bioloških aktivnosti. U nekim primerima izvođenja, "varijanta polipeptida" deli jednu ili više bioloških aktivnosti sa referentnim polipeptidom. U nekim primerima izvođenja, "varijanti polipeptida" nedostaje jedna ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim primerima izvođenja, "varijanta polipeptida" pokazuje smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. U mnogim primerima izvođenja, polipeptid od interesa smatra se "varijantom" roditeljskog ili referentnog polipeptida ukoliko polipeptid od interesa ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična onoj od roditelja izuzev malog broja izmena sekvence na određenim položajima. Tipično, manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, ili 2% ostataka u varijanti je supstituisano u poređenju sa roditeljem. U nekim primerima izvođenja, "varijanta" ima, npr., ali se ne ograničavajući na, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 supstituisanih ostataka u poređenju sa roditeljem. Često, "varijanta" ima veoma mali broj (npr., manje od 5, 4, 3, 2, ili 1) supstituisanih funkcionalnih ostataka (tj., ostataka koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti). Dodatno, "varijanta" tipično nema više od, npr., ali se ne ograničavajući na, 5, 4, 3, 2, ili 1 adicija ili delecija, i često nema nijednu adiciju ili deleciju, u poređenju sa roditeljem. Dodatno, bilo koje adicije ili delecije su tipično manje od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i uobičajeno su manje od oko 5, oko 4, oko 3, ili oko 2 ostatka. U nekim primerima izvođenja, roditelj ili referentni polipeptid se nalazi u prirodi. Kao što će shvatiti stručnjaci, mnoštvo varijanti određenog polipeptida od interesa može se uobičajeno naći u prirodi, naročito kada je polipeptid od interesa infektivni agens polipeptid.
[0111] Vektor: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. U nekim primerima izvođenja, vektori su sposobni za ekstra-hromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su vezani u ćeliji domaćinu kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori sposobni da usmeravaju ekspresiju operativno povezanih gena ovde se označavaju kao "ekspresioni vektori."
[0112] Divlji tip: kao što je ovde korišćeno, odnosi se na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kao što se sreće u prirodi kod "normalnog" (nasuprot mutantnom, obolelom, izmenjenom, itd.) stanju ili kontekstu. Stručnjaci će shvatiti da geni divljeg tipa i polipeptidi često postoje u više različitih oblika(npr., aleli).
DETALJAN OPIS ODREĐENIH PRIMERA IZVOĐENJA
[0113] U određenim aspektima, ovde su korišćeni, između ostalog, konstruisani glodari koji imaju heterologni genetički materijal koji kodira humane varijabilne domene i, u nekim
4
primerima izvođenja, humane konstantne domene, pri čemu heterologni genetički materijal sadrži humane Vλ, Jλ i Cλ genske sekvence (tj., genske segmente) i druge humane sekvence koje obezbeđuju ispravan rearanžman i ekspresiju antitela koja imaju humani deo i glodarski deo ili antitela koja imaju sekvencu koja je suštinski ili suštinski cela humana. U različitim primerima izvođenja, korišćeni konstruisani glodari sadrže heterologni genetički materijal koji je inseriran na takav način da su antitela koja sadrže lake lance koji imaju humani Vλ domen i humani ili glodarski Cλ domen eksprimirana u repertoaru antitela životinje glodara. Dodatno, korišćeni konstruisani glodari sadrže heterologni genetički materijal koji je inseriran na takav način da su antitela koja sadrže lake lance koji imaju humani Vλ domen i humani ili glodarski Cλ domen eksprimirana od strane lokusa konstruisanog Igλ lakog lanca koji uključuju humane i glodarske Igλ enhanser regione (ili sekvence) u genomu klicine linije glodara.
[0114] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, predviđeno je da glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju poboljšani in vivo sistem koji koristi ekspresiju antitela koja sadrže humane Vλ domene za proizvodnju terapeutskih antitela. Takođe je predviđeno da neki primeri izvođenja uključuju glodare kao što je ovde opisano, koji obezbeđuju alternativne konstruisane oblike lokusa Igλ lakog lanca koji sadrže heterologni genetički materijal za razvoj humanih terapeutika zasnovanih na antitelu (npr., humana monoklonska antitela, multispecifična vezujuća sredstva, scFvs, fuzione polipeptide, itd.) za bolesne targete koji su povezani sa pristrasnim odgovorima antitela (npr., odgovori antitela koji se karakterišu prevelikom proporcijom ili κ ili λ lakih lanaca). Stoga, glodari kao što je ovde opisano su naročito korisni za razvoj humanih antitela protiv targeta povezanih sa slobom imunogenošću (npr., virusima) usled, delimično, suženih repertoara i/ili odgovora antitela.
[0115] Naročito, u određenim aspektima predmetni ops opisuje proizvodnju glodara, kao što je pacov ili miš, glodar koji ima genom klicine linije koj sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ odnosno, u nekim primerima izvođenja, karakterisanim sa introdukcijom mnoštva humanih Vλ, Jλ i Cλ genskih sekvenci u operativnoj vezi sa Cλ regionom glodara što rezultuje u ekspresiji antitela koja sadrže lake lance koji uključuju humani Vλ domen i humani ili Cλ domen glodara. Kao što je ovde opisano, proizvodnja takvog konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ rezultuje u ekspresiji antitela koja sadrže lake lance koji uključuju humani Vλ domen i humani ili Cλ domen glodara iz pomenutog konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ u genomu klicine linije glodara. Genome klicine linije korišćenih glodara, u nekim primerima izvođenja, dodatno sadrži (1) humanizovane IgH i Igκ lokuse ili (2) humanizovani IgH lokus i funkcionalno utišane ili na drugi način učinjene nefunkcionalnim lokuse Igκ lakog lanca. Glodar, kao što je ovde opisano, eksprimiraju repertoare antitela koji sadrže Igλ lake
4
lance koji uključuju humane Vλ domene.
[0116] Glodari kao što je ovde opisano sadrže humane i glodarske sekvence Igλ lakog lanca unutar jednog lokusa lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano sadrže sekvence humanog Igλ i mišjeg (npr. miša ili pacova) Igλ lakog lanca unutar lokusa lakog lanca Igλ. U mnogim primerima izvođenja glodara kao što je ovde opisano, glodarske sekvence Igλ lakog lanca su ili sadrže mišje sekvence (npr., miša ili pacova).
[0117] U nekim primerima izvođenja, sekvence Igλ lakog lanca uključuju intergensku DNK koja je humanog i/ili mišjeg (npr., miš ili pacov) porekla. U nekim primerima izvođenja, sekvence Igλ lakog lanca uključuju intergensku DNK koja je sintetička i zasnovana na izvoru sekvenci koji je humanog ili mišjeg (npr., miš ili pacov) porekla. U nekim primerima izvođenja, pomenuta intragenska DNK je sa istog imunoglobulinskog lokusa u kome je intragenska DNK postavljena, inserirana, stavljena ili konstruisana (npr., Igλ intragenska DNK u lokusu lakog lanca Igλ). U nekim određenim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ koji sadrži intergensku DNK koja uključuje sekvencu (sekvence) Igλ lakog lanca glodarskog porekla (npr., mišje ili pacovske sekvence Igλ lakog lanca).
[0118] U različitim primerima izvođenja, humanizovani IgH lokus sadrži mnoštvo humanih VH, DHi JHgenskih segmenata operativno povezanih sa glodarskim IgH konstantnim regionom (npr., endogeni glodarski IgH konstantni region koji uključuje jedan ili više gena IgH konstantnog regiona kao što je, na primer, IgM, IgG, itd.). U različitim primerima izvođenja, lokus humanizovanog Igκ lakog lanca sadrži mnoštvo humanih Vκ i Jκ genskih segmenata operatvino vezanih sa glodarskim Igκ konstantnim regionom. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari imaju genom klicine linije koji uključuje imunoglobulinske lokuse (ili alele) prikazane u Crtežu obezbeđenom ovde (npr., videti Slika 1, 2, 3 i/ili 4). Takvi konstruisani glodari obezbeđuju izvor humanih antitela i fragmenata humanih antitela, i/ili nukleinske kiseline koje kodiraju takva humana antitela i fragmente humanih antitela, i obezbeđuju poboljšani in vivo sistem pogodan za korišćenje humanih Vλ sekvenci za proizvodnju humanih terapeutskih antitela.
[0119] Kao što je ovde opisano, u određenim primerima izvođena glodari imaju genom koji sadrži mnoštvo genskih segmenata humanog λ lakog lanca (npr., Vλ, Jλ i Cλ) umesto glodarskih genskih segmenata imunoglobulinskog λ lakog lanca na endogenim lokusima imunoglobulinskog λ lakog lanca, i uključuje humanu nekodirajuću intergensku DNK između genskih segmenata humanog varijabilnog regiona. U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari ovde imaju genom koji dodatno sadrži genske segmente varijabilnog regiona humanog teškog (tj., VH, DHi JH) i κ lakog lanca (npr., Vκ i Jκ) umesto genskih segmenata
4
glodarskog varijabilnog regiona teškog (tj., VH, DHi JH) i κ lakog lanca (npr., Vκ i Jκ) na endogenim lokusima imunoglobulinskog teškog i κ lakog lanca, respektivno. U mnogim primerima izvođenja, humani imunoglobulini genski segmenti (teški i/ili laki) su konstruisani sa humanom intragenskom DNK (tj., humanom nekodirajućom imunoglobulinskom intergenskom DNK) koja je prirodno povezana sa pomenutim genskim segmentima (tj., nekodirajuću genomsku DNK povezanu sa pomenutim genskim segmentima koja se prirodno javlja u humanom imunoglobulinskom lokusu humane ćelije). Takva intergenska DNK uključuje, na primer, promotore, lider sekvence i rekombinacione signalne sekvence koj eomogućavaju ispravnu rekombianciju i ekspresiju humanih genskih segmenata u kontekstu varijabilnih domena antitela. Stručnjaci će shvatiti da glodarski imunoglobulinski lokusi takođe sadrže takvu nekodirajuću inetrgensku DNK i da, nakon čitanja ovog opisa, druga humana ili glodarska intergenska DNK se može upotrebiti za konstrukciju takvih konstruisanih imunoglobulinskih lokusa koji rezultuju u istoj ekspresiji humanih varijabilnih domena u kontekstu antitela u glodaru. Takvi slični konstruisani imunoglobulinski lokusi moraju imati samo humane kodirajuće sekvence (tj., egzone) željenih humanih genskih segmenata, ili kombinaciju humanih genskih segmenata, da bi postigli ekspresiju antitela koja sadrže humane varijabilne domene.
[0120] Različiti aspekti određenih primera izvođenja su opisani detaljno u sledećim odeljcima, od kojih se svaki može primeniti na bilo koji aspekt ili primer izvođenja kao što je ovde opisano. Upotreba odeljaka nije namenjena ograničavanju, i upotreba "ili" označava "i/ili" ukoliko nije drugačije naznačeno.
Repertoari antitela u glodarima
[0121] Imunoglobulini (takođe nazvani antitela) su veliki (∼150 kD), Y-oblika glikoproteini koji se proizvode od strane B ćelija imunog sistema domaćina da bi neutralisali strane antigene (npr., viruse, bakterije, itd.). Svaki imunoglobulin (Ig) je sastavljenod dva identična teška lanca i dva identična laka lanca, pri čemu svaki ima dve strukturne komponente: varijabilni domen i konstantni domen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca razlikuju se kod antitela proizvedenih od strane različitih B ćelija, ali su isti za sva antitela proizvedena od strane jedne B ćelija ili klona B ćelije. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca svakog antitela zajedno sadrže antigen-vezujući region (ili mesto vezivanja antigena). Imunoglobulini mogu postojati u različitim varijetetima koji se označavaju kao izotipovi ili klase na osnovu regiona (ili domena) konstantnih regiona teškog lanca koje sadrže. Konstantni domen teškog lanca je dentičan kod svih antitela istog izotipa, ali se razlikuje kod antitela različitih izotipova. Tabela
4
u nastavku rezimira devet izotipova antitela kod miša i čoveka (humana).
Miš Čovek
IgM IgM
IgD IgD
IgG1 IgG1
IgG2a IgG2
IgG2b IgG3
IgG2c IgG4
IgG3 IgE
IgE IgA1
IgA IgA2
[0122] Identifikovani su dodoatni izotipovi u drugim vrstama. Izotipovi daju specijalizovane biološke osobine antitelu usled različitih strukturnih karakteristika između različitih izotipova i nađeni su na različitim mestima (ćelije, tkiva, itd.) unutar tela životinje. Inicijalno, B ćelije proizvode IgM i IgD sa identičnim antigen-vezujućim regionima. Nakon aktivacije, B ćelije vrše promenu u druge izotipove procesom nazvanim promena klase, koji uključuje promenu konstantnog domena antitela proizvedenog od strane B ćelije dok varijabilni domeni ostaju isti, čime se čuva specifičnost za antigen originalnog antitela (B ćelija).
[0123] Dva zasebna lokusa (Igκ i Igλ) sadrže genske segmente koji kodiraju lake lance antitela, i pokazuju i alelno i izotipsko isključivanje. Odnosi ekspresije κ+ prema λ+ B ćelijama variraju između vrsta. Na primer, ljudi pokazuju odnos od oko 60:40 (κ:λ). Kod miševa i pacova, uočen je odnos od 95:5 (κ:λ). Interesantno, κ:λ odnos uočen kod mačaka (5:95) je suprotan miševima i pacovima. Izvedeno je nekoliko studija radi rasvetljivanja mogućih razloga iza ovih uočenih odnosa i pretpostavili su i kompleksnost lokusa (tj., broj genskih segmenata, naročito, V genskih segmenata) i efikasnost rearanžmana genskog segmenta kao razlog. Lokus humanog imunoglobulinskog λ lakog lanca prostire se preko 1,000kb i sadrži približno 70 Vλ genskih segmenata (29 do 33 funkcionalnih) i sedam Jλ-Cλ parova genskih segmenata (četiri do pet funkcionalnih) organizovanih u tri klastera (videti, npr., Sl. 1 iz SAD Patent br. 9,006,511). Većina uočenih Vλ regiona u repertoaru eksprimiranih antitela su kodirani od strane genskih segmenata koji se sadrže unutar najproksimalnijeg klastera (tj., klaster A). Lokus mišjeg imunoglobulinskog λ lakog lanca je izrazito različit od humanog lokusa i, u zavisnosti od soja, sadrži samo nekoliko Vλ i Jλ genskih segmenata organizovanih dva različita genska klastera (videti, npr., Sl. 2 iz SAD
4
Patent br.9,006,511).
[0124] Razvoj terapeutskih antitela za tretman različitih humanih bolesti je uveliko bio fokusiran na stvaranje konstruisanih glodarskih linija, naročito, konstruisanih glodarskih linija, koje nose različite količine genetičkog materijala u svojim genomima koje odgovaraju humanim imunoglobulinskim genima (pregledno dato u, npr., Brüggemann, M. et al., 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:101-8). Inicijalni napori u stvaranju takvih transgenih glodarskih linija fokusirali su se na integraciju delova lokusa humanog imunoglobulina koji bi mogli, sami po sebi, da podrže rekombinaciju genskih segmenata i proizvodnju teških i/ili lakih lanaca koji su u potpunosti humani uz to da su im endogeni imunoglobulinski lokusi inaktivirani (videti npr., Brüggemann, M. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.86:67-09-13; Brüggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol.21:1323-6; Taylor, L.D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. et al., 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. et al., 1994, Nat. Gent. 7:13-21; Lonberg, N. et al., 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. et al., 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. et al., 1996, Nat. Biotechnol.14:845-51; Wagner, S.D. et al., 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. et al., 1997, Nat. Gent. 15:146-56; Green, L.L. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. et al., 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. et al., 2000, Immunol. Todan 21:364-70; Kellermann, S.A. i L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol.
13:593-7). Naročito, neki napori su uključivali integraciju sekvenci humanog Igλ lakog lanca (videti, npr., SAD Patentne prijave br. 2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 i 2011/0236378 A1; SAD Patent br. 6,998,514 i 7,435,871; Nicholson, I.C. et al., 1999, J. Immunol.
163:6898-906; Popov, A.V et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19). Takvi napori su se fokusirali na randomizovanu integraciju veštačkih hromozoma kvasca koji su sadržali humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence čime su stvoreni mišji sojevi koji eksprimiraju potpuno humane λ lake lance (tj., humane varijabilne i humane konstantne). Skoriji napori su upotrebljavali slične strategije upotrebom konstrukata koji takođe sadrže humane Vλ, Jλ i Cλ sekvencie (Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63).
[0125] Sledeći napori su uključivali specifičnu inserciju humanih Vλ i Jλ genskih segmenata u endogene glodarski lokuse Ig lakog lanca (κ i λ) tako da su pomenuti humani Vλ i Jλ genski segmenti operativno povezani sa konstantnim regionaima endogenog Ig lakog lanca (videti, npr., SAD patentne br. 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092). U takvim životinjama, svi segmenti humanog Vλ gena iz klastera A i B i bilo koji ili četiri segmenta humanog Jλ gena su inserirani u lokuse endogenog Igκ i Igλ lakog lanca. Kao rezultat, nekoliko različitih humanih Vλ i Jλ genskih segmenata demostriralo je ispravan rearanžman na oba konstruisana lokusa glodarskog Ig lakog lanca da bi se formirali funkcionalni humani Vλ domeni koji su eksprimirani u kontekstu oba Cκ i Cλ regiona u lakim lancima repertoara glodarskog antitela (videti, npr., Tabela 7 i Slike 11-13 iz SAD Patent br.
9,006,511). Naročito, miševi koji imaju konstruisane lokuse Igκ lakog lanca koji nose humane Vλ i Jλ genske segmente demostrirali su κ:λ odnos od oko 1:1 u slezinskom kompartmanu (videti, npr., Tabela 4 SAD Patenta br. 9,006,511). Zaista, oba konstruisana mišja soja (tj., lokusi konstruisanog Igκ ili konstruisanog Igλ lakog lanca) demostrirali su da humani Vλ domeni mogu biti eksprimirani iz lokusa endogenog Ig lakog lanca u glodarima, koji normalno prikazuju veliku pristrastnost u ekspresiji lakog lanca (videti prethodno). Predmetni pronalazak je zasnovan na prepoznavanju da druge konstruisane strukture lokusa Ig lakog lanca mogu biti proizvedene da bi se maksimizovala upotreba humanih Vλ i Jλ genskih segmenata u repertoarima antitela na terapeutske targete kod glodara, naročito, u poređenju sa glodarima koji sadrže lokus lakog lanca Igλ kome nedostaje kompleksnost i robusni kvalitet (npr., miševi i pacovi) koji je noramlno povezansa humanim lokusom lakog lanca Igλ (tj., koji se javlja u humanoj ćeliji). Takve alternativno konstruisane strukture lokus Ig lakog lanca obezbeđuju kapacitet za jedinstvene repertoare antitela koji su rezultat njihovog dizajna.
[0126] Predmetni opis opisuje, između ostalog, uspešnu proizvodnju glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani endogeni lokus lakog lanca Igλ koji sadrži mnoštvo humanih Vλ, Jλ i Cλ genskih segmenata u operativnoj vezi sa glodarskim konstantnim regionom Igλ lakog lanca. Naročito, predmetni opis specifično demonstrira uspešnu proizvodnju konstruisanog glodara koji eksprimira antitela koja imaju humane varijabilne domene i glodarske konstantne domene, pri čemu antitela uključuju lake lance koji sadrže humani Vλ domen. Kao što je ovde opisano, ekspresija takvih lakih lanaca je postignuta insercijom pomenutog mnoštva humanih Vλ, Jλ i Cλ genskih segmenata u endogeni lokus lakog lanca Igλ (ili alel). Takođe, kao što je ovde opisano, korišćeni glodari su, u nekim primerima izvođenja, konstruisani tako da ekspresija lakih lanaca koji sadrže endogene Vλ domene je inaktivirana (npr., delcijom gena). Stoga, predmetni opis, u najmanje nekim primerima izvođenja, obuhvata razvoj poboljšanog in vivo sistema za proizvodnju humanih antitela korišćenjem konstruisanog glodara koji sadrži alternativno konstruisani lokus lakog lanca Igλ koji rezultuje u eksprimiranom repertoaru antitela koja sadrže humane Vλ domene.
DNK inserti
[0127] Tipično, polinukleotidni molekul koji sadrži sekvence humanog Igλ lakog lanca (npr., Vλ, Jλ, Cλ i Igλ enhanseri) ili njegov deo (delove) je inseriran u vektor, poželjno DNK vektor,
1
da bi replicirao polinukleotidni molekul u ćeliji domaćinu.
[0128] Sekvence humanog Igλ lakog lanca mogu se klonirati direktno iz poznatih sekvenci ili izvora (npr., biblioteka) ili sintetisati iz sekvenci klicine linije dizajniranih in silico na osnovu objavljenih sekvenci dostupnih iz GenBank ili drugih javno dostupnih baza podataka (npr., IMGT). Alternativno, biblioteke vešačkog bakterijskog hromozoma (BAC) mogu obezbediti imunoglobulinske DNK sekvence od interesa (npr., segmenti humanog Vλ gena, parovi segmenata Jλ-Cλ gena, humani Eλ regioni ili sekvence, i njihove kombinacije). BAC biblioteke mogu sadržati insert veličine od 100-150kb i sposobni su da nose inserte veličine 300kb (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Gens i Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218). Na primer, opisana je humana BAC biblioteka koja nosi prosečne veličine inserata od 164-196kb (Osoegawa, K. et al., 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. et al., 1998, Genomics 52:1-8, Article No. GE985423). Humane i mišje genomske BAC biblioteke su konstruisane i komercijalno su dostupne (npr., ThermoFisher). Genomske BAC biblioteke mogu takođe služiti kao izvor imunoglobulinskih DNK sekvenci kao i transkripcionih kontrolnih regiona.
[0129] Alternativno, imunoglobulinske DNK sekvence mogu biti izolovane, klonirane i/ili prenete iz veštačkog hromozoma kvasca (YACs). Na primer, nukelotidne sekvence humanog lokusa lakog lanca Igλ su određene (videti, npr., Dunham, I. et al., 1999, Nature 402:489-95). Dodatno, YACs su prethodno korišćeni za sastavljanje humanog lokusa lakog lanca Igλ transgena (videti, npr., Popov, A.V. et al., 1996, Gen 177:195-201; Popov, A.V. et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10): 1611-19). Ceo lokus lakog lanca Igλ (humani ili glodarski) može biti kloniran i sadržan unutar nekoliko YACs. Ukoliko je korišćeno više YACs i sadrže regione preklapajuće homologije, oni mogu biti rekombiovani unutar sojeva domaćinakvasca da proizvedu jedan konstrukt koji predstavlja ceo lokus ili željene delove lokusa (npr., region za targeting sa targeting vektorom). YAC ruke mogu biti dodatno modifikovane sa sisarskim selekcionim kasetama preko retrofitovanja da bi se pomoglo u introdukciji konstrukata u embrionalne matične ćelije ili embrione postupcima poznatim u tehnici i/ili opisanim ovde.
[0130] DNK i aminokiselinske sekvence genskih segmenata humanog Igλ lakog lanca za upotrebu u konstruisanju konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano mogu se dobiti iz objavljenih baza podataka (npr., GenBank, IMGT, itd.) i/ili objavljenih sekvenci antitela. DNK inserti koji sadrže genske segmente humanog Igλ lakog lanca, u nekim primerima izvođenja, sadrže jedan ili više enhanser sekvenci (ili regiona) humanog Igλ lakog lanca. DNK inserti, u nekim primerima izvođenja, sadrže enhanser sekvencu (ili region) humanog Igλ lakog lanca koji uključuje jedan ili više elemenata sekvence, npr., jedan, dva, tri, itd. U nekim određenim primerima izvođenja, DNK inserti sadrže enhanser sekvencu (ili
2
region) humanog Igλ lakog lanca, označenog kao humani Eλ koji ima tri različita elementa sekvence. Stoga, u nekim primerima izvođenja, humani Eλ kao što je ovde opisano je modularna i jedan ili više elemenata sekvence funkcionišu zajedno kao enhanser sekvenca (ili region. U nekim određenim primerima izvođenja, DNK inserti koji sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca operativno povezane sa glodarskom sekvencom Igλ lakog lanca (npr., sekvenca konstantnog regiona glodarskog Igλ lakog lanca). U nekim određenim primerima izvođenja, DNK inserti koji sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca operativno vezane sa sekvencom glodarskog Igλ lakog lanca (npr., sekvenca konstantnog regiona glodarskog Igλ lakog lanca) i operativno vezani sa jednim ili više segmenata humanog Vλ gena, jednim ili više parova genskih segmenata humanih Jλ-Cλ gena i/ili jedan ili više segmenata humanog Jλ gena. U nekim određenim primerima izvođenja, DNK inserti koji sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca sadrže enhanser sekvence humanog Igλ lakog lanca operativno povezane sa sekvencom glodarskog Igλ lakog lanca (npr., sekvencom konstantnog regiona glodarskog Igλ lakog lanca), jednim ili više segmenata humanog Vλ gena, jednim ili više segmenata humanog Jλ gena i jednim ili više segmenata humanog Cλ gena.
[0131] DNK inserti se mogu pripremiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Na primer, DNK insert se može pripremiti kao deo većeg plazmida. Takve pripreme omogućavaju kloniranje i selekciju ispravnih konstrukata na efikasan način kao što je poznato u tehnici. DNK inserti koji sadrže sekvence humanog Igλ lakog lanca, u celini ili delimično, kao što je ovde opisano može se locirati između pogodnih restrikcionih mesta na plazmidu tako da sse mogu lako izolovati od preostalih sekvenci plazmida za inkorporaciju u željenog glodara.
[0132] Različiti postupci korišćeni u pripremi plazmida i transformaciji organizama domaćina su poznati u tehnici. Za druge pogodne ekspresione sisteme i za prokariotske i za eukariotske ćelije, kao i za opšte rekombinantne procedure, videti Principles of Gen Manipulation: An Introduction to Gentic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. i S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Targeting vektori
[0133] Targeting vektori se mogu koristiti za uvođenje DNK inserta u genomski target lokus i sadrže DNK insert i homologe ruke koje flankiraju pomenuti DNK insert. Targeting vektori mogu biti linearnog oblika ili kružnog oblika, i mogu biti jenolančani ili dvolančani.
