[go: up one dir, main page]

RS62011B1 - Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije - Google Patents

Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije

Info

Publication number
RS62011B1
RS62011B1 RS20210774A RSP20210774A RS62011B1 RS 62011 B1 RS62011 B1 RS 62011B1 RS 20210774 A RS20210774 A RS 20210774A RS P20210774 A RSP20210774 A RS P20210774A RS 62011 B1 RS62011 B1 RS 62011B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
activin
amino acid
cases
polypeptide
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20210774A
Other languages
English (en)
Inventor
Ravindra Kumar
John Knopf
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Publication of RS62011B1 publication Critical patent/RS62011B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • A61K38/35—Corticotropin [ACTH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA POVEZANOST SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva od privremenih SAD prijava serijskih brojeva 62/362,955, koja je podneta 15.7.2016; 62/453,888, koja je podneta 2.2.2017; i 62/510,403, koja je podneta 24.5.2017.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Plućna hipertenzija (PH) je bolest koju karakteriše visok krvni pritisak u krvnim sudovima pluća, uključujući plućne arterije, plućne vene i plućne kapilare. Uopšteno, PH se definiše kao srednji plućni arterijski pritisak (PA) koji je ≧25 mm Hg u mirovanju ili ≧30 mm Hg pri vežbanju [Hill et al., Respiratory Care 54 (7): 958-68 (2009)]. Glavni simptom PH je otežano disanje ili kratak dah, a ostali simptomi uključuju umor, vrtoglavicu, nesvesticu, periferni edem (oticanje stopala, nogu ili članaka), plavičaste usne i kožu, bol u grudima, anginu pektoris, vrtoglavicu tokom vežbanja, neproduktivni kašalj, ubrzani puls i lupanje srca. PH može da bude teška bolest koja uzrokuje srčanu insuficijenciju, što je jedan od najčešćih uzroka smrti ljudi koji imaju plućnu hipertenziju. Postoperativna plućna hipertenzija može da komplikuje mnoge vrste hirurških operacija ili procedura i predstavlja problem koji je povezan sa visokim mortalitetom.
[0003] PH mogu da se grupišu na osnovu različitih manifestacija bolesti koje imaju sličnosti u patofiziološkim mehanizmima, kliničkoj slici i terapijskim pristupima [Simonneau et al., JACC 54 (1): S44-54 (2009)]. Klinička klasifikacija PH prvi put je predložena 1973. godine, a nedavno ažuriranu kliničku klasifikaciju odobrila je Svetska zdravstvena organizacija (WHO) 2008. Prema ažuriranoj kliničkoj klasifikaciji PH postoji pet glavnih grupa PH: plućna arterijska hipertenzija (PAH), koja se karakteriše okluzivnim PA koji je ≦15 mm Hg; PH zbog bolesti levog srca (poznate i kao plućna venska hipertenzija ili kongestivna srčana insuficijencija), koju karakteriše okluzivni PA >15 mm Hg; PH zbog plućnih bolesti i/ili hipoksije; hronična tromboembolijska PH; i PH sa nejasnim ili višefaktorskim etiologijama [Simonneau et al., JACC 54 (1): S44-54 (2009); Hill et al., Respiratory Care 54 (7): 958-68 (2009)]. PAH se dalje klasifikuje na idiopatsku PAH (IPAH), sporadičnu bolest kod koje ne postoji porodična istorija PAH niti identifikovani faktor rizika; naslednu PAH; PAH izazvanu lekovima i toksinima; PAH povezanu sa bolestima vezivnog tkiva, HIV infekcijom, portnom hipertenzijom, urođenim srčanim bolestima, šistozomijazom i hroničnom hemolitičkom anemijom; i upornu PH novorođenčadi [Simonneau et al., JACC 54 (1): S44-54 (2009)]. Dijagnoza različitih vrsta PH zahteva niz testova.
[0004] Uopšteno, lečenje PH zavisi od uzroka ili klasifikacije PH. Kada je PH uzrokovana poznatim lekom ili zdravstvenim stanjem, poznata je kao sekundarna PH i njeno lečenje je obično usmereno na osnovnu bolest. Lečenje plućne venske hipertenzije obično uključuje optimizaciju funkcije leve komore davanjem diuretika, beta blokatora i ACE inhibitora ili popravljanjem ili zamenom mitralnog zaliska ili aortnog zaliska. Terapije PAH uključuju plućne vazodilatatore, digoksin, diuretike, antikoagulanse i terapiju kiseonikom. Plućni vazodilatatori ciljno deluju na različite puteve, uključujući put prostaciklina (npr. prostaciklini, uključujući intravenski epoprostenol, potkožni ili intravenski treprostinil i inhalacioni iloprost), put azotnog oksida (npr. inhibitori fosfodiesteraze-5, uključujući sildenafil i tadalafil) i put endotelina-1 (npr. antagonisti receptora za endotelin, uključujući oralni bosentan i oralni ambrisentan) [Humbert, M. Am. J. Respir. Crit. Care Med.179: 650-6 (2009); Hill et al., Respiratory Care 54 (7): 958-68 (2009)]. Međutim, terapije koje su trenutno u upotrebi ne omogućavaju izlečenje PH i ne leče direktno vaskularno remodelovanje i muskularizaciju krvnih sudova koji se nalaze u osnovi bolesti i primećeni su kod mnogih pacijenata sa PH. EP2594280 se odnosi na upotrebu neutralizatora aktivina za lečenje bolesti povezanih sa aberantnom aktivacijom "odbrambenog odgovora domaćina". AU2012244215 se odnosi na postupke i kompozicije koje sadrže polipeptide receptora ActRII za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa abnormalnom aktivnošću proteina ActRII i/ili liganda ActRII, uključujući plućnu bolest.
[0005] Dakle, postoji velika, nezadovoljena potreba za efikasnim terapijama za lečenje plućne hipertenzije. Shodno tome, cilj ovog otkrića je da obezbedi kompozicije za upotrebu u lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili težine PH, posebno lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili ozbiljnosti jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Obim za koji se traži zaštita je definisan u patentnim zahtevima 1-24.
[0007] U tom pogledu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju plućne arterijske hipertenzije, pri čemu kompozicija sadrži efikasnu količinu polipeptida ActRIIA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju plućne arterijske hipertenzije, pri čemu kompozicija sadrži efikasnu količinu polipeptida ActRIIA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39. U jednom slučaju, pacijent ima plućni arterijski pritisak u mirovanju (PAP) od najmanje 25 mm Hg. U sledećem slučaju, kompozicija za upotrebu snižava PAP kod pacijenta; smanjuje hipertrofiju komora kod pacijenta; smanjuje hipertrofiju glatkih mišića kod pacijenta; smanjuje mišićavost plućnih arteriola kod pacijenta; smanjuje plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta; snižava plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta; povećava plućni kapilarni okluzivni pritisak; povećava pritisak na kraju dijastole u levoj komori; povećava kapacitet vežbanja pacijenta; povećava razdaljinu koju pacijent može da pređe za 6 minuta; i/ili snižava Borgov indeks dispneje (BDI) kod pacijenta. U jednom slučaju, pacijent ima plućnu hipertenziju funkcionalne klase II ili klase III, kako je prepoznato od strane Svetske zdravstvene organizacije. U sledećem slučaju, kompozicija za upotrebu sprečava ili odlaže napredovanje funkcionalne klase plućne hipertenzije. U sledećem slučaju, kompozicija za upotrebu podstiče ili povećava regresiju funkcionalne klase plućne hipertenzije. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 32. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U sledećem slučaju, polipeptid se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 32. U jednom slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identično aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39. U sledećem slučaju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39. U sledećem slučaju, polipeptid se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39. U jednom slučaju, polipeptid je deo homodimernog proteinskog kompleksa. U sledećem slučaju, tretman dalje uključuje primenu jednog ili više sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od: vazodilatatora, inhibitora fosfodiesteraze tipa 5, stimulatora rastvorljive guanilat ciklaze, agonista receptora za prostaciklin i antagonista receptora za endotelin. U jednom slučaju, pacijent je lečen jednim ili većim brojem vazodilatatora. U sledećem slučaju, jedan ili više vazodilatatora je odabran iz grupe koja se sastoji od: bosentana, sildenafila, beraprosta, macitentana, seleksipaga, epoprostenola, treprostinila, iloprosta, ambrisentana i tadalafila. U jednom slučaju, polipeptid ActRIIA se vezuje za jedan ili više liganda izabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina A, aktivina B i GDF11.
[0008] Delom, ovde predstavljeni podaci pokazuju da antagonisti (inhibitori) GDF/BMP mogu da se koriste za lečenje plućne hipertenzije. Na primer, pokazano je da rastvorljivi polipeptid ActRIIA i heterodimer ALK4:ActRIIB mogu pojedinačno da se koriste za snižavanje krvnog pritiska, srčane hipertrofije i težine pluća u modelu plućne arterijske hipertenzije (PAH) izazvanom monokrotalinom. Slični pozitivni efekti primećeni su za polipeptid ActRIIA u PAH modelu Sugen hipoksije. Histološka analiza je dalje otkrila da je polipeptid ActRIIA imao iznenađujuće i značajne efekte na smanjenje vaskularnog remodelovanja i muskularizacije krvnih sudova kako u modelu PAH, izazvanom monokrotalinom, tako i u Sugen hipoksiji. Osim toga, i polipeptid ActRIIA i heterodimer ALK4:ActRIIB su iznenađujuće imali veći efekat na ublažavanje različitih komplikacija PAH u poređenju sa sildenafilom, koji je lek odobren za lečenje PAH. Prema tome, ovim otkrićem je ustanovljeno da antagonisti signalnih puteva ActRII (ActRIIA i ActRIIB) mogu da se koriste za redukciju težine plućne hipertenzije. Iako rastvorljivi polipeptidi ActRIIa i heteromultimeri ALK4:ActRIIB mogu da utiču na plućnu hipertenziju preko mehanizma drugačijeg od antagonizma liganda ActRIIA/B, otkriće ipak pokazuje da poželjna terapijska sredstva mogu da budu izabrana na osnovu antagonističke aktivnosti signalizacije putem ActRII. Stoga, u nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za upotrebu različitih antagonista signalizacije putem ActRII za lečenje hipertenzije, posebno plućne hipertenzije, uključujući, na primer, antagoniste koji inhibiraju jedan ili više liganda ActRIIA/B [npr. aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15 i BMP10]; antagoniste koji inhibiraju jedan ili više receptora tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 i ALK5); i antagoniste koji inhibiraju jednu ili više nishodnih signalnih komponenti (npr. Smad proteini kao što su Smad 2 i 3). Kako se ovde koristi, takvi signalni antagonisti se zajedno nazivaju "antagonisti GDF/BMP" ili "inhibitori GDF/BMP". Prema tome, otkriće delom obezbeđuje kompozicije antagonista GDF/BMP i kompozicije za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije (npr. PAH), posebno lečenje jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr. povišeni krvni pritisak, hipertrofija srca, vaskularno remodelovanje, i muskularizacija sudova). Antagonisti GDF/BMP za upotrebu u skladu sa postupcima i upotrebama otkrića uključuju, na primer, zamke za ligande (npr. rastvorljive polipeptide ActRIIA, polipeptide ActRIIB, heterodimere ALK4:ActRIIB, polipeptide folistatina i polipeptide FLRG), antagoniste antitela, antagoniste malih molekula i antagoniste nukleotida. Opciono, antagonisti GDF/BMP mogu da se koriste u kombinaciji sa jednom ili više suportivnih terapija i/ili dodatnih aktivnih sredstava za lečenje plućne hipertenzije.
[0009] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju plućne arterijske hipertenzije, koje uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine polipeptida ActRIIA. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% (npr., najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) identična aminokiselinskoj sekvenci koja započinje na bilo kojoj od aminokiselina 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 SEQ ID NO: 9 i završava se bilo kojom od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135 SEQ ID NO: 9. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% (npr. najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% (npr. najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA je fuzioni protein koji sadrži domen ActRIIA i jedan ili više polipeptidnih domena heterolognih sa ActRIIA. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA je fuzioni protein koji sadrži Fc domen imunoglobulina. U nekim slučajevima, Fc domen imunoglobulina je Fc domen IgG1 imunoglobulina. U nekim slučajevima, fuzioni protein ActRIIA dalje sadrži domen linkera pozicioniran između polipeptidnog domena ActRIIA i jednog ili više heterolognih domena (npr. Fc domena imunoglobulina). U nekim slučajevima, domen linkera je izabran iz grupe koja se sastoji od: TGGG (SEQ ID NO: 23), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGG (SEQ ID NO: 19), GGGG (SEQ ID NO: 20) i SGGG (SEQ ID NO: 24). U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA je deo homodimernog proteinskog kompleksa. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA je glikozilisan. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA ima obrazac glikozilacije koji se može dobiti ekspresijom u ćeliji jajnika kineskog hrčka. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje plućni arterijski pritisak kod pacijenta. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje plućni arterijski pritisak kod pacijenta za najmanje 10% (npr.
10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili najmanje 80%). U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje hipertrofiju komora kod pacijenta. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje hipertrofiju komora kod pacijenta za najmanje 10% (npr.10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili najmanje 80%). U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje hipertrofiju glatkih mišića kod pacijenta. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje hipertrofiju glatkih mišića kod pacijenta za najmanje 10% (npr. 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili najmanje 80%). U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje mišićavost plućnih arteriola kod pacijenta. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje mišićavost plućnih arteriola kod pacijenta za najmanje 10% (npr.10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili najmanje 80%). U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta. U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta za najmanje 10% (npr. 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili najmanje 80%). U nekim slučajevima, primena polipeptida ActRIIA smanjuje plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta za najmanje 25-30%. U nekim slučajevima, pacijent ima plućnu arterijsku hipertenziju i ima plućnu hipertenziju funkcionalne klase II ili klase III u skladu sa funkcionalnim sistemom klasifikacije plućne hipertenzije Svetske zdravstvene organizacije. U nekim slučajevima, pacijent ima plućnu arterijsku hipertenziju koja je klasifikovana kao jedan ili više podtipova izabranih iz grupe koja se sastoji od: idiopatske ili nasledne plućne arterijske hipertenzije, plućne hipertenzije izazvane lekovima i/ili toksinima, plućne hipertenzije povezane sa bolestima vezivnog tkiva i plućne hipertenzije povezane sa urođenim šantovima između sistemske i plućne cirkulacije najmanje 1 godinu nakon popravke šanta. U nekim slučajevima, pacijent je lečen jednim ili većim brojem vazodilatatora. U nekim slučajevima, pacijent je lečen jednim ili većim brojem sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od: inhibitora fosfodiesteraze tipa 5, stimulatora rastvorljive guanilat ciklaze, agonista receptora za prostaciklin i antagonista receptora za endotelin. U nekim slučajevima, jedno ili više sredstava je izabrano iz grupe koja se sastoji od: bosentana, sildenafila, beraprosta, macitentana, seleksipaga, epoprostenola, treprostinila, iloprosta, ambrisentana i tadalafila. U nekim slučajevima, postupak dalje uključuje primenu jednog ili više vazodilatatora. U nekim slučajevima, postupak dalje uključuje primenu jednog ili više sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od: inhibitora fosfodiesteraze tipa 5, stimulatora rastvorljive guanilat ciklaze, agonista receptora za prostaciklin i antagonista receptora za endotelin. U nekim slučajevima, jedno ili više sredstava je izabrano iz grupe koja se sastoji od: bosentana, sildenafila, beraprosta, macitentana, seleksipaga, epoprostenola, treprostinila, iloprosta, ambrisentana i tadalafila. U nekim slučajevima, razdaljina koju pacijent može da pređe za 6 minuta hoda iznosi od 150 do 400 metara. U nekim slučajevima, postupak povećava razdaljinu koju pacijent može da pređe za 6 minuta hoda za najmanje 10 metara (npr. najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 ili više od 400 metara). U nekim slučajevima, pacijent ima nivo hemoglobina od >8 i <15 g/dl. U nekim slučajevima, postupak odlaže kliničko pogoršanje plućne arterijske hipertenzije. U nekim slučajevima, postupak odlaže kliničko pogoršanje plućne hipertenzije u skladu sa funkcionalnim sistemom klasifikacije plućne hipertenzije Svetske zdravstvene organizacije. U nekim slučajevima, postupak smanjuje rizik od hospitalizacije zbog jedne ili više komplikacija povezanih sa plućnom arterijskom hipertenzijom. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA se vezuju za jedan ili više liganda izabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina A, aktivina B, GDF11, GDF8, BMP10 i BMP6.
[0010] U nekim slučajevima, ovo otkriće se odnosi na postupke za lečenje plućne hipertenzije, koji uključuju davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na postupke za prevenciju plućne hipertenzije, koji uključuju davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na postupke za snižavanje brzine progresije plućne hipertenzije, koji uključuju davanje pacijentu kome je to potrebno, efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju intersticijalne bolesti pluća, koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno, efikasne količine antagonista GDF/BMP, pri čemu antagonist GDF/BMP inhibira jedno ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i ALK7. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju, prevenciji ili snižavanju brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija intersticijalne bolesti pluća, što uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP, pri čemu antagonist GDF/BMP inhibira jedno ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i ALK7. U nekim slučajevima, intersticijalna bolest pluća je idiopatska plućna fibroza. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na postupke za smanjenje težine plućne hipertenzije, koji uključuju davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju jedne ili više komplikacija (npr. proliferacija glatkih mišićnih i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) plućne hipertenzije, koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno, efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u prevenciji jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr. proliferacija glatkih mišićnih i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) koja obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u snižavanju brzine progresije jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr. proliferacija glatkih mišićnih i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) koja obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u smanjenju težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr. proliferacija glatkih mišićnih i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) koja obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP ili kombinacije antagonista GDF/BMP. U određenim poželjnim slučajevima, ovde opisani postupci odnose se na pacijenta koji ima plućnu arterijsku hipertenziju. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci odnose se na pacijenta koji ima plućni arterijski pritisak u mirovanju (PAP) od najmanje 25 mm Hg (npr. najmanje 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mm Hg). U nekim slučajevima, ovde opisani postupci snižavaju PAP kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. Na primer, postupak može da snizi PAP za najmanje 3 mm Hg (na primer, najmanje 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20 ili 25 mm Hg) kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci snižavaju plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci povećavaju plućni kapilarni okluzivni pritisak kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci povećavaju pritisak na kraju dijastole u levoj komori kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci povećavaju (poboljšavaju) sposobnost vežbanja (sposobnost, toleranciju) kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. Na primer, postupak može da poveća razdaljinu koju pacijent može da pređe za 6 minuta hoda kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom, opciono povećavajući razdaljinu tokom 6-minutnog hoda za najmanje 10 metara (npr. najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više metara). Pored toga, postupak može da snizi Borgov indeks dispneje (BDI) kod pacijenta, koji se opciono može proceniti nakon testa 6-minutnog hoda. U nekim slučajevima, postupak snižava Borgov indeks dispneje (BDI) kod pacijenta za najmanje 0.5 indeksnih poena (npr. najmanje 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 ili 10 indeksnih poena). U nekim slučajevima, ovde opisani postupci odnose se na pacijenta koji ima plućnu hipertenziju klase I, klase II, klase III ili klase IV, kao što je prepoznato od strane Svetske zdravstvene organizacije. U nekim slučajevima, ovde opisani postupci odnose se na odlaganje kliničke progresije (pogoršanja) plućne hipertenzije (npr. progresije merene standardom Svetske zdravstvene organizacije). U nekim slučajevima, postupak sprečava ili odlaže napredovanje klase plućne hipertenzije (npr. sprečava ili odlaže progresiju iz klase I u klasu II, klase II u klasu III, ili III klase u klasu IV plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane Svetske zdravstvene organizacije). U nekim slučajevima, postupak podstiče ili povećava regresiju klase plućne hipertenzije (npr. podstiče ili povećava regresiju iz klase IV u klasu III, iz klase III u klasu II, ili iz klase II u klasu I plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane Svetske zdravstvene organizacije). U nekim slučajevima, pacijentu se dodatno daje jedna ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava za lečenje plućne hipertenzije, uz jedan ili više antagonista GDF/BMP. Na primer, pacijentu se takođe može dati jedna ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od: prostaciklina i njegovih derivata (npr. epoprostenol, treprostinil i iloprost); agonista receptora za prostaciklin (npr. seleksipag); antagonista receptora za endotelin (npr. telin, ambrisentan, macitentan i bosentan); blokatora kalcijumskih kanala (npr. amlodipin, diltiazem i nifedipin); antikoagulanasa (npr. varfarin); diuretika; terapije kiseonikom; atrijalne septostomije; plućne tromboendarterektomije; inhibitora fosfodiesteraze tipa 5 (npr. sildenafil i tadalafil); aktivatora rastvorljive guanilat ciklaze, cinaciguat i riociguat); inhibitora ASK-1 (npr. CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-nafto[1,2,3-de]hinilin-2,7-diona, NQDI-1; 2-tiokso-tiazolidina, 5-bromo-3-(4-okso-2-tiokso-tiazolidin-5-iliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona); antagonista NF-κB (npr. dh404, CDDO-epoksida; 2.2-difluoropropionamida; C28 imidazola (CDDO-Im); 2-cijano-3,12-dioksoolean-1,9-dien-28-oične kiseline (CDDO); 3-acetiloleanolne kiseline; 3-triflouroacetiloleanolne kiseline; 28-metil-3-acetiloleanana; 28-metil-3-trifluoroacetiloleanana; 28-metiloksioleanolne kiseline; SZC014; SCZ015; SZC017; PEGilovanih derivata oleanolne kiseline; 3-O-(beta-D-glukopiranozil) oleanolne kiseline; 3-O-(beta-D-glukopiranozil- (1→3)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→2)-beta-D-
1
glukopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→3)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→2)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 3-O-[α-L-ramnopiranozil-(1→3)-beta-D-glukuronopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[alfa-L-ramnopiranozil-(1→3)-beta-D-glukuronopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-β-D-glukopiranozil-oleanolne kiseline; 3-O-β-D-glukopiranozil (1→3)-β-D-glukopiranoziduronske kiseline (CS1); oleanolne kiseline 3-O-β-D-glukopiranozil (1→3)-β-D-glukopiranoziduronske kiseline (CS2); metil 3,11-dioksoolean-12-en-28-olata (DIOXOL); ZCVI4-2; benzil 3-dehidroksi-1,2,5-oksadiazolo [3’, 4’:2,3] oleanolata), transplantacije pluća i/ili srca. U nekim slučajevima, pacijentu se može da se daje i polipeptid BMP9. U nekim slučajevima polipeptid BMP9 je zreli polipeptid BMP9. U nekim slučajevima, polipeptid BMP9 sadrži polipeptid prodomena BMP9. U nekim slučajevima, polipeptid BMP9 se primenjuje u farmaceutskom preparatu, koji opciono može da sadrži polipeptid prodomena BMP9. U takvim farmaceutskim preparatima BMP9, koji sadrže polipeptid prodomena BMP9, polipeptid BMP9 može da bude nekovalentno povezan sa polipeptidom prodomena BMP9. U nekim slučajevima, farmaceutski preparati BMP9 u suštini ne sadrže, ili ne sadrže polipeptid prodomena BMP9. U nekim slučajevima, pacijentu se takođe može davati oleanolna kiselina ili njen derivat.
[0011] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar GDF11 (npr. antagonist GDF11). Efekti na inhibiciju GDF11 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za GDF11. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za GDF11 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju GDF11 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira GDF11, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0012] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar GDF8 (npr. antagonist GDF8). Efekti na inhibiciju GDF8 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za GDF8. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za GDF8 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju GDF8 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira GDF8, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0013] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar GDF3 (npr. antagonist GDF3). Efekti na inhibiciju GDF3 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za GDF3. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za GDF3 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju GDF3 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira GDF3, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0014] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar BMP6 (npr. antagonist BMP6). Efekti na inhibiciju BMP6 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za BMP6. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za BMP6 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju BMP6 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira BMP6, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0015] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar BMP15 (npr. antagonist BMP15). Efekti na inhibiciju BMP15 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za BMP15. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za BMP15 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti
1
GDF/BMP koji inhibiraju BMP15 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira BMP15, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0016] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar BMP10 (npr. antagonist BMP10). Efekti na inhibiciju BMP10 mogu da se odrede, na primer, upotrebom ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da se veže bar za BMP10. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuje se bar za BMP10 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju BMP10 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koja inhibira BMP10, može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0017] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE) (npr. antagonist aktivina). Efekti na inhibiciju aktivina mogu da se odrede, na primer, korišćenjem ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću može da veže bar aktivin. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću se vezuje bar za aktivin sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju aktivin mogu se koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju aktivin, mogu dodatno da inhibiraju jedno ili više od: BMP15 GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jedan ili više Smad (npr. Smad 2 i 3). U određenim poželjnim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar aktivin B. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, u suštini se ne vezuju za aktivin A (npr. vezuju se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili se relativno umereno vezuju, npr. oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M) i/ili inhibiraju aktivnost aktivina A. U određenim poželjnim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar aktivin B, ali se u suštini ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M) i/ili inhibira aktivnost aktivina A.
[0018] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar ActRII (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB) (npr. antagonist ActRII). Efekti na inhibiciju ActRII mogu da se odrede, na primer, korišćenjem ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću mogu da se vežu bar za ActRII. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuju se bar za ActRII sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju ActRII mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri
1
ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju ActRII, mogu dodatno da inhibiraju jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0019] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira bar ALK4 (npr. antagonist ALK4). Efekti na inhibiciju ALK4 mogu da se odrede, na primer, pomoću ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću mogu da se vežu bar za ALK4. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću se vezuju bar za ALK4 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju ALK4 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, mali molekuli, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju ALK4, mogu dodatno da inhibiraju jedno ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0020] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, je sredstvo koje inhibira najmanje ALK5 (npr., antagonist ALK5). Efekti na inhibiciju ALK5 mogu da se odrede, na primer, pomoću ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr. reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonisti GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću mogu da se vezuju bar za ALK5. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja, uključujući one ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću se vezuju za najmanje ALK5 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kao što je ovde opisano, različiti
1
antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju ALK5 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama, uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju ALK5, mogu dodatno da inhibiraju jedan ili više od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK7, ALK4 i jednog ili više Smad (npr. Smad 2 i 3).
[0021] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je sredstvo koje inhibira bar ALK7 (npr., antagonist ALK7). Efekti na inhibiciju ALK7 mogu da se odrede, na primer, pomoću ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr., reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću mogu da se vežu bar za ALK7. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja uključujući ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuju se bar za ALK7 sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kako je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju ALK7 mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju ALK7 može dodatno da inhibira jedno ili više od: aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK4, i jednog ili više Smad (npr., Smad 2 i 3).
[0022] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je sredstvo koje inhibira bar jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). Dejstvo na inhibiciju Smad može da se odredi, na primer, pomoću ćelijskog testa koji uključuje ovde opisane (npr., reporterski test signalizacije Smad). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću mogu da se vežu za bar jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, upotrebom ogleda afiniteta vezivanja uključujući
1
ovde opisane. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, prema otkriću vezuju se bar za jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3) sa KDod najmanje 1 x 10-7 M (npr., najmanje 1 x 10-8 M, najmanje 1 x 10-9 M, najmanje 1 x 10-10 M, najmanje 1 x 10-11 M ili najmanje 1 x 10-12 M). Kako je ovde opisano, različiti antagonisti GDF/BMP koji inhibiraju jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3) mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama uključujući, na primer, zamke za ligande (npr. polipeptidi ActRII, GDF zamke, polipeptidi folistatina, polipeptidi FLRG i heteromultimeri ALK4:ActRIIB), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence i njihove kombinacije. U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP, ili kombinacija antagonista, koji inhibiraju jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3) mogu dodatno da inhibiraju jedno ili više od: aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, i ALK4.
[0023] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je polipeptid ActRII. Pojam "polipeptid ActRII" zajednički se odnosi na prirodne polipeptide ActRIIA i ActRIIB, kao i na skraćene oblike i njihove varijante kao one koje su ovde opisane (npr., polipeptidi GDF zamke). Poželjno polipeptidi ActRII sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od ligand-vezujućeg domena polipeptida ActRII ili njegovog modifikovanog oblika (varijante). Na primer, u nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od ActRIIA ligand-vezujućeg domena polipeptida ActRIIA, na primer, dela vanćelijskog domena ActRIIA. Slično tome, polipeptid ActRIIB može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od ActRIIB ligand-vezujućeg domena polipeptida ActRIIB, na primer, dela vanćelijskog domena ActRIIB. Poželjno, polipeptidi ActRII za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima su rastvorljivi polipeptidi.
[0024] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije koje sadrže polipeptid ActRIIA i njegove upotrebe. Na primer, u nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiselina 30-110 u SEQ ID NO: 9. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIA koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 21-30 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30) u SEQ ID NO: 9 i završava na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 110-135 (npr., završava na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114,
1
115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, ili 135) u SEQ ID NO: 9. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 36. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39.
[0025] U drugim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije koje sadrže polipeptid ActRIIB i njegove upotrebe. Na primer, u nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiselina 29-109 u SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiselina 29-109 u SEQ ID NO: 1, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu [prirodnu (E ili D) ili veštačku kiselu aminokiselinu] na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiselina 25-131 u SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiselina 25-131 u SEQ ID NO: 1, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%,
1
85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci koja počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29 u SEQ ID NO: 1 i završava na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci koja počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29 u SEQ ID NO: 1 i završava na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO: 1, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili
2
100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 4. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 5. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 5, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 5. U drugim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 6. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 40. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 42. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 45. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 46, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 48. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 48, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 69. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 74. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 74, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 77. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 77, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 78. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 78, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U sledećim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 79. U nekim slučajevima, polipeptid ActRIIB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 79, pri čemu polipeptid ActRIIB sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1.
U određenim slučajevima, polipeptidi ActRIIB za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama ne sadrže kiselu aminokiselinu na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1.
[0026] Kako je ovde opisano, polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4 i njihove varijante (GDF zamke) mogu da budu homomultimeri, na primer, homodimer, homotrimeri, homotetrameri, homopentameri i homomultimerni kompleksi višeg reda. U određenim poželjnim slučajevima, polipeptidi ActRII i njihove varijante su homodimeri. U određenim slučajevima, polipeptidni dimeri ActRII koji su ovde opisani sadrže prvi polipeptid ActRII kovalentno, ili nekovalentno, povezan sa drugim polipeptidom ActRII, pri čemu prvi polipeptid sadrži domen ActRII i aminokiselinsku sekvencu prvog člana (ili drugog člana) interagujućeg para (npr., konstantni domen imunoglobulina), a drugi polipeptid sadrži polipeptid ActRII i aminokiselinsku sekvencu drugog člana (ili prvog člana) interagujućeg para.
[0027] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je heteromultimer ALK4:ActRIIB. Kako je ovde opisano, otkriveno je da heterodimerni proteinski kompleks ALK4:ActRIIB ima drugačiji profil/selektivnost vezivanja liganda u poređenju sa odgovarajućim homodimerima ActRIIB i ALK4. Konkretno, heterodimer ALK4:ActRIIB ispoljava poboljšano vezivanje za aktivin B u poređenju sa homodimerom, zadržava snažno vezivanje za aktivin A, GDF8 i GDF11 kakvo je zapaženo kod homodimera ActRIIB, i ispoljava suštinski smanjeno vezivanje za BMP9, BMP10 i GDF3. Konkretno, BMP9 ispoljava nizak do neuočljiv afinitet za heterodimer ALK4:ActRIIB, dok se ovaj ligand snažno vezuje za homodimer ActRIIB. Kao i homodimer ActRIIB, heterodimer ALK4:ActRIIB zadržava vezivanje intermedijarnog nivoa za BMP6. Videti sliku 19. Ovi rezultati prema tome pokazuju da su heterodimeri ALK4:ActRIIB selektivniji antagonisti (inhibitori) aktivina A, aktivina B, GDF8 i GDF11, u poređenju sa homodimerima ActRIIB. Prema tome, heterodimer ALK4:ActRIIB biće korisniji od homodimera ActRIIB u određenim primenama gde takav selektivni antagonizam predstavlja prednost. Primeri uključuju terapijske primene u kojima je poželjno zadržati antagonizam jednog ili više aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin AC), GDF8 i GDF11, ali svesti na najmanju meru antagonizam jednog ili više od BMP9, BMP10 i GDF3. Osim toga, pokazano je da heterodimer ALK4:ActRIIB leči PAH kod pacijenta. Bez želje za vezivanjem za određeni mehanizam delovanja, očekuje se da će heteromultimeri ALK4:ActRIIB, kao i njihove varijante, koje se vezuju za najmanje jedan ili više aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, i aktivin AC), GDF8 i/ili GDF11 biti korisna sredstva za podsticanje blagotvornih dejstava kod pacijenata sa PAH.
2
[0028] Prema tome, predmetno otkriće obezbeđuje heteromultimerne komplekse (heteromultimere) koji sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 i najmanje jedan polipeptid ActRIIB (heteromultimeri ALK4:ActRIIB) kao i njihove upotrebe. Poželjno, polipeptidi ALK4 sadrže ligand-vezujući domen receptora ALK4, na primer, deo vanćelijskog domena ALK4. Slično tome, polipeptidi ActRIIB uopšteno sadrže ligand-vezujući domen receptora ActRIIB, na primer, deo vanćelijskog domena ActRIIB. Poželjno je da takvi polipeptidi ALK4 i ActRIIB, kao i njihovi rezultujući heteromultimeri budu rastvorljivi.
[0029] U određenim slučajevima, heteromultimer ALK4:ActRIIB sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 34-101 u SEQ ID NO: 100. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 101. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 105. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 122. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 124. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 116. U sledećim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 117. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 111. U sledećim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ALK4 koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 113.
[0030] U određenim slučajevima, heteromultimer ALK4:ActRIIB sadrži aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 2. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 3. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 5. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 6. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 118. U sledećim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 120 U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 114. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 115. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 108. U drugim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu ActRIIB koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 110. U određenim poželjnim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB ne sadrže polipeptid ActRIIB koji sadrži kiselu aminokiselinu (npr., E ili D) na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1.
2
[0031] Kako je ovde opisano, heteromultimerne strukture ALK4:ActRIIB uključuju, na primer, heterodimere, heterotrimere, heterotetramere, heteropentamere, i heteromultimerne komplekse višeg reda. Videti, npr., slike 21-23. U određenim poželjnim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB su heterodimeri. U određenim slučajevima, polipeptidi ALK4 i/ili ActRIIB mogu da budu fuzioni proteini.
[0032] U određenim slučajevima, polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4, uključujući njihove varijante (npr., GDF zamke), mogu da budu fuzioni proteini. Na primer, u nekim slučajevima, polipeptid ActRII (ili ALK4) može da bude fuzioni protein koji sadrži polipeptidni domen ActRII (ili ALK4) i jedan ili više heterologih (ne-ActRII) polipeptidnih domena. U nekim slučajevima, polipeptid ActRII (ili ALK4) može da bude fuzioni protein koji ima, kao jedan domen, aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida ActRII (ili ALK4) (npr., ligandvezujući domen receptora ActRII (ili ALK4) ili njegovu varijantu) i jedan ili više heterologih domena koji obezbeđuju željeno svojstvo, kao što je poboljšana farmakokinetika, lakše prečišćavanje, usmerenost na određena tkiva, itd. Na primer, domen fuzionog proteina može da poboljša jedno ili više od stabilnosti in vivo, polu-života in vivo, preuzimanja/primene, lokalizacije ili raspodele u tkivu, obrazovanja proteinskih kompleksa, multimerizacije fuzionog proteina, i/ili prečišćavanja. Opciono, polipeptidni domen ActRII (ili ALK4) fuzionog proteina direktno je spojen (fuzionisan) sa jednim ili više heterologih polipeptidnih domena, ili umetnuta sekvenca, kao što je linker, može da bude postavljena između aminokiselinske sekvence polipeptida ActRII (ili ALK4) i aminokiselinske sekvence jednog ili više heterologih domena. U određenim slučajevima, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) sadrži relativno nestrukturirani linker postavljen između heterologog domena i domena ActRII (ili ALK4). Nestrukturirani linker može da odgovara nestrukturiranom regionu od otprilike 15 aminokiselina na C-kraju vanćelijskog domena ActRII (ili ALK4), ili to može da bude veštačka sekvenca između 3 i 15, 20, 30, 50 ili više aminokiselina koje su relativno lišene sekundarne strukture. Linker može da bude bogat glicinskim i/ili prolinskim ostacima i može, na primer, da sadrži ponavljajuće sekvence treonin/serin i glicina. Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na sekvence TGGG (SEQ ID NO: 23), SGGG (SEQ ID NO: 24), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGG (SEQ ID NO: 20), i GGG (SEQ ID NO: 19). U nekim slučajevima, fuzioni proteini ActRII (ili ALK4) mogu da sadrže konstantni domen imunoglobulina, uključujući, na primer, Fc deo imunoglobulina. Na primer, aminokiselinska sekvenca koja potiče od Fc domena IgG (IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4), IgA (IgA1 ili IgA2), IgE, ili IgM imunoglobulina. Na primer, Fc deo imunoglobulinskog domena može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%,
2
85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 14-18. Takvi imunoglobulinski domeni mogu da sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr., delecije, adicije i/ili supstitucije) koje doprinose izmenjenoj aktivnosti Fc, npr., smanjenju jedne ili više efektorskih funkcija Fc. U nekim slučajevima, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u formuli A-B-C. Na primer, B deo je N- i C-terminalno skraćeni polipeptid ActRII (ili ALK4), npr., kako je ovde opisano. A i C delovi mogu da budu nezavisno nula, jedna, ili više od jedne aminokiseline, i oba A i C dela su heterologa u odnosu na B. Delovi A i/ili C mogu da budu vezani za B deo preko sekvence linkera. U određenim slučajevima, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) sadrži vodeću sekvencu. Vodeća sekvenca može da bude nativna vodeća sekvenca ActRII (ili ALK4) ili heterologa vodeća sekvenca. U određenim slučajevima, vodeća sekvenca je vodeća sekvenca tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) (npr., SEQ ID NO: 34).
[0033] Polipeptid ActRII ili polipeptid ALK4, uključujući njihove varijante, može da sadrži podsekvencu za prečišćavanje, kao što je epitopska oznaka, FLAG oznaka, polihistidinska sekvenca i GST fuzija. Opciono, polipeptid ActRII ili polipeptid ALK4 sadrži jedan ili više modifikovanih aminokiselinskih ostataka odabranih od: glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilisane aminokiseline, i/ili aminokiseline konjugovane sa lipidnim fragmentom. Polipeptidi ActRII i polipeptidi ALK4 mogu da sadrže najmanje jedan N-vezani šećer, i mogu da uključuju dva, tri ili više N-vezanih šećera. Takvi polipeptidi mogu takođe da sadrže O-vezane šećere. Uopšteno, poželjno je da polipeptidi ActRII i ALK4 budu eksprimirani u sisarskoj ćelijskoj liniji koja posreduje u pogodnoj prirodnoj glikozilaciju polipeptida kako bi se smanjila verovatnoća nepovoljnog imunološkog odgovora kod pacijenta. Polipeptidi ActRII i ALK4 mogu da budu proizvedeni u različitim ćelijskim linijama koje glikoziluju protein na način koji je pogodan za upotrebu kod pacijenta, uključujući konstruisane ćelije insekata ili kvasca, i sisarske ćelije poput COS ćelija, CHO ćelija, HEK ćelija i NSO ćelija. U nekim slučajevima, polipeptid ActRII ili ALK4 je glikozilisan i ima obrazac glikozilacije koji se može dobiti u ćelijskoj liniji jajnika kineskog hrčka. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRII ili ALK4 otkrića ispoljavaju serumski polu-život od najmanje 4, 6, 12, 24, 36, 48, ili 72 časa kod sisara (npr., miša ili čoveka). Opciono, polipeptidi ActRII ili ALK4 mogu da ispoljavaju serumski polu-život od najmanje 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, ili 30 dana kod sisara (npr., miša ili čoveka).
[0034] U određenim slučajevima, otkriće obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže jedan ili više antagonista GDF/BMP predmetnog otkrića i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski
2
preparat može takođe da sadrži jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava poput jedinjenja koje se koristi za lečenje plućne hipertenzije, posebno za lečenje ili prevencija jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr., proliferacija glatkih mišićnih i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) uključujući, na primer, vazodilatatore kao prostaciklin, epoprostenol i sildenafil; antagoniste receptora za endotelin kao bosentan; blokatore kalcijumskih kanala kao amlodipin, diltiazem i nifedipin; antikoagulanse kao varfarin; diuretike; polipeptide BMP9; polipeptide BMP10; bardoksolon metil; i oleanolnu kiselinu. Uopšteno, farmaceutski preparat će poželjno biti bez pirogena (što znači bez pirogena u meri u kojoj to zahtevaju propisi koji uređuju kvalitet proizvoda za terapijsku upotrebu).
[0035] U određenim slučajevima, pri primeni antagonista GDF/BMP ili kombinacija antagonista prema otkriću kod ovde opisanih poremećaja ili stanja, može da bude poželjno praćenje efekata na crvena krvna zrnca tokom primene antagonista GDF/BMP, ili određivanje ili podešavanje doziranja antagonista GDF/BMP, kako bi se smanjili neželjeni efekti na crvena krvna zrnca. Na primer, povećanje nivoa crvenih krvnih zrnaca, hemoglobina ili hematokrita može da prouzrokuje neželjena povećanja krvnog pritiska.
[0036] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP za upotrebu u skladu sa postupcima i upotrebama ovog otkrića je antitelo ili kombinacija antitela. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za ActRII (ActRIIA i/ili ActRIIB). U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ActRII inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ActRII inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP, receptora tipa I ili ko-receptora za ActRII. U određenim slučajevima antitelo koje se vezuje za ActRII inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP za ActRII odabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 i GDF3. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za ALK4. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK4 inhibira signalizaciju ALK4, opciono mereno u testu na bazi ćelija, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK4 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP, receptora tipa II ili ko-receptora za ALK4. U određenim slučajevima antitelo koje se vezuje za ALK4 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP za ALK4 odabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 i GDF3. U nekim
2
slučajevima, antitelo se vezuje bar za ALK5. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK5 inhibira signalizaciju ALK5, opciono mereno u testu na bazi ćelija, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK5 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP, receptora tipa II ili ko-receptora za ALK5. U određenim slučajevima antitelo koje se vezuje za ALK5 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP za ALK5 odabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 i GDF3. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za ALK7. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK7 inhibira signalizaciju ALK7, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za ALK7 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP, receptora tipa II ili ko-receptora za ALK7. U određenim slučajevima antitelo koje se vezuje za ALK7 inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP za ALK7 odabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 i GDF3. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za GDF11. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF11 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF11 inhibira vezivanje GDF11-ActRII i/ili GDF11-ALK (npr. vezivanje GDF11-ALK4, GDF11-ALK5 i/ili GDF11-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za GDF8. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF8 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF8 inhibira vezivanje GDF8-ActRII i/ili vezivanje GDF8-ALK (npr. vezivanje GDF8-ALK4, GDF8-ALK5 i/ili GDF8-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za BMP6. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP6 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP6 inhibira vezivanje BMP6-ActRII i/ili vezivanje BMP6-ALK (npr. vezivanje BMP6-ALK4, BMP6-ALK5 i/ili BMP6-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za BMP15. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP15 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP15 inhibira vezivanje BMP15-ActRII i/ili BMP15-ALK (npr. vezivanje BMP15-ALK4, BMP15-ALK5 i/ili BMP15-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za GDF3. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF3 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za GDF3 inhibira vezivanje
2
GDF3-ActRII i/ili GDF3-ALK (npr. vezivanje GDF3-ALK4, GDF3-ALK5 i/ili GDF3-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje bar za BMP10. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP10 inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za BMP10 inhibira vezivanje BMP10-ActRII i/ili BMP10-ALK (npr. vezivanje BMP10-ALK4, BMP10-ALK5 i/ili BMP10-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE). U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE) inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćeliji na bazi testa kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE) inhibira vezivanje aktivin-ActRII i/ili vezivanje aktivin-ALK (npr. vezivanje aktivin-ALK4, aktivin-ALK5 i/ili aktivin-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za aktivin B. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za aktivin B inhibira signalizaciju ActRII, opciono mereno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. U određenim slučajevima, antitelo koje se vezuje za aktivin B inhibira vezivanje aktivin B-ActRII i/ili vezivanje aktivin B-ALK (npr. vezivanje aktivin B-ALK4, aktivin B-ALK5 i/ili aktivin B-ALK7). U nekim slučajevima, antitelo je multispecifično antitelo ili kombinacija multispecifičnih antitela koja se vezuje za jedno ili više od ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, GDF11, GDF8, aktivina, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15. U određenim slučajevima multispecifično antitelo ili kombinacija multispecifičnih antitela inhibiraju signalizaciju u ćelijskom testu jednog ili više od: ActRIIB, GDF11, GDF8, aktivina, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15. U nekim slučajevima, antitelo je himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo. U nekim slučajevima, antitelo je jednolančano antitelo, fragment F(ab')2, jednolančano dijatelo, tandemski jednolančani Fv fragment, tandemsko jednolančano dijatelo, ili fuzioni protein koji sadrži jednolančano dijatelo i najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.
[0037] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP je inhibitor malog molekula ili kombinacija inhibitora malog molekula. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje ActRII (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB). U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje ALK4. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje ALK5. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje ALK7. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje GDF11. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje GDF8. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje BMP6. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje BMP15. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje BMP10. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje GDF3. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE). U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje aktivina B. U nekim slučajevima, inhibitor malog molekula je inhibitor najmanje jednog ili većeg broja Smad proteina (npr. Smad 2 i 3).
[0038] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP je inhibitor na bazi nukleinske kiseline ili kombinacija inhibitora na bazi nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje ActRII (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB). U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje ALK4. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje ALK5. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje ALK7. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje GDF11. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje GDF8. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje BMP6. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje BMP15. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje BMP10. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje GDF3. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje aktivina (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i aktivin BE). U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje aktivina B. U nekim slučajevima, inhibitor na bazi nukleinske kiseline je inhibitor najmanje jednog ili više Smad proteina (npr. Smad 2 i 3).
[0039] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP je polipeptid folistatin. U nekim slučajevima, polipeptid folistatin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 26. U nekim slučajevima, polipeptid folistatin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 27. U nekim slučajevima, polipeptid folistatin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična
1
aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 28. U nekim slučajevima, polipeptid folistatin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 29. U nekim slučajevima, polipeptid folistatin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 30.
[0040] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP je polipeptid FLRG. U nekim slučajevima, polipeptid FLRG sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0041]
Na slici 1 prikazano je poravnanje vanćelijskih domena humanog ActRIIB (SEQ ID NO: 2) i humanog ActRIIA (SEQ ID NO: 10) sa ostacima za koje je ovde zaključeno, na osnovu kompozitne analize višestrukih kristalnih struktura ActRIIB i ActRIIA, da su u direktnom kontaktu sa ligandom označenim pravougaonicima.
Na slici 2 prikazano je višestruko poravnavanje sekvenci različitih proteina ActRIIB kičmenjaka (SEQ ID NO: 53-58) i humanog ActRIIA (SEQ ID NO: 59), kao i konsenzusna sekvenca ActRII izvedena iz poravnanja (SEQ ID NO: 60).
Na slici 3 prikazano je višestruko poravnavanje sekvenci različitih proteina ActRIIA kičmenjaka i humanog ActRIIA (SEQ ID NO: 61-68).
Na slici 4 prikazano je višestruko poravnavanje sekvenci Fc domena iz humanih IgG izotipova primenom Clustal 2.1. Regioni zgloba označeni su tačkastim podvlačenjem. Dvostruko podvlačenje označava primere pozicija konstruisanih u Fc IgG1 da bi se podstaklo asimetrično uparivanje lanca i odgovarajuće pozicije u odnosu na druge izotipove IgG2, IgG3 i IgG4.
Na slici 5 prikazano je prečišćavanje ActRIIA-hFc eksprimiranog u CHO ćelijama. Protein se prečišćava kao jedan, dobro definisan pik, vizuelno prikazan pomoću kolone za određivanje veličine (gornji panel) i Coomassie obojenog SDS-PAGE (donji panel) (leva traka: standardi molekularne težine; desna traka: ActRIIA-hFc).
Na slici 6 prikazano je vezivanje ActRIIA-hFc za aktivin (gornji panel) i GDF-11 (donji panel), mereno Biacore™ testom.
2
Na slici 7 prikazana je cela, neobrađena aminokiselinska sekvenca ActRIIB(25-131)-hFc (SEQ ID NO: 69). Podvučeni su vodeća sekvenca TPA (ostaci 1-22) i dvostruko skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (ostaci 24-131, koristeći numerisanje zasnovano na nativnoj sekvenci u SEQ ID NO: 1). Istaknut je glutamat za koji je sekvenciranjem otkriveno da je N-terminalna aminokiselina zrelog fuzionog proteina, koji je na poziciji 25 u odnosu na SEQ ID NO: 1.
Na slikama 8A i 8B prikazana je nukleotidna sekvenca koja kodira ActRIIB(25-131)-hFc (kodirajući lanac je prikazan na vrhu, SEQ ID NO: 70, a komplementarni lanac je prikazan na dnu u smeru 3’-5’, SEQ ID NO: 71). Sekvence koje kodiraju vodeću sekvencu TPA (nukleotidi 1-66) i vanćelijski domen ActRIIB (nukleotidi 73-396) su podvučene. Takođe je prikazana odgovarajuća aminokiselinska sekvenca ActRIIB (25-131).
Na slikama 9A i 9B prikazana je alternativna nukleotidna sekvenca koja kodira ActRIIB(25-131)-hFc (kodirajući lanac je prikazan na vrhu, SEQ ID NO: 72, a komplementarni lanac je prikazan na dnu u smeru 3’-5’, SEQ ID NO: 73). Ova sekvenca daje veći nivo ekspresije proteina u početnim transformantima, čineći razvoj ćelijske linije bržim postupkom. Sekvence koje kodiraju vodeću sekvencu TPA (nukleotidi 1-66) i vanćelijski domen ActRIIB (nukleotidi 73-396) su podvučene, a supstitucije u nukleotidnoj sekvenci divljeg tipa ECD (videti sliku 8) su istaknute. Prikazana je i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca ActRIIB (25-131).
Na slici 10 prikazana je potpuna aminokiselinska sekvenca GDF zamke ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (SEQ ID NO: 74), uključujući vodeću sekvencu TPA (dvostruko podvučeno), vanćelijski domen ActRIIB (ostaci 20-134 u SEQ ID NO: 1; jednostruko podvučeno) i hFc domen. Aspartat supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i istaknut, kao i glicin za koji je sekvenciranjem otkriveno da je N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Na slikama 11A i 11B prikazana je nukleotidna sekvenca koja kodira ActRIIB(L79D 20-134)-hFc. SEQ ID NO: 75 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 76 odgovara antisens lancu. Vodeća sekvenca TPA (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučena, a vanćelijski domen ActRIIB (nukleotidi 76-420) je jednostruko podvučen.
Na slici 12 prikazana je cela aminokiselinska sekvenca za skraćenu GDF zamku ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (SEQ ID NO: 77), uključujući vodeću sekvencu TPA (dvostruko podvučeno), skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO : 1; jednostruko podvučeno) i hFc domen. Aspartat supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i istaknut, kao i glutamat za koji je sekvenciranjem otkriveno da je N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Na slici 13 prikazana je aminokiselinska sekvenca skraćene GDF zamke ActRIIB (L79D 25-131)-hFc bez vodeće sekvence (SEQ ID NO: 78). Skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1) je podvučen. Aspartat supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i istaknut, kao i glutamat za koji je sekvenciranjem utvrđeno da predstavlja N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Na slici 14 prikazana je aminokiselinska sekvenca skraćene GDF zamke ActRIIB (L79D 25-131) bez vodeće sekvence, hFc domena i linkera (SEQ ID NO: 79). Aspartat supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je podvučen i istaknut, kao i glutamat za koji je sekvenciranjem utvrđeno da predstavlja N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Na slikama 15A i 15B prikazana je sekvenca nukleotida koja kodira ActRIIB (L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 80 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 81 odgovara antisens lancu. Vodeća sekvenca TPA (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučena, a skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (nukleotidi 76-396) je jednostruko podvučen. Takođe je prikazana aminokiselinska sekvenca vanćelijskog domena ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1).
Na slikama 16A i 16B prikazana je alternativna nukleotidna sekvenca koja kodira ActRIIB (L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 82 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 83 odgovara antisens lancu. Vodeća sekvenca TPA (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučena, skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (nukleotidi 76-396) je podvučen, a supstitucije u nukleotidnoj sekvenci divljeg tipa vanćelijskog domena su dvostruko podvučene i istaknute (uporediti sa SEQ ID NO: 81, slika 15). Takođe je prikazana aminokiselinska sekvenca vanćelijskog domena ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1).
Na slici 17 prikazani su nukleotidi 76-396 (SEQ ID NO: 84) alternativne nukleotidne sekvence prikazane na slici 16 (SEQ ID NO: 82). Iste supstitucije nukleotida naznačene na slici 16 takođe su ovde podvučene i istaknute. SEQ ID NO: 84 kodira samo skraćeni vanćelijski domen ActRIIB (koji odgovara ostacima 25-131 u SEQ ID NO: 1) sa supstitucijom L79D, npr. ActRIIB (L79D 25-131).
Na slici 18 prikazano je višestruko poravnavanje sekvenci različitih proteina ALK4 kičmenjaka i humanog ALK4 (SEQ ID NO: 126-132).
Na slici 19 prikazani su uporedni podaci o vezivanju liganda za heterodimerni proteinski kompleks ALK4-Fc:ActRIIB-Fc u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc i homodimerom ALK4-Fc. Za svaki proteinski kompleks, ligandi se rangiraju na osnovu koff, kinetičke konstante koja dobro korelira sa inhibicijom signalizacije liganda, i navedeni su u opadajućem redosledu afiniteta vezivanja (ligandi koji su najsnažnije vezani navedeni su na vrhu). Levo, žute, crvene, zelene i plave linije označavaju veličinu konstante brzine disocijacije. Pune crne linije označavaju ligande čije je vezivanje za heterodimer poboljšano ili nepromenjeno u poređenju sa homodimerom, dok isprekidane crvene linije ukazuju na značajno smanjeno vezivanje u poređenju sa homodimerom. Kao što je prikazano, heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc pokazuje pojačano vezivanje za aktivin B u poređenju sa bilo kojim homodimerom, zadržava snažno
4
vezivanje za aktivin A, GDF8 i GDF11 kakvo je zapaženo kod homodimera ActRIIB-Fc i pokazuje značajno smanjeno vezivanje za BMP9, BMP10 i GDF3. Kao i homodimer ActRIIB-Fc, i heterodimer zadržava vezivanje srednjeg nivoa za BMP6.
Na slici 20 prikazani su uporedni podaci o IC50za heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc/homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc određeno primenom testa reporterskog gena A-204 kako je ovde opisano. Heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc inhibira signalne puteve aktivina A, aktivina B, GDF8 i GDF11 slično kao homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Međutim, inhibicija signalnih puteva BMP9 i BMP10 heterodimerom ALK4-Fc:ActRIIB-Fc značajno je smanjena u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Ovi podaci pokazuju da su heterodimeri ALK4:ActRIIB selektivniji antagonisti aktivina A, aktivina B, GDF8 i GDF11 u odnosu na odgovarajuće homodimere ActRIIB:ActRIIB.
Na slikama 21A i 21B prikazana su dva šematska primera heteromernih proteinskih kompleksa koji sadrže polipeptide receptora tipa I i receptora tipa II. Na slici 21A prikazan je heterodimerni proteinski kompleks koji sadrži jedan fuzioni polipeptid receptora tipa I i jedan fuzioni polipeptid receptora tipa II, koji mogu kovalentno ili nekovalentno da se sklope preko multimerizacionog domena koji se nalazi unutar svakog polipeptidnog lanca. Dva sklopljena multimerizaciona domena čine interagujući par, koji može da bude usmeren ili neusmeren. Na slici 21B prikazan je heterotetramerni proteinski kompleks koji sadrži dva heterodimerna kompleksa kao što je prikazano na slici 21A. Mogu se predvideti kompleksi višeg reda.
Na slikama 22 pokazan je šematski primer heteromernog proteinskog kompleksa koji sadrži polipeptid receptora tipa I (označen kao „I“) (npr. polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan vanćelijskom domenu proteina ALK4 kod ljudi ili drugih vrsta kao što su ovde opisane) i polipeptid receptora tipa II (naznačen kao „II“) (npr. polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan vanćelijskom domenu proteina ActRIIB kod ljudi ili drugih vrsta kao što su ovde opisane). U ilustrovanim slučajevima, polipeptid receptora tipa I je deo fuzionog polipeptida koji sadrži prvi član interagujućeg para ("Ci"), a polipeptid receptora tipa II deo je fuzionog polipeptida koji sadrži drugi član interagujućeg para („C2“). U svakom fuzionom polipeptidu, linker može da bude postavljen između polipeptida receptora tipa I ili tipa II i odgovarajućeg člana interagujućeg para. Prvi i drugi član interagujućeg para mogu da budu usmereni (asimetrični) par, što znači da se članovi para preferencijalno povezuju jedni s drugima, umesto da se samo-udružuju, ili interagujući par može da bude neusmeren, što znači da članovi para mogu da se udružuju jedni sa drugima, ili da se samo-udružuju bez suštinskih preferencija i mogu da imaju iste ili različite aminokiselinske sekvence. Tradicionalni Fc fuzioni proteini i antitela primeri su neusmerenih interagujućih parova, dok su razni konstruisani Fc domeni dizajnirani kao usmereni (asimetrični) interagujući parovi [npr. Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].
Na slikama 23A-23D prikazani su šematski primeri heteromernih proteinskih kompleksa koji sadrže polipeptid ALK4 (npr. polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97 %, 98%, 99% ili 100% identičan vanćelijskom domenu proteina ALK4 kod ljudi ili drugih vrsta kao što su ovde opisane) i polipeptid ActRIIB (npr. polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan vanćelijskom domenu proteina ActRIIB kod ljudi ili drugih vrsta kao što su one ovde opisane). U ilustrovanim primerima, polipeptid ALK4 je deo fuzionog polipeptida koji sadrži prvi član interagujućeg para ("Ci"), a polipeptid ActRIIB deo je fuzionog polipeptida koji sadrži drugi član interagujućeg para ("C2"). Pogodni interagujući parovi uključuju, na primer, interagujuće parove teškog lanca i/ili lakog lanca imunoglobulina, njihove skraćene oblike i varijante, kao što je ovde opisano [npr. Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. U svakom fuzionom polipeptidu, linker može da bude postavljen između polipeptida ALK4 ili ActRIIB i odgovarajućeg člana interagujućeg para. Prvi i drugi član interagujućeg para mogu da budu neusmereni, što znači da članovi para mogu međusobno da se udružuju, ili da se samo-udružuju bez značajnih preferencija i mogu da imaju iste ili različite aminokiselinske sekvence. Videti sliku 23A. Alternativno, interagujući par može da bude usmereni (asimetrični) par, što znači da se članovi para preferencijalno povezuju jedni s drugima, umesto da se samoudružuju. Videti sliku 23B. Mogu se predvideti kompleksi višeg reda. Videti slike 23C i 23D.
DETALJAN OPIS
1. Pregled
[0042] Superfamiliju TGF-β čini preko 30 sekretovanih faktora uključujući TGF-beta, aktivine, nodale, koštane morfogenetske proteine (BMPs), faktore rasta i diferencijacije (GDFs) i anti-Milerov hormon (AMH) [Weiss et al. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. Članovi superfamilije, koji su nađeni i kod kičmenjaka i kod beskičmenjaka, sveprisutno su eksprimirani u različitim tkivima i funkcionišu tokom najranijih faza razvoja tokom životnog veka životinje. Zapravo, proteini superfamilije TGF-β ključni su posrednici samoobnavljanja matičnih ćelija, gastrulacije, diferencijacije, morfogeneze organa i homeostaze adultnih tkiva. U skladu sa ovom sveprisutnom aktivnošću, poremećena signalizacija superfamilije TGF-beta povezana je sa širokim spektrom patologija kod ljudi, uključujući, na primer, autoimune bolesti, kardiovaskularne bolesti, fibrozu i kancer.
[0043] Ligandi superfamilije TGF-beta dele istu dimernu strukturu u kojoj se centralna spirala od 3-1/2 zavoja jednog monomera smešta uz udubljenu površinu koju formiraju beta-lanci drugog monomera. Većina članova familije TGF-beta su dodatno stabilizovani međumolekulskom disulfidnom vezom. Ova disulfidna veza prolazi kroz prsten formiran pomoću druge dve disulfidne veze stvarajući motiv nazvan „cisteinski čvor“ [Lin et al. (2006) Reproduction 132: 179-190; i Hinck et al. (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].
[0044] Signalizacija superfamilije TGF-beta je posredovana heteromernim kompleksima receptora serin/treonin kinaze tipa I i tipa II, koji fosforilišu i aktiviraju nishodne SMAD proteine (npr. SMAD proteini 1, 2, 3, 5 i 8) nakon stimulacije ligandom [Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]. Ovi receptori tipa I i tipa II su transmembranski proteini, sačinjeni od vanćelijskog domena koji vezuje ligand sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatskog domena sa predviđenom specifičnošću za serin/treonin kinazu. Uopšteno, receptori tipa I posreduju u unutarćelijskoj signalizaciji, dok su receptori tipa II potrebni za vezivanje liganada TGF-beta superfamilije. Receptori tipa I i II formiraju stabilan kompleks nakon vezivanja liganda, što rezultira fosforilacijom receptora tipa I receptorima tipa II.
[0045] Familija TGF-beta može da se podeli u dve filogenetske grane na osnovu receptora tipa I koje vezuju i Smad proteina koje aktiviraju. Jedna je grana koja je skorije evoluirala, koja uključuje, na primer, TGF-beta, aktivine, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 i nodal, koji signaliziraju preko receptora tipa I koji aktiviraju Smad 2 i 3 [Hinck (2012) FEBS Letters 586 : 1860-1870]. Druga grana obuhvata manje srodne proteine superfamilije i uključuje, na primer, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6 i GDF7, koji prenose signale preko Smad 1, 5 i 8.
[0046] Aktivini su članovi superfamilije TGF-beta i u početku su otkriveni kao regulatori sekrecije folikulo-stimulirajućeg hormona, ali su potom okarakterisane njihove razne reproduktivne i ne-reproduktivne uloge. Postoje tri glavna oblika aktivina (A, B i AB) koji su homo/heterodimeri dve blisko povezane β podjedinice (βAβA, βBβB, odnosno βAβB). Ljudski genom takođe kodira aktivin C i aktivin E, koji su prvenstveno eksprimirani u jetri, a takođe su poznati i heterodimerni oblici koji sadrže βCili βE. U superfamiliji TGF-beta aktivini su jedinstveni i multifunkcionalni faktori koji mogu da stimulišu proizvodnju hormona u ćelijama jajnika i placente, podrže opstanak neuronskih ćelija, pozitivno ili negativno utiču na napredovanje ćelijskog ciklusa u zavisnosti od tipa ćelija i indukuju mezodermalnu diferencijaciju bar kod embriona vodozemaca [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med.198: 500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7: 81-84; i Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55: 953-963]. U nekoliko tkiva, signalizacija aktivina je antagonizovana srodnim heterodimerom, inhibinom. Na primer, u regulaciji sekrecije folikulo-stimulirajućeg hormona (FSH) hipofize, aktivin podstiče sintezu i sekreciju FSH, dok inhibin smanjuje sintezu i sekreciju FSH. Ostali proteini koji mogu da regulišu biološku aktivnost aktivina i/ili da se vežu za aktivin uključuju folistatin (FS), protein povezan sa folistatinom (FSRP, takođe poznat kao FLRG ili FSTL3) i α2-makroglobulin.
[0047] Kao što je ovde opisano, sredstva koja se vezuju za „aktivin A“ su sredstva koja se specifično vezuju za podjedinicu βA, bilo u kontekstu izolovane podjedinice βAili kao dimerni kompleks (npr. homodimer βAβAili heterodimer βAβB). U slučaju heterodimernog kompleksa (npr. heterodimer βAβB), sredstva koja se vezuju za „aktivin A“ specifična su za epitope prisutne u βApodjedinici, ali se ne vezuju za epitope prisutne u ne-βApodjedinici kompleksa (npr. βBpodjedinica kompleksa). Slično tome, ovde otkrivena sredstva koja antagonizuju (inhibiraju) „aktivin A“ su sredstva koja inhibiraju jednu ili više aktivnosti posredovanih podjedinicom βA, bilo u kontekstu izolovane podjedinice βAili kao dimerni kompleks (npr. homodimer βAβAili heterodimer βAβB). U slučaju heterodimera βAβB, sredstva koja inhibiraju „aktivin A“ su sredstva koja specifično inhibiraju jednu ili više aktivnosti βApodjedinice, ali ne inhibiraju aktivnost neβApodjedinice kompleksa (npr. podjedinice kompleksa βB). Ovaj princip se odnosi i na sredstva koja se vezuju i/ili inhibiraju „aktivin B“, „aktivin C“ i „aktivin E“. Ovde otkrivena sredstva koja antagonizuju "aktivin AB" su sredstva koja inhibiraju jednu ili više aktivnosti posredovanih podjedinicom βAi jednu ili više aktivnosti posredovanih podjedinicom βB.
[0048] BMP i GDF zajedno čine familiju citokina sa cisteinskim čvorom koji dele karakteristično savijanje sa superfamilijom TGF-beta [Rider et al. (2010) Biochem J., 429 (1): 1-12]. Ova familija uključuje, na primer, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (poznat i kao GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (poznat i kao GDF2), BMP10, BMP11 (poznat i kao GDF11), BMP12 (poznat i kao GDF7), BMP13 (takođe poznat kao GDF6), BMP14 (poznat i kao GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (poznat i kao VGR2), GDF8 (poznat i kao miostatin), GDF9, GDF15 i dekapentaplegik. Pored sposobnosti da indukuju stvaranje kostiju, na osnovu čega je nastao naziv BMP, BMP/GDF pokazuju morfogenetske aktivnosti u razvoju širokog spektra tkiva. Homo- i hetero-dimeri BMP/GDF interaguju sa kombinacijama dimera receptora tipa I i tipa II da bi proizveli više mogućih signalnih kompleksa, što dovodi do aktivacije jednog od dva kompetirajuća skupa transkripcionih faktora SMAD. BMP/GDF imaju visoko specifične i lokalizovane funkcije. Oni su regulisani na više načina, uključujući razvojno ograničenje ekspresije BMP/GDF i putem sekrecije nekoliko specifičnih proteina antagonista BMP koji se sa velikim afinitetom vezuju za citokine. Zanimljivo je da mnogi od ovih antagonista podsećaju na ligande TGF-beta superfamilije.
[0049] Faktor rasta i diferencijacije 8 (GDF8) takođe je poznat kao miostatin. GDF8 je negativni regulator skeletne mišićne mase i visoko je eksprimiran u skeletnim mišićima u razvoju i kod odraslih. Nul mutaciju GDF8 kod transgenih miševa karakteriše izrazita hipertrofija i hiperplazija skeletnih mišića [McPherron et al. Nature (1997) 387:83-90]. Slično povećanje skeletne mišićne mase je uočljivo kod prirodnih mutacija GDF8 kod goveda i, iznenađujuće, kod ljudi [Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur et al. Genome Res. (1997) 7:910-915; i Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8]. Studije su takođe pokazale da je gubitak mišićne mase povezan sa HIV-infekcijom kod ljudi praćen povećanjem ekspresije proteina GDF8 [Gonzalez-Cadavid et al., PNAS (1998) 95:14938-43]. Pored toga, GDF8 može da modulira proizvodnju enzima specifičnih za mišiće (npr. kreatin kinaze) i da modulira proliferaciju ćelija mioblasta [objava međunarodne patentne prijave br. WO 00/43781]. Propeptid GDF8 može nekovalentno da se veže za zrelim dimerom domena GDF8, inaktivirajući tako njegovu biološku aktivnost [Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; i Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. Drugi proteini koji se vezuju za GDF8 ili strukturno srodne proteine i inhibiraju njihovu biološku aktivnost uključuju folistatin, i potencijalno, proteine srodne folistatinu [Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].
[0050] GDF11, takođe poznat kao BMP11, je sekretovani protein koji se eksprimira u repnom pupoljku, pupoljku udova, maksilarnim i mandibularnim lukovima i ganglijima dorzalnog korena tokom razvoja miša [McPherron et al. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; i Nakashima et al. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. GDF11 igra jedinstvenu ulogu u uspostavljanju obrasca mezodermalnih, kao i neuralnih tkiva [Gamer i sar. (1999) Dev Biol., 208: 222-32]. Pokazalo se da je GDF11 negativni regulator hondrogeneze i miogeneze u razvoju udova pilića [Gamer et al. (2001) Dev Biol., 229: 407-20]. Ekspresija GDF11 u mišićima takođe sugeriše njegovu ulogu u regulisanju rasta mišića na sličan način kao GDF8. Pored toga, ekspresija GDF11 u mozgu sugeriše da GDF11 takođe može da ima aktivnosti koje se odnose na funkciju nervnog sistema.
Zanimljivo je da je utvrđeno da GDF11 inhibira neurogenezu u olfaktornom epitelu [Wu et al. (2003) Neuron., 37: 197-207]. Otuda, GDF11 može imati in vitro i in vivo primene u lečenju bolesti kao što su bolesti mišića i neurodegenerativne bolesti (npr. amiotrofična lateralna skleroza).
[0051] Kao što je ovde pokazano, rastvorljivi polipeptid ActRIIA i heterodimer ALK4:ActRIIB, koji se vezuju za različite ligande koji interaguju sa ActRIIA i ActRIIB, efikasni su u smanjenju krvnog pritiska i srčane hipertrofije u PAH modelu. Bez želje za vezivanjem za bilo koji određeni mehanizam, očekuje se da su dejstva ovih sredstava prvenstveno izazvana antagonističkim delovanjem na signalni put ActRIIA/B. Bez obzira na mehanizam, iz ovde predstavljenih podataka je očigledno da antagonisti signalizacije ActRIIA/B (antagonisti GDF/BMP) snižavaju krvni pritisak, smanjuju srčanu hipertrofiju i imaju druge pozitivne efekte u lečenju plućne hipertenzije. Treba napomenuti da su krvni pritisak i hipertrofija dinamični, sa promenama u zavisnosti od ravnoteže faktora koji povećavaju krvni pritisak i hipertrofiju i faktora koji smanjuju krvni pritisak i hipertrofiju. Krvni pritisak i srčana hipertrofija mogu da se smanje povećanjem faktora koji smanjuju krvni pritisak i srčanu hipertrofiju, redukovanjem faktora koji podstiču povišeni krvni pritisak i srčanu hipertrofiju, ili oboje. Pojmovi snižavanje krvnog pritiska ili smanjenje hipertrofije srca odnose se na uočljive fizičke promene krvnog pritiska i srčanog tkiva i predviđeno je da budu neutralni po pitanju mehanizma putem koga se promene odvijaju.
[0052] Modeli pacova za PAH koji su korišćeni u ovde opisanim studijama smatraju se predikativnim za efikasnost kod ljudi, pa prema tome, ovo otkriće obezbeđuje postupke za upotrebu polipeptida ActRIIA, heteromultimera ALK4:ActRIIB i drugih antagonista GDF/BMP za lečenje plućne hipertenzije (npr. PAH), posebno lečenje, prevenciju ili smanjenje težine ili trajanja jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije kod ljudi. Kao što je ovde opisano, termin antagonisti GDF/BMP odnosi se na razna sredstva koja mogu da se koriste za antagonizovanje signalizacije ActRIIA/B, uključujući, na primer, antagoniste koji inhibiraju jedan ili više liganda ActRIIA/B [npr. aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10]; antagoniste koji inhibiraju jedan ili više receptora tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 i ALK5); i antagoniste koji inhibiraju jednu ili više nishodnih signalnih komponenti (npr. Smad proteini kao što su Smad 2 i 3). Antagonisti GDF/BMP za upotrebu u skladu sa postupcima i upotrebama ovog otkrića uključuju razne oblike, na primer, zamke za ligande (npr. rastvorljivi polipeptidi ActRIIA, polipeptidi ActRIIB, heterodimeri
4
ALK4:ActRIIB, polipeptidi folistatina i polipeptidi FLRG), antagoniste antitela (npr. antitela koja inhibiraju jedno ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 i ALK5), antagoniste malog molekula [npr. mali molekuli koji inhibiraju jedan ili više aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5 i jedan ili više Smad proteina (npr. Smad 2 i 3)] i nukleotidne antagoniste [npr. nukleotidne sekvence koje inhibiraju jedno ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5 i jedan ili više Smad proteina (npr. Smad 2 i 3)].
[0053] Termini korišćeni u ovoj specifikaciji uglavnom imaju svoja uobičajena značenja u tehnici, u kontekstu ovog otkrića i u specifičnom kontekstu u kome se koristi svaki termin. Određeni termini su razmotreni u nastavku ili negde drugde u specifikaciji kako bi pružili dodatne smernice praktičaru u opisivanju kompozicija i postupaka otkrića i načina kako ih napraviti i koristiti. Obim ili značenje bilo koje upotrebe termina biće očigledno iz specifičnog konteksta u kojem se koristi.
[0054] „Homologni“, u svim svojim gramatičkim oblicima i pravopisnim varijacijama, odnosi se na odnos između dva proteina koji imaju „zajedničko evoluciono poreklo“, uključujući proteine iz superfamilija iste vrste organizma, kao i homologne proteine različitih vrsta organizma. Takvi proteini (i njihove kodirajuće nukleinske kiseline) imaju homologiju sekvence, što se ogleda u sličnosti njihovih sekvenci, bilo u smislu procenta identičnosti ili prisustva specifičnih ostataka ili motiva i očuvanih pozicija. Međutim, u uobičajenoj upotrebi i u ovoj prijavi, termin „homologan“, modifikovan prilogom kao što je „visoko“, može da se odnosi na sličnost sekvence i može da se odnosi na zajedničko evoluciono poreklo, ali ne mora.
[0055] Termin "sličnost sekvence", u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na stepen identičnosti ili korelacije između sekvenci nukleinskih kiselina ili aminokiselina koje mogu, ali ne moraju imati zajedničko evoluciono poreklo.
[0056] „Procenat (%) identičnosti sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida (ili nukleotida) je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka (ili ostataka nukleinske kiseline) u sekvenci-kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima (ili ostacima nukleinske kiseline) u sekvenci referentnog polipeptida (nukleotida), nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakvu konzervativnu supstituciju kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinskih sekvenci može da se ostvari na različite načine koji su u okviru znanja u ovoj oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog programa kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) program. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju. U svrhu ovog dokumenta, međutim, vrednosti % identičnosti aminokiselinskih sekvenci (sekvenci nukleinske kiseline) se generišu pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za upoređivanje sekvenci ALIGN-2 autorizovan je od strane Genentech, Inc., a izvorni kod je priložen sa korisničkom dokumentacijom u SAD kancelariji za autorska prava, Washington DC, 20559, gde je registrovan pod SAD registracionim brojem autorskih prava TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornija, ili može da bude kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da bude kompiliran za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre za upoređivanje sekvenci postavlja program ALIGN-2 i oni ne variraju.
[0057] „Agonizovati“, u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na postupak aktiviranja proteina i/ili gena (npr. aktiviranjem ili pojačavanjem ekspresije gena tog proteina ili indukovanjem neaktivnog proteina da uđe u aktivno stanje) ili povećanja aktivnosti proteina i/ili gena.
[0058] „Antagonizovati“, u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na postupak inhibicije proteina i/ili gena (npr. inhibicijom ili smanjenjem ekspresije gena tog proteina ili indukovanjem aktivnog proteina da uđe u neaktivno stanje) ili smanjenja aktivnosti proteina i/ili gena.
[0059] Termini "oko" i "približno", kada se koriste u vezi sa numeričkom vrednošću u celoj specifikaciji i zahtevima, označavaju interval preciznosti, poznat i prihvatljiv stručnjaku u ovoj oblasti. Uopšteno, takav interval preciznosti je ± 10%. Alternativno, a naročito u biološkim sistemima, izrazi "oko" i "približno" mogu značiti vrednosti koje su unutar reda veličine, poželjno unutar ≤ 5-struke i još poželjnije ≤ 2-struke vrednosti od date vrednosti.
[0060] Numerički opsezi koji su ovde opisani uključuju brojeve koji definišu opsege.
[0061] Termini u jednini uključuju množinu, osim ako kontekst u kojem se termin koristi jasno ne nalaže drugačije. Izrazi u jednini, kao i izrazi „jedan ili više“ i „najmanje jedan“, ovde mogu da se koriste kao sinonimi. Dalje, kada se ovde koristi, "i/ili" treba razumeti kao specifično opisivanje svake od dve ili više specifičnih karakteristika ili komponenti sa ili bez druge. Prema tome, izraz "i/ili", kako se ovde koristi u izrazu kao što je "A i/ili B", namenjen je da uključuje "A i B", "A ili B", "A" (sam) i "B" (sam). Isto tako, predviđeno je da izraz "i/ili", kako se koristi u izrazu kao što je "A, B i/ili C", obuhvati svaki od sledećih slučajeva: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (sam).
[0062] U ovoj specifikaciji, podrazumevaće se da reč „sadržati“, ili varijacije kao „sadrži“ ili „koji sadrži“ uključuje navedeni ceo broj ili grupu celih brojeva, ali ne isključuje bilo koji drugi ceo broj ili grupu celih brojeva.
2. Polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4, heteromultimeri ALK4:ActRIIB i njihove varijante
[0063] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na polipeptide ActRII i njihove upotrebe (npr. za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije ili jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije) i/ili intersticijalne bolesti pluća (npr. idiopatska plućna fibroza). Kako se ovde koristi, termin "ActRII" odnosi se na familiju aktivinskih receptora tipa II. Ova familija uključuje aktivinski receptor tipa IIA (ActRIIA) i aktivinski receptor tipa IIB (ActRIIB).
[0064] Kako se ovde koristi, termin "ActRIIB" odnosi se na familiju proteina aktivinskih receptora tipa IIB (ActRIIB) bilo koje vrste i varijante dobijene iz takvih ActRIIB proteina mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ActRIIB u ovom tekstu podrazumeva se kao pozivanje na bilo koji od trenutno identifikovanih oblika. Članovi familije ActRIIB su uglavnom transmembranski proteini, sačinjeni od vanćelijskog domena koji vezuje ligand i sadrži region bogat cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatskog domena sa predviđenom aktivnošću serin/treonin kinaze.
[0065] Izraz "polipeptid ActRIIB" uključuje polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid člana familije ActRIIB, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost. Primeri takve varijante polipeptida ActRIIB dati su u ovom opisu, kao i u objavama međunarodnih patentnih prijava br. WO 2006/012627, WO 2008/097541, WO 2010/151426 i WO 2011/020045. Numerisanje aminokiselina za sve ovde opisane polipeptide povezane sa ActRIIB zasniva se na numerisanju
4
sekvence humanog prekursorskog proteina ActRIIB koja je data u nastavku (SEQ ID NO: 1), osim ako nije specifično naznačeno drugačije.
[0066] Sekvenca humanog prekursorskog proteina ActRIIB je kao što sledi:
[0067] Signalni peptid je označen jednostrukim podvlačenjem; vanćelijski domen je označen podebljanim slovima; a potencijalni, endogena N-vezana mesta glikozilacije su označena dvostrukim podvlačenjem.
[0068] Sekvenca obrađenog (zrelog) vanćelijskog polipeptida ActRIIB je kao što sledi:
[0069] U nekim slučajevima, protein može da bude proizveden sa "SGR..." sekvencom na N-kraju. C-terminalni "rep" vanćelijskog domena označen je jednostrukim podvlačenjem. Sekvenca sa deletiranim "repom" (sekvenca Δ15) je kao što sledi:
[0070] Oblik ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 SEQ ID NO: 1 (A64) takođe je objavljen u literaturi. Videti, npr., Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Podnosioci prijave su utvrdili da fuzioni protein ActRIIB-Fc koji sadrži vanćelijski domen ActRIIB sa supstitucijom A64 ima relativno nizak afinitet za aktivin i GDF11. Nasuprot tome, isti fuzioni protein ActRIIB-Fc sa argininom na poziciji 64 (R64) ima afinitet za aktivin i GDF11 u niskom nanomolarnom do visokog piko-molarnog opsega. Prema tome, sekvence sa R64 se koriste kao referentna sekvenca "divljeg tipa" za humani ActRIIB u ovom otkriću.
[0071] Oblik ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 je kao što sledi:
[0072] Signalni peptid je naznačen jednostrukim podvlačenjem, a vanćelijski domen je naznačen podebljanim slovima.
[0073] Sekvenca obrađenog (zrelog) vanćelijskog polipeptida ActRIIB alternativnog oblika A64 je kao što sledi:
[0074] U nekim slučajevima, protein može da bude proizveden sa "SGR..." sekvencom na N-kraju. C-terminalni "rep" vanćelijskog domena je naznačen jednostrukim podvlačenjem. Sekvenca sa deletiranim "repom" (sekvenca Δ15) je kao što sledi:
4
[0075] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ActRIIB prekursorski protein prikazana je ispod (SEQ ID NO: 7), predstavljajući nukleotide 25-1560 Genbank referentne sekvence NM_001106.3, koja kodira aminokiseline 1-513 prekursora ActRIIB. Sekvenca kakva je prikazana obezbeđuje arginin na poziciji 64 i može da bude modifikovana tako da umesto njega obezbedi alanin. Signalna sekvenca je podvučena.
4
[0076] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski humani polipeptid ActRIIB je kao što sledi (SEQ ID NO: 8). Sekvenca kakva je prikazana obezbeđuje arginin na poziciji 64, i može da bude modifikovana tako da umesto njega obezbedi alanin.
[0077] Poravnanje aminokiselinskih sekvenci vanćelijskog domena humanog ActRIIB i vanćelijskog domena humanog ActRIIA ilustrovano je na slici 1. Ovo poravnanje ukazuje na aminokiselinske ostatke u oba receptora za koje se smatra da stupaju u neposredni kontakt sa ligandima ActRII. Na primer, složene strukture ActRII ukazale su da je džep ActRIIB koji vezuje ligande definisan, delom, ostacima Y31, N33, N35, L38 do T41, E47, E50, Q53 do K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 do N83, Y85, R87, A92, i E94 do F101. Očekivano je da će konzervativne mutacije na ovim pozicijama biti tolerisane.
[0078] Pored toga, ActRIIB je dobro očuvan među kičmenjacima, sa velikim nizovima u vanćelijskom domenu koji su u potpunosti konzervativni. Na primer, na slici 2 prikazano je višestruko poravnanje sekvenci vanćelijskog domena humanog ActRIIB u poređenju sa različitim ortolozima ActRIIB. Mnogi ligandi koji se vezuju za ActRIIB su takođe visoko konzervativni. Shodno tome, iz ovih poravnanja, moguće je predvideti ključne aminokiselinske pozicije u domenu koji vezuje ligand koje su važne za normalne aktivnosti vezivanja ActRIIB-ligand, kao i predvideti aminokiselinske pozicije koje će verovatno biti tolerantne na supstituciju bez značajnih promena normalne aktivnosti vezivanja ActRIIB-ligand. Prema tome, aktivna
4
varijanta humanog polipeptida ActRIIB korisna u skladu sa ovde opisanim postupcima može da uključuje jednu ili više aminokiselina na odgovarajućim pozicijama iz sekvence ActRIIB drugog kičmenjaka, ili može da sadrži ostatak sličan onom u sekvencama čoveka ili drugog kičmenjaka. Bez namere da budu ograničavajući, sledeći primeri ilustruju ovaj pristup za definisanje aktivne varijante ActRIIB. L46 u humanom vanćelijskom domenu (SEQ ID NO: 2) je valin u ActRIIB Xenopusa (SEQ ID NO: 58), tako da ova pozicija može da bude izmenjena, i opciono može da bude izmenjena u drugi hidrofobni ostatak, kao V, I ili F, ili nepolarni ostatak kao A. E52 u humanom vanćelijskom domenu je K kod Xenopusa, što ukazuje na to da ovo mesto može da toleriše širok opseg promena, uključujući polarne ostatke, kao E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y i verovatno A. T93 u humanom vanćelijskom domenu je K kod Xenopusa, što ukazuje da se na ovoj poziciji tolerišu široke strukturne varijacije, sa favorizovanim polarnim ostacima, kao S, K, R, E, D, H, G, P, G i Y. F108 u humanom vanćelijskom domenu je Y kod Xenopusa, i prema tome, trebalo bi da Y ili druga hidrofobna grupa, kao I, V ili L budu tolerisane. E111 u humanom vanćelijskom domenu je K kod Xenopusa, što ukazuje na to da će naelektrisani ostaci biti tolerisani na ovoj poziciji, uključujući D, R, K i H, kao i Q i N. R112 u humanom vanćelijskom domenu je K kod Xenopusa, što ukazuje na to da se bazni ostaci tolerišu na ovoj poziciji, uključujući R i H. A na poziciji 119 u humanom vanćelijskom domenu je relativno slabo očuvano, i javlja se kao P kod glodara i V kod Xenopusa, tako da bi suštinski bilo koja aminokiselina trebalo da bude tolerisana na ovoj poziciji.
[0079] Osim toga, proteini ActRII su u struci okarakterisani u pogledu strukturnih i funkcionalnih karakteristika, posebno u vezi sa vezivanjem liganda [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; kao i SAD patenti br: 7,709,605, 7,612,041, i 7,842,663]. Pored ovde iznetih saznanja, ove reference pružaju obimna uputstva za generisanje varijanti ActRIIB koje zadržavaju jednu ili više normalnih aktivnosti (npr., aktivnost vezivanja liganda).
[0080] Na primer, definisani strukturni motiv poznat kao nabor toksina u vidu tri prsta važan je za vezivanje liganda pomoću receptora tipa I i tipa II i formiran je od konzervativnih ostataka cisteina koji se nalaze na različitim pozicijama unutar vanćelijskog domena svakog monomernog receptora [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; i Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Prema tome, jezgarni ligand-vezujući domeni humanog ActRIIB, ograničeni najudaljenijim od ovih konzervativnih cisteina, odgovaraju pozicijama 29-109 u SEQ ID NO: 1 (prekursor ActRIIB). Strukturno manje uređene aminokiseline koje okružuju ove cisteinom
4
ograničene jezgarne sekvence mogu da se skrate za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 ostataka na N-kraju i/ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ili 22 ostatka na C-kraju bez nužnog menjanja vezivanja liganda. Ilustrativni vanćelijski domeni ActRIIB za N-terminalno i/ili C-terminalno skraćenje uključuju SEQ ID NOs: 2, 3, 5 i 6.
[0081] Attisano et al. su pokazali da delecija prolinskog čvora na C-kraju vanćelijskog domena ActRIIB smanjuje afinitet receptora za aktivin. Fuzioni protein ActRIIB-Fc koji sadrži aminokiseline 20-119 predmetne SEQ ID NO: 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", ispoljava redukovano vezivanje za GDF11 i aktivin u odnosu na ActRIIB(20-134)-Fc, koji uključuje region prolinskog čvora i kompletan jukstamembranski domen (videti, npr., SAD patent br. 7,842,663). Međutim, ActRIIB(20-129)-Fc zadržava sličnu, ali donekle smanjenu aktivnost, u odnosu na divlji tip, iako je područje prolinskog čvora narušeno.
[0082] Prema tome, očekivano je da će svi vanćelijski domeni ActRIIB koji se završavaju na aminokiselinama 134, 133, 132, 131, 130 i 129 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) biti aktivni, ali konstrukti koji se zaustavljaju na 134 ili 133 mogu da budu najaktivniji. Slično tome, ne očekuje se da mutacije bilo kog ostatka 129-134 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) promene afinitet vezivanja liganda u značajnoj meri. U prilog tome, u struci je poznato da mutacije P129 i P130 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ne smanjuju suštinski vezivanje liganda. Prema tome, polipeptid ActRIIB ovog otkrića može da se završava već aminokiselinom 109 (krajnji cistein), međutim, kod oblika koji se završavaju na, ili između, 109 i 119 (npr., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, ili 119) očekuje se smanjeno vezivanje liganda. Aminokiselina 119 (u odnosu na ovde datu SEQ ID NO:1) je slabo konzervativna i lako se menja ili skraćuje. Polipeptidi ActRIIB koji se završavaju na 128 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ili kasnije bi trebalo da imaju očuvanu aktivnost vezivanja liganda. Polipeptidi ActRIIB koji se završavaju na, ili između, 119 i 127 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, ili 127), u odnosu na SEQ ID NO: 1, imaće intermedijarnu sposobnost vezivanja. Bilo koji od ovih oblika može da bude poželjan za upotrebu, u zavisnosti od kliničke ili eksperimentalne postavke.
[0083] Očekivano je da će, na N-kraju ActRIIB, protein koji počinje aminokiselinom 29 ili nekom pre nje (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadržati aktivnost vezivanja liganda. Aminokiselina 29 predstavlja početni cistein. Mutacija alanina u asparagin na poziciji 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) uvodi sekvencu N-vezane glikozilacije bez suštinskog uticaja na vezivanje liganda [SAD patent br. 7,842,663]. Ovo potvrđuje da se mutacije u regionu između signalnog peptida za
4
odvajanje i umreženog regiona cisteina, koji odgovara aminokiselinama 20-29, dobro tolerišu. Konkretno, trebalo bi da polipeptidi ActRIIB koji počinju na pozicijama 20, 21, 22, 23 i 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadrže opštu aktivnost vezivanja liganda, i takođe se očekuje da polipeptidi ActRIIB koji počinju na pozicijama 25, 26, 27, 28 i 29 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadrže aktivnost vezivanja liganda. Pokazano je, npr., u SAD patentu br. 7,842,663, da će, iznenađujuće, konstrukt ActRIIB koji počinje na 22, 23, 24, ili 25 imati najveću aktivnost.
[0084] Ukupno uzevši, opšta formula za aktivni deo (npr., deo koji vezuje ligand) u ActRIIB sadrži aminokiseline 29-109 iz SEQ ID NO: 1. Prema tome, polipeptidi ActRIIB mogu, na primer, da sadrže, suštinski se sastoje od, ili da se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIB koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 20-29 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) iz SEQ ID NO: 1 i završava na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 109-134 (npr., završava na bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) iz SEQ ID NO: 1. Ostali primeri uključuju polipeptide koji počinju na poziciji 20-29 (npr., bilo koja od pozicija 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) ili 21-29 (npr., bilo koja od pozicija 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) iz SEQ ID NO: 1 i završavaju na poziciji 119-134 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), 119-133 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ili 133), 129-134 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), ili 129-133 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132, ili 133) iz SEQ ID NO: 1. Ostali primeri uključuju konstrukte koji počinju na poziciji 20-24 (npr., bilo koja od pozicija 20, 21, 22, 23, ili 24), 21-24 (npr., bilo koja od pozicija 21, 22, 23, ili 24), ili 22-25 (npr., bilo koja od pozicija 22, 22, 23, ili 25) iz SEQ ID NO: 1 i završavaju na poziciji od 109-134 (npr., bilo koja od pozicija 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), 119-134 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) ili 129-134 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) iz SEQ ID NO: 1. Obuhvaćene su i varijante unutar ovih opsega, posebno one koje sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična odgovarajućem delu SEQ ID NO: 1.
[0085] Ovde opisane varijacije mogu se kombinovati na razne načine. U nekim slučajevima, varijante ActRIIB ne sadrže više od 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 15 konzervativnih promena aminokiselina u džepu koji vezuje ligand, opciono nijednu, jednu ili više nekonzervativnih promena na pozicijama 40, 53, 55, 74, 79 i/ili 82 u džepu koji vezuje ligand. Mesta van džepa koji vezuje ligand, na kojima varijabilnost može posebno dobro da se toleriše, uključuju amino i karboksi krajeve vanćelijskog domena (kao što je gore navedeno), i pozicije 42-46 i 65-73 (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Izgleda da promena asparagina u alanin na poziciji 65 (N65A) ne smanjuje vezivanje liganda u okruženju R64 [SAD patent br. 7,842,663]. Ova promena verovatno eliminiše glikozilaciju na N65 u okruženju A64, čime pokazuje da će značajna promena u ovom regionu verovatno biti tolerisana. Dok se promena R64A slabo toleriše, R64K se dobro toleriše, pa samim tim i drugi bazni ostatak, kao što je H, može da bude tolerisan na poziciji 64 [SAD patent br. 7,842,663]. Pored toga, rezultati programa mutageneze opisani u tehnici pokazuju da postoje pozicije aminokiselina u ActRIIB koje je često korisno očuvati. Što se tiče SEQ ID NO: 1, one uključuju poziciju 80 (kisela ili hidrofobna aminokiselina), poziciju 78 (hidrofobna, a naročito triptofan), poziciju 37 (kisela, a naročito asparaginska ili glutaminska kiselina), poziciju 56 (bazna aminokiselina), poziciju 60 (hidrofobna aminokiselina, naročito fenilalanin ili tirozin). Prema tome, otkriće daje okvir aminokiselina koji mogu da budu očuvane u polipeptidima ActRIIB. Ostale pozicije koje je možda poželjno očuvati su sledeće: pozicija 52 (kisela aminokiselina), pozicija 55 (bazna aminokiselina), pozicija 81 (kisela), 98 (polarna ili naelektrisana, naročito E, D, R ili K), sve u odnosu na SEQ ID NO: 1.
[0086] Prethodno je pokazano da se dodavanje narednog N-vezanog glikozilacionog mesta (N-X-S/T) u vanćelijski domen ActRIIB dobro toleriše (videti, npr., SAD patent br. 7,842,663). Prema tome, N-X-S/T sekvence mogu uglavnom da se uvedu na pozicije izvan džepa za vezivanje liganda definisanog na slici 1 u polipeptidu ActRIIB ovog otkrića. Naročito pogodna mesta za uvođenje ne-endogenih N-X-S/T sekvenci uključuju aminokiseline 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 ili 129-134 (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Sekvence N-X-S/T se takođe mogu uvesti u linker između sekvence ActRIIB i Fc domena ili druge fuzione komponente, kao i opciono u samu fuzionu komponentu. Takva lokacija se može uvesti uz minimalan napor uvođenjem N na ispravnoj poziciji u odnosu na već postojeći S ili T ili uvođenjem S ili T na poziciji koja odgovara već postojećem N. Dakle, poželjne promene koje bi stvorile N-vezano mesto glikozilacije su: A24N, R64N, S67N (moguće u kombinaciji sa izmenom N65A), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S i R112T (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Bilo koje S za koje se predviđa da će biti glikozilovano može da se promeni u T bez stvaranja imunogenog mesta, zbog zaštite koju pruža glikozilacija. Slično tome, bilo koje T za koje se
1
predviđa da će biti glikozilovano može da se promeni u S. Prema tome, razmatraju se izmene S67T i S44T (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Slično tome, u varijanti A24N, može da se koristi izmena S26T. Shodno tome, polipeptid ActRIIB ovog otkrića može da bude varijanta koja ima jednu ili više dodatnih, ne-endogenih konsenzusnih sekvenci N-vezane glikozilacije kao što je gore opisano.
[0087] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na antagoniste (inhibitore) GDF/BMP koji sadrže polipeptid ActRIIB, koji uključuje njegove fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane oblike, kao i njihove upotrebe (npr., lečenje ili prevenciju PH ili jedne ili više komplikacija povezanih sa PH). Poželjno, polipeptidi ActRIIB su rastvorljivi (npr., sadrže vanćelijski domen ActRIIB). U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB antagonizuju aktivnost (npr., Smad signalizaciju) jednog ili više liganda GDF/BMP [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E), BMP6, GDF3, BMP15 i BMP10]. Prema tome, u nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB se vezuju za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E), BMP6, GDF3, BMP15 i BMP10]. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIB koji počinje na ostatku koji odgovara aminokiselinama 20-29 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) iz SEQ ID NO: 1 i završava se na poziciji koja odgovara aminokiselinama 109-134 (npr., završava na bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) iz SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 29-109 u SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 29-109 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina (prirodne kisele aminokiseline D i E ili veštačka kisela aminokiselina). U određenim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1. U određenim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se
2
suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci bilo koje od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 i 120. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci bilo koje od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 i 120, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIB otkrića sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od najmanje jednog polipeptida ActRIIB pri čemu pozicija koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 nije kisela aminokiselina (tj., nije prirodna kisela aminokiselina D ili E ili veštački kiseli aminokiselinski ostatak).
[0088] U određenim slučajevima, ovo otkriće se odnosi na polipeptide ActRIIA. Kako se ovde koristi, termin "ActRIIA" odnosi se na familiju proteina aktivinskih receptora tipa IIA (ActRIIA) iz bilo koje vrste i varijante dobijene iz takvih ActRIIA proteina mutagenezom ili drugom modifikacijom. U ovom dokumetu, pozivanje na ActRIIA treba razumeti kao upućivanje na bilo koji od trenutno identifikovanih oblika. Članovi familije ActRIIA su uglavnom transmembranski proteini, sačinjeni od vanćelijskog domena koji vezuje ligand i sadrži region bogat cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatskog domena sa predviđenom aktivnošću serin/treonin kinaze.
[0089] Izraz "polipeptid ActRIIA" uključuje polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid koji je član familije ActRIIA, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzione i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost. Primeri takve varijante polipeptida ActRIIA dati su u ovom otkriću, kao i u objavama međunarodnih patentnih prijava br. WO 2006/012627 i WO 2007/062188. Numerisanje aminokiselina za sve ovde opisane polipeptide povezane sa ActRIIA zasniva se na numerisanju sekvence prekursorskog proteina humanog ActRIIA navedene u nastavku (SEQ ID NO: 9), osim ako nije specifično naznačeno drugačije.
[0090] Kanonska sekvenca prekursorskog proteina humanog ActRIIA je kao što sledi:
[0091] Signalni peptid označen je jednostrukim podvlačenjem; vanćelijski domen je označen podebljanim slovima; a potencijalna, endogena mesta N-vezane glikozilacije označena su dvostrukim podvlačenjem.
[0092] Sekvenca obrađenog (zrelog) vanćelijskog humanog polipeptida ActRIIA je kao što sledi:
[0093] C-terminalni "rep" vanćelijskog domena je naznačen jednostrukim podvlačenjem. Sekvenca sa deletiranim "repom" (sekvenca Δ15) je kao što sledi:
[0094] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prekursorski protein humanog ActRIIA prikazana je ispod (SEQ ID NO: 12), kao sledeći nukleotidi 159-1700 Genbank referentne sekvence NM_001616.4. Signalna sekvenca je podvučena.
4
[0095] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni rastvorljivi (vanćelijski) humani polipeptid ActRIIA je kao što sledi:
[0096] ActRIIA je dobro očuvan među kičmenjacima, sa velikim nizovima u vanćelijskom domenu koji su u potpunosti očuvani. Na primer, na slici 3 prikazano je višestruko poravnanje sekvenci vanćelijskog domena humanog ActRIIA u poređenju sa različitim ortolozima ActRIIA. Mnogi ligandi koji se vezuju za ActRIIA su takođe visoko konzervativni. Shodno tome, iz ovih poravnanja, moguće je predvideti ključne aminokiselinske pozicije u domenu koji vezuje ligand koje su važni za normalne aktivnosti vezivanja ActRIIA-ligand, kao i predvideti aminokiselinske pozicije koje će verovatno biti tolerantne na supstituciju bez značajnih promena normalne aktivnosti vezivanja ActRIIA-ligand. Prema tome, aktivna varijanta humanog polipeptida ActRIIA korisna u skladu sa ovde opisanim postupcima može da uključuje jednu ili više aminokiselina na odgovarajućim pozicijama iz sekvence ActRIIA drugog kičmenjaka, ili može da sadrži ostatak sličan onom u sekvencama čoveka ili drugog kičmenjaka.
[0097] Bez namere da budu ograničavajući, sledeći primeri ilustruju ovaj pristup za definisanje aktivne varijante ActRIIA. Kao što je prikazano na slici 3, F13 u humanom vanćelijskom domenu je Y u ActRIIA Ovis aries (SEQ ID NO: 62), Gallus gallus (SEQ ID NO: 65), Bos Taurus (SEQ ID NO: 66), Tyto alba (SEQ ID NO: 67) i Myotis davidii (SEQ ID NO: 68), što ukazuje na to da se aromatični ostaci tolerišu na ovoj poziciji, uključujući F, W i Y. Q24 u humanom vanćelijskom domenu je R u ActRIIA Bos Taurus, što ukazuje na to da će naelektrisani ostaci biti tolerisani na ovoj poziciji, uključujući D, R, K, H i E. S95 u humanom vanćelijskom domenu je F u ActRIIA Gallus gallus i Tyto alba, što ukazuje na to da ovo mesto može da toleriše širok opseg izmena, uključujući polarne ostatke, kao E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, i verovatno hidrofobne ostatke kao L, I, ili F. E52 u humanom vanćelijskom domenu je D u ActRIIA Ovis aries, što ukazuje na to da se na ovoj poziciji tolerišu kiseli ostaci, uključujući D i E. P29 u humanom vanćelijskom domenu je relativno slabo očuvan, pojavljujući se kao S u ActRIIA Ovis aries i L u ActRIIA Myotis davidii, tako da bi suštinski bilo koja aminokiselina trebalo da bude tolerisana na ovoj poziciji.
[0098] Osim toga, kao što je gore razmatrano, proteini ActRII su okarakterisani u tehnici, u pogledu strukturnih/funkcionalnih karakteristika, naročito u odnosu na vezivanje liganda [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; kao i SAD patenti br: 7,709,605, 7,612,041 i 7,842,663]. Pored saznanja iznetih u ovom dokumentu, ove reference pružaju obimna uputstva o tome kako generisati varijante ActRII koje zadržavaju jednu ili više željenih aktivnosti (npr. aktivnost vezivanja liganda).
[0099] Na primer, definisani strukturni motiv poznat kao nabor toksina u vidu tri prsta važan je za vezivanje liganda pomoću receptora tipa I i tipa II i formiran je od konzervativnih ostataka cisteina koji se nalaze na različitim pozicijama unutar vanćelijskog domena svakog monomernog receptora [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; i Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Prema tome, jezgarni ligand-vezujući domeni humanog ActRIIA, ograničen najudaljenijim od ovih konzervativnih cisteina, odgovara pozicijama 30-110 u SEQ ID NO: 9 (prekursor ActRIIA). Prema tome, strukturno manje uređene aminokiseline koje okružuju ove cisteinom ograničene jezgarne sekvence mogu da se skrate za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29 ostataka na N-kraju i za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 ostataka na C-kraju bez nužnog menjanja vezivanja liganda. Primeri skraćivanja vanćelijskih domena ActRIIA uključuju SEQ ID NOs: 10 i 11.
[0100] Prema tome, opšta formula aktivnog dela (npr., dela koji vezuje ligand) ActRIIA je polipeptid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od aminokiselina 30-110 SEQ ID NO: 9. Prema tome, polipeptidi ActRIIA mogu, na primer, da sadrže, suštinski se sastoje od, ili da se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIA koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 21-30 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30) u SEQ ID NO: 9 i završava na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 110-135 (npr., završava na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, ili 135) u SEQ ID NO: 9. Ostali primeri uključuju konstrukte koji počinju na poziciji odabranoj od 21-30 (npr., koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30), 22-30 (npr., koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30), 23-30 (npr., koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30), 24-30 (npr., koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30) u SEQ ID NO: 9, i završavaju se na poziciji odabranoj od 111-135 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135), 112-135 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135), 113-135 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135), 120-135 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135), 130-135 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 130, 131, 132, 133, 134 ili 135), 111-134 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), 111-133 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ili 133), 111-132 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, ili 132), ili 111-131 (npr., završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, ili 131) u SEQ ID NO: 9. Obuhvaćene su i varijante unutar ovih opsega, posebno one koje sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa odgovarajućim delom SEQ ID NO: 9. Tako, u nekim slučajevima, polipeptid ActRIIA može da sadrži, suštinski se sastoji od, ili da se sastoje od polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinama 30-110 u SEQ ID NO: 9. Opciono, polipeptidi ActRIIA sadrže polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinama 30-110 u SEQ ID NO: 9, i sadrže ne više od 1, 2, 5, 10 ili 15 konzervativnih aminokiselinskih izmena u džepu koji vezuje ligand.
[0101] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na antagoniste (inhibitore) GDF/BMP koji sadrže polipeptid ActRIIA, koji uključuje njegove fragmente, funkcionalne varijante i modifikovane oblike, kao i njihove upotrebe (npr., povećanje imunološkog odgovora kod pacijenta kome je to potrebno i lečenje kancera). Poželjno, polipeptidi ActRIIA su rastvorljivi (npr., vanćelijski domen ActRIIA). U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA inhibiraju (npr., Smad signalizacija) jedan ili više liganda GDF/BMP [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3, BMP15, i/ili BMP10]. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA se vezuju za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3, BMP15, i/ili BMP10]. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA otkrića sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIA koji počinje na ostatku koji odgovara aminokiselinama 21-30 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30) u SEQ ID NO: 9 i završava na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 110-135 (npr., završava na bilo kojoj od aminokiselina 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135) u SEQ ID NO: 9. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 30-110 u SEQ ID NO: 9. U određenim slučajevima, polipeptidi ActRIIA sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 21-135 u SEQ ID NO: 9. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRIIA sadrže, sastoje se, ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci bilo koje od SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 32, 36 i 39.
[0102] U određenim slučajevima, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide GDF zamke (označene i kao "GDF zamke"). U nekim slučajevima, GDF zamke predmetnog otkrića su varijanta polipeptida ActRII (npr., polipeptida ActRIIA i ActRIIB) koja sadrži jednu ili više mutacija (npr., aminokiselinske adicije, delecije, supstitucije i njihove kombinacije) u vanćelijskom domenu (označenom i kao ligand-vezujući domen) polipeptida ActRII (npr., "divlji tip" ili nemodifikovani polipeptid ActRII) tako da varijanta polipeptida ActRII ima jednu ili više izmenjenih aktivnosti vezivanja liganda u odnosu na odgovarajući polipeptid ActRII divljeg tipa. U poželjnim primerima, polipeptidi GDF zamke predmetnog otkrića zadržavaju najmanje jednu sličnu aktivnost kao odgovarajući polipeptid ActRII divljeg tipa. Na primer, poželjne GDF zamke vezuju i inhibiraju (npr. antagonizuju) funkciju GDF11 i/ili GDF8. U nekim slučajevima, GDF zamke predmetnog otkrića dodatno vezuju i inhibiraju jedan ili više liganda GDF/BMP. Prema tome, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptide GDF zamke koji imaju izmenjenu specifičnost vezivanja za jedan ili više ActRII liganada.
[0103] Ilustracije radi, mogu da se odaberu jedna ili više mutacija koje povećavaju selektivnost izmenjenog ligand-vezujućeg domena za GDF11 i/ili GDF8 u odnosu na jedan ili više ActRII-vezujućih liganada kao aktivini (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, i/ili aktivin E), posebno aktivin A. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen ima odnos Kdpri vezivanju aktivina prema Kdpri vezivanju GDF11 i/ili GDF8 koji je najmanje 2, 5, 10, 20, 50, 100 ili čak 1000 puta veći od tog odnosa kod ligand-vezujućeg domena divljeg tipa. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen ima odnos IC50za inhibiciju aktivina prema IC50za inhibiciju GDF11 i/ili GDF8 koji je najmanje 2, 5, 10, 20, 50, 100 ili čak 1000 puta veći u odnosu na ligand-vezujući domen divljeg tipa. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen inhibira GDF11 i/ili GDF8 pri IC50najmanje 2, 5, 10, 20, 50, 100 ili čak 1000 puta manjom od IC50za inhibiciju aktivina.
[0104] Aminokiselinski ostaci ActRIIB proteina (npr., E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80 i F101 u odnosu na SEQ ID NO: 1) su u džepu koji vezuje ligand ActRIIB i pomažu u posredovanju vezivanja za njegove ligande uključujući, na primer, aktivin A, GDF11 i GDF8. Prema tome, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptide GDF zamke koji sadrže izmenjeni ligand-vezujući domen (npr., domen koji vezuje GDF8/GDF11) ActRIIB receptora koji sadrži jednu ili više mutacija na tim aminokiselinskim ostacima.
[0105] Kao specifični primer, pozitivno naelektrisan aminokiselinski ostatak Asp (D80) ligandvezujućeg domena ActRIIB može da bude mutiran u drugačiji aminokiselinski ostatak kako bi se proizveo polipeptid GDF zamke koji se preferencijalno vezuje za GDF8, ali ne i za aktivin. Poželjno, ostatak D80 u odnosu na SEQ ID NO: 1 promenjen je u aminokiselinski ostatak odabran iz grupe koja se sastoji od: nenaelektrisanog aminokiselinskog ostatka, negativno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka i hidrofobnog aminokiselinskog ostatka. Kao sledeći specifični primer, hidrofobni ostatak L79 u SEQ ID NO: 1 može da se izmeni tako da obezbedi promenjene karakteristike vezivanja aktivin-GDF11/GDF8. Na primer, supstitucija L79P smanjuje vezivanje GDF11 u većem stepenu nego vezivanje aktivina. Nasuprot tome, zamena L79 kiselom aminokiselinom [asparaginskom kiselinom ili glutaminskom kiselinom; supstitucija L79D ili L79E] značajno smanjuje afinitet vezivanja aktivina A uz očuvanje afiniteta vezivanja GDF11. U ilustrativnim primerima, ovde opisani postupci upotrebljavaju polipeptid GDF zamke koji je varijanta polipeptida ActRIIB koja sadrži kiselu aminokiselinu (npr., D ili E) na poziciji koja odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1, opciono u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih aminokiselinskih supstitucija, adicija, ili delecija.
[0106] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na polipeptide ALK4 i njihove upotrebe. Kako se ovde upotrebljava, pojam "ALK4" se odnosi na familiju proteina aktivinskom receptoru-slične kinaze-4 bilo koje vrste, i varijante dobijene od takvih ALK4 proteina mutagenezom ili drugim modifikacijama. Pozivanje na ALK4 ovde se podrazumeva kao upućivanje na bilo koji od trenutno identifikovanih oblika. Članovi familije ALK4 su uglavnom transmembranski proteini, sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom aktivnošću serin/treonin kinaze.
[0107] Pojam "polipeptid ALK4" uključuje polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid člana familije ALK4, kao i sve njihove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzione i peptidomimetičke oblike) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje aminokiselina za sve ovde opisane polipeptide povezane sa ALK4 zasniva se na numerisanju sekvence prekursorskog proteina humanog ALK4 ispod (SEQ ID NO: 100), osim ako nije specifično naznačeno drugačije.
[0108] Sekvenca prekursorskog proteina humanog ALK4 (NCBI ref. sekv. NP_004293) je kao što sledi:
1
[0109] Signalni peptid označen je jednostrukim podvlačenjem, a vanćelijski domen je označen podebljanim slovima.
[0110] Sekvenca obrađenog vanćelijskog humanog polipeptida ALK4 je kao što sledi:
[0111] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prekursorski protein ALK4 prikazana je ispod (SEQ ID NO: 102), i odgovara nukleotidima 78-1592 Genbank referentne sekvence NM_004302.4. Signalna sekvenca je podvučena, a vanćelijski domen je označen podebljanim slovima.
2
[0112] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski polipeptid ALK4 je kao što sledi:
[0113] Alternativna izoforma sekvence prekursorskog proteina humanog ALK4, izoforma B (NCBI ref. sekv. NP_064732.3), je kao što sledi:
[0114] Vanćelijski domen je označen podebljanim slovima.
[0115] Sekvenca obrađenog vanćelijskog polipeptida ALK4 je kao što sledi:
[0116] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prekursorski protein ALK4 (izoforma B) prikazana je ispod (SEQ ID NO: 106), i odgovara nukleotidima 186-1547 Genbank referentne sekvence NM_020327.3. Nukleotidi koji kodiraju vanćelijski domen označeni su podebljanim slovima.
4
[0117] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski polipeptid ALK4 (izoforma B) je kao što sledi:
[0118] ALK4 je dobro očuvan među kičmenjacima, sa velikim nizovima u vanćelijskom domenu koji su u potpunosti očuvani. Na primer, na slici 18 prikazano je višestruko poravnanje sekvenci vanćelijskog domena humanog ALK4 u poređenju sa različitim ortolozima ALK4. Mnogi ligandi koji se vezuju za ALK4 su takođe visoko konzervativni. Shodno tome, iz ovih poravnanja, moguće je predvideti ključne aminokiselinske pozicije u domenu koji vezuje ligand koje su važne za normalne aktivnosti vezivanja ALK4-ligand, kao i predvideti aminokiselinske pozicije koje će verovatno biti tolerantne na supstituciju bez značajnih promena normalne aktivnosti vezivanja ALK4-ligand. Prema tome, aktivna varijanta humanog polipeptida ALK4 korisna u skladu sa ovde opisanim postupcima može da uključuje jednu ili više aminokiselina na odgovarajućim pozicijama iz sekvence ALK4 drugog kičmenjaka, ili može da sadrži ostatak sličan onom u sekvencama čoveka ili drugog kičmenjaka.
[0119] Bez namere da budu ograničavajući, sledeći primeri ilustruju ovaj pristup za definisanje aktivne varijante ALK4. Kako je prikazano na slici 18, V6 u humanom vanćelijskom domenu ALK4 (SEQ ID NO: 126) je izoleucin u ALK4 Mus muculusa (SEQ ID NO: 130), tako da ova pozicija može da bude izmenjena, i opciono može da bude izmenjena u drugi hidrofobni ostatak, kao L, I, ili F, ili nepolarni ostatak kao A, kao što je zapaženo u ALK4 Gallus gallusa (SEQ ID NO: 129). E40 u humanom vanćelijskom domenu je K u ALK4 Gallus gallusa, što ukazuje na to da ovo mesto može da toleriše širok opseg izmena, uključujući polarne ostatke, kao E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, i verovatno nepolarni ostatak kao A. S15 u humanom vanćelijskom domenu je D u ALK4 Gallus gallusa, što ukazuje na to da se na ovoj poziciji toleriše širok opseg strukturnih varijacija, sa favorizovanim polarnim ostacima, kao S, T, R, E, K, H, G, P, G i Y. E40 u humanom vanćelijskom domenu je K u ALK4 Gallus gallusa, što ukazuje na to da će naelektrisani ostaci biti tolerisani na ovoj poziciji, uključujući D, R, K, H, kao i Q i N. R80 u humanom vanćelijskom domenu je K u ALK4 Condylura cristata (SEQ ID NO: 127), što ukazuje na to da se bazni ostaci tolerišu na ovoj poziciji, uključujući R, K i H. Y77 u humanom vanćelijskom domenu je F u ALK4 Sus scrofa (SEQ ID NO: 131), što ukazuje na to da se na ovoj poziciji tolerišu aromatični ostaci, uključujući F, W i Y. P93 u humanom vanćelijskom domenu je relativno slabo očuvan, i javlja se kao S u ALK4 Erinaceus europaeusa (SEQ ID NO: 128) i N u ALK4 Gallus gallusa, tako da bi suštinski bilo koja aminokiselina trebalo da bude tolerisana na ovoj poziciji.
[0120] Osim toga, ALK4 proteini su okarakterisani u tehnici u pogledu strukturnih/funkcionalnih karakteristika, naročito u odnosu na vezivanje liganda [npr., Harrison et al. (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano et al. (2012) J Mol Model 18(8):3617-3625; i Calvanese et al. (2009) 15(3):175-183]. Pored saznanja iznetih u ovom dokumentu, ove reference pružaju obimna uputstva o tome kako generisati varijante ALK4 koje zadržavaju jednu ili više željenih aktivnosti (npr. aktivnost vezivanja liganda).
[0121] Na primer, definisani strukturni motiv poznat kao nabor toksina u vidu tri prsta važan je za vezivanje liganda pomoću receptora tipa I i tipa II i formiran je od konzervativnih ostataka cisteina koji se nalaze na različitim pozicijama unutar vanćelijskog domena svakog monomernog receptora [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; i Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Prema tome, jezgarni ligand-vezujući domeni humanog ALK4, ograničeni najudaljenijim od ovih konzervativnih cisteina, odgovaraju pozicijama 34-101 u SEQ ID NO: 100 (prekursor ALK4). Strukturno manje uređene aminokiseline koje okružuju ove cisteinom ograničene jezgarne sekvence mogu da se skrate za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ostatka na N-kraju i/ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 ostataka na C-kraju bez nužnog menjanja vezivanja liganda. Primeri skraćivanja vanćelijskih domena ALK4 na N-kraju i/ili C-kraju uključuju SEQ ID NOs: 101 i 105.
[0122] Prema tome, opšta formula za aktivni deo (npr., deo koji vezuje ligand) ALK4 sadrži aminokiseline 34-101 u odnosu na SEQ ID NO: 100. Prema tome, polipeptidi ALK4 mogu, na primer, da sadrže, suštinski se sastoje od, ili da se sastoje od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ALK4 koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 24-34 (npr., koji počinje na bilo kojoj od aminokiselina 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34) u SEQ ID NO: 100 i završava se na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 101-126 (npr., završava se na bilo kojoj od aminokiselina 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, ili 126) u SEQ ID NO: 100. Ostali primeri uključuju konstrukte koji počinju na poziciji od 24-34 (npr., bilo koja od pozicija 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34), 25-34 (npr., bilo koja od pozicija 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34), ili 26-34 (npr., bilo koja od pozicija 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34) u SEQ ID NO: 100 i završavaju se na poziciji od 101-126 (npr., bilo koja od pozicija 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, ili 126), 102-126 (npr., bilo koja od pozicija 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, ili 126), 101-125 (npr., bilo koja od pozicija 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, ili 125), 101-124 (npr., bilo koja od pozicija 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, ili 124), 101-121 (npr., bilo koja od pozicija 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, ili 121), 111-126 (npr., bilo koja od pozicija 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, ili 126), 111-125 (npr., bilo koja od pozicija 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, ili 125), 111-124 (npr., bilo koja od pozicija 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, ili 124), 121-126 (npr., bilo koja od pozicija 121, 122, 123, 124, 125, ili 126), 121-125 (npr., bilo koja od pozicija 121, 122, 123, 124, ili 125), 121-124 (npr., bilo koja od pozicija 121, 122, 123, ili 124), ili 124-126 (npr., bilo koja od pozicija 124, 125, ili 126) u SEQ ID NO: 100. Varijante unutar ovih opsega su takođe obuhvaćene, posebno one koje imaju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa odgovarajućim delom SEQ ID NO: 100.
[0123] Ovde opisane varijacije mogu da se kombinuju na različite načine. U nekim slučajevima, varijante ALK4 ne sadrže više od 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 15 konzervativnih aminokiselinskih izmena u džepu koji vezuje ligand. Mesta izvan vezujućeg džepa, na kojima varijabilnost može da bude posebno dobro tolerisana, uključuju amino i karboksi krajeve vanćelijskog domena (kao što je gore navedeno).
[0124] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na antagoniste BMP/GDF koji su heteromultimeri koji sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4, koji uključuje njegove fragmente, funkcionalne varijante i modifikovane oblike, kao i njihove upotrebe (npr., lečenje, prevenciju ili smanjenje težine PAH ili jedne ili više komplikacija PAH). Poželjno, polipeptidi ALK4 su rastvorljivi (npr., vanćelijski domen ALK4). U nekim slučajevima, heteromultimeri koji sadrže polipeptid ALK4 inhibiraju (npr., Smad signalizacija) jedan ili više liganda superfamilije TGFβ [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3, BMP10, i/ili BMP9]. U nekim slučajevima, heteromultimeri koji sadrže polipeptid ALK4 vezuju jedan ili više liganda superfamilije TGFβ [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3, BMP10, i/ili BMP9]. U nekim slučajevima, heteromultimeri sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100% identičan aminokiselinama 34-101 u odnosu na SEQ ID NO: 100. U nekim slučajevima, heteromultimeri sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 i 124. U nekim slučajevima, heteromultimer sadrži najmanje jedan polipeptid ALK4 koji se sastoji ili se suštinski sastoji od najmanje jednog polipeptida ALK4 koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 i 124.
[0125] U određenim slučajevima, predmetno otkriće se odnosi na heteromultimerne komplekse koji sadrže jedan ili više receptorskih polipeptida ALK4 (npr., SEQ ID Nos: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 i 124 i njihove varijante) i jedan ili više receptorskih polipeptida ActRIIB (npr., SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 i 120 i njihove varijante), koje su ovde uopšteno označene kao "heteromultimerni kompleksi ALK4:ActRIIB" ili "heteromultimeri ALK4:ActRIIB", uključujući njihove upotrebe (npr., povećanje imunološkog odgovora kod pacijenta kome je to potrebno i lečenje kancera). Poželjno, heteromultimeri ALK4:ActRIIB su rastvorljivi [npr., heteromultimerni kompleks sadrži rastvorljivi deo (domen) receptora ALK4 i rastvorljivi deo (domen) receptora ActRIIB]. Uopšteno, vanćelijski domeni ALK4 i ActRIIB odgovaraju rastvorljivom delu ovih receptora. Prema tome, u nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže vanćelijski domen receptora ALK4 i vanćelijski domen receptora ActRIIB. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB inhibiraju (npr., Smad signalizacija) jedan ili više liganda superfamilije TGFβ [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E), BMP6, GDF3, BMP10, i/ili BMP9]. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB vezuju jedan ili više liganda superfamilije TGFβ [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E), BMP6, GDF3, BMP10, i/ili BMP9]. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 i 124. U nekim slučajevima, heteromultimerni kompleksi ALK4:ActRIIB otkrića sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ALK4 koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 24-34, 25-34, ili 26-34 u SEQ ID NO: 100 i završava se na poziciji od 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101-121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124, ili 124-126 u SEQ ID NO: 100. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 34-101 u odnosu na SEQ ID NO: 100. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4-ActRIIB sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci bilo koje od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 i 120. U nekim slučajevima, heteromultimerni kompleksi ALK4:ActRIIB otkrića sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična delu ActRIIB koji počinje na ostatku koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 20-29, 20-24, 21-24, 22-25, ili 21-29 i završava se na poziciji od 109-134, 119-134, 119-133, 129-134, ili 129-133 u SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1. U nekim slučajevima, heteromultimeri ALK4:ActRIIB sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB koji sadrži, suštinski se sastoji od, sastoji se od sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1. U određenim slučajevima, heteromultimerni kompleksi ALK4:ActRIIB otkrića sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB pri čemu pozicija koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 nije kisela aminokiselina (tj., nisu prirodni D ili E aminokiselinski ostaci ili veštački kiseli aminokiselinski ostatak). Heteromultimeri ALK4:ActRIIB otkrića uključuju, npr., heterodimere, heterotrimere, heterotetramere i druge oligomerne strukture višeg reda. Videti, npr., slike 21-23. U određenim poželjnim slučajevima, heteromultimerni kompleksi otkrića su heterodimeri ALK4:ActRIIB.
[0126] U nekim slučajevima, ovo otkriće predviđa stvaranje funkcionalnih varijanti modifikovanjem strukture polipeptida ActRII i/ili ALK4 u takve svrhe kao što je povećanje terapijske efikasnosti ili stabilnosti (npr. rok trajanja i otpornost na proteolitičku razgradnju in vivo). Varijante mogu da se dobiju supstitucijom, delecijom, adicijom aminokiselina ili njihovim kombinacijama. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom (npr. konzervativne mutacije) neće imati veliki efekat na biološku aktivnost rezultujućeg molekula. Konzervativne zamene su one koje se dešavaju unutar porodice aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. To da li promena aminokiselinske sekvence polipeptida otkrića rezultira funkcionalnim homologom može lako da se utvrdi procenom sposobnosti varijantnog polipeptida da proizvede odgovor u ćelijama na način sličan polipeptidu divljeg tipa, ili da se veže za jedan ili više liganda TGF-beta, uključujući, na primer, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodal, neurotrofni faktor poreklom iz ćelija glije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty.
[0127] U određenim slučajevima, ovo otkriće obuhvata specifične mutacije polipeptida ActRII i/ili ALK4 kako bi se izmenila glikozilacija polipeptida. Takve mutacije mogu da budu odabrane tako da uvedu ili eliminišu jedno ili više mesta glikozilacije, kao što su O-vezana ili N-vezana mesta glikozilacije. Mesta za prepoznavanje glikozilacije povezana sa asparaginom obično sadrže tripeptidnu sekvencu, asparagin-X-treonin ili asparagin-X-serin (gde je "X" bilo koja aminokiselina) koju specifično prepoznaju odgovarajući ćelijski enzimi glikozilacije. Izmena se takođe može izvršiti adicijom ili supstitucijom jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci polipeptida (za O-vezana mesta glikozilacije). Raznovrsne supstitucije ili delecije aminokiselina na jednoj ili obe od prve ili treće aminokiselinske pozicije mesta za prepoznavanje glikozilacije (i/ili delecije aminokiseline na drugoj poziciji) dovode do izostanka glikozilacije na modifikovanoj sekvenci tripeptida. Drugi način za povećanje broja ugljenohidratnih fragmenata na polipeptidu je hemijskim ili enzimskim spajanjem glikozida sa polipeptidom. U zavisnosti od korišćenog načina spajanja, šećer/šećeri mogu da budu vezani za (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksilne grupe; (c) slobodne sulfhidrilne grupe poput cisteinskih; (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one kod serina, treonina ili hidroksiprolina; (e) aromatične ostatke kao što su oni kod fenilalanina, tirozina ili triptofana; ili (f) amidnu grupu glutamina. Uklanjanje jednog ili više ugljenohidratnih fragmenata prisutnih na polipeptidu može da se postigne hemijski i/ili enzimski. Hemijska deglikozilacija može da uključuje, na primer, izlaganje polipeptida jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman rezultira cepanjem većine ili svih šećera, osim povezujućih šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok aminokiselinski niz ostaje netaknut. Enzimsko cepanje fragmenata ugljenih hidrata na polipeptidima može da se postigne upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza kako su opisali Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138: 350]. Sekvenca polipeptida može da se prilagodi, prema potrebi, u zavisnosti od tipa ekspresionog sistema koji se koristi, jer ćelije sisara, kvasca, insekata i biljaka mogu da uvedu različite obrasce glikozilacije na koje može da utiče aminokiselinska sekvenca peptida. Uopšteno, polipeptidi ovog otkrića za upotrebu kod ljudi mogu da se eksprimiraju u ćelijskoj liniji sisara koja obezbeđuje odgovarajuću glikozilaciju, kao što su ćelijske linije HEK293 ili CHO, mada se očekuje da će biti korisne i druge sisarske ćelijske linije za ekspresiju.
[0128] Ovo otkriće dalje razmatra postupak generiranja mutanata, posebno skupova kombinatornih mutanata polipeptida ActRII i/ili ALK4, kao i skraćenih mutanata. Pulovi kombinatornih mutanata su posebno korisni za identifikaciju funkcionalno aktivnih (npr. koje vezuju ligand GDF/BMP) sekvenci ActRII. Smisao pretraživanja takvih kombinatornih biblioteka može da bude stvaranje, na primer, polipeptidnih varijanti koje imaju izmenjena svojstva, poput izmenjene farmakokinetike ili izmenjenog vezivanja liganda. U nastavku su dati razni skrining testovi koji se mogu koristiti za procenu varijanti. Na primer, varijante ActRII i/ili ALK4, i heteromultimeri koji ih sadrže, mogu da se pretraže u pogledu sposobnosti vezivanja za jedan ili više liganda GDF/BMP (npr. BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin AC, nodal, neurotrofni faktor poreklom iz ćelija glije (GDNF), neurturin,
1
artemin, persefin, MIS i Lefty), kako bi se sprečilo vezivanje liganda GDF/BMP za polipeptid ActRII i/ili ALK4, kao i za njihove heteromultimere, i/ili da bi se ometala signalizacija izazvana ligandom GDF/BMP.
[0129] Aktivnost polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 i heterodimera ALK4:ActRIIB može da se ispita i u ćelijskom ili in vivo testu. Na primer, procenjen je efekat polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB na ekspresiju gena koji su uključeni u PH patogenezu. To se, prema potrebi, može izvesti u prisustvu jednog ili više rekombinantnih proteina liganda (npr. BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB aktivin AC, nodal, neurotrofni faktor poreklom iz ćelija glije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty), a ćelije mogu da budu transfektovane tako da proizvode polipeptid ActRII, polipeptid ALK4 ili heterodimer ALK4:ActRIIB, i opciono, ligand GDF/BMP. Slično tome, polipeptid ActRII, polipeptid ALK4 ili heterodimer ALK4:ActRIIB mogu da se daju mišu ili drugoj životinji i efekti na patogenezu PH mogu da se procene upotrebom postupaka priznatih u tehnici. Slično tome, aktivnost polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB ili njihove varijante može da se ispita u prekursorskim ćelijama krvnih zrnaca u pogledu bilo kakvog efekta na rast ovih ćelija, na primer, pomoću testova kako su ovde opisani i onih uobičajenih u tehnici. Reporterski gen koji reaguje na SMAD može da se koristi u takvim ćelijskim linijama za praćenje delovanja na nishodnu signalizaciju.
[0130] Moguće je stvoriti kombinatorno izvedene varijante koje imaju povećanu selektivnost ili generalno povećanu potenciju u odnosu na referentni polipeptid ActRII, polipeptid ALK4 ili heterodimer ALK4:ActRIIB. Takve varijante, kada se eksprimiraju sa rekombinantnih DNK konstrukata, mogu da se upotrebe u protokolima genske terapije. Slično tome, mutagenezom mogu da se dobiju varijante koje imaju unutarćelijski polu-život drastično različit od odgovarajućeg nemodifikovanog polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB. Na primer, izmenjeni protein se može učiniti stabilnijim ili manje stabilnim na proteolitičku razgradnju ili druge ćelijske procese koji rezultiraju uništenjem ili drugačijom inaktivacijom nemodifikovanog polipeptida. Takve varijante, i geni koji ih kodiraju, mogu da se upotrebe da izmene nivoe polipeptidnog kompleksa modulacijom polu-života polipeptida. Na primer, kratak polu-život može da dovede do kratkotrajnijih bioloških efekata i, kada su deo inducibilnog sistema ekspresije, mogu da omoguće strožu kontrolu nivoa rekombinantnog polipeptidnog kompleksa u ćeliji. U Fc fuzionom proteinu, mutacije mogu da se uvedu u linker
2
(ako postoji) i/ili Fc deo, kako bi se izmenio polu-život polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB.
[0131] Kombinatorna biblioteka može da se proizvede pomoću degenerisane biblioteke gena koji kodiraju biblioteku polipeptida od kojih svaki uključuje bar deo sekvenci potencijalnog polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB. Na primer, smeša sintetičkih oligonukleotida može se enzimski povezati u genske sekvence tako da degenerisani skup nukleotidnih sekvenci koje potencijalno kodiraju ActRII i/ili ALK4 može da se eksprimira kao pojedinačni polipeptidi, ili alternativno, kao skup većih fuzionih proteina (npr. za prikaz na fagu).
[0132] Postoji mnogo načina na koje se biblioteka potencijalnih homologa može generisati iz degenerisane oligonukleotidne sekvence. Hemijska sinteza degenerisane genske sekvence može da se obavi u automatskom sintetizeru DNK, i sintetički geni mogu zatim da se povežu u odgovarajući ekspresioni vektor. Sinteza degenerisanih oligonukleotida je dobro poznata u tehnici [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc.3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; i Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Takve tehnike su korišćene u usmerenoj evoluciji drugih proteina [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; kao i SAD patenti br: 5,223,409, 5,198,346, i 5,096,815].
[0133] Alternativno, za stvaranje kombinatorne biblioteke mogu da se koriste drugi oblici mutageneze. Na primer, polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4 i heterodimeri ALK4:ActRIIB otkrića mogu da se generišu i izoluju iz biblioteke skriningom, upotrebom, na primer, mutageneze alaninskim skeniranjem [Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; i Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085], linker-skenirajuće mutageneze [Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; i Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316], saturacione mutageneze [Meyers et al., (1986) Science 232:613]; PCR mutageneze [Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1: 11-19]; ili nasumične mutageneze, uključujući hemijsku mutagenezu [Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; i Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. Linker-skenirajuća mutageneza, posebno u kombinatornom okruženju, atraktivna je metoda za identifikovanje skraćenih (bioaktivnih) oblika polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB.
[0134] U struci je poznat širok spektar tehnika za pretraživanje genskih proizvoda kombinatornih biblioteka napravljenih pomoću tačkastih mutacija i skraćivanja, i, u tu svrhu, za pretraživanje cDNK biblioteka za genske proizvode koji imaju određeno svojstvo. Takve tehnike će uglavnom moći da se prilagode za brzo pretraživanje genskih biblioteka napravljenih kombinatornom mutagenezom polipeptida ActRII. Najčešće korišćene tehnike za pretraživanje velikih genskih biblioteka obično obuhvataju kloniranje genske biblioteke u replikabilne ekspresione vektore, transformisanje pogodnih ćelija dobijenom bibliotekom vektora i ekspresiju kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti omogućava relativno laku izolaciju vektora koji kodira gen čiji je proizvod detektovan. Poželjni testovi uključuju testove vezivanja liganda (npr. BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodal, neurotrofilni faktor poreklom iz ćelija glije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty) i/ili testove ćelijske signalizacije posredovane ligandom.
[0135] Kao što će stručnjak u ovoj oblasti prepoznati, većina opisanih mutacija, varijanti ili modifikacija opisanih u ovom dokumentu može da se izvede na nivou nukleinske kiseline ili, u nekim slučajevima, post-translacionom modifikacijom ili hemijskom sintezom. Takve tehnike su dobro poznate u tehnici, a neke od njih su ovde opisane. Delom, ovo otkriće identifikuje funkcionalno aktivne delove (fragmente) i varijante polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 ili heterodimera ALK4:ActRIIB koji mogu da se upotrebe kao smernice za generisanje i upotrebu drugih varijanti polipeptida ActRII u okviru ovde datog otkrića.
[0136] U određenim slučajevima, funkcionalno aktivni fragmenti polipeptida ActRII, polipeptida ALK4 i heterodimera ALK4:ActRIIB ovog otkrića mogu da se dobiju pretraživanjem polipeptida koji su rekombinantno proizvedeni sa odgovarajućeg fragmenta nukleinske kiseline koja kodira polipeptide ActRII i/ili ALK4. Pored toga, fragmenti se mogu hemijski sintetizovati korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti, kao što je konvencionalna Merrifieldova f-Moc ili t-Boc hemija čvrste faze. Fragmenti mogu da se proizvedu (rekombinantno ili hemijskom sintezom) i ispitaju kako bi se identifikovali oni peptidilni fragmenti koji mogu da funkcionišu
4
kao antagonisti (inhibitori) receptora ActRII i/ili ALK4 i/ili jednog ili više liganda (npr. BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodal, neurotrofilni faktor poreklom iz ćelija glije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty).
[0137] U određenim slučajevima, polipeptid ActRII, polipeptid ALK4 i/ili heterodimer ALK4:ActRIIB ovog otkrića može dodatno da sadrži post-translacione modifikacije pored bilo kojih koje su prirodno prisutne u polipeptidu ActRII, polipeptidu ALK4 ili heterodimeru ALK4:ActRIIB. Takve modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. Kao rezultat, polipeptid ActRII, polipeptid ALK4 ili heterodimer ALK4:ActRIIB može da sadrži ne-aminokiselinske elemente, kao što su polietilen glikoli, lipidi, polisaharid ili monosaharid i fosfati. Efekti takvih ne-aminokiselinskih elemenata na funkcionalnost polipeptidne zamke za ligande mogu da se ispitaju kao što je ovde opisano za druge varijante ActRII, AKL4 i ALK4:ActRIIB. Kada se polipeptid otkrića proizvodi u ćelijama cepanjem novonastalog oblika polipeptida, post-translaciona obrada takođe može da bude važna za pravilno savijanje i/ili funkciju proteina. Različite ćelije (npr. CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ili HEK293) imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za takve post-translacione aktivnosti i mogu se odabrati kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada polipeptida ActRII.
[0138] U određenim slučajevima, polipeptidi ActRII i ALK4 ovog otkrića uključuju fuzione proteine koji imaju najmanje deo (domen) polipeptida ActRII ili ALK4 i jedan ili više heterolognih delova (domena). Poznati primeri takvih fuzionih domena uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidin, Glu-Glu, glutation S-transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region teškog lanca imunoglobulina (Fc), maltoza-vezujući protein (MBP) ili humani serumski albumin. Fuzioni domen može da bude izabran tako da daje željeno svojstvo. Na primer, neki fuzioni domeni su posebno korisni za izolaciju fuzionih proteina afinitetnom hromatografijom. U svrhu afinitetnog prečišćavanja koriste se odgovarajuće matrice za afinitetnu hromatografiju, poput glutation-, amilaza- i nikl- ili kobalt-konjugovanih smola. Mnoge od takvih matrica dostupne su u obliku "kompleta", poput sistema za prečišćavanje Pharmacia GST i sistema QIAexpress™ (Qiagen) korisnog sa fuzionim partnerima (HIS6). Kao drugi primer, fuzioni domen može da bude izabran tako da olakša detekciju polipeptida ActRII ili ALK4. Primeri takvih domena za detekciju uključuju različite fluorescentne proteine (npr.
GFP), kao i „epitopske oznake“, koje su obično kratke peptidne sekvence za koje je dostupno specifično antitelo. Dobro poznate epitopske oznake za koje su dostupna specifična monoklonska antitela uključuju FLAG, hemaglutinin virusa gripa (HA) i c-myc oznake. U nekim slučajevima, fuzioni domeni imaju mesto cepanja proteazom, kao što je faktor Xa ili trombin, što omogućava relevantnoj proteazi da delimično digestira fuzione proteine i time oslobodi rekombinantne proteine iz njih. Oslobođeni proteini mogu zatim da se odvoje od fuzionog domena naknadnim hromatografskim razdvajanjem. Ostale vrste fuzionih domena koje se mogu odabrati uključuju multimerizacione (npr. dimerizacione, tetramerizacione) domene i funkcionalne domene (koji obezbeđuju dodatnu biološku funkciju) uključujući, na primer, konstantne domene iz imunoglobulina (npr. Fc domene).
[0139] U određenim slučajevima, polipeptidi ActRII i ALK4 ovog otkrića sadrže jednu ili više modifikacija koje mogu da „stabilizuju“ polipeptide. Pod „stabilizacijom“ podrazumeva se sve što povećava in vitro polu-život, polu-život u serumu, bez obzira da li je to zbog smanjene razgradnje, smanjenog bubrežnog klirensa ili drugog farmakokinetičkog efekta sredstva. Na primer, takve modifikacije povećavaju rok trajanja polipeptida, povećavaju polu-život polipeptida u cirkulaciji i/ili smanjuju proteolitičku razgradnju polipeptida. Takve stabilizacione modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, fuzione proteine (uključujući, na primer, fuzione proteine koji sadrže domen polipeptida ActRII (ili polipeptida ALK4) i stabilizujući domen), modifikacije mesta glikozilacije (uključujući, na primer, dodavanje mesta glikozilacije polipeptidu prema otkriću) i modifikacije ugljenohidratnog fragmenta (uključujući, na primer, uklanjanje ugljenohidratnih fragmenata iz polipeptida prema otkriću). Kako se ovde koristi, termin "stabilizujući domen" odnosi se ne samo na fuzioni domen (npr. Fc domen imunoglobulina) kao u slučaju fuzionih proteina, već uključuje i neproteinske modifikacije kao što je ugljenohidratni fragment ili neproteinski fragment, kao što je npr. polietilen glikol. U određenim poželjnim slučajevima, polipeptid ActRII (ili polipeptid ALK4) je fuzionisan sa heterolognim domenom koji stabilizuje polipeptid („stabilizujući“ domen), poželjno heterolognim domenom koji povećava stabilnost polipeptida in vivo. Poznato je da fuzije sa konstantnim domenom imunoglobulina (npr. Fc domen) daju poželjna farmakokinetička svojstva širokom spektru proteina. Slično tome, fuzije sa humanim serumskim albuminom mogu da obezbede poželjna svojstva.
[0140] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja može da se upotrebi za Fc deo humanog IgG1 (G1Fc) je prikazan u nastavku (SEQ ID NO: 14). Podvlačenjem tačkastom linijom označen je region zgloba, a punom linijom pozicije sa prirodnim varijantama. Delom, otkriće pruža polipeptide koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO: 14. Prirodne varijante u G1Fc bi uključivale E134D i M136L prema sistemu numerisanja upotrebljenom za SEQ ID NO: 14 (videti Uniprot P01857).
[0141] Opciono, Fc domen IgG1 ima jednu ili više mutacija na ostacima kao što su Asp-265, lizin 322 i Asn-434. U određenim slučajevima, mutirani Fc domen IgG1 koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr. Asp-265 mutaciju) ima smanjenu sposobnost vezivanja za Fcγ receptor u odnosu na Fc domen divljeg tipa. U drugim slučajevima, mutirani Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr. mutaciju Asn-434) ima povećanu sposobnost vezivanja za Fc-receptor povezan sa MHC klasom I (FcRN) u odnosu na Fc domen IgG1 divljeg tipa.
[0142] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja može da bude upotrebljena za Fc deo humanog IgG2 (G2Fc) prikazan je ispod (SEQ ID NO: 15). Podvlačenjem tačkastom linijom označen je region zgloba, a dvostrukom linijom pozicije na kojima postoje neslaganja sa bazom podataka u sekvenci (prema UniProt P01859). Delom, otkriće pruža polipeptide koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO: 15.
[0143] Dva primera aminokiselinskih sekvenci koje mogu da budu upotrebljene za Fc deo humanog IgG3 (G3Fc) prikazana su ispod. Region zgloba u G3Fc može da bude i do četiri puta duži nego u ostalim Fc lancima i sadrži tri identična segmenta od 15 ostataka kojima prethodi sličan segment od 17 ostataka. Prva G3Fc sekvenca prikazana ispod (SEQ ID NO: 16) sadrži kratak region zgloba koji se sastoji od jednog segmenta od 15 ostataka, dok druga G3Fc sekvenca (SEQ ID NO: 17) sadrži region zgloba cele dužine. U oba slučaja, podvlačenjem tačkastom linijom označen je region zgloba, a punom linijom pozicije sa prirodnim varijantama prema UniProt P01859. Delom, otkriće pruža polipeptide koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NOs: 16 i 17.
[0144] Prirodne varijante u G3Fc (na primer, videti Uniprot P01860) uključuju E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y kada se prevedu u sistem numerisanja koji se koristi u SEQ ID NO: 16, a ovo otkriće obezbeđuje fuzione proteine koji sadrže G3Fc domene koji sadrže jednu ili više ovih varijacija. Pored toga, gen humanog imunoglobulina IgG3 (IGHG3) pokazuje strukturni polimorfizam koji se odlikuje različitim dužinama zgloba [videti Uniprot P01859]. Konkretno, varijanti WIS nedostaje veći deo regiona V i ceo region CH1. Ima dodatnu međulančanu disulfidnu vezu na poziciji 7 pored one na poziciji 11 koja je normalno prisutna u regionu zgloba. U varijanti ZUC nedostaje veći deo regiona V, ceo region CH1 i deo zgloba. Varijanta OMM može da predstavlja alelni oblik ili drugu potklasu gama lanca. Ovo otkriće pruža dodatne fuzione proteine koji sadrže G3Fc domene koji sadrže jednu ili više ovih varijanti.
[0145] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja može da bude upotrebljena za Fc deo humanog IgG4 (G4Fc) prikazan je ispod (SEQ ID NO: 18). Podvlačenjem tačkastom linijom označen je region zgloba. Delom, otkriće pruža polipeptide koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO: 18.
[0146] Ovde su predstavljene razne konstruisane mutacije u Fc domenu u odnosu na sekvencu G1Fc (SEQ ID NO: 14), a analogne mutacije u G2Fc, G3Fc i G4Fc mogu da se izvedu iz njihovog poravnanja sa G1Fc na slici 4. Zbog nejednakih dužina zgloba, analogne pozicije Fc zasnovane na poravnanju izotipa (slika 4) poseduju različite aminokiselinske brojeve u SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 i 18. Takođe treba zapaziti da će data aminokiselinska pozicija u imunoglobulinskoj sekvenci koja se sastoji od zgloba, regiona CH2 i CH3 (npr. SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 i 18) biti identifikovana različitim brojem u odnosu na istu poziciju kada numerisanje obuhvata ceo konstantni domen teškog lanca IgG1 (koji se sastoji od regiona CH1, zgloba, CH2 i CH3) kao u bazi podataka Uniprot. Na primer, korelacija između izabranih CH3 pozicija u sekvenci humanog G1Fc (SEQ ID NO: 14), konstantnog domena teškog lanca humanog IgG1 (Uniprot P01857) i teškog lanca humanog IgG1 je sledeća.
[0147] U određenim slučajevima, ovde otkriveni polipeptidi mogu da formiraju proteinske komplekse koji sadrže najmanje jedan polipeptid ALK4 povezan, kovalentno ili nekovalentno, sa najmanje jednim polipeptidom ActRIIB. Poželjno je da ovde otkriveni polipeptidi formiraju heterodimerne komplekse, mada su takođe uključeni i heteromultimerni kompleksi višeg reda (heteromultimeri) kao što su, ali bez ograničenja, heterotrimeri, heterotetrameri i druge oligomerne strukture (videti, na primer, sliku 21-23). U nekim slučajevima, polipeptidi ALK4 i/ili ActRIIB sadrže najmanje jedan domen za multimerizaciju. Kao što je ovde otkriveno, termin "domen za multimerizaciju" odnosi se na aminokiselinu ili sekvencu aminokiselina koja podstiče kovalentnu ili nekovalentnu interakciju između najmanje prvog polipeptida i najmanje drugog polipeptida. Ovde otkriveni polipeptidi mogu se spojiti kovalentno ili nekovalentno sa domenom za multimerizaciju. Poželjno je da domen za multimerizaciju podstiče interakciju između prvog polipeptida (npr. polipeptida ALK4) i drugog polipeptida (npr. polipeptida ActRIIB) kako bi se podstaklo formiranje heteromultimera (npr. formiranje heterodimera), a opciono ometa ili na drugi način defavorizuje formiranje homomultimera (npr., formiranje homodimera), povećavajući time prinos željenog heteromultimera (vidi, npr., sliku 22).
[0148] Mnogi postupci poznati u struci mogu da se koriste za generisanje heteromultimera ALK4:ActRIIB. Na primer, disulfidne veze koje se ne javljaju u prirodi mogu da se konstruišu zamenom na prvom polipeptidu (npr. polipeptidu ALK4) prirodne aminokiseline ostatkom koji sadrži slobodni tiol, kao što je cistein, tako da slobodni tiol stupa u interakciju sa drugim ostatkom koji sadrži slobodni tiol na drugom polipeptidu (npr. polipeptid ActRIIB) tako da se formira disulfidna veza između prvog i drugog polipeptida. Dodatni primeri interakcija za podsticanje stvaranja heteromultimera uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske interakcije kao što je opisano u Kjaergaard et al., WO2007147901; efekte elektrostatičkih interakcija kao što je opisano u Kannan et al., U.S.8,592,562; interakcije kalemova kao što je opisano u Christensen et al., U.S.20120302737; leucinske rajsferšluse kao što je opisano u Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584; i motive heliks-zavoj-heliks kao što je opisano u Pack et al., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. Povezivanje različitih segmenata može se dobiti, npr., kovalentnim vezivanjem, na primer hemijskim umrežavanjem, peptidnim linkerima, disulfidnim mostovima, itd., ili afinitetnim interakcijama kao primenom tehnologije avidin-biotin ili leucinskog rajsferšlusa.
[0149] U određenim slučajevima, domen za multimerizaciju može da sadrži jednu komponentu interagujućeg para. U nekim slučajevima, ovde otkriveni polipeptidi mogu da formiraju proteinske komplekse koji sadrže prvi polipeptid koji je kovalentno ili nekovalentno povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu polipeptida ALK4 i aminokiselinsku sekvencu prvog člana interagujućeg para; a drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu polipeptida ActRIIB i aminokiselinsku sekvencu drugog člana interagujućeg para. Interagujući par mogu da predstavljaju bilo koje dve polipeptidne sekvence koje interaguju stvarajući kompleks, posebno heterodimerni kompleks, mada u funkcionalnim primerima takođe može da se koristi interagujući par koji može da formira homodimerni kompleks. Jedan član interagujućeg para može da bude fuzionisan sa polipeptidom ALK4 ili ActRIIB kako je ovde opisano, uključujući, na primer, polipeptidnu sekvencu koja sadrži, suštinski se sastoji, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 101 i 103. Može se odabrati interagujući par koji će dati poboljšano svojstvo/aktivnost, poput povećanog polu-života u serumu, ili koji deluje kao adapter na koji se vezuje drugi fragment za poboljšanje svojstva/aktivnosti. Na primer, fragment polietilen glikola može da se veže za jednu ili obe komponente interagujućeg para kako bi se obezbedilo poboljšano svojstvo/aktivnost kao što je poboljšan polu-život u serumu.
[0150] Prvi i drugi član interagujućeg para mogu da budu asimetrični par, što znači da se članovi para preferencijalno međusobno udružuju, umesto da se samo-udružuju. Shodno tome, prvi i drugi član asimetričnog interagujućeg para mogu se udružiti da bi formirali heterodimerni kompleks (vidi, na primer, sliku 22). Alternativno, interagujući par može da bude neusmeren, što znači da članovi para mogu međusobno da se udružuju ili da se samo-udružuju bez značajnih preferencija i prema tome mogu da imaju iste ili različite aminokiselinske sekvence. Prema tome, prvi i drugi član neusmerenog interagujućeg para mogu da se udruže da bi formirali homodimerni kompleks ili heterodimerni kompleks. Po želji, prvi član interagujućeg para (npr. asimetrični par ili neusmereni interagujući par) kovalentno se udružuje sa drugim članom interagujućeg para. Po želji, prvi član interagujućeg para (npr. asimetrični par ili neusmereni interagujući par) nekovalentno se udružuje sa drugim članom interagujućeg para.
[0151] Kao specifične primere, ovo otkriće daje fuzione proteine koji sadrže ALK4 ili ActRIIB fuzionisane sa polipeptidom koji sadrži konstantni domen imunoglobulina, kao što je domen CH1, CH2 ili CH3 poreklom iz humanog IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 koji je modifikovan tako
1
da podstiče stvaranje heteromultimera. Problem koji se javlja kod proizvodnje velikog obima asimetričnih proteina na bazi imunoglobulina iz jedne ćelijske linije poznat je kao „problem udruživanja lanaca“. Kao što se u proizvodnji bispecifičnih antitela često javlja, problem udruživanja lanaca tiče se izazova efikasne proizvodnje željenog višelančanog proteina iz višestrukih kombinacija koje inherentno nastaju kada se različiti teški lanci i/ili laki lanci proizvode u jednoj ćelijskoj liniji [Klein et al (2012) mAbs 4: 653-663]. Ovaj problem je najizraženiji kada se u istoj ćeliji proizvode dva različita teška lanca i dva različita laka lanca, u kom slučaju postoji ukupno 16 mogućih kombinacija lanaca (iako su neke od njih identične) pri čemu je obično poželjan samo jedan. Ipak, isti princip objašnjava smanjeni prinos željenog višelančanog fuzionog proteina koji uključuje samo dva različita (asimetrična) teška lanca.
[0152] U tehnici su poznati različiti postupci koji povećavaju željeno uparivanje lanaca fuzionih polipeptida koji sadrže Fc u jednoj ćelijskoj liniji da bi se proizveo poželjni asimetrični fuzioni protein sa prihvatljivim prinosima [Klein et al (2012) mAbs 4:653-663; i Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Postupci za dobijanje željenog uparivanja lanaca koji sadrže Fc uključuju, ali se ne ograničavaju na, uparivanje zasnovano na naelektrisanju (elektrostatičke interakcije), steričko uparivanje "ispupčenja-u-udubljenjima", uparivanje SEEDbody i uparivanje na bazi leucinskog rajsferšlusa [Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et al (2010); 285:19637-19646; Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, i WO 2011/034605]. Kako je ovde opisano, ovi postupci mogu da se upotrebe za stvaranje heteromultimernih kompleksa ALK4-Fc:ActRIIB-Fc. Videti, npr., sliku 23.
[0153] Heteromultimeri ALK4:ActRIIB i postupak za pravljenje takvih heteromultimera prethodno je opisan. Videti, na primer, WO 2016/164497.
[0154] Podrazumeva se da različiti elementi fuzionih proteina (npr., Fc fuzionih proteina imunoglobulina) mogu da budu raspoređeni na bilo koji način koji je u skladu sa željenom funkcionalnošću. Na primer, domen polipeptida ActRII (ili polipeptida ALK4) može da bude postavljen C-terminalno do heterolognog domena, ili alternativno, heterologni domen može da bude postavljen C-terminalno do domena polipeptida ActRII (ili polipeptida ALK4). Domen polipeptida ActRII (ili polipeptida ALK4) i heterologni domen ne moraju da budu susedni u fuzionom proteinu, a dodatni domeni ili sekvence aminokiselina mogu da budu uključeni C- ili N-terminalno do bilo kog domena ili između domena.
2
[0155] Na primer, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) receptora može da sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u formuli A-B-C. Deo B odgovara polipeptidnom domenu ActRII (ili ALK4). Delovi A i C mogu nezavisno da predstavljaju nijednu, jednu ili više aminokiselina, a oba, i A i C deo, kada su prisutni, heterologni su u odnosu na B. A i/ili C delovi mogu da budu vezani za B deo preko sekvence linkera. Linker može da bude bogat glicinom (npr.2-10, 2-5, 2-4, 2-3 ostatka glicina) ili ostacima glicina i prolina i može, na primer, da sadrži jednu sekvencu treonina/serina i glicina ili ponavljajuće sekvence treonina/serina i/ili glicina, npr., GGG (SEQ ID NO: 19), GGGG (SEQ ID NO: 20), TGGGG(SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), TGGG (SEQ ID NO: 23), SGGG(SEQ ID NO: 24), ili GGGGS (SEQ ID NO: 25) singlete ili ponovke. U određenim slučajevima, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u formuli A-B-C, gde je A vodeća (signalna) sekvenca, B se sastoji od polipeptidnog domena ActRII (ili ALK4), a C je deo polipeptida koji poboljšava jedno ili više od in vivo stabilnosti, polu-života in vivo, unosa/primene, lokalizacije ili raspodele u tkivu, stvaranja proteinskih kompleksa i/ili prečišćavanja. U određenim slučajevima, fuzioni protein ActRII (ili ALK4) sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u formuli A-B-C, gde je A vodeća sekvenca TPA, B se sastoji od polipeptidnog domena receptora ActRII (ili ALK4), a C je Fc domen imunoglobulina. Poželjni fuzioni proteini sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 32, 36, 39, 40, 42, 45, 46, 48, 69, 74, 77, 78, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 122 i 124.
[0156] U poželjnim slučajevima, polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4 i heteromultimeri ALK4:ActRIIB koji se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima su izolovani polipeptidi. Kako se ovde koristi, izolovani protein ili polipeptid je onaj koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim slučajevima, polipeptid otkrića se prečišćava do čistoće veće od 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, određeno, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografskim (npr. jonoizmenjivačka ili reverzno-fazna HPLC) metodama. Metode za procenu čistoće dobro su poznate u tehnici [videti, na primer, Flatman i sar., (2007) J. Chromatogr. B 848: 79-87]. U nekim slučajevima, polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4 i heteromultimeri ALK4:ActRIIB koji se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima su rekombinantni polipeptidi.
[0157] Polipeptidi ActRII, polipeptidi ALK4 i heteromultimeri ALK4:ActRIIB ovog otkrića mogu da budu proizvedeni različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, polipeptidi ovog otkrića mogu da se sintetizuju korišćenjem standardnih tehnika hemije proteina, poput onih opisanih u Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) i Grant GA (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Pored toga, automatizovani sintetizeri peptida su komercijalno dostupni (npr. Advanced ChemTech model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativno, polipeptidi prema otkriću, uključujući njihove fragmente ili varijante, mogu da se proizvedu rekombinantno upotrebom različitih ekspresionih sistema [npr. E. coli, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS ćelije, bakulovirus], kao što je dobro poznato u struci. U sledećem slučaju, modifikovani ili nemodifikovani polipeptidi ovog otkrića mogu da se proizvedu digestijom rekombinantno proizvedenih polipeptida ActRII cele dužine, korišćenjem, na primer, proteaze, npr. tripsina, termolizina, himotripsina, pepsina ili konvertujućeg enzima uparenih baznih aminokiselina (PACE). Kompjuterska analiza (pomoću komercijalno dostupnog softvera, npr. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) može da se koristi za identifikaciju mesta proteolitičkog cepanja. Alternativno, takvi polipeptidi mogu da se proizvedu iz rekombinantno generisanih polipeptida ActRII ili ALK4 cele dužine korišćenjem hemijskog cepanja (npr. cijanogen bromid, hidroksilamin, itd.).
3. Nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide ActRII i ALK4 i njihove varijante
[0158] U određenim slučajevima, predmetno otkriće obezbeđuje izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide ActRII i/ili ALK4 (uključujući njihove fragmente, funkcionalne varijante i fuzione proteine). Na primer, SEQ ID NO: 7 kodira prirodni humani prekursorski polipeptid ActRIIB (varijanta R64 koja je gore opisana), dok SEQ ID NO: 8 kodira obrađeni vanćelijski domen ActRIIB (varijanta R64 koja je gore opisana). Predmetne nukleinske kiseline mogu da budu jednolančane ili dvolančane. Takve nukleinske kiseline mogu da budu molekuli DNK ili RNK. Ove nukleinske kiseline mogu da se koriste, na primer, u postupcima za pravljenje polipeptida zamke za ligande na bazi ActRII, kako je ovde opisano.
[0159] Kako se ovde koristi, izraz izolovana nukleinska kiselina/kiseline odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan van hromozoma ili na lokaciji u hromozomu koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0160] U određenim slučajevima, podrazumeva se da nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide ActRII ili ALK4 otkrića uključuju nukleinske kiseline koje predstavljaju varijante
4
bilo koje od SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135. Varijante nukleotidnih sekvenci uključuju sekvence koje se razlikuju po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija, adicija, ili delecija uključujući alelne varijante, i prema tome, uključivaće kodirajuću sekvencu koja se razlikuje od nukleotidne sekvence prikazane u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135.
[0161] U određenim slučajevima, polipeptidi ActRII ili ALK4 otkrića su kodirani sekvencama izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identične bilo kojoj od SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135. Stručnjak u ovoj oblasti znaće da su sekvence nukleinske kiseline koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identične sekvencama komplementarnim sa SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135, i njihove varijante, takođe u okviru obima predmetnog otkrića. U sledećim slučajevima, sekvence nukleinske kiseline otkrića mogu da budu izolovane, rekombinantne, i/ili fuzionisane sa heterolognom nukleotidnom sekvencom, ili u DNK biblioteci.
[0162] U drugim slučajevima, nukleinske kiseline predmetnog otkrića takođe uključuju nukleotidne sekvence koje se pod veoma strogim uslovima hibridizuju sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135, sekvencom komplementarnom SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135, ili fragmentima istih. Kao što je gore razmatrano, stručnjak u oblasti će lako razumeti da odgovarajuća strogost uslova koja podstiče hibridizaciju DNK može da varira. Stručnjak u oblasti će lako razumeti da uslovi odgovarajuće strogosti koja podstiče hibridizaciju DNK mogu da variraju. Na primer, hibridizacija se može obaviti upotrebom 6.0 x natrijum-hlorida/natrijum-citrata (SSC), na oko 45 °C, a zatim ispiranjem sa 2.0 x SSC, na 50 °C. Na primer, koncentracija soli u koraku ispiranja može da se bira od niske strogosti, od oko 2.0 x SSC na 50 °C, do visoke strogosti od oko 0.2 x SSC, na 50 °C. Pored toga, u koraku ispiranja, temperatura može da se poveća od uslova niske strogosti na sobnoj temperaturi, oko 22 °C, do uslova visoke strogosti na oko 65 °C. Temperatura i koncentracija soli mogu obe da variraju, ili, jedna od njih, temperatura ili koncentracija soli, može da se održava na konstantnoj vrednosti, dok se druga varijabla menja. U jednom slučaju, otkriće obezbeđuje nukleinske kiseline koje hibridizuju pod uslovima niske strogosti od 6 x SSC, na sobnoj temperaturi, sa naknadnim ispiranjem sa 2 x SSC na sobnoj temperaturi.
[0163] Izolovane nukleinske kiseline koje se, usled degeneracije genetičkog koda, razlikuju od nukleinskih kiselina ovde izloženih u SEQ ID NOs: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 i 135 takođe su obuhvaćene obimom otkrića. Na primer, brojne aminokiseline određene su više nego jednim tripletom. Kodoni koji određuju istu aminokiselinu, ili sinonimi (na primer, CAU i CAC sinonimi su za histidin), mogu za rezultat imati "tihe" mutacije koje ne utiču na sekvencu aminokiselina u proteinu. Međutim, očekuje se da će među ćelijama sisara postojati polimorfizmi DNK sekvenci koji dovode do promena u aminokiselinskim sekvencama predmetnih proteina. Stručnjak u oblasti će razumeti da ove varijacije u jednom ili više nukleotida (do oko 3-5% nukleotida) nukleinskih kiselina koje kodiraju određeni protein, mogu postojati među individuama date vrste, usled prirodne varijacije alela. Bilo koje i sve takve nukleotidne varijacije i rezultujući polimorfizmi aminokiselina obuhvaćeni su obimom ovog otkrića.
[0164] U određenim slučajevima, rekombinantne nukleinske kiseline predmetnog otkrića mogu u ekspresionom konstruktu da budu funkcionalno povezane sa jednom ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci. Regulatorne nukleotidne sekvence će uglavnom biti odgovarajuće za ćeliju domaćina koja se koristi za ekspresiju. Brojni tipovi pogodnih ekspresionih vektora i pogodnih regulatornih sekvenci poznati su u struci i mogu da se koriste u brojnim ćelijamadomaćinima. Tipično, jedna ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na promotorske sekvence, liderske ili signalne sekvence, vezujuća mesta za ribozome, sekvence za početak i završetak transkripcije, sekvence za početak i završetak translacije i sekvence pojačivača ili aktivatora. Konstitutivni ili inducibilni promotori poznati u struci obuhvaćeni su otkrićem. Promotori mogu da budu prirodni promotori ili hibridni promotori koji kombinuju elemente više od jednog promotora. Ekspresioni konstrukt može da bude prisutan u ćeliji na epizomu, kao što je plazmid, ili ekspresioni konstrukt može da bude insertovan u hromozom. U nekim slučajevima, ekspresioni vektor sadrži selektabilni marker-gen koji omogućava odabir transformisanih ćelija-domaćina. Selektabilni marker-geni dobro su poznati u struci i mogu da variraju u zavisnosti od ćelije koja je upotrebljena kao domaćin.
[0165] U određenim slučajevima, predmetna nukleinska kiselina koja je ovde opisana obezbeđena je u ekspresionom vektoru koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ActRII i/ili ALK4 i funkcionalno je povezana sa najmanje jednom regulatornom sekvencom.
Regulatorne sekvence su prepoznatljive u struci i biraju se tako da upravljaju ekspresijom polipeptida ActRII i/ili ALK4. U skladu sa tim, pojam regulatorna sekvenca uključuje promotore, pojačivače i druge kontrolne elemente ekspresije. Primeri regulatornih sekvenci opisani su u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Na primer, bilo koja od velikog broja ekspresionih kontrolnih sekvenci koje kontrolišu ekspresiju DNK sekvence kada su funkcionalno povezane za nju, može da se koristi u ovim vektorima za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju polipeptid ActRII i/ili ALK4. Takve korisne ekspresione kontrolne sekvence uključuju, na primer, rani i kasni promotor SV40, tet promotor, adenovirusni ili citomegalovirusni neposredni rani promotor, RSV promotore, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, T7 promotor čijom ekspresijom upravlja RNK-polimeraza T7, glavni operatorski i promotorski region lambda faga, kontrolne regione za fd protein omotača, promotor za 3-fosfoglicerat-kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotore kisele fosfataze, npr., Pho5, promotore α-sparujućih faktora kvasca, poliedronski promotor bakulovirusnog sistema i druge sekvence za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, i njihove različite kombinacije. Treba razumeti da dizajn ekspresionog vektora može da zavisi od faktora kao što su izbor ćelijedomaćina koja će se transformisati i/ili tipa proteina čiju ekspresiju je potrebno postići. Pored toga, broj kopija vektora, sposobnost kontrole tog broja kopija i ekspresiju bilo kog drugog proteina kodiranog vektorom, kao što su antibiotski markeri, takođe treba uzeti u obzir.
[0166] Rekombinantna nukleinska kiselina predmetnog otkrića može da se proizvede vezivanjem kloniranog gena ili njegovog dela, u vektor pogodan za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, eukariotskim ćelijama (ćelije kvasca, ptica, insekata ili sisara), ili u oba tipa ćelija. Ekspresioni prenosnici za proizvodnju rekombinantnog polipeptida ActRII i/ili ALK4 uključuju plazmide i druge vektore. Na primer, pogodni vektori uključuju plazmide sledećih tipova: plazmide poreklom iz pBR322, plazmide poreklom iz pEMBL, plazmide poreklom iz pEX, plazmide poreklom iz pBTac i plazmide poreklom iz pUC, za ekspresiju u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli.
[0167] Neki sisarski ekspresioni vektori sadrže i prokariotske sekvence da bi se olakšala propagacije vektora u bakterijama, i jednu ili više eukariotskih transkripcionih jedinica koje se eksprimiraju u eukariotskim ćelijama. Vektori poreklom iz pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg predstavljaju primere sisarskih ekspresionih vektora pogodnih za transfektovanje eukariotskih ćelija. Neki od ovih vektora modifikovani su sekvencama iz bakterijskih plazmida, npr. pBR322, da bi se olakšala replikacija i selekcija prema rezistenciji na lekove, u prokariotskim i eukariotskim ćelijama. Alternativno, derivati virusa kao što su goveđi papiloma virus (BPV-1), ili Epstein-Barr virus (pHEBo, derivat pREP i p205) mogu da se koriste za prolaznu ekspresiju proteina u eukariotskim ćelijama. Primeri drugih virusnih (uključujući retrovirusne) ekspresionih sistema mogu da se nađu dole u opisu sistema za isporuku genske terapije. Različiti postupci upotrebljeni u pripremanju plazmida i u transformisanju organizama-domaćina, dobro su poznati u struci. Za druge pogodne ekspresione sisteme za prokariotske i za eukariotske ćelije, kao i za opšte postupke rekombinacije, videti npr., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3<rd>Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). U nekim slučajevima, može da bude poželjno da se rekombinantni polipeptidi eksprimiraju upotrebom bakulovirusnih ekspresionih sistema. Primeri takvih bakulovirusnih ekspresionih sistema uključuju vektore poreklom iz pVL (npr. pVL1392, pVL1393 i pVL941), vektore poreklom iz pAcUW (npr. pAcUW1) i vektore poreklom iz pBlueBac (npr. pBlueBac III koji sadrži β-gal).
[0168] U poželjnom slučaju, vektor će biti dizajniran za proizvodnju predmetnih polipeptida ActRII i/ili ALK4 u ćelijama CHO, kao što je vektor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vektori pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i vektori pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Kao što će biti očigledno, predmetni genski konstrukti mogu da se upotrebe da izazovu ekspresiju predmetnih polipeptida ActRII u ćelijama umnožavanim u kulturi, npr., da proizvode proteine, uključujući fuzione proteine ili varijantne proteine, za prečišćavanje.
[0169] Ovo otkriće se takođe odnosi na ćeliju-domaćina koja je transfektovana rekombinantnim genom, uključujući kodirajuću sekvencu za jedan ili više predmetnih polipeptida ActRII i/ili ALK4. Ćelija-domaćin može da bude bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, polipeptid ActRII i/ili ALK4 prema otkriću može da se eksprimira u bakterijskim ćelijama kao E. coli, ćelijama insekata (npr. korišćenjem sistema ekspresije bakulovirusa), kvascu ili ćelijama sisara [npr. ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO)]. Stručnjacima su poznate i druge pogodne ćelije-domaćini.
[0170] Prema tome, ovo otkriće se dalje odnosi na postupke za proizvodnju predmetnih polipeptida ActRII i/ili ALK4. Na primer, ćelija-domaćin transfektovana ekspresionim vektorom koji kodira polipeptid ActRII i/ili ALK4 može da se kultiviše pod odgovarajućim uslovima kako bi se omogućila ekspresija polipeptida ActRII i/ili ALK4. Polipeptid može da bude izlučen i izolovan iz smeše ćelija i medijuma koji sadrže polipeptid. Alternativno, polipeptid ActRII i/ili ALK4 može da ostane u citoplazmi ili u membranskoj frakciji, a da se ćelije sakupe, liziraju i protein izoluje. Kultura ćelija uključuje ćelije-domaćine, medijume i druge sporedne proizvode. Pogodni medijumi za kulturu ćelija dobro su poznati u tehnici. Predmetni polipeptidi mogu da se izoluju iz medijuma ćelijske kulture, ćelija-domaćina ili oboje, upotrebom tehnika poznatih u struci za prečišćavanje proteina, uključujući jonoizmenjivačku hromatografiju, gel-filtracionu hromatografiju, ultrafiltraciju, elektroforezu, imunoafinitetno pročišćavanje antitelima specifičnim za određene epitope na polipeptidima ActRII i/ili ALK4 i afinitetno prečišćavanje sredstvom koje se vezuje za domen fuzionisan sa polipeptidom ActRII (npr. kolona sa proteinom A može da se koristi za prečišćavanje fuzionih proteina ActRII-Fc i/ili ALK4-Fc). U nekim slučajevima, polipeptid ActRII i/ili ALK4 je fuzioni protein koji sadrži domen koji olakšava njegovo prečišćavanje.
[0171] U nekim slučajevima, prečišćavanje se postiže nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, fenilsefarozna hromatografija, ekskluziona hromatografija prema veličini i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera. Protein ActRII i/ili ALK4 mogu da se prečiste do čistoće >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99%, određeno ekskluzionom hromatografijom prema veličini i >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99%, određeno metodom SDS PAGE. Ciljni nivo čistoće treba da bude dovoljan da se postignu poželjni rezultati u sisarskim sistemima, posebno kod primata koji nisu ljudi, glodara (miševa) i ljudi.
[0172] U drugom slučaju, fuzioni gen koji kodira vodeću sekvencu za prečišćavanje, kao što je sekvenca mesta cepanja poli-(His)/enterokinazom na N-kraju željenog dela rekombinantnog polipeptida ActRII i/ili ALK4, može da omogući prečišćavanje eksprimiranog fuzionog proteina afinitetnom hromatografijom upotrebom smole sa metalom Ni<2+>. Vodeća sekvenca za prečišćavanje zatim može da se ukloni obradom enterokinazom da bi se dobio prečišćeni polipeptid ActRII i/ili ALK4. Videti, npr., Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; i Janknecht et al. (1991) PNAS USA 88:8972.
[0173] Tehnike izrade fuzionih gena su dobro poznate. U suštini, spajanje različitih fragmenata DNK koji kodiraju različite polipeptidne sekvence se izvodi u skladu sa konvencionalnim tehnikama, primenom tupih ili lepljivih krajeva za ligaciju, digestijom restrikcionim enzimom kako bi se obezbedili odgovarajući krajevi, popunjavanjem kohezivnih krajeva po potrebi, obradom alkalnom fosfatazom kako bi se izbeglo neželjeno spajanje i enzimskom ligacijom. U drugom slučaju, fuzioni gen može da se sintetizuje konvencionalnim tehnikama, uključujući automatizovane sintetizere DNK. Alternativno, PCR amplifikacija fragmenata gena može se izvršiti pomoću sidrenih prajmera koji dovode do komplementarnih preklapanja između dva uzastopna fragmenta gena koji naknadno mogu da hibridizuju kako bi se generisala himerna sekvenca gena. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992.
4. Antitela kao antagonisti
[0174] U određenim slučajevima, antagonist GDF/BMP koji će se koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je antitelo (antagonističko antitelo protiv GDF/BMP) ili kombinacija antitela. Antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, mogu da se vezuju za, na primer, jedan ili više liganda ActRII (npr. aktivin, GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 i/ili GDF3), receptor ActRII (ActRIIA i/ili ActRIIB), receptor tipa I (ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili ko-receptor. Kao što je ovde opisano, antagonistička antitela protiv GDF/BMP mogu da se koriste, pojedinačno ili u kombinaciji sa jednom ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava, za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (PH), posebno za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
[0175] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE). Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za aktivin. Kako se ovde koristi, antitelo protiv aktivina (ili anti-aktivinsko antitelo) se uopšteno odnosi na antitelo koje se vezuje za aktivin sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na aktivin. U određenim slučajevima, stepen vezivanja antitela protiv aktivina za nesrodni, neaktivinski protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za aktivin, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv aktivina se vezuje za epitop aktivina koji je konzervativan među aktivinima različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-aktivinsko antitelo se vezuje za humani aktivin. U nekim slučajevima, antitelo protiv aktivina može da inhibira vezivanje aktivina za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i da na taj način inhibira signalizaciju posredovanu aktivinom (npr. Smad signalizacija). U nekim slučajevima, antitelo protiv aktivina može da inhibira vezivanje aktivina za ko-receptor ActRII i da na taj način inhibira signalizaciju posredovanu aktivinom (npr. Smad signalizacija). Treba napomenuti da aktivin A ima sličnu homologiju sekvence sa aktivinom B, pa stoga antitela koja se vezuju za aktivin A, u nekim slučajevima, takođe mogu da vežu i/ili inhibiraju aktivin B, što se takođe odnosi na anti-aktivin B antitela. U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegovu upotrebu, koje se vezuje za aktivin i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin ne vezuje se ili se u suštini ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv aktivina i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda superfamilije GDF/BMP [npr. GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv aktivina ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv aktivina ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0176] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje aktivin B. Stoga se, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP ili kombinacija antitela vezuje bar za aktivin B. Kako se ovde koristi, antitelo protiv aktivina B (ili anti-aktivin B antitelo) obično se odnosi na antitelo koje se vezuje za aktivin B sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na aktivin B. U određenim slučajevima, stepen vezivanja antitela protiv aktivina B za nesrodni protein koji nije aktivin B manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2 % ili manji od oko 1% vezivanja antitela za aktivin, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv aktivina B vezuje se za epitop aktivina B koji je konzervativan među aktivinom B različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-aktivin B antitelo se vezuje za humani aktivin B. U nekim slučajevima, antitelo protiv aktivina B može da inhibira vezivanje aktivina B za receptor
1
tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira signalizaciju posredovanu aktivinom B (npr. Smad signalizacija). U nekim slučajevima, antitelo protiv aktivina B može da inhibira vezivanje aktivina B za ko-receptor i na taj način inhibira signalizaciju posredovanu aktivinom B (npr. Smad signalizacija). Treba napomenuti da aktivin B ima sličnu homologiju sekvence sa aktivinom A i stoga antitela koja se vezuju za aktivin B, u nekim slučajevima, takođe mogu da vežu i/ili inhibiraju aktivin A. U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo), i njegovu upotrebu, koje se vezuje za aktivin B i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više koreceptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin B ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa K -7
Dvećom od 1 x 10 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin B ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv aktivina B i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv aktivina B ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv aktivina B ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0177] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje GDF8. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za GDF8. Kako se ovde koristi, antitelo protiv GDF8 (ili anti-antitelo protiv GDF8) se generalno odnosi na antitelo koje se vezuje za GDF8 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na GDF8. U određenim slučajevima, stepen vezivanja GDF8 antitela za nesrodni, ne-GDF8 protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF8, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv GDF8 se vezuje za epitop GDF8 koji je konzervativan među GDF8 različitih vrsta. U određenim poželjnim
2
slučajevima, antitelo protiv GDF8 se vezuje za humani GDF8. U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF8 može da inhibira vezivanje GDF8 za receptor tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira GDF8-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF8 može da inhibira vezivanje GDF8 za ko-receptor i na taj način inhibira GDF8-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). Treba napomenuti da GDF8 ima visoku homologiju sekvence sa GDF11 i prema tome antitela koja se vezuju za GDF8, u nekim slučajevima, takođe mogu da vežu i/ili inhibiraju GDF11. U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegove upotrebe, koje se vezuje za GDF8 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF11, GDF3, BMP15, BMP10 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF8 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF8 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv GDF8 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF8 ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF8 ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0178] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje GDF11. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za GDF11. Kako se ovde koristi, antitelo protiv GDF11 (ili anti-GDF11 antitelo) se uopšteno odnosi na antitelo koje se vezuje za GDF11 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na GDF11. U određenim slučajevima, stepen vezivanja GDF11 antitela za nesrodni protein koji nije GDF11 manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2 % ili manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF11, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv GDF11 se vezuje za epitop GDF11 koji je konzervativan među GDF11 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo na GDF11 se vezuje za humani GDF11. U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF11 može da inhibira vezivanje GDF11 za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira GDF11-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF11 može da inhibira vezivanje GDF11 za ko-receptor i tako inhibira GDF11-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). Treba napomenuti da GDF11 ima visoku homologiju sekvence sa GDF8 i stoga antitela koja se vezuju za GDF11, u nekim slučajevima, takođe mogu da vežu i/ili inhibiraju GDF8. U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegovu upotrebu, koje se vezuje za GDF11 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF11 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF11 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv GDF11 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF11 ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF11 ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0179] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje BMP6. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za BMP6. Kako
4
se ovde koristi, antitelo protiv BMP6 (ili anti-BMP6 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje može da se vezuje za BMP6 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na BMP6. U određenim slučajevima, stepen vezivanja BMP6 antitela za nesrodni protein koji nije BMP6 manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili je manji od oko 1% vezivanja antitela za BMP6, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv BMP6 se vezuje za epitop BMP6 koji je konzervativan među BMP6 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo na BMP6 se vezuje za humani BMP6. U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP6 može da inhibira vezivanje BMP6 za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira BMP6-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP6 može da inhibira vezivanje BMP6 za ko-receptor i na taj način inhibira BMP6-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegove upotrebe, koje se vezuje za BMP6 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 i GDF11], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP6 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP6 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv BMP6 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP10 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više koreceptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP6 ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP6 ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0180] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje GDF3. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za GDF3. Kako se ovde koristi, antitelo protiv GDF3 (ili anti-GDF3 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje može da se veže za GDF3 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na GDF3. U određenim slučajevima, stepen vezivanja GDF3 antitela za nesrodni, protein koji nije GDF3 manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili je manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF3, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv GDF3 se vezuje za epitop GDF3 koji je konzervativan među GDF3 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo protiv GDF3 se vezuje za humani GDF3. U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF3 može da inhibira vezivanje GDF3 za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira signalizaciju posredovanu GDF3 (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv GDF3 može da inhibira vezivanje GDF3 za ko-receptor i tako inhibira signalizaciju posredovanu GDF3 (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegove upotrebe, koje se vezuje za GDF3 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, BMP6, BMP15, BMP10 i GDF11], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF3 ne vezuje se ili se u suštini ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF3 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv GDF3 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10 i BMP15], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF3 ne sadrži antitelo protiv BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv GDF3 ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0181] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje BMP15. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP ili kombinacija antitela vezuje se bar za BMP15. Kako se ovde koristi, antitelo protiv BMP15 (ili anti-BMP15 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje može da se veže za BMP15 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na BMP15. U određenim slučajevima, stepen vezivanja BMP15 antitela za nesrodni protein koji nije BMP15 manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za BMP15, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv BMP15 se vezuje za epitop BMP15 koji je konzervativan među BMP15 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo protiv BMP15 se vezuje za humani BMP15. U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP15 može da inhibira vezivanje BMP15 za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira BMP15-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP15 može da inhibira vezivanje BMP15 za ko-receptor i na taj način inhibira BMP15-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegove upotrebe, koje se vezuje za BMP15 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP10 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više koreceptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP15 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP15 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo protiv BMP15 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF3 BMP6, BMP10 i GDF11], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP15 ne sadrži antitelo BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP15 ne sadrži antitelo aktivin A.
[0182] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje BMP10. Prema tome, u nekim slučajevima antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za BMP10. Kako se ovde koristi, antitelo protiv BMP10 (ili anti-BMP10 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje može da se veže za BMP10 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na BMP10. U određenim slučajevima, stepen vezivanja antitela protiv BMP10 za nesrodni protein koji nije BMP10 manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za BMP10, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije proteina ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv BMP10 se vezuje za epitop BMP10 koji je konzervativan među BMP10 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo protiv BMP10 se vezuje za humani BMP10. U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP10 može da inhibira vezivanje BMP10 za receptore tipa I i/ili tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i na taj način inhibira BMP10-posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, antitelo protiv BMP10 može da inhibira vezivanje BMP10 za ko-receptor i na taj način inhibira BMP10 posredovanu signalizaciju (npr. Smad signalizaciju). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) i njegove upotrebe, koje se vezuje za BMP10 i dodatno se vezuje, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3 i BMP6], jedan ili više receptora tipa I i/ili tipa II receptora (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP10 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za BMP9 (npr. vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP10 ne vezuje se, ili se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr. vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10-7 M ili je njegovo vezivanje relativno umereno, npr. oko 1 x 10-8 M ili oko 1 x 10-9 M). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži antitelo BMP10 i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više dodatnih liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF3 BMP6, BMP10 i GDF11], jedan ili više receptora tipa I i/ili receptora tipa II (npr. ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP10 ne sadrži antitelo BMP9. U nekim slučajevima, kombinacija antitela koja sadrži antitelo protiv BMP10 ne sadrži antitelo protiv aktivina A.
[0183] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje ActRIIB. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za ActRIIB. Kako se ovde koristi, antitelo protiv ActRIIB (anti-ActRIIB antitelo) obično se odnosi na antitelo koje se vezuje za ActRIIB sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na ActRIIB. U određenim slučajevima, stepen vezivanja anti-ActRIIB antitela za nesrodni, ne-ActRIIB protein manji je od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ActRIIB, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugom interakcijom proteina i proteina ili testom afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, antitelo protiv ActRIIB vezuje se za epitop ActRIIB koji je konzervativan među ActRIIB različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, antitelo protiv ActRIIB se vezuje za humani ActRIIB. U nekim slučajevima, antitelo protiv ActRIIB može da inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15] za ActRIIB. U nekim slučajevima, anti-ActRIIB antitelo je multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) koje se vezuje za ActRIIB i jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC), GDF3, BMP6 i BMP10], receptor tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), ko-receptor i/ili dodatni receptor tipa II (npr. ActRIIA). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži anti-ActRIIB antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), BMP6, GDF3 i BMP10], ko-receptore, receptore tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili dodatne receptore tipa II (npr. ActRIIA). Treba imati na umu da ActRIIB ima sličnost u sekvenci sa ActRIIA i stoga antitela koja se vezuju za ActRIIB, u nekim slučajevima, takođe mogu da vezuju i/ili inhibiraju ActRIIA.
[0184] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje ActRIIA. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za ActRIIA. Kako se ovde koristi, antitelo protiv ActRIIA (anti-ActRIIA antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ActRIIA sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na ActRIIA. U određenim slučajevima, stepen vezivanja anti-ActRIIA antitela za nesrodni, ne-ActRIIA protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ActRIIA, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugom interakcijom protein-protein ili testom afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, anti-ActRIIA antitelo vezuje se za epitop ActRIIA koji je konzervativan među ActRIIA iz različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-ActRIIA antitelo vezuje se za humani ActRIIA. U nekim slučajevima, anti-ActRIIA antitelo može da inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15] za ActRIIA. U nekim slučajevima, anti-ActRIIA antitelo je multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) koje se vezuje za ActRIIA i jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC), GDF3, BMP6 i BMP10], receptor tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), ko-receptor i/ili dodatni receptor tipa II (npr. ActRIIB). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži anti-ActRIIA antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6 i BMP10], ko-receptore, receptore tipa I (npr., ALK4, ALK5 i/ili ALK7) i/ili dodatne receptore tipa II (npr. ActRIIB). Treba napomenuti da ActRIIA ima sličnost u sekvenci sa ActRIIB i stoga antitela koja se vezuju za ActRIIA, u nekim slučajevima, takođe mogu da vežu i/ili inhibiraju ActRIIB.
[0185] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje ALK4. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za ALK4. Kako se ovde koristi, antitelo protiv ALK4 (anti-ALK4 antitelo) se uopšteno odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK4 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na ALK4. U određenim slučajevima, stepen vezivanja anti-ALK4 antitela za nesrodni, ne-ALK4 protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK4, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugom interakcijom protein-protein ili
1
testom afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, anti-ALK4 antitelo se vezuje za epitop ALK4 koji je konzervativan među ALK4 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-ALK4 antitelo se vezuje za humani ALK4. U nekim slučajevima, anti-ALK4 antitelo može da inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15] za ALK4. U nekim slučajevima, anti-ALK4 antitelo je multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) koje se vezuje za ALK4 i jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC), GDF3, BMP6 i BMP10], receptor tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptor i/ili dodatni receptor tipa I (npr. ALK5 i/ili ALK7). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži anti-ALK4 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6 i BMP10], ko-receptore, receptore tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), i/ili dodatne receptore tipa I (npr. ALK5 i/ili ALK7).
[0186] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje ALK5. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za ALK5. Kako se ovde koristi, antitelo protiv ALK5 (anti-ALK5 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK5 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na ALK5. U određenim slučajevima, stepen vezivanja anti-ALK5 antitela za nesrodni, ne-ALK5 protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK5, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije protein-protein ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, anti-ALK5 antitelo se vezuje za epitop ALK5 koji je konzervativan među ALK5 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-ALK5 antitelo se vezuje za humani ALK5. U nekim slučajevima, anti-ALK5 antitelo može da inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15] za ALK5. U nekim slučajevima, anti-ALK5 antitelo je multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) koje se vezuje za ALK5 i jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC), GDF3, BMP6 i BMP10], receptor tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptor i/ili dodatni receptor tipa I (npr. ALK4 i/ili ALK7). U nekim
1 1
slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži anti-ALK5 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), BMP6 i BMP10], koreceptore, receptore tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB) i/ili dodatne receptore tipa I (npr. ALK4 i/ili ALK7).
[0187] U određenim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, je antitelo koje inhibira najmanje ALK7. Prema tome, u nekim slučajevima, antagonističko antitelo protiv GDF/BMP, ili kombinacija antitela, vezuje se bar za ALK7. Kako se ovde koristi, antitelo protiv ALK7 (anti-ALK7 antitelo) uopšteno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK7 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na ALK7. U određenim slučajevima, stepen vezivanja antitela na ALK7 za nesrodni, ne-ALK7 protein je manji od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK7, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA), Biacore testom ili drugim testom za određivanje interakcije protein-protein ili afiniteta vezivanja. U određenim slučajevima, anti-ALK7 antitelo se vezuje za epitop ALK7 koji je konzervativan među ALK7 različitih vrsta. U određenim poželjnim slučajevima, anti-ALK7 antitelo se vezuje za humani ALK7. U nekim slučajevima, anti-ALK7 antitelo može da inhibira vezivanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 i BMP15] za ALK7. U nekim slučajevima, anti-ALK7 antitelo je multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) koje se vezuje za ALK7 i jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC), GDF3, BMP6 i BMP10], receptor tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptor i/ili dodatni receptor tipa I (npr. ALK4 i/ili ALK5). U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kombinacije antitela i njihove upotrebe, pri čemu kombinacija antitela sadrži anti-ALK7 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju, na primer, za jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. GDF11, GDF8, aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), BMP6 i BMP10], koreceptore, receptore tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB) i/ili dodatne receptore tipa I (npr. ALK4 i/ili ALK5).
[0188] Termin antitelo se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična
1 2
antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok oni ispoljavaju željenu aktivnost vezivanja antigena. Fragment antitela odnosi se na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koji vezuje antigen za koji se netaknuto antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela [videti, npr., Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plückthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; i SAD pat. br. 5,571,894; 5,587,458; i 5,869,046]. Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koji mogu da budu bivalentni ili bispecifični [videti, npr., EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. Tria-tela i tetra-tela su takođe opisana u Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134. Jednodomenska antitela su fragmenti antitela koji sadrže ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim slučajevima, jednodomensko antitelo je humano jednodomensko antitelo [videti, na primer, SAD pat. br.
6,248,516]. Ovde opisana antitela mogu da budu poliklonska antitela ili monoklonska antitela. U određenim slučajevima, antitela iz ovog otkrića sadrže oznaku koja je vezana za njih i koja može da se detektuje (npr. oznaka može da bude radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski ko-faktor). U nekim poželjnim slučajevima, antitela ovog otkrića su izolovana antitela. U određenim poželjnim slučajevima, antitela ovog otkrića su rekombinantna antitela.
[0189] Ovde navedena antitela mogu da budu bilo koje klase. Klasa antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti u potklase (izotipove), na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mi.
[0190] Uopšteno, antitelo za upotrebu u ovde opisanim postupcima specifično se vezuje za svoj ciljni antigen, poželjno sa visokim afinitetom vezivanja. Afinitet se može izraziti kao vrednost KDi odražava svojstveni afinitet vezivanja (npr. sa minimalizovanim efektima aviditeta). Afinitet vezivanja se obično meri in vitro, bilo u testu bez ćelija ili u ćelijskom okruženju. Bilo koji od brojnih testova koji su poznati u tehnici, uključujući i ovde opisane, može da se koristi za dobijanje mere afiniteta vezivanja, uključujući, na primer, Biacore, radioaktivno obeleženi test vezivanja antigena (RIA) i ELISA. U nekim slučajevima, antitela ovog otkrića vezuju se za svoje ciljne antigene (npr. ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, aktivin, GDF11, GDF8, GDF3,
1
BMP15, BMP10 i/ili BMP6) sa KDod najmanje 1 x 10-7 ili jače, 1 x 10<-8>ili jače, 1 x 10<-9>ili jače, 1 x 10-10 ili jače, 1 x 10<-11>ili jače, 1 x 10<-12>ili jače, 1 x 10<-13>ili jače, ili 1 x 10<-14>ili jače.
[0191] U određenim slučajevima, KDse meri pomoću RIA izvedenog sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog ciljnog antigena, kako je opisano u sledećem testu. Afinitet vezivanja rastvora Fabs za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom radioaktivno obeleženog antigena (npr. obeleženom pomoću<125>I) u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče obložene anti-Fab antitelom [videti, na primer, Chen et al. (1999) J. Mol. Biol.293: 865-881]. Da bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, ploče sa više bunarčića (npr. MICROTITER<®>kompanije Thermo Scientific) su obložene (npr. preko noći) vezujućim anti-Fab antitelom (npr. kompanije Cappel Labs) i potom blokirane goveđim serumskim albuminom, poželjno na sobnoj temperaturi (približno 23 °C). U neadsorbujućoj ploči, radioaktivno obeleženi antigen se pomeša sa serijskim razblaženjima Fab od interesa [npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599]. Fab od interesa se zatim inkubira, po mogućnosti preko noći, ali inkubacija može da se nastavi tokom dužeg perioda (npr. oko 65 časova) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga, smeše se prenose na vezujuću ploču radi inkubacije, poželjno na sobnoj temperaturi oko jedan čas. Zatim se rastvor uklanja i ploča se opere nekoliko puta, poželjno smešom polisorbata 20 i PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se scintilant (npr. MICROSCINT® kompanije Packard) i ploče se očitavaju pomoću gama brojača (npr. TOPCOUNT® kompanije Packard).
[0192] U drugom slučaju, KDse meri pomoću testova rezonance površinskog plazmona upotrebom, na primer, BIACORE® 2000 ili BIACORE® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) sa čipovima sa imobilizovanim antigenom CM5 na oko 10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi na bazi karboksimetilovanog dekstrana (CM5, BIACORE, Inc.) aktiviraju se pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) u skladu sa uputstvima dobavljača. Na primer, antigen može da se razblaži sa 10 mM natrijum acetata, pH 4.8, na 5 µg/ml (oko 0.2 µM) pre ubrizgavanja pri brzini protoka od 5 µl/minutu da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spregnutog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1M etanolamin da blokira neizreagovale grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TVEEN-20®) surfaktanta (PBST) pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunavaju se primenom, na primer, jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja
1 4
(BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2), istovremeno uklapajući senzorske dijagrame asocijacije i disocijacije. Konstanta disocijacije u ravnoteži (KD) izračunava se kao odnos koff/kon[videti, na primer, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol.293: 865-881]. Ako brzina asocijacije prelazi, na primer, 106 M-1 s-1 određeno pomoću gornjeg testa rezonance površinskog plazmona, tada se brzina asocijacije može odrediti upotrebom tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (npr. ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg od 16 nm) 20 nM anti-antigenskog antitela (Fab oblik) u PBS u prisustvu rastućih koncentracija antigena merenih spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja protoka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-AMINCO<®>serije 8000 (ThermoSpectronic) sa kivetom čiji se sadržaj meša.
[0193] Fragmenti antitela mogu da se naprave različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija-domaćina (npr. E. coli ili fag), kako je ovde opisano. Sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselina humanih ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, aktivina (aktivin A, aktivin B, aktivin C i aktivin E), GDF11, GDF8, BMP15, GDF3, BMP10 i BMP6 su poznate u tehnici. Pored toga, brojni postupci za stvaranje antitela su dobro poznati u tehnici, od kojih su neki ovde opisani. Prema tome, stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da prave antagonistička antitela za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem na osnovu znanja u struci i tumačenja koja su ovde data.
[0194] U određenim slučajevima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Himerno antitelo se odnosi na antitelo u kome deo teškog i/ili lakog lanca potiče iz određenog izvora ili vrste, dok ostatak teškog i/ili lakog lanca potiče iz drugog izvora ili vrste. Određena himerna antitela su opisana, na primer, u SAD pat. br. 4,816,567; i Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855. U nekim slučajevima, himerno antitelo sadrži varijabilni region koji nije humanog porekla (npr. varijabilni region poreklom iz miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, poput majmuna) i humani konstantni region. U nekim slučajevima, himerno antitelo je antitelo sa „promenjenom klasom“ u kome je klasa ili potklasa promenjena u odnosu na matično antitelo. Uopšteno, himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0195] U određenim slučajevima, ovde dato himerno antitelo je humanizovano antitelo. Humanizovano antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz nehumanih hipervarijabilnih regiona (HVR) i aminokiselinske ostatke iz humanih okvirnih regiona (FR). U određenim slučajevima, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od
1
najmanje jednog, i tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima kod ne-humanih antitela, i svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima kod humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela poreklom iz humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, na primer, nehumano antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju. Humanizovana antitela i postupci za njihovo pravljenje dati su, na primer, u Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci.
13:1619-1633 i dodatno su opisani, na primer, u Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; SAD pat. br. 5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; i 7,087,409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [opisuje kalemljenje SDR (a-CDR)]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (opisuje "promenu površine"); Dall’Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 (opisuje "mešanje FR"); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; i Klimka et al. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (opisuje pristup "vođene selekcije" u mešanju FR). Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane postupkom „optimalnog uklapanja“ [videti, npr., Sims et al. (1993) J. Immunol.151:2296 ]; okvirne regione poreklom od konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca [videti, npr., Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; i Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]; humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humane klicine linije [videti, npr., Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; i okvirne regione odabrane pretraživanjem biblioteka FR [videti, npr., Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; i Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem.
271:22611-22618].
[0196] U određenim slučajevima, ovde obezbeđeno antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu da se proizvedu upotrebom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su uopšteno opisana u van Dijk i van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459. Na primer, humana antitela mogu se pripremiti davanjem imunogena (npr. polipeptida GDF11, polipeptida aktivina B, polipeptida ActRIIA ili polipeptida ActRIIB) transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigeni izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo lokusa humanog imunoglobulina, koji zamenjuju endogene lokuse imunoglobulina, ili su prisutni van hromozoma ili nasumično integrisani u hromozome životinje. Kod takvih transgenih životinja endogeni lokusi imunoglobulina su uopšteno inaktivisani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela iz transgenih životinja videti, na primer, Lonberg (2005) Nat. Biotech.23:1117-1125; SAD pat. br.
1
6,075,181 i 6,150,584 (opisuje tehnologiju XENOMOUSE™); SAD pat. br. 5,770,429 (opisuje tehnologiju HuMab®); SAD pat. br. 7,041,870 (opisuje tehnologiju K-M MOUSE®); i objavu SAD patentne prijave br.2007/0061900 (opisuje tehnologiju VelociMouse®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela generisani u takvim životinjama mogu dodatno da se modifikuju, na primer, kombinovanjem sa drugačijim humanim konstantnim regionom.
[0197] Humana antitela koja su ovde obezbeđena mogu da se naprave i postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i heteromijeloma miša-čoveka za proizvodnju humanih monoklonskih antitela [videti, npr., Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; i Boerner et al. (1991) J. Immunol., 147: 86]. Humana antitela generisana pomoću tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562. Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u SAD pat. br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (opisuje hibridome čoveka-čoveka). Tehnologija humanih hibridoma (Trioma tehnologija) takođe je opisana u Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91. Humana antitela koja su ovde data mogu takođe da se naprave izolovanjem sekvence varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka prikaza na fagu humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu zatim da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike selekcije humanih antitela iz biblioteka antitela poznate su u stanju tehnike i opisane su u ovom dokumentu.
[0198] Na primer, antitela iz ovog otkrića mogu se izolovati pretraživanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. U tehnici su poznati različiti postupci za stvaranje biblioteka prikaza na fagima i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su prikazani, na primer, u Hoogenboom et al. (2001) u Methods in Molecular Biology 178:1-37, O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J. i dodatno opisani, na primer, u McCafferty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) u Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; i Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132.
1
[0199] U određenim postupcima prikaza na fagima, repertoari VH i VL gena se odvojeno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumično se kombinuju u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju kako bi se izdvojio fag koji vezuje antigen, kao što je opisano u Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Fagi tipično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju antitela sa visokim afinitetom za imunogen (npr. ActRIIA, ActRIIB, aktivin, GDF11, GDF8, BMP15, GDF3 ili BMP6) bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može da se klonira (na primer, iz čoveka) da bi se obezbedio jedan izvor antitela za širok spektar ne-sopstvenih, kao i sopstvenih antigena, bez ikakve imunizacije kako su opisali Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Konačno, naivne biblioteke takođe mogu da se naprave sintetički kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređivanja in vitro, kako su opisali Hoogenboom i Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388. Objava patenta koja opisuje biblioteke humanih antitela na fagima uključuje, na primer: SAD pat. br. 5,750,373, i SAD pat. objave br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
[0200] U određenim slučajevima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela (tipično monoklonska antitela) su ona koja imaju specifičnosti vezivanja bar za dva različita epitopa (npr. dva, tri, četiri, pet ili šest ili više) na jednom ili više (npr. dva, tri, četiri, pet, šest ili više) antigena.
[0201] Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu ko-ekspresiju dva para teškog lanca/lakog lanca imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti [videti, npr., Milstein and Cuello (1983) Nature 305: 537; međunarodna patentna objava br. WO 93/08829; i Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655, i SAD pat. br.
5,731,168 (konstruisanje "ispupčenja u udubljenju")]. Multispecifična antitela takođe mogu da se naprave konstruisanjem efekata elektrostatičkih interakcija za stvaranje molekula antitela sa heterodimernim Fc (videti, npr., WO 2009/089004A1); umrežavanjem dva ili više antitela ili fragmenata [videti, npr., SAD pat. br. 4,676,980; i Brennan et al. (1985) Science, 229: 81]; upotrebom leucinskih rasferšlusa za proizvodnju bispecifičnih antitela [videti, npr., Kostelny et al. (1992) J. Immunol., 148(5): 1547-1553]; upotrebom tehnologije "dijatela" za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela [videti, npr., Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1
90:6444-6448]; korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera [videti, npr., Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152:5368]; i pripremom trispecifičnih antitela (videti, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60. Multispecifična antitela mogu da se pripreme kao antitela cele dužine ili kao fragmenti antitela. Ovde su uključena i konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela-hobotnice" [videti, npr., US 2006/0025576A1].
[0202] U određenim slučajevima, ovde opisano antitelo je monoklonsko antitelo. Monoklonsko antitelo se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, koje npr., sadrže prirodne mutacije ili nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskih antitela, takve varijante su uglavnom prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koja obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih epitopa, svako monoklonsko antitelo preparata monoklonskih antitela je usmereno protiv pojedinačnog epitopa na antigenu. Prema tome, modifikator "monoklonski" ukazuje na to da je antitelo dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim postupcima mogu da se naprave različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke prikazivanja na fagu i postupke koji koriste transgene životinje koje sadrže sve ili deo lokusa humanog imunoglobulina, takvi postupci i drugi ilustrativni postupci za stvaranje monoklonskih antitela su opisani u ovom dokumentu.
[0203] Na primer, korišćenjem imunogena poreklom od aktivina, anti-proteinski/anti-peptidni antiserumi ili monoklonska antitela mogu da se naprave prema standardnim protokolima [videti, npr., Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Sisar, poput miša, hrčka ili zeca, može da bude imunizovan imunogenim oblikom polipeptida aktivina, antigenim fragmentom koji je u stanju da izazove odgovor antitela ili fuzionim proteinom. Tehnike za postizanje imunogenosti proteina ili peptida uključuju konjugaciju sa nosačima ili druge tehnike dobro poznate u struci. Imunogeni deo polipeptida aktivina može da se primenjuje u prisustvu adjuvansa. Napredak imunizacije može da se prati detektovanjem titara antitela u plazmi ili serumu. Za procenu nivoa proizvodnje antitela i/ili nivoa afiniteta vezivanja mogu da se koriste standardni ELISA ili drugi imunološki testovi sa imunogenom kao antigenom.
1
[0204] Nakon imunizacije životinje antigenim preparatom aktivina, mogu da se dobiju antiserumi i, po želji, iz seruma mogu da se izoluju poliklonska antitela. Da bi se proizvela monoklonska antitela, ćelije koje proizvode antitela (limfociti) mogu da se sakupe iz imunizovane životinje i fuzionišu standardnim postupcima fuzije somatskih ćelija sa besmrtnim ćelijama kao što su ćelije mijeloma čime se dobijaju ćelije hibridoma. Takve tehnike su dobro poznate u struci, i uključuju, na primer, tehniku hibridoma [videti, npr., Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], tehniku hibridoma humanih B ćelija [videti, npr., Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72], i tehniku EBV-hibridoma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela [Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]. Moguće je sprovesti imunohemijsko pretraživanje ćelije hibridoma u odnosu na proizvodnju antitela koja su specifično reaktivna sa polipeptidom aktivina i izolovanje monoklonskih antitela iz kulture koja sadrži takve ćelije hibridoma.
[0205] U određenim slučajevima, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u Fc region antitela koje je ovde dato, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koja sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju, deleciju i/ili adiciju) na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija.
[0206] Na primer, ovo otkriće obuhvata varijantu antitela koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je in vivo polu-život antitela važan, dok su određene efektorske funkcije [npr. citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)] nepotrebne ili štetne. Analize citotoksičnosti in vitro i/ili in vivo mogu da se sprovedu da bi se potvrdilo smanjenje/iscrpljivanje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, mogu da se izvedu testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) kako bi se osiguralo da se antitelo ne vezuje za FcγR (pa stoga verovatno nema ni ADCC aktivnost), ali da zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje u ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoeznim ćelijama sumirana je, na primer, u Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492. Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u SAD pat. br. 5,500,362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; SAD pat. br. 5,821,337; Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361. Alternativno, mogu da se koriste postupci neradioaktivnih testova (npr., ACTI™, neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu
11
citometriju; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; i neradioaktivni test citotoksičnosti CytoTox96®, Promega, Madison, Wis.). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, na primer, na životinjskom modelu kakav je opisan u Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656. Mogu da se obave i analize vezivanja za C1q kako bi se potvrdilo da antitelo nije u mogućnosti da vezuje C1q, pa stoga nema CDC aktivnost. [videti, npr., ELISA test za vezivanje C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402]. Za procenu aktivacije komplementa, može da se izvede CDC test [videti, npr, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; i Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. Vezivanje FcRn i određivanja klirensa/polu-života in vivo takođe može da se izvede primenom postupaka poznatih u struci [videti, npr., Petkova, S. B. et al. (2006) Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769]. Antitela iz ovog otkrića sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više od ostataka 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 iz Fc regiona (SAD pat. br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (SAD pat. br.7,332,581).
[0207] U određenim slučajevima, može da bude poželjno stvaranje antitela sa konstruisanim cisteinom, na primer, „tioMAbs“, u kojima je jedan ili više ostataka u antitelu supstituisano ostacima cisteina. U posebnim slučajevima, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima u antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiol grupe se tako postavljaju na pristupačna mesta u antitelu i mogu da se koriste za konjugaciju antitela sa drugim fragmentima, kao što su fragmenti leka ili fragmenti linker-lek, kako bi se stvorio imunokonjugat, kako je ovde dalje opisano. U određenim slučajevima, bilo koji ili više sledećih ostataka mogu da budu supstituisani cisteinom: V205 (Kabat numerisanje) u lakom lancu; A118 (EU numerisanje) u teškom lancu; i S400 (EU numerisanje) u Fc regionu teškog lanca. Antitela sa konstruisanim cisteinom mogu da se generišu kako je opisano, na primer, u SAD pat. br.
7,521,541.
[0208] Pored toga, tehnike korišćene za ispitivanje antitela u cilju identifikovanja poželjnog antitela mogu da utiču na svojstva dobijenog antitela. Na primer, ako se antitelo koristi za vezivanje antigena u rastvoru, može da bude poželjno ispitati vezivanje rastvora. Dostupne su različite tehnike za ispitivanje interakcija između antitela i antigena kako bi se identifikovala posebno poželjna antitela. Takve tehnike uključuju ELISA testove, testove vezivanja na bazi rezonance površinskog plazmona (npr. test vezivanja Biacore, Biacore AB, Uppsala, Švedska), „sendvič“ testove (npr. sistem paramagnetnih zrnaca IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), western blotove, testove imunoprecipitacije i imunohistohemiju.
[0209] U određenim slučajevima se razmatraju varijante aminokiselinske sekvence antitela i/ili vezujućih polipeptida koji su ovde dati. Na primer, može da bude poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela i/ili vezujućeg polipeptida. Varijante aminokiselinske sekvence antitela i/ili vezujućih polipeptida mogu da se pripreme uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo i/ili vezujući polipeptid, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije i/ili insercije i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela i/ili vezujućeg polipeptida. Može da se uvede bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije, kako bi se dobio finalni konstrukt, pod uslovom da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike, na primer, vezivanje za ciljni molekul (npr. i aktivin poput vezivanja aktivina E i/ili aktivina C).
[0210] Promene (npr. supstitucije) mogu da se uvedu u HVR, na primer, za poboljšanje afiniteta antitela. Takve promene mogu da se uvedu na „vrućim tačkama mutacija“ u HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima koji veoma često podležu mutacijama tokom procesa somatskog sazrevanja [videti, na primer, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)] i/ili SDR (a-CDR), pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL ispituje u odnosu na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je u tehnici [videti, na primer, Hoogenboom et al., u Methods in Molecular Biology 178: 1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totova, N.J., (2001). U nekim slučajevima sazrevanja afiniteta, u varijabilne gene koji su izabrani za sazrevanje uvodi se diverzitet bilo kojim od različitih postupaka (npr. PCR metodom sklonom greškama, mešanjem lanaca ili oligonukleotidimausmerenom mutagenezom). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje kako bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje diverziteta uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima se nekoliko ostataka u HVR (npr. 4-6 ostataka istovremeno) randomizuje. Ostaci u HVR koji su uključeni u vezivanje antigena mogu specifično da se identifikuju, na primer, primenom mutageneze alaninskim skeniranjem ili modelovanjem. Postupak je često usmeren na CDR-H3 i CDR-L3.
[0211] U određenim slučajevima, do supstitucija, insercija ili delecija može da dođe unutar jednog ili više HVR, sve dok takve promene ne smanjuju suštinski sposobnost antitela da se veže za antigen. Na primer, konzervativne promene (npr. konzervativne supstitucije kako su ovde date) koje ne smanjuju suštinski afinitet vezivanja mogu da se uvedu u HVR. Takve promene mogu da budu izvan „vrućih tačaka mutacija“ u HVR ili SDR. U određenim slučajevima gore navedenih varijanti sekvenci VH i VL, svaki HVR je ili nepromenjen, ili ne sadrži više od jedne, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
[0212] Postupak koji je koristan za identifikaciju ostataka ili regiona antitela i/ili vezujućeg polipeptida na koje može da bude usmerena mutageneza naziva se "mutageneza alaninskim skeniranjem" kako su opisali Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alanin ili polialanin) da bi se utvrdilo da li to utiče na interakciju antitelo-antigen. Na pozicijama aminokiselina mogu da se uvedu dodatne supstitucije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, određuje se kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i antigena. Na takve kontaktne ostatke i njima susedne ostatke može ciljno da se deluje, ili oni mogu da se eliminišu kao kandidati za supstituciju. Varijante mogu zatim da se pretraže kako bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0213] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije u rasponu dužine od jednog ostatka sve do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i insercije unutar sekvence od jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom. Druge insercione varijante molekula antitela uključuju fuziju N- ili C-kraja antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom koji povećava serumski polu-život antitela.
[0214] U određenim slučajevima, ovde dato antitelo i/ili vezujući polipeptid mogu dodatno da se modifikuju tako da sadrže dodatne neproteinske fragmente koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Fragmenti pogodni za derivatizaciju antitela i/ili vezujućeg polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilena/anhidrida maleinske kiseline, poliaminokiseline (bilo homopolimere ili slučajne kopolimere) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše.
11
Polietilen glikol propionaldehid može da ima prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može da bude bilo koje molekulske težine i može da bude razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo i/ili vezujući polipeptid može da varira, a ako je vezano više od jednog polimera, oni mogu da budu isti ili različiti molekuli. Uopšteno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju može da se odredi na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na konkretna svojstva ili funkcije antitela i/ili vezujućeg polipeptida koji treba poboljšati, bilo da će se u terapiji pod definisanim uslovima koristiti derivat antitela i/ili derivat vezujućeg polipeptida.
5. Antagonisti malog molekula
[0215] U drugim slučajevima, antagonist GDF/BMP koji će se koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je mali molekul (antagonist GDF/BMP malog molekula) ili kombinacija antagonista malog molekula. Antagonist GDF/BMP malog molekula ili kombinacija antagonista malog molekula može da inhibira, na primer, jedan ili više liganda GDF/BMP (npr. aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 i/ili BMP15), receptor tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), receptor tipa II (npr. ActRIIB i/ili ActRIIA), ko-receptor i/ili jedan ili više signalnih faktora (npr. Smad proteini kao što su Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira signalizaciju posredovanu jednim ili većim brojem liganda GDF/BMP, na primer, kako je određeno u ćelijskom testu, kao što su oni koji su ovde opisani. Kao što je ovde opisano, antagonisti GDF/BMP malog molekula mogu da se koriste, sami ili u kombinaciji sa jednom ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava, za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (PH), posebno za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
[0216] U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje GDF11, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje GDF8, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF11, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje aktivin B, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje BMP6, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje BMP15, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje GDF3, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje BMP10, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje ActRIIA, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje ActRIIB, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr.,
11
Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje ALK4, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje ALK5, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, inhibira najmanje ALK7, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, kako je ovde opisano ne inhibira ili suštinski ne inhibira BMP9. U nekim slučajevima, antagonist GDF/BMP malog molekula, ili kombinacija antagonista malog molekula, kako je ovde opisano ne inhibira ili suštinski ne inhibira aktivin A.
[0217] Antagonisti GDF/BMP malog molekula mogu da budu direktni ili indirektni inhibitori. Na primer, indirektni antagonist malog molekula ili kombinacija antagonista malog molekula može da inhibira ekspresiju (npr. transkripciju, translaciju, ćelijsku sekreciju ili njihove kombinacije) najmanje jednog ili više liganda GDF/BMP [npr. aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin B, aktivin BC, aktivin AE ili aktivin BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 i/ili GDF8], receptora tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), receptora tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptora i/ili jedne ili više nishodnih signalnih komponenti (npr. Smad). Alternativno, direktni antagonist malog molekula ili kombinacija antagonista malog molekula mogu direktno da se vežu i inhibiraju, na primer, jedan ili više liganda GDF/BMP [npr. aktivin (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin B, aktivin BC, aktivin AE ili aktivin BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 i/ili GDF8], receptor tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), receptore tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptor i/ili jednu ili više nishodnih signalnih komponenti (npr. Smad). Kombinacije jednog ili više indirektnih i jednog ili više direktnih antagonista GDF/BMP malog molekula mogu da se koriste u skladu sa ovde opisanim postupcima.
11
[0218] Vezujući antagonisti malog molekula ovog otkrića mogu da se identifikuju i hemijski sintetizuju upotrebom poznate metodologije (videti, na primer, PCT objavu br. WO 00/00823 i WO 00/39585). Uopšteno, antagonisti malog molekula prema otkriću su obično manji od oko 2000 daltona, ili manji od oko 1500, 750, 500, 250 ili 200 daltona, pri čemu su takvi organski mali molekuli sposobni da se vežu, poželjno specifično, za polipeptid kako je ovde opisano. Ovi antagonisti malog molekula mogu da se identifikuju bez nepotrebnog eksperimentisanja, koristeći dobro poznate tehnike. U tom pogledu, treba napomenuti da su tehnike za pretraživanje biblioteka organskih malih molekula kako bi se izdvojili molekuli koji su sposobni da se vežu za ciljni polipeptid dobro poznate u tehnici (videti, npr. međunarodne patentne objave br. WO00/00823 i WO00/39585).
[0219] Vezujući organski mali molekuli predmetnog otkrića mogu da budu, na primer, aldehidi, ketoni, oksimi, hidrazoni, polukarbazoni, karbazidi, primarni amini, sekundarni amini, tercijarni amini, N-supstituisani hidrazini, hidrazidi, alkoholi, etri, tioli, tioetri, disulfidi, karboksilne kiseline, estri, amidi, uree, karbamati, karbonati, ketali, tioketali, acetali, tioacetali, aril halogenidi, aril sulfonati, alkil halogenidi, alkil sulfonati, aromatična jedinjenja, heterociklična jedinjenja, anilini, alkeni, alkini, dioli, amino alkoholi, oksazolidini, oksazolini, tiazolidini, tiazolini, enamini, sulfonamidi, epoksidi, aziridini, izocijanati, sulfonil hloridi, diazo jedinjenja i acil hloridi.
6. Polinukleotidni antagonisti
[0220] U drugim slučajevima, antagonist GDF/BMP koji će se koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima i upotrebama je polinukleotid (polinukleotidni antagonist GDF/BMP) ili kombinacija polinukleotida. Polinukleotidni antagonist GDF/BMP ili kombinacija polinukleotidnih antagonista može da inhibira, na primer, jedan ili više liganda GDF/BMP (npr. aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 i/ili BMP15), receptore tipa I (npr. ALK4, ALK5 i/ili ALK7), receptore tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB), ko-receptor i/ili nishodnu signalnu komponentu (npr. Smad). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira signalizaciju posredovanu jednim ili većim brojem liganda GDF/BMP, na primer, kako je određeno u ćelijskom testu, kao što su oni ovde opisani. Kao što je ovde opisano, polinukleotidni antagonisti GDF/BMP mogu da se koriste, sami ili u kombinaciji sa jednom ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava, za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (PH), posebno za
11
lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
[0221] U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje GDF11, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje GDF8, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF11, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje aktivin B, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje BMP6, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje BMP15, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje GDF3, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista,
11
inhibira najmanje BMP 10, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje ActRIIA, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje ActRIIB, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje ALK4, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje ALK5, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira najmanje ALK7, opciono dodatno inhibira jedan ili više od GDF8, aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10, i jedan ili više Smad proteina (npr., Smad 2 i 3). U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, kako je ovde opisano ne inhibira ili suštinski ne inhibira BMP9. U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonist GDF/BMP, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, kako je ovde opisano ne inhibira ili suštinski ne inhibira aktivin A.
[0222] U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonisti otkrića mogu da budu antisens nukleinska kiselina, molekul RNAi [npr. mala interferirajuća RNK (siRNA), RNK u obliku male ukosnice (shRNA), mikroRNK (miRNA)], aptamer i/ili ribozim. Sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselina humanih GDF11, GDF8, aktivina (aktivin A, aktivin B, aktivin C i aktivin E),
11
BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15 i Smad proteina su poznate u tehnici. Pored toga, mnogi različiti postupci generisanja polinukleotidnih antagonista su dobro poznati u tehnici. Prema tome, stručnjak u ovoj oblasti može rutinski da napravi polinukleotidne antagoniste za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem na osnovu znanja u ovoj oblasti i učenja koja su ovde data.
[0223] Antisens tehnologija može da se koristiti za kontrolu ekspresije gena kroz antisens DNK ili RNK, ili kroz formiranje trostrukog heliksa. O antisens tehnikama se govori, na primer, u Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). O formiranju trostrukog heliksa diskutuje se, na primer, u Cooney et al. (1988) Science 241:456; i Dervan et al., (1991) Science 251:1300. Postupci se zasnivaju na vezivanju polinukleotida za komplementarnu DNK ili RNK. U nekim slučajevima antisens nukleinske kiseline sadrže jednolančanu RNK ili DNK sekvencu koja je komplementarna sa najmanje delom RNK transkripta gena koji je ovde opisan. Međutim, apsolutna komplementarnost, iako poželjna, nije neophodna.
[0224] Sekvenca „komplementarna sa najmanje delom RNK“, na koju se ovde poziva, označava sekvencu koja ima dovoljnu komplementarnost da bi mogla da hibridizuje sa RNK, formirajući stabilan dupleks; u slučaju dvolančanih antisens nukleinskih kiselina ovde opisanog gena, može da se ispita jedan lanac dupleksa DNK ili može da se ispita stvaranje tripleksa. Sposobnost hibridizacije zavisiće i od stepena komplementarnosti i od dužine antisens nukleinske kiseline. Uopšteno, što je veća hibridizujuća nukleinska kiselina, to više nepodudarnih baza sa RNK može da sadrži, a da još uvek formira stabilan dupleks (ili tripleks, u zavisnosti od slučaja). Stručnjak u ovoj oblasti može da utvrdi podnošljiv stepen nepodudarnosti korišćenjem standardnih postupaka za određivanje tačke topljenja hibridizovanog kompleksa.
[0225] Polinukleotidi koji su komplementarni 5’ kraju informacionog molekula, na primer, 5’-netranslatiranoj sekvenci do, i uključujući, inicijacioni kodon AUG, trebalo bi najefikasnije da deluju na inhibiciju translacije. Međutim, pokazalo se da su sekvence komplementarne 3’-netranslatiranim sekvencama iRNK takođe efikasne u inhibiranju translacije iRNK [videti, na primer, Wagner, R., (1994) Nature 372: 333-335]. Prema tome, oligonukleotidi komplementarni ili 5’- ili 3’-netranslatiranim, nekodirajućim regionima gena prema otkriću, mogu da se koriste u antisens pristupu da inhibiraju translaciju endogene iRNK. Polinukleotidi komplementarni 5’-netranslatiranom regionu iRNK treba da uključuju komplement startnog kodona AUG. Antisens polinukleotidi komplementarni kodirajućim regionima iRNK su manje efikasni inhibitori
12
translacije, ali bi mogli da se koriste u skladu sa postupcima ovog otkrića. Bez obzira da li su konstruisane za hibridizaciju sa 5’-, 3’- ili kodirajućim regionom iRNK prema otkriću, antisens nukleinske kiseline treba da budu duge najmanje šest nukleotida, a poželjno su oligonukleotidi dužine u opsegu od 6 do oko 50 nukleotida. U određenim slučajevima oligonukleotid je dugačak najmanje 10 nukleotida, najmanje 17 nukleotida, najmanje 25 nukleotida ili najmanje 50 nukleotida.
[0226] U jednom slučaju, antisens nukleinska kiselina ovog otkrića se proizvodi unutarćelijski transkripcijom sa egzogene sekvence. Na primer, vektor ili njegov deo se transkribuje, proizvodeći antisens nukleinsku kiselinu (RNK) gena otkrića. Takav vektor bi sadržao sekvencu koja kodira željenu antisens nukleinsku kiselinu. Takav vektor može da ostane epizomalan ili da postane integrisan u hromozom, sve dok može da se transkribuje da bi se proizvela željena antisens RNK. Takvi vektori mogu da se konstruišu postupcima rekombinantne DNK tehnologije standardnim u struci. Vektori mogu da budu plazmidni, virusni ili drugi poznati u tehnici, koji se koriste za replikaciju i ekspresiju u ćelijama kičmenjaka. Ekspresija sekvence koja kodira željene gene predmetnog otkrića, ili njihove fragmente, može da se ostvari pomoću bilo kog promotora za koji je u tehnici poznato da deluje u ćelijama kičmenjaka, poželjno u humanim ćelijama. Takvi promotori mogu da budu inducibilni ili konstitutivni. Takvi promotori uključuju, ali nisu ograničeni na, region ranog promotora SV40 [vidi, npr. Benoist and Chambon (1981) Nature 290: 304-310], promotor sadržan u 3’ dugim terminalnim ponovcima virusa Rous sarkoma [videti, npr., Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797], timidinski promotor herpesa [videti, npr., Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445], i regulatorne sekvence metalotioneinskog gena [videti, npr., Brinster, et al. (1982) Nature 296:39-42].
[0227] U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonisti su molekuli interferirajuće RNK (RNAi) koji ciljno deluju na ekspresiju jednog ili više od: GDF11, GDF8, aktivina (aktivin A, aktivin B, aktivin C i aktivin E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15 i Smad proteini. RNAi se odnosi na ekspresiju RNK koja ometa ekspresiju ciljane iRNK. Konkretno, RNAi utišava ciljani gen interakcijom sa specifičnom iRNK putem siRNA (mala interferirajuća RNK). Ćelija zatim usmerava kompleks dsRNA na razgradnju. Molekul siRNA je dvolančani RNK dupleks dužine od 10 do 50 nukleotida, koji ometa ekspresiju ciljnog gena koji je dovoljno komplementaran (npr. najmanje 80% identičan sa genom). U nekim slučajevima, molekul siRNA sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identična nukleotidnoj sekvenci ciljnog gena.
[0228] Dodatni molekuli RNAi uključuju RNK u vidu kratke ukosnice (shRNA); kao i kratku interferirajuću RNK u vidu ukosnice i mikroRNK (miRNA). Molekul shRNA sadrži sens i antisens sekvence ciljnog gena povezane petljom. ShRNA se transportuje iz jedra u citoplazmu i razgrađuje se zajedno sa iRNK. Promotori Pol III ili U6 mogu da se koriste za ekspresiju RNK za RNAi. Paddison i sar. [Genes & Dev. (2002) 16: 948-958, 2002] koristili su male molekule RNK izuvijane u vidu ukosnica kao sredstvo za delovanje na RNAi. Shodno tome, takvi molekuli RNK u vidu kratke ukosnice (shRNA) se takođe povoljno koriste u ovde opisanim postupcima. Dužina stabljike i petlje funkcionalnih shRNA varira; dužine stabljika mogu da budu od oko 25 do oko 30 nt, a veličina petlje može da bude između 4 i oko 25 nt bez uticaja na aktivnost prigušivanja. Bez želje za vezivanjem za bilo koju određenu teoriju, veruje se da ove shRNA podsećaju na dvolančane RNK (dsRNA) proizvode DICER RNaze i, u svakom slučaju, imaju isti kapacitet da inhibiraju ekspresiju određenog gena. ShRNA može da se eksprimira sa lentivirusnog vektora. miRNA je jednolančana RNK dužine od oko 10 do 70 nukleotida koja se inicijalno transkribuje kao pre-miRNA koju karakteriše struktura „stabljike-petlje“, koja se nakon dalje obrade kroz RISC obrađuje u zrelu miRNA.
[0229] Molekuli koji posreduju RNAi, uključujući bez ograničenja siRNA, mogu da se proizvedu in vitro hemijskom sintezom (Hohjoh, FEBS Lett 521: 195-199, 2002), hidrolizom dsRNA (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 9942- 9947, 2002), in vitro transkripcijom sa RNK polimerazom T7 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30: e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 6047-6052, 2002), i hidrolizom dvolančane RNK upotrebom nukleaze kao što je RNaza III E. coli (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002).
[0230] U drugom slučaju, otkriće obezbeđuje polinukleotidne antagoniste, uključujući, ali bez ograničenja, lažnu DNK, dvolančanu DNK, jednolančanu DNK, složenu DNK, inkapsuliranu DNK, virusnu DNK, plazmidnu DNK, golu RNK, inkapsuliranu RNK, virusnu RNK, dvolančanu RNK, molekul sposoban da generiše RNK interferenciju ili njihove kombinacije.
[0231] U nekim slučajevima, polinukleotidni antagonisti otkrića su aptameri. Aptameri su molekuli nukleinske kiseline, uključujući molekule dvolančane DNK i jednolančane RNK, koji se vezuju i formiraju tercijarne strukture koje se specifično vezuju za ciljni molekul. Generisanje i terapijska upotreba aptamera dobro su uspostavljeni u tehnici (videti, na primer, SAD patent br.
5,475,096). Dodatne informacije o aptamerima mogu da se nađu u objavi SAD patentne prijave br. 20060148748. Nukleinske kiseline aptamera se biraju postupcima poznatim u struci, na primer postupkom sistematskog razvoja liganda eksponencijalnim obogaćivanjem (SELEX).
SELEX je postupak za in vitro evoluciju molekula nukleinske kiseline sa visoko specifičnim vezivanjem za ciljne molekule kako je opisano u, na primer, SAD pat. br.5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177; 6,011,577; i 6.699.843. Druga metoda skrininga za identifikaciju aptamera opisana je u SAD pat. br. 5,270,163. Postupak SELEX zasnovan je na sposobnosti nukleinskih kiselina da formiraju razne dvodimenzionalne i trodimenzionalne strukture, kao i na hemijskoj univerzalnosti koja omogućava nukleotidnim monomerima da deluju kao ligandi (formiraju specifične vezujuće parove) sa praktično bilo kojim hemijskim jedinjenjem, bilo monomernim ili polimernim, uključujući ostale molekule nukleinske kiseline i polipeptide. Molekuli bilo koje veličine ili sastava mogu da posluže kao ciljni. Postupak SELEX uključuje odabir iz smeše potencijalnih oligonukleotidnih kandidata i postepena ponavljanja vezivanja, razdvajanja i umnožavanja, upotrebom iste opšte šeme odabira, da bi se postigao željeni afinitet i selektivnost vezivanja. Polazeći od smeše nukleinskih kiselina, koja može da sadrži segment nasumične sekvence, postupak SELEX uključuje korake dovođenja u kontakt smeše sa ciljnim molekulom pod uslovima povoljnim za vezivanje; razdvajanja nevezanih nukleinskih kiselina od onih nukleinskih kiselina koje su se specifično vezale za ciljne molekule; disocijacije kompleksa nukleinska kiselina-ciljni molekul; umnožavanja nukleinske kiseline razdvojene iz kompleksa nukleinska kiselina-ciljni molekul kako bi se dobila mešavina nukleinskih kiselina obogaćena ligandom. Koraci vezivanja, razdvajanja, disocijacije i amplifikacije ponavljaju se kroz onoliko ciklusa koliko je poželjno da bi se dobili ligandi nukleinske kiseline koji se sa visokim afinitetom i specifičnošću vezuju za ciljni molekul.
[0232] Tipično, takvi vezujući molekuli se životinji daju posebno [videti, npr., O’Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], ali takvi vezujući molekuli mogu takođe da se eksprimiraju in vivo sa polinukleotida koje je ćelija-domaćinom preuzela i eksprimira ih in vivo [videti, npr., Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].
7. Folistatin i antagonisti FLRG
[0233] U drugim slučajevima, antagonist GDF/BMP je folistatin ili polipeptid FLRG. Kao što je ovde opisano, folistatin i/ili polipeptidi FLRG mogu da se koriste za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (PH), posebno lečenje, prevencija ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
12
[0234] Termin "polipeptid folistatina" uključuje polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid folistina, kao i bilo koje njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost, i dalje uključuje bilo koji funkcionalni monomer ili multimer folistatina. U određenim poželjnim slučajevima, polipeptidi folistatina ovog otkrića vezuju se i/ili inhibiraju aktivnost aktivina, posebno aktivina A. Varijante polipeptida folistatina koje zadržavaju svojstva vezivanja aktivina mogu da se identifikuju na osnovu prethodnih studija koje uključuju interakcije folistina i aktivina. Na primer, WO 2008/030367 otkriva specifične domene folistatina („FSD“) za koje je pokazano da su važni za vezivanje aktivina. Kao što je prikazano dole u SEQ ID NO: 28-30, N-terminalni domen folistatina ("FSND" SEQ ID NO: 28), FSD2 (SEQ ID NO: 30) i u manjoj meri FSD1 (SEQ ID NO: 29) predstavljaju primere domena unutar folistatina koji su važni za vezivanje aktivina. Pored toga, postupci za pravljenje i ispitivanje biblioteka polipeptida su gore opisani u kontekstu polipeptida ActRII, a takvi postupci se takođe odnose na pravljenje i ispitivanje varijanti folistatina. Polipeptidi folistatina uključuju polipeptide poreklom iz sekvence bilo kog poznatog folistatina koji imaju sekvencu najmanje oko 80% identičnu sekvenci polipeptida folistatina, i opciono najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnu. Primeri polipeptida folistatina uključuju zreli polipeptid folistatina ili kraće izoforme ili druge varijante prekursora humanog polipeptida folistatina (SEQ ID NO: 26) kako je opisano, na primer, u WO2005/025601.
[0235] Prekursor humanog polipeptida folistatina izoforme FST344 je kao što sledi:
(SEQ ID NO: 26; NCBI referentni br. NP_037541.1)
[0236] Signalni peptid je podvučen; takođe je gore podvučeno poslednjih 27 ostataka koji predstavljaju C-terminalni produžetak po kome se ova izoforma folistatina razlikuje od kraće izoforme folistatina FST317 prikazane dole.
[0237] Prekursor humanog polipeptida folistatina izoforme FST317 je kao što sledi:
Signalni peptid je podvučen.
[0238] Sekvenca N-terminalnog domena folistatina (FSND) je kao što sledi:
[0239] Sekvence FSD1 i FSD2 su kao što sledi:
ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO: 29; FSD1)
KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT (SEQ ID NO: 30; FSD2)
[0240] U drugim slučajevima, sredstvo za upotrebu u skladu sa ovde opisanim postupcima je gen sličan folistatinu (FLRG), takođe poznat kao protein 3 povezan sa folistatinom (FSTL3). Pojam "polipeptid FLRG" uključuje polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid FLRG, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost. U određenim poželjnim slučajevima, polipeptidi FLRG ovog otkrića vezuju se i/ili inhibiraju aktivnost aktivina, posebno aktivina A. Varijante polipeptida FLRG koje zadržavaju svojstva vezivanja aktivina mogu da se identifikuju pomoću rutinskih postupaka za ispitivanje interakcija FLRG i aktivina (videti, na primer, US 6,537,966). Pored toga, postupci za pravljenje i ispitivanje biblioteka polipeptida su gore opisani u kontekstu polipeptida ActRII i takvi postupci se takođe odnose na izradu i ispitivanje varijanti FLRG. Polipeptidi FLRG uključuju polipeptide poreklom od sekvence bilo kog poznatog FLRG koji
12
imaju sekvencu najmanje oko 80% identičnu sekvenci FLRG polipeptida, i opciono identičnost od najmanje 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, ili veću identičnost.
[0241] Prekursor humanog polipeptida FLRG (prekursor proteina 3 povezanog sa folistatinom) je kao što sledi:
Signalni peptid je podvučen.
[0242] U određenim slučajevima, funkcionalne varijante ili modifikovani oblici polipeptida folistatina i polipeptida FLRG uključuju fuzione proteine koji imaju najmanje deo polipeptida folistatina i polipeptida FLRG i jedan ili više fuzionih domena, kao što su, na primer, domeni koji olakšavaju izolaciju, detekciju, stabilizaciju ili multimerizaciju polipeptida. Pogodni fuzioni domeni su detaljno razmotreni gore u tekstu u vezi sa polipeptidima ActRII. U nekim slučajevima, antagonističko sredstvo otkrića je fuzioni protein koji sadrži deo koji vezuje aktivin polipeptida folistatina fuzionisan sa Fc domenom. U drugom slučaju, antagonističko sredstvo otkrića je fuzioni protein koji sadrži deo koji vezuje aktivin polipeptida FLRG fuzionisan sa Fc domenom.
8. Testovi pretraživanja
[0243] U određenim slučajevima, ovo otkriće se odnosi na upotrebu predmetnih antagonista GDF/BMP (npr. polipeptida ActRII i njihovih varijanti) za identifikaciju jedinjenja (sredstava) koja se mogu koristiti za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težina plućne hipertenzije (PH), posebno za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa PH.
[0244] Postoje brojni pristupi pretraživanju terapijskih sredstava za lečenje PH ciljnim delovanjem na signalizaciju (npr. Smad signalizaciju) jednog ili više liganda GDF/BMP. U
12
određenim slučajevima, može da se sprovede visoko-propusno pretraživanje jedinjenja kako bi se identifikovala sredstva koja remete efekte posredovane ligandima GDF/BMP na odabranu ćelijsku liniju. U određenim slučajevima, test se izvodi u cilju pretraživanja i identifikacije jedinjenja koja specifično inhibiraju ili smanjuju vezivanje liganda GDF/BMP (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, GDF3, BMP6, GDF8, GDF15, GDF11 ili BMP10) za njegovog vezujućeg partnera, kao što je receptor tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB). Alternativno, test se može koristiti za identifikaciju jedinjenja koja pojačavaju vezivanje liganda GDF/BMP za njegovog vezujućeg partnera, kao što je receptor tipa II. U sledećem slučaju, jedinjenja mogu da se identifikuju po svojoj sposobnosti interakcije sa receptorima tipa II.
[0245] Postoje različiti formati testova i, u svetlu ovog otkrića, stručnjak u ovoj oblasti u svakom slučaju će razumeti i one koji nisu izričito opisani u ovom dokumentu. Kao što je ovde opisano, ispitivana jedinjenja (sredstva) otkrića mogu da se kreiraju bilo kojim kombinatornim hemijskim postupkom. Alternativno, predmetna jedinjenja mogu da budu prirodni biomolekuli sintetizovani in vivo ili in vitro. Jedinjenja (sredstva) čija sposobnost da deluju kao modulatori rasta tkiva treba da se ispita mogu da budu proizvedeni, na primer, pomoću bakterija, kvasca, biljaka ili drugih organizama (npr. prirodni proizvodi), hemijskim putem (npr. mali molekuli, uključujući peptidomimetike), ili rekombinantno. Ispitivana jedinjenja koja se razmatraju u ovom otkriću uključuju nepeptidilne organske molekule, peptide, polipeptide, peptidomimetike, šećere, hormone i molekule nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, ispitivano sredstvo je mali organski molekul koji ima molekulsku težinu manju od oko 2000 daltona.
[0246] Ispitivana jedinjenja ovog otkrića mogu da se obezbede kao pojedinačni, zasebni entiteti ili da se dobiju iz biblioteka veće složenosti, kao što su one napravljene kombinatornom hemijskom sintezom. Ove biblioteke mogu da sadrže, na primer, alkohole, alkil halogenide, amine, amide, estre, aldehide, etre i druge klase organskih jedinjenja. Ispitivana jedinjenja mogu da se prikažu sistemu za ispitivanje ili u izolovanom obliku, ili kao smeša jedinjenja, posebno u početnim koracima pretraživanja. Po želji, jedinjenja mogu opciono da budu derivatizovana sa drugim jedinjenjima i da imaju derivatizacione grupe koje olakšavaju izolaciju jedinjenja. Neograničavajući primeri derivatizacionih grupa uključuju biotin, fluorescein, digoksigenin, zeleni fluorescentni protein, izotope, polihistidin, magnetne perlice, glutation S-transferazu (GST), umreživače koji se aktiviraju pomoću svetlosti ili bilo koje njihove kombinacije.
[0247] U mnogim programima za pretraživanje lekova, koji ispituju biblioteke jedinjenja i prirodne ekstrakte, poželjni su visoko-propusni testovi, kako bi se što je više moguće povećao
12
broj ispitivanih jedinjenja u datom vremenskom periodu. Analize koje se izvode u nećelijskim sistemima, kao što su oni koji se mogu izvesti sa prečišćenim ili poluprečišćenim proteinima, često su poželjni kao „primarno“ pretraživanje zbog toga što mogu da se kreiraju tako da se omogući brz razvoj i relativno lako detektovanje promene u ciljnom molekulu posredovane ispitivanim jedinjenjem. Osim toga, efekti ćelijske toksičnosti ili bioraspoloživosti ispitivanog jedinjenja mogu uglavnom da se zanemare u in vitro sistemu, a test je umesto toga fokusiran prvenstveno na efekat leka na ciljni molekul, što se može manifestovati kao promena afiniteta vezivanja između liganda GDF/BMP (npr. aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, GDF8, GDF15, GDF11, GDF3, BMP6 ili BMP10) i njegovog vezujućeg partnera, kao što je receptor tipa II (npr. ActRIIA i/ili ActRIIB).
[0248] Kao ilustracija, u primeru testa pretraživanja prema ovom otkriću, jedinjenje od interesa dovodi se u kontakt sa izolovanim i prečišćenim polipeptidom ActRIIB koji je obično sposoban da se veže za ligand ActRIIB, kako odgovara nameni testa. Smeši jedinjenja i polipeptida ActRIIB se zatim dodaje kompoziciji koja sadrži ligand ActRIIB (npr. GDF11). Detekcija i kvantifikacija kompleksa ActRIIB/ActRIIB-ligand predstavlja način za određivanje efikasnosti jedinjenja u inhibiranju (ili potenciranju) stvaranja kompleksa između polipeptida ActRIIB i njegovog vezujućeg proteina. Efikasnost jedinjenja može da se proceni generisanjem doznozavisne krive, na osnovu podataka dobijenih korišćenjem različitih koncentracija ispitivanog jedinjenja. Osim toga, može da se sprovede i kontrolni test kako bi se obezbedila bazalna vrednost za poređenje. Na primer, u kontrolnom testu, izolovani i prečišćeni ligand ActRIIB se dodaje smeši koja sadrži polipeptid ActRIIB i formiranje kompleksa ActRIIB/ligand ActRIIB se kvantifikuje u odsustvu ispitivanog jedinjenja. Podrazumeva se da, obično, redosled dodavanja reaktanata može da varira, kao i da mogu da budu istovremeno umešani. Osim toga, umesto prečišćenih proteina, mogu da se koriste ćelijski ekstrakti i lizati, kako bi se dobio pogodan nećelijski sistem za ispitivanje.
[0249] Formiranje kompleksa između liganda GDF/BMP i njegovog vezujućeg proteina može da se detektuje različitim tehnikama. Na primer, modulacija formiranja kompleksa može da se kvantifikuje primenom, na primer, detektabilno obeleženih proteina, kao što su radioaktivno obeleženi (npr.<32>P,<35>S,<14>C ili<3>H), fluorescentno obeleženi (npr. FITC) ili enzimski obeleženi polipeptid ActRIIB i/ili njegov vezujući protein, imunološkim testom ili hromatografskom detekcijom.
12
[0250] U određenim slučajevima, ovo otkriće razmatra upotrebu testova polarizacije fluorescencije i testova fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET) u merenju, bilo direktno ili indirektno, stepena interakcije između liganda GDF/BMP i njegovog vezujućeg proteina. Dalje, drugi načini detektovanja, poput onih zasnovanih na optičkim talasovodima (videti, npr., PCT objavu WO 96/26432 i SAD pat. br. 5,677,196), rezonanci površinskog plazmona (SPR), senzorima površinskog naelektrisanja i senzorima površinske sile, kompatibilni su sa mnogim primerima otkrića.
[0251] Osim toga, ovo otkriće razmatra upotrebu testa interakcije zamki, takođe poznatog kao „dvohibridni test“, za identifikovanje sredstava koja ometaju ili potenciraju interakciju između liganda GDF/BMP i njegovog vezujućeg partnera. Videti, npr., SAD pat. br. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). U konkretnom slučaju, ovo otkriće razmatra upotrebu reverznih dvohibridnih sistema za identifikaciju jedinjenja (npr. malih molekula ili peptida) koja razdvajaju interakcije između liganda GDF/BMP i njegovog vezujućeg proteina [videti, npr., Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i SAD pat. br.5,525,490; 5,955,280; i 5,965,368].
[0252] U određenim slučajevima, predmetna jedinjenja su identifikovana prema svojoj sposobnosti interakcije sa ligandom GDF/BMP. Interakcija između jedinjenja i liganda GDF/BMP može da bude kovalentna ili nekovalentna. Na primer, takva interakcija se može identifikovati na nivou proteina korišćenjem biohemijskih metoda in vitro, uključujući fotoumrežavanje, vezivanje radioaktivno obeleženih liganda i afinitetnu hromatografiju [videti, na primer, Jakobi WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. U određenim slučajevima, jedinjenja mogu da se pretražuju u testu zasnovanom na mehanizmu, kao što je test za otkrivanje jedinjenja koja se vezuju za ligand GDF/BMP. To može da uključuje događaj vezivanja na čvrstoj ili tečnoj fazi. Alternativno, gen koji kodira ligand GDF/BMP može da se transfektuje sa reporterskim sistemom (npr. β-galaktozidaza, luciferaza ili zeleni fluorescentni protein) u ćeliju i pretražiti prema biblioteci, poželjno visoko-propusnim pretraživanjem ili sa pojedinačnim članovima biblioteke. Mogu da se koriste i drugi testovi vezivanja zasnovani na mehanizmu; na primer, testovi vezivanja koji otkrivaju promene slobodne energije. Testovi vezivanja mogu da se sprovode sa ciljnim molekulom koji je fiksiran za bunarčić, perlicu ili čip, ili zarobljen imobilizovanim antitelom ili razdvojen kapilarnom elektroforezom. Vezana jedinjenja mogu da
12
se detektuju obično pomoću kolorimetrijske ili fluorescentne analize ili primenom rezonance površinskog plazmona.
9. Terapijske upotrebe
[0253] Delom, ovo otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije (npr. plućne arterijske hipertenzije), koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina). U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u lečenju jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije (npr. proliferacija glatkih mišića i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji, angiogeneza u plućnoj arteriji, dispneja, bol u grudima, remodelovanje plućne vaskulature, hipertrofija desne komore i plućna fibroza) koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP. U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u prevenciji jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP pacijentu kome je to potrebno. U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u smanjenju brzine progresije plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP pacijentu kome je to potrebno. U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u smanjenju brzine progresije jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP pacijentu kome je to potrebno. U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u smanjenju težine plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP pacijentu kome je to potrebno. U nekim slučajevima, u otkriću se razmatraju kompozicije za upotrebu u smanjenju težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP pacijentu kome je to potrebno. Opciono, ovde otkriveni postupci za lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije, posebno lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije, mogu dalje da obuhvataju davanje pacijentu jedne ili više suportivnih terapija ili dodatnih aktivnih sredstava za lečenje plućne hipertenzije. Na primer, pacijentu se takođe može dati jedna ili više suportivnih terapija ili aktivnih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od: prostaciklina i njegovih derivata (npr. epoprostenol, treprostinil i iloprost); agonista receptora za prostaciklin (npr. seleksipag); antagonista receptora za endotelin (npr. telin, ambrisentan, macitentan i bosentan); blokatora kalcijumskih kanala (npr. amlodipin, diltiazem i nifedipin;
1
antikoagulanasa (npr. varfarin); diuretika; terapije kiseonikom; atrijalne septostomije; plućne tromboendarterektomije; inhibitora fosfodiesteraze tipa 5 (npr. sildenafil i tadalafil); aktivatora rastvorljive guanilat ciklaze (npr. cinaciguat i riociguat); inhibitora ASK-1 (npr. CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-nafto[1,2,3-de]hinilin-2,7-diona, NQDI-1; 2-tioksotiazolidina, 5-bromo-3-(4-okso-2-tiokso-tiazolidin-5-iliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona); antagonista NF-κB (npr. dh404, CDDO-epoksida; 2.2-difluoropropionamida; C28 imidazola (CDDO-Im); 2-cijano-3,12-dioksoolean-1,9-dien-28-oične kiseline (CDDO); 3-acetiloleanolne kiseline; 3-triflouroacetiloleanolne kiseline; 28-metil-3-acetiloleanana; 28-metil-3-trifluoroacetiloleanana; 28-metiloksioleanolne kiseline; SZC014; SCZ015; SZC017; PEGilovanih derivata oleanolne kiseline; 3-O-(beta-D-glukopiranozil) oleanolne kiseline; 3-O-(beta-D-glukopiranozil-(1→3)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→2)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→3)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[beta-D-glukopiranozil-(1→2)-beta-D-glukopiranozil] oleanolne kiseline; 3-O-[α-L-ramnopiranozil-(1→3)-beta-D-glukuronopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-beta-D-glukopiranozil estra 3-O-[alfa-L-ramnopiranozil-(1→3)-beta-D-glukuronopiranozil] oleanolne kiseline; 28-O-3-D-glukopiranozil-oleanolne kiseline; 3-O-β-D-glukopiranozil (1→3)-β-D-glukopiranoziduronske kiseline (CS1); oleanolne kiseline 3-O-β-D-glukopiranozil (1→3)-β-D-glukopiranoziduronske kiseline (CS2); metil 3,11-dioksoolean-12-en-28-olata (DIOXOL); ZCVI4-2; benzil 3-dehidroksi-1,2,5-oksadiazolo [3’,4’:2,3] oleanolata), transplantacije pluća i/ili srca. U nekim slučajevima, pacijentu može da se daje i polipeptid BMP9. U nekim slučajevima polipeptid BMP9 je zreli polipeptid BMP9. U nekim slučajevima, polipeptid BMP9 sadrži polipeptid prodomena BMP9. U nekim slučajevima, polipeptid BMP9 se primenjuje u farmaceutskom preparatu, koji opciono može da sadrži polipeptid prodomena BMP9. U takvim farmaceutskim preparatima BMP9, koji sadrže polipeptid prodomena BMP9, polipeptid BMP9 može da bude nekovalentno povezan sa polipeptidom prodomena BMP9. U nekim slučajevima, farmaceutski preparati BMP9 su u suštini bez, ili ne sadrže polipeptid prodomena BMP9. Polipeptidi BMP9 (zreli i pro-polipeptidi), polipeptidi prodomena BMP9, farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, kao i postupak za generisanje takvih polipeptida i farmaceutskih kompozicija opisani su u, na primer, WO 2013/152213. Kako se ovde koristi, terapeutik koji "sprečava" poremećaj ili stanje odnosi se na jedinjenje koje, u statističkom uzorku, smanjuje pojavu poremećaja ili stanja u tretiranom uzorku u odnosu na netretirani kontrolni uzorak ili odlaže početak ili smanjuje težina jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja u odnosu na netretirani kontrolni uzorak.
1 1
[0254] U nekim slučajevima, ovo otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju intersticijalne bolesti pluća (npr. idiopatska plućna fibroza), koja uključuje davanje pacijentu, kome je to potrebno, efikasne količine bilo kog od antagonista GDF/BMP koji su ovde opisani (npr. antagonist jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina). U nekim slučajevima, intersticijalna bolest pluća je plućna fibroza. U nekim slučajevima intersticijalnu bolest pluća izaziva bilo šta od sledećeg: silikoza, azbestoza, berilioza, hipersenzitivni pneumonitis, upotreba lekova (npr. antibiotici, hemoterapijski lekovi, antiaritmijska sredstva, statini), sistemska skleroza, polimiozitis, dermatomiozitis, sistemski lupus eritematozus, reumatoidni artritis, infekcija (npr. atipična pneumonija, pneumonija izazvana pneumocistom, tuberkuloza, hlamidija trahomatis i/ili respiratorni sincicijalni virus), limfangitisna karcinomatoza, pušenje cigareta ili razvojni poremećaji. U nekim slučajevima, intersticijalna bolest pluća je idiopatska (npr. sarkoidoza, idiopatska plućna fibroza, Hamman-Rich-ov sindrom i/ili sindrom antisintetaze). U posebnim slučajevima, intersticijalna bolest pluća je idiopatska plućna fibroza. U nekim slučajevima, tretman idiopatske plućne fibroze se primenjuje u kombinaciji sa dodatnim terapijskim sredstvom. U nekim slučajevima, dodatno terapijsko sredstvo se bira iz grupe koja se sastoji od: pirfenidona, N-acetilcisteina, prednizona, azatioprina, nintedaniba, njihovih derivata i njihovih kombinacija.
[0255] Termin "lečenje", kako se ovde koristi, uključuje poboljšanje ili uklanjanje stanja nakon što se uspostavi. U oba slučaja, prevencija ili lečenje mogu se raspoznati u dijagnozi koju daje lekar ili drugi zdravstveni radnik i predviđenom rezultatu primene terapijskog sredstva.
[0256] Uopšteno, lečenje ili prevencija bolesti ili stanja kao što je opisano u ovom otkriću postiže se davanjem antagonista GDF/BMP u efikasnoj količini. Efikasna količina sredstva odnosi se na količinu efikasnu, u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog terapijskog ili profilaktičkog rezultata. Terapijski efikasna količina sredstva ovog otkrića može se razlikovati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca i sposobnost sredstva da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Profilaktički efikasna količina odnosi se na količinu koja je efikasna, u potrebnih dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata.
[0257] Pojmovi „subjekat“, „jedinka“ ili „pacijent“ koriste se kao sinonimi u celoj specifikaciji i uopšteno se odnose na sisare. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr.
1 2
krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove).
[0258] Plućna hipertenzija (PH) je ranije klasifikovana kao primarna (idiopatska) ili sekundarna. Nedavno je Svetska zdravstvena organizacija (WHO) klasifikovala plućnu hipertenziju u pet grupa: 1. grupa: plućna arterijska hipertenzija (PAH); 2. grupa: plućna hipertenzija sa oboljenjem levog srca; 3. grupa: plućna hipertenzija sa oboljenjem pluća i/ili hipoksemijom; 4. grupa: plućna hipertenzija usled hronične trombotičke i/ili embolijske bolesti; i 5. grupa: različita stanja (npr. sarkoidoza, histiocitoza X, limfangiomatoza i kompresija plućnih sudova). Videti, na primer, Rubin (2004) Chest 126:7-10.
[0259] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (npr. lečenje, prevencija ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije) koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina). U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente sa plućnom hipertenzijom koji imaju plućnu arterijsku hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente sa plućnom hipertenzijom koji imaju plućnu hipertenziju sa bolestima levog srca. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente sa plućnom hipertenzijom koji imaju plućnu bolest i/ili hipoksemiju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente sa plućnom hipertenzijom koji imaju hroničnu trombotičku i/ili embolijsku bolest. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente sa plućnom hipertenzijom koji imaju sarkoidozu, histiocitozu X ili limfangiomatozu i kompresiju plućnih sudova.
[0260] Plućna arterijska hipertenzija je ozbiljna, progresivna i po život opasna bolest krvnih sudova pluća, koju karakteriše duboka vazokonstrikcija i abnormalna proliferacija glatkih mišićnih ćelija u zidovima plućnih arterija. Snažno suženje krvnih sudova u plućima dovodi do vrlo visokih plućnih arterijskih pritisaka. Ovi visoki pritisci otežavaju srcu pumpanje krvi kroz pluća kako bi se oksigenisala. Pacijenti sa PAH pate od ekstremno kratkog daha jer se srce bori da pumpa protiv ovih visokih pritisaka. Pacijenti sa PAH obično razvijaju značajno povećanje plućne vaskularne rezistencije (PVR) i trajno povišenje plućnog arterijskog pritiska (PAP), što na kraju dovodi do insuficijencije desne komore i smrti. Pacijenti kojima je dijagnostikovana PAH
1
imaju lošu prognozu i podjednako ugrožen kvalitet života, sa prosečnim životnim vekom od 2 do 5 godina od trenutka dijagnoze ako se ne leče.
[0261] Razni faktori doprinose patogenezi plućne hipertenzije, uključujući proliferaciju plućnih ćelija, što može doprineti remodelovanju vaskulature (tj. hiperplaziji). Na primer, do remodelovanja vaskulature pluća dolazi prvenstveno putem proliferacije arterijskih endotelnih ćelija i glatkih mišićnih ćelija pacijenata sa plućnom hipertenzijom. Veruje se da prekomerna ekspresija različitih citokina podstiče plućnu hipertenziju. Dalje, utvrđeno je da plućna hipertenzija može nastati usled hiperproliferacije glatkih ćelija plućnih arterija i plućnih endotelnih ćelija. Zatim, uznapredovala PAH može da se okarakteriše muskularizacijom distalnih plućnih arteriola, koncentričnim zadebljanjem intime i opstrukcijom vaskularnog lumena proliferacijom endotelnih ćelija. Pietra et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004).
[0262] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (npr. lečenje, prevencija ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije) koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina), pri čemu pacijent ima plućni arterijski pritisak u mirovanju (PAP) od najmanje 25 mm Hg (npr.25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mm Hg). U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 25 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 30 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 35 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 40 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 45 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijente koji imaju PAP u mirovanju od najmanje 50 mm Hg.
[0263] U nekim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u podešavanju jednog ili više hemodinamskih parametara kod pacijenta sa PH na normalniji nivo (npr. normalan u poređenju sa zdravim ljudima sličnih godina i pola), koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina). U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP. U
1 4
nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 3 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 5 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 7 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 10 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 12 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 15 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 20 mm Hg. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje PAP kod pacijenta za najmanje 25 mm Hg. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje plućne vaskularne rezistencije (PVR). U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje plućnog kapilarnog okluzivnog pritiska (PCWP). U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje pritiska na kraju dijastole u levoj komori (LVEDP).
[0264] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije, koja uključuje davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonist jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina) pacijentu kome je to potrebno. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine proliferacije ćelija u plućnoj arteriji pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine proliferacije glatkih mišića i/ili endotelnih ćelija u plućnoj arteriji pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine angiogeneze u plućnoj arteriji pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje fizičke aktivnosti pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine dispneje kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili jačine bolova u grudima kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine umora kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne fibroze kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine fibroze kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na
1
lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine remodelovanja plućne vaskulature kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine hipertrofije desne komore kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom.
[0265] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u povećanju kapaciteta vežbanja kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom, koja obuhvata davanje efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina) pacijentu kome je to potrebno. Može da se upotrebi bilo koja odgovarajuća mera sposobnosti vežbanja. Na primer, kapacitet vežbanja u testu od 6 minuta hodanja (6MWT), kojim se meri koliko ispitanik može da pređe hodajući 6 minuta, tj. razdaljina pređena tokom 6 minuta hoda (6MWD), često se koristi za procenu težine plućne hipertenzije i progresije bolesti. Borgov indeks dispneje (BDI) je numerička skala za procenu opažene dispneje (nelagodnosti u disanju). On meri stepen ostajanja bez daha, na primer, nakon završetka 6MWT, gde BDI od 0 ukazuje na to da nema daha, i 10 ukazuje na maksimalno ostajanje bez daha. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 10 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 20 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 30 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 40 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 50 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 60 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 70 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 80 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 90 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na povećanje 6MWD za najmanje 100 metara kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 0.5 indeksnih poena kod pacijenta sa plućnom hipertenzijom. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 1 indeksni poen kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 1.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 2
1
indeksna poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 2.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 3 indeksna poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 3.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 4 indeksna poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 4.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na smanjenje BDI za najmanje 5.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na smanjenje BDI za najmanje 6 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 6.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na smanjenje BDI za najmanje 7 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na smanjenje BDI za najmanje 7.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 8 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 8.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 9 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 9.5 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na snižavanje BDI za najmanje 3 indeksna poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na smanjenje BDI za 10 indeksnih poena kod pacijenta koji ima plućnu hipertenziju.
[0266] Plućna hipertenzija na početku može da bude blaga, umerena ili teška, kako se na primer meri funkcionalnim klasama Svetske zdravstvene organizacije (WHO), što je mera težine bolesti kod pacijenata sa plućnom hipertenzijom. Funkcionalna klasifikacija WHO je adaptacija sistema njujorške srčane asocijacije (NYHA) i rutinski se koristi za kvalitativnu procenu tolerancije aktivnosti, na primer u praćenju napredovanja bolesti i odgovora na lečenje (Rubin (2004) Chest 126: 7-10). U sistemu WHO prepoznate su četiri funkcionalne klase: Klasa I: plućna hipertenzija bez ograničenja fizičke aktivnosti; uobičajena fizička aktivnost ne uzrokuje neprimerenu dispneju ili umor, bol u grudima ili presinkopu; Klasa II: plućna hipertenzija koja rezultira
1
blagim ograničenjem fizičke aktivnosti; pacijentu je ugodno u mirovanju; uobičajena fizička aktivnost uzrokuje neprimerenu dispneju ili umor, bol u grudima ili presinkopu; Klasa III: plućna hipertenzija koja rezultira izrazitim ograničenjem fizičke aktivnosti; pacijentu je ugodno u mirovanju; manje od uobičajene aktivnosti uzrokuje neprimerenu dispneju ili umor, bol u grudima ili presinkopu; Klasa IV: plućna hipertenzija koja rezultira nemogućnošću izvođenja fizičke aktivnosti bez simptoma; pacijent manifestuje znake insuficijencije desnog srca; dispneja i/ili umor mogu da budu prisutni čak i u mirovanju; nelagodnost se povećava bilo kojom fizičkom aktivnošću.
[0267] U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju, prevenciji ili smanjenju brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (npr. lečenje, prevencija ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije) koja uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 i jednog ili više Smad proteina), gde pacijent ima plućnu hipertenziju klase I, klase II, klase III ili klase IV, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijenta koji ima plućnu hipertenziju klase I, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijenta koji ima plućnu hipertenziju klase II, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na prevenciju ili odlaganje progresije kod pacijenta iz klase I plućne hipertenzije u klasu II plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz klase II plućne hipertenzije u klasu I plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijenta koji ima plućnu hipertenziju klase III, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na prevenciju ili odlaganje progresije kod pacijenta iz klase II plućne hipertenzije u klasu III plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz klase III plućne hipertenzije u klasu II plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz klase III plućne hipertenzije u klasu I plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na pacijenta koji ima plućnu hipertenziju klase IV, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na prevenciju ili odlaganje progresije kod pacijenta iz klase III plućne hipertenzije u klasu IV plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz
1
klase IV plućne hipertenzije u klasu III plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz klase IV plućne hipertenzije u klasu II plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO. U nekim slučajevima, postupak se odnosi na podsticanje ili povećanje regresije kod pacijenta iz klase IV plućne hipertenzije u klasu I plućne hipertenzije, kao što je prepoznato od strane WHO.
[0268] Ne postoji poznati lek za plućnu hipertenziju; aktuelni postupci za lečenje usredsređeni su na produženje životnog veka pacijenta i poboljšanje kvaliteta života pacijenta. Aktuelni postupci za lečenje plućne hipertenzije uključuju primenu: vazodilatatora kao što su prostaciklin, epoprostenol i sildenafil; antagonista receptora za endotelin kao što je bosentan; blokatora kalcijumskih kanala kao što su amlodipin, diltiazem i nifedipin; antikoagulanasa kao što je varfarin; i diuretika. Lečenje plućne hipertenzije takođe je sprovođeno terapijom kiseonikom, atrijalnom septostomijom, plućnom tromboendarterektomijom i transplantacijom pluća i/ili srca. Svaki od ovih postupaka, međutim, ima jedan ili više nedostataka koji mogu da obuhvataju nedostatak efikasnosti, ozbiljne neželjene efekte, nisku komplijansu pacijenta i visoke troškove. U određenim slučajevima, postupak se odnosi na lečenje, prevenciju ili smanjenje brzine progresije i/ili težine plućne hipertenzije (npr. lečenje, prevencija ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija plućne hipertenzije) pri čemu obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine antagonista GDF/BMP (npr. antagonista jednog ili više od aktivina, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i jednog ili više Smad proteina) u kombinaciji (npr. primenjuju se istovremeno ili u različito vreme, ali uglavnom na takav način da se postignu preklapajući farmakološki/fiziološki efekti) sa jednim ili više dodatnih aktivnih sredstava i/ili suportivnih terapija za lečenje plućne hipertenzije (npr. vazodilatatori poput prostaciklina, epoprostenola i sildenafila; antagonisti receptora za endotelin kao što je bosentan; blokatori kalcijumskih kanala kao što su amlodipin, diltiazem i nifedipin; antikoagulansi kao što je varfarin; diuretici; terapija kiseonikom; atrijalna septostomija; plućna tromboendarterektomija; i transplantacija pluća i/ili srca); polipeptidi BMP9; polipeptidi BMP 10; bardoksolon metil ili njegov derivat; oleanolna kiselina ili njen derivat.
[0269] U određenim slučajevima, ovo otkriće obezbeđuje postupke za vođenje lečenja pacijenta koji je lečen, ili je kandidat za lečenje jednim ili više antagonista GDF/BMP prema otkriću (npr. zamke za ligande kao što su polipeptidi ActRIIA, polipeptidi ActRIIB i polipeptidi GDF zamke) merenjem jednog ili više hematoloških parametara kod pacijenta. Hematološki parametri se
1
mogu koristiti za procenu odgovarajućeg doziranja za pacijenta koji je kandidat za lečenje antagonistom ovog otkrića, za praćenje hematoloških parametara tokom lečenja, za procenu da li treba prilagoditi doziranje tokom lečenja jednim ili većim brojem antagonista prema otkriću i/ili za procenu odgovarajuće doze održavanja jednog ili više antagonista prema otkriću. Ako su jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog nivoa, doziranje jednog ili više antagonista GDF/BMP može da se smanji, odloži ili prekine.
[0270] Hematološki parametri koji mogu da se mere u skladu sa ovde datim metodama uključuju, na primer, nivoe crvenih krvnih zrnaca, krvni pritisak, zalihe gvožđa i druge agense koji se nalaze u telesnim tečnostima koji koreliraju sa povišenim nivoima crvenih krvnih zrnaca, upotrebom postupaka poznatih u tehnici. Takvi parametri mogu da se odrede pomoću uzorka krvi pacijenta. Povećanje nivoa crvenih krvnih zrnaca, hemoglobina i/ili nivoa hematokrita može da dovede do povećanja krvnog pritiska.
[0271] U jednom slučaju, ako su jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog opsega ili bliže gornjoj granici normale kod pacijenta koji je kandidat za lečenje jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP, tada početak primene jednog ili više antagonista prema otkriću može da se odloži sve dok se hematološki parametri ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo, bilo prirodno ili terapijskom intervencijom. Na primer, ako pacijent koji je kandidat ima hipertenziju ili prehipertenziju, tada pacijent može da se leči sredstvom za snižavanje krvnog pritiska kako bi se smanjio krvni pritisak kod pacijenta. Može da se koristi bilo koje sredstvo za snižavanje krvnog pritiska koje odgovara stanju pojedinačnog pacijenta, uključujući, na primer, diuretike, adrenergičke inhibitore (uključujući alfa blokatore i beta blokatore), vazodilatatore, blokatore kalcijumskih kanala, inhibitore angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE) ili blokatore receptora za angiotenzin II. Krvni pritisak alternativno može da se leči korišćenjem dijete i režima vežbanja. Slično tome, ako pacijent koji je kandidat ima zalihe gvožđa niže od normalnih ili bliže donjoj granici normalne vrednosti, tada pacijent može da se leči odgovarajućim dijetetskim režimom i/ili suplementima na bazi gvožđa sve dok se zalihe gvožđa kod pacijenta ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo. Za pacijente koji imaju nivoe crvenih krvnih zrnaca i/ili nivoe hemoglobina više od normalnih, primena jednog ili više antagonista otkrića može da se odloži dok se nivoi ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo.
[0272] U određenim slučajevima, moguće je da, ako su jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog opsega ili bliže gornjoj granici normale kod pacijenta koji je kandidat za lečenje jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP, početak njihove primene ne bude
14
odložen. Međutim, količina doze ili učestalost doziranja jednog ili više antagonista otkrića mogu da se podese na količinu koja bi smanjila rizik od neprihvatljivog povećanja hematoloških parametara koje nastaje nakon primene jednog ili više antagonista otkrića. Alternativno, može da se razvije terapijski režim za pacijenta u kome se kombinuju jedan ili više antagonista GDF/BMP sa terapijskim sredstvom koje je usmereno na problem nepoželjnog nivoa hematološkog parametra. Na primer, ako pacijent ima povišen krvni pritisak, tada može da se dizajnira terapijski režim koji uključuje primenu jednog ili više antagonista GDF/BMP i sredstva za snižavanje krvnog pritiska. Za pacijenta koji ima zalihe gvožđa niže od željenih, može da se razvije terapijski režim koji uključuje jedan ili više antagonista GDF/BMP otkrića i suplement gvožđa.
[0273] U jednom slučaju, mogu da se ustanove bazalni parametar/parametri za jedan ili više hematoloških parametara za pacijenta koji je kandidat za lečenje jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP otkrića, i da se uspostavi odgovarajući režim doziranja za tog pacijenta na osnovu bazalne/bazalnih vrednosti. Alternativno, ustanovljeni bazalni parametri zasnovani na anamnezi pacijenta mogu da se koriste kao informacija za uspostavljanje odgovarajućeg režima doziranja antagonista za pacijenta. Na primer, ako zdrav pacijent ima ustanovljeno bazalno očitavanje krvnog pritiska koje je iznad definisanog normalnog opsega, možda neće biti potrebno dovesti pacijentov krvni pritisak u opseg koji se smatra normalnim za opštu populaciju pre lečenja jednim ili većim brojem antagonista prema otkriću. Pacijentove bazalne vrednosti za jedan ili više hematoloških parametara pre lečenja jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP otkrića isto tako mogu da se koriste kao relevantne uporedne vrednosti za praćenje bilo kakvih promena hematoloških parametara tokom lečenja jednim ili većim brojem antagonista otkrića.
[0274] U određenim slučajevima, jedan ili više hematoloških parametara se mere kod pacijenata koji se leče jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP. Hematološki parametri mogu da se koriste za praćenje pacijenta tokom lečenja i omogućavaju prilagođavanje ili prekid doziranja jednog ili više antagonista otkrića ili dodatno doziranje drugog terapijskog sredstva. Na primer, ako primena jednog ili više antagonista GDF/BMP dovede do povećanja krvnog pritiska, nivoa crvenih krvnih zrnaca ili nivoa hemoglobina ili smanjenja zaliha gvožđa, tada doza jednog ili više antagonista otkrića može da bude smanjena u količini ili učestalosti kako bi se smanjili efekti jednog ili više antagonista otkrića na jedan ili više hematoloških parametara. Ako primena jednog ili više antagonista GDF/BMP rezultira promenom jednog ili više hematoloških parametara koja je štetna za pacijenta, tada doziranje jednog ili više antagonista otkrića može da se prekine, ili privremeno, dok se hematološki parametar/parametri ne vrate na prihvatljiv nivo, ili trajno. Slično tome, ako jedan ili više hematoloških parametara nisu dovedeni u prihvatljivi opseg nakon smanjenja doze ili učestalosti primene jednog ili više antagonista otkrića, tada se doziranje može prekinuti. Kao alternativa, ili dodatak, smanjenju ili prekidu doziranja jednog ili više antagonista otkrića, pacijentu može da se daje dodatno terapijsko sredstvo koje se odnosi na neželjeni nivo hematološkog/hematoloških parametara, kao što su: na primer, sredstvo za snižavanje krvnog pritiska ili suplement gvožđa. Na primer, ako pacijent koji se leči jednim ili većim brojem antagonista GDF/BMP ima povišen krvni pritisak, tada doziranje jednog ili više antagonista otkrića može da se nastavi na istom nivou, i da se u režim doziranja doda sredstvo za snižavanje krvnog pritiska, doziranje jednog ili više antagonista otkrića može da se smanji (npr. u količini i/ili učestalosti), i da se u režim doziranja doda sredstvo za snižavanje krvnog pritiska, ili doziranje jednog ili više antagonista otkrića može da se prekine i pacijent može da se leči sredstvom za snižavanje krvnog pritiska.
10. Farmaceutske kompozicije
[0275] Ovde opisana terapijska sredstva (npr. antagonisti GDF/BMP) mogu da se formulišu u farmaceutske kompozicije. Farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem mogu da se formulišu na konvencionalan način upotrebom jednog ili većeg broja fiziološki prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Takve formulacije će uglavnom biti suštinski bez pirogena, u skladu sa većinom regulatornih zahteva.
[0276] U određenim slučajevima, terapijski postupci otkrića uključuju primenu kompozicije sistemski, ili lokalno u vidu implantata ili uređaja. Kada se daje, terapijska kompozicija za upotrebu u ovom otkriću je suštinski bez pirogena, ili je bez pirogena, u fiziološki prihvatljivom obliku. Terapijski korisna sredstva, osim antagonista GDF/BMP, koja takođe mogu opciono da budu uključeni u kompoziciju kako je gore opisano, mogu da se primenjuju istovremeno ili uzastopno sa predmetnim jedinjenjima u ovde opisanim postupcima.
[0277] Tipično, ovde otkrivena proteinska terapijska sredstva će se primenjivati parenteralno, a naročito intravenozno ili potkožno. Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu mogu da sadrže jedan ili više antagonista GDF/BMP u kombinaciji sa jednim ili većim brojem farmaceutski prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili nevodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija ili sterilnih prahova koji mogu da se rekonstituišu u sterilne injekcione rastvore ili disperzije neposredno pre upotrebe, koje mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostate, rastvorene supstance koje čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca ili sredstva za suspendovanje ili zgušnjavanje. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama iz ovog otkrića uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao maslinovo ulje i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0278] Kompozicije i formulacije mogu, po želji, da budu predstavljene u pakovanju ili uređaju za doziranje koji može sadržati jedan ili više jediničnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Uz pakovanje ili uređaj za doziranje mogu da budu priložena uputstva za primenu.
[0279] Dalje, kompozicija može da bude inkapsulirana ili injektirana u obliku za isporuku na mesto ciljnog tkiva. U određenim slučajevima, kompozicije ovog otkrića mogu da uključuju matricu koja je sposobna da isporuči jedno ili više terapijskih jedinjenja (npr. antagonista GDF/BMP) na mesto ciljnog tkiva, obezbeđujući strukturu za tkivo u razvoju i optimalno sposobnu da bude apsorbovana u telo. Na primer, matrica može da obezbedi sporo oslobađanje antagonista GDF/BMP. Takve matrice mogu da budu izrađene od materijala koji se trenutno koriste za druge medicinske implantate.
[0280] Izbor materijala za matricu zasnovan je na biokompatibilnosti, biorazgradivosti, mehaničkim svojstvima, kozmetičkom izgledu i svojstvima dodirne površine. Konkretna primena predmetnih kompozicija definisaće odgovarajuću formulaciju. Potencijalne matrice za kompozicije mogu da budu biorazgradivi i hemijski definisani kalcijum sulfat, trikalcijum fosfat, hidroksiapatit, polilaktična kiselina i polianhidridi. Ostali potencijalni materijali su biorazgradivi i biološki dobro definisani, kao što je kolagen kostiju ili kože. Dodatne matrice su sačinjene od čistih proteina ili komponenti vanćelijskog matriksa. Ostale potencijalne matrice nisu biorazgradive i hemijski su definisane, kao što su sinterovani hidroksiapatit, bio-staklo, aluminati ili druga keramika. Matrice mogu da budu sačinjene od kombinacija bilo koje od gore pomenutih vrsta materijala, kao što su polilaktična kiselina i hidroksiapatit ili kolagen i trikalcijum fosfat. Biokeramike mogu da budu izmenjene po sastavu, na primer u kalcijum-aluminat-fosfat i da se prerade kako bi im se promenila veličina pora, veličina čestica, oblik čestica i biorazgradivost.
14
[0281] U određenim slučajevima, kompozicije za upotrebu prema otkriću mogu da se primenjuju oralno, npr. u obliku kapsula, skrobnih kapsula, pilula, tableta, pastila (upotrebom aromatizovane baze, obično saharoze i akacije ili tragakanta), praškova, granula, ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili kao tečna emulzija ulje u vodi ili voda u ulju, ili kao eliksir ili sirup, ili kao pastile (upotrebom inertne baze, poput želatina i glicerina, ili saharoze i akacije) i/ili kao sredstva za ispiranje usta i slično, od kojih svako sadrži unapred određenu količinu sredstva kao aktivnog sastojka. Sredstvo se takođe može primeniti kao bolus, elektuarijum ili pasta.
[0282] U čvrstim doznim oblicima za oralnu primenu (kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, granule i slično), jedno ili više terapijskih jedinjenja iz ovog otkrića mogu da se pomešaju sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što je natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili bilo kojim elementom od sledećih: (1) punioci ili sredstva za povećanje zapremine, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol i/ili silicijumska kiselina; (2) veziva, kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; (3) humektanti, kao što je glicerol; (4) sredstva za raspadanje, kao što su agar-agar, kalcijumkarbonat, skrob krompira ili tapioke, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat; (5) sredstva za usporavanje rastvaranja, kao što je parafin; (6) sredstva za ubrzanje apsorpcije, poput kvaternarnih amonijumovih jedinjenja; (7) sredstva za kvašenje, kao što su, na primer, cetil alkohol i glicerol monostearat; (8) apsorbenti, kao što su kaolin i bentonitna glina; (9) lubrikansi, kao talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat i njihove smeše; i (10) sredstva za bojenje. U slučaju kapsula, tableta i pilula, farmaceutske kompozicije mogu takođe da sadrže puferska sredstva. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu takođe da se koriste kao punioci u mekim i tvrdo punjenim želatinskim kapsulama, upotrebom ekscipijenasa kao što su laktoza ili mlečni šećeri, kao i visokomolekulski polietilen glikoli, i slično.
[0283] Tečni dozni oblici za oralnu primenu uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Pored aktivnog sastojka, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne razblaživače koji se uobičajeno koriste u struci, poput vode ili drugih rastvarača, sredstava za povećanje rastvorljivosti i emulgatora, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (posebno ulja semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusa i susama), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sa sorbitanom i njihove smeše. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu takođe da uključuju adjuvanse kao što su sredstva za kvašenje, emulgovanje i suspendovanje, zaslađivači, arome, boje, mirisi i konzervansi.
[0284] Suspenzije, pored aktivnih jedinjenja, mogu da sadrže sredstva za suspendovanje kao što su etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i estri sorbitana, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakant i njihove smeše.
[0285] Kompozicije prema otkriću mogu takođe da sadrže adjuvanse, kao što su konzervansi, sredstva za kvašenje, emulgatori i sredstva za dispergovanje. Prevencija delovanja mikroorganizama može da se obezbedi uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline i slično. Takođe može da bude poželjno da se u kompozicije uključe izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se postigne uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, poput aluminijum-monostearata i želatina.
[0286] Podrazumeva se da će režim doziranja odrediti nadležni lekar uzimajući u obzir različite faktore koji modifikuju delovanje predmetnih jedinjenja otkrića (npr. antagonista GDF/BMP). Razni faktori uključuju, ali nisu ograničeni na starost pacijenta, pol i ishranu, težinu bolesti, vreme primene i druge kliničke faktore. Po želji, doziranje može da varira u zavisnosti od vrste matrice koja se koristi u rekonstituciji i tipova jedinjenja u kompoziciji. Dodavanje drugih poznatih faktora rasta u finalnu kompoziciju takođe može da utiče na doziranje. Napredak se može pratiti periodičnom procenom rasta i/ili popravke kostiju, na primer, rendgenskim snimkom (uključujući DEXA), histomorfometrijskim određivanjima i obeležavanjem tetraciklinom.
[0287] U određenim slučajevima, ovo otkriće takođe pruža gensku terapiju za in vivo proizvodnju antagonista GDF/BMP. Takva terapija bi postigla svoj terapijski efekat uvođenjem polinukleotidnih sekvenci antagonista GDF/BMP u ćelije ili tkiva koja imaju gore navedene poremećaje. Isporuka polinukleotidnih sekvenci antagonista GDF/BMP može da se postigne korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora kao što je himerni virus ili koloidnodisperzni sistem. Za terapijsku isporuka polinukleotidnih sekvenci antagonista GDF/BMP poželjna je upotreba usmerenih lipozoma.
14
[0288] Razni virusni vektori koji mogu da se koriste za gensku terapiju, kao što je ovde opisano, uključuju adenovirus, herpes virus, vakciniju ili, poželjno, RNK virus kao što je retrovirus. Poželjno je da je retrovirusni vektor derivat mišjeg ili ptičjeg retrovirusa. Primeri retrovirusnih vektora u koje može da se ubaci jedan strani gen uključuju, ali nisu ograničeni na: virus mišje leukemije Moloney (MoMuLV), virus mišjeg sarkoma Harvey (HaMuSV), virus mišjeg tumora mlečne žlezde (MuMTV) i virus Rous sarkoma (RSV). Brojni dodatni retrovirusni vektori mogu da uključuju više gena. Svi ovi vektori mogu da prenesu ili ugrade gen za selektivni marker, tako da transdukovane ćelije mogu da se identifikuju i generišu. Retrovirusni vektori mogu da budu učinjeni specifičnim za ciljno mesto vezanjem, na primer, šećera, glikolipida ili proteina. Poželjno ciljno delovanje se postiže korišćenjem antitela. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće da specifične polinukleotidne sekvence mogu da se ubace u retrovirusni genom ili vežu za virusni omotač kako bi se omogućilo ciljno-specifično isporučivanje retrovirusnog vektora koji sadrži antagonist GDF/BMP. U poželjnom slučaju, vektor je usmeren na kost ili hrskavicu.
[0289] Alternativno, ćelije kulture tkiva mogu se direktno transfektovati plazmidima koji kodiraju retrovirusne strukturne gene gag, pol i env, konvencionalnom transfekcijom kalcijumfosfatom. Ove ćelije se zatim transfektuju vektorskim plazmidom koji sadrži gene od interesa. Dobijene ćelije oslobađaju retrovirusni vektor u medijum za kulturu.
[0290] Još jedan sistem za usmerenu isporuku polinukleotida antagonista GDF/BMP je koloidno-disperzni sistem. Koloidno-disperzni sistemi uključuju komplekse makromolekula, nanokapsule, mikrosfere, perlice i sisteme na bazi lipida, uključujući emulzije ulja u vodi, micele, mešane micele i lipozome. Poželjni koloidni sistem ovog otkrića je lipozom. Lipozomi su veštačke membranske vezikule koje su korisne kao nosači za isporuku in vitro i in vivo. RNK, DNK i netaknuti virioni mogu da se inkapsuliraju unutar vodene unutrašnjosti i da se isporuče ćelijama u biološki aktivnom obliku (videti, na primer, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Postupci za efikasan prenos gena pomoću lipozomskog nosača poznati su u struci, videti, na primer, Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988. Kompozicija lipozoma je obično kombinacija fosfolipida, obično u kombinaciji sa steroidima, posebno holesterolom. Takođe mogu da se koriste i drugi fosfolipidi ili drugi lipidi. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske snage i prisustva dvovalentnih katjona.
[0291] Primeri lipida korisnih u proizvodnji lipozoma uključuju fosfatidilna jedinjenja, kao što su fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipidi, cerebrozidi i gangliozidi. Ilustrativni fosfolipidi uključuju fosfatidilholin jajeta, dipalmitoilfosfatidilholin i
14
distearoilfosfatidilholin. Usmeravanje lipozoma je takođe moguće na osnovu, na primer, specifičnosti za organe, specifičnosti za ćelije i specifičnosti za organele, i poznato je u struci.
[0292] Otkriće obezbeđuje formulacije koje mogu da se menjaju tako da uključuju kiseline i baze za podešavanje pH; i puferska sredstva za održavanje pH u uskom opsegu.
PRIMERI
[0293] Otkriće koje je sada uopšteno opisano, biće lakše razumljivo pozivanjem na sledeće primere, koji su dati samo kao ilustracije pojedinih slučajeva predmetnog otkrića i nisu namenjeni da ograniče otkriće. Primeri 4-12 nisu deo ovog pronalaska.
Primer 1: Fuzioni proteini ActRIIa-Fc
[0294] Konstruisan je rastvorljivi fuzioni protein ActRIIA koji ima vanćelijski domen humanog ActRIIa fuzionisan sa Fc domenom čoveka ili miša sa minimalnim linkerom između njih. Konstrukti su označeni kao ActRIIA-hFc, odnosno ActRIIA-mFc.
[0295] ActRIIA-hFc koji je prikazan ispod, prečišćen je iz ćelijskih linija CHO (SEQ ID NO: 32):
[0296] Proteini ActRIIA-hFc i ActRIIA-mFc su eksprimirani u ćelijskim linijama CHO. Razmatrane su tri različite vodeće sekvence:
(i) Melitin pčelinjeg meda (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 33)
(ii) Tkivni aktivator plazminogena (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 34)
(iii) Nativna sekvenca: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 35).
14
[0297] Odabrani oblik koristi vodeću sekvencu TPA i ima sledeću neobrađenu aminokiselinsku sekvencu:
[0298] Ovaj polipeptid je kodiran sledećom sekvencom nukleinske kiseline:
14
[0299] I ActRIIA-hFc i ActRIIA-mFc bili su izuzetno podložni rekombinantnoj ekspresiji. Kao što je prikazano na slici 5, protein je prečišćen kao jedan, dobro definisan proteinski pik. N-terminalno sekvenciranje otkrilo je jednu sekvencu -ILGRSETQE (SEQ ID NO: 38). Prečišćavanje može da se ostvari nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera. Protein ActRIIA-hFc je prečišćen do čistoće >98%, kako je određeno ekskluzionom hromatografijom i >95%, kako je određeno metodom SDS PAGE.
[0300] ActRIIA-hFc i ActRIIA-mFc su pokazali visok afinitet za ligande. GDF11 ili aktivin A su imobilizovani na Biacore™ CM5 čipu primenom standardnog postupka kuplovanja amina. Proteini ActRIIA-hFc i ActRIIA-mFc su naneti na sistem i izmereno je vezivanje. ActRIIA-hFc se vezao za aktivin sa konstantom disocijacije (KD) od 5 x 10-12 , a za GDF11 se vezao sa KDod 9.96 x 10<-9>. Videti sliku 6. Korišćenjem sličnog testa vezivanja, utvrđeno je da ActRIIA-hFc ima visok do umeren afinitet za druge ligande superfamilije TGF-beta, uključujući, na primer, aktivin B, GDF8, BMP6 i BMP10. ActRIIA-mFc se ponašao slično.
[0301] ActRIIA-hFc je bio veoma stabilan u farmakokinetičkim studijama. Pacovima su davane doze od 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg proteina ActRIIA-hFc, a nivoi proteina u plazmi mereni su na 24, 48, 72, 144 i 168 sati. U odvojenoj studiji, pacovima su davane doze od 1 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg. Kod pacova, ActRIIA-hFc je imao polu-život u serumu od 11-14 dana, a nivoi leka u cirkulaciji su bili prilično visoki posle dve nedelje (11 µg/ml, 110 µg/ml ili 304 µg/ml za početnu primenu 1 mg/kg, 10 mg/kg, odnosno 30 mg/kg). Kod majmuna cinomolgus, polu-život u plazmi je bio znatno veći od 14 dana, a nivoi leka u cirkulaciji bili su 25 µg/ml, 304 µg/ml, ili 1440 µg/ml za početnu primenu 1 mg/kg, 10 mg/kg, odnosno 30 mg/kg.
Primer 2: Karakterizacija proteina ActRIIA-hFc
[0302] Fuzioni protein ActRIIA-hFc je eksprimiran u stabilno transfektovanim ćelijama CHO-DUKX B11 sa vektora pAID4 (ori/pojačivač SV40, promotor CMV), upotrebom vodeće sekvence tkivnog plazminogena SEQ ID NO: 34. Protein, prečišćen kao što je opisano gore u primeru 1, imao je sekvencu SEQ ID NO: 32. Fc deo je Fc sekvenca humanog IgG1, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32. Analiza proteina otkriva da je fuzioni protein ActRIIA-hFc formiran kao homodimer sa disulfidnom vezom.
14
[0303] Materijal eksprimiran u CHO ćelijama ima veći afinitet za ligand aktivin B od onog o kome se izveštava za fuzioni protein ActRIIa-hFc eksprimiran u humanim ćelijama 293 [videti, del Re et al. (2004) J Biol Chem.279 (51): 53126-53135]. Pored toga, upotreba vodeće sekvence TPA obezbedila je veću proizvodnju od ostalih vodećih sekvenci i, za razliku od ActRIIA-Fc eksprimiranog sa nativnom vodećom sekvencom, pružila je izuzetno čistu N-terminalnu sekvencu. Korišćenje nativne vodeće sekvence rezultiralo je u dve glavne vrste ActRIIA-Fc, od kojih svaka ima drugačiju N-terminalnu sekvencu.
Primer 3: Alternativni proteini ActRIIA-Fc
[0304] Razne varijante ActRIIA koje mogu da se upotrebe prema ovde opisanim postupcima opisane su u međunarodnoj patentnoj prijavi objavljenoj kao WO2006/012627 (videti, na primer, str. 55-58). Alternativni konstrukt može da ima deleciju C-terminalnog repa (poslednjih 15 aminokiselina vanćelijskog domena ActRIIA). Sekvenca takvog konstrukta je predstavljena u nastavku (Fc deo je podvučen) (SEQ ID NO: 39):
Primer 4: Stvaranje fuzionih proteina ActRIIB-Fc
[0305] Podnosioci prijave su konstruisali rastvorljivi fuzioni protein ActRIIB koji ima vanćelijski domen humanog ActRIIB fuzionisan za Fc domenom čoveka ili miša sa minimalnim linkerom između njih. Konstrukti su označeni kao ActRIIB-hFc, odnosno ActRIIB-mFc.
[0306] ActRIIB-hFc koji je prikazan ispod, prečišćen je iz ćelijskih linija CHO (SEQ ID NO: 40):
1
[0307] Proteini ActRIIB-hFc i ActRIIB-mFc su eksprimirani u ćelijskim linijama CHO. Razmatrane su tri različite vodeće sekvence: (i) melitin pčelinjeg meda (HBML), ii) tkivni aktivator plazminogena (TPA) i (iii) nativna sekvenca: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 41).
[0308] Izabrani oblik koristi vodeću sekvencu TPA i ima sledeću neobrađenu aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 42):
[0309] Ovaj polipeptid je kodiran sledećom sekvencom nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 43):
1 1
[0310] Sekvenciranje N-terminalnog kraja materijala proizvedenog u CHO ćelijama otkrilo je glavnu sekvencu -GRGEAE (SEQ ID NO: 44). Treba zapaziti da ostali konstrukti prikazani u literaturi počinju sekvencom -SGR....
[0311] Prečišćavanje može da se ostvari nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera.
1 2
[0312] Fuzioni proteini ActRIIB-Fc su takođe eksprimirani u ćelijama HEK293 i ćelijama COS. Iako materijali iz svih ćelijskih linija, uz umerene uslove kultivisanja, daju protein sa aktivnošću izgradnje mišića in vivo, primećena je varijabilnost potencije koja je verovatno u vezi sa izborom ćelijske linije i/ili uslove kultivisanja.
[0313] Podnosioci prijave su generisali niz mutacija u vanćelijskom domenu ActRIIB i proizveli ove mutirane proteine kao rastvorljive fuzione proteine vanćelijskog ActRIIB i Fc domena. Osnovni fuzioni protein ActRIIB-Fc ima sekvencu SEQ ID NO: 40.
[0314] Razne mutacije, uključujući skraćivanje N- i C-kraja, uvedene su u osnovni protein ActRIIB-Fc. Na osnovu ovde predstavljenih podataka, očekuje se da će ovim konstruktima, ako se eksprimiraju sa vodećom sekvencom TPA, nedostajati N-terminalni serin. Mutacije su generisane u vanćelijskom domenu ActRIIB PCR mutagenezom. Posle PCR, fragmenti su prečišćeni na Qiagen koloni, digestirani pomoću SfoI i AgeI i prečišćeni na gelu. Ovi fragmenti su povezani u ekspresioni vektor pAID4 (videti WO 2006/012627) tako da posle vezivanja on stvara fuzionu himeru sa humanim IgG1. Nakon transformacije DH5 alfa u E. coli, sakupljene su kolonije i izolovana je DNK. Kod mišjih konstrukata (mFc), mišji IgG2a supstituisan je za humani IgG1. Sekvence svih mutanata su verifikovane.
Svi mutanti su proizvedeni u ćelijama HEK293T prolaznom transfekcijom. Ukratko, u spineru od 500 ml, ćelije HEK293T su podešene na koncentraciju od 6 x 10<5>ćelija/ml u Freestyle (Invitrogen) medijumu u zapremini od 250 ml i uzgajane preko noći. Sledećeg dana, ove ćelije su tretirane kompleksom DNK:PEI (1:1) pri finalnoj koncentraciji DNK od 0.5 ug/ml. Posle 4 sata dodato je 250 ml medijuma i ćelije su gajene 7 dana. Kondicionirani medijum je sakupljen taloženjem ćelija centrifugiranjem i koncentrovan.
[0315] Mutanti su prečišćeni upotrebom različitih tehnika, uključujući, na primer, kolonu proteina A, i eluirani glicinskim puferom sa niskim pH (3.0). Posle neutralizacije, podvrgnuti su dijalizi upotrebom PBS.
[0316] Mutanti su takođe proizvedeni u CHO ćelijama po sličnoj metodologiji. Mutanti su ispitivani u testovima vezivanja i/ili biološkim testovima opisanim u WO 2008/097541 i WO 2006/012627. U nekim slučajevima, testovi su izvedeni sa kondicioniranim medijumom, a ne prečišćenim proteinima. Dodatne varijacije ActRIIB opisane su u SAD patentu br.7,842,663.
1
[0317] Podnosilac prijave je generisao fuzioni protein ActRIIB(25-131)-hFc, koji sadrži vanćelijski domen humanog ActRIIB sa N-terminalnim i C-terminalnim skraćenjem (ostaci 25-131 nativnog proteina SEQ ID NO: 1) fuzionisan N-terminalno sa vodećom sekvencom TPA supstituisanom za nativnu vodeću sekvencu ActRIIB i C-terminalno sa humanim Fc domenom preko minimalnog linkera (tri glicinska ostatka) (slika 7). Nukleotidna sekvenca koja kodira ovaj fuzioni protein prikazana je na slici 8. Podnosioci prijave su modifikovali kodone i pronašli varijantu nukleinske kiseline koja kodira protein ActRIIB(25-131)-hFc koja je obezbedila značajno poboljšanje nivoa ekspresije početnih transformanata (slika 9).
[0318] Zreli protein ima sledeću aminokiselinsku sekvencu (N-kraj je potvrđen N-terminalnim sekvenciranjem)(SEQ ID NO: 45):
[0319] Eksprimirani molekul je prečišćen serijom koraka hromatografije na koloni, uključujući na primer tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera.
[0320] Afiniteti nekoliko liganada za ActRIIB(25-131)-hFc i njegov ekvivalent cele dužine ActRIIB(20-134)-hFc procenjeni su in vitro pomoću Biacore™ instrumenta, a rezultati su sumirani u donjoj tabeli. Vrednosti Kd su dobijene prilagođavanjem afiniteta u ravnotežnom stanju zbog vrlo brze asocijacije i disocijacije kompleksa, što je sprečilo tačno određivanje koni koff. ActRIIB(25-131)-hFc vezuje, na primer, aktivin A, aktivin B i GDF11 sa visokim afinitetom.
Afiniteti oblika ActRIIB-hFc za ligande:
1 4
Primer 5: Stvaranje GDF zamke
[0322] GDF zamka je konstruisana na sledeći način. Polipeptid koji ima modifikovani vanćelijski domen ActRIIB (aminokiseline 20-134 iz SEQ ID NO: 1 sa supstitucijom L79D) sa znatno smanjenim vezivanjem aktivina A u odnosu na GDF11 i/ili miostatin (kao posledica supstitucije leucina u aspartat na poziciji 79 u SEQ ID NO: 1) fuzionisan je sa Fc domenom čoveka ili miša sa minimalnim linkerom između. Konstrukti su označeni kao ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, odnosno ActRIIB(L79D 20-134)-mFc. Alternativni oblici sa glutamatom umesto sa aspartatom na poziciji 79 funkcionisali su na sličan način (L79E). Alternativni oblici sa alaninom umesto sa valinom na poziciji 226 u odnosu na SEQ ID NO: 64, dole, takođe su generisani i funkcionisali su ekvivalentno u svim ispitivanim aspektima. Aspartat na poziciji 79 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) je označen dvostrukim podvlačenjem u nastavku. Valin na poziciji 226 u odnosu na SEQ ID NO: 64 je takođe označen dvostrukim podvlačenjem u nastavku.
[0323] GDF zamka ActRIIB(L79D 20-134)-hFc koja je prikazana u nastavku, prečišćena je iz ćelijskih linija CHO (SEQ ID NO: 46).
[0324] Deo GDF zamke koji potiče od ActRIIB ima aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u nastavku (SEQ ID NO: 47), i taj deo bi mogao da se koristi kao monomer ili kao ne-Fc fuzioni protein, kao monomer, dimer ili kompleks višeg reda.
1
[0325] Protein GDF zamke je eksprimiran u ćelijskim linijama CHO. Razmatrane su uzete tri različite vodeće sekvence: (i) melitin pčelinjeg meda (HBML), (ii) tkivni aktivator plazminogena (TPA) i (iii) nativna sekvenca.
[0326] Izabrani oblik koristi vodeću sekvencu TPA i ima sledeću neobrađenu aminokiselinsku sekvencu:
[0327] Ovaj polipeptid je kodiran sledećom sekvencom nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 49):
1
[0328] Prečišćavanje može da se ostvari nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera. U primeru šeme prečišćavanja, medijum ćelijske kulture se propušta preko kolone proteina A, opere u 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0), zatim opere u 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0) i eluira sa 0.1 M glicinom, pH 3.0. Eluat sa niskim pH se drži na sobnoj temperaturi 30 minuta kao korak čišćenja virusa. Eluat se zatim neutrališe i propušta kroz jonoizmenjivačku Q-sefaroznu kolonu i opere u 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl i eluira u 50 mM Tris pH 8.0, sa koncentracijom NaCl između 150 mM i 300 mM. Eluat se zatim izmeni u 50 mM Tris pH 8.0, 1.1 M amonijum sulfata i propušta preko fenilsefarozne kolone, opere i eluira u 50 mM Tris pH 8.0 pomoću amonijum sulfata između 150 i 300 mM. Eluat se podvrgava dijalizi i filtrira za upotrebu.
[0329] Dodatne GDF zamke (fuzioni proteini ActRIIB-Fc modifikovani tako da im se smanji odnos vezivanja aktivina A u odnosu na vezivanje miostatina ili GDF11) opisane su u WO 2008/097541 i WO 2006/012627.
Primer 6: Biotest za signalizaciju posredovanu sa GDF11 i aktivinom
[0330] Analiza sa reporterskim genom A-204 korišćena je za procenu efekata proteina ActRIIB-Fc i GDF zamki na signalizaciju putem GDF-11 i aktivina A. Ćelijska linija: humani rabdomiosarkom (poreklom od mišića). Reporterski vektor: pGL3(CAGA)12 (opisan u Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100). Motiv CAGA12 prisutan je u genima koji reaguju na TGF-
1
beta (npr. gen PAI-1), pa je ovaj vektor od opšte upotrebe za faktore koji signaliziraju putem SMAD2 i 3.
1. dan: Raspoređivanje ćelija A-204 na ploču sa 48 bunarčića.
2. dan: Transfekcija ćelija A-204 sa 10 ug pGL3(CAGA)12 ili pGL3(CAGA)12(10 ug) pRLCMV (1 µg) i Fugenom.
3. dan: Dodavanje faktora (razblaženi u medijumu 0.1% BSA). Pre dodavanja u ćelije, inhibitore treba prethodno inkubirati sa faktorima tokom 1 sata. Šest sati kasnije, ćelije su isprane PBS-om i lizirane.
[0331] Nakon toga sledi test luciferaze. U odsustvu bilo kakvih inhibitora, aktivin A je pokazao 10-struku stimulaciju ekspresije reporterskog gena i ED50 od ~2 ng/ml. GDF-11: 16-struka stimulacija, ED50: ~1.5 ng/ml.
[0332] ActRIIB(20-134) je snažni inhibitor, na primer, aktivnosti aktivina A, GDF-8 i GDF-11 u ovom testu. Kao što je opisano u nastavku, u ovom testu su takođe ispitane varijante ActRIIB. Primer 7: Varijante ActRIIB-Fc, aktivnost u ćelijskom testu
[0333] Aktivnost proteina ActRIIB-Fc i GDF zamki testirana je u ćelijskom testu kako je gore opisano. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli. Neke varijante su testirane u različitim konstruktima sa skraćivanjem C-kraja. Kao što je gore pomenuto, skraćivanje pet ili petnaest aminokiselina uzrokovalo je smanjenje aktivnosti. GDF zamke (varijante L79D i L79E) pokazale su značajan gubitak inhibicije aktivina A, uz zadržavanje inhibicije GDF11 gotovo na nivou divljeg tipa.
Vezivanje rastvorljivog ActRIIB-Fc za GDF11 i aktivin A:
1
[0334] Varijanta A24N ima aktivnost u ćelijskom testu (gore) i to je ekvivalentno molekulu divljeg tipa. Varijanta A24N i bilo koja druga prethodno ispitivana varijanta mogu da se kombinuju sa molekulima GDF zamke, kao što su varijante L79D ili L79E.
Primer 8: Vezivanje GDF11 i aktivina A.
[0335] Vezivanje određenih proteina ActRIIB-Fc i GDF zamki za ligande je ispitano u Biacore™ testu.
[0336] Varijante ActRIIB-Fc ili divlji tip proteina vezani su za sistem upotrebom anti-hFc antitela. Ligandi su injektirani i proticali su preko vezanih receptorskih proteina. Rezultati su sumirani u donjim tabelama.
Specifičnost u vezivanju liganda IIB varijanti.
1
[0337] Ovi podaci dobijeni u nećelijskom testu potvrđuju podatke zasnovane na ćelijskom testu, pokazujući da varijanta A24N zadržava aktivnost vezivanja liganda koja je slična aktivnosti molekula ActRIIB(20-134)-hFc i da molekul L79D ili L79E zadržava vezivanje za miostatin i GDF11, ali pokazuje izrazito smanjeno (ne može se kvantifikovati) vezivanje za aktivin A.
[0338] Generisane su i testirane druge varijante, kao što je navedeno u WO 2006/012627. Videti, na primer, str. 59-60, upotrebom liganda vezanih za uređaj i protoka receptora preko vezanih liganda. Značajno je da K74Y, K74F, K74I (i verovatno druge hidrofobne supstitucije na K74, kao što je K74L) i D80I, uzrokuju smanjenje odnosa vezivanja aktivina A (ActA) prema vezivanju za GDF11 u odnosu na molekul K74 divljeg tipa. Tabela podataka u vezi sa ovim varijantama prikazana je u nastavku:
1
Vezivanje rastvorljivih varijanti ActRIIB-Fc za GDF11 i aktivin A (test Biacore™)
1 1
Primer 9: Stvaranje GDF zamke sa skraćenim vanćelijskim domenom ActRIIB
[0339] GDF zamka označena kao ActRIIB(L79D 20-134)-hFc generisana je N-terminalnom fuzijom vodeće sekvence TPA sa vanćelijskim domenom ActRIIB (ostaci 20-134 u SEQ ID NO: 1) koji sadrži supstituciju leucin u aspartat (na ostatku 79 u SEQ ID NO: 1) i C-terminalnom fuzijom humanog Fc domena sa minimalnim linkerom (tri glicinska ostatka) (slika 10; SEQ ID NO: 74). Nukleotidna sekvenca koja odgovara ovom fuzionom proteinu prikazana je na slici 11 (SEQ ID NO: 75, sens lanac; i SEQ ID NO: 76, antisens lanac).
[0340] GDF zamka sa skraćenim vanćelijskim domenom ActRIIB, označena kao ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, generisana je N-terminalnom fuzijom vodeće sekvence TPA sa skraćenim vanćelijskim domenom (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1) koji sadrži supstituciju leucin u aspartat (na ostatku 79 u SEQ ID NO: 1) i C-terminalnom fuzijom humanog Fc domena sa minimalnim linkerom (tri glicinska ostatka) (slika 12, SEQ ID NO: 77). Sekvenca prečišćenog oblika ćelijskog ActRIIB(L79D 25-131)-hFc predstavljena je na slici 13 (SEQ ID NO: 78). Jedna nukleotidna sekvenca koja kodira ovaj fuzioni protein prikazana je na slici 15 (SEQ ID NO: 80) zajedno sa njenom komplementarnom sekvencom (SEQ ID NO: 81), a alternativna nukleotidna sekvenca koja kodira potpuno isti fuzioni protein prikazana je na slici 16 (SEQ ID NO: 82), i njena komplementarna sekvenca (SEQ ID NO: 83).
Primer 10: Selektivno vezivanje liganda pomoću GDF zamke sa dvostruko skraćenim vanćelijskim domenom ActRIIB
[0341] Afinitet GDF zamki i drugih proteina ActRIIB-hFc za nekoliko liganda procenjen je in vitro pomoću Biacore™ instrumenta. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli. Vrednosti Kd su dobijene prilagođavanjem afiniteta u ravnotežnom stanju zbog vrlo brze asocijacije i disocijacije kompleksa, što je sprečilo precizno određivanje koni koff.
Selektivnost varijanti ActRIIB-hFc za ligande:
1 2
[0342] GDF zamka sa skraćenim vanćelijskim domenom, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, izjednačila je ili nadmašila selektivnost za ligande koju ispoljava duža varijanta, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, sa izraženim gubitkom vezivanja aktivina A, delimičnim gubitkom vezivanja aktivina B i gotovo potpunom očuvanošću vezivanja GDF11 u poređenju sa ActRIIB-hFc ekvivalentima kojima nedostaje supstitucija L79D. Treba zapaziti da samo skraćivanje (bez supstitucije L79D) nije promenilo selektivnost među ovde prikazanim ligandima [uporediti ActRIIB(L79 25-131)-hFc sa ActRIIB(L79 20-134)-hFc]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc takođe zadržava snažno do srednje vezivanje za Smad 2/3 signalni ligand GDF8 i Smad 1/5/8 ligande BMP6 i BMP10.
Primer 11: GDF zamka poreklom iz ActRIIB5
[0343] Drugi istraživači su prijavili alternativni, rastvorljivi oblik ActRIIB (označen kao ActRIIB5), u kojem je egzon 4, uključujući transmembranski domen ActRIIB, zamenjen drugom C-terminalnom sekvencom. (videti, npr., WO 2007/053775).
[0344] Sekvenca nativnog humanog ActRIIB5 bez njegove vodeće sekvence je kao što sledi:
[0345] Supstitucija leucina u aspartat ili supstitucije drugih kiselih aminokiselina mogu da se uvedu na nativnom poziciji 79 (podvučeno) kako je opisano, da bi se konstruisala varijanta ActRIIB5(L79D), koja ima sledeću sekvencu:
1
[0346] Ova varijanta može da bude spojena sa humanim Fc (dvostruko podvučeno) pomoću linkera TGGG (jednostruko podvučeno) da bi se generisao humani fuzioni protein ActRIIB5(L79D)-hFc sa sledećom sekvencom:
[0347] Ovaj konstrukt može da bude eksprimiran u CHO ćelijama.
Primer 12: Generisanje heterodimera ALK4:ActRIIB
[0348] Konstruisan je heteromerni kompleks ALK4-Fc:ActRIIB-Fc koji sadrži vanćelijske domene humanog ActRIIB i humanog ALK4, koji su svaki odvojeno fuzionisani sa Fc domenom sa linkerom postavljenim između vanćelijskog domena i Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao fuzioni polipeptid ActRIIB-Fc, odnosno fuzioni polipeptid ALK4-Fc, a sekvence svakog od njih su date u nastavku.
[0349] Metodologija za podsticanje stvaranja heteromernih kompleksa ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, nasuprot homodimernim kompleksima ActRIIB-Fc ili ALK4-Fc, podrazumeva uvođenje promena u aminokiselinsku sekvencu Fc domena kako bi se usmerilo stvaranje asimetričnih heteromernih kompleksa. U ovom otkriću su opisani mnogi različiti pristupi stvaranju asimetričnih interagujućih parova upotrebom Fc domena.
1 4
[0350] U jednom pristupu, ilustrovanom na sekvencama polipeptida ActRIIB-Fc i ALK4-Fc SEQ ID NO: 108 i 110 i SEQ ID Nos: 111 i 113, redom, jedan Fc domen je izmenjen da bi se na mestu interakcije uvele katjonske aminokiseline, dok je drugi Fc domen izmenjen da bi se na mestu interakcije uvele anjonske aminokiseline. U fuzionom polipeptidu ActRIIB-Fc, kao i u fuzionom polipeptidu ALK4-Fc koristi se vodeća sekvenca tkivnog aktivatora plazminogena (TPA).
[0351] Polipeptidna sekvenca ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 108) prikazana je ispod:
[0352] Vodeća (signalna) sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se podstaklo stvaranje heterodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, umesto bilo kog od mogućih homodimernih kompleksa, u Fc domen fuzionog proteina ActRIIB mogu se uvesti dve supstitucije aminokiselina (zamena kiselih aminokiselina lizinom), što je označeno dvostrukim podvlačenjem gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 108 može opciono da bude data sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
[0353] Ovaj fuzioni protein ActRIIB-Fc kodiran je sledećom sekvencom nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 109):
1
[0354] Zreli fuzioni polipeptid ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 110) je kao što sledi, i može opciono da bude dat sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
1
[0355] Komplementarni oblik fuzionog polipeptida ALK4-Fc (SEQ ID NO: 111) je kao što sledi:
[0356] Vodeća sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se usmerilo stvaranje heterodimera sa fuzionim polipeptidom ActRIIB-Fc SEQ ID NO: 108 i 110, gore, u Fc domen fuzionog polipeptida ALK4-Fc mogu da se uvedu dve supstitucije aminokiselina (zamena lizina asparaginskim kiselinama), što je gore označeno dvostrukim podvlačenjem. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 111 može opciono biti data sa lizinom (K) dodatim na C-kraju.
[0357] Ovaj fuzioni protein ALK4-Fc kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 112):
1
�
�
[0358] Sekvenca zrelog fuzionog proteina ALK4-Fc (SEQ ID NO: 113) je kao što sledi i može opciono da bude data sa lizinom (K) dodatim na C-kraju.
1
[0359] Proteini ActRIIB-Fc i ALK4-Fc sa SEQ ID NO: 110, odnosno SEQ ID NO: 113, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz ćelijske linije CHO, dajući heteromerni kompleks koji sadrži ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.
[0360] U drugom pristupu podsticanju stvaranja heteromultimernog kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih proteina, Fc domeni su izmenjeni kako bi se uvele komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u sekvencama polipeptida ActRIIB-Fc i ALK4-Fc SEQ ID NOs: 114 i 115 i SEQ ID Nos: 116 i 117, redom. U fuzionom polipeptidu ActRIIB-Fc, kao i u fuzionom polipeptidu ALK4-Fc koristi se vodeća sekvenca tkivnog aktivatora plazminogena (TPA).
[0361] Polipeptidna sekvenca ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 114) prikazana je ispod:
1 1
[0362] Vodeća (signalna) sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se podstaklo stvaranje heterodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, umesto bilo kog od mogućih homodimernih kompleksa, u Fc domen fuzionog proteina mogu da se uvedu dve supstitucije aminokiselina (zamenom serina cisteinom i treonina trifofanom), kao što je gore naznačeno dvostrukim podvlačenjem. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 114 može opciono da bude data sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
[0363] Zreli fuzioni polipeptid ActRIIB-Fc je kao što sledi:
1 2
[0364] Komplementarni oblik fuzionog polipeptida ALK4-Fc (SEQ ID NO: 116) je kao što sledi i može opciono da bude dat sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
1
[0365] Vodeća sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se usmerilo stvaranje heterodimera sa fuzionim polipeptidom ActRIIB-Fc SEQ ID NO: 114 i 115 gore, u Fc domen fuzionog polipeptida ALK4 mogu da se uvedu četiri supstitucije aminokiselina, kako je gore naznačeno dvostrukim podvlačenjem. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 116 može opciono da bude data sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
[0366] Sekvenca zrelog fuzionog proteina ALK4-Fc je kao što sledi i može opciono da bude data sa lizinom (K) uklonjenim sa C-kraja.
1 4
[0367] Proteini ActRIIB-Fc i ALK4-Fc sa SEQ ID NO: 115 odnosno SEQ ID NO: 117, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz ćelijske linije CHO, dajući heteromerni kompleks koji sadrži ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.
[0368] Prečišćavanje različitih kompleksa ALK4-Fc: ActRIIB-Fc može da se postigne nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija i hromatografija sa izmenom katjona. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera.
[0369] U drugom pristupu, za podsticanje stvaranja heteromultimernih kompleksa upotrebom asimetričnih Fc fuzionih proteina, Fc domeni su izmenjeni kako bi se uvele komplementarne hidrofobne interakcije, dodatna međumolekulska disulfidna veza i elektrostatičke razlike između dva Fc domena radi olakšavanja prečišćavanja na osnovu neto molekulskog naelektrisanja, kako je ilustrovano u sekvencama polipeptida ActRIIB-Fc i ALK4-Fc SEQ ID NO: 118-121, odnosno 122-125. U fuzionom polipeptidu ActRIIB-Fc, kao i u fuzionom polipeptidu ALK4-Fc koristi se vodeća sekvenca tkivnog aktivatora plazminogena (TPA).
1
[0370] Polipeptidna sekvenca ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 118) je prikazana ispod:
[0371] Vodeća sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se podstaklo stvaranje heterodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, umesto bilo kog od mogućih homodimernih kompleksa, u Fc domen fuzionog proteina mogu da se uvedu dve supstitucije aminokiselina (zamenom serina cisteinom i treonina trifofanom), kao što je gore naznačeno dvostrukim podvlačenjem. Da bi se olakšalo prečišćavanje hetrodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, dve supstitucije aminokiselina (zamena lizina kiselim aminokiselinama) takođe se mogu uvesti u Fc domen fuzionog proteina, kako je gore naznačeno dvostrukim podvlačenjem. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 118 može opciono da bude data sa lizinom dodatim na C-kraju.
[0372] Ovaj fuzioni protein ActRIIB-Fc kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 119):
1
[0373] Zreli fuzioni polipeptid ActRIIB-Fc je kao što sledi (SEQ ID NO: 120) i može opciono da bude dat sa lizinom dodatim na C-kraju.
[0374] Ovaj fuzioni polipeptid ActRIIB-Fc je kodiran sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 121):
1
[0375] Komplementarni oblik fuzionog polipeptida ALK4-Fc (SEQ ID NO: 122) je kao što sledi i može opciono da bude dat sa lizinom uklonjenim sa C-kraja.
[0376] Vodeća sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se usmerilo stvaranje heterodimera sa fuzionim polipeptidom ActRIIB-Fc SEQ ID NO: 118 i 120, gore, u Fc domen fuzionog polipeptida ALK4 mogu da se uvedu četiri zamene aminokiselina (zamena tirozina cisteinom, treonina serinom, leucina alaninom i tirozina valinom), kao što je gore naznačeno dvostrukim
1
podvlačenjem. Da bi se olakšalo prečišćavanje heterodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, dve supstitucije aminokiselina (zamena asparagina argininom i aspartata argininom) takođe se mogu uvesti u Fc domen fuzionog polipeptida ALK4-Fc, što je gore naznačeno dvostrukim podvlačenjem. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 122 može opciono da bude data sa lizinom uklonjenim sa C-kraja.
[0377] Ovaj fuzioni polipeptid ALK4-Fc kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 123):
[0378] Sekvenca zrelog fuzionog polipeptida ALK4-Fc je kao što sledi (SEQ ID NO: 124) i može opciono da bude data sa lizinom uklonjenim sa C-kraja.
1
[0379] Ovaj fuzioni polipeptid ALK4-Fc je kodiran sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 125):
[0380] Proteini ActRIIB-Fc i ALK4-Fc sa SEQ ID NO: 120, odnosno SEQ ID NO: 124, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz ćelijske linije CHO da bi se dobio heteromerni kompleks koji sadrži ALK4-Fc:ActRIIB- Fc.
1
[0381] Prečišćavanje različitih kompleksa ALK4-Fc:ActRIIB-Fc može da se postigne nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q-sefarozi, hromatografija na fenilsefarozi, ekskluziona hromatografija, hromatografija sa izmenom katjona, afinitetna hromatografija zasnovana na epitopu (npr. sa antitelom ili funkcionalno ekvivalentnim ligandom usmerenim protiv epitopa na ALK4 ili ActRIIB) i multimodalna hromatografija (npr. sa smolom koja sadrži i elektrostatičke i hidrofobne ligande). Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i izmenom pufera.
Primer 13. Profil vezivanja liganda za heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc i homodimerom ALK4-Fc
[0382] Analiza vezivanja zasnovana na testu Biacore™ korišćena je za upoređivanje selektivnosti vezivanja liganda gore opisanog heterodimernog kompleksa ALK4-Fc:ActRIIB-Fc sa onom kod homodimernih kompleksa ActRIIB-Fc i ALK4-Fc. Heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, homodimer ActRIIB-Fc i homodimer ALK4-Fc su nezavisno vezani za sistem upotrebom anti-Fc antitela. Ligandi su injektirani i propuštani preko vezanog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli, u kojoj su stope disocijacije (kd) liganda, koje najviše ukazuju na efikasne zamke za ligande, označene sivim osenčenjem.
1 1
[0383] Ovi uporedni podaci o vezivanju pokazuju da heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc ima izmenjeni profil/selektivnost vezivanja u odnosu na homodimere ActRIIB-Fc ili ALK4-Fc. Heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc pokazuje pojačano vezivanje za aktivin B u poređenju sa bilo kojim homodimerom, zadržava snažno vezivanje za aktivin A, GDF8 i GDF11 kao što je zapaženo kod homodimera ActRIIB-Fc i pokazuje značajno smanjeno vezivanje za BMP9, BMP10 i GDF3. Konkretno, BMP9 pokazuje nizak ili nemerljiv afinitet za heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, dok se ovaj ligand snažno vezuje za homodimer ActRIIB-Fc. Poput homodimera ActRIIB-Fc, i heterodimer zadržava vezivanje srednjeg nivoa za BMP6. Videti sliku 19.
[0384] Pored toga, test sa reporterskim genom A-204 korišćen je za procenu efekata heterodimera ALK4-Fc:ActRIIB-Fc i homodimera ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc na signalizaciju aktivinom A, aktivinom B, GDF11, GDF8, BMP10 i BMP9. Ćelijska linija: humani rabdomiosarkom (poreklom od mišića). Reporterski vektor: pGL3(CAGA)12 (kako je opisano u Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100). Motiv CAGA12 prisutan je u genima koji reaguju na TGFβ (PAI-1 gen), tako da je ovaj vektor opšte korišćen za faktore koji prenose signale putem Smad2 i 3. Primer testa sa reporterskim genom A-204 je dat ispod.
1 2
1. dan: Raspoređivanje ćelija A-204 na ploču sa 48 bunarčića.
2. dan: Transfekcija ćelija A-204 sa 10 ug pGL3(CAGA)12 ili pGL3(CAGA)12(10 ug) pRLCMV (1 ug) i Fugenom.
3. dan: Dodavanje faktora (razblaženi u medijumu 0.1% BSA). Pre dodavanja u ćelije, inhibitore treba prethodno inkubirati sa faktorima tokom jednog sata. Približno šest sati kasnije, ćelije su isprane PBS-om i zatim lizirane.
[0385] Sledeći gornje korake, izveden je test luciferaze.
[0386] U ovom testu, utvrđeno je da su i heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc i homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc snažni inhibitori aktivina A, aktivina B, GDF11 i GDF8. Konkretno, kao što se može videti iz uporednih podataka o IC50za homodimer/heterodimer prikazanih na slici 19, heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc inhibira signalne puteve aktivina A, aktivina B, GDF8 i GDF11 slično kao homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Međutim, inhibicija signalnih puteva BMP9 i BMP10 heterodimerom ALK4-Fc:ActRIIB-Fc je značajno smanjena u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Ovi podaci su u skladu sa gore razmatranim podacima o vezivanju u kojima je uočeno da i heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc i homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc pokazuju snažno vezivanje za aktivin A, aktivin B, GDF8 i GDF11, ali BMP10 i BMP9 imaju značajno smanjen afinitet za heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc.
[0387] Ovi podaci, prema tome, zajedno pokazuju da je heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc selektivniji antagonist aktivina A, aktivina B, GDF8 i GDF11 u poređenju sa homodimerom ActRIIB-Fc. Shodno tome, heterodimer ALK4-Fc:ActRIIB-Fc će biti korisniji od homodimera ActRIIB-Fc u određenim primenama gde je takav selektivni antagonizam povoljan. Primeri uključuju terapijske primene gde je poželjno zadržati antagonizam jednog ili više od aktivina A, aktivina B, aktivina AC, GDF8 i GDF11, ali svesti na najmanju meru antagonizam jednog ili više od BMP9, BMP10, GDF3 i BMP6.
Primer 14: Efekti polipeptida ActRII i heterodimera ALK4:ActRIIB na plućnu hipertenziju u monokrotalinskom modelu pacova
[0388] Efekti fuzionog proteina ActRIIA-mFc (homodimer ActRIIA-mFc kako je opisano u primeru 1), heterodimera ALK4-Fc-ActRIIB-Fc (kao što je opisano u primerima 12 i 13) i sildenafila (inhibitora fosfodiesteraze-5 odobrenog za lečenje PAH) ispitivani su na pacovskom
1
modelu plućne arterijske hipertenzije (PAH). U ovom modelu, pacovi Sprague Dawley primili su subkutanu injekciju monokrotalina (MCT) za indukciju PAH 24 sata pre početka terapije.
[0389] Pacovi su razdvojeni u različite tretmanske grupe (10 miševa u grupi): 1) tretman sa MCT (60 mg/kg primenjeno i.p. kao pojedinačna doza 1. dana studije) i Tris-puferisanim fiziološkim rastvorom (i.p. kao 1 ml/kg, na svaka tri dana) (tretmanska grupa sa vehikulumom), 2) tretman polipeptidom ActRIIA-mFc (10 mg/kg primenjeno i.p. na svaka tri dana) i MCT (60 mg/kg primenjeno i.p. kao pojedinačna doza 1. dana studije), 3) tretman heterodimerom ALK4-Fc:ActRIIB-Fc (10 mg/kg primenjeno i.p. na svaka tri dana) i MCT (60 mg/kg primenjeno i.p. kao pojedinačna doza 1. dana studije), 4) tretman sildenafilom (30 mg/kg primenjeno oralno dva puta dnevno) i MCT (60 mg/kg primenjeno i.p. kao pojedinačna doza 1. dana studije) i 5) kontrolni pacovi (fiziološki rastvor puferisan Tris-om primenjen i.p. kao 1 ml/kg, na svaka tri dana). Pacovi su tretirani 28 dana. Telesne težine su beležene pre prve doze 1. dana, a zatim nedeljno tokom studije.
[0390] 28. dana pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina/ksilazina (80/10 mg/kg). Na vratu je napravljen rez, a jugularna vena je izolovana i anteriorno podvezana. Kateter za merenje pritiska ispunjen tečnošću uveden je u desnu jugularnu venu za merenje plućnog arterijskog pritiska (PAP). Napravljen je još jedan rez u regionu prepona, i femoralna arterija je izolovana i anteriorno podvezana. Kateter za merenje pritiska Millar uveden je u femoralnu arteriju za merenje sistolnog arterijskog pritiska, dijastolnog pritiska i srčane frekvencije. Srednji arterijski pritisak i desni PAP praćeni su pomoću Notocord HEM (Croissy sur Seine, Frnace) v3.5 sistema za prikupljanje podataka približno 5-10 minuta dok nisu dobijena stabilna merenja. Tokom merenja, pacovi su održavani na približno 37 °C na grejnom jastučiću i tokom postupka praćena je telesna temperatura sondom za rektalnu temperaturu. Po završetku postupka, pacovi su eutanazirani, a srca i pluća uklonjena. Celo srce je odmereno. Zatim su uklonjene pretkomore i odvojena leva komora sa septumom (LV S) od desne komore (RV). Komore su odmerene odvojeno. Hipertrofija je delom procenjena izračunavanjem RV/LV S. Pluća su takođe odmerena.
[0391] U poređenju sa kontrolnim životinjama, primećeno je da pacovi tretirani monokrotalinom (tretmanska grupa sa vehikulumom) imaju smanjenu telesnu težinu, povišen PAP, hipertrofiju desnog srca i povećanu težinu pluća, što ukazuje na uspostavljanje PAH. Pacovi tretirani sildenafilom nisu imali nikakvo poboljšanje telesne težine u poređenju sa pacovima tretiranim monokrotalinom. Međutim, tretman sildenafilom smanjio je povišeni PAP za 30%, smanjio
1 4
hipertrofiju desnog srca za 18.5% i smanjio težinu pluća za 10% u poređenju sa pacovima koji su tretirani monokrotalinom. Iznenađujuće je utvrđeno da i ALK4-Fc:ActRIIB-Fc i ActRIIA-mFc imaju značajno veće efekte u lečenju PAH u ovom modelu u poređenju sa sildenafilom. Na primer, tretman sa ALK4-Fc:ActRIIB-Fc rezultirao je poboljšanjem telesne težine (+5.1%), smanjenjem povišenog PAP za 44.6%, smanjenjem hipertrofije desnog srca za 39.6% i smanjenjem težine pluća za 19.0%. Iako tretman sa ActRIIA-mFc nije pokazao poboljšanje telesne težine, imao je značajne efekte u lečenju drugih komplikacija PAH. Na primer, tretman sa ActRIIA-Fc rezultirao je smanjenjem povišenog PAP za 68%, smanjenjem hipertrofije desnog srca za 47.1% i smanjenjem težine pluća za 18.4%.
[0392] Slični trendovi su primećeni i kod mišićavosti krvnih sudova na osnovu histopatološkog ocenjivanja. Nakon bojenja uzoraka tkiva za detekciju αSMA/elastina, 100 plućnih arteriola po životinji, veličine između 10 µm i 50 µm, kategorisano je kao nemuskularizovano, delimično muskularizovano ili potpuno muskularizovano. Utvrđeno je da je, kod pacova tretiranih vehikulumom, 62.3% plućnih arteriola potpuno muskularizovano, 36.4% delimično muskularizovano i 1.4% nemuskularizovano. Tretman sildenafilom imao je samo umereni efekat na smanjenje mišićavosti krvnih sudova (npr. 57.9% plućnih arteriola je potpuno muskularizovano, 41.6% delimično muskularizovano i 0.9% nemuskularizovano). Suprotno tome, tretman sa ActRIIA-mFc rezultirao je značajnim smanjenjem mišićavosti krvnih sudova u poređenju sa životinjama tretiranim sildenafilom (npr. potpuno je muskularizovano 25.8% plućnih arteriola, delimično muskularizovano 66.9% i 7.3% nemuskularizovano, u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom). Histopatološko bodovanje hipertrofije glatkih mišića plućnih arteriola takođe je zabeleženo na sledeći način: 0 (normalno), 1 (minimalno), 2 (blago), 3 (umereno) ili 4 (značajno). Pacovi tretirani vehikulumom imali su prosečnu hipertrofiju glatkih mišića ocenjenu kao umerenu do izraženu (ocena 3.8). Opet, primećeno je da tretman sildenafilom ima umeren efekat na hipertrofiju sa prosečnom ocenom 3 (umereno). U isto vreme, primećeno je da su životinje tretirane sa ActRIIA-mFc imale značajno smanjenje hipertrofije glatkih mišića (prosečna ocena 1.6) u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom i sildenafilom. Ukupno uzevši, tretman sa ActRIIA-mFc značajno je smanjio mišićavost krvnih sudova i hipertrofiju u ovom modelu PAH.
[0393] Ovi podaci zajedno pokazuju da su i ActRIIA-mFc i ALK4-Fc:ActRIIB-Fc efikasni u ublažavanju različitih komplikacija PAH u ovom modelu izazvanom monokrotalinom. Konkretno, i ActRIIA-mFc i ALK4-Fc:ActRIIB-Fc imali su veći efekat na smanjenje arterijskog pritiska, hipertrofiju desnog srca i vaskularnu muskularizaciju nego što je primećeno za
1
sildenafil, koji je odobreni lek za lečenje PAH. Dalje, podaci ukazuju da drugi antagonisti GDF/BMP, posebno oni koji imaju aktivnosti slične ActRIIA-mFc i ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, mogu da budu korisni u lečenju PAH, posebno u prevenciji ili smanjenju težine različitih komplikacija PAH.
Primer 15: Efekti polipeptida ActRII i heterodimera ALK4:ActRIIB na plućnu hipertenziju u modelu pacova Sugen hipoksije
[0394] Efekti fuzionog proteina ActRIIA-mFc (homodimer ActRIIA-mFc kako je opisano u primeru 1 i sildenafil (inhibitor fosfodiesteraze-5 odobren za lečenje PAH) su dalje ispitivani u PAH modelu Sugen hipoksije. U ovom modelu pacovi dobijaju dnevne doze semaksaniba i stavljaju se u okruženje sa niskim sadržajem kiseonika (približno 13% kiseonika) da bi se indukovao PAH 24 sata pre početka terapije.
[0395] Pacovi su razdvojeni u različite tretmanske grupe (10 miševa u grupi): 1) tretman semaksanibom (200 mg/kg primenjeno s.c. kao jedna doza dnevno)/hipoksija i Tris-puferisanim fiziološkim rastvorom (primenjivan i.p. kao 1 ml/kg, na svaka tri dana) (tretmanska grupa sa vehikulumom), 2) tretman polipeptidom ActRIIA-mFc (10 mg/kg primenjeno i.p. na svaka tri dana) i semaksanibom (200 mg/kg primenjeno s.c. kao jedna doza dnevno)/hipoksija, 3) tretman sildenafilom (30 mg/kg primenjeno oralno dva puta dnevno) i semaksanibom (200 mg/kg primenjeno s.c. kao jedna doza dnevno)/hipoksija, i 4) kontrolni pacovi (Tris-puferisani fiziološki rastvor primenjen i.p. kao 1 ml/kg, na svaka tri dana). Pacovi su tretirani 28 dana. Telesne težine su beležene pre prve doze 1. dana, a zatim nedeljno tokom studije.
[0396] 28. dana pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina/ksilazina (80/10 mg/kg). Na vratu je napravljen rez, a jugularna vena je izolovana i anteriorno podvezana. Kateter za merenje pritiska ispunjen tečnošću uveden je u desnu jugularnu venu za merenje plućnog arterijskog pritiska (PAP). Napravljen je još jedan rez u regionu prepona, i femoralna arterija je izolovana i anteriorno podvezana. Kateter za merenje pritiska Millar uveden je u femoralnu arteriju za merenje sistolnog arterijskog pritiska, dijastolnog pritiska i srčane frekvencije. Srednji arterijski pritisak i desni PAP praćeni su pomoću Notocord HEM (Croissy sur Seine, Frnace) v3.5 sistema za prikupljanje podataka približno 5-10 minuta dok nisu dobijena stabilna merenja. Tokom merenja, pacovi su održavani na približno 37 °C na grejnom jastučiću i tokom postupka praćena je telesna temperatura sondom za rektalnu temperaturu. Po završetku postupka, pacovi su eutanazirani, a srca i pluća uklonjena. Celo srce je odmereno. Zatim su uklonjene pretkomore i odvojena leva komora sa septumom (LV S) od desne komore (RV). Komore su odmerene
1
odvojeno. Hipertrofija je delimično procenjena izračunavanjem RV/LV S. Pluća su takođe odmerena.
[0397] U poređenju sa kontrolnim životinjama, primećeno je da pacovi tretirani semaksanibom/hipoksijom (tretmanska grupa sa vehikulumom) imaju smanjenu telesnu težinu, povišen PAP, hipertrofiju desnog srca i povećanu težinu pluća, što ukazuje na uspostavljanje PAH. Tretman sildenafilom smanjio je srednji plućni arterijski pritisak za 22.4% i smanjio hipertrofiju desnog srca za 10% u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom. Opet je utvrđeno da je tretman sa ActRIIA-mFc imao značajno veće efekte u lečenju PAH u ovom modelu u poređenju sa sildenafilom. Na primer, tretman sa ActRIIA-mFc rezultirao je smanjenjem srednjeg plućnog arterijskog pritiska za 51.3% i smanjenjem hipertrofije desnog srca za 53.5% u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom.
[0398] Slični trendovi su primećeni i kod mišićavosti krvnih sudova na osnovu histopatološkog ocenjivanja. Nakon bojenja uzoraka tkiva za detekciju αSMA/elastina, 100 plućnih arteriola po životinji, veličine između 10 µm i 50 µm, kategorisano je kao nemuskularizovano, delimično muskularizovano ili potpuno muskularizovano. Utvrđeno je da je, kod pacova tretiranih vehikulumom 72.5% plućnih arteriola potpuno muskularizovano, 27.4% delimično muskularizovano i 0.1% nemuskularizovano. Tretman sildenafilom imao je samo umereni efekat na smanjenje mišićavosti krvnih sudova (npr. 67.4% plućnih arteriola je potpuno muskularizovano, 31.6% delimično muskularizovano i 1.0% nemuskularizovano), u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom. Nasuprot tome, tretman sa ActRIIA-mFc rezultirao je značajnim smanjenjem mišićavosti krvnih sudova u poređenju sa životinjama tretiranim sildenafilom (npr. 29.3% plućnih arteriola je potpuno muskularizovano, 69,3% delimično muskularizovano i 1.4% nemuskularizovano, u poređenju sa životinjama tretiranim vehikulumom). Histopatološko ocenjivanje hipertrofije glatkih mišića plućnih arteriola takođe je zabeleženo na sledeći način: 0 (normalno), 1 (minimalno), 2 (blago), 3 (umereno) ili 4 (značajno). Pacovi tretirani vehikulumom imali su prosečnu hipertrofiju glatkih mišića ocenjenu kao umerenu do izraženu (ocena 3.6). Opet, primećeno je da tretman sildenafilom ima umeren efekat na hipertrofiju sa prosečnom ocenom 3 (umereno). Istovremeno je primećeno da su životinje tretirane sa ActRIIA-mFc imale značajno smanjenje hipertrofije glatkih mišića (prosečna ocena 1.4) u poređenju sa životinjama tretiranim sildenafilom. Ukupno uzevši, tretman sa ActRIIA-mFc značajno je smanjio mišićavost krvnih sudova i hipertrofiju u ovom PAH modelu.
1
[0399] Ovi podaci zajedno pokazuju da je ActRIIA-mFc efikasan u ublažavanju različitih komplikacija PAH u modelu Sugen hipoksije. Konkretno, ActRIIA-mFc je imao veći efekat na smanjenje arterijskog pritiska, hipertrofiju desnog srca i muskularizaciju sudova nego što je primećeno za sildenafil, koji je odobreni lek za lečenje PAH. Dalje, podaci ukazuju da i drugi antagonisti GDF/BMP, naročito oni koji imaju aktivnosti slične ActRIIA-mFc mogu da budu korisni u lečenju PAH, posebno u prevenciji ili smanjenju težine različitih komplikacija PAH.
1

Claims (24)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija za upotrebu u lečenju plućne arterijske hipertenzije, naznačena time, što kompozicija sadrži polipeptid ActRIIA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32.
2. Kompozicija za upotrebu u lečenju plućne arterijske hipertenzije, naznačena time, što kompozicija sadrži polipeptid ActRIIA koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39.
3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time, što pacijent ima plućni arterijski pritisak (PAP) u mirovanju od najmanje 25 mm Hg.
4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time, što lečenje snižava PAP kod pacijenta; smanjuje hipertrofiju komora kod pacijenta; smanjuje hipertrofiju glatkih mišića kod pacijenta; smanjuje mišićavost plućnih arteriola kod pacijenta; smanjuje plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta; snižava plućnu vaskularnu rezistenciju kod pacijenta; povećava plućni kapilarni okluzivni pritisak; povećava pritisak na kraju dijastole u levoj komori; povećava kapacitet vežbanja pacijenta; povećava razdaljinu koju pacijent može da pređe za 6 minuta hoda; i/ili snižava Borgov indeks dispneje (BDI) kod pacijenta.
5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačena time, što pacijent ima plućnu hipertenziju funkcionalne klase II ili klase III, kao što je prepoznato od strane Svetske zdravstvene organizacije.
6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što lečenje sprečava ili odlaže progresiju funkcionalne klase plućne hipertenzije.
7. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5 ili 6, naznačena time, što lečenje podstiče ili povećava regresiju funkcionalne klase plućne hipertenzije.
8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32.
9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32.
10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32.
11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-10, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQIDNO: 32.
12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-11, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32.
13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-12, naznačena time, što se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 32.
14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 39.
15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili 14, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQIDNO: 39.
16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, 14, ili 15, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQIDNO: 39.
17. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2-7 ili 14-16, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQIDNO: 39.
1
18. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2-7 ili 14-17, naznačena time, što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39.
19. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 2-7 ili 14-18, naznačena time, što se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39.
20. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19, naznačena time, što je polipeptid deo homodimernog proteinskog kompleksa.
21. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-20, naznačena time, što lečenje dalje obuhvata primenu jednog ili više sredstava odabranih iz grupe koja se sastoji od: vazodilatatora, inhibitora fosfodiesteraze tipa 5, stimulatora rastvorljive guanilat ciklaze, agonista receptora za prostaciklin i antagonista receptora za endotelin.
22. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-21, naznačena time, što je pacijent lečen primenom jednog ili više vazodilatatora.
23. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21 ili 22, naznačena time, što je jedan ili više vazodilatatora odabran iz grupe koja se sastoji od: bosentana, sildenafila, beraprosta, macitentana, seleksipaga, epoprostenola, treprostinila, iloprosta, ambrisentana i tadalafila.
24. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-23, naznačena time, što se polipeptid ActRIIA vezuje za jedan ili više liganda odabranih iz grupe koja se sastoji od: aktivina A, aktivina B i GDF11.
1 1
RS20210774A 2016-07-15 2017-07-14 Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije RS62011B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662362955P 2016-07-15 2016-07-15
US201762453888P 2017-02-02 2017-02-02
US201762510403P 2017-05-24 2017-05-24
EP17828540.9A EP3496739B1 (en) 2016-07-15 2017-07-14 Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
PCT/US2017/042157 WO2018013936A1 (en) 2016-07-15 2017-07-14 Compositions and methods for treating pulmonary hypertension

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62011B1 true RS62011B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=60953378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210774A RS62011B1 (sr) 2016-07-15 2017-07-14 Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije

Country Status (26)

Country Link
US (12) US10722558B2 (sr)
EP (2) EP3928784A1 (sr)
JP (3) JP7220141B2 (sr)
KR (1) KR102512157B1 (sr)
CN (2) CN109689085A (sr)
AU (2) AU2017296040C1 (sr)
CA (1) CA3030859C (sr)
CY (1) CY1124277T1 (sr)
DK (1) DK3496739T3 (sr)
ES (1) ES2875905T3 (sr)
FI (1) FIC20250004I1 (sr)
FR (1) FR25C1005I2 (sr)
HR (1) HRP20210694T1 (sr)
HU (2) HUE054228T2 (sr)
LT (2) LT3496739T (sr)
MD (1) MD3496739T2 (sr)
MX (2) MX378869B (sr)
NL (1) NL301313I2 (sr)
NO (1) NO2025008I1 (sr)
PL (1) PL3496739T3 (sr)
PT (1) PT3496739T (sr)
RS (1) RS62011B1 (sr)
RU (1) RU2748278C2 (sr)
SI (1) SI3496739T1 (sr)
SM (1) SMT202100345T1 (sr)
WO (1) WO2018013936A1 (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201412290D0 (en) * 2014-07-10 2014-08-27 Cambridge Entpr Ltd Novel use
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
TWI773117B (zh) 2014-12-03 2022-08-01 美商西建公司 活化素-actrii拮抗劑及治療貧血之用途
HK1252174A1 (zh) 2015-05-20 2019-05-17 细胞基因公司 使用II型活化素受体配体阱的用於β-地中海贫血的体外细胞培养方法
RS62011B1 (sr) 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
HRP20240974T1 (hr) 2016-07-27 2024-10-25 Acceleron Pharma Inc. Pripravci za uporabu u liječenju mijelofibroze
JP7139326B2 (ja) 2016-11-10 2022-09-20 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンＩＩａ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
US11484573B2 (en) 2017-11-09 2022-11-01 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIa variants and methods of use thereof
US10407396B2 (en) * 2017-11-16 2019-09-10 Apotex Inc. Crystalline form of selexipag
IL275936B2 (en) 2018-01-12 2025-09-01 Keros Therapeutics Inc Activin receptor type iib variants and methods of using them
EP3790572A4 (en) * 2018-05-09 2022-03-16 Keros Therapeutics, Inc. ACTIVIN RECEPTOR TYPE IIA VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4081240A4 (en) * 2019-12-03 2023-12-06 Acceleron Pharma Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF PULMONARY HYPERTENSION
US20230190875A1 (en) * 2019-12-10 2023-06-22 Acceleron Pharma Inc. Single-arm actriia and actriib heteromultimers and methods for treating pulmonary hypertension
EP4100430A4 (en) * 2020-02-03 2024-04-03 Acceleron Pharma Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PULMONARY HYPERTENSION
EP4121088A4 (en) 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
CA3176735A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type ii chimeras and methods of use thereof
CA3176701A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-04 Gang Li Actrii proteins and use in treating post-capillary pulmonary hypertension
MX2022016243A (es) * 2020-06-17 2023-03-08 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de actrii-alk4 y métodos para el tratamiento contra insuficiencia cardíaca.
PE20230783A1 (es) * 2020-06-23 2023-05-11 Acceleron Pharma Inc Proteinas actrii para el tratamiento de la hipertension pulmonar
US12186370B1 (en) 2020-11-05 2025-01-07 Celgene Corporation ACTRIIB ligand trap compositions and uses thereof
WO2022150590A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
BR112023018256A2 (pt) * 2021-03-10 2023-10-31 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de actrii-alk4 e métodos para tratar insuficiência cardíaca
EP4305052A4 (en) * 2021-03-10 2025-01-01 Acceleron Pharma Inc. ACTRII-ALK4 ANTAGONISTS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
US20240174733A1 (en) * 2021-03-10 2024-05-30 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
IL309100A (en) * 2021-06-11 2024-02-01 Acceleron Pharma Inc Actrii proteins and uses thereof
EP4351723A4 (en) * 2021-06-11 2025-04-16 Acceleron Pharma, Inc. ACTRII PROTEINS AND THEIR USES
EP4358991A4 (en) * 2021-06-21 2025-05-14 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
US20240327494A1 (en) * 2021-07-19 2024-10-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and uses thereof
WO2023108137A1 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Biogen Ma Inc. Modified actriib proteins and methods of use thereof
CN114409721B (zh) * 2022-01-24 2023-07-18 大连理工大学 一类含有亲电弹头的五环三萜衍生物、其制备方法和应用
US20260042816A1 (en) * 2022-08-10 2026-02-12 Gb002, Inc. Tyrosine kinase inhibitor and activin type 2 receptor antagonist combination therapy for treating pulmonary arterial hypertension (pah)
WO2025061752A1 (en) 2023-09-19 2025-03-27 Roche Diagnostics Gmbh Circulating bmp10 (bone morphogenic protein 10) in the assessment of congestion and pulmonary hypertension

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
DK0533838T3 (da) 1990-06-11 1998-02-23 Nexstar Pharmaceuticals Inc Nukleinsyreligander
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
CA2149441C (en) 1992-11-17 2004-03-02 Kohei Miyazono Activin receptor-like kinases, proteins having serine threonine kinase domains and their use
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0830459B1 (en) 1995-04-11 2007-01-24 The General Hospital Corporation Reverse two-hybrid systems
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6699843B2 (en) 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US6011577A (en) 1997-06-30 2000-01-04 Polaroid Corporation Modular optical print head assembly
US6372454B2 (en) 1997-08-29 2002-04-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding Follistatin-3
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
JP2002519450A (ja) 1998-06-30 2002-07-02 ザ ダウ ケミカル カンパニー 改良されたシンジオタクチックモノビニリデン芳香族重合方法
WO2000039585A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1147413B1 (en) 1999-01-21 2006-04-05 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
DE60042021D1 (de) 1999-07-29 2009-05-28 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2005025601A1 (en) 2003-09-15 2005-03-24 Monash University Follistatin isoforms and uses thereof
EP1677816B1 (en) 2003-10-06 2014-03-12 Paranta Biosciences Limited Follistatin for use in down-regulation an inflammatory response
EP1729793B1 (en) 2004-03-02 2015-07-22 Acceleron Pharma Inc. Alk7 and myostatin inhibitors for muscle wasting disorders
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
KR20070004123A (ko) 2004-04-23 2007-01-05 셀진 코포레이션 폐 고혈압증의 치료 및 관리를 위한 탈리도미드의 사용방법 및 그를 포함하는 조성물
AU2012244215B2 (en) * 2004-07-23 2014-11-27 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
ES2551852T3 (es) 2004-07-23 2015-11-24 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ActRII
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
EP1924697A2 (en) * 2005-06-29 2008-05-28 Cameron Clokie Production of bone morphogenic proteins (bmps) in transgenic mammals
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
WO2007059359A2 (en) 2005-11-21 2007-05-24 Biogen Idec Ma Inc. Substituted pyrazalones
KR20160137665A (ko) 2005-11-23 2016-11-30 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
CA2671983A1 (en) 2006-12-08 2009-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
SI2101777T1 (sl) 2006-12-12 2015-08-31 Gilead Sciences, Inc. Sestavek za zdravljenje pljučne hipertenzije
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
ES2396734T3 (es) 2006-12-18 2013-02-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonistas de ACTIVINA-ACTRII y sus usos para tratar la anemia
JP5237970B2 (ja) 2007-02-01 2013-07-17 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
JP5574711B2 (ja) * 2007-02-09 2014-08-20 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 癌患者における骨成長を促進するためのアクチビン−ａｃｔｒｉｉａアンタゴニストおよびその使用
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA2685306A1 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
KR20200079567A (ko) 2008-05-02 2020-07-03 악셀레론 파마 인코포레이티드 혈관신생 및 혈관주위세포 적용범위의 조정을 위한 ａｌｋ１ 길항제 기재의 방법 및 조성물
EP3363453A1 (en) 2008-06-26 2018-08-22 Acceleron Pharma Inc. Soluble actriia as activin-actriia antagonist for use in treating anemia or bone-related disorders
SI3750552T1 (sl) 2008-08-14 2023-10-30 Acceleron Pharma Inc. GDF pasti
WO2010062640A1 (en) 2008-10-28 2010-06-03 Gilead Colorado, Inc. Methods for treating idiopathic pulmonary fibrosis and associated complications
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
ES2575695T3 (es) 2009-03-30 2016-06-30 Acceleron Pharma Inc. Antagonistas de BMP-ALK3 y sus usos para estimular el crecimiento óseo
WO2010151426A1 (en) 2009-06-12 2010-12-29 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CN105561295B (zh) 2009-08-13 2020-03-20 阿塞勒隆制药公司 Gdf捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加红细胞水平
AU2010296018B2 (en) 2009-09-16 2016-05-05 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
US9121007B2 (en) 2010-01-26 2015-09-01 Anthrogenesis Corporatin Treatment of bone-related cancers using placental stem cells
KR101508047B1 (ko) 2010-03-15 2015-04-06 유나이티드 세러퓨틱스 코오포레이션 폐고혈압의 치료
JP5806320B2 (ja) * 2010-10-15 2015-11-10 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
CN103492562B (zh) * 2011-02-03 2017-04-05 佐马技术有限公司 用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料
BR112014009949A8 (pt) 2011-10-28 2018-01-16 Paranta Biosciences Ltd métodos de tratamento de hipersecreção de muco e uso de agentes
GR1007832B (el) * 2011-11-21 2013-02-14 Ιδρυμα Ιατροβιολογικων Ερευνων Ακαδημιας Αθηνων, Αδρανοποιητες της ακτιβινης και χρηση τους για την θεραπεια ασθενειων που σχετιζονται με παρεκκλινουσα ενεργοποιηση της "αμυντικης αποκρισης του ξενιστη"
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
WO2014025958A2 (en) 2012-08-09 2014-02-13 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
AU2013326867B2 (en) 2012-10-05 2018-03-08 Rigel Pharmaceuticals, Inc. GDF-8 inhibitors
CN104981250A (zh) 2012-10-24 2015-10-14 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
NZ707477A (en) * 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
US10562974B2 (en) 2013-03-13 2020-02-18 University Of Kentucky Research Foundation Methods of administering IgG1 antibodies and methods of suppressing angiogenesis
US9481725B2 (en) 2013-03-14 2016-11-01 Alderbio Holdings, Llc Antibodies to HGF and compositions containing
TWI655207B (zh) 2013-07-30 2019-04-01 再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
WO2015037000A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Compugen Ltd Vstm5 polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of cancer, infectious diseases and immune related diseases
AU2014352843B2 (en) 2013-11-21 2020-03-05 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
WO2015161220A1 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
MA40008A (fr) 2014-06-13 2021-05-05 Acceleron Pharma Inc Antagoniste actrii pour le traitement et la prevention d'un ulcere cutane chez un sujet ayant l'anemie
WO2016019368A1 (en) 2014-08-01 2016-02-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to treatment of pulmonary arterial hypertension
JP6810702B2 (ja) 2015-04-06 2021-01-06 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
MA41919A (fr) * 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
US10227392B2 (en) 2015-04-06 2019-03-12 Acceleron Pharma Inc. ALK7:ActRIIB heteromultimers and uses thereof
CA2983440C (en) 2015-04-22 2024-03-12 Alivegen Usa Inc. Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
TN2017000468A1 (en) 2015-05-13 2019-04-12 Acceleron Pharma Inc TREATMENT OF BETA-THALASSEMIA USING ACTRIl LIGAND TRAPS.
WO2017015622A2 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Scholar Rock, Inc Gdf11 binding proteins and uses thereof
WO2018009732A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-activin a antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension
RS62011B1 (sr) * 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
EP4241848A3 (en) 2017-05-04 2023-11-01 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta receptor type ii fusion proteins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021000276A (es) 2021-03-31
US20210023174A1 (en) 2021-01-28
AU2017296040B2 (en) 2022-12-22
US11622992B2 (en) 2023-04-11
US11497794B2 (en) 2022-11-15
EP3496739A4 (en) 2020-04-01
US10722558B2 (en) 2020-07-28
US10946067B2 (en) 2021-03-16
WO2018013936A1 (en) 2018-01-18
US20250249071A1 (en) 2025-08-07
NL301313I2 (nl) 2025-04-09
HRP20210694T1 (hr) 2021-09-17
MX378869B (es) 2025-03-10
US20200405814A1 (en) 2020-12-31
DK3496739T3 (da) 2021-05-10
NO2025008I1 (no) 2025-01-21
AU2022283782B2 (en) 2026-02-12
LT3496739T (lt) 2021-05-25
MD3496739T2 (ro) 2021-09-30
US10973880B2 (en) 2021-04-13
RU2748278C2 (ru) 2021-05-21
JP2022107775A (ja) 2022-07-22
CN109689085A (zh) 2019-04-26
AU2017296040C1 (en) 2023-06-22
US11318188B2 (en) 2022-05-03
US20250241988A1 (en) 2025-07-31
AU2022283782A1 (en) 2023-02-02
US20200390860A1 (en) 2020-12-17
KR102512157B1 (ko) 2023-03-21
US20210299216A1 (en) 2021-09-30
US20200397865A1 (en) 2020-12-24
MX2019000618A (es) 2019-11-28
US11065303B2 (en) 2021-07-20
HUE054228T2 (hu) 2021-08-30
RU2021114098A (ru) 2021-12-14
US20230233648A1 (en) 2023-07-27
US10695405B2 (en) 2020-06-30
JP7220141B2 (ja) 2023-02-09
US12343378B2 (en) 2025-07-01
JP2024009166A (ja) 2024-01-19
CA3030859A1 (en) 2018-01-18
CY1124277T1 (el) 2022-07-22
FR25C1005I1 (fr) 2025-04-04
US20210299220A1 (en) 2021-09-30
EP3928784A1 (en) 2021-12-29
KR20190039716A (ko) 2019-04-15
US11219666B2 (en) 2022-01-11
US20200384080A1 (en) 2020-12-10
RU2019104084A (ru) 2020-08-18
AU2017296040A1 (en) 2019-01-31
RU2019104084A3 (sr) 2020-09-24
PT3496739T (pt) 2021-06-21
FR25C1005I2 (fr) 2026-02-06
US20180050089A1 (en) 2018-02-22
SMT202100345T1 (it) 2021-07-12
PL3496739T3 (pl) 2021-10-11
EP3496739B1 (en) 2021-04-28
LTPA2025508I1 (sr) 2025-02-25
JP2019521144A (ja) 2019-07-25
BR112019000790A2 (pt) 2019-07-02
JP7391139B2 (ja) 2023-12-04
EP3496739A1 (en) 2019-06-19
CN116531490A (zh) 2023-08-04
HUS2500007I1 (hu) 2025-02-28
CA3030859C (en) 2024-04-23
SI3496739T1 (sl) 2021-06-30
US20180221447A1 (en) 2018-08-09
FIC20250004I1 (fi) 2025-01-17
ES2875905T3 (es) 2021-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7391139B2 (ja) 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
JP7246618B2 (ja) ＡＬＫ７：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JP7154250B2 (ja) アクチビンｂおよび／またはｇｄｆ１１の阻害によって赤血球レベルを増大させ、無効赤血球生成を処置する方法
CN110198743B (zh) 用于治疗肾脏疾病的组合物和方法
EP3280726B1 (en) Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
EP3131931B1 (en) Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
HK40066390A (en) Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
JP2026026172A (ja) 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
HK40007913B (en) Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
HK40007913A (en) Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
HK40007840A (en) Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
HK1248735B (en) Alk7:actriib heteromultimers and uses thereof
HK1248734B (en) Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
HK40008525A (en) Methods and compositions for treating myelofibrosis
HK1234417B (en) Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease