[go: up one dir, main page]

RS61846B1 - Sredstva za upotrebu u lečenju glioma - Google Patents

Sredstva za upotrebu u lečenju glioma

Info

Publication number
RS61846B1
RS61846B1 RS20210578A RSP20210578A RS61846B1 RS 61846 B1 RS61846 B1 RS 61846B1 RS 20210578 A RS20210578 A RS 20210578A RS P20210578 A RSP20210578 A RS P20210578A RS 61846 B1 RS61846 B1 RS 61846B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
tumor
cell
ttyh1
expression
Prior art date
Application number
RS20210578A
Other languages
English (en)
Inventor
Matthias Osswald
Wolfgang Wick
Frank Winkler
Erik Jung
Jonas Blaes
Original Assignee
Dc Europa Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dc Europa Ltd filed Critical Dc Europa Ltd
Publication of RS61846B1 publication Critical patent/RS61846B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A61K31/515—Barbituric acids; Derivatives thereof, e.g. sodium pentobarbital
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na sredstva za upotrebu u lečenju glioma, naročito astrocitoma WHO II° i III°, kao i IV° (glioblastoma), kod pacijenta.
Gliomi, kao što su astrocitski tumori mozga, uključujući glioblastome, su neizlečive neoplazme koje se karakterišu difuzno infiltrativnim rastom. Astrocitomi (WHO II°, III°, IV° = glioblastomi) su prototipni primeri visoko invazivnih tumora koji difuzno kolonizuju organ u kojem se nalaze, što na kraju dovodi do neurološke disfunkcije i smrti, uprkos intenzivnoj radio- i hemioterapiji. Ćelijski i(li) molekularni mehanizmi invazivnosti i otpornosti na terapiju nisu dovoljno dobro razjašnjeni. Klasična terapija astrocitoma, uključujući glioblastome, obuhvata hiruršku resekciju čvrstog dela tumora, radioterapiju i hemoterapiju. Međutim, ove terapije za sada mogu samo da odlože napredovanje bolesti. Ne postoje poznati slučajevi u kojima je došlo do izlečenja astrocitoma ili glioblastoma.
Oligodendrogliomi se takođe odlikuju infiltrativnim obrascem rasta unutar mozga, ali su daleko osetljiviji na terapeutske intervencije od astrocitoma. Prisustvo njihove karakteristične 1p/19q kodelecije dovodi se u vezu sa visokom stopom odgovora na kombinaciju radio- i hemioterapije kod oligodendroglioma, a donosi im i sklonost ka apoptozi čak i u odsustvu terapije. Razlog je za sada nejasan, kao što je nejasan i specifični mehanizam(mi) rezistencije kod astrocitoma.
WO2009/096615A1 opisuje preparat koji sadrži kofein kao aktivni sastojak, za prevenciju i(li) lečenje tumora mozga. Eyler et al. (2011; Cell 146: 53-56) opisuju promociju proliferacije matičnih ćelija glioma i rasta tumora posredstvom sintaze-2 azot monoksida. WO03/015713A2 opisuje postupak za lečenje glijalnih tumora, koji se sastoji od primene glutamatnog antagonista ili antagonista NMDA receptora. Xie et al. (2009; Cancer Letters 282: 35-42) opisuju inhibiciju proliferacije i migracije malignih glijalnih ćelija anestetikom pentobarbitalom. Zhang et al. (2011; Cancer Research 71: 7155-7167) opisuju kako blokada TGF-β signalizacije pomoću inhibitora TGF R-I kinaze pojačava odgovor na zračenje i produžava preživljavanje u slučaju glioblastoma. WO2015/017034A1 opisuje postupke za lečenje kancera zasnovane na ciljanom ometanju interakcije između alfa koneksina-43 i ZO-I (zonula occludens-I). Jacobs et al. (2012; Neuro-Oncology 14: 119-131) opisuju smanjenje rasta tumora u životinjskom modelu glioblastoma multiforme pomoću propentofilina.
Shodno tome, tehnički problem koji se nalazi u osnovi predmetnog pronalaska je obezbeđenje novih sredstava za upotrebu u lečenju glioma, naročito astrocitoma i glioblastoma, kod pacijenta.
Rešenje navedenog tehničkog problema postiže se rešenjima koja su opisana patentnim zahtevima.
Konkretnije, u prvom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na sredstvo za upotrebu u lečenju glioma kod pacijenta, gde je navedeno sredstvo u stanju da ometa (a) invaziju i(li) (b) proliferaciju i(li) (c) međućelijsku komunikaciju i(li) (d) rezistenciju na radioterapiju i(li) hemioterapiju ćelija glioma u kojoj posreduju tumorske mikrocevčice (TM), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od: (a1) sredstva koje je u stanju da posreduje u RNK ometanju (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije gena za protein vezan za rast 43 (growthassociated protein 43, GAP43), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (eng. small hairpin RNA, shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka jednoj od nukleokiselinskih sekvenca datih kao Sek. sa ID br.: 1 do 5;
(a2) sredstva koje je u stanju da posreduje u ometanju RNK (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije gena za protein vezan za rast 43 (GAP43), gde je dato sredstvo DNK antisens oligonukleotid (asDNK) koji sadrži jednu od nukleokiselinskih sekvenci datih kao Sek. sa ID br.: 6 do 8, ili je asRNA koja sadrži jednu od nukleokiselinskih sekvenci datih kao Sekv. sa ID br.: 9 do 11;
(b) jedinjenje koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost GAP43 proteina, gde navedeno jedinjenje jeste antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za GAP43 protein;
(c) sredstvo koje je u stanju da posreduje pri RNAi za specifično smanjenje ekspresije gena za humani homolog tviti proteina 1 (human tweety homologue 1, Ttyh1), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka jednoj od nukleokiselinskih sekvenci datih kao Sek. sa ID br.: 12 do 16;
(d) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost TTYH-1 proteina, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za TTYH-1 protein;
(e) sredstvo koje je u stanju da posreduje u RNK ometanju (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije gena za koneksin 43 (Cx43), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka nukleokiselinskoj sekvenci datoj kao Sek. sa ID br.: 21;
(f) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost koneksina 43 (Cx43), gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje i(li) funkcionalno blokira Cx43; i
(f2) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost koneksina 43 (Cx43), gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od peptida koji blokira pukotinaste međućelijske veze (eng. gap junctions) Gap 26 (Sekv. sa ID br.: 17); peptida koji blokira pukotinaste međućelijske veze Gap 27 (Sekv. sa ID br.: 18); gliciretinske kiseline i njenih derivata; kvinina i njegovih derivata; anandamida; oktanola; heptanola; antranilne kiseline i njenih derivata; fenaminske kiseline i njenih derivata; anestetika; retinske kiseline; i tonabersata.
Predmetni pronalazak se zasniva na otkriću da mnoge tumorske ćelije u gliomima, naročito u astrocitomima i glioblastomima, izgrađuju veoma dugačke membranske nastavke, kako u mozgu živih miševa, tako i u uzorcima uzetim od pacijenata. Ovi nastavci, za koje se predlaže naziv tumorske mikrocevčice (eng. tumor microtubes, TM) imaju veoma karakteristične anatomske i funkcionalne odlike. Ćelije astrocitoma koriste TM kao puteve za invaziju mozga, proliferaciju, kao i za povezivanje sa drugim infiltriranim ćelijama na velikim rastojanjima. Dobijena ćelijska mreža, povezana preko CM, omogućava međućelijsku razmenu molekula preko pukotinastih međućelijskih veza preko koneksina 43 (Cx43 gap junctions), uključujući i komunikaciju preko intercelularnih kalcijumskih talasa (ICW). TM se koriste za detekciju ozleda ćelija koje čine mrežu, kao i da se pokrene popravka oštećenja. Dalje, ćelije astrocitoma povezane preko TM, ali ne i one koje tokom progresije tumora ostanu nepovezane, zaštićene su od ćelijske smrti koja nastaje usled radioterapije. Zadržavanje hromozoma 1p i 19q neophodno je za formiranje međućelijskih TM, kao i za visoku ekspresiju neuronalnih proteina koji se dovode u vezu sa rastom GAP42 i Ttyh1. Smanjenje ekspresije (eng. knockdown) GAP43 dovodilo je do inhibicije nastanka TM i međusobnog povezivanja ćelija preko TM, što je dovodilo do značajno smanjene progresije astrocitoma i smanjene rezistencije na terapiju zračenjem. Smanjenje ekspresije Ttyh1 je dramatično inhibiralo rast i invaziju astrocitoma pod uticajem TM, pri čemu su tumori bili onemogućeni da porastu do značajnih dimenzija u mozgu. Ukratko, ćelije astrocitoma koje vrše invaziju povezuju se preko TM u jednu funkcionalnu ćelijsku mrežu. Raskidanje veza između tumorskih ćelija usmeravanjem dejstva na TM pojavljuje se kao nova paradigma u smanjenju rezistencije na tretman, po kojoj je ova bolest čuvena.
Gliom koji se leči može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od tumora mozga bogatih TM, naročito rekurentnog oligodendroglioma, i primarnog i rekuretnong astrocitoma WHO II° i WHO III°, kao i glioblastoma (= WHO IV°). Dalje, poželjno je da pacijent koji se leči bude čovek.
Prema prvom rešenju predmetnog pronalaska, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste sredstvo koje je u stanju da posreduje u RNK interferenciji (RNAi) specifičnog smanjenja ekspresije gena za protein koji se dovodi u vezu sa rastom 43 (GAP43), gde je to sredstvo kao što je prethodno definisano.
GAP43 je identifikovan u predmetnom pronalasku kao važan faktor za razvoj TM i njihovu funkciju. Uopšteno, GAP43 je faktor za razvoj spoljnih veza između nervnih ćelija tokom embrionalnog razvoja, i njegova ekspresija se smanjuje (eng. downregulated) u centralnom nervnom sistemu (CNS) odraslih. Dalje, on je povezan sa ćelijskom homeostazom kalcijuma. Preterana ekspresija GAP43 u neuronima i ćelijama koje nisu neuroni dovodi do nastanka filamentoznih membranskih nastavaka. Dakle, GAP43 je neophodan i dovoljan faktor za nastanak aksona i drugih struktura koje povezuju ćelije preko membranskih cevčica, kao što su TM.
GAP43 je intenzivno eksprimiran u ćelijskim linijama astrocitoma, gde je posebno zastupljen na konusnom vrhu TM cevčica, koji je mesto njihovog rasta. Lentivirusno smanjenje ekspresije GAP43 gena u ćelijama primarnog glioblastoma dovodi do drastičnog smanjenja invazije, proliferacije i rasejanja u kojima posreduju TM cevčice. U in vivo životinjskom modelu, odgovarajući tumori su jedva mogli da budu identifikovani nakon 70 dana od implantacije, dok su se tumori u kontrolnoj grupi proširili kroz čitav mozak, dovodeći do smrtonosnih neuroloških komplikacija svega nekoliko dana nakon toga. Istovremeno, životinje kod kojih je smanjena ekspresija GAP43 gena nisu pokazivale nikakve kliničke deficite. Shodno tome, smanjenje ekspresije GAP43 gena dovelo je do značajno poboljšanog preživljavanja kod miševa, u poređenju sa tumorima u kontrolnoj grupi.
U daljim studijama, GAP43 je identifikovan kao odlučujući faktor za uspostavljanje prethodno opisane funkcionalne ćelijske mreže. Konačno, tumori u kojima je smanjena ekspresija GAP43 gena pokazivali su značajno veću degradaciju tumorskih ćelija izazvanu zračenjem, što je dovodilo do snažne degradacije cele populacije tumorskih ćelija šest nedelja nakon zračenja. Nasuprot tome, tumorske ćelije u kontrolnoj grupi bile su veoma rezistentne na zračenje i počele su ponovo da rastu već nakon šest nedelja posle zračenja.
Tako je GAP43 identifikovan u predmetnom pronalasku kao medijator svih funkcija u kojima posreduju TM, kao što su invazija, rasejanje tumora, međusobno povezivanje, formiranje stabilne mreže i rezistencija na terapiju.
Sredstva koja su u stanju da posreduju u RNK interferenciji (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije proteina koji se dovodi u vezu sa rastom 43 (GAP43) izabrana su iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikro RNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA) i antisens oligonukleotida/antisens RNK (asRNA). Ukratko, siRNA su kratke (obično 20 do 24 bp) dvolančane RNK (dsRNA) sa fosforilovanim 5' krajevima i hidroksilovanim 3' krajevima, sa dva „viseća” nukleotida. Fiziološki, Dicer enzim katalizuje proizvodnju siRNA iz dugačkih dsRNA i shRNA. SiRNA molekuli su ugrađeni u kompleks za utišavanje posredstvom RNK (RISC, eng. RNA-induced silencing complex) i deluju tako što ometaju ekspresiju specifičnih gena sa komplementarnim nukleotidnim sekvencama, dovodeći do razlaganja iRNK nakon transkripcije, što znači da ne dolazi do translacije. ShRNA su RNK molekuli koji grade čvrsto spojenu „ukosnicu“, koje može da hidrolizuje enzim Dicer, čime nastaju siRNA ugrađene u RISC kompleks. MiRNA su RNK konstrukti koji mogu unutarćelijski da se prerade, a na kraju ih takođe hidrolizuje enzim Dicer, dajući siRNA, koje se ugrađuju u RISC. Na kraju, as-oligonukleotidi/asRNA su jednolančani oligonukleotidi/RNK molekuli koji su komplementarni sa lancem informacione RNK (iRNK, eng. mRNA) koja se transkribuje unutar ćelije, i mogu da inhibiraju translaciju komplementarne iRNK tako što se sparuju sa njom i fizički blokiraju translacione strukture.
Postupci za dobijanje i upotrebu siRNA, shRNA, miRNA i as-oligonukleotida/asRNA za smanjenje ekspresije nekog konkretnog ciljanog gena poznati su u struci. Ciljne sekvence za smanjenje ekspresije GAP43 prema predmetnom pronalasku izabrane su iz grupe koja se sastoji od sledećih sekvenci:
CGTGGACACATAACAAGGAAA
(TRCN0000047323-NM_002045.2-212s1 c1; Sekv. sa ID br.: 1);
CTGAAGCTAATAAGAAGGA
(TRCN0000047324-NM_002045.2-275s1c1; Sekv. sa ID br.: 2);
TGTAGATGAAACCAAACCTAA
(TRCN0000047325-NM_002045.2-718s1c1; Sekv. sa ID br.: 3);
CCACTAAAGCTTCCACTGATA
(TRCN0000047326-NM_002045.2-513s1c1; Sekv. sa ID br.: 4); i TCAAACAGTGTGGCTTAAAC
(TRCN0000421227-NM_002045.3-1302s21c1; Sekv. sa ID br.: 5).
U konkretnom rešenju, sredstva koja su u stanju da posreduju u RNK interferenciji (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije GAP43 gena su DNK antisens oligonukleotidi koji sadrže, ili se sastoje od jedne od sekvenci GCACAGCATGATCGTAT (Sekv. sa ID br. 6), TTTGTTCTTCTCATACAG (Sekv. sa ID br.: 7), i ACAGCATCTGTCTTCTC (Sekv. sa ID br.: 8). U srodnom rešenju, navedena sredstva su asRNA koje sadrže ili se sastoje od jedne od sledećih sekvenci GCACAGCAUGAUCGUAU (Sekv. sa ID br.: 9), UUUGUUCUUCUCAUACAG (Sekv. sa ID br.: 10), i ACAGCAUCUGUCUUCUC (Sekv. sa ID br.: 11).
U još jednom rešenju, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku je jedinjenje koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost GAP43 proteina, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za GAP43 protein.
U ovom kontekstu, fragmenti antitela obuhvataju Fab fragmente, F(ab')2fragmente i Fab' fragmente. Mimetici antitela obuhvataju jednolančane varijabilne fragmente (scFv), antitela sa jednim domenom, afitela, antikaline, DARPine, monotela, peptidne aptamere, afiline, afimere i afitine, koji su svi poznati u struci. U ovom kontekstu, izraz „antitelo koje se specifično vezuje za GAP43 protein” se koristi kao sinonim sa izrazom „anti-GAP43 antitelo“.
U daljem rešenju predmetnog pronalaska, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste sredstvo koje je u stanju da posreduje u RNK interferenciji smanjenja ekspresije gena za humani homolog tweety proteina 1 (Ttyh1), gde je to sredstvo kao što je prethodno definisano.
Ttyh1 je identifikovan u predmetnom pronalasku kao važan faktor za razvoj TM i njihovu funkciju. Uopšteno posmatrano, Ttyh1 se specifično eksprimira u mozgu, neophodan je za neuritogenezu i rani razvoj mozga, i (kao i GAP43), njegova ekspresija se utišava u centralnom nervnom sistemu (CNS) odraslih. Dalje, on je povezan sa ćelijskom homeostazom kalcijuma. Takođe je pokazano da se eksprimira u astrocitima, sa povećanom ekspresijom nakon povrede/aktivacije.
Ttyh1 je posebno prisutan duž membrane TM ćelija astrocitoma koje vrše invaziju. Lentivirusno smanjenje ekspresije Ttyh1 gena u ćelijama primarnog glioblastoma dovodi do drastičnog smanjenja invazije, proliferacije i rasejanja u kojima posreduju TM cevčice. U in vivo životinjskom modelu, odgovarajući tumori više nisu mogli da budu identifikovani na MRI snimcima nakon 70 dana od implantacije, dok su se tumori u kontrolnoj grupi proširili kroz čitav mozak gradeći velike lezije koje zauzimaju dosta prostora, dovodeći do smrtonosnih neuroloških komplikacija svega nekoliko dana nakon toga. Istovremeno, životinje kod kojih je smanjena ekspresija Ttyh1 gena nisu pokazivale nikakve kliničke deficite.
Tako je Ttyh1 identifikovan u predmetnom pronalasku kao medijator invazije i rasejanja zavisnih od TM.
Sredstva koja su u stanju da posreduju pri RNK interferenciji (RNAi) prema daljem rešenju predmetnog pronalaska, su definisana iznad u prvom rešenju predmetnog pronalaska. Isto se odnosi i na postupke za dobijanje i upotrebu navedenih sredstava.
Ciljne sekvence za smanjenje ekspresije Ttyh1 gena izabrane su iz sledećih sekvenci, gde su posebno poželjne Sekv. sa ID br.: 12 i 16: TCAGACATCCTGAGCTATTAT (ORF 880-900; Sekv. sa ID br.: 12); CTTGGAGGAGACTCTGAATGT (ORF 1047-1067; Sekv. sa ID br.: 13); CTCCAATCCAGACCCTTATGT (ORF 825-845; Sekv. sa ID br.: 14); ATCGGTTTCTATGGCAACAGT (ORF 319-339; Sekv. sa ID br.: 15); i GCTCTGACCACTAACACTCTT (3’UTR 91-111; Sekv. sa ID br.: 16).
U još jednom rešenju, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku je jedinjenje koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost TTYH-1 proteina, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za TTYH-1 protein. U ovom kontekstu, fragmenti antitela i mimetici antitela su kao što je definisano iznad. Dalje, izraz „antitelo koje se specifično vezuje za TTYH-1 protein” se koristi kao sinonim sa izrazom „anti-TTYH-1 antitelo“.
U različitom rešenju, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste sredstvo koje je u stanju da posreduje u RNK interferenciji (RNAi) specifičnog smanjenja ekspresije gena za koneksin 43 (Cx43), gde je to sredstvo kao što je prethodno definisano. Koneksin 43 (Cx43) je najvažniji protein pukotinaste međućelijske veze (gap junction) za funkcije u kojima posreduju TM. Cx43 pukotinaste međućelijske veze se redovno nalaze na mestima kontakata između TM: one su obavezni kanali, neophodni za funkciju mreže tumorskih ćelija u kojoj posreduju TM u primarnim tumorima mozga, čime direktno promovišu njihovu progresiju i otpornost na terapiju. Specifično, Cx43 pukotinaste međućelijske veze su neophodne za razmenu molekula između tumorskih ćelija, a neophodne su i za međućelijske komunikacije unutar glioma, koje se kreću putem unutarćelijskih kalcijumskih talasa (ICW). Od 22 poznata proteina pukotinastih međućelijskih veza, Cx43 je jedini koji je diferencijalno regulisan u ćelijama sa 1p/19q kodelecijom u odnosu na intaktne humane gliome, što znači da je glavni kandidat za posredovanje u rezistentnosti na tretman. Samim tim, smanjenje ekspresije Cx43 putem shRNA dovodi do smanjenja rasta glioma i produžetka preživljavanja kod miševa koji nose tumor na mozgu. Ciljna sekvenca za smanjenje ekspresije Cx43 gena je sekvenca GCCCAAACTGATGGTGTCAAT (Sekv. sa ID br.21).
U daljem rešenju, sredstvo za upotrebu prema predmetnom pronalasku je jedinjenje koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost Cx43, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za i(li) funkcionalno blokira Cx43. U ovom kontekstu, fragmenti antitela i mimetici antitela su kao što je definisano iznad. Dalje, izraz „antitelo koje se specifično vezuje za Cx43“ se koristi kao sinonim sa izrazom „anti-Cx43 antitelo“.
U daljem rešenju, obezbeđeno je jedinjenje koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost koneksina 43 (Cx43), gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od peptida koji blokira pukotinastu međućelijsku vezu 26 (VCYDKSFPISHVR; Sekv. sa ID br.: 17); peptida koji blokira pukotinastu međućelijsku vezu Gap 27 (SRPTEKTIFII; Sekv. sa ID br.: 18); gliciretinske kliseline i njenih derivata, posebno karvenoksolona; kvinina i njegovih derivata, posebno kvinidina i meflokvina; anandamida; oktanola; heptanola; antranilne kiseline i njenih derivata; fenaminske kiseline i njenih derivata kao što je meklofenaminska kiselina; anestetika, posebno izoflurana i ketamina; retinske kiseline; i tonabersata.
Lečenje glioma kod pacijenta prema predmetnom pronalasku može da podrazumeva, uz upotrebu sredstava prema predmetnom pronalasku, dodatnu terapiju za tumor, naročito hemioterapiju i(li) radioterapiju.
Predmetni pronalazak obezbeđuje, po prvi put, terapeutske pristupe za lečenje glioma, naročito astrocitoma i glioblastoma, koji se odlikuju smanjenjem rezistentnosti tumora na terapiju, visokom efikasnošću, niskim morbiditetom i mortalitetom, produženim preživljavanjem i malom toksičnošću koja se dovodi u vezu sa terapijom.
Kratak opis slika
Na slikama je prikazano sledeće:
Slika 1:
Pojedinačne membranske mikrocevčice doprinose rasejanju tumora i povezuju pojedinačne tumorske ćelije. a, In vivo MPLSM iz S24 GBMSC koje rastu u mozgu miševa preko 60 dana (D). Strelice: tanki nastvci na membranama koji se pružaju ka normalnom moždanom tkivu na ivici tumora; vrhovi strelica: dugački intratumorski nastavci. Projekcije maksimalnog intenziteta (MIP, eng. maximum intensity projections), 300-357 μm dubine. b, Broj i dužina nastavaka u istim vremenskim tačkama (S24 tumori; n=77-120 ćelija u n=3 miša). c, Putanja dva nukleusa (strelice, vrhovi strelica) nakon podele jedra (na početku i nakon 103 časa) duž ćelijskih nastavaka u S24 GBMSC ćelijama. Brzina putovanja jedara: 66,42 ± 36,25 μm/dan, n=16 jedara kod n= 6 miševa. 3D slike, z-dimenzija 63 μm. d, Nastavci su bogati aktinom, i granaju se (S24 Lifeact-YFP, MIP, z dimenzija 15 μm). e, 3D rekonstrukcija membranskih mikrocevčica kod T325 astrocitoma tokom 3 dana (in vivo MPLSM). Vrhovi strelica: stabilna glavna cevčica; strelice: dinamične bočne cevčice. f, Slika dobijene skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) S24 GBMSC membranskih mikrocevčica (strelica, identifikovane putem fotooksidacije GFP) u parenhimu mozga miša, koja sadrži mitohondriju i mikrovezikule. Zvezdice: aksoni. g, 3D render membranskih cevčica koje povezuju pojedinačne S24 GBMSC ćelije u gustu višećelijsku mrežu u primeru zapremine mozga 238 x 192 x 90 μm. Međućelijske (povezane) i nepovezujuće cevčice i povezane i nepovezane tumorske ćelije prikazane su obeležene bojama. Cevčice su takođe klasifikovane kao povezujuće kada je povezana ćelija bila izvan prikazane zapremine. h, Broj membranskih cevčica po S24 tumorskoj ćeliji koje povezuju datu ćeliju sa nekom drugom tumorskom ćelijom u istom mikroregionu, u toku vremena (n=141-437 ćelija kod n=3 miša). Duži sa greškama prikazuju standardne devijacije.
Slika 2:
Različite ćelijske linije glioblastoma (GBMSC ćelije) koje rastu unutar astrocitičnih tumora u mozgu miša. a-f: In vivo mikroskopija (3D) 6 različitih linija GBMSC ćelija otkriva intenzivno formiranje veoma dugačkih membranskih nastavaka u mozgu miša: a T1, b T269, c T325, d S24, e WJ i f P3 (z-dimenzije od 200 do 500 μm dubine). Uokvireni delovi pokazuju oivičena polja na odgovarajućim slikama pod većim uveličanjem, pokrivajući deo z dimenzije. Po ćelijskoj liniji, prikazane su dve vremenske tačke, adaptirane prema brzini rasta in vivo (T269, P3 brzi; T1, S24, umereni; T325 i WJ spori). g, 3D slike S24 astrocitoma (injekcija 50:50 smeše bilo GFP- ili RFP-pozitivnih ćelija), koje otkrivaju izuzetno dugačke i veoma tanke membranske nastavke (strelice) u živom mozgu pacova. Obratiti pažnju da se membranske cevčice jednim delom pružaju paralelno. h, CGH-profil S24 GBMSC ćelijske linije koja pokazuje hromozomske aberacije tipične za GBM (dobitak u hromozomu 7, gubitak u 10). i, FISH analiza hromozoma 7 jedne od S24 GBMSC ćelija u glavnom delu tumora pokazuje poliploidiju: 90% od n=100 analiziranih ćelija u glavnom delu tumora su vrlo jasno poliploidne za hromozom 7, što ukazuje da implantirane S24 GBMSC ćelije dovode do tumora koji se genetski mogu identifikovati kao glioblastomi. j, Koronarne sekcije celog mozga miša
1
na dan 171 nakon injekcije S24, koje pokazuju dve glavne odlike rasta glioblastoma: difuznu invaziju u moždano tkivo u tipičnom obrascu rasejanja (leva slika) i čvrsti, angiogenični centralni deo koji se identifikuje hemoragičnim promenama glavnog dela tumora (desna slika u tehnici svetlog polja). k, Povećanje angiogeneze kod ovog tumora dalje je pokazano dinamičkom MPLSM in vivo. l, Vrh S24 GBMSC bogat aktinom, koji prodire u moždano tkivo (slike iz jedne ravni; šematski prikaz dat ispod). In vivo MPLSM: a-g; k,l.
Slika 3:
Karakterizacija membranskih mikrocevčica u mišjim modelima astrocitoma. a, Konfokalna imunohistohemija (projekcije sa maksimalnim intenzitetom) humanog nestina (zeleno, omogućava specifičnu detekciju struktura koje su u vezi sa S24 GBMSC ćelijama u mozgu miša), i različiti drugi ćelijski i molekulski faktori (crveno, istovremeno bojenje). Stepen ekspresije različitih faktora u membranskim cevčicama dobijenim iz tumorskih ćelija naznačen je u desnoj traci: – = bez signala u membranskim cevčicama, (-) = samo slab signal u maloj podgrupi membranskih cevčica, (+) = pozitivan signal u nekim membranskim cevčicama, = pozitivan signal u svim membranskim cevčicama. b, In vivo slike S24 GBMSC ćelija koje genetski eksprimiraju zeleni fluorescentni protein (GFP, zeleno) povezanih sa različitim ćelijskim/molekularnim komponentama. c, Primer veoma stabilne mikrocevčice T325 GBMSC (vrh strelice), praćene u toku 126 dana in vivo; MIP, z-dimenzija 48 μm. d, SEM slika dve membranske mikrocevčice pod fotokonverzijom (strelice) i jedra moždane ćelije koja nije pod fotokonverzijom (N). e, 3D rekonstrukcija serije SEM slika (22,29 μm (xy) * 4,62 μm (z) = 102,9 μm<3>) pokazuje konture membrana. f, Maksimalna brzina mitohondrija kod S24 membranskih cevčica u poređenju sa telima tumorskih ćelija in vivo (n=10 po grupi, t-test, crvene linije prikazuju srednju vrednost). g, 3D rekonstrukcija serijskih SEM preseka membranskih mikrocevčica (crveno) i dva aksona (zeleno), koji su prikazani na slici 1f. h, in vivo MPLSM 3D slika modela genetskog Tlx modela kod miša, sa obilatim membranskim mikrocevčicama koje povezuju pojedinačne ćelije astrocitoma koje nalikuju matičnim ćelijama (z dimenzija 83 μm). *p<0.05.
Slika 4:
Poreklo TM veza između ćelija astrocitoma, i dugoročna dinamika ćelija koje produžavaju TM. a, Grafik ilustruje dva teorijski moguća načina ostvarivanja međućelijskih veza preko membranskih cevčica u modelu dve populacije tumorskih ćelija označenih sa 2 različita fluorescentna proteina: (1) tumorske ćelije ostaju povezane sa svojim prethodnicama nakon ćelijske deobe. U ovom slučaju, očekivane su samo veze između ćelija iste boje [GFPGFP (zelene) ili RFP-RFP (crvene)]; (2) tumorske ćelije se povezuju samo sa nesrodnim ćelijama glioma. U ovom slučaju, 50% veza bi bilo između ćelija različitih boja [GFP-RFP ili RFP-GFP (sive)], a po 25% između istih boja [GFP-GFP (zelene) i RFP-RFP (crvene)], redom. b, Kvantitativno određivanje stvarnog skupa podataka, gde je smeša 1:1 S24 GBMSC ćelija koje eksprimiraju bilo GFP ili RFP (S24GFP/S24RFP) istovremeno ubrizgana u mišji mozak, pokazujući da su prisutna oba potencijalna mehanizma (n=164 veze kod n=3 miša). c, 3D slika (70 dana nakon injekcije) suimplantacije S24 GBMSC ćelija koje eksprimiraju GFP i koje eksprimiraju RFP. Kvantitativno određivanje je pokazalo da obe velike fluorofore (koje ne mogu da prođu kroz pukotinaste međućelijske veze) nikad nisu kolocirane u telima ćelija ili u TM cevčicama (n= >2500 analiziranih ćelija astrocitoma). d, e, Primeri 3D slika veza membranskih cevčica između pojedinačnih, nesrodnih ćelija astrocitoma koje diferencijalno eksprimiraju bilo GFP ili RFP (strelice kod d i e). f, Primer 3D slike veza iste boje između dve ćelije pozitivne za RFP (strelice). g, SEM slika S24 sferoida, levo polje: žutom bojom su obeležena tela ćelija, vrhovi strelica pokazuju ka membranskim mikrocevčicama; desno polje: veliko uveličanje cevčica sa direktnim membranskim kontaktom (strelica). h, 3D slike ćelija perivaskularnog T325 astrocitoma (strelice), koji prvo koristi TM da istraži perivaskularno okruženje (D45-D73), dok se ne pomeri u istraženu regiju, i ostane u strogo perivaskularnom položaju do dana 255. Druga ćelija (vrh strelice) miruje do D129 i ugrađena je u vaskularnu petlju, koja zaostaje nakon nestanka tela glavne ćelije. i, MIP ćelije S24 GFP astrocitoma koja ulazi u perivaskularni položaj u toku određenog vremena (strelica), i još jedne koja ostaje na svom nevaskularnom (parenhimalnom) položaju tokom 105 dana (vrh strelice). Sve slike su snimljene pomoću MPLSM in vivo, na 50-650 μm dubine u moždanom tkivu.
Slika 5:
Tumorske mikrocevčice (TM) su karakteristične za humane gliome bez kodelecije 1p/19q (na slikama oznaka non-codel, prim. prev.). a, b, Reprezentativne IDH1 R132H imunofluorescentne slike astrocitoma bez 1p/19q kodelecije (a), i oligodendroglioma sa 1p/19q kodelecijom (b). c, Udeo glioma kod pacijenata koji imaju maksimalnu dužinu IDH1 R132H-pozitivnih struktura mikrocevčica u standardnim presecima debljine 3 μm. Oligodendrogliom (O, 1p/19q kodelecija) gradus II, III; i astrocitom (A, bez 1p/19q kodelecije) gradus II, III i IV (glioblastom, GBM); n=20-24 pacijenta po tumorskom uzorku, n=105. d, Maksimalna dužina mikrocevčica oligoastrocitoma sa 1p/19q kodelecijom (OA CODEL; n=31 pacijent) i bez (OA NON-CODEL; n=9 pacijenata). e, Maksimalna dužina mikrocevčica u tumorima koji su morfološki klasifikovani kao astrocitomi ali sa 1p/19q kodelecijom („A” CODEL; n=6 pacijenata), i tumorima koji su morfološki klasifikovani kao oligodendrogliomi ali bez 1p/19q kodelecije („O” NON-CODEL; n=9 pacijenata).
Slika 6:
Gliomi sa 1p/19q kodelecijom ne pokazuju relevantne TM, dok oni bez kodelecije pokazuju prisustvo TM čak i u kontralateralnoj hemisferi kod pacijenata. a, 3D slika BT088 ksenografta tumora oligodendroglioma koji raste u mozgu miša; unutrašnja polja pokazuju uokvireni deo sa većim uveličanjem. Ćelije su okruglaste, TM su retke. b, Kvantitativno određivanje TM ćelija BT088 oligodendroglioma (levo) i S24 astrocitoma (desno) na 60. dan od implantacije tumora. n=3 životinje po uzorku. c, IDH1 R132H imunohistohemijski prikaz kontralateralne hemisfere mozga (makroskopski bez tumora) pacijenta koji je preminuo od astrocitoma WHO °III. d, Primer IDH1 imunohistohemije glioma koji je morfološki klasifikovan kao oligoastrocitom, sa (levo) ili bez (desno) 1p/19q kodelecije.
Slika 7:
Veze preko TM omogućavaju komunikaciju unutar višećelijskih mreža. a, Reprezentativna slika kalcijumskih talasa sa prolaskom vremena (Rho2-AM) koji putuju duž TM unutar GBMSC (dvosmerno; strelica). Crvene strelice: prolaz kroz dve TM, uz istovremeni kalcijumski maksimum. Desno: 3D slika GFP signala iz ovog regiona GBMSC ćelije, i 3D render struktura koje učestvuju u kalcijumskim talasima (zeleno). Zvezdica i tačka označavaju dve pojedinačne ćelije. c, Frekvencija i sinhronicitet (videti deo Postupci) kalcijumskih talasa u GBMSC ćelijama, prikazani za tumorske ćelije povezane preko TM naspram onih koje nisu povezane preko TM (n=40 naspram 43 ćelije u n=3 miša/uslovu; t-testovi). c, desno: Prolazni kalcijumski talasi ćelija koje nisu povezane (sivo) naspram ćelija povezanih preko TM (plavo); isprekidana linija označava sinhrone kalcijumske prolazne talase; levo: MIP (10 preseka) odgovarajućeg regiona (crvene ćelije: astrociti; zelene ćelije: tumorske ćelije bez Rhod-2AM signala; žute ćelije: tumorske ćelije sa Rhod-2AM signalom). d, Reprezentativna toplotna mapa kalcijumskih prolaznih talasa između GBMSC ćelija. e, Frekvencija i sinhronicitet kalcijumskih maksimuma zabeleženih tokom superfuzije mozga ekstracelularnim fiziološkim rastvorom (ES-kontrola) naspram 100 μM karbenoksolona (CBX) u GBMSC ćelijama (plavo polje) i normalnim moždanim astrocitima (crveno polje) n=3 miša po grupi; t-testovi. f, Unos SR101 u GBMSC ćeliju koja nije povezana preko TM (gornja slika) i onu koja jeste povezana preko TM (donja slika). Desno, odgovarajuće kvantitativno određivanje (AU, arbitrarne jedinice); n=55 ćelija kod n=3 miša/uslovu; Man-Vitnijev test. g, 3D slike (z-dimenzija 180 μm) SR101 mikroinjektovanih tumora, bez (kontrola, gornja slika) i sa istovremeno ubrizganim CBX (donja slika; oblast ubrizgavanja: krugovi) 120 minuta nakon injekcije. Crvene ćelije: normalni moždani astrociti. Grafik:
1
odgovarajuće kvantitativno određivanje SR101-fluorescencije (n=4962-5676 ćelija kod n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). Slike a, c, f i g su snimljene putem MPLSM in vivo. GBMSC ćelije: linija S24. Duži sa greškama prikazuju standardne devijacije. *p<0,05, ***p<0.001.
Slika 8:
Unutarćelijska komunikacija preko međućelijskih veza u ćelijama astrocitoma povezanim preko TM. a, Primer kalcijumskog talasa u kome učestvuju TM iz GBMSC ćelija iz regiona u kome je tumor; merenje genetski-kodiranim senzorom Twitch-3 koji omogućava ratiometrijsko merenje kalcijuma preko FRET-a. Prikazane su preklopljene slike cpVenusCD i CFP kanala. Žuta boja označava niske koncentracije, crvena boja visoke koncentracije kalcijuma. Desno: odnosi pojedinačnih preseka jedne TM koji ilustruju propagiranje kalcijumskog talasa duž TM. b, Primer toplotne mape komunikacije putem unutarćelijskog kalcijumskog talasa (ICW) između ćelija T325 astrocitoma transficiranih genetski kodiranim kalcijumskim senzorom GCaMP3. c, Primer toplotne mape (niskomolekulski kalcijumski indikator Fluo-4 AM). d, Analiza sinhroniciteta normalizovanog prema početnom stanju (videti deo Postupci za detaljne informacije) za kalcijumske signale između S24 GBMSC ćelija glioma naspram normalnih moždanih astrocita. Inozitol trifosfat (IP3) je blokiran putem 2-APB, ćelijski receptori za ATP putem neselektivnog antagonista purinergijskog 2 receptora suramina, dok su pukotinaste međućelijske veze blokirane putem CBX (ćelije glioma: t-testovi, astrociti: Man-Vitnijev test). ES, vanćelijski fiziološki rastvor korišćen je kao kontrola. e, 3D slike S24 tumorskih ćelija koje nisu povezane (S24tdtomato), koje su elektroporacijom napunjene bojom lucifer žutom koja može da prolazi kroz pukotinastu međućelijsku vezu. f, 3D slike S24 tumorskih ćelija koje su povezane preko TM (S24tdtomato) nakon prelaska boje u jednu od ćelija povezanih preko TM. g, Kvantitativno određivanje intenziteta fluorescencije lucifer žute u ćelijama neposredno do elektroporiranih ćelija (n=4 preseka iz n=2 miša; kvantitativno određeno n=64 ćelije povezane preko TM naspram n=42 ćelije koje nisu povezane preko TM; t-test). h, Vestern Blot analiza ekspresije Cx43 proteina u 4 GBMSC ćelijske linije i 2 ćelijske linije oligodendroglioma. i, Imunohistohemija koja pokazuje lokalizaciju različitih koneksina u S24 GBMSC ćelijama; nema jasne ekspresije koja se dovodi u vezu sa TM i(li) lokalizacije koja bi mogla da se uoči na prelascima TM. a-d, snimljeno pomoću in vivo MPLSM. e, f, i: slike sa konfokalne mikroskopije. *p<0,05, ***p<0.001.
Slika 9:
Pukotinaste međućelijske veze sa koneksinom 43 povezuju TM u astrocitomima. a, Kvantitativno određivanje ekspresije Cx43 proteina detektovane imunohistohemijski u ćelijama humanog glioma sa 1p/19q kodelecijom, naspram onih bez delecije (n=8 od svakog, t-test). b, Dvostruka imunofluorescencija nestina i Cx43 u S24 i T1 GBMSC tumorima (strelice pokazuju na međusobne veze preko TM koje su pozitivne na Cx43, a vrhovi strelica na TM koje su pozitivne na Cx43). c, SEM slika direktnog membranskog kontakta 2 TM u mozgu miša (identifikovanog fotooksidacijom). d, Sinhronicitet kalcijumskih maksimuma kod S24 shKontrola naspram shCx43 ćelija (n=3 miša/uslovu; Man-Vitnijev test). e, Udeo ćelija bez TM (0 TM) naspram ćelija bogatih TM (> 4 TM) u ovim tumorima 20 i 40 dana nakon implantacije tumora (n=3 miša po grupi, ANOVA, Takijev post-hoc test). f, T2 MRI slike visokog polja shKontrola naspram shCx43 tumora, 72 dana nakon implantacije tumora. Kvantitativno određivanje n=6 životinja po grupi (t-test). g, Grafik preživljavanja po Kaplan-Mejeru za ove grupe (log rang test). Duži sa greškama prikazuju standardne devijacije. *p<0,05; ***p<0,001.
Slika 10:
Ćelijske mreže astrocitoma povezanih preko TM mogu same da poprave svoja oštećenja i opiru se radioterapiji. a, Serija ilustrativnih 3D slika snimljenih sa prolaskom vremena (54 μm debljine) tumorskog regiona nakon laserskog uništenja GBMSC ćelija (krug). Tokom vremena TM (vrh strelice) se produžava i jedro (zvezdica) se translocira preko te TM na mesto na kojoj je prethodno bila ubijena ćelija. b, 3D slike (debljina 51 μm) regiona tumora mozga direktno pre nanošenja svetlosnog oštećenja na širu zonu (tačkasta polja) i 2 dana kasnije. Desna slika: presek oštećenog regiona u jednoj ravni. c, Protok vremena za region neposredno do velike zone koja je podvrgnuta svetlosnom oštećenju (tačkasta zona), strelice: GBMSC TM koje se pružaju u region oštećen dejstvom svetlosti. MIP od 21 μm, n=3 miša. d, Primeri mikroregiona GBMSC tumora (3D slike, dubina 20 μm) pre početka zračenja (d0), i sedam dana kasnije (d7). Zvezdice: GBMSC ćelije koje nisu povezane preko TM; strelice: jedan primer ćelije sa mnogo TM. Grafik: Relativna promena ćelijskih podtipova pod lažnim zračenjem (Sham) ili zračenjem (Rad) (n=3 miša po grupi, t-testovi). e, Broj TM po ćeliji kod ovih tumora (3D slike s leve strane, n=50 ćelija po vremenskoj tački kod n=3 miša po grupi, Man-Vitnijev test). f, Primeri toplotnih mapa prolaznih kalcijumskih talasa (Rhod-2AM) u regionu GBMSC tumora pri lažnom tretmanu (levo) i pri zračenju (desno). g, Sinhronicitet prolaznih kalcijumskih talasa nakon lažnog tretmana ili radioterapije u pojedinačnim regionima GBMSC tumora (Fluo-4AM, n=3 miša po grupi, Man-Vitnijev test). h, Relativne promene svih ćelija (levo) i podgrupa GBMSC ćelija koje su povezane preko TM naspram onih koje nisu iz shKontrola naspram shCx43 tumora nakon lažnog tretmana/zračenja (n=3 miša po grupi, ttestovi). Sve slike su snimljene putem MPLSM in vivo. GBMSC ćelije: linija S24. Duži sa greškama prikazuju standardne devijacije. *p<0,05,** p<0,01,***< 0,001
1
Slika 11:
Efekti radioterapije na ćelijsku morfologiju, dugoročno preživljavanje i homeostazu kalcijuma kod astrocitoma. a, 5 dana nakon početka radioterapije (3x7Gy), moguće je detektovati fragmentaciju jedra karakterističnu za apoptozu (strelica) u jednom delu ćelija, u toj vremenskoj tački. Zeleno, bojenje jedara H2B-GFP transdukcijom; crveno, citoplazma S24 ćelija. b, Reprezentativni 42-dnevni tok vremena u određenom mikroregionu tumora, praćen nakon početka radioterapije (dan 0). Ćelije povezane preko TM (dva primera su označena crnim zvezdicama) pokazuju dugoročno preživljavanje; treba primetiti da ćelije koje preživljavaju pokazuju povećanje broja svojih TM. n=3 miša po grupi. Sve slike su snimljene pomoću MPLSM in vivo, na 50-650 μm dubine u moždanom tkivu. c-f, Ratiometrijska merenja bazalnih koncentracija kalcijuma. c, Srednja vrednost odnosa intenziteta fluorescencije FRET partnera cpVenusCD i CFP, pre, i dva dana nakon zračenja (2x7Gy) u ćelijama povezanim preko TM (n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). d, Intenziteti fluorescencije (normalizovani preko srednje vrednosti za intenzitet odgovarajućih skupova podataka) kod ćelija povezanih preko TM za dva FRET partnera, ilustrovani skater blotom (crne tačke predstavljaju analizirane ćelije na dan pre radioterapije, crvene tačke 2 dana nakon početka radioterapije); linearna regresija pokazala je sličnu snagu korelacije u dve vremenske tačke (n=3 miša), što odslikava veoma homogene koncentracije kalcijuma u ćelijama astrocitoma pre i nakon radioterapije. e, Srednje vrednosti odnosa intenziteta fluorescencije FRET partnera pre i nakon dva dana radijacije (2x7Gy) u nepovezanim ćelijama, n=3 miša; Man-Vitnijev test. f, Normalizovani intenziteti fluorescencije u nepovezanim ćelijama za dva FRET partnera. Ovde je linearna regresija pokazala visoko homologne bazalne koncentracije kalcijuma samo pre radioterapije, dok je tokom radioterapije linearna korelacija izgubljena, što ilustruje heterogene koncentracije kalcijuma u analiziranim ćelijama. (n=3 miša po grupi). GBMSC, S24 ćelijska linija.
Slika 12:
In silico analiza glioma sa 1p/19q kodelecijom naspram onih bez kodelecije. Analiza biološke funkcije sprovedena je pomoću programa Ingenuity Pathway Analysis. a, Grafik najvažnijih diferencijalno regulisanih nishodnih bioloških funkcija. b, Toplotna mapa nishodnih bioloških funkcija. Mapa je prikazana uz obeležavanje bojom: intenzivnija narandžasta boja znači veću aktivaciju kod tumora bez 1p/19q kodelecije (u poređenju s tumorima sa kodelecijom), a plava prikazuje obrnuto. Uočiti aktivaciju „ćelijskog kretanja” i „međućelijske signalizacije” kod tumora bez kodelecije. c, Rezultati analize kanonskih puteva kod glioma bez 1p/19q kodelecije naspram onih s njom. Veća pozitivna z ocena: pojačanje
1
(upregulation) kod glioma bez 1p/19q kodelecije naspram onih s njom; veća negativna z ocena: pojačanje kod glioma sa 1p/19q kodelecijom naspram onih bez nje.
Slika 13:
Sklonost ka ekspresiji GAP-43 kod glioma bez 1p/19q kodelecije; i šematska ilustracija uloge TM u progresiji tumora na mozgu. a, Ekspresija TrkA, TrkB, NGF i NT-4 proteina detektovana imunohistohemijski kod humanih glioma sa 1p/19q kodelecijom naspram onih bez nje (n=8 za svaki, t-testovi).b, Vestern blot analiza ekspresije GAP-43 proteina kod 4 GBMSC linije gajene u neadherentnoj neurosferi (NSM) naspram onih gajenih u adherentnim uslovima, sa serumom. c, Test sferoidne invazije iz S24 shKontrole naspram shGAP-43 ćelija u gel matriksu, i odgovarajuće kvantitativno određivanje (t-test). d, Vestern blot analiza ekspresije Cx26, C31, Cx37 i Cx43 proteina u shGAP-43 GBMSC ćelijama naspram shKontrola. Treba uočiti da smanjenje ekspresije GAP-43 dovodi do smanjenja koncentracije Cx43 proteina od 89%, dok ekspresija drugih koneksina nije smanjena. e, Preterana ekspresija GAP-43 u BT088 oligodendrogliomskim ćelijama dovodi do koncentracija proteina sličnih onim u GBMSC. f, Anatomski i molekulski mehanizmi rasejanja tumora za koje su zaslužne TM i funkcije mreže kod astrocitoma. MV, mikrovezikule; mito, mitohondrija; ER, endoplazmatični retikulum (identifikovan preko pozitivnog rezultata PDI); MT, mikrotubule. *p<0,05,** p<0,01,***< 0,001.
Slika 14:
GAP-43 je neophodan za rast i funkciju TM. a, Ekspresija GAP-43 proteina detektovana imunohistohemijski kod humanih astrocitoma sa 1p/19q kodelecijom naspram oligodendroglioma bez nje (n=8 od svakog) i odgovarajuće kvantitativno određivanje (Man-Vitnijev test). b, Vestern blot GAP-43 za različite ćelijske linije glioma. c, Imunocitološke slike GAP-43 proteina, sa preferencijalnom lokalizacijom GAP-43 u vrhovima TM koji su negativni na nestin (strelice) u različitim GBMSC linijama. d, 3D slike ćelija glioma (levo, invertovane) i kvantitativno određivanje bočnih grana TM 20 dana nakon implantacije (n=60 ćelija kod n=5/6 miševa, t-test).e, Skenirane slike pojedinačnih ravni kontrola (gornja slika) i GBMSC S24 tumora sa smanjenom ekspresijom shGAP-43 (donja slika); desno: odgovarajuća kvantifikacija (n=3 miša/uslovu; Man-Vitnijev test).f, Razdaljina invazije tumora in vivo u roku od 24 časa (n=3 miša, Man-Vitnijev test). g, Proliferacija S24 GBMSC ćelija in vivo (zapremina od 0,037 mm<3>n=4 miša, Man-Vitnijev test).h, Frakcija ćelija povezanih preko TM u danu 20 kod S24 tumora (n=164 ćelije kod n=6 miševa, t-test). i, Analiza sinhroniciteta kalcijumskih maksimuma kod S24 shKontrola naspram shGAP-43 ćelija in vivo (n=3 miša, Man-Vitnijev test). j, T2 MRI snimci S24 shKontrola naspram shGAP-43 tumora, 72 dana
1
nakon implantacije tumora. Kvantitativno određivanje n=6 životinja po grupi (t-test). k, Grafik preživljavanja po Kaplan-Mejeru za ove grupe (log rang test). l, protok vremena nakon zračenja sa 3x7Gy kod ćelija S24 shKontrola naspram shGAP-43 astrocitoma, odgovarajuće kvantifikacije (n=3 miša/grupi; t-testovi). m, MRI snimci S24 shKontrola naspram shGAP-43 tumora, 60 dana nakon zračenja (115 dana nakon implantacije tumora); desno: kvantifikacija 5-6 životinja po grupi (t-test). n, Primeri preseka mozga prikazani tehnikom nestinske IHC ovih miševa; regioni sa najvećom gustinom tumorskih ćelija (uokvirena polja) su analizirani kako bi se kvantitativno odredio indeks proliferacije (Ki-67-pozitivne ćelije/sve ćelije; n=3 životinje; t-test).o-q, Preterana ekspresija GAP-43 kod BT088 oligodendrogliomskih ćelija dovodi do povećanog broja TM (o, levo: invertovane 3D slike i kvantifikacije, n=80 ćelija kod n=3 miša/grupi), više TM grana (p, n=40 ćelija kod n=3 miša/grupi) i do većeg kapaciteta za invaziju (q, n=75 ćelija kod n=3 miša/grupi; crvene linije pokazuju srednje vrednosti; t-testovi) 14 dana nakon injekcije. r, Relativna promena zapremine tumora 21 dan nakon radioterapije kod BT088 vektorske-kontrole naspram tumora kod kojih dolazi do prekomerne ekspresije GAP-43 (n=3 miša/grupi; t-test). In vivo MPLSM: slike d, e, l i o, i kvantifikacije d-i, l, m, or. Duži sa greškama prikazuju standardne devijacije. *p<0,05,** p<0,01,***< 0,001.
Slika 15:
a, GBMSC ćelije S24 shKontrole pokazuju ravnomerno tanke i ravnomerno razgranate TM in vivo, dok S24 shTTYH1 ćelije razvijaju aberantne TM. Treba uočiti abnormalnu morfologiju TM, koje su kratke, sa manje grana i često imaju kvržice. b, Razdaljina pojedinačnih tumorskih ćelija od glavnog tumora (centar tumora definisan je kao 500 μm), merena nakon rasta in vivo na dan 20 (n=3 miša po grupi). Srednje vrednosti za broj ćelija tumora koje su izvršile invaziju prikazane su za svaki opseg. Nasuprot tumorima S24 shKontrola, S24 shTTYH1 tumori su manje infiltrativni, te je moguće detektovati samo mali broj ćelija van centra tumora. [Opseg <500 μm: 395 naspram 19,5 ćelija [medijana] (p=0,004; Man-Vitnijev U-test), opseg 500-1000 μm 260 naspram 1,5 ćelija (P=0,004; Man-Vitnijev U-test) i opseg >1000 μm: 138 naspram 0 ćelija (p=0,004; Man-Vitnijev U-test).] c, Odnos površine tumora/površine mozga meren je na dan 74 na MRI skenerima od 9,4 Tesle (n=6 životinja po grupi). U proseku 62,90% površine mozga pokazivalo je vidljivu infiltraciju S24 shKontrola tumorskih ćelija dok je samo 5,82% ukupne površine mozga pokazivalo vidnu infiltraciju S24 shTTYH1 ćelijama (p= <0,001; dvosmerni t-test). d, Analiza preživljavanja po Kaplan-Mejeru izvedena je sa 6 životinja po grupi. Srednja vrednost vremena preživljavanja za životinje u S24 shKontrolnoj grupi bila je 74,67 dana u poređenju sa 176,17 dana u S24 shTTYH grupom (P=<0,001; log rang test).
1
Slika 16:
Novi molekulski kandidati za građenje TM (A, B) Gliomi koji rastu u živom mozgu miševa nakon implantacije S24 GBMSC ćelija gajenih u kulturi u uslovima koji daju sferoide nalik matičnim ćelijama (eng. stem-like spheroid conditions) (A), i u adherentnim uslovima sa serumom (B) (z=180 μm; reprezentativne slike 12 dana nakon implantacije). (C) Razdaljina tumorskih ćelija koje su izvršile invaziju od površine glavnog tumora 14 dana nakon implantacije S24 ćelija gajenih u kulturi u adherentim uslovima (sa serumom) naspram uslova bez seruma (GBMSC-uslova) (20-115 ćelija kod n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). (D) Kvantitativno određivanje dužine TM u S24 tumorskim ćelijama gajenim u kulturi pod adherentnim uslovima naspram GBMSC uslova 14 dana nakon implantacije (20-52 TM kod n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). (E) Reprezentativna slika S24 glioma na dan 104, kada su GBMSC ćelije gajene u kulturi u uslovima koji daju ćelije nalik matičnim ćelijama pre (z=165 μm) (F) Reprezentativna slika S24 glioma na dan 101, kada su GBMSC ćelije gajene u kulturi u uslovima sa serumom pre (z=165 μm) (G) Inteligentna analiza putanje (IPA, eng. ingenuity pathway analysis) za podatke iz mikroniza sa poređenjem GBMSC gajenih u kulturi u uslovima koji pogoduju razvoju sferoidnog oblika nalik matičnim ćelijama naspram adherentnih uslova sa serumom pokazuje 10 kategorija koje se najviše aktiviraju (za detaljne podatke videti sliku 17). Visoka pozitivna z ocena za aktivaciju ukazuje na pojačavanje (upregulation) u uslovima koji favorizuju ćelije nalik matičnim ćelijama. A-F: podaci dobijeni pomoću MPLSM in vivo, A, B, E, F: 3D slike.
Slika 17:
(A) Toplotna mapa bioloških funkcija iz IPA analize kojom se poredi ekspresija u GBMSC gajenim u uslovima kojima se favorizuju ćelije nalik matičnim naspram uslova kojim se favorizuje adherencija, sa serumom (podaci iz RNK mikroniza). (B) IPA toplotna mapa za kategoriju Kretanje ćelija. Toplotne mape su obeležene bojom: intenzivnija narandžasta boja ukazuje na pojačavanje ekspresije, pod uslovima koji pogoduju ćelijama nalik matičnim. Kategorije su dimenzionisane prema log(p-vrednost).
Slika 18:
(A) Vestern blot analiza stepena ekspresije TTYH1 i VGF proteina u S24 i T1 GBMSC ćelijama gajenim u kulturi u uslovima bez seruma, bez adherencije i sa serumom, sa adherencijom tokom 7 dana, čime se pokazuje smanjenje ekspresije tj. koncentracije proteina pod adherentnim uslovima. (B) Prikazi projekcije maksimalnog intenziteta imunohistohemijskog bojenja humanog nestina (zeleno) i VGF (crveno) dobijeni konfokalnom mikroskopijom (S24 GBMSC tumori); vrhovi strelica: VGF-pozitivne TM. (C) Verifikacija
1
smanjenja ekspresije VGF pomoću shRNA u 24S GBMSC ćelijama vestern blot analizom (smanjenje koncentracije proteina 95%). (D) In vivo 3D MPLSM slike S24 shKontrola i shVGF GBMSC ćelija na dan 40 (z=45 μm) koje ne pokazuju ni očigledne fenotipske aberacije ni očigledne razlike u invaziji i rastu tumora; GBMSC ćelije (zeleno) i krvni sudovi (plavo).
Slika 19:
TTYH1 protein se nalazi na tačno određenim delovima ćelija glioma i njihovih TM.
(A) Slike maksimalnog intenziteta projekcije (MIP, eng. Maximum Intensity Projection) imunohistohemijskog bojenja TTYH1 (crveno) u S24 GFP ćelijama (zeleno) koje otkrivaju preferencijalnu lokalizaciju TTYH1 proteina duž membrane nastavka i na konusnim vrhovima na mestu rasta u ovim strukturama nalik na TM (vrhovi strelica; veće uveličanje vrha prikazano je u donjem polju). (B, C) MIP slike imunohistohemijskog dvostrukog bojenja humanog nestina (zeleno) koji specifično označava GBMSC i njihove TM, i TTYH1 (crveno) u S24 GMBSC tumorima. (B) pokazuje tumorsku ćeliju (telo ćelije: zvezdica) i njene TM pozitivne na prisustvo TTYH1 (vrhovi strelica) među brojnim TM negativnim na prisustvo TTYH1; (C) prikazuje tumorsku ćeliju (telo ćelije: zvezdica) sa TM pozitivnim (vrhovi strelica) i negativnim (strelice) na TTYH1. (D) Imunohistohemijsko bojenje IDH1 (nedvosmislena identifikacija tumorskih ćelija sa antitelom specifičnim za IDH1 R132H mutaciju) i TTYH1 uzorka humanog astrocitoma takođe pokazuje ćeliju glioma koja je pozitivna na TTYH1 i njene TM (vrh strelice) u tumoru mozga. (E) 3D slike imunohistohemijskog bojenja integrina-
(ITGA5; zeleno) i TTYH1 (crveno) u S24 ćelijama (strelica: veća koncentracija ITGA5 na konusnom vrhu na kome dolazi do rasta; vrhovi strelica: kolokalizacija ITGA5 i TTYH1 na vrhu TM). A-E: Konfokalna mikroskopija.
Slika 20:
TTYH1 pokreće invaziju ćelija glioma. (A) Vestern blot analiza koncentracija TTYH1 proteina u različitim ćelijskim linijama glioma. (B) Leva strana: Linearna regresija je otkrila korelaciju između srednje vrednosti koncentracije TTYH1 proteina koja se ocenjuje vestern blot analizom i kapaciteta za difuznu infiltraciju tri različite ćelijske linije glioma in vivo. Koeficijent invazije je definisan kao srednja vrednost broja ćelija koje su dalje od 1500 μm od centra glavnog tumora, u odnosu na površinu glavnog tumora, kako bi se opisao stepen kapaciteta difuzne infiltracije svake od GBMSC linija (n=3 miša po ćelijskoj liniji). Desna strana: Reprezentativne in vivo 3D MPLSM slike S24, T269 i T325 tumora koje pokazuju različite stepene difuzne infiltracije na dan 39 (±5 dana). (C) Test sferoidne infiltracije S24 shKontrola ćelija naspram shTTYH1 ćelija u kolagenom matriksu 48 sati nakon zasejavanja.
2
Granična površina sferoida direktno nakon zasejavanja označena je belim linijama (n=3 sferoida po grupi; Man-Vitnijev test). (D, E) Vremenska serija 3D slika S24 shKontrola GBMSC ćelija (z=36 μm) (D) i S24 shTTYH1 GBMSC ćelija (z=69 μm) (E) pokazuju oštećen kapacitet za invaziju koji uzrokuje smanjenje ekspresije TTYH1 proteina. Strelice u levom polju ukazuju na budući put invazije; vrhovi strelica obeležavaju ćelijska tela GBMSC ćelija koje su izvršile invaziju (zeleno), krvni sudovi (crveno). (F) Merenja brzine invazije pojedinačnih S24 shKontrola naspram shTTYH1 GBMSC ćelija in vivo tokom 24 časa (n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). (G, H) Primeri in vivo 3D MPLSM slika TM iz S24 shKontrola i shTTYH1 GBMSC ćelija (G) kao i T269 shKontrola i shTTYH1 GBMSC TM (H). Uočiti da ćelije sa smanjenom ekspresijom shTTYH1 pokazuju morfološki izmenjene TM sa kvržicama filamenata (vrhovi strelica). B, D-H: podaci dobijeni pomoću in vivo MPLSM.
Slika 21:
(A) Verifikacija smanjenja ekspresije TTYH1 proteina pomoću shRNA u S24 (levo) i T269 (desno) GBMSC ćelijama vestern blot analizom (30% smanjenje u koncentraciji proteina kod S24 i 96% smanjenje kod T269, redom). (B) Ilustrativne MPLSM slike in vivo tumorskih ćelija bogatih TM kod S24 shKontrola i S24 shTTYH1 tumora, koji ne pokazuju nikakve fenotipske promene u ovom ćelijskom podtipu. (C) Različiti ćelijski podtipovi sa 0, 1, 2 i više od 4 TM takođe su prisutni kod T269 i T1 GBMSC linija. (D) Kvantitativno određivanje frakcija GBMSC ćelija povezanih preko TM u ćelijskim podgrupama sa 1-2 TM naspram onih sa više od 4 TM, koje pokazuje da je većina ćelija sa više od 4 TM povezana, dok su ćelije sa 1-2 TM uglavnom nepovezane sa drugim ćelijama ovog glioma, preko svojih TM. B-D: podaci dobijeni pomoću in vivo MPLSM.
Slika 22:
Heterogenost i invazivnost ćelija glioma u vezi sa TM. (A) Reprezentativne in vivo MPLSM slike ćelijskih podtipova sa 0, 1, 2 i više od 4 TM (S24). (B) Prikaz ćelijskih podtipova u humanim astrocitomima (antitelo specifično za IDH1 R132H mutaciju). (C) Leva strana: Relativne frakcije GBMSC ćelija sa 0, 1 ili 2, i sa više od 4 TM u S24 shKontrola ćelijama naspram shTTYH1 tumorima (20-25 dana nakon implantacije) (n=3 miša po grupi; dvostruki t-testovi). Desna strana: Apsolutni broj tumorskih ćelija po mm<3>kategorizovanih prema ovim ćelijskim podtipovima (n=3 miša po grupi; ANOVA analiza rangiranja). (D) Merenja brzine invazije S24 shKontrola naspram shTTYH1 GBMSC ćelija in vivo tokom 24 časa, potkategorizovanje prema broju svojih TM (n=3 miša po grupi; ANOVA analiza rangiranja).
A-D: podaci dobijeni pomoću in vivo MPLSM.
Slika 23:
Kolonizacija mozga i rast glioma značajno se smanjuju deficijencijom TTYH1. (A-D) Reprezentativne slike iz jedne ravni za S24 shKontrola (A) i ssTTYH1 (B) kao i za T269 shKontrola (C) i shTTYH1 (D) tumore 20 dana nakon implantacije, koje pokazuju smanjenu invaziju koju prouzrokuje smanjenje ekspresije TTYH1; srednja i desna slika pokazuju veće modifikacije odgovarajućih regiona u pregledu (levo), GBMSC (crveno), krvni sudovi (tirkiz), krug: mesto injekcije tumora. Uočiti da je tumorigeničnost drastično smanjena u T269 ćelijskoj liniji koja pokazuje veoma difuznu infiltraciju. (E) Odgovarajuće kvantitativno određivanje S24 tumorskih ćelija koje su izvršile invaziju prema udaljenosti od glavnog tumora, koji je definisan kao oblast sa radijalnom širinom od 500 μm (n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test).
(F) Apsolutni broj tumorskih ćelija u T269 shKontrolama naspram shTTYH1 ćelija meren na osnovu slike cele hemisfere u pojedinačnoj ravni na dan 20 (n=3 miša po grupi; dvostrani ttest). (G) 9,4Tesla T2 MRI snimci S24 shKontrola (dan 72) naspram shTTYH1 tumora (dan 75 od implantacije) i odgovarajuća kvantifikacija odnosa površine tumora/površine mozga (n=6 životinja po grupi; dvostrani t-test); zelena linija: površina tumora. (H) Grafik preživljavanja po Kaplan-Mejeru za miševe koji nose S24 shKontrola naspram onih koji nose shTTYH1 tumor (n=6 životinja po grupi; Log rang test). A-F: podaci dobijeni pomoću in vivo MPLSM.
Slika 24:
Međusobne veze tumorskih ćelija u kojima posreduju TM i rezistencija na zračenje. (A) Odnos 24 shKontrola i shTTYH1 GBMSC koje su povezane/koje nisu povezane preko TM 20 i 40 dana nakon implantacije (n=3 miša po grupi; Man-Vitnijev test). (B) Leva strana: reprezentativne 3D MPLSM slike 24 shKontrola i shTTYH1 tumora pre, i 7 dana nakon zračenja (z=51 μm). Desna strana: odgovarajuće kvantitativno određivanje pokazuje apsolutan broj ćelija u zapremini od 276x10<3>μm<3>pre i 7 dana nakon zračenja (n=3 životinje po grupi; ANOVA analiza ranga). (C) Odnos broja ćelija 7 dana nakon/pre zračenja u smislu povezanosti preko TM (n=3 miša po grupi; ANOVA). A-C: podaci dobijeni pomoću in vivo MPLSM.
Predmetni pronalazak će dalje biti ilustrovan primerima koji slede, ali njima nije ograničen.
Primeri
Eksperimentalne procedure:
Životinje i hirurške procedure
NMRI golokoži miševi starosti 8-10 nedelja korišćeni su za sve studije sa humanim tumorskim ćelijama primarnih tumora mozga. Da bi se ispitao nastanak TM u mišijem modelu singenog astrocitoma korišćeni su Nestin-Tv-a;Tlx-GFP miševi u kombinaciji sa RCAS-PDGFB/AKT vektorima. Sve procedure sa životinjama sprovedene su u skladu sa institucionalnim smernicama za istraživanja na laboratorijskim životinjama, nakon odobrenja koje izdaje Regierungspräsidium Karlsruhe, Nemačka (nadležni organ). Učinjeni su svi napori da bi se patnja životinja smanjila na minimum i da bi se smanjio broj korišćenih životinja. Ako bi miševi pokazali neurološke simptome ili veliki gubitak težine (>20%), eksperimenti su prekidani.
Implantacija kranijalnog prozora sprovedena je kao što je u struci poznato: nakon uklanjanja kože, kost anesteziranih miševa je izbušena, te su menige uklonjene. Otvor je pokriven okruglim staklenim prozorom od 6 mm, koji je zalepljen za kost stomatološkim cementom, nakon čega je preko toga postavljen titanijumski prsten koji se tačno uklapa u posebno prilagođeni držač, kako bi se garantovalo da tokom snimanja neće doći do artefakta zbog pomeranja.
2-3 nedelje nakon implantacije kranijalnog prozora, 30.000 tumorskih ćelija stereotaktično je ubrizgano u mozak miša na dubinu od 500 μm, pod uglom od 45<o>. Za eksperimente preživljavanja, ubrizgavano je po 50.000 ćelija. U jednoj podgrupi miševa, ispod stakla je zalepljena kratka plastična cevčica sa jednim krajem unutra a drugim napolju, koja je omogućavala topijsku primenu različitih supstanci ispod prozora, bez potrebe za njegovim ponovnim otvaranjem (npr. za snimanje kalcijumskih talasa).
Za intratumorske mikroinjekcije sulforhodamina 101 (SR101, Molecular Probes, S-359), 50 nl 100 μM SE101 (sa ili bez 100 μM CBX, Sigma-Aldrich, C4790) ubrizgano je pomoću veoma tanke staklene pipete u regione tumora sličnih ćelijskih gustina, >90 dana nakon ubrizgavanja tumora.
Mužjaci NMRI golokožih miševa starosti 8-10 nedelja (Charles River, Sulzfeld, Nemačka) korišćeni su za ispitivanje rasta ćelijskih linija primarnih tumora mozga in vivo. Implantacija kranijalnog prozora je izvedena kao što je prethodno opisano. Dve nedelje nakon implantacije kranijalnog prozora, GBMSC sferoidi su podeljeni akutazom (A6964, Sigma Aldrich) kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija, te je 40.000 tumorskih ćelija
2
suspendovanih u PBS-u ubrizgano kortikalno, na dubinu od 500 μm. Za studije preživljavanja i MRI snimanja, po 50.000 ćelija (i sa smanjenom ekspresijom Ttyh1 i odgovarajućih shRNA kontrolnih GBMSC) je ubrizgano, kao deo šireg eksperimentalnog pristupa u kojem je ispitivano smanjenje ekspresije (eng. knockdown) većeg broja gena. Miševi su ocenjivani klinički, te brzo žrtvovani ako bi pokazali neurološke simptome ili gubitak težine od >20%. Tumori su zračeni sa 7 Gy tokom tri uzastopna dana na dan 57 (+/- 8).
Radioterapija
Životinje su anestezirane izofuranom, pa su tumori, koji su već porasli, zračeni sa po 7 Gy tri uzastopna dana (ukupna doza 21 Gy) u regionima koji imaju odgovarajuću gustinu tumorskih ćelija, pomoću linearnog akceleratora od 6 MV sa kolimatorom od 6 mm (prilagođenim veličini prozora), sa brzinom dopremanja doze od 3 Gy/min (Artiste, Siemens, Erlangen, Nemačka) – ili nije primenjivano nikakvo zračenje (lažni tretman, eng. sham radiation). Vreme zračenja bilo je oko 60. dana (+/- 10 dana) nakon implantacije tumora. Za MRI ispitivanja, korišćeno je zračenje celog mozga istom dozom, sa veličinom polja od 17 