Targeting vektori mogu biti dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Za lakše obeležavanje, homologe ruke se ovde označavaju kao 5’ i 3’ (tj., ushodne i nishodne) homologe ruke. Ova terminologija se odnosi na relativni položaj homologih ruku u odnosu na DNK insert unutar targeting vektora. 5’ i 3’ homologe ruke odgovaraju regionima unutar targetiranog lokusa ili regionu unutar drugog targeting vektora, koji se ovde označavaju kao "5’ target sekvenca" i "3’ target sekvenca," respektivno. U nekim primerima izvođenja, homologe ruke takođe mogu funkcionisati kao 5’ ili 3’ target sekvence.
[0134] U nekim primerima izvođenja, ovde opisani postupci koriste dva, tri ili više targeting vektora koji su sposobni za međusobnu rekombinaciju. U različitim primerima izvođenja, targeting vektori su veliki targeting vektori (LTVEC) kao što je ovde opisano na drugim mestima. U takvim primerima izvođenja, svaki od prvog, drugog, i trećeg targeting vektora sadrži 5’ i 3’ homologu ruku.3’ homologa ruka prvog targeting vektora sadrži sekvencu koja se preklapa sa 5’ homologom rukom drugog targeting vektora (tj., preklapajuće sekvence), koje omogućavaju homologu rekombinaciju između prvog i drugog LTVECs.
[0135] U slučaju dvostrukih targeting postupaka, 5’ homologa ruka prvog targeting vektora i 3’ homologa ruka drugog targeting vektor su homologe odgovarajućim segmentima unutar target genomskog lokusa (tj., target sekvenci) što promoviše homologu rekombinaciju prvog i drugog targeting vektora sa odgovarajućim genomskim segmentima i modifikuje target genomski lokus.
[0136] U slučaju trostrukih targeting postupaka, 3’ homologa ruka drugog targeting vektora sadrži sekvencu koja se preklapa sa 5’ homologom rukom trećeg targeting vektora (tj., preklapajućim sekvencama), što omogućava homologu rekombinaciju između drugog i trećeg LTVEC. 5’ homologa ruka prvog targeting vektora i 3’ homologa ruka trećeg targeting vektora su homologe odgovarajućim segmentima unutar target genomskog lokusa (tj., target sekvence), što promoviše homologu rekombinaciju prvog i trećeg targeting vektora sa odgovarajućim genomskim segmentima i modifikuje target genomski lokus.
[0137] Homologa ruka i target sekvenca ili dve homologe ruke "odgovaraju" ili su međusobno "odgovarajuće" kada dva regiona imaju dovoljan nivo međusobne identičnosti sekvence da bi delovali kao supstrati za reakciju homologe rekombinacije. Termin "homologija" uključuje DNK sekvence koje su ili identične ili imaju identičnost sekvence sa odgovarajućom sekvencom. Identičnost sekvence između date target sekvence i odgovarajuće homologe ruke koja se nalazi na targeting vektoru (tj., preklapajuće sekvence) ili između dve homologe ruke može biti bilo koji stepen identičnosti sekvence koji omogućava dešavanje homologe rekombinacije. Kao primer, količina identičnosti sekvence koju imaju homologa ruka targeting vektora (ili njegovog fragmenta) i target sekvence drugog targeting vektora ili
4
target sekvence target genomskog lokusa (ili njegovog fragmenta) može biti, npr., ali se ne ograničavajući na, najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, tako da sekvence podležu homologoj rekombinaciji.
[0138] Dodatno, odgovarajući region homologije između homologe ruke i odgovarajuće target sekvence može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homologu rekombinaciju na target genomskom lokusu. Na primer, data homologa ruka i/ili odgovarajuća target sekvenca može sadržati odgovarajuće regione homologije koji su, npr., ali se ne ograničavajući na, najmanje oko 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, ili 200-300kb u dužini ili više (kao što je opisano ovde na drugim mestima) tako da homologa ruka ima dovoljnu homologiju da podležu homologoj rekombinaciji sa odgovarajućom target sekvencom (sekvencama) unutar target genomskog lokusa ćelije ili unutar drugog targeting vektora. U nekim primerima izvođenja, data homologa ruka i/ili odgovarajuća target sekvenca sadrže odgovarajuće regione homologije koji su, npr., ali se ne ograničavajući na, najmanje oko 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, ili 95-100kb u dužini ili više (kao što je ovde napisano na drugim mestima) tako da homologa ruka ima dovoljnu homologiju da podlegne homologoj rekombinaciji sa odgovarajućom target sekvencom (sekvencama) unutar target genomskog lokusa ćelije ili unutar drugog targeting vektora.
[0139] Preklapanje sekvenci 3’ homologe ruke prvog targeting vektora i 5’ homologe ruke drugog targeting vektora ili 3’ homologe ruke drugog targeting vektora i 5’ homologe ruke trećeg targeting vektora može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homologu rekombinaciju između pomenutih targeting vektora. Na primer, dato preklapanje sekvenci homologe ruke može sadržati odgovarajuće preklapajuće regione koji su najmanje oko 1-5kb, 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, ili 200-300kb u dužini ili više tako da preklapajuća sekvenca homologe ruke ima dovoljnu homologiju da podlegne homologoj rekombinaciji sa odgovarajućom preklapajućom sekvencom unutar drugog targeting vektora. U nekim primerima izvođenja, data preklapajuća sekvenca homologe ruke sadrži preklpajući region koji je najmanje oko 1-100kb, 5-100kb, 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, ili 95-100kb u dužini ili više tako da preklapajuća sekvenca homologe ruke ima dovoljnu homologiju da podlegne homologoj rekombinaciji sa odgovarajućom preklapajućom sekvencom unutar drugog targeting vektora. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je od 1-5kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je od oko 1kb do oko 70kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je od oko 10kb do oko 70kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je od oko 10kb do oko 50kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je najmanje 10kb. U nekim primerima izvođenja, preklapajuća sekvenca je najmanje 20kb. Na primer, preklapajuća sekvenca može biti od oko 1kb do oko 5kb, uključujući i nju, od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 15kb, uključujući i nju, od oko 15kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 25kb, uključujući i nju, od oko 25kb do oko 30 kb, uključujući i nju, od oko 30kb do oko 35kb, uključujući i nju, od oko 35kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 45kb, uključujući i nju, od oko 45kb do oko 50kb, uključujući i nju, od oko 50kb do oko 60kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 70kb, uključujući i nju, od oko 70kb do oko 80kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 90kb, uključujući i nju, od oko 90kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do oko 120kb, uključujući i nju, od oko 120kb do oko 140kb, uključujući i nju, od oko 140kb do oko 160kb, uključujući i nju, od oko 160kb do oko 180kb, uključujući i nju, od oko 180kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 200kb do oko 220kb, uključujući i nju, od oko 220kb do oko 240kb, uključujući i nju, od oko 240kb do oko 260kb, uključujući i nju, od oko 260kb do oko 280kb, uključujući i nju, ili oko 280kb do oko 300 kb, uključujući i nju. Kao primer, preklapajuća sekvenca može biti od oko 20kb do oko 60kb, uključujući i nju. Alternativno, preklapajuća sekvenca može biti najmanje 1kb, najmanje 5kb, najmanje 10kb, najmanje 15kb, najmanje 20kb, najmanje 25kb, najmanje 30kb, najmanje 35kb, najmanje 40kb, najmanje 45kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 120kb, najmanje 140kb, najmanje 160kb, najmanje 180kb, najmanje 200kb, najmanje 220kb, najmanje 240kb, najmanje 260kb, najmanje 280kb, ili najmanje 300kb.
[0140] Homologe ruke mogu, u nekim primerima izvođenja, odgovarati lokusu koji je nativan ćeliji (npr., targetirani lokus), ili alternativno mogu odgovarati regionu heterologog ili egzogenog segmenta DNK koji je integrisan u genom ćelije, uključujući, na primer, transgene, ekspresione kasete, ili heterologne ili egzogene regione DNK. Alternativno, homologe ruke mogu, u nekim primerima izvođenja, odgovarati regionu na targeting vektoru u ćeliji. U nekim primerima izvođenja, homologe ruke targeting vektora mogu odgovrati regionu veštačkog hromozoma kvasca (YAC), bakterijskom veštačkom hromozomu (BAC), humanom veštačkom hromozomu, ili bilo kom drugom konstruisanom regionu koji se sadrži u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Dodatno, homologe ruke targeting vektora mogu odgovarati ili biti izvedene iz regiona BAC biblioteke, kozmidne biblioteke, ili biblioteke P1 faga. U nekim određenim primerima izvođenja, homologe ruke targeting vektora odgovaraju lokusu koji je nativan, heterologans, ili egzogen u odnosu na prokariota, kvasca, ptice (npr., kokoške), ne-humanog sisara, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka ili zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, mačke, psa, feretke, primata (npr., marmozeta, rezus majmuna), domestifikovanog sisara, poljoprivrednog sisara, ili bilo kog drugog organizma od interesa. U nekim primerima izvođenja, homologe ruke odgovaraju lokusu ćelije koja nije targetabilna korišćenjem konvencionalnog postupka ili koja se može targetirati samo nekorektno ili sa mo sa značajno nižom efikasnošću u dosustvu jednolančani ili dvolančanog prekida indukovanog nukleaznim sredstvom (npr., Cas protein). U nekim primerima izvođenja, homologe ruke su izvedene iz veštačke DNK.
[0141] U nekim primerima izvođenja, jedna od 5’ ili 3’ homologih ruku targeting vektora (ili više njih) odgovara targetiranom genomskom lokusu dok druge od 5’ ili 3’ homologih ruku odgovaraju regionu drugog targeting vektora.
[0142] U nekim primerima izvođenja, 5’ i 3’ homologe ruke targeting vektora (ili više njih) odgovaraju targetiranom genomu. Alternativno, homologe ruke mogu biti iz srodnog genoma. Na primer, targetirani genom je mišji genom prvog soja, i targeting ruke su od mišjeg genoma drugog soja, pri čemu su prvi soj i drugi soj različiti. U određenim primerima izvođenja, homologe ruke su od genoma iste životinje ili su od genoma istog soja, npr., targetirani genom je mišji genome prvog soja, i targeting ruke su od mišjeg genoma iz istog miša ili od istog soja.
[0143] Homologa ruka targeting vektora može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše događaja homologe rekombinacije sa odgovarajućom target sekvencom, uključujući, na primer, najmanje 1-5kb, uključujući i nju, 5-10kb, uključujući i nju, 5-15kb, uključujući i nju, 5-20kb, uključujući i nju, 5-25kb, uključujući i nju, 5-30kb, uključujući i nju, 5-35kb, uključujući i nju, 5-40kb, uključujući i nju, 5-45kb, uključujući i nju, 5-50kb, uključujući i nju, 5-55kb, uključujući i nju, 5-60kb, uključujući i nju, 5-65kb, uključujući i nju, 5-70kb, uključujući i nju, 5-75kb, uključujući i nju, 5-80kb, uključujući i nju, 5-85kb, uključujući i nju, 5-90kb, uključujući i nju, 5-95kb, uključujući i nju, 5-100kb, uključujući i nju, 100-200kb, uključujući i nju, ili 200-300kb, uključujući i nju, u dužini ili duže. U nekim primerima izvođenja, homologa ruka targeting vektora ima dužinu koja je dovoljna da promoviše događaj homologe rekombinacije sa odgovarajućom target sekvencom koja je najmanje 1-100kb, uključujući i nju, 5-100kb, uključujući i nju, 10-100kb, uključujući i nju, 15-100kb, uključujući i nju, 20-100kb, uključujući i nju, 25-100kb, uključujući i nju, 30100kb, uključujući i nju, 35-100kb, uključujući i nju, 40-100kb, uključujući i nju, 45-100kb, uključujući i nju, 50-100kb, uključujući i nju, 55-100kb, uključujući i nju, 60-100kb, uključujući i nju, 65-100kb, uključujući i nju, 70-100kb, uključujući i nju, 75-100kb, uključujući i nju, 80-100kb, uključujući i nju, 85-100kb, uključujući i nju, 90-100kb, uključujući i nju, ili 95-100kb, uključujući i nju, u dužini ili duža. Kao što je ovde opisano, veliki targeting vektori mogu koristiti targeting ruke veće dužine.
[0144] Nukleazna sredstva (npr., CRISPR/Cas sistemi) mogu se koristiti u kombinaciji sa targeting vektorima da olakšaju modifikaciju target lokusa (npr., lokusa lakog lanca Igλ). Takva nukleazna sredstva mogu promovisati homologu rekombinaciju između targeting vektora i target lokusa. Kada se koriste nukelazna sredstva u kombinaciji sa targeting vektorom, targeting vektor može sadržati 5’ i 3’ homologe ruke koje odgovaraju 5’ i 3’ target sekvenci lociranoj u dovoljnoj blizini mesta isecanja nukleze tako da se promoviše pojava događaja homologe rekombinacije između target sekvenci i homologih ruku nakon jednolančani ili dvostrukog prekida na mestu isecanja nukleaze. Termin "mesto isecanja nukleaze" uključuje DNK sekvencu na kojoj je stvoren jednolančani ili dvolančani prekid sa nukleaznim sredstvom (npr., Cas9 mesto isecanja). Target sekvence unutar targetiranog lokusa koji odgovara 5’ i 3’ homologim rukama targeting vektora su "smeštene u dovoljnoj blizini" mesta isecanja nukleaze ukoliko je razdaljina takva da promoviše pojavu događaja homologe rekombinacije između 5’ i 3’ target sekvenci i homologih ruku nakon jednolančanog ili dvolančanog prekida na mestu prepoznavanja. Stoga, u određenim primerima izvođenja, target sekvence koje odgovaraju 5’ i/ili 3’ homologim rukama targeting vektora su unutar jednog nukleotida datog mesta prepoznavanja ili su unutar najmanje 10 nukleotida do oko 14kb datog mesta prepoznavanja. U nekim primerima izvođenja, mesto isecanja nukleaze je neposredno susedno najmanje jednoj ili obe target sekvence.
[0145] Prostorni odnos target sekvenci koje odgovaraju homologim rukama targeting vektora i mestu isecanja nukleaze može varirati. Na primer, target sekvence se mogu nalaziti 5’ od mesta isecanja nukelaze, target sekvence se mogu nalaziti 3’ od mesta prepoznavanja, ili target sekvence mogu flankirati mesto isecanja nukleaze.
[0146] Kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, veliki targeting vektor) sa nukleaznim sredstvom može rezultovati u povećanoj efikasnosti targetinga u poređenju sa upotrebom samog targeting vektora. Na primer, kada se targeting vektor koristi zajedno sa nukelaznim sredstvom, efikasnost targetinga targeting vektora može se povećati najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje četiri puta, najmanje pet puta, najmanje šest puta, najmanje sedam puta, najmanje osam puta, najmanje devet puta, najmanje deset puta ili unutar opsega formiranog od ovih celih brojeva, kao što je 2-10-puta u poređenju sa upotrebom targeting vektora zasebno.
[0147] Neki targeting vektori su "veliki targeting vektori" ili "LTVECs," što uključuje targeting vektore koji sadrže homologe ruke koje odgovaraju i izveden su iz sekvenci nukleinske kiseline većih od onih koje su tpično korišćene za druge pristupe nameravane da izvedu homologu rekombinaciju u ćelijama. LTVEC može biti, na primer, najmanje 10kb dužine, ili ukupni zbir 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke može biti, na primer, najmanje 10kb. LTVECs takođe uključuju targeting vektore koji sadrže DNK inserte veće od onih koji se tipično koriste u drugim pristupima čija je namera da izvedu homologu rekombinaciju u ćelijama. Na primer, LTVECs čine mogućom modifikaciju velikih lokusa koji se ne mogu smestiti tradicionalnim targeting vektorima zasnovanim na plazmidu usled ograničenja njihove veličine. Na primer, targetirani lokus može biti (tj., 5’ i 3’ homologe ruke mogu odgovarati) lokusu ćelije koji nije targetabilan korišćenjem konvencionalnog postupka ili koji može biti targetiran samo nekorektno ili samo sa značajno niskom efiaksnošću u odsustvu jednolančanog ili dvolančanog prekida indukovanog sa nukleaznim sredstvom (npr., Cas protein).
[0148] U nekim primerima izvođenja, postupci opisani ovde koriste dva ili tri LTVECs koi su sposobni za međusobnu rekombinaciju i sa targetiranim genomskim lokusom u događaju trostruke ili četvorostruke rekombinacije. Takvi postupci čine mogućim modifikaciju velikih lokusa koja se ne može postići korišćenjem jednog LTVEC.
[0149] Primeri LTVECs uključuju vektore izvedene iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromooma, ili veštačog hromozoma kvasca (YAC). Primeri LTVECs i postupci za njihovo stvaranje su opisani, npr., SAD patentnima br. 6,586,251, 6,596,541 i br. 7,105,348; i Međunarodnoj patentnoj prijavi objavi br. WO 2002/036789. LTVECs mogu biti linearnog oblika ili kružnog oblika.
[0150] LTVECs mogu biti bilo koje dužine, uključujući, na primer, od oko 20kb do oko 300kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 50 kb, uključujući i nju, od oko 50kb do oko 75kb, uključujući i nju, od oko 75kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do 125kb, uključujući i nju, od oko 125kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 175kb, uključujući i nju, od oko 175kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 200kb do oko 225kb, uključujući i nju, od oko 225kb do oko 250kb, uključujući i nju, od oko 250kb do oko 275kb, uključujući i nju, ili od oko 275kb do oko 300kb, uključujući i nju. Alternativno, LTVEC može biti najmanje 10kb, najmanje 15kb, najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 150kb, najmanje 200kb, najmanje 250kb, najmanje 300kb, najmanje 350kb, najmanje 400kb, najmanje 450kb, ili najmanje 500kb ili više. Veličina LTVEC može, u nekim primerima izvođenja, biti prevelika da bi omogućila skrining targeting događaja konvencionalnim analizama, npr., southern bloting i long-range (npr., 1kb do 5kb) PCR.
[0151] U nekim primerima izvođenja, LTVEC sadrži DNK insert u opsegu od oko 5kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 30kb, uključujući i nju, od oko 30kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 50kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 70kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 90kb, uključujući i nju, od oko 90kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do oko 110kb, uključujući i nju, od oko 120kb do oko 130kb, uključujući i nju, od oko 130kb do oko 140kb, uključujući i nju, od oko 140kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 160kb, uključujući i nju, od oko 160kb do oko 170kb, uključujući i nju, od oko 170kb do oko 180kb, uključujući i nju, od oko 180kb do oko 190kb, uključujući i nju, ili od oko 190kb do oko 200kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, DNK insert može biti u opsegu od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 60kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 80kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 200kb do oko 250kb, uključujući i nju, od oko 250kb do oko 300kb, uključujući i nju, od oko 300kb do oko 350kb, uključujući i nju, ili od oko 350kb do oko 400kb, uključujući i nju. U nekim primerima izvođenja, LTVEC sadrži DNK insert u opsegu od oko 400kb do oko 450kb, uključujući i nju, od oko 450kb do oko 500kb, uključujući i nju, od oko 500kb do oko 550kb, uključujući i nju, od oko 550kb do oko 600kb, uključujući i nju, oko 600kb do oko 650kb, uključujući i nju, od oko 650kb do oko 700kb, uključujući i nju, od oko 700kb do oko 750kb, uključujući i nju, ili od oko 750kb do oko 800kb, uključujući i nju.
[0152] U nekim primerima izvođenja, ukupan zbir 5’ homologu ruku i 3’ homologu ruku LTVEC je najmanje 10kb. U nekim primerima izvođenja, 5’ homologa ruka LTVEC(s) je u opsegu od oko 1kb do oko 100kb, uključujući i nju, i/ili 3’ homologa ruka LTVEC(s) je u opsegu od oko 1kb do oko 100kb, uključujući i nju. Ukupan zbir of 5’ i 3’ homologe ruke mogu biti, na primer, od oko 1kb do oko 5kb, uključujući i nju, od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 30kb, uključujući i nju, od oko 30kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 50kb, uključujući i nju, od oko 50kb do oko 60kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 70kb, uključujući i nju, od oko 70kb do oko 80kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 90kb, uključujući i nju, od oko 90kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do oko 110kb, uključujući i nju, od oko 110kb do oko 120kb, uključujući i nju, od oko 120kb do oko 130kb, uključujući i nju, od oko 130kb do oko 140kb, uključujući i nju, od oko 140kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 160kb, uključujući i nju, od oko 160kb do oko 170kb, uključujući i nju, od oko 170kb do oko 180kb, uključujući i nju, od oko 180kb do oko 190kb, uključujući i nju, ili od oko 190kb do oko 200kb, uključujući i nju. Alternativno, svaka homologa ruka može, u nekim primerima izvođenja, biti najmanje 5kb, najmanje 10kb, najmanje 15kb, najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80 kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 1 10kb, najmanje 120kb, najmanje 130kb, najmanje 140kb, najmanje 150kb, najmanje 160kb, najmanje 170kb, najmanje 180kb, najmanje 190kb, ili najmanje 200kb. Slično tome, ukupan zbir 5’ i 3’ homologih ruku može, u nekim primerima izvođenja, biti najmanje 5kb, najmanje 10kb, najmanje 15kb, najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 1 10kb, najmanje 120kb, najmanje 130kb, najmanje 140kb, najmanje 150kb, najmanje 160kb, najmanje 170kb, najmanje 180kb, najmanje 190kb, ili najmanje 200kb.
[0153] U nekim primerima izvođenja, LTVEC i DNK insert su dizajnirani da omogućuju deleciju endogene sekvence na target lokus od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 60kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 80kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 100kb, uključujući i nju, ili od oko 100kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 200kb do oko 300kb, uključujući i nju, od oko 300kb do oko 400kb, uključujući i nju, od oko 400kb do oko 500kb, uključujući i nju, od oko 500kb do oko 600kb, uključujući i nju, od oko 600kb do oko 700kb, uključujući i nju, od oko 700kb do oko 800kb, uključujući i nju, ili od oko 500kb do oko 1Mb, uključujući i nju, od oko 1Mb do oko 1.5Mb, uključujući i nju, od oko 1.5Mb do oko 2Mb, uključujući i nju, od oko 2Mb do oko 2.5Mb, uključujući i nju, ili od oko 2.5Mb do oko 3Mb, uključujući i nju. Alternativno, delecija može biti od oko 3Mb do oko 4Mb, uključujući i nju, od oko 4Mb do oko 5Mb, uključujući i nju, od oko 5Mb do oko 10Mb, uključujući i nju, od oko 10Mb do oko 20Mb, uključujući i nju, od oko 20Mb do oko 30Mb, uključujući i nju, od oko 30Mb do oko 40Mb, uključujući i nju, od oko 40Mb do oko 50Mb, uključujući i nju, od oko 50Mb do oko 60Mb, uključujući i nju, od oko 60Mb do oko 70Mb, uključujući i nju, od oko 70Mb do oko 80Mb, uključujući i nju, od oko 80Mb do oko 90Mb, uključujući i nju, ili od oko 90Mb do oko 100Mb, uključujući i nju. Alternativno, delecija može biti najmanje 10kb, najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 150kb, najmanje 200kb, najmanje 250kb, najmanje 300kb, najmanje 350kb, najmanje 400kb, najmanje 450kb, ili najmanje 500kb ili
1
veća.
[0154] U nekim primerima izvođenja, LTVEC i DNK inserti su dizajnirani da omogućuju inserciju u target lokus egzogene sekvence nukelinske kiseline u opsegu od oko 5kb do oko 10kb, uključujući i nju, od oko 10kb do oko 20kb, uključujući i nju, od oko 20kb do oko 40kb, uključujući i nju, od oko 40kb do oko 60kb, uključujući i nju, od oko 60kb do oko 80kb, uključujući i nju, od oko 80kb do oko 100kb, uključujući i nju, od oko 100kb do oko 150kb, uključujući i nju, od oko 150kb do oko 200kb, uključujući i nju, od oko 200kb do oko 250kb, uključujući i nju, od oko 250kb do oko 300kb, uključujući i nju, od oko 300kb do oko 350kb, uključujući i nju, ili od oko 350kb do oko 400kb, uključujući i nju. Alternativno, insercija može, u nekim primerima izvođenja, biti od oko 400kb do oko 450kb, uključujući i nju, od oko 450kb do oko 500kb, uključujući i nju, od oko 500kb do oko 550kb, uključujući i nju, od oko 550kb do oko 600kb, uključujući i nju, oko 600kb do oko 650kb, uključujući i nju, od oko 650kb do oko 700kb, uključujući i nju, od oko 700kb do oko 750kb, uključujući i nju, ili od oko 750kb do oko 800kb, uključujući i nju. Alternativno, insercija može biti, u nekim primerima izvođenja, najmanje 10kb, najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 150kb, najmanje 200kb, najmanje 250kb, najmanje 300kb, najmanje 350kb, najmanje 400kb, najmanje 450kb, ili najmanje 500kb ili greater.
[0155] U drugim slučajevima, DNK insert i/ili region endogenog lokusa koji je izmenjen, deletiran, targetiran, modifikovan, konstruisan, itd., je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ili 900 nukleotida ili najmanje 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14kb, 15kb, 16kb, 17kb, 18kb, 19kb, 20kb ili veći. U nekim primerima izvođenja, DNK insert i/ili region endogenog lokusa koji je izmenjen, deletiran, targetiran, modifikovan, konstruisan, itd., je nukleotida do 20kb, 200 nukleotida do 20kb, 300 nukleotida do 20kb, 400 nukleotida do 20kb, 500 nukleotida do 20kb, 600 nukleotida do 20kb, 700 nukleotida do 20kb, 800 nukleotida do 20kb, 900 nukleotida do 20kb, 1kb do 20kb, 2kb do 20kb, 3kb do 20kb, 4kb do 20kb, 5kb do 20kb, 6kb do 20kb, 7kb do 20kb, 8kb do 20kb, 9kb do 20kb, 10kb do 20kb, 11kb do 20kb, 12kb do 20kb, 13kb do 20kb, 14kb do 20kb, 15kb do 20kb, 16kb do 20kb, 17kb do 20kb, 18kb do 20kb, ili 19kb do 20kb. U nekim primerima izvođenja, DNK insert i/ili region endogenog lokusa koji je izmenjen, deletiran, targetiran, modifikovan, konstruisan, itd., je 100 nukleotida do 19kb, 100 nukleotida do 18kb, 100 nukleotida do 17kb, 100 nukleotida do 16kb, 100 nukleotida do 15kb, 100 nukleotida do 14kb, 100 nukleotida do 13kb, 100 nukleotida do 12kb, 100 nukleotida do 11kb, 100 nukleotida do 10kb, 100 nukleotida do 9kb, 100 nukleotida do 8kb, 100 nukleotida do 7kb, 100 nukleotida do 6kb, 100 nukleotida do 5kb, 100 nukleotida do 4kb, 100 nukleotida do 3kb,
2
100 nukleotida do 2kb, 100 nukleotida do 1kb, 100 nukleotida do 900 nukleotida, 100 nukleotida do 800 nukleotida, 100 nukleotida do 700 nukleotida, 100 nukleotida do 600 nukleotida, 100 nukleotida do 500 nukleotida, 100 nukleotida do 400 nukleotida, 100 nukleotida do 300 nukleotida, ili 100 nukleotida do 200 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, DNK insert i/ili region endogenog lokusa koji je izmenjen, deletiran, targetiran, modifikovan, konstruisan, itd., je 200 nukleotida do 19kb, 300 nukleotida do 18kb, 400 nukleotida do 17kb, 500 nukleotida do 16kb, 600 nukleotida do 15kb, 700 nukleotida do 14kb, 800 nukleotida do 13kb, 900 nukleotida do 12kb, 1kb do 11kb, 2kb do 10kb, 3kb do 9kb, 4kb do 8kb, 5kb do 7kb, ili 5kb do 6kb.
Glodari
[0156] U određenim aspektima, korišćeni su glodari koji eksprimiraju antitela koja sadže lake lance koji uključuju sekvence humanog Igλ lakog lanca, u celini ili delimično, pto je rezultat integracije genetičkog materijala koji odgovara najmanje delu humanog lokus lakog lanca Igλ, i koji kodira najmanje humani Vλ domen (tj., rearanžirane humane Vλ- Jλ sekvence), umesto odgovarajućih sekvenci glodarskog Igλ lakog lanca u genimu klicine linije miša.
[0157] Sekvence humanog Igλ lakog lanca, u nekim primerima izvođenja, sadrže genetiki materijal od humanog lokusa lakog lanca Igλ, pri čemu sekvenca humanog Igλ lakog lanca kodira imunoglobulinski laki lanac koji sadrži kodirani deo genetičkg materijala od humanog lokusa lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano sadrži najmanje jedan humani Vλ genski segment i najmanje jedan humani Jλ genski segment, i jednu ili više sekvenci neophodniš za promovisanje rearanžmana (npr., rekombinaciona signalna sekvenca [sekvence]) pomenutog najmanje jednog humanog Vλ genskog segmenta sa pomenutim najmanje jednim humanim Jλ genskim segmentom da bi se formirao funkcionalana rearanžirana humana Vλ-Jλ sekvenca koja kodira humani Vλ domen. U mnogim primerima izvođenja, sekvence humanog Igλ lakog lanca sadrže mnoštvo segmenta humanog Vλ gena i jedan ili više sekvenci neophodnih za promovisanje rearanžmana pomenutog segmenta humanog Vλ gena sa najmanje jednim humanim Jλ genskim segmentom. U mnogim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano je genomska sekvenca humanog lokusa lakog lanca Igλ (npr., izolovanog i/ili kloniranog iz bakterijskog veštačkog hromozoma) i sadrži mnoštvo segmenata humanog Vλ gena u konsfiguraciji klicine linije. U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca sadrži humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence u konfiguraciji klicine linije (tj., kako se pomenute humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence pojavljuju u lokusu lakog lanca Igλ u humanoj ćeliji). U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je ili sadrži humanu sekvencu koja se pojavljuje u Crtežima (npr., videti Slike 1-4). U nekim primerima izvođenja, sekvence humanog Igλ lakog lanca kodiraju polipeptid Igλ lakog lanca, u celini ili delimično, pri čemu polipeptid Igλ lakog lanca se pojavljuje u imunoglobulinu, naročito, imunoglobulin koji je eksprimiran od strane humane B ćelije. Glodari, embrioni, ćelije i targeting konstrukti za stvaranje glodara, embriona glodara, i ćelija koje sadrže sekvencu humanog Igλ lakog lanca umesto odgovarajuće sekvence glodarskog Igλ lakog lanca (npr., endogeni glodarski lokus lakog lanca Igλ) mogu takođe biti korišćeni.
[0158] U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je inseriran umesto odogvarajće sekvence glodarskog Igλ lakog lanca unutra genoma klicine linije glodara. U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je inserirana ushodno od glodarske sekvence Igλ lakog lanca (npr., sekvence glodarskog konstantnog regiona Igλ lakog lanca). U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je inserirana u sredini između jedne ili više sekvenci glodarskog Igλ lakog lanca tako da pomenuta sekvenca humanog Igλ lakog lanca je postavljena nasuprot sekvenci glodarskog Igλ lakog lanca (npr., videti Slike 1, 2, 3 i/ili 4).
[0159] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više glodarskih sekvenci (ili njihov deo) Igλ lakog lanca glodarskog lokusa lakog lanca Igλ nisu deletirani. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci Igλ lakog lanca (npr., Vλ, Jλ i/ili Cλ) lokusa lakog lanca Igλ su izmenjene, izmeštene, disruptovane, deletirane ili zamenjene sa, između ostalog, sekvencom humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano (npr., sekvenca koja uključuje jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena, jedan ili više segmenata humanog Cλ gena, ili njihove kombinacije) operativno vezana sa konstantnim regionom glodarskog Igλ lakog lanca, i jedan ili više enhanser i/ili regulatornih elemenata glodarskog lokusa lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, sav ili suštinski sav glodarski lokus lakog lanca Igλ je zamenjen sa jednom ili više sekvenci humanog Igλ lakog lanca (kao što je ovde opisano) koje su operativno vezane sa konstantnim regionom glodarskim Igλ lakog lanca i jednim ili više enhansera Igλ lakog lanca i/ili regulatorni element(e) glodarskog lokusa lakog lanca Igλ. U nekim određenim primerima izvođenja, jedan ili više gena konstantnog regiona glodarskog Igλ lakog lanca nisu deletirani ili zamenjeni u glodaru koji uključuje sekvencu humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano. Kao neograničavajući primer, u slučaju insercije sekvence humanog Igλ lakog lanca koji je ubačen u glodarski lokus lakog lanca Igλ, pomenuta insercija je napravljena na način da se održi integritet sekvenci glodarskog Igλ lakog lanca blizu tačke insercije (npr., konstantni region glodarskog Igλ lakog lanca i/ili region ili sekvenca glodarskog enhansera
4
Igλ lakog lanca). Stoga, takvi s imaju konstantni region divljeg tipa Igλ lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, glodarski lokus lakog lanca Igλ kojii je izmenjen, izmešten, dsiruptovan, deletiran, zamenjen ili konstruisan sa jednom ili više sekvenci humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano je glodarski (npr., miša ili pacova) lokus lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca je inserirana u jednoj kopiji (tj., alelu) glodarskog lokusa lakog lanca Igλ od dve kopije pomenutog glodarskog lokusa Igλ, lakog lanca dajući glodara koji je heterozigotan u odnosu na sekvence humanog Igλ lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, korišćen je glodar koji je homozigotan za lokus lakog lanca Igλ koij uključuje sekvencu humanog Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano.
[0160] U nekim primerima izvođenja, konstruisani glodarski lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži humane Vλ, Jλ i Cλ genske segmente operativno vezane sa konstantnim regionom glodarskog Igλ lakog lanca i jednim ili više mišijih enhansera Igλ lakog lanca (izborno regulatorni elementi glodarskog Igλ lanca mogu takođe biti prisutni). U nekim primerima izvođenja, konstruisani glodarski lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži humane Vλ, Jλ i Cλ genske segmente operativno vezane sa konstantnim regionom glodarskog Igλ lakog lanca, jednim ili više enhansera nehumanih Igλ lakog lanca) (izborno regulatorni elementi glodarskog Igλ lakog lanca) i jedan ili više humana enhansera i/ili regulatorna elementa Igλ lakog lanca.
[0161] U nekim primerima izvođenja, glodar sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano koji je randomizovano integrisan u njegov genom (npr., kao deo randomizovano integrisane sekvence humanog Igλ lakog lanca). Stoga, takvi glodari se mogu opisati kao da imaju transgen humanog Igλ lakog lanca koji sadrži mnoštvo humanih Vλ, Jλ i/ili Cλ genskih segmenata konfigurisanih tako da pomenuti humani Vλ, Jλ i/ili Cλ genski segmenti su sposobni za rearanžman i kodiranje Igλ lakog lanca, u celini ili delimično, antitela u eksprimiranom repertoaru glodara. Konstruisani lokus lakog lanca Igλ ili transgen kao što je ovde opisano može se detektovati korišćenjem različitih postupaka uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP), ili analizu zadobijanja ili gubitka alela. U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano je heterozigotan u odnosu na konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano je hemizigotan u odnosu na konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano sadrži jednu ili više kopija konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ ili transgen kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano sadrži lokus lakog lanca Igλ kao što je prikazano na Crtežu (npr., videti Sliku 1, 2, 3 i/ili 4).
[0162] U nekim slučajevima, kompozicije i postupci za stvaranje glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ koji uključuje jedan ili više sekvenci humanih Igλ lakog lanca (npr., humani Vλ, Jλ i/ili Cλ genskih segmenata) umesto sekvenci glodarskog Igλ lakog lanca, ukjljučujući kodirajuće sekvence humanog Igλ lakog lanca koje uključuju specifične polimorfne obike humanih Vλ, Jλ i/ili Cλ segmenata (npr., specifični V i/ili J aleli ili varijante) su opisani, uključujući kompozicije i postupke za stvaranje glodara koji eksprimira antitela koja sadrže Igλ lake lance koji sadrže humane varijabilne domene i humane ili glodarske konstantne domene, sastavljene od lokusa lakog lanca Igλ koji sadrži humane Vλ, Jλ i Cλ segmente operativno vezane za konstantni region glodarskog Igλ lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci za stvaranje glodara koji eksprimiraju takva antitela pod kontrolom endogenog enhansera (ili više njih) i/ili endogene regulatorne sekvence (sekvenci) su takođe opisani. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci za stvaranje glodara koji eksprimiraju takva antitela pod kontrolom heterologog enhansera (ili više njih) i/ili heterologe regulatorne sekvence (sekvenci) su takođe opisani.
[0163] U određenim primerima izvođenja, postupci opisani ovde uključuju inserciju sekvence koja kodira humani Igλ laki lanac, u celini ili delimično, ushodno od konstantnog regiona glodarskog Igλ lakog lanca (npr., mišjeg Cλ regiona) tako da je antitelo eksprimirano, pri čemu je antitelo karakterisano prisustvom lakog lanca koji sadrži najmanje humani Vλ domen i, u nekim primerima izvođenja, humani Vλ i Cλ domen, i eksprimirano je i na površini B ćelija i u serumu krvi glodara.
[0164] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju serijsku inserciju genetičkog materijala koji odgovara humanom lokus lakog lanca Igλ. U nekim primerima izvođenja, genetički materijal koji odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ može biti sintetički ili genomski (npr., kloniran iz bakterijskog veštačkog hromozoma). U nekim primerima izvođenja, genetički materijal koi odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ može se dizajnirati iz objavljenih izvora i/ili bakterijskih veštačkih hromozoma tako da pomenuti genetički materijal sadrži humane Vλ, Jλ i/ili Cλ segmente u orijentaciji koja je različita od one koja se javlja u humanom lokusu lakog lanca Igλ iako pomenuti genetički materijal još uvek sadrži sekvence da bi podržao rearanžman pomenutih humanih Vλ, Jλ i/ili Cλ segmenata da kodiraju funkcionalni Igλ laki lanac. Kao primer, genetički materijal koji odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ može se dizajnirati korišćenjem uputstva koje je ovde obezbeđeno da bi se konstruisala sekvenca humanog Igλ lakog lanca koja sadrži humane Vλ, Jλ i/ili Cλ segmente u redosledu i/ili aranžmanu koji je različit od onoga koji se pojavljuje u humanom lokusu lakog lanca Igλ humane ćelije. U takvom primeru, sadržaj humanih Vλ, Jλ i/ili Cλ segmenata bio bi ekvivalentan odgovarajućim segmentima u humanoj ćeliji, međutim, redosled i aranžman bi bili različiti. Kada se konstruiše humani lokus lakog lanca Igλ za stvaranje glodara kao što je ovde opisano potrebne rekombinacione signalne sekvence se mogu konfigurisati tako da humani segmenti mogu da se korektno rearanžiraju i formiraju funkcionalni Igλ laki lanac. Uputstva za konfiguraciju klicine linije segmenata humanog Igλ lakog lanca i sekvenci neophodnih za ispravnu rekombinaciju mogu se naći u Molecular Biology of B Cells, London: Elsevier Academic Press, 2004, Ed. Honjo, T., Alt, F.W., Neuberger, M. Chapters 4 (pp.37-59) i 5 (61-82).
[0165] U nekim primerima izvođenja, serijska insercija uključuje multiple insercije delova heterologog genetičkog materijala u jedan klon ES ćelije. U nekim primerima izvođenja, serijska insercija uključuje sekvencijalne insercije delova heterologog genetičkog materijala u sukcesivnim klonovima ES ćelije.
[0166] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuje inserciju od oko 11,822bp DNK nishodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da je pomenuta DNK operativno povezana sa mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, čija DNK uključuje jedan ili više enhanser regiona (ili sekvenci) humanog Igλ lakog lanca. U nekim određenim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 11,822bp DNK koja sadrži tri regiona (ili sekvence) enhansera humanog Igλ lakog lanca, pri čemu su pomenuta tri regiona (ili sekvence) enhansera humanog Igλ lakog lanca inserirani nishodno od pomenutog mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona.
[0167] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 125,473bp DNK ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da je DNK operativno vezana sa pomenutim mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, segmenata parova humanog Jλ-Cλ od Jλ1-Cλ1, Jλ2- Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i humanog Jλ genskog segmenta Jλ7. U nekim određenim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 11,822bp DNK koja sadrži jedan ili više enhanser regiona (ili sekvenci) humanog Igλ lakog lanca, pri čemu jedan ili više enhanser regiona (ili sekvenci) humanog Igλ lakog lanca su inserirane nishodno od pomenutog mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona.
[0168] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 171,458bp DNK ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da je pomenuta DNK operativno povezana sa pomenutim mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25 i Vλ3-27. U nekim određenim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 171,458bp DNK ushodno od humanog Vλ3-10 genskog segmenta koji je operativno vezani za mišji (npr., miša ili pacova) Cλ1 region, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25 i Vλ3-27.
[0169] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 121,188bp DNK ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da je pomenuta DNK operativno vezana za pomenuti mišji (npr., miša ili pacova) Cλ1 region, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ3-27, Vλ1-36, Vλ5-37, Vλ5-39, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ9-49, Vλ1-51 i Vλ5-52. U nekim određenim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 121,188bp DNK ushodno od humanog Vλ3-27 genskog segmenta koji je operativno vezan za mišji (npr., miša ili pacova) Cλ1 region, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ3-27, Vλ1-36, Vλ5-37, Vλ5-39, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ9-49, Vλ1-51 i Vλ5-52.
[0170] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 121,188bp DNK ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da pomenuta DNK je operativno vezana sa pomenutim mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ3-27, Vλ1-36, Vλ5-37, Vλ5-39, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ9-49, Vλ1-51 i Vλ5-52, i pri čemu DNK uključuje homologu ruku koja uključuje sekvencu koja je 5’ od mišjeg Vλ2 genskog segmenta. U nekim određenim primerima izvođenja, postupci uključuju inserciju od oko 121,188bp DNK ushodno od humanog Vλ3-27 genskog segmenta koji je operativno vezan sa mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segment humanog Vλ gena Vλ3-27, Vλ1-36, Vλ5-37, Vλ5-39, Vλ1-40, Vλ7-43, Vλ1-44, Vλ5-45, Vλ7-46, Vλ1-47, Vλ9-49, Vλ1-51 i Vλ5-52, i pri čemu DNK uključuje homologu ruku koja uključuje mišju sekvencu koja je 5’ od mišjeg Vλ2 genskog segmenta za direktnu deleciju mišje Igλ genomske sekvence (npr., lokus lakog lanca Igλ) nakon homologe rekombinacije sa pomenutim DNK fragmentom.
[0171] Insercija dodatnih humanih Vλ, Jλ i/ili Cλ genskih segmenata može se postići korišćenjem postupaka opisanih ovde da bi se dodalo diverzitetu konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ. Na primer, u nekim primerima izvođenja, postupci mogu uključivati inserciju oko 300kb DNK ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) Cλ1 regiona tako da pomenuta DNK je operativno vezana sa pomenutim mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 i Vλ4-69. U takvim primerima izvođenja, pomenuta DNK je inserirana ushodno od humanog Vλ5-52 genskog segmenta koji je operativno vezana sa mišjim (npr., miša ili pacova) Cλ1 regionom, pri čemu DNK uključuje segmente humanog Vλ gena Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61 i Vλ4-69. U nekim određenim primerima izvođenja, pomenuta DNK uključuje humani VpreB gen. Dodatni humani Vλ segmenti opisani prethodno mogu se klonirati direktno iz komercijalno dostupnih BAC klonova i aranžirani u manjem DNK fragmentu korišćenjem rekombinantnih tehnika opisanih ovde ili drugačije poznatih u tehnici. Alternativno, dodatni segmenti humanog Vλ gena opisani prethodno mogu se sintetisati u DNK fragment i dodati konstruisanom lokusu lakog lanca Igλ kao što je prethodno opisano. Slično tome, dodatni humani Jλ i/ili Cλ genski segmenti mogu se dobiti iz komercijalno dostupnih BAC klonova ili sintetisani dirktno iz objavljenih sekvenci. Takođe, endogeni enhanser regioni (ili sekvence) Igλ lakog lanca mogu se deletirati iz konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano. Ilustracija kao primer koja pokazuje konstruisani lokus lakog lanca Igλ glodara kao što je ovde opisano je data na bilo kojoj od Slika 1, 2, 3 i 4.
[0172] Gde je pogodno, sekvenca humanog Igλ lakog lanca (tj., sekvenca koja sadrži humane Vλ, Jλ i/ili Cλ genske segmente) koja kodira Igλ laki lanac, u celini ili delimično, može se odvojeno modifikovati da uključuje kodone koji su optimizovani za ekspresiju u glodaru (npr., videri SAD patente br.5,670,356 i 5,874,304). Sekvence sa optimizovanim kodonom su sintetičke sekvence, i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptid pune dužine koji ima suštinski istu aktivnost kao polipepti pune dužine) kodiran od strane roditeljskog polinukleotida čija sekvenca nije optimizovana. U nekim primerima izvođenja, sekvenca humanog Igλ lakog lanca koja kodira Igλ laki lanac, u celini ili delimično, može zasebno uključivati izmenjenu sekvencu da bi se optimizovalo korišćenje kodona za određeni tip ćelije (npr., glodarske ćelije). Na primer, kodoni svake nukleotidne sekvence koje treba inserirati u genom glodara može se optimizovati za ekspresiju u ćeliji glodara. Takva sekvence može se opisati kao sekvenca sa optimizovanim kodonom.
[0173] U nekim primerima izvođenja, insercija nukelotidne sekvence koja kodira humani Igλ laki lanac, u celini ili delimično, koristi minimalnu modifikaciju genoma klicine linije glodara kao što je ovde opisano i rezultuje u ekspresiji antitela koje sadrži lake lance koji su humani, u celini ili delimično. Postupci za stvaranje konstruisanih glodara, uključujući nok-aut i nok-in, su poznati u tehnici (videti, npr., Gen Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000). Na primer, stvaranje transgenih glodara može izborno uključivati disrupciju genskih lokusa jednog ili više endogenih glodarskih gena (ili genskih segmenata) i introdukciju jednog ili više heterologih gena (ili genskih segmenata ili nukleotidnih sekvenci) u glodarski genom, U nekim primerima izvođenja, na istoj lokaciji kao endogeni glodarski gen (ili genski segmenti). U nekim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira humani Igλ laki lanac, u celini ili delimično, je introdukovano ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) gena konstantnog regiona Igλ lakog lanca randomizovano inseriranog transgena Igλ lakog lanca u genomu klicine linije glodara. U nekim primerima izvođenja, nukelotidna sekvenca koja kodira humani Igλ laki lanac, u celini ili delimično, je introdukovana ushodno od mišjeg (npr., miša ili pacova) gena konstantnog regiona Igλ lako lanca endogenog lokusa lakog lanca Igλ u genomu klicine linije glodara; u nekim određenim primerima izvođenja, endogeni lokus lakog lanca Igλ je izmenjen, modifikovan, ili konstruisan da sadrži genske segmente humanog Igλ (npr., Vλ, Jλ i/ili Cλ) operativno vezan sa glodarskim Cλ1 regionom.
[0174] Šematska lustracija (nije u razmeri) primera konstruisanog lokusa Igλ lakog lanca je obezbeđena na Slikama 1-4. Naročito, Slike 1 i 3 daju primere strategije za konstrukciju konstruisanih lokusa Igλ lakog lanca karakterisanih insercijom nukleotidnih sekvenci koje sadrže mnoštvo humanih Vλ, Jλ i Cλ segmenata. Kao što je ilustrovano na Slici 1, DNK fragment koji sadrži humanu Eλ sekvencu (ili region) je inseriran nishodno od glodarskog Cλ regiona preko homologe rekombinacije. Ovaj DNK fragment sadrži selekcionu kasetu za neomicin (npr., gen za rezistenciju na neomicin [NEOR] flankiran sa loxP mestima z aprepoznavanje rekombinacije) postavljenim 3’ od humane Eλ sekvence, koja sadrži tri humana Eλ elementa konstruisana nishodno (ili 3’) od glodarskog Cλ1 regiona. Na Slici 1 je takođe ilustrovan DNK fragment koji sadrži prvi deo humanih Vλ segmenata, set parova segmenata humanih Jλ-Cλ (npr., humanih Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cl3, Jλ6-Cλ6) i segment humanog Jλ7 je inseriran ushodno od glodarskog Cλ1 regiona preko homologe rekombinacije. Kao što je ilustrovano selekciona kaseta za higromicin (npr., gen za rezistenciju na higromicin [HYGR] flankirana sa Frt mestima za prepoznavanje rekombinacije) je postavljena na 5’ kraju targeting vektora i ushodno od sekvence humanog Igλ lakog lanca koja je sadržana u targeting vektoru. Selekciona kaseta za higromicin je uklonjena preko homologe rekombinacije sa narednim targeting vektorima opisanim u odeljku primera u nastavku. Targeting vektor je zatim elektroporisan u glodarske embrionalne matične (ES) ćelije da bi se stvorio glodar čiji genom klicine linije sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ. Kada je potvrđen pozitvni klon glodarske ES ćelije, drugi prikazani targeting vektori su elektroporisani na sukcesivni način i potvrđeni na svakom koraku da bi se završila konstrukcija konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (videti Sliku 2). Finalni targeting vektor može se dizajnirati sa (6680 targeting vektor) ili bez (6597 targeting vektor) homologe ruke koja usmerava deleciju endogenih segmenata Igλ lakog lanca preko homologe rekombinacije što rezultuje u dva potencijalna konstruisana alela Igλ lakog lanca (Slika 2). Dodatno, bilo koj apreostala selekciona kaseta može se deletirati po želji preko delecije posredovane rekombinazom. Alternativna strategija za inserciju dodatnih segmenata humanog Vλ gena u konstruisani lokus lakog lanca Igλ korišćenjem guide RNAs (gRNAs) je data na Slici 3.
[0175] Kada je sekvenca humanog Igλ lakog lanca inserirana ushodno od ne-humanog konstantnog regiona BAC klona Igλ lakog lanca, stvara se targeting vektor za integraciju u lokus lakog lanca Igλ. BAC klon targetiran sa sekvencom humanog Igλ lakog lanca za stvaranje targeting vektora može sadržati 5’ i/ili 3’ flankirajuću genomsku DNK mišjeg (npr., miša ili pacova) porekla. Alternativno, ili dodatno, BAC klon targetiran sa sekvencom humanog Igλ lakog lanca za stvaranje targeting vektora može sadržati 5’ i/ili 3’ flankirajuću genomsku DNK humanog porekla tako da se stvara region preklapanja sa sekvencom humanog Igλ lakog lanca. Na taj način, sukcesivni targeting višestrukih konstruisanih BAC klonova je omogućen (npr., videti Sliku 1). Finalni targeting vektori su inkorporisani u lokus lakog lanca Igλ u genomu glodarske embrionalne ćelije. U nekim primerima izvođenja, targeting vektori kao što je ovde opisano su inkorporisani u lokus lakog lanca Igλ u genomu klicine linije glodarske ćelije koja dodatno sadrži humane VH, DHi JHgenomske DNK (npr., koji sadrže mnoštvo humanih VH, DHi JHgenskih segmenata) operativno vezanih sa jednim ili više gena IgH konstantnog regiona i/ili humanim Vκ i Jκ genomske DNK (npr., koja sadrži mnoštvo humanih Vκ i Jκ genskih segmenata) operativno vezanom sa genom konstantnog regiona Igκ (npr., videti SAD patente br.8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323).
[0176] Targeting vektor je introdukovan u glodarske (npr., mišje) embrionalne matične ćelije elektroporacijom tako da je sekvenca koja se sadrži u targeting vektoru inserirana u genom glodarskih embrionalnih matičnih ćelija i rezultuje u kapacitetu glodarske ćelije ili glodara (npr. miša) koji eksprimira antitela koja imaju humane Igλ lake lance, u celini ili delimično. Kao što je ovde opisano, stvoren je transgeni glodar gde konstruisani lokus lakog lanca Igλ je stvoren u klicinoj liniji glodarskog genoma (npr., endogeni lokus lakog lanca Igλ koji sadrži sekvencu humanog Igλ lakog lanca operativno vezanu sa endogenim glodarskim Cλ regionom kao što je ovde opisano). Antitela su eksprimirana na površini glodarskih B ćelija i u serumu pomenutog glodara, pri čemu su antitela karkaterisana lakim lancima koja imaju humane Vλ domene i, u nekim primerima izvođenja, humane Vλ i Cλ domene. Kada endogeni lokus lakog lanca Igλ u klicinoj liniji glodarskog genoma nije targetiran sa targeting vektorom, konstruisani lokus lakog lanca Igλ je poželjno inseriran na mestu koje je različito od endogenog glodarskog lokusa lakog lanca Igλ (npr., randomizovano inserirani transgen).
[0177] Stvaranje konstruisanog lokus lakog lanca Igλ u glodaru kao što je prethodno opisano obezbeđuje konstruisani glodarski soj koji proizvodi antitela koja uključuju Igλ lake lance eksprimirane sa takvog konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ koji ima humani Vλ domen, i u nekim primerima izvođenja, humane Vλ i Cλ domene. DA bi se uravnotežilo prisustvo konstruisanog IgH lokusa koji uključuje mnoštvo humanih VH, DHi JHgenskih segmenata operativno povezanih sa genima IgH konstantnog regiona, stvoren je konstruisani glodarski
1
soj koji proizvodi antitela i komponente antitela za razvoj humanih terapeutika zasnovanih na antitelu. Stoga, jedan konstruisani glodarski soj je realizovan da ima kapacitet da obezbedi alternativni in vivo sistem za korišćenje humanih Vλ domena za razvoj novih lekova zasnovanih na antitelu za tretiranje humane bolesti.
[0178] U nekim primerima izvođenja, genom glodara kao što je ovde opisano dodatno sadrži (npr., preko strategija unakrsnog ukrštanja ili targetinga više gena) jedan ili više humanih varijabilnih regiona imunoglobulinskog teškog i/ili lakog lanca kao što je opisano u SAD patentima br. 8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323. Alternativno, konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano može biti konstruisan u embrionalnoj matičnoj ćeliji koja sadrži humanizovane IgH i/ili Igκ lokuse, ili glodara i sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ opisan ovde može biti ukršten sa drugim glodarom koji sadrži humanizovane IgH i/ili Igκ lokuse. Različite takve životinje koje sadrže humanizovane IgH i/ili Igκ lokuse su poznati, npr., VELOCIMMUNE® soj (videti, npr., SAD patenti br.. 8,502,018 i/ili 8,642,835), XENOMOUSE™ soj (videti, npr., Mendez, M.J. et al., 1997, Nat. Genteics 15(2): 146-56 i Jakobovits, A. et al., 1995, Ann. NY Acad. Sci. 764:525-35). Homozigotnost konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano može biti naknadno postignuta ukrštanjem. Alternativno, u slučaju randomizovano inseriranog konstruisanog transgena Igλ lakog lanca (opisanog prethodno), glodarski sojevi se mogu izabrati na osnovu, između ostalog, ekspresije humanih Vλ domena sa transgena.
[0179] Alternativno, i/ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, genom klicine linije glodara kao što je ovde opisano dodatno sadrži deletirani, inaktivirani, funkcionalno utišani ili na drugi način ne-funkcionalni endogeni lokus Igκ lakog lanca. Genetičke modifikacije da se deletira ili učini nefunkcionalnim gen ili genski lokus mogu se postići korišćenjem postupaka opisanih ovde i/ili postupaka poznatih u tehnici.
[0180] Transgeni osnivački glodar može se identifikovati na osnovu prisustva konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ u svojoj klicinoj liniji genoma i/ili ekspresije antitela koja imaju sekvencu humanog Igλ lakog lanca, u celini ili delimično, u tkivima ili ćelijama glodara. Transgeni osnivački glodar se matim može koristiti za ukrštanje dodatnih glodara koji nose konstruisani lokus lakog lanca Igλ čime se stvara kohorta glodara gde svaki od njih nosi jednu ili više kopija konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ. Dodatno, transgeni glodari koji nose konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano mogu po želji biti dodatno ukrštani sa drugim transgenim glodarima koji nose druge transgene (npr., gene humanog imunoglobulina).
[0181] U nekim primerima izvođenja, takođe se mogu proizvesti transgeni glodari da sadrže izabrane sisteme koji omogućavaju regulisanu, usmerenu, inducibilnu i/ili specifičnu za tip
2
ćelije ekspresiju transgena ili integrisane sekvence (sekvenci). Na primer, glodari kao što je ovde opisano mogu biti konstruisani da sadrže sekvencu koja kodira humani Igλ laki lanac, u celini ili delimično, antitela koja je/su uslovno eksprimirane (npr., pregledno dato u Rajewski, K. et al., 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3). Primeri sistema uključuju Cre/loxP sistem rekombinaze bakteriofaga PI (videti, npr., Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6) i FLP/Frt sistem rekombinaze S. cerevisiae (O’Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-5). Takve životinje mogu biti obezbeđene konstrukcijom "dvostrukih" transgenih životinja, npr., ukrštanjem dve transgene životinje, jedne koja sadrži transgen koji sadrži izabranu modifikaciju (npr., konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano) i druge koja sadrži transgen koji kodira rekombinazu (npr., Cre rekombinazu).
[0182] Glodari kao što je ovde opisano mogu se pripremiti kao što je prethodno opisano, ili korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, da sadrže dodatne humane, humanizovane ili drugačije konstruisane gene, često u zavisnosti od nameravane upotrebe glodara. Genetički materijal takvih humanih, humanizovanih ili na drugi način konstruisanih gena može se introdukovati preko dodatne izmene genoma ćelija (npr., embrionalnih matičnih ćelija) koje imaju genetičke modifikacije ili izmene kao što je prethodno opisano ili preko tehnika ukrštanja pozantih u tehnici sa drugim genetički modifikovanim ili konstruisanim sojevima po želji. U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su pripremljeni da dodatno sadrže transgene gene humanog IgH i/ili Igκ lakog lanca ili genske segmente (videti npr., Murphy, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158; SAD patent br. 8,502,018; SAD patent br. 8,642,835; SAD patent br. 8,697,940; SAD patent br: 8,791,323; i SAD patent prijava objava br.2013/0096287 A1).
[0183] U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano mogu se pripremiti introdukovanjem targeting vektora opisanog ovde u ćeliju iz modifikovanog soja. Kao primer, targeting vektor, kao što je prethodno opisano, može biti introdukovan u VELOCIMMUNE® miša. VELOCIMMUNE® miševi eksprimiraju antitela koja imaju potpuno humane varijabilne domene i mišje konstantne domene. U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su pripremljeni da dodatno sadrže humane imunoglobulinske gene (gene varijabilnog i/ili konstantnog regiona). U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i genetički materijal iz heterologne vrste (npr., ljudi), gde genetički materijal kodira, u celini ili delimično, jedan ili više varijabilnih domena humanog teškog i/ili Igκ lakog lanca.
[0184] Na primer, kao što je ovde opisano, glodari koji sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano mogu dodatno sadržati (npr., preko strategija unakrsnog ukrštanja ili targetinga više gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u Murphy, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; SAD patenti br.. 8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i 8,791,323. U nekim primerima izvođenja, glodar koji sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano je ukršten sa glodarom koji sadrži lokus varijabilnog regiona humanizovanog IgH i/ili Igκ lakog lanca (videti, npr., SAD patenti br..8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i/ili 8,791,323). U nekim primerima izvođenja, glodar koji sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano je ukršten sa glodarom koji sadrži lokus varijabilnog regiona humanizovanog IgH (videti, npr., SAD patenti br..8,502,018, 8,642,835, 8,697,940 i/ili 8,791,323;) i inaktivirani lokus endogenog Igκ lakog lanca (videti, npr., SAD patenti br..9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092).
[0185] Iako primeri izvođenja koji opisuju konstrukciju konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ u mišu (tj., mišu sa konstruisanim lokusom lakog lanca Igλ karakterisanim prisustvom više humanih Vλ, Jλ i Cλ genskih segmenata operativno vezanih sa mišjim Cλ regionom tako da su antitela koja sadrže humane Igλ lake lance eksprimirana, u celini ili delimično) su ekstenzivno ovde razmatrana, takođe su obezbeđeni drugi glodari koji sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ. Takvi glodari uključuju bilo koje od onih koji mogu biti gentički modifikovani da eksprimiraju antitela kao što je ovde opisano, uključujući, npr., sisare, npr., miša, pacova, zeca, svinju, goveda (npr., krava, bik, bizon), jelena, ovcu, kozu, kokošku, mačku, psa, feretku, primata (npr., marmozeta, rezus majmuna), itd. Na primer, za one glodare za koje nisu lako dostupne genetički ES ćelije koje mogu modifikovati, korišćeni su drugi postupci za stvaranje glodara koji sadržui genetičku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, npr., modifikaciju genoma ne-ES ćelije (npr., fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelija) i korišćenje transfera jedra somatske ćelije (SCNT) da bi se preneo genetički modifikovani genom do pogodne ćelije, npr., enukleisane oocite, i gestaciju modifikovane ćelije (npr., modifikovane oocite) u glodarima pod pogodnim uslovima za formiranje embriona.
[0186] Postupci za modifikaciju genoma klicine linije glodara uključuje, npr., korišćenje cinkov prsten nukleaze (ZFN), efektorne nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN), ili Cas proteina (tj., CRISPR/Cas sistema) da se uključi konstruisanje lokusa lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano. Uputstva za postupke za modifikovanje genoma klicine linije glodara mogu se naći u, npr., SAD patentne prijave br. 14/747,461 (podneta 23. juna 2015), 14/948,221 (podneta 20. novembra 2015) i 14/974,623 (podneta 18. Decembra 2015).
[0187] Genetski modifikovana životinja kako je ovde opisano je glodar. U nekim izvođenjima, glodar kako je ovde opisano je izabran između miša, pacova i hrčka. U nekim izvođenjima, glodar kako je ovde opisano je izabran između superfamilije Muroidea. U nekim
4
izvođenjima, genetički modifikovana životinja kako je ovde opisano je iz familije izabrane između Calomyscidae (npr., mišolikog hrčka), Cricetidae (npr., hrčak, pacovi i miševi Novoga sveta, voluharcice), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, kamenjarski miševi, pacovi sa belim repom, Malagasy bambusovi pacovi, i zokori). U nekim posebnim izvođenjima, genetski modifikovan glodar kako je ovde opisano je izabran između pravih miševa i pacova (familije Muridae), gerbila, bodljikavog miša, i grivastog pacova. U nekim posebnim izvođenjima, genetički modifikovan miš kako je ovde opisano je član familije Muridae. U nekim U nekim izvođenjima, nehumana životinja kakoje ovde opisano je miš.
.
[0188] U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano je miš C57BL soja izabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U nekim određenim primerima izvođenja, miš kao što je ovde opisano je 129 soj izabran iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim primerima izvođenja, gentički modifikovani miš kao što je ovde opisano je mešavina prethodno pomenutog 129 soja i prethodno pomenutog C57BL/6 soja. U nekim određenim primerima izvođenja, miš kao što je ovde opisano je miš prethodno pomenutih 129 sojeva, ili mešavina prethodno pomenutih BL/6 sojeva. U nekim određenim primerima izvođenja, 129 soj mešavine kao što je ovde opisano je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U nekim primerima izvođenja, miš kao što je ovde opisano je BALB soj, npr., BALB/c soj. U nekim primerima izvođenja, miš kao što je ovde opisano je mešavina BALB soja i drugog prethodno pomenutog soja.
[0189] U nekim primerima izvođenja, glodar kao što je ovde opisano je pacov. U nekim određenim primerima izvođenja, pacov kao što je ovde opisano je izabran od Wistar pacova, LEA soja, Sprague Dawley soja, Fischer soja, F344, F6, i Dark Agouti. U nekim određenim primerima izvođenja, soj pacova kao što je ovde opisano je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koja se sastoji od Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, i Dark Agouti.
[0190] Pluripotentna i/ili totipotentna ćelija pacova može biti od bilo kog soja pacova, uključujući, na primer, ACI soj pacova, Dark Agouti (DA) soj pacova, Wistar soj pacova, LEA soj pacova, Sprague Dawley (SD) soj pacova, ili Fischer soj pacova kao što je Fisher F344 ili Fisher F6. Pluripotentne i/ili totipotentne ćelije se takođe mogu dobiti iz soja izvedenog iz mešavine dva ili više sojeva navedenih prethodno. Na primer, pluripotentna i/ili totipotentna ćelija pacova može biti od DA soja ili ACI soja. ACI soj pacova se karakteriše time što ima crni aguti, sa belim trbuhom i šapama i RTlavl haplotip. Takvi sojevi su dostupni iz različitih izvora uključujući Harlan Laboratories. Primer ES ćelijske linije pacova iz ACI pacova je ACI.G1 ES ćelija pacova. Dark Agouti (DA) soj pacova se karakteriše time što ima aguti krzno i RTlavl haplotip. Takvi pacovi su dostupni iz različitih izvora uključujući Charles River i Harlan Laboratories. Primeri ES ćelijskih linija pacova iz DA pacova su DA.2B ES ćelijska linija pacova i DA.2C ES ćelijska linija pacova. U nekim primerima izvođenja, pluripotentne i/ili totipotentne ćelije pacova su od inbred soja pacova (videti, npr., SAD patent prijava objava br.2014-0235933 A1, objavljena 21. avgusta 2014).
Specifični primeri izvođenja – Konstruisani IgH lokusi
[0191] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni glodari sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i dodatno sadrže konstruisane IgH lokuse (ili alele) koje karakteriše prisustvo mnoštva humanih VH, DHi JHgenskih segmenata aranžiranih u konfiguraciji klicine linije i operativno povezani sa glodarskim IgH konstantnim regionima, enhanserima i regulatornim regionima. U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata operativno vezanih sa glodarskim IgH konstantnim regionom.
[0192] U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili više (npr., 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, itd.) humanih VHgenskih segmenata. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne humane VHgenske segmente koji se nalaze između humanih VH3-74 i humanih VH6-1 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog IgH lokusa koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži najmanje humane VHgenske segmente VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 i VH6-1.
[0193] U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži 5, 10, 15, 20, 25 ili više (npr., 26, 27, itd.) humanih DHgenskih segmenata. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadržui sve ili suštinski sve funkcionalne humane DHgenske segmente koji se nalaze između humanih DH1-1 i humanih DH7-27 genskih segmenataa uključujući i njih, humanog IgH lokusa koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži najmanje humane DHgenske segmente DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 i DH7-27.
[0194] U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više funkcionalnih humanih JHgenskih segmenata. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne humane JHgenske segmente koji se nalaze između humanih JH1 i humanih JH6 genskih segmenata, uključujući i njij, humanog IgH lokus koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus (ili alel) sadrži najmanje humane JHgenske segmente JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 i JH6.
[0195] U nekim primerima izvođenja, glodarski IgH konstantni region uključuje jedan ili više glodarskih gena IgH konstantnog regiona kao što je, na primer, imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin D (IgD), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin E (IgE) i imunoglobulin A (IgA). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski IgH konstantni region uključuje glodarski IgM, glodarski IgD, glodarski IgG3, glodarski IgG1, glodarski IgG2b, glodarski IgG2a, glodarski IgE i glodarski IgA gen konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa jednim ili više glodarskih IgH enhansera (tj., enhanser sekvenci ili enhanser regiona). U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa jednim ili više glodarskih IgH regulatornih regiona (ili regulatornih sekvenci). U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa jednim ili više glodarskih IgH enhansera (ili enhanser sekvenci) i jednim ili više glodarskih IgH regulatornih regiona (ili regulatornih sekvenci).
[0196] U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus kao što je ovde opisano ne sadrži endogeni Adam6 gen. U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus kao što je ovde opisano ne sadrži endogeni Adam6 gen (ili Adam6-kodirajuću sekvencu) na istom položaju u genomu klicine linije kao što se nalazi u genomu klicine linije divljeg tipa glodara. U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus kao što je ovde opisano ne sadrži humani Adam6 pseudogen. U nekim primerima izvođenja, konstruisani IgH lokus kao što je ovde opisano sadrži inserciju najmanje jedne nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više ne-humanih (npr., glodarskih) Adam6 polipeptida. Pomenuta insercija može biti van konstruisanog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca kao što je ovde opisano (npr., ushodno od 5’ većine VHgenskih segmenata), unutar konstruisanog IgH lokusa ili na drugom mestu u genomu klicine linije glodara (npr., randomizovano introdukovana ne-humana Adam6-kodirajuća sekvenca), ćelije ili tkiva.
[0197] U različitim primerima izvođenja, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano detektabilno ne eksprimira, u celini ili delimično, endogeni glodarski VHregion u molekulu antitela. U različitim primerima izvođenja, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne sadrži (ili mu nedostaje, ili sadrži deleciju) jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celini ili delimično, endogeni glodarski VHregion (npr., VH, DHi/ili JH) u molekulu antitela. U različitim primerima izvođenja, glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ima genom klicine linije koji uključuje deleciju endogenih glodarskih VH, DHi JHgenskih segmenata, u celini ili delimično. U različitim primerima izvođenja, korišćeni glodar je fertilan.
[0198] Uputstvo za stvaranje targeting vektora, ćelija glodara i životinja koje nose takve konstruisane IgH lokuse (ili alele) može se naći u, npr., SAD patentima br.. 8,642,835 i 8,697,940. Stručnjacima su poznate različite tehnologije, poznate u tehnici, za postizanje takvog genetskog inženjeringa i/ili manipulaciju glodarskih genoma ili za na drugi način pripremu, obezbeđivanje, ili proizvodnju takvih sekvenci za introdukciju u genom klicine linije glodara.
Specifični primeri izvođenja – Konstruisani lokusi Igκ lakog lanca
[0199] U nekim primerima izvođenja, glodari sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i dodatno sadrže konstruisane lokuse Igκ lakog lanca (ili alele) koje karakteriše prisustvo mnoštva humanih Vκ i Jκ genskih segmenata aranžiranih u konfiguraciji klicine linije i operativno vezanih sa mišjim konstantnim regionom glodarski-humanog Igκ lakog lanca, Igκ enhanserima i regulatornim regionima. U nekim primerima izvođenja, lokus konstruisanog Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata operativno vezanih sa glodarskim Igκ konstantnim regionom (Cκ).
[0200] U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži najmanje humane Vκ genske segmente koji se javljaju u distalnom varijabilnom klasteru (ili distalnoj ruci, ili distalnoj duplikaciji) lokusa humanog Igκ lakog lanca koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži najmanje humane Vκ genske segmente koji se javljaju u proksimalnom varijabilnom klasteru (ili proksimalnoj ruci, ili proksimalnoj duplikaciji) lokusa humanog Igκ lakog lanca koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži humane Vκ genske segmene koji se javljaju u distalnim i proksimalnim varijabilnim klasterima lokusa humanog Igκ lakog lanca koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne humane Vκ genske segmente koji se nalaze između humanih Vκ2-40 (ili Vκ3D-7) i human Vκ4-1 genskih segmenata, uključujući i njih, lokusa humanog Igκ lakog lanca koji se javlja u prirodi.
[0201] U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ili više (npr., 36, 37, 38, 39, 40 itd.) humanih VK genskih segmenata. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži humane VK genske segmente Vκ3D-7, Vκ1D-8, Vκ1D-43, VK3D-11, Vκ1D-12, Vκ1D- 13, Vκ3D-15, Vκ1D-16, Vκ1D-17, Vκ3D-20, Vκ6D-21, Vκ2D-26, Vκ2D-28, Vκ2D-29, Vκ2D-30, Vκ1D-33, Vκ1D-39, Vκ2D-40, Vκ2-40, Vκ1-39, Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-28, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ6-21, Vκ3-20, VK1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 i Vκ4-1. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži najmanje humane Vκ genske segmente Vκ3D-7, Vκ1D-8, Vκ1D-43, Vκ3D-11, VκID-12, VκID-13, Vκ3D-15, VκID-16, VκID-17, Vκ3D-20, Vκ6D-21, Vκ2D-26, Vκ2D-28, Vκ2D-29, Vκ2D-30, VκID-33, VκID-39 i Vκ2D- 40. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži najmanje humane Vκ genske segmente Vκ2-40, Vκ1-39, Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-28, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ6-21, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 i Vκ4-1.
[0202] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili više funkcionalnih humanih Jκ genskih segmenata. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne humane Jκ genske segmente koji se nalaze između humanih Jκ1 i humanih Jκ5 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa Igκ lakog lanca koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, lokus konstruisanog Igκ lakog lanca (ili alel) sadrži najmanje humane Jκ genske segmente Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 i Jκ5.
[0203] U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani za jedan ili više glodarskih enhansera Igκ lako lanca (tj., enhanser sekvenci ili enhanser regiona). U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani za jedan ili više glodarskih regulatornih regiona (ili regulatornih sekvenci) Igκ lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani za jedan ili više glodarskih enhansera (ili enhanser sekvenci ili enhanser regiona) Igκ lakog lanca i jedan ili više glodarskih regulatornih regiona (ili regulatornih sekvenci) Igκ lakog lanca.
[0204] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cκ region konstruisanog lokusa Igκ lakog lanca (ili alel) uključuje Cκ region glodara kao što je, na primer, mišji Cκ region ili Cκ region pacova. U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cκ region konstruisanog lokusa Igκ lakog lanca (ili alel) je ili sadrži mišji Cκ region iz genetičke osnove koja uključuje 129 soj, BALB/c soj, C57BL/6 soj, mešavinu 129xC57BL/6 soja ili njihove kombinacije.
[0205] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni glodari sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i dodatno sadrže inaktivirane lokuse (ili alele) Igκ lakog lanca.
[0206] U različitim primerima izvođenja, korišćeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano detektabilno ne eksprimira, u celini ili delimično, endogeni glodarski Vκ region u molekulu antitela. U različitim primerima izvođenja, korišćeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne sadrži (ili mu nedostaje, ili sadrži deleciju) jednog ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celini ili delimično, endogeni mišji Vκ region u molekulu antitela. U različitim primerima izvođenja, korišćeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ima genom klicine linije koji uključuje deleciju endogenih glodarskih Vκ i Jκ genskih segmenata, u celini ili delimično.
[0207] Uputstvo za stvaranje targeting vektora, glodarskih ćelija i životinja koje nose takve konstruisane lokuse (ili alele) Igκ lakog lanca može se naći u, npr., SAD patentima br.
8,642,835 i 8,697,940. Stručnjacima su poznate različite tehnologije, poznate u tehnici, za postizanje takvog genetičkog inženjeringa i/ili manipulacije glodarskih genoma ili za na drugi način pripremu, obezbeđivanje, ili proizvodnju takvih sekvenci za introdukciju u genom klicine linije glodara.
Specifični primeri izvođenja – Konstruisani lokusi Igλ lakog lanca
[0208] U nekim primerima izvođenja, korišćeni glodari sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ koji se karakteriše prisustvom mnoštva humanih Vλ, Jλ i Cλ genskih segmenata aranžiranih u konfiguraciji klicine linije i inserirane ushodno od, i operativno vezane sa, glodarskim Cλ genskim segmentom (ili genom Cλ regiona). Kao što je ovde opisano, takav konstruisani lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje jedan ili više humana regiona enhansera (ili enhanser sekvenci) Igλ lakog lanca. Konstruisani lokus lakog lanca Igλ sadrži jedan ili više segmenata glodarskih konstantnih (Cλ) regiona Igλ lakog lanca. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži segmente humanog Vλ gena koji se javlja u najmanje klasteru A humanog lokusa lakog lanca Igλ; u nekim primerima izvođenja, klaster A i klaster B humanog lokusa lakog lanca Igλ; u nekim određenim primerima izvođenja, klaster A, klaster B i klaster C humanog lokusa lakog lanca Igλ.
[0209] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus (ili alel) lakog lanca Igλ sadrži 5, 10, 15, 20, 25, 30 ili više (npr., 31, 32, 33, 34, 35, itd.) segmenata humanog Vλ gena. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog Vλ gena koji se nalaze između humanih Vλ4-69 i humanih Vλ3-1 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa lakog lanca Igλ koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog Vλ gena koji se nalaze između humanih Vλ5-52 i humanih Vλ3-1 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa lakog lanca Igλ koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog Vλ gena koji se nalaze između humanih Vλ3-27 i humanih Vλ3-1 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa lakog lanca Igλ koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži segmente humanog Vλ gena Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 i Vλ3-1. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži najmanje funkcionalne segmente humanog Vλ gena iz Vλ5-52 do Vλ1-40 i iz Vλ3-27 do Vλ3-1.
[0210] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više funkcionalnih segmenata humanog Jλ gena. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog Jλ gena koji se nalaze između humanih Jλ1 i humanih Jλ7 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa lakog lanca Igλ koji se javlja u prirodi. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži najmanje segmente humanog Jλ gena Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 i Jλ7.
[0211] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više funkcionalnih segmenata humanog Cλ gena. U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne segmente humanog Cλ gena koi se nalazi između humanih Cλ1 i humanih Cλ7 genskih segmenata, uključujući i njih, humanog lokusa lakog lanca Igλ koji se javlja u prirodi.
1
U nekim određenim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) sadrži najmanje segmente humanog Cλ gena Cλ1, Cλ2, Cλ3 i Cλ6.
[0212] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus Igλ lakog lanca (ili alel) nema iste regione enhansera glodarskog Igλ lakog lanca (ili sekvence enhansera) koje se pojavljuju u lokusu divljeg tipa Igλ lakog lanca (ili alel). U nekim izvođenjima, konstruisani lokus Igλ lakog lanca (ili alel) nema bar jedan glodarski region enhansera Igλ lakog lanca (ili sekvencu enhansera), u celini ili delimično (npr., Igλ enhanser 2-4 ili Eλ2-4).
[0213] U nekim primerima izvođenja, pomenuti segmenti humanih Vλ i Jλ gena su operativno vezani za jedan ili više enhansera glodarskog Igλ lakog lanca (tj., sekvenci enhansera ili regiona enhansera) i jedan ili više enhansera humanog Igλ lakog lanca (tj., sekvenci enhansera ili regiona enhansera). U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanih Vλ i Jλ gena su operativno povezani sa jednim ili više regulatornih regiona glodarskog Igλ lakog lanca (ili regulatornim sekvencama). U nekim izvođenjima, pomenuti segmenti humanih Vλ i Jλ gena su operativno vezani za jedan ili više enhansera glodarskog Igλ lakog lanca (ili sekvenci enhansera ili regiona enhansera), jedan ili više enhansera humanog Igλ lakog lanca tj., sekvenci enhansera ili regiona enhansera) i jednim ili više regulatornih regiona glodarskog Igλ lakog lanaca (ili regulatornim sekvencama).
[0214] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano ne sadrži humani VpreB gen (ili humane VpreB gen-kodirajuće sekvenca).
[0215] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (ili alel) uključuje glodarski Cλ region kao što je, na primer, mišji Cλ region ili Cλ region pacova. U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (ili alel) je ili sadrži mišji Cλ region iz genetičke osnove koja uključuje 129 soj, BALB/c soj, C57BL/6 soj, mešoviti 129xC57BL/6 soj ili njihvoe kombinacije.
[0216] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO: 1 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:3 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:5 (mišji Cλ3). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa SEQ ID NO: 1 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:3 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:5 (mišji Cλ3). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano je ili sadrži sekvencu mišjeg Cλ1 regiona.
[0217] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ region kodiran sekvencom na
2
konstruisanom lokusu (ili alelu) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO:2 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:4 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:6 (mišji Cλ3). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarskimišji Cλ region kodiran sekvencom na konstruisanom lokusu (ili alelu) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa SEQ ID NO:2 (mišji Cλ1), SEQ ID NO:4 (mišji Cλ2) ili SEQ ID NO:6 (mišji Cλ3). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region kodiran sekvencom na konstruisanom lokusu (ili alelu) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano je ili sadrži mišji polipeptid Cλ1 regiona.
[0218] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa (ili alela) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO:7 (Cλ1 pacova), SEQ ID NO:9 (Cλ2 pacova), SEQ ID NO: 11 (Cλ3 pacova) ili SEQ ID NO: 13 (Cλ4 pacova). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa (ili alela) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa SEQ ID NO:7 (Cλ1 pacova), SEQ ID NO:9 (Cλ2 pacova), SEQ ID NO: 11 (Cλ3 pacova) ili SEQ ID NO:13 (Cλ4 pacova). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region konstruisanog lokusa (ili alela) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano je ili sadrži sekvencu Cλ1 regiona pacova.
[0219] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ region kodiran sekvencom na konstruisanom lokusu (ili alelu) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sa SEQ ID NO:8 (Cλ1 pacova), SEQ ID NO: 10 (Cλ2 pacova), SEQ ID NO: 12 (Cλ3 pacova) ili SEQ ID NO: 14 (Cλ4 pacova). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region kodiran sekvencom na konstruisanom lokusu (ili alelu) lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sadrži sekvencu koja je suštinski identična ili identična sa SEQ ID NO:8 (Cλ1 pacova), SEQ ID NO: 10 (Cλ2 pacova), SEQ ID NO:12 (Cλ3 pacova) ili SEQ ID NO:14 (Cλ4 pacova). U nekim određenim primerima izvođenja, glodarski Cλ region kodrian sekvencom na konstruisanom lokusu lakog lanca Igλ (ili alelu) kao što je ovde opisano je ili sadrži polipeptid Cλ1 regiona pacova.
[0220] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano karakteriše se prisutvom jednog ili više jedinstvenih spojeva nukleotidne sekvence (ili kombinacija jedinstvenih spojeva sekvenci) koji su rezultat insercije humanog genetičkog materijala koji odgovara sekvenci humanog Igλ lakog lanca (genomskoj ili sintetičkoj) umesto ili unutar sekvence glodarski Igλ lakog lanca na endogenom lokusu. Primeri spojeva nukelotidne sekvence su dati u SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128 i SEQ ID NO:129.
[0221] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži jedan ili više od SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128 i SEQ ID NO:129.
[0222] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122 i SEQ ID NO:123.
[0223] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122 i SEQ ID NO:123.
[0224] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:128 i SEQ ID NO:129.
[0225] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:126 i SEQ ID NO:127.
[0226] U nekim primerima izvođenja, konstruisani lokus lakog lanca Igλ (ili alel) kao što je ovde opisano sadrži SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124 i SEQ ID NO:125.
[0227] Uputstvo za humane Vλ, Jλ i Cλ genske segmente može se naći u, npr., Lefranc, M.P., 2000, Nomenclature of the human imunoglobulin lambda (IGL) gens, Current Protocols in Immunology, No. Supplement, 40:A.1p.1- A.1p.37. Između ostalog, predmetni opis demonstrira da prisustvo humanih Vλ i Jλ genskih segmenata na lokusima (ili alelima) Igλ lakog lanca povećava divezitet repertoara lakog lanca korišćenog glodara u poređenju sa diverzitetom lakih lanaca u eksprimiranom repertoaru antitela glodara koji ne sadrži takav konstruisani alel Igλ lakog lanca.
4
Postupci
[0228] U određenim aspektima, glodari kao što je ovde opisano mogu se koristiti za stvaranje humanog antitelo i/ili sekvence nukleinske kiseline koja kodira humana antitela, pri čemu humano antitelo sadrži varijabilne domene izvedene iz sekvenci nukleinske kiseline kodirane od strane genetičkog materijala ćelije glodara kao što je ovde opisano. Na primer, glodar kao što je ovde opisano je imunizovan sa antigenom od interesa pod uslovima i u vremenu dovoljnom da razvije imuni odgovor na pomenuti antigen od interesa. Antitela su izolovana iz tako imunizovanog glodara (ili jedne ili više ćelija, na primer, jedne ili više B ćelija) karakterisana korišćenjem različitih analiza koje mere, na primer, afinitet, specifičnost, mapiranje epitopa, sposobnost za blokiranje interakcije ligand-receptor, inhibicije aktivacije receptora, itd. U različitim primerima izvođenja, antitela proizvedena od strane glodara kao što je ovde opisano sadrže jedan ili više humanih varijabilnih domena koji su izvedeni iz nukleotidnih sekvenci jednog ili više humanih varijabilnih regiona izolovanih iz glodara. U nekim primerima izvođenja, anti-lek antitela (npr., anti-idiotip antitelo) može se izazvati u glodarima kao što je ovde opisano.
[0229] U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr., ćelija) za proizvodnju humanih antitela koja su korisna za različite analize. U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za razvoj terapeutika koji targetiraju polipeptid od interesa (npr., transmembranski ili izlučeni polipeptid) i/ili moduliraju jednu ili više aktivnosti povezanih sa pomenutim polipeptidom od interesa i/ili moduliraju interakcije pomenutog polipeptida od interesa sa drugim vezujućim partnerima (npr., ligand ili receptor polipeptid). Na primer, u različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za razvoj terapeutika koji targetiraju jedan ili više receptor polipeptida, moduliraju aktivnost receptor polipeptida i/ili moduliraju interakcije receptor polipeptida sa drugim vezujućim partnerima. U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za identifikaciju, skrining i/ili razvoj kandidat terapeutika (npr., antitela, siRNA, itd.) koji vezuju jedan ili više polipeptida od interesa. U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za skrining i razvoj kandidata terapeutika (npr., antitela, siRNA, itd.) koji blokiraju aktivnost jednog ili više polipeptida od interesa ili koji blokiraju aktivnost jednog ili više receptor polipeptida od interesa. U različitim primerima izvođenja, miševi kao što je ovde opisano su korišćeni za određivanje vezujućeg profila antagonista i/ili agonista jednog ili više polipeptida od interesa. U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za određivanje epitopa ili epitopa jednog ili više kandidat terapeutskih antitela koji vezuju jedan ili više polipeptida od interesa.
[0230] U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za određivanje farmakokinetičkih profila jednog ili više humanih antitelo kandidata. U različitim primerima izvođenja, jedan ili više glodara kao što je ovde opisano i jedan ili više kontrolnih ili referentnih glodara su svaki izloženi jednom ili više humanih antitelo kandidata na različitim dozama (npr., 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ili 50 mg/kg ili više). Kandidati za terapeutska antitela mogu biti dozirani preko bilo kog poželjnog načina primene uključujući parenteralne i ne-parenteralne puteve primene. Parenteralni putevi uključuju, npr., intravenski, intraarterijalni, intraportalni, intramuskularni, potkožni, intraperitonealni, intraspinalni, intratekalni, intracerebroventrikularni, intrakranijalni, intrapleuralni ili druge puteve injekcije. Neparenteralni putevi uključuju, npr., oralni, nazalni, transdermalni, pulmonalni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Primena može biti takođe kontinuiranom infuzijom, lokalnom primenom, produženim oslobađanjem iz implanata (gelovi, membrane ili slično), i/ili intravenskom injekcijom. Krv je izolovana iz glodara (humanizovani i kontrola) na različitim vremenskim tačkama (npr., 0 č, 6 č, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, ili do 30 ili više dana). Različite analize se mogu izvesti da se odrede farmakokinetički profili primenjenog kandidata za terapeutska antitela korišćenjem uzoraka dobijenih od glodara kao što je ovde opisano uključujući, ali se ne ograničavajući na, ukupni IgG, odgovor anti-terapeutskog antitela, aglutinaciju, itd.
[0231] U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili moduliranja aktivnosti polipeptida od interesa i efekta na ekspresiju gena kao rezultat ćelijskih promena ili, u kontekstu receptor polipeptida, gustine receptor polipeptida na površini ćelija u glodarima. U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano ili ćelije izolovane iz njih su izložene kandodatima terapeuticima koji se vezuju za polipeptid od interesa i, nakon naknadnog vremenskog perioda, analizirani u odnosu na efekte na specifične ćelijske procese koji su povezani sa pomenutim polipeptidom od interesa, na primer, ligand-receptor interakcije ili prenos signala.
[0232] U određenim aspektima, glodari kao što je ovde opisano eksprimiraju varijabilne domene humanog antitela, tako da se ćelije, ćelijske linije, i kulture ćelija mogu stvoriti da služe kao izvor varijabilnih domena humanog antitela za upotrebu u analizama vezivanja i funkcionalnim analizama, npr., da se analizira vezivanje ili funkcija antagonista ili agonista, naročito tamo gde antagonist ili agonist je specifičan za humani antigen od interesa ili specifičan za epitop koji funkcioniše u ligand-receptor interakciji (vezivanju). U različitim primerima izvođenja, epitopi koje vezuju kandidati terapeutskih antitela ili siRNAs mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih iz glodara kao što je ovde opisano.
[0233] Ćelije od opisanih glodara mogu se izolovati i koristiti na ad hoc bazi, ili se mogu održavati u kulturi mnogo generacija. U različitim primerima izvođenja, ćelije od korišćenih glodara su imortalizovane (npr., preko upotrebe virusa) i održavane u kulturi neograničeno vreme (npr., u serijskim kulturama).
[0234] U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za generisanje varijanti varijabilnih domena humanog antitela koji se vezuju za polipeptid od interesa (npr., varijante humanog Vλ domena). Takve varijante uključuju varijabilne domene humanog antitela koji imaju željenu funkcionalnost, specifičnost, nisku unakrsnu reaktivnost sa zajedničkim epitopom koji dele dve ili više varijanti polipeptida od interesa. U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano su korišćeni za stvaranje panela varijabilnih domena humanog antitela koji sadrže serije varijanti varijabilnih domena koji su podvrgnuti skriningu u odnosu na željenu ili poboljšanu funkcionalnost.
[0235] U određenim aspektima, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za generisanje biblioteka varijabilnog regiona humanog antitela (npr., biblioteka humanog Vλ domena). Takve biblioteke obezbeđuju izvor za sekvence varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca koje se mogu graftovati na različite Fc regione zasnovane na željenoj efektornoj funkciji, korišćene kao izvor za afinitetno sazrevanje sekvence varijabilnog regiona korišćenjem tehnika poznatih u tehnici (npr., mutageneza usemerena na mesto, PCR sklona greškama, itd.) i/ili korišćene kao izvor komponenti antitela za generisanje antitelozasnovanih terapeutskog molekula kao što su, na primer, himerni antigen receptori (tj., molekul konstruisan korišćenjem komponenti antitela, npr., scFv), multi-specifična vezujuća sredstva (npr., bi-specifična vezujuća sredstva) i fuzioni proteini (npr., antitela sa jednim domenom, scFvs, itd.).
[0236] U nekim aspektima, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za anlizu i testiranje leka ili vakcine. U različitim primerima izvođenja, kandidat lek ili vakcina može biti dopremljen jednom ili više glodara kao što je ovde opisano, nakon čega sledi monitoring glodara da se odredi jedan ili više od imunih odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosni profil leka ili vakcine, ili efekat na bolest ili stanje i/ili jedan ili više simptoma bolesti ili stanja. Primeri postupaka korišćenih za određivanje bezbednosnog profila uključuje merenje toksičnosti, ptimalne koncentracije doze, odgovora antitela (tj., anti-lek), efikasnosti leka ili vakcine i mogućih faktora rizika. Takvi lekovi ili vakcine mogu biti poboljšani i/ili razvijeni u takvim glodarima.
[0237] Efikasnost vakcine se može odrediti na više načina. Ukratko, glodari kao što je ovde opisano su vakcinisani korišćenjem postupaka poznatih u tehnici i zatim izloženi vakcini ili je vakcina primenjena već inficiranim glodarima. Odgovor glodara na vakcinu može biti meren monitoringom, i/ili izvođenjem jednog ili više analiza na glodarima (ili ćelijama izolovanim iz njih) da bi se odredila efiaksnost vakcine. Odgovor glodara na vakcinu je zatim poređen sa kontrolnim životinjama, korišćenjem jedne ili više mera poznatih u tehnici i/ili opisanih ovde.
[0238] Efikasnost vakcine može se dodatno odrediti analizom neutralizacije virusa. Ukratko, glodari kao što je ovde opisano su imunizovani i serum je sakupljen na različite dane nakon imunizacije. Serijska razblaženja seruma su pre-inkubirana sa virusom tokom kog vremena antitela u serumu koja su specifična za virus će se vezati za njega. Smeša virus/serum je zatim dodata permisivnim ćelijama da se odredi infektivnost plak analizom ili analizom mikroneutralizacije. Ukoliko antitela u serumu neutralizuju virus, postoji manje plaka ili niže relativne jedinice luciferaze u poređenju sa kontrolnom grupom.
[0239] U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano proizvode varijabilne domene humanog antitela i, stoga, obezbeđuju in vivo sistem za proizvodnju humanih antitela za upotrebu u dijagnostičkim primenama (npr., imunologiji, serologiji, mikrobiologiji, ćelijskoj patologiji, itd.). U različitim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano mogu se koristiti za proizvodnju varijabilnih domena humanog antitela koji vezuju relevantna antigena mesta za identifikaciju ćelijskih promena kao što su, na primer, ekspresija specifičnih markera ćelijske površine indikativnih za patološke promene. Takva antitela mogu biti konjugovana sa različtim hemijskim entitetima (npr., radioaktivni trejser) i biti upotrebljena u in vivo i/ili in vitro analizama po želji.
[0240] U nekim primerima izvođenja, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju poboljšani in vivo sistem za razvoj i selekciju humanih antitela za upotrebu u onkologiji i/ili infektivnim bolestima. U različitim primerima izvođenja, glodarima kao što je ovde opisano i kontrolnim glodarima (npr., koji imaju genetičku modifikaciju koja je različita od kao što je ovde opisano ili nemaju genetičku modifikaciju, tj., divlji tip) može se implantirati tumor (ili tumorske ćelije) ili mogu biti inficirani sa virusom (npr., influenca, HIV, HCV, HPV, itd.). Nakon implantacije ili infekcije, na glodare se može primeniti kandidat terapeutik. Tumoru ili virusu se može dati dovoljno vremena da se ustanovi u jednoj ili više lokacija unutar glodara pre primene kandidat terapeutika. Alternativno, i/ili dodatno, imuni odgovor se može pratiti u takvim glodarima da bi se okarakterisala i izabrala potencijalna humana antitela koja mogu biti razvijena kao terapeutik.
Kompleti
[0241] Takođe je opisano pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više spremnika napunjenih sa najmanje jednim glodarom, ćelijom glodara, DNK fragmentom, targeting vektorom, ili bilo kojom njihovom kombinacijom, kao što je ovde opisano. Kompleti se mogu koristiti u bilo kom primenjivom postupku (npr., istraživački postupak). Izborno povezano sa takvim spremnikom (spremnicima) može biti napomena u obliku propisanom od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutika ili bioloških proizvoda, pri čemu napomena odražava (a) odobrenje od strane agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za upotrebu na ljudima, (b) uputstva za upotrebu, i/ili (c) ugovor koji određuje prenos materijala i/ili bioloških proizvoda (npr., glodara ili ćelije glodara kao što je ovde opisano) između dva ili više entiteta i njihovih kombinacija.
[0242] Druge osobine određenih primera izvođenja biće očigledne iz sledećih opisa primera izvođenja, koji su dati radi ilustracije i nije namera da ga ograničavaju.
Dodatni primeri izvođenja
[0243] Opisan je glodar čiji genom klicine linije sadrži endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca koji sadrži:
(a) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena,
(b) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena,
(c) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena, i
(d) mišji Cλ genski segment,
gde (a) i (b) su sposobni da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane humane gene λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa konstantnim regionom genskih segmen(a)ta (c) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde (a) i (b) su takođe sposobni za rearanžiranje da stvaraju rearanžirane gene humanog λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa glodarskim Cλ genskim segmentom (d) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca dalje sadrži: jedan ili više enhansera (Eλ) mišjeg imunoglobulinskog λ lakog lanca, i jedan ili više enhansera (Eλ) humanog imunoglobulinskog λ lakog lanca.
[0244] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži dva glodarska Eλs.
[0245] U nekim primerima izvođenja, dva glodarska Eλs su mišji Eλ i mišji Eλ3-1. U nekim primerima izvođenja, genom klicine linije dodatno sadrži (i) endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina; ili (ii) endogenim lokusom imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina, i endogeni lokus imunoglobulin κ lakog lanca sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani sa glodarskim imunoglobulinskim Cκ regionom.
[0246] U nekim primerima izvođenja, insercija jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata zamenjuje glodarske VH, DHgenske segmente.
[0247] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih VH, DH, i JHgenskih segmenata, i njihove kombinacije.
[0248] U nekim primerima izvođenja, insercija jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata zamenjuje glodarski Vκ i Jκ genskih segmenata.
[0249] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vκ i Jκ genskih segmenata, i njihovih kombinacija.
[0250] U nekim primerima izvođenja, glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina je endogeni glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
[0251] U nekim primerima izvođenja, gde glodarski Cκ region je endogeni glodarski Cκ region.
[0252] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži deleciju endogenih Vλ i Yλ genskih segmenata, u celini ili delimično.
[0253] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži deleciju Vλ2-Vλ3- Jλ2-Cλ2 genskih segmenata i Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1 genskih segmenata.
[0254] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži deleciju Vλ2-Vλ3- Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P genskih segmenata i Vλ1-Jλ3-Jλ3P-Cλ3-Jλ1 genskih segmenata.
[0255] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je mišji Cλ1 genski segment.
[0256] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži deleciju glodarskog Eλ2-4.
[0257] U nekim primerima izvođenja, glodar ne eksprimira detektabilno endogene imunoglobulinske λ lake lance.
[0258] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži inserciju humanih VHgenskih segmenata od VH3-74 do VH6-1, humanih DHgenskih segmenata od DH1-1 do DH7-27, i humanih JHgenskih segmenata JH1-JH6.
[0259] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih VH3-74 do VH6-1, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih DH1-1 do DH7-27, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih JH1-JH6.
[0260] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulin κ lakog lanca sadrži inserciju proksimalne Vκ duplikacije, u celini ili delimično, lokusa humanog imunoglobulin κ lakog lanca.
[0261] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulin κ lakog lanca sadrži inserciju humanih Vκ genskih segmenata od Vκ2-40 do Vκ4-1 i humanih Jκ genskih segmenata od Jκ1-Jκ5.
[0262] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vκ2-40 do Vκ4-1, i humane nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Jκ1-Jκ5.
[0263] U nekim primerima izvođenja, endogen lokus imunoglobulin λ lakog lanca sadrži inserciju segmenata humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, najmanje parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6, humananog Jλ genskog segmenta Jλ7 i glodarski Cλ1 genski segment.
[0264] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenta humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ genskog segmenta Jλ7.
[0265] U nekim primerima izvođenja, lokusu imunoglobulinskog teškog lanca nedostaje endogeni glodarski Adam6 gen.
[0266] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulinskog teškog lanca dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida.
[0267] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su inserirane između prvog i drugog humanog VHgenskog segmenta.
[0268] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su inserirane
1
umesto humanog Adam6 pseudogena.
[0269] U nekim primerima izvođenja, prvi humani VHgenski segment je humani VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je humani VH6-1.
[0270] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su inserirane između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta.
[0271] U nekim primerima izvođenja, glodar je heterozigotan ili homozigotan za endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca.
[0272] U nekim primerima izvođenja, glodar je heterozigotan ili homozigotan za endogeni lokus imunoglobulin κ lakog lanca.
[0273] U nekim primerima izvođenja, glodar je heterozigotan ili homozigotan za endogeni lokus imunoglobulin λ lakog lanca.
[0274] U nekim primerima izvođenja, glodar je pacov ili miš.
[0275] Takođe je opisana izolovana glodarska ćelija od ovde opisanog glodara.
[0276] Takođe je opisana imortalizovana ćelija napravljena od glodarske ćelije ovde opisane.
[0277] U nekim primerima izvođenja, glodarska ćelija je glodarska embrionalna matična ćelija.
[0278] Takođe je opisan glodarski embrion stvoren iz glodarske embrionalne matične ćelije ovde opisane.
[0279] Takođe je opisan postupak za stvaranje glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina, pri čemu postupak sadrži (a) introdukciju DNK fragmenta u glodarsku embrionalnu matičnu ćeliju, pomenuti DNK fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja uključuje (i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena, (ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena, i (iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena, gde (i)-(iii) su operativno vezani za glodarski Cλ genski segment, i gde sekvenca nukleotida dalje sadrži jedan ili više enhansera (Eλ) humanog λ lakog lanca imunoglobulina; (b) dobijanje glodarske embrionalne matične ćelije generisane u (a); i (c) stvaranje glodara korišćenjem glodarske embrionalne matične ćelije od (b).
[0280] [Obrisan].
[0281] Takođe je opisan postupak za stvaranje glodara čiji genom klicine linije sadrži konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina, gde konstruisani endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži insercije jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i jednog ili više segmenata humanog Cλ gena, pri čemu su segmenti humanog Vλ i Jλ gena operativno vezani za segmente glodarskog ili humanog Cλ gena, i gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dalje sadrži jedan ili više enhansera (Eλ) λ lakog lanca glodarskih imunoglobulina, i jednog ili više enhansera (Eλ)
2
λ lakog lanca humanog immunoglobulina, postupak obuhvata modifikovanje genoma klicine linije glodara tako da obuhvata konstruisani lokus λ lakog lanca imunoglobulina koji uključuje insercije jednog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više segmenata humanog Jλ gena i jednog ili više segmenata humanog Cλ gena, gde segmenti humanih Vλ i Jλ gena su operativno vezani za segment glodarskog ili humanog Cλ gena, i koji endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dalje obuhvata jedan ili više enhansera (Eλ) λ lakog lanca glodarskog imunoglobulina, i jedan ili više humanih enhansera λ lakog lanca (Eλ) humanog imunoglobulina, tako praveći pomenutog glodara.
[0282] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje Vλ5-52 do Vλ1-40 i/ili Yλ3-27 do Vλ3-1.
[0283] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vλ5-52 do Vλ1-40 i/ili Vλ3-27 do Vλ3-1.
[0284] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i jedan ili više segmenata humanog Cλ gena uključuju parove segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i humani Jλ7 genski segment.
[0285] U nekim primerima izvođenja, parovi segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanih Jλ i Cλ gena, i humani Jλ7 genski segment uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7.
[0286] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je mišji Cλ1 genski segment.
[0287] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži tri humana Eλs.
[0288] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži dva glodarska Eλs.
[0289] U nekim primerima izvođenja, dva glodarska Eλs su mišji Eλ i mišji Eλ3-1.
[0290] U nekim primerima izvođenja, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više selekcionih markera.
[0291] U nekim primerima izvođenja, DNK fragment dodatno sadrži jedan ili više mesta rekombinacije specifičnih za mesto.
[0292] U nekim primerima izvođenja, DNK fragment iz (a) je introdukovan u glodarsku embrionalnu matičnu ćeliju čiji genom klicine linije sadrži endogeni lokus imunoglobulin teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina; ili endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani za glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina, i endogeni lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genskih segmenata su operativno vezani sa glodarskim imunoglobulinskim Cκ regionom.
[0293] U nekim primerima izvođenja, DNK fragment iz (a) je introdukovan u glodarsku embrionalnu matičnu ćeliju čiji genom klicine linije sadrži divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca; ili divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca i divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog κ lakog lanca; i gde postupak dodatno sadrži korak ukršatnja miša proizvedenog od pomenute mišje embrionalne matične ćelije sa drugim mišem.
[0294] U nekim primerima izvođenja, modifikacija genoma klicine linije glodara tako da sadrži konstruisani lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca je izvedena u glodarskoj embrionalnoj matičnoj ćeliji čiji genom klicine linije dodatno sadrži endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenati su operativno povezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina; ili endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina, i endogen lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno vezani sa glodarskim imunoglobulinskim Cκ regionom.
[0295] U nekim primerima izvođenja, insercija jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih JHgenskih segmenata.
4
[0296] U nekim primerima izvođenjainsercija jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih Vκ gen segmenata i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata.
[0297] U nekim primerima izvođenja, modifikovanje genoma klicine linije miša tako da sadrži konstruisani lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca je izvedena u mišjoj embrionalnoj matičnoj ćeliji čiji genom klicine linije sadrži divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca; ili divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca i divlji tip endogenog lokusa imunoglobulinskog κ lakog lanca; i gde postupak dodatno sadrži korak ukrštanja miša proizveden iz pomenute mišje embrionalne matične ćelije sa drugim mišem.
[0298] U nekim primerima izvođenja, drugi miš ima genom klicine linije koji sadrži divlji tip IgH i Igκ lokusa.
[0299] U nekim primerima izvođenja, drugi miš ima genom klicine linije koji sadrži homozigotne ili heterozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, pri čemu homozigotni ili heterozigotni humanizovani IgH lokus sadrži inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu.
[0300] U nekim primerima izvođenja, drugi miš ima genom klicine linije koji sadrži homozigotni ili heterozigotni humanizovani IgH lokus i homozigotni ili heterozigotni inaktivirani Igκ lokus.
[0301] U nekim primerima izvođenja, ovde je obezbeđen postupak za proizvodnju antitela u glodaru, pri čemu postupak sadrži korake (1) imunizacije korišćenog glodara sa antigenom od interesa; (2) održavanje glodara pod uslovima dovoljnim da glodar proizvede imuni odgovor na antigen od interesa; i (3) rekuperacije antitela iz glodara, ili glodarske ćelije, koja vezuju antigen od interesa.
[0302] U nekim primerima izvođenja, glodar ima genom klicine linije koji dodatno sadrži: endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina; ili endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata, pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno vezani sa glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina, i endogeni lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca koji sadrži inserciju jednog ili više humanih Vκ genskih segmenata i jednog ili više humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno povezani sa glodarskim imunoglobulinskim Cκ regionom.
[0303] U nekim primerima izvođenja, glodarska ćelija je B ćelija.
[0304] U nekim primerima izvođenja, glodarska ćelija je hibridom.
[0305] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži inserciju segmenata humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, parova segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i humani Jλ genski segment Jλ7.
[0306] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vλ Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanih Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ genskog segmenta Jλ7.
[0307] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je mišji Cλ1 genski segment.
[0308] U nekim primerima izvođenja, imunoglobulinski lokus teškog lanca sadrži inserciju humanih VHgenskih segmenata od VH3-74 do VH6-1, humanih DHgenskih segmenata od DH1-1 do DH7-27 i humanih JHgenskih segmenata JH1-JH6, i pri čemu humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno povezani sa endogenim glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina.
[0309] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih VH3-74 do VH6-1, humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih DH1-1 do DH7-27, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih JH1-JH6.
[0310] U nekim primerima izvođenja, humani VH, DHi JHgenski segmenti zamenjuju glodarske VH, DHi JHgenske segmente.
[0311] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca sadrži inserciju humanih Vκ genskih segmenata od Vκ2-40 do Vκ4-1 i humanih Jκ genskih segmenata od Jκ1-Jκ5, i pri čemu humani Vκ i Jκ genski segmenati su operativno vezani sa endogenim glodarskim imunoglobulinskim Cκ regionom.
[0312] U nekim primerima izvođenja, insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Vκ2-40 do Vκ4-1, i humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih Jκ1-Jκ5.
[0313] U nekim primerima izvođenja, humani Vκ i Jκ genski segmenti zamenjuju glodarske Vκ i Jκ genske segmente.
[0314] U nekim primerima izvođenja, genom klicine linije glodara dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukelotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida.
[0315] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulinskog teškog lanca nema endogeni glodarski Adam6 gen.
[0316] U nekim primerima izvođenja, lokus imunoglobulinskog teškog lanca dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida.
[0317] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida su inserirane između prvog i drugog humanog VHgenskog segmenta.
[0318] U nekim primerima izvođenja, prvi humani VHgenski segment je humani VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je humani VH6-1.
[0319] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukelotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida su inserirane na mestu humanog Adam6 pseudogena.
[0320] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida je inserirano između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta.
[0321] U nekim primerima izvođenja, antitelo rekuperovano iz glodara, ili ćelije glodara, koje vezuje antigen od interesa sadrži varijabilni domen humanog teškog lanca i varijabilni domen humanog lambda lakog lanca.
[0322] U nekim primerima izvođenja, varijabilni domen humanog teškog lanca uključuje rearanžirani humani VHgenski segment izabran iz grupe koja se sastoji od VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 i VH6-1.
[0323] U nekim primerima izvođenja, varijabilni domen humanog lambda lakog lanca uključuje rearanžirani humani Vλ genski segment izabran iz grupe koja se sastoji od λ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Yλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 i Vλ3-1.
[0324] U nekim primerima izvođenja, glodar is miš ili pacov.
[0325] Takođe je opisan glodar čiji genom klicine linije sadrži homozigotni endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca koji sadrži: (i) segmente humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1, (ii) parove segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3Cλ3 i Jλ6-Cλ6, (iii) humani Jλ genski segment Jλ7, i (iv) tri enhansera humanog imunoglobulinskog λ lakog lanca; gde (i)-(iv) su operativno međusobno vezani i (i)-(iii) su ushodno od glodarskog Cλ genskog segmenta, i gde endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca nema endogeni glodarski imunoglobulinski Eλ2-4, segmenti humanog Vλ gena Vλ5-52 do Vλ1-40 i Vλ3-27 do Vλ3-1 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između segmenata humanog Vλ gena, parovi segmenata humanih Jλ- Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanih Jλ-Cλ gena, i humani Jλ genski segment Jλ7 uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7.
[0326] U nekim primerima izvođenja, glodarski Cλ genski segment je mišji Cλ1 genski segment.
[0327] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca dodatno sadrži endogene enhansere Eλ i Eλ3-1 glodarskog imunoglobulinskog λ lakog lanca.
[0328] U nekim primerima izvođenja, endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca sadrži deleciju endogenih glodarskih Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4P-Cλ4P genskih segmenata i Vλ1-Jλ3-J3Pλ-Cλ3-Jλ1 genskih segmenata.
[0329] U nekim primerima izvođenja, glodar je pacov ili miš.
PRIMERI
[0330] Sledeći primeri su obezbeđeni da se stručnjaku opiše kako da napravi i koristi postupke i kompozicije opisane ovde, i nije namera da ograničavaju obim onoga što pronalazači predmetnog pronalaska smatraju njihovim pronalaskom. Ukoliko nije drugačije naznačeno, temperatura je data u stepenima Celzijusa i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Konstrukcija targeting vektora za konstruisanje glodarskog lokusa lakog lanca Igλ
[0331] Ovaj primer ilustruje primere postupaka konstruisanja targeting vektora za inserciju u genom glodara (npr. miša). Postupci opisani u ovom primeru demonstriraju proizvodnju miša čiji genom klicine linije sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ. Naročito, ovaj primer demonstrira konstrukciju serije targeting vektora za konstruisanje endogenog lokusa lakog lanca Igλ u glodaru tako da glodar eksprimira i/ili proizvodi antitela koja uključuju Igλ lake lance koja imaju humane varijabilne domene i glodarske ili, u nekim primerima izvođenja, humane konstantne domene od pomenutog endogenog lokusa lakog lanca Igλ u genomu klicine linije glodara. Kao što je opisano u nastavku, serija targeting vektora koji sadrže različite količine genetičkog materijala koji odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ (tj., humane Vλ, Jλ, Cλ i Igλ enhanser sekvence) je inserirana u endogeni glodarski lokus lakog lanca Igλ. Naročito, pomenuti genetički materijal je inseriran ushodno od glodarskog Cλ gena (ili genskog segmenta) tako da su humani Vλ, Jλ i Cλ genski segmenti su operativno vezani sa pomenutim glodarskim Cλ genom. Postupci opisani u ovom primeru obezbeđuju retenciju i/ili deleciju endogenih glodarskih Igλ genskih segmenata (ili sekvenci). Primer šematske ilustracije serija targeting vektora za inženjering konstruisanog endogenog lokusa lakog lanca Igλ je dat na Slikama 1-4.
[0332] Serija targeting vektoara koji sadrže različite količine humanih Vλ, Jλ, Cλ i Igλ enhanser sekvenci (ili regiona) za inserciju u glodarski lokus lakog lanca Igλ su stvorene korišćenjem VELOCIGEN® tehnologije (videti, npr., SAD patent br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9) i tehnika molekularne biologije poznatih u tehnici. Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti da se upotrebe bilo koje humane Vλ, Jλ, Cλ i Igλ enhanser sekvence, ili kombinacija sekvenci (ili fragmenata sekvence) po želji. Tabela 1 dajekratak opis svakog targeting vektora ilustrovanog na Slici 1.
[0333] Ukratko, oko 12kb (1 1,822bp) humane Igλ genomske sekvence iz humanog bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) klona CTD-2502m16 vezana je u mišji BAC klon RP23-60e14. Ovaj mišji BAC klon je konstruisan da skrati BAC klon za oko 90kb, inserira jedinstvena AsiSI i PI-SceI mesta prepoznavanja restrikcionog enzima nishodno od mišjeg Cλ1 gena i zameni originalni gen za rezistenciju na hloramfenikol (CMR) sa genom za rezistenciju na spektinomicin (SpecR) i jedinstveno I-CeuI restrikciono mesto preko dve uzastopna koraka bakterijske homologe rekombinacije (BHR) pre vezivanja sa humanom Igλ genomskom sekvencom. Humani BAC klon CTD-2502m16 je takođe modifikovan sa dva uzastopna BHR koraka da bi se skratilo oko 53kb humane sekvence sa 3’ kraja sa neomicin selekcionom kasetom i jedinstvenim PI-SceI restrikcionim mestom, i skrati CMR gen i oko 101.5kb od humane sekvence sa 5’ kraja sa higromicin kasetom i jedinstvenim AsiSI restrikcionim mestom, čime se AsiSI mesto i neomicin selekciona kaseta postavljaju oko 2885bp ushodno i oko 1418bp nishodno, respektivno, modularnog humanog enhanser regiona (videti, npr., Asenbauer, H. i H.G. Klobeck, 1996, Eur. J. Immunol. 26(1): 142-50). Humana Igλ genomska sekvenca sadržala je oko 7.5kb koje odgovaraju humanom Igλ enhanser (Eλ) regionu (ili sekvenci), koja je modularna i sadrži tri elementa sekvence (Slika 1; Asenbauer, H. i H.G. Klobeck, 1996, Eur. J. Immunol. 26(1): 142-50), i 2.9kb i 1.4kb od 5’ i 3’ flankirajuću sekvencu, respektivno, kao i neomicin selekcionu kasetu (tj., gen za rezistenciju na neomicin [NEOR] pod transkripcionom kontrolom ubukvitin promotora i flankiran sa loxP mestima). Modifikovani humani i mišji BAC klonovi su digestovani na AsiSI i PI-SceI mestima i zajedno vezani. Nakon ligacije sa konstruisanim mišjim BAC klonom, rezultujući targeting vektor sadržao je oko 39,166 bp mišje sekvence kao 5’ homologa ruka i uključivao je mišje Igλ genske segmente Vλ1, Jλ3, Jλ3P, Cλ3, Jλ1, i Cλ1 (6286 targeting vektor, Slika 1). 3’ homologa ruka (oko 30,395bp) uključivala je mišji Igλ enhanser (mEλ). Radi jednostavnosti, u prikazu 6286 targeting vektora na Slici 1, mišje homologe ruke nisu prikazane. Homologa rekombinacija sa ovim targeting vektorom rezultovala je u inserciji tri humane Igλ enhanser sekvence kao i 5’ i 3’ flankirajućih sekvenci bez bilo kakve delecije mišje sekvence. Rekombinaza-posredovana delecija neomicin selekcione kasete je postignuta u ES ćelijama sa prolaznom ekspresijom Cre rekombinaze (videti npr., Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6; Orban, P.C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
89:6861-5; Gu, H. et al., 1993, Ćelija 73(6):1155-64; Araki, K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:160-4; Dymecki, S.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.93(12):6191-6).
[0334] Drugi konstrukt (6571 targeting vektor) je konstruisan da uključuje grupu od pet funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena i suštinski sve od humanog Jλ-Cλ klastera (tj., humani Yλ1-Cλ1-Jλ2-Cλ2-Jλ3-Cλ3-Jλ4-Cλ4-Jλ5-Cλ5- Jλ6-Vλ6-hJλ7) koj zauzimaju oko 125,473bp, što je dobijeno od humanog BAC klona CTD-2079i4. Da bi se konstruisano targeting vektor, humani Cλ7 gen u humanom BAC klonu CTD-2079i4 je prvo zamenjen sa BHR sa mišjim Cλ1 genom i oko 1588bp flankirajuće sekvence, koja je amplifikovana sa PCR korišćenjem mišjeg BAC klona RP23-60e14 kao templejta.5’ homologa ruka sadrži oko 37,161bp mišje sekvence koja odgovara sekvenci 5’ od mišjeg Cλ1 gena u mišjem BAC klonu RP23-60e14 je zatim vezana za modifikovani humani BAC klon CTD-2079i4 koji sadrži sintetički mišji Cλ1 gen korišćenjem jedinstvenih mesta prepoznavanja restrikcionih enzima I-CeuI i PI-SceI zasebno introdukovana i u mišje i humane BAC klone sa BHR. Ova 5’ homologa ruka sadržala je mišje Vλ1, Jλ3, Jλ3P, Cλ3, i Jλ1 genske segmente (Slika 1).3’ homologa ruka sadrži oko 9,189bp humane sekvence koja odgovara dva od humanih Eλs od 6286 targeting vektora (Slika 1).
[0335] Treći konstrukt (6596 targeting vektor) je konstruisan da sadrži dodatnih jedanaest funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena. Ovaj targeting vektor sadržao je oko 171,458bp humane sekvence iz BAC klona RP11-761L13. Po dizajnu, tri segmenta humanog Vλ gena su uključivani da obezbede 3’ preklapajuću homologiju (od oko 33,469bp) sa 6571 targeting vektorom. Kao što je prethodno opisano, 5’ homologa ruka koja sadrži oko 37,161bp mišje sekvence je vezana sa 5’ krajem DNK fragmenta koji sadrži segmente humanog Vλ gena korišćenjem jedinstvenih mesta prepoznavanja restrikcionih menzima I-CeuI i AscI zasebno uveđenjne i u mišje i u humane BAC klonove sa BHR
1
[0336] Četvrti konstrukt (6597 targeting vektor) je konstruisan da sadrži dodatnih devet funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena. Ovaj targeting vektor sadržao je oko 121,188bp humane sekvence iz dva BAC klona, RP11-22L18 i RP11-761L13. Kao što je prethodno opisano, 3’ kraj ove humane sekvence sadržao je dodatne segmente humanog Vλ gena koji su obezbedili 3’ preklapajuće homologije sa 6596 targeting vektorom (oko 27,468bp). Kao što je prethodno opisano za 6571 i 6596 targeting vektore, oko 37,161bp 5’ homologa ruka koja sadrži mišju sekvencu iz BAC klona RP23-60e14 vezana je sa 5’ krajem humane sekvence korišćenjem jedinstvenih mesta prepoznavanja restrikcionih enzima I-CeuI i AscI zasebno uvedenih i u mišje i u humane BAC klonove sa BHR.
[0337] Na sličan način, peti konstrukt (6680 targeting vektor) je konstruisan da sadrži devet istih dodatnih funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena kao 6597 targeting vektor, izuzev što je 5’ homologa ruka izmenjena da omogući deleciju mišjeg lokusa lokus lakog lanca Igλ preko homologe rekombinacije. Ova 5’ homologa ruka je sadržala oko 22,298bp iz mišjeg BAC klona RP23-15m16 i vezana je sa 5’ krajem humane sekvence (∼121,188bp fragment, supra) korišćenjem jedinstvenih mesta prepoznavanja restrikcionih menzima I-CeuI i AscI zasebno introdukovane i u mišje i u humane BAC klonove sa BHR. Ova 5’ homologa ruka sadrži mišju sekvencu 5’ od mišjeg Vλ2 genskog segmenta, koji, nakon homologe rekombinacije, efikasno deletira mišji lokus lakog lanca Igλ. Ovaj targeting vektor je sadržao istu 3’ preklapajuću homologiju kao 6597 targeting vektor (opisan prethodno). Slika 2 ilustruje različite alele koji su rezultat insercije 6597 ili 6680 targeting vektora.
[0338] Na sličan način, dodatni konstruisani mišji soj je stvoren preko ko-elektroporacije dva različita targeting vektora u ES ćelije uz pomoć upotrebe guide RNAs (gRNAs) korišćenjem CRISPR/Cas9 sistema (Slika 3), videti, npr., SAD patent br. 9,228,208 (odobren 5. januara 2016) i SAD patentna prijava objava br. U.S. 2015-0159174 A1 (podneta 15. oktobra 2014), SAD 2015-0376650 A1 (podneta 5. juna 2015), SAD 2015-0376628 A1 (podneta 23. juna 2015), SAD 2016-0060657 A1 (podenta 30. oktobar 2015), SAD 2016-0145646 A1 (podneta 20. novembra 2015), i SAD 2016-0177339 A1 (podneta 18. decembra 2015). ES ćelije imale su genom heterozigotan za inserciju konstrukta 6571 targeting vektora.
[0339] Ukratko, kao što je prikazano na Slici 3, skraćeni 6596 targeting vektor (tj., bez 5’ homologe ruke i kasete kao što je prethodno opisano) dizajniranje da sadrži oko 33kb 3’ homologu ruku koja uključuje preklapajuću sekvencu koja odgovara tri segmenta humanog Vλ gena u 6571 targeting vektoru, oko 111kb sekvencu koji sadrži 11 dodatnih segmenata humanog Vλ gena, i oko 27kb sekvencu koja sadrži jedan humani Vλ genski segment i služi kao preklapajući region sa drugim targeting vektorom. Drugi targeting vektor (6680 targeting vektor) sadrži isti oko 27kb preklapajući region sekvence postavljene na 3’ kraj targeting
1 1
vektora, oko 94kb sekvencu koja sadrži dodatnih devet segmenata humanog Vλ gena, neomicin selekcionu kasetu (npr., gen z arezistenciju na neomicin [NEOR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora flankiranu sa mestima prepoznavanja Frt rekombinacije) i oko 22kb 5’ mišju λ homologu ruku. ES ćelije upotrebljene u elektroporaciji ova dva targeting vektora imale su genom heterozigotan za inserciju 6571 targeting vektora (Slika 3). Ove ES ćelije su ko-elektroporisane sa dva targeting vektora opisana prethodno zajedno sa vodećom RNK (gRNK) koja targetira gen za rezistenciju na higromicin iz 6571 targeting vektora na nukleotidnoj sekvenci CGACCTGATG CAGCTCTCGG (SEQ ID NO: 130) i dve gRNK koja targetira region ushodno od mišjeg Vλ2 genskog segmenta (tj., 3’ od mišjeg Vλ2 genskog segmenta na minus lancu; gRNK1: GTACATCTTG TCTTCAACGT, SEQ ID NO: 139, oko 1000bp ushodno od mišjeg Vλ2; gRNK2: GTCCATAATT AATGTAGTTA C, SEQ ID NO:140, oko 380bp ushodno od mišjeg Vλ2) i promoviše dvolančane prekide na ovim sekvencama. Dva ko-elektroporisana targeting vektora su inserirana homologom rekombinacijom u genom ES ćelija na higromicin sekvenci, zamenjujući region koji sadrži i okružuje higromicin selekcionu kasetu. Rezultujuće ES ćelije kako sadrže konstruisani endogen Igλ lokusa koji je uključivao varijabilni region humanog imunoglobulina koji sadrži 25 funkcionalnog segmenata humanog Vλ gena operativno vezan za humani Jλ-Cλ klaster, humani Jλ7 genski segment i operativno vezan za mišji Cλ1 gen (Slika 3).
[0340] Targeting vektori opisani prethodno introdukovani su u mišje embrionalne matične (ES) ćelije da se izgradi konstruisani lokus lakog lanca Igλ. Klonovi pozitivne ES ćelije su potvrđeni nakon insercije svakog targeting vektora u genom ES ćelija (videti u nastavku) pre insercije u sledeći targeting vektor. U nekim slučajevima, intermedijerni sojevi su stvoreni za fenotipsku analizu.
Tabela 1. Rezime targeting vektora
Približna hIgλ
Naziv Opis
sekvenca
6286 11,822bp Insercija humanih Eλs u mišji Igλ lokus
6571 125,473bp Insercija pet funkcionalnih humanih Vλ genskih segmenata i dela humanog Jλ-Cλ genskog klastera
6596 171,458bp Insercija dodatnih jedanaest funkcionalnih humanih Vλ genskih segmenata
6597 121,188bp Insercija dodatnih devet funkcionalnih humanih Vλ genskih segmenata
1 2
Približna hIgλ
Naziv Opis
sekvenca
6680 121,188bp Insercija dodatnih devet funkcionalnih humanih Vλ genskih segmenata i delecija mišjih Igλ genskih segmenata 6889 121,188bp Insercija dodatnih devet funkcionalnih humanih Vλ genskih segmenata i delecija mišjih Igλ genskih segmenata preko istovremene insercije dva targeting vektora i vodeće RNK
[0341] Nukleotidne sekvence duž izabranih spojnih tačaka nakon insercije targeting vektora opisanih prethodno potvrđene su sekvenciranjem. Izabrane spojne tačke naznačene na Slikama 1-4 obezbeđene su ispod.
1
[0342] U konstruisanju inježeringom dobijenih lokusa, naročito, konstruisanih imunoglobulinskih lokusa, pronalazači su prepoznali da neki segmenti humanog Vλ gena mogu nedostajati iz određenih haplotipova i, stoga, nisu zastupljeni u izabranim BAC klonovima koji obuhvataju humani lokus lakog lanca Igλ. Kao primer, jedna objava je
1 4
obezbedila dokaz da skorije otkriveni alel sadrži inserciju/deleciju jednog ili više segmenata humanog Vλ gena u klasteru B humanog lokusa lakog lanca Igλ u poređenju sa prethodno objavljenim alelom (npr., human Vλ1-50, Vλ5-48, Vλ5-45 i Vλ5-39; videti Moraes, J.C. i G.A. Passos, 2003, Immunogentics 55(1):10-5). Stoga, pronalazači su dizajnirali strategiju da uključuje segmente humanog Vλ gena koji nedostaju u određenom BAC klonu korišćenom za dizajn i konstruisanje targeting vektora.
[0343] Ukratko, humani BAC klonovi su mapirani na humanom lokusu lakog lanca Igλ sa sekvenciranjem kraja. Naročito korišćenjem GRCh37/hg19 Assembly (UCSC Genome Browser, Human Feb. 2009) humani BAC klonovi RP11-34614, CTD-2523F21 i CTD-2523E22 su identifikovani da obuhvataju region klastera B humanog lokusa lakog lanca Igλ koji uključuje humane Vλ7-46 do Vλ1-36. Na primer, jedan ili više nedostajućih segmenata humanog Vλ gena (npr., Vλ5-39, Vλ5-37 i/ili Vλ1-36) može biti inserirano u targeting vektor opisan prethodno (6680 ili 6889) korišćenjem bilo kog od ovih BAC klonova identifikovanih da sadrže jedan ili više segmenata humanog Vλ gena koji su poželjni za inserciju. Na primer, BAC klon CTD-2523F21 je modifikovan zamenom 3’ sa selekcionom kasetom (npr., gen za rezistenciju na higromicin [HYGR] pod transkripcionom kontrolom ubikvitin promotora) flankiran sa mestima prepoznavanja rekombinaze (npr., lox2372) i ∼27kb 3’ homologa ruka koja ima preklapajuću sekvencu sa 6597 targeting vektorom (videti prethodno). 5’ kraj humanog BAC klona služi kao 5’ homologa ruka koja ima preklapajuću sekvencu sa 6680 ili 6889 targeting vektor čime se olakšava homologu rekombinaciju i inserciju bilo kojih nedostajućih segmenata humanog Vλ gena zajedno sa selekcionom kasetom. Izborni poslednji korak prolazne ekspresije rekombinaze (npr., Cre) može biti upotrebljen da se ukloni selekciona kaseta.
Primer 2. Stvaranje glodara koji ima konstruisani lokus lakog lanca Igλ
[0344] Ovaj primer demonstrira proizvodnju glodara čiji genom klicine linije sadrži endogeni lokus lakog lanca Igλ koji sadrži inserciju mnoštva humanih Vλ, Jλ i Cλ sekvenci, pri čemu humane Vλ, Jλ i Cλ sekvence su operativno vezane za glodarski Cλ gen (ili genski segment), i pri čemu endogeni lokus lakog lanca Igλ dodatno uključuje jedan ili više humanih Igλ enhansera (Eλs). U nekim primerima izvođenja, pomenuti endogeni lokus lakog lanca Igλ uključuje deleciju jednog ili više endogenih enhanser regiona (ili sekvenci) Igλ lakog lanca. Takvi glodari su karakterisani, u nekim primerima izvođenja, ekspresijom Igλ, lakih lanaca koji su potpuno humani (tj., humani varijabilni i konstantni domeni).
[0345] Targetirana insercija targeting vektora opisana u Primeru 1 je potvrđen lančanom
1
reakcijom polimeraze. Targetirana BAC DNK, potvrđena sa lančanom reakcijom polimeraze, je zatim introdukovana u F1 hibrid (129S6SvEvTac/C57BL6NTac) mišjih embrionalnih matičnih (ES) ćelija preko elektroporacije praćene kultivisanjem u selekcionom medijumu. U nekim primerima izvođenja, ES ćelija korišćena za elektroporaciju serije targeting vektora mogu imati genom klicine linije koji uključuje divlji tip IgH i Igκ lokusa, homozigotne humanizovane IgH i Igκ lokuse, pri čemu homozigotni humanizovani IgH lokus je sadržao inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu (videti, npr., SAD patenti br.. 8,642,835 i 8,697,940), ili homozigotni humanizovani IgH lokus (videti, npr., SAD patenti br..8,642,835 i 8,697,940, supra) i homozigotni inaktivirani Igκ lokus. U drugim primerima izvođenja, nakon što su targetirane ES ćelije kao što je ovde opisano korišćene za stvaranje miševa (videti u nastavku), rezultujući miševi sadrže konstruisani humani Igλ lokus kao što je ovde opisano su korišćeni da se ukrštaju sa miševima koji sadrže humanizovane IgH i Igκ lokuse, pri čemu humanizovani IgH lokus sadrži inseriranu glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu (videti, npr., SAD patenti br.. 8,642,835 i 8,697,940, supra), ili humanizovani IgH lokus (videti, npr., SAD patenti br..8,642,835 i 8,697,940, supra) i inaktivirani Igκ lokus. Kolonije otporne na lek su uzete 10 dana nakon elektroporacije i skrininga sa TAQMAN™ i kariotipizacijom za korektan targeting kao što je prethodno opisano (Valenzuela et al., supra; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307). Tabela 2 daje setove prajmera/proba korišćenih za skrining klonova pozitivnih ES ćelija (F: forward prajmer; R: reverzni prajmer; P: proba).
[0346] VELOCIMOUSE® postupak (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol.
476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99) je korišćen, u kome su targetirane ES ćelije su injektirane u nekompaktovani stadijum od 8-ćelija Swiss Webster embriona, da bi se proizveli zdravi potpuno ES ćelije-izvedeni miševi F0 generacije heterozigotni za konstruisani alel Igλ lakog lanca. Heterozigotni miševi F0 generacije su ukršteni sa C57B16/NTac miševima da stvore F1 heterozigote koji su međusobno ukršteni da proizvedu životinje F2 generacije za fenotipske analize.
[0347] Uzet zajedno, ovaj primer ilustruje generisanje glodara (npr., miša) čiji genom klicine linije sadrži konstruisani lokus lakog lanca Igλ karakterisan prisustvom mnoštva humanih Vλ, Jλ i Cλ sekvenci operativno vezanih sa glodarskim Cλ genom, pri čemu glodarski konstruisani lokus lakog lanca Igλ uključuje endogene glodarske i humane sekvence (ili regione) enhansera Igλ lakog lanca. Strategija opisana ovde za inserciju humanih Vλ, Jλ i Cλ sekvenci u endogeni glodarski lokus lakog lanca Igλ omogućuje konstrukciju glodara koji eksprimira antitela koja sadrže humane Vλ domene fuzionisane ili sa humanim ili sa glodarskim Cλ
1
domenom. Kao što je ovde opisano, takvi humani Vλ domeni su eksprimirani iz endogenih lokusa Igλ lakog lanca u glodarskom genomu klicine linije.
Tabela 2. Reprezentativni setovi prajmera/proba za skrining klonova pozitivne ES ćelije Naziv Sekvenca (5’/3’)
1
1
Primer 3. Fenotipska procena glodara koji imaju konstruisani lokus lakog lanca Igλ
[0348] Ovaj primer demonstrira karakterizaciju populacija različitih imunih ćelija kod glodara (npr., miševa) konstruisanih da sadrže endogeni lokus lakog lanca Igλ kao što je prethodno opisano. Naročito, ovaj primer specifično demonstrira da glodari koji imaju konstruisani endogeni lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano prikazuju sličan razvoj B ćelija u poređenju sa mladuncima divljeg tipa iz istog lega. Naročito, nekoliko konstruisanih glodara koji nose različite količine genetičkog materijala koji odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ svaki detektabilno eksprimira Igλ lake lance koji imaju humane varijabilne i humane ili glodarske konstantne domene na površini glodarskih B ćelija.
[0349] Ukratko, slezine i femuri su sakupljeni od izabranih konstruisanih mišjih sojeva homozigotnih ili heterozigotnih za alel Igλ lakog lanca prikazan na Slici 4 i mladunce divljeg tipa iz istog legla. Kostna srž je sakupljena iz femura ispiranjem sa 1x fosfatno puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS, Gibco) sa 2.0% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Crvene krvne ćelije iz preparata slezine i kostne srži su lizirane sa ACK puferom za lizu (Gibco) nakon čega je sledilo ispiranje sa 1xPBS sa 2.0% FBS. Izolovane ćelije (1x10<6>) su inkubirane sa koktelima izabranih antitela 30 min na 4°C (videti Tabelu 3).
Tabela 3. Antitela za bojenje ćelija analizirana sa protočnom citometrijom Antitelo Oznaka Dobavljač Klon
Kostna srž
anti-mišji CD43 FITC BioLegend 1B11
anti-mišji c-Kit PE BioLegend 2B8
anti-mišji IgM PeCy7 eBiosciences II/41
anti-mišji IgD PerCP-Cy5.5 BioLegend 11-26c.2a anti-mišji CD3 PB BioLegend 17-A2
anti-mišji/-humani B220 APC eBiosciences RA3-6B2
anti-mišji CD19 APC-H7 BD 1D3
Kostna srž
anti-mišji Igκ FITC BD 187.1
anti-mišji Igλ PE BioLegend RML-42
anti-mišji IgM PeCy7 eBiosciences II/41
anti-mišji/-humani B220 PerCP-Cy5.5 BD RA3-6B2
1
anti-mišji CD3 PB BioLegend 17-A2
anti-humani Igλ APC Biolegend MHL-38
anti-mišji CD19 APC-H7 BD 1D3
Slezina
anti-mišji Igκ FITC BD 187.1
anti-mišji Igλ PE BioLegend RML-42
anti-mišji IgM PeCy7 eBiosciences II/41
anti-mišji IgD PerCP-Cy5.5 BioLegend 11-26c.2a
anti-mišji CD3 PB BioLegend 17-A2
anti-humani Igλ APC BioLegend MHL-38
anti-mišji CD19 APC-H7 BD 1D3
[0350] Nakon bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka je izvedeno na BD FORTESSA™ protočnom citometru i analizirano sa FLOWJO™ softverom. Reprezentativni rezultati su dati na Slikama 5-13 i 18-21. Slični podaci su dobijeni za sojeve prikazane na Slici 4, ali su prikazani samo izabrani označeni sojevi.
[0351] Rezultati su pokazali da je svaki soj koji nosi različite količine genetičkog materijala koji odgovara humanom lokusu lakog lanca Igλ demonstrirao slične profile populacije imunih ćelija u kompartmanima slezine i kostne srži. Naročito, što je očigledno iz podataka prikazanih na Slikama 5-7, konstruisani miševi su demonstrirali slične brojeve CD19+ B ćelija slezine, slične populacije zrelih i prelaznih B ćelija u slezini, sličnu upotrebu kapa u slezini, i slične populacije marginalne zone i folikularnih B ćelija kao njihove konstrole mladunaca divljeg tipa iz istog legla. Dodatno, miševi koji sadrže konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano u prisustvu dodatnih humanizovanih IgH i humanizovanih Igκ lokusa nisu demonstrirali velike razlike u razvoju B ćelija u poređenju sa miševima koji su sadržali samo humanizovane IgH i humanizovane Igκ lokuse (npr., videti Sliku 18A i 18B). Takođe, kao što je pokazano na miševima prikazanim na Slikama 8-12, konstruisani miševi su imali sličan broj CD19+, pro-, pre-, nezrelih i zrelih B ćelija i sličnu upotrebu kapa u kostnoj srži kao njihove kontrole mladunaca divljeg tipa iz istog legla. Rezime ekspresije lakog lanca u izabranim konstruisanim sojevima (homozigoti - HO; heterozigoti - HET) u poređenju sa njihovim kontrolama mladuncima divljeg tipa iz istog leglaobezbeđen je na Slici 13. Miševi homozigotni za konstruisani humanizovani Igλ lokus kao što je ovde opisano, i takođe homozigotni za IgH i Igκ lokuse i homozigotni za glodarsku Adam6-kodirajuću sekvencu demonstrirali su povećano korišćenje lambda lokusa (oko 40%) u poređenju sa
11
tipičnom perifernom upotrebom (npr., 5% u slezini) lambda poznatom za miševe divljeg tipa (videti kolone za 668OHO/VI HO/Adam6 HO i 6689HO/VI HO/Adam6 HO miševe, Slika 13). Takođe, mali deo mišjih Igλ-Pozitivnih B ćelija je detektovan (∼3-5%) u ovim miševima, što potvrđuje da mišji Cλ gen unutar konstruisanog lokusa λ lakog lanca je takođe eksprimiran u kontekstu funkcionalnih λ lakih lanaca u ovim miševima.
Primer 4. Ekspresija antitela u glodarima koji imaju konstruisani lokus lakog lanca Igλ
[0352] Ovaj primer pokazuje ekspresiju antitela kod glodara, pri čemu antitela sadrže lake lance karakterisane prisustvom humanih Vλ regiona i humanih ili mišjih Cλ regiona, i pri čemu su laki lanci eksprimirani iz konstruisanog endogenog mišjeg lokusa lakog lanca Igλ. Naročito, ovaj primer specifično demonstrira ekspresiju antitela u serumu glodara čiji genom klicine linije sadrži endogeni lokus lakog lanca Igλ koji sadrži inserciju jedanog ili više segmenata humanog Vλ gena, jednog ili više humanih Yλ genskih segmenata i jednog ili više segmenata humanog Cλ gena, pri čemu humani Vλ, Jλ i Cλ genski segmenti su operativno povezani sa glodarskim Cλ genom, i pri čemu endogeni lokus imunoglobulinskog λ lakog lanca dodatno sadrži jedan ili više glodarskih enhansera (Eλ) Igλ lakog lanca i jedan ili više humanih enhansera (Eλ) Igλ lakog lanca.
[0353] Ukratko, krv je izvađena iz izabranih konstruisanih mišjih sojeva i mladunaca divljeg tipa iz istog legla (videti Primer 3). Serum je razdvojen od krvi korišćenjem Eppendorf epruveta centrifugiranih na 9000 rcf pet minuta na 4°C. Sakupljeni serum je korišćen za imunobloting da se identifikuje ekspresija Ig lakog lanca antitela. Mišji serumi su razblaženi 1.5:10 u PBS (bez Ca<2+>i Mg<2+>) i pušteni na 4-20% Novex Tris-Glycine gelove pod redukujućim i neredukujućim uslovima. Gelovi su preneti na poliviniliden difluorid (PVDF) membrane prema specifikaciji proizvođača. Blotovi su blokirani preko noći sa 5% nemasnim mlekom u Tris-puferovanom fiziološkom rastvoru sa 0.05% Tween-20 (TBST, Sigma). PVDF membrane su izložene različitim primarnim antitelima (mišje anti-hIgλ konjugovano sa HRP (Southern Biotech); kozje anti-mIgλ konjugovano sa HRP, Southern Biotech) razblažene 1:1,000 u 0.1% nemasnom mleku u TBST jedan čas na sobnoj temperaturi. Blotovi su isprani četiri puta po deset minuta po ispiranju i razvijeni tokom jednog minuta sa Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences) prema specifikacijama proizvođača. Blotovi su zatim vizuelizovani korišćenjem GE Healthcare ImageQuant LAS-4000 Cooled CCD Camera Gel Documentation System. Slike su napravljene u intervalima od 15 sekundi do dobijanja 20 slika ili do potpune ekspozicije fotografija, šta god da je bilo prvo. Reprezentativni rezultati su dati na Slikama 14A i 14B. Rezultati su demonstrirali da su svi konstruisani sojevi eksprimirali detektabilne nivoe antitela koja sadrže humani Igλ laki lanac u njihovim serumima (Slika 14 i podaci koji nisu prikazani).
Primer 5. Upotreba humanog genskog segmenta u glodarima koji imaju konstruisani lokus lakog lanca Igλ
[0354] Ovaj primer demonstrira upotrebu humanog gena u lakim lancima antitela eksprimiranih u glodarima (npr., miševima) konstruisanim da sadrže endogeni lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano. Upotreba humanih Igλ genskih segmenata u izabranim konstruisanim glodarskim sojevima opisanim prethodno određena je sa Next Generation Sequencing analizom repertoara antitela.
[0355] Ukratko, splenocite su sakupljene iz miševa heterozigotnih za inserciju 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena, 4 funkcionalna humana Jλ-Cλ klastera, i humanog Yλ7 genskog segmenta ushodno od mišjeg Cλ1 gena, i humanog Igλ enhansera inseriranog između mišjeg Cλ1 gena i endogenog mišjeg Igλ enhansera 3.1 (6889 heterozigotni miševi kao na Slici 4). B ćelije su pozitivno obogaćene iz ukupnih splenocita sa anti-mišjim CD19 magnetnim perlicama i MACS kolonama (Miltenyi Biotech). Ukupna RNK je izolovana iz B ćelija slezine korišćenjem RNeasy Plus kit (Qiagen).
[0356] Reverzna transkripcija sa oligo-dT prajmerom praćena gen specifičnom PCR je izvedena da se generiše cDNK koja sadrži sekvence konstantnog regiona humanog Igλ (Cλ1, Cλ2, Cλ3 i Cλ6), kao i cDNK koja sadrži mišje Cλ1 sekvence, korišćenjem SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Tokom reverzne transkripcije, specifična DNK sekvenca (PIIA: 5’-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3’, SEQ ID NO:133) je vezana za 3’ kraj novo sintetisanih cDNK. cDNK su prečišćene sa NucleoSpin Gel i PCR Clean-Up Kit (Clontech), zatim dodatno amplifikovane korišćenjem prajmer reverznog komplementa PIIA (5’ - AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACAT - 3’) uparenog sa humanim Cλ specifičnim prajmerom (5’-CACYAGTGTG GCCTTGTTGG CTTG-3’, SEQ ID NO:131) i mišjim Cλ1 specifičnim prajmerom (5’-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3’, SEQ ID NO:132).
[0357] Prečišćeni amplikoni su zatim amplifikovani sa PCR korišćenjem PIIA specifičnog prajmera (5’-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAG TGGTATCAAC GCAGAGT-3’, SEQ ID NO: 134) i ugnežđenog humanog Cλ specifičnog prajmera (5’-ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTCAGAGGA GGGCGGGAAC AGAGTG-3’, SEQ ID NO:135) ili ugnežđenog mišjeg Cλ1 specifičnog prajmera (5’-ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGGTGG AAACAGGGTG ACTGATG-3’, SEQ ID NO: 136). PCR proizvodi između 450-690bp su izolovani i sakupljeni sa Pippin Prep (SAGE Science). Ovi fragmenti su dodatno amplifikovani sa PCR korišćenjem sledećih prajmera: 5’-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATC-3’, SEQ ID NO: 137, i 5’- CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXG TGACTGGAGT TCAGACGTGT GCTCTTCCGA TCT-3’, SEQ ID NO:138 ("XXXXXX" je 6bp indeks sekvenci da se omogući multipleksiranje uzoraka za sekvenciranje). PCR proizvodi između 490bp-710bp su izolovani i sakupljeni sa Pippin Prep, zatim kvantifikovani sa qPCR korišćenjem KAPA Library Quantification Kit (KAPA Biosystems) pre punjena u Miseq sekvencer (Illumina) za sekvenciranje (v3, 600-ciklusa).
[0358] Za bioinformatičku analizu, rezultujuće Illumina sekvence su demultipleksirane i skraćene zarad kvaliteta. Preklapajuća očitavanja uparenih krajeva su zatim sastavljena i obeležena korišćenjem lokalne instalacije igblast (NCBI, v2.2.25+). Očitavanja su poravnata i sa humanom i sa mišjom bazom podataka Vλ i Jλ segmenata klicine linije i sortirana za najbolje pogodke. Sekvenca je markirana kao ambivalentna i uklonjena iz analize kada je detektovano više najboljih pogodaka sa identičnim skorom. Set perl skriptova je razvijen da bi se anaizirali rezultati i uskladištili podaci u mysql bazu podataka. Reprezentativni rezultati su dati na Slikama 15A (humani Cλ-prajmovani) i 15B (mišji Cλ-prajmovani).
[0359] U sledećem eksperimentu, B ćelije iz slezine sakupljene od miševa (n=3) homozigotni za inserciju 6889 targeting vektora (6889HO/VI HO/Adam6 HO, videti prethodno) analizirane su za upotrebu humanih Igλ genskih segmenata sa Next Genration Sequencing analizom repertoara antitela (opisana prethodno). iRNK izolovana iz B ćelija slezine je amplifikovana sa 5’RACE korišćenjem prajmera na mišje mCλ (n=3) i humane hCλ (n=3) konstantne regione i sekvencirana korišćenjem MiSeq. Repreznetativni rezultati su dati na Slici 15C (human Cλ-prajmovani) i 15D (mišji Cλ-prajmovani).
[0360] Miševi stvoreni korišćenjem 6889 targeting vektora (tj., ko-elektroporacijom dva targeting vektora i gRNK) demonstrirali su ekspresiju svih 25 funkcionalnih segmenata humanog Vλ gena. Dodatno, ekspresija segmenata humanog Vλ gena iz B ćelija ovih miševa demonstrirala je slične učestalosti u izolovanim B ćelijama u poređenju sa segmentima humanog Vλ gena uočenim u krvi humane pupčane vrpce. Uzeto zajedno, ovaj primer demonstrira da glodari koji sadrže konstruisane lokuse Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano u njihovom genomu klicinih linija eksprimiraju Igλ lake lance koji sadrže humane Igλ sekvence u B ćelijama. Dodatno, takve humane Igλ sekvence mogu se lako razlikovati po lakim lancima koji sadrže mišji ili humani Cλ domen.
11
Primer 6. Proizvodnja antitela u konstruisanim glodarima
[0361] Ovaj primer demonstrira proizvodnju antitela u glodaru koji sadrži konstruisani endogeni lokus lakog lanca Igλ kao što je prethodno opisano korišćenjem antigena od interesa (npr., single-pass ili multi-pass membranskog proteina, itd.). Postupci opisani u ovom primeru, ili postupci imunizacije dobro poznati u tehnici, mogu se koristiti za imunizaciju glodara koji sadrži konstruisani endogeni lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano sa polipeptidima ili njihovim fragmentima (npr., peptidi izvedeni iz željenog epitopa), ili kombinacija polipeptida ili njihovih fragmenata, po želji.
[0362] Kohorte miševa koje imaju konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i humanizovani IgH lokus (opisan prethodno), ili konstruisani lokus lakog lanca Igλ kao što je ovde opisano i humanizovane lokuse IgH i Igκ lakog lanca (opisani prethodno), su izloženi antigenu od interesa korišćenjem imunizacionih postupaka poznatih u tehnici. Imuni odgovor sa antitelom je praćen sa ELISA imunoanalizom (tj., serumskim titrom). Kada je željeni imuni odgovor postignut, splenocite (i/ili drugo limfno tkivo) su sakupljene i fuzionisane sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se očuvala njihova vijabilnost i formirale besmrtne hibridoma ćelijske linije. Hibridoma ćelijske linije su podvrgnute skriningu (npr., sa ELISA testom) i izabrane da se identifikuju hibridoma ćelijske linije koje proizvode antigen-specifična antitela. Hibridomi se mogu dodatno karakterisati u odnosu na relativni afinitet vezivanja i izotip po želji. Korišćenjem ove tehnike, i imunogena opisanog prethodno, dobijeno je nekoliko antigen-specifičnih himernih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i glodarske konstantne domene).
[0363] DNK koja kodira varijabilne domene teškog lanca i lakih lanaca može se izolovati i vezati sa željenim izotipovima (konstantnim domenima) teškog lanca i lakog lanca za pripremu potpuno humanih antitela. Takav protein antitela može se proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Potpuno humana antitela su zatim karakterisana u odnosu na relativni afinitet vezivanja i/ili neutralizacionu aktivnost antigena od interesa.
[0364] DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može se izolovati direktno iz antigen-specifičnih limfocita. Inicijalno, izolovana su himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni domen i glodarski konstantni domen i karakterisana su i izabrana u odnosu na željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Glodarski konstantni domeni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim domenom da bi se generisala potpuno-humana antitela. Dok izabrani konstantni domen može varirati u skladu sa specifičnom upotrebom, karakteristike visokog afiniteta antigen-vezivanja i target specifičnosti leže u varijabilnom domenu. Antigenspecifična antitela su takođe direktno izolovana iz antigen-pozitivnih B ćelija (iz imunizovanih miševa) bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u, npr., SAD patentu br. 7,582,298. Korišćenjem ovog postupka, napravljeno je nekoliko potpuno humaih antigen-specifičnih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene).
[0365] U jednom eksperimentu, 6597het (n=6) i 6680het (n=6) miševi su imunizovani preko primene u stopalo polipeptida ekstraćelijskog domena (ECD) receptora da bi se odredio imuni odgovor u konstruisanim miševima.
[0366] Ukratko, miševi su prajmovani sa 2.35 µg antigena (receptor polipeptid ECD) plus 10 µg CpG ađuvanta (Invivogen ODN1826). Miševi su bustovani sedam puta sa 2.35 µg antigena (receptor polipeptid ECD), 10 µg CpG ađuvanta i 25 µg Adju-Phos (Brenntag). Dva dana nakon finalne injekcije, krv je uzeta iz izabranih konstruisanih sojeva miševa i konstrola. Serum je razdvojen od krvi korišćenjem Mictrotainer koletorskih epruveta za kapilarnu krv (BD cat#365967) sa centrifugiranjem na 9000 rcf pet minuta na 4°C. Serum ELISA test je izveden da bi se odredili titri ukupnog IgG (Slika 16A), antigen-specifičnog IgG (Slika 16B), mIgκ (Slika 17C) mIgλ (Slika 17B) i hIgλ (Slika 17A).
[0367] Za analizu ukupnog IgG sa ELISA testom, Mosaorp ploče (Nunc) su obložene sa 1 µg/mL kozjeg anti-mišjeg IgG+IgM+IgA H&L (Abcam) u DPBS (sa Ca i Mg) po bunarčiću i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče su isprane četiri puta u PBS-T (PBS bez Ca ili Mg plus 0.1%Tween-20) i blokirane u PBS-T sa 1% BSA jedan čas na sobnoj temperaturi. Serum je razblažen deset puta (počinjući od 1:100 i završavajući na 1:109) u PBS-T sa 0.1% BSA i mišjim IgG standardom (Sigma) i razblažen je tri puta (počinjući od 1mg/mL i završavajući na 0.05ng/mL) u PBS-T sa 0.1% BSA. 100 µl svakog standarda i razblaženja uzorka je dodato ploči i inkubirano na sobnoj temperaturi jedan čas, praćeno sa ispiranjem četiri puta u PBS-T. 100 µl kozjeg anti-mišjeg IgG humanih ads-HRP (Southern Biotech) razblaženih 1:2500 je dodato u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane jedan čas. Ploče su isprane četiri puta u PBS-T, i 100 µl reagensa TMB supstrata (BD Biosciences) je dodato u svaki bunarčić u toku deset minuta. Reakcija je zaustavljena sa 100 µl 1N sumpornom kiselinom po bunarčiću, i apsorpcija je merena na 450 nm. Podaci su analizirani u GraphPad Prism i fitovani na četvoro-parametarskoj krivi.
[0368] Za antigen-specifičnu ELISA, Mosaorp ploče (Nunc) su obložene sa 1 µg/mL antigenom u DPBS (sa Ca i Mg) po bunarčiću i inkubirane preko noći na 4°C. Sledeći dan, ploče su isprane četiri puta u PBS-T i blokirane u Sea Block (ThermoFisher) razblažene 1:2 in PBS-T jedan čas na sobnoj temperaturi. Serum je razblažen (kao pretohodno) u Sea Block razblaženo 1:5 u PBS-T. Svako razređenje uzorka je dodato svakoj ploči i inkubirano na
11
sobnoj temperaturi jedan čas. Zatim su ploče isprane četiri puta u PBS-T. 100 µl ili kozjeg anti-mišjeg IgG humanog ads-HRP (Southern Biotech) razblažene 1:2500, kozjeg anti-mIgκ-HRP (Southern Biotech) razblaženog 1:4000, kozjeg anti-mIgλ-HRP (Southern Biotech) razblaženog 1:4000, ili kozjeg anti-hIgλ mišjeg ads-HRP (Southern Biotech) razblaženog 1:4000 su dodati u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane jedan čas. Ploče su isprane četiri puta u PBS-T, i razvijene kao što je prethodno opisano. Reprezentativni rezultati su dati na Slici 16 i 17.
[0369] Uzeto zajedno, ovaj primer specifično demonstrira da glodari konstruisane da sadrže lokuse Igλ lakog lanca kao što je ovde opisano generišu snažane antitelo odgovore na imunizaciju sa antigenom od interesa. Dodatno, takvi konstruisani glodari demonstriraju ukupne i antigen-specifične IgG nivoe koji su uporedivi sa konstolama divljeg tipa, što potvrđuje kapacitet za robusni imuni odgovor u ovim konstruisanim životinjama. Zaista, hIgλ titeri su bili snažniji od mIgλ titara nakon imunizacije (Slika 17A i 17B). Stoga, konstruisani glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju poboljšani in vivo ssitem za generisanje antitela za razvoj umanih terapeutika zasnovanih na antitelu, naročito, humanih terapeutika zasnovanih na antitelu koji koriste sekvence humanog Igλ lakog lanca.
EKVIVALENTI
[0370] Stručnjaci će shvatiti da će različite izmene, modifikacije, i poboljšanja u odnosu na predmetni opis biti lako uočene od strane stručnjaka.
[0371] Upotreba rednih termina kao što su "prvi," "drugi," "treći," itd., u patentnim zahtevima da se modifikuje element patentnog zahteva sami po sebi ne znače bilo kakav prioritet, prednost, ili redosled jednog elementa patentnog zahteva u odnosu na drugi ili vremenski redosled po kome su izvedeni koraci postupka, već su korišćeni samo kao oznake da se razlikuje jedan element patentnog zahteva koji ima određeni naziv od drugog elementa koji ima isti naziv (osim upotrebe rednog termina) da bi se razlikovali elementi patentnog zahteva.
[0372] Članovi "a" i "an" (na engleskom jeziku) u specifikaciji i u patentnim zahtevima, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, podrazumevano uključuju množinu. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ukoliko jedan, više od jednog, ili svi od članova grupe su prisutni u, upotrebljeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces ukoliko nije jasno naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak uključuje primere izvođenja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, upotrebljen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili proces. Pronalazak takođe uključuje primere izvođenja u kojima je više od jednog, ili članovi
11
cele grupe su prisutni u, upotrebljeni u, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili proces. Pored toga, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, uslova, opisnih termina itd. iz jednog ili više navedenih zahteva se uvodi u drugi zahtev koji zavisi od istog osnovnog zahteva (ili, prema potrebi, bilo kog drugog zahteva), osim ako nije drugačije naznačeno ili osim ako stručnjaku u ovoj oblasti ne bi bilo očigledno da bi došlo do kontradikcije ili nedoslednosti. Kada su elementi predstavljeni kao liste (npr. u Markušovoj grupi ili sličnom formatu), treba razumeti da je svaka podgrupa elemenata takođe otkrivena i da se bilo koji elementi mogu ukloniti iz grupe. Treba razumeti da, generalno, tamo gde se na pronalazak ili aspekti pronalaska navode kao da sadrže određene elemente, karakteristike itd., određena izvođenja pronalaska ili aspekata pronalaska sastoje se, ili se u suštini sastoje od takvih elemenata, karakteristika itd. Radi jednostavnosti, ta izvođenja nisu u svakom slučaju posebno opširno navedena. Takođe treba razumeti da bilo koje izvođenje ili aspekt pronalaska može biti eksplicitno isključeno iz zahteva, bez obzira na to da li je specifično isključenje navedeno u opisu.
[0373] Stručnjaci će shvatiti tipične standarde devijacije ili greške koje su rezultat vrednosti dobijenih u analizama ili drugim procesima kao što je ovde opisano.
11
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING AN ENGINEERED IMMUNOGLOBULIN LAMBDA LIGHT CHAIN LOCUS
<130> RPB-01825
<140> PCT/US2017/060006
<141> 2017-11-03
<150> 62/567,932
<151> 2017-10-04
<150> 62/417,845
<151> 2016-11-04
<160> 141
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 317
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gccagcccaa gtcttcgcca tcagtcaccc tgtttccacc ttcctctgaa gagctcgaga 60 ctaacaaggc cacactggtg tgtacgatca ctgatttcta cccaggtgtg gtgacagtgg 120 actggaaggt agatggtacc cctgtcactc agggtatgga gacaacccag ccttccaaac 180 agagcaacaa caagtacatg gctagcagct acctgaccct gacagcaaga gcatgggaaa 240 ggcatagcag ttacagctgc caggtcactc atgaaggtca cactgtggag aagagtttgt 300 cccgtgctga ctgttcc 317
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu
65 70 75 80
Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser
100 105
<210> 3
<211> 314
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gtcagcccaa gtccactccc actctcaccg tgtttccacc ttcctctgag gagctcaagg 60 aaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ccaacttttc cccgagtggt gtgacagtgg 120 cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180 agggcaacaa gttcatggcc agcagcttcc tacatttgac atcggaccag tggagatctc 240 acaacagttt tacctgtcaa gttacacatg aaggggacac tgtggagaag agtctgtctc 300 ctgcagaatg tctc 314
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn
20 25 30
Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys
50 55 60
Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu
100 105
<210> 5
<211> 314
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
gtcagcccaa gtccactccc acactcacca tgtttccacc ttcccctgag gagctccagg 60 aaaacaaagc cacactcgtg tgtctgattt ccaatttttc cccaagtggt gtgacagtgg 120 cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180 aggacaacaa gtacatggcc agcagcttct tacatttgac atcggaccag tggagatctc 240 acaacagttt tacctgccaa gttacacatg aaggggacac tgtggagaag agtctgtctc 300 ctgcagaatg tctc 314
<210> 6
<211> 105
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Met Phe Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn
20 25 30
Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Asp Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu
100 105
<210> 7
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60 gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120 cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180 agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240 gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgtggagaag agtctgtctc 300 ctgcagaatg tgtc 314
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 8
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Asp Val Glu Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Ser Gln Gly Val Asp Thr Ala Asn Pro Thr Lys Gln Gly Asn Lys
50 55 60
Tyr Ile Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Thr Ala Glu Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
Arg Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Val
100 105
<210> 9
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 9
accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60 ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120 tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180 agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240 atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300 gtgctgagtg ttcc 314
<210> 10
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 10
Asp Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Thr Asp Lys Ala Thr Leu Val Cys Met Val Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Met Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Gln Pro Phe Lys Gln Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Ala Lys Ala Trp Glu Thr
65 70 75 80
His Ser Asn Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Glu Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 11
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 11
gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60 gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120 cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180 agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240 gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgtggaaaag agtctgtctc 300 ctgcagagtg tgtc 314
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 12
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Asp Val Glu Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Ser Gln Gly Val Asp Thr Ala Asn Pro Thr Lys Gln Gly Asn Lys
50 55 60
Tyr Ile Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Thr Ala Glu Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
Arg Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Val
100 105
<210> 13
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 13
accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60 ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120 tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180 agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240 atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300 gtgctgagtg ttcc 314
<210> 14
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 14
Asp Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Thr Asp Lys Ala Thr Leu Val Cys Met Val Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Met Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Gln Pro Phe Lys Gln Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Ala Lys Ala Trp Glu Thr
65 70 75 80
His Ser Asn Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Glu Asn Thr Val Glu 85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 15
gcatggccta gagataacaa gac 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 16
ggccttggat aacctcagga tac 23
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 17
tccatcccaa tagatctcat tccttccc 28
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 18
ccctgtcaag tctccaaggt tg 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 19
cactgtggcc caaggatcac 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 20
cactctgccc agggagtgtc tgg 23
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 21
gcatggccta gagataacaa gactg 25
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 22
gtgctcttcc cttgggaga 19
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 23
tccatcccaa tagagcgatc gca 23
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 24
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 25
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 26
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 27
agctgaatgg aaacaaggca a 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 28
ggagacaatg ccccagtga 19
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 29
tgacatgaac catctgtttc tctctcgaca a 31
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 30
ccaccgccaa gttgacctc 19
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 31
tgaaggacta aggcccagga tag 23
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 32
agtacagcaa gggcccagcc t 21
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 33
tggctcagtg acaagagtc 19
<210> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 34
ccagggacac agcctttgc 19
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 35
tgcattgcag agaccaggga cc 22
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 36
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 37
acgagcgggt tcggcccatt c 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 38
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 39
tgtcgggcgt acacaaatcg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 40
gggcgtcggt ttccactatc 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 41
ccgtctggac cgatggctgt gt 22 <211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 42
cgacgtctgt cgagaagttt ctg 23
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 43
cacgccctcc tacatcgaa 19
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 44
agttcgacag cgtgtccgac ctga 24
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 45
aacaaccgag ctccaggtgt 20 <211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 46
agggcagcct tgtctccaa 19
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 47
cctgccagat tctcaggctc cctg 24
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 48
ggaggtcagg aatgagggac 20
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 49
cacttgctca ctgcaaaagc a 21
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
<400> 50
tgtgggattt tggaattcta tctcactgat aggaaag 37
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 51
gcagagagga ttcaagagct gg 22
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 52
tttttgcaat gcttcacctg a 21
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
caggtgtctg tattggaggt caatggca 28
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 54
gatttgctga gggcagggt 19
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 55
ccccaagtct gatccttcct t 21
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 56
ccttcatact cttgcatcct cccttctcca 30
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
gctgaccaac gatcgcctaa 20
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 58
taagcgccac actgcacct 19
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 59
ttccttctct tctgtgactc aattatttgt ggaca 35
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 60
aactgctgat gcactgggc 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 61
tgaatgcatg gagttggcc 19
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 62
tctcctttgc agtggcttaa ttagctgagt ca 32
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 63
ccctggtgaa gcatgtttgc 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 64
tgtggcctgt ctgccttacg 20
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 65
ccaagcagga ggtgctcagt tcccaa 26
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 66
gggacaggtg aagggcctat c 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 67
tggtccacag gatgcagttg 20
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 68
cgcacctgta tctaaccagt cccagcatc 29
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 69
cacacctaga ccccggaagt c 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 70
tcgctttgcc agttgattct c 21
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 71
tccacactgt cggctgggag ctca 24
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 72
cgcttcaatg acccaacca 19
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 73
tgttgaaacg taatccccaa tg 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 74
ctcccaccag gtgccacatg ca 22
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 75
gggctacttg aggaccttgc t 21
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 76
gacagccctt acagagtttg gaa 23
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
<400> 77
cagggcctcc atcccaggca 20
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 78
agtgcaaaca gcaagatgag atct 24
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 79
ggcgctgagc agaaaacaa 19
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
<400> 80
agaccaccaa gaaggcccag agtgacc 27
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 81
aagaccagga gctctgccta agt 23
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 82
cccatcacga actgaagttg ag 22
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 83
ccccagtgtg tgaatcactc taccctcc 28
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 84
cccttcatga tgctttgtca tc 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 85
gtagtggcaa aggcagattc ct 22
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 86
ccttcactcc ccgaatgccc tcc 23
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 87
gccctgctcc agtcttattc c 21
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 88
ctgcgtctgg gctttgct 18
<210> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 89
ccacagatcc caagttgagc ctgc 24
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 90
gtgagcggta ccctggaatc 20
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 91
agcctcgtct tcggtcagga c 21
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 92
tgaacgattc tctgggtcca cc 22 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 93
cctgagccag gatggaatga ag 22
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 94
ggccgtgatt taagaggttg ttag 24
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 95
actgtggacc ccagataatt cccctg 26
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 96
gagtgcagtg gcagaatctt g 21 <211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 97
ggcagggagc attggtaga 19
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 98
tactgaaatc tcagcctccc aggc 24
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 99
tggctccagc tcaggaaav 19
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 100
cccgggagtt acagtaatag tca 23 <211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 101
cacagcttcc ttgaccatca ctggg 25
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 102
ccagcccacc caattatgct a 21
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 103
gcgtttaggg ccaggtacaa at 22
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 104
tggatctgtc aaacactttc agagca 26
<210> 105
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 105
gaggctgcag ggatgtaac 19
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 106
cccattccag gtccaattct ca 22
<210> 107
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 107
tttgtaaagt gcataacaca gaccctga 28
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
gggtacaatg agacaagaat caga 24
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 109
gaaaggcaaa cacaagtcac agatg 25
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
<400> 110
tcagccctct ggaatgtaag gatca 25
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 111
gctgcatctt ctcaagtctt taagt 25
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
gggaaccagt caggaactca tac 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 113
taagcagacc tatgcatcgc tca 23
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 114
gtgctccttg ttcccttcac ag 22
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 115
ctgaagcatc tgcaccatca aatc 24
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe"
<400> 116
ccacccacat gtgcccgtgt g 21
<210> 117
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 117
ccctattcac tgagttctgg aagctctgct atttccatga tcgttcacac tgacccctgt 60 tgatcttacc ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta 100
<210> 118
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 118
ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt ggcgcgccga tgtacatcag 60 ttcagtctgg aaaggtggaa cagctccagg tgaaggcagg 100
<210> 119
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 119
ctctacgggt gatgttcatc taaggtgaca ggagtcagtg agggcttctc aagctttatc 60 tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcactcg agccctgctg gtgccttctg 120 ttgtatccac gccttcagta gatttgatga 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 120
gagtttttcc ctttcctgtc tgtcgaaggc taaggtctaa gcctgtctgg tcacactagg 60 taaagaattt ctttcttctc tagatgcttt gtctcatttc 100
<210> 121
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 121
tatgtcactg gaatttagag tagtgtgtgg aatgtcttgg caacctggac acgcgtcctg 60 gcacccagtg agaaagtggc cctgagggag aggctcatag 100
<210> 122
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 122
agcagccgac atttagcaaa gaggattgga aaatgaaccc ccccttaaaa tacagttaaa 60 cacagaggag ggagcaaacc ggtataactt cgtataatgt 100
<210> 123
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 123
atgctatacg aagttatgtc gacctcgagg gggggcccgg taccatctat gtcgggtgcg 60
gagaaagagg taatgaaatg gtctcattcc ttccctgtct caaggcataa tggttcaata 120
tgcacctgta 130
<210> 124
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 124
ttctctccaa gacttgaggt gctttttgtt gtatactttc cctttctgta ttctgcttca 60
tacctatact ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta 100
<210> 125
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 125
ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt ggcgcgcctg ccatttcatt 60
acctctttct ccgcacccga catagataag ctttggattg gattcagtga gcaagaattc 120
acaaacacaa tggacttatc 140
<210> 126
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
ttctctccaa gacttgaggt gctttttgtt gtatactttc cctttctgta ttctgcttca 60 tacctatact ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta 100
<210> 127
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 127
ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt ggcgcgcccc cctgctggtg 60 ccttttgttg tatccacgcc ttcagtagat ttgatgatgc 100
<210> 128
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 128
ttctctccaa gacttgaggt gctttttgtt gtatactttc cctttctgta ttctgcttca 60 tacctatact ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta 100
<210> 129
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide"
<400> 129
ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt ggcgcgccga tgtacatcag 60 ttcagtctgg aaaggtggaa cagctccagg tgaaggcagg 100 <211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide"
<400> 130
cgacctgatg cagctctcgg 20
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 131
cacyagtgtg gccttgttgg cttg 24
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 132
caccagtgtg gccttgttag tctc 24
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide"
<400> 133
cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 134
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57
<210> 135
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 135
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagagga gggcgggaac agagtg 56
<210> 136
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 136
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggtgg aaacagggtg actgatg 57
<210> 137
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(35)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 137
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60
tccgatc 67
<210> 138
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<220>
<221> modified_base
<222> (25)..(29)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 138
caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tgactggagt tcagacgtgt gctcttccga 60
tct 63
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide"
<400> 139
gtacatcttg tcttcaacgt 20
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
gtccataatt aatgtagtta c 21
<210> 141
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer"
<400> 141
aagcagtggt atcaacgcag agtacat 27

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Postupak dobijanja nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog lamda lakog lanca i/ili nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog teškog lanca koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog glodara sa antigenom, gde genetski modifikovan glodar ima genom klicine linije koji obuhvata:
(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena;
(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena;
(iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena;
(iv) jedan ili više enhensera (Eλ) λ lakog lanca imunoglobulina glodara;
(v) tri humana Eλs; i
(vi) segment Cλ gena glodara,
gde (i) – (vi) su na endogenom lokusu imunoglobulinskog λ lakog lanca;
gde (i) i (ii) su sposobni da se rearanžiraju da bi formirali rearanžirane humane gene λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa segmentima gena konstantnog regiona od (iii) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde (i) i (ii) su takođe sposobni da se reraranžiraju da bi formirali rearanžirane gene humanog λ varijabilnog regiona koji su eksprimirani zajedno sa glodarskim Cλ segmentom gena od (vi) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina; i
(vii) konstruisani lokus teškog lanca koji obuhvata inserciju jednog ili više segmenta humanog VHgena, jednog ili više segmenta humanog DHgena i jednog ili više segmenta humanog JHgena sposobnih da se rearanžiraju da bi formirali rearanžirane gene humanog varijabilnog regiona teškog lanca koji su eksprimovani zajedno sa segmentom gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobilina glodara;
(b) održavanja glodara u uslovima dovoljnim da glodar proizvede imuni odgovor na antigen; i
(c) regeneracije nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog lambda lakog lanca i/ili nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog teškog lanca iz glodara, ili ćelije iz glodara.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde
(a) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje humane Vλ5‑52 do Vλ1‑40 i/ili Vλ3‑27 do Vλ3‑1, opciono gde jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanog Vλ5‑52 do Vλ1‑40 i/ili Vλ3‑27 do Vλ3‑1; i
(b) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i jedan ili više segmenata humanog Cλ gena uključuju parove segmenata Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i segment humanog Jλ7 gena, opciono gde parovi segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-C11, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena, i segment humanog Jλ7 gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7; i
(c) jedan ili više glodarskih Eλs su mišji Eλ i mišji Eλ3‑1.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde insercija jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata zamenjuje glodarske VH, DH, i JHgenske segmente, opciono gde insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih VH, DH, i JHgenskih segmenata, i njihovih kombinacija.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina endogeni glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju endogenih segmenata Vλ gena i segmenata Jλ gena, gde je delecija endogenih segmenata Vλ gena i segmenata Jλ gena u celini ili delimična.
6. Glodar prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde je glodarski segment Cλ gena od (vi) mišji segment Cλ gena.
1
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde
(a) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina nema endogeni glodarski Adam6 gen, opciono gde endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih ADAM6 polipeptida; i/ili
(b) glodar je homozigotan na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde
(a) glodar je homozigitan na endogenom lokusu λ lakog lanca imunoglobulina; i/ili (b) glodar je pacov ili miš.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je humani varijabilni domen varijabilni domen humanog lambda lakog lanca.
10. Postupak stvaranja sekvence varijabilnog domena humanog lambda lakog lanca i/ili sekvence varijabilnog domena humanog teškog lanca koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog glodara sa antigenom, gde genetski modifikovan glodar ima genom klicine linije koji obuhvata:
(i) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena;
(ii) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena;
(iii) jedan ili više segmenata humanog Cλ gena;
(iv) jedan ili više enhensera (Eλ) λ lakog lanca imunoglobulina glodara;
(v) tri humana Eλs; i
(vi) Cλ genska segmenta pacova,
gde (i)-(vi) su na endogenom lokusu imunoglobulinskog λ lakog lanca; gde su (i) i (ii) u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane λ varijabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa konstantnim regionom genskih segmenata (iii) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina, i gde su (i) i (ii) takođe u stanju da se reanžiraju da formiraju rearanžirane λ varijabilne regione humanih gena koji se eksprimuju zajedno sa segmentima Cλ gena glodara (vi) kao λ laki lanci antigen vezujućih proteina; i
(vii) konstruisanje lokusa teškog lanca koje obuhvata inserciju jednog ili više segmenata humanog VHgena, jednog ili više segmenata humanog DHgena, i
1 1
jednog ili više segmenata JHhumanog gena koji su u stanju da se rearanžiraju da formiraju rearanžirane varijabilne regione teškog lanca humanog gena koji se eksprimuju zajedno sa glodarskim genskim segmentima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina; i
(b) određivanje sekvence varijabilnog domena humanog lambda lakog lanca i/ili sekvence varijabilnog domena humanog teškog lanca antitela koje specifično: (i) vezuje antigen i (ii) stvoreno je od strane genetski modifikovanog glodara.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde određivanje sekvence varijabilnog domena humanog lakog lanca obuhvata određivanje nukleotidne sekvence koja kodira sekvencu varijabilnog domena humanog lakog lanca.
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 ili 11, gde:
a) jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuje humane Vλ5‑52 do Vλ1‑40 i/ili Vλ3‑27 do Vλ3‑1, opciono gde jedan ili više segmenata humanog Vλ gena uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanog Vλ5‑52 do Vλ1‑40 i/ili Vλ3‑27 do Vλ3‑1; i
(b) jedan ili više segmenata humanog Jλ gena i jedan ili više segmenata humanog Cλ gena uključuju parove segmenata Jλ-Cλ gena Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 i segment humanog Jλ7 gena, opciono gde parovi segmenata humanog Jλ-Cλ gena Jλ1-C11, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 i Jλ6-Cλ6 uključuju humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između parova segmenata humanog Jλ-Cλ gena, i segment humanog Jλ7 gena uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja ushodno (ili 5’) od humanog Jλ7; i
(c) jedan ili više glodarskih Eλs su mišji Eλ i mišji Eλ3‑1.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10-12, gde insercija jednog ili više humanih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih DHgenskih segmenata i jednog ili više humanih JHgenskih segmenata zamenjuje glodarske VH, DH, i JHgenske segmente, izborno gde insercija uključuje humanu nekodirajuću DNK koja se prirodno javlja između humanih VH, DH, i JHgenskih segmenata, i njihovih kombinacija.
1 2
14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 13, gde je glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina endogeni glodarski konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10-13, gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina sadrži deleciju endogenih segmenata Vλ gena i segmenata Jλ gena, gde delecija endogenih segmenata Vλ gena i segmenata Jλ gena je u celini ili delimična.
16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 14, gde je glodarski segment Cλ gena od (vi) mišji segment Cλ gena.
17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 15, gde
(a) endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina nema endogeni glodarski Adam6 gen, opciono gde endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina dodatno sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više glodarskih ADAM6 polipeptida; i/ili
(b) glodar je homozigotan na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina.
18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 15, gde
(a) glodar je homozigitan na endogenom lokusu λ lakog lanca imunoglobulina; i/ili (b) glodar je pacov ili miš.
1
RS20250535A 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca RS66884B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662417845P 2016-11-04 2016-11-04
US201762567932P 2017-10-04 2017-10-04
EP22164751.4A EP4082334B1 (en) 2016-11-04 2017-11-03 Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66884B1 true RS66884B1 (sr) 2025-07-31

Family

ID=62025924

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250535A RS66884B1 (sr) 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca
RS20201205A RS60886B1 (sr) 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lamba lakog lanca
RS20220669A RS63390B1 (sr) 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lamba lakog lanca

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201205A RS60886B1 (sr) 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lamba lakog lanca
RS20220669A RS63390B1 (sr) 2016-11-04 2017-11-03 Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lamba lakog lanca

Country Status (26)

Country Link
US (2) US10820582B2 (sr)
EP (4) EP3407709B9 (sr)
JP (5) JP6884860B2 (sr)
KR (4) KR102492433B1 (sr)
CN (2) CN114369157A (sr)
AU (2) AU2017391167B2 (sr)
BR (1) BR112019008675A2 (sr)
CA (1) CA3038720A1 (sr)
CY (2) CY1123491T1 (sr)
DK (3) DK3407709T3 (sr)
ES (3) ES2823305T3 (sr)
FI (1) FI4082334T3 (sr)
HR (3) HRP20250695T1 (sr)
HU (3) HUE061980T2 (sr)
IL (2) IL308197A (sr)
LT (3) LT3766343T (sr)
MA (2) MA44091A (sr)
MX (2) MX385857B (sr)
PL (3) PL3766343T3 (sr)
PT (3) PT3766343T (sr)
RS (3) RS66884B1 (sr)
RU (2) RU2021129958A (sr)
SG (2) SG10201913483XA (sr)
SI (3) SI3407709T1 (sr)
SM (3) SMT202200259T1 (sr)
WO (1) WO2018128691A1 (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
HRP20192218T1 (hr) * 2012-02-01 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi koji izražavaju teške lance koji sadrže vl domene
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
RS66884B1 (sr) 2016-11-04 2025-07-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca
DK3772927T3 (da) 2018-03-24 2025-02-17 Regeneron Pharma Genetisk modificerede mus eller rotter til generering af terapeutiske antistoffer mod peptid¿MHC-komplekser, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
KR20250121150A (ko) 2018-03-26 2025-08-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류
IL318469A (en) * 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
DK3993623T3 (da) * 2019-07-01 2025-05-26 Zoetis Services Llc Transgene gnavere og fremgangsmåder til anvendelse deraf
EP4158034A4 (en) * 2020-06-02 2024-07-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
IL301137A (en) 2020-09-11 2023-05-01 Regeneron Pharma Identification and production of antigen-specific antibodies
KR20230147048A (ko) 2020-12-16 2023-10-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
CA3197426A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce the same
GB202217978D0 (en) * 2022-11-30 2023-01-11 Petmedix Ltd Rodents expressing a common light chain

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993012227A1 (en) * 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DK1461442T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
MXPA06000562A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
MX2008014804A (es) 2006-06-02 2009-01-27 Regeneron Pharma Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano.
PL2346994T3 (pl) 2008-09-30 2022-04-19 Ablexis, Llc Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał
US20110314563A1 (en) * 2008-12-18 2011-12-22 Kingdon Craig R Antibody production
DK2564695T3 (en) * 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011115476A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 N.V. Nutricia Infant nutrition for improving fatty acid composition of brain membranes later in life
WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hybrid light chain mice
LT2578688T (lt) 2011-02-25 2019-11-11 Regeneron Pharma Adam6 pelės
LT2627773T (lt) 2011-10-17 2017-12-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės iškirpta sunkioji imunoglobulino grandinė
US9253965B2 (en) * 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR102038974B1 (ko) * 2011-12-20 2019-10-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 경쇄 마우스
AU2014218931C1 (en) 2013-02-20 2020-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
DK2840892T3 (en) * 2013-02-20 2018-07-23 Regeneron Pharma Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences
US9788534B2 (en) * 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA2925723A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
MX388127B (es) 2013-12-11 2025-03-19 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma.
CA2950173C (en) 2014-06-06 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modifying a targeted locus
ES2781323T3 (es) 2014-06-23 2020-09-01 Regeneron Pharma Montaje de ADN mediado por nucleasas
ES2731437T3 (es) 2014-11-21 2019-11-15 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías
CN107208113A (zh) 2014-12-19 2017-09-26 瑞泽恩制药公司 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
RS66884B1 (sr) 2016-11-04 2025-07-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca

Also Published As

Publication number Publication date
EP3407709B9 (en) 2021-10-06
SI3766343T1 (sl) 2022-06-30
SMT202500204T1 (it) 2025-07-22
NZ753456A (en) 2021-08-27
RU2757665C2 (ru) 2021-10-20
AU2017391167B2 (en) 2024-02-15
LT3766343T (lt) 2022-06-10
AU2024200582A1 (en) 2024-03-28
KR20210134059A (ko) 2021-11-08
CY1123491T1 (el) 2022-03-24
HRP20250695T1 (hr) 2025-08-01
PL3407709T3 (pl) 2021-01-11
EP3766343A1 (en) 2021-01-20
MA53935A (fr) 2021-12-22
RS60886B1 (sr) 2020-11-30
KR20230020550A (ko) 2023-02-10
SG10201913483XA (en) 2020-03-30
HUE052087T2 (hu) 2021-04-28
BR112019008675A2 (pt) 2019-07-09
ES2823305T3 (es) 2021-05-06
JP2022130725A (ja) 2022-09-06
DK4082334T3 (da) 2025-06-02
SMT202200259T1 (it) 2022-07-21
EP4082334A1 (en) 2022-11-02
EP3407709B1 (en) 2020-07-29
KR102492433B1 (ko) 2023-01-30
KR20190076024A (ko) 2019-07-01
IL266282B2 (en) 2024-04-01
WO2018128691A1 (en) 2018-07-12
HUE061980T2 (hu) 2023-09-28
JP7386292B2 (ja) 2023-11-24
PL4082334T3 (pl) 2025-08-11
MX2019005256A (es) 2019-08-05
IL266282A (en) 2019-06-30
US20180125043A1 (en) 2018-05-10
FI4082334T3 (fi) 2025-06-10
PT3766343T (pt) 2022-05-30
KR102658529B1 (ko) 2024-04-19
EP3766343B1 (en) 2022-05-11
RU2019112589A3 (sr) 2021-03-30
EP4567119A3 (en) 2025-09-24
CN109996441B (zh) 2022-02-08
CN114369157A (zh) 2022-04-19
US10820582B2 (en) 2020-11-03
EP4082334B1 (en) 2025-03-26
HRP20220888T1 (hr) 2022-10-28
RS63390B1 (sr) 2022-08-31
US20210029978A1 (en) 2021-02-04
CN109996441A (zh) 2019-07-09
ES2915609T3 (es) 2022-06-23
JP6884860B2 (ja) 2021-06-09
MA44091A (fr) 2018-10-24
ES3035365T3 (en) 2025-09-02
CY1125474T1 (el) 2025-05-09
JP2020501516A (ja) 2020-01-23
JP2025166207A (ja) 2025-11-05
IL266282B1 (en) 2023-12-01
EP3407709A1 (en) 2018-12-05
SG11201903344XA (en) 2019-05-30
EP4567119A2 (en) 2025-06-11
HUE071595T2 (hu) 2025-09-28
PL3766343T3 (pl) 2022-09-26
MX2021010556A (es) 2021-10-01
KR20240055863A (ko) 2024-04-29
PT4082334T (pt) 2025-05-21
MX385857B (es) 2025-03-18
HRP20201403T1 (hr) 2020-11-27
CA3038720A1 (en) 2018-07-12
DK3766343T3 (da) 2022-06-20
US12433264B2 (en) 2025-10-07
LT3407709T (lt) 2020-10-12
JP2023053400A (ja) 2023-04-12
KR102319069B1 (ko) 2021-11-01
PT3407709T (pt) 2020-08-20
JP2021090455A (ja) 2021-06-17
IL308197A (en) 2024-01-01
RU2021129958A (ru) 2021-11-02
SMT202000558T1 (it) 2020-11-10
SI4082334T1 (sl) 2025-06-30
AU2017391167A1 (en) 2019-05-30
WO2018128691A8 (en) 2019-02-28
DK3407709T3 (da) 2020-08-31
SI3407709T1 (sl) 2020-10-30
RU2019112589A (ru) 2020-12-04
LT4082334T (lt) 2025-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7386292B2 (ja) 操作されたイムノグロブリンラムダ軽鎖座位を有する非ヒト動物
RS63772B1 (sr) Miševi koji imaju modifikovani lambda laki lanac imunoglobulina i njihove upotrebe
RS63117B1 (sr) Nehumane životinje sposobne za dh-dh uređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina
HK40127071A (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40082722B (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40082722A (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40045047B (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40045047A (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
NZ753456B2 (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40001433B (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
HK40001433A (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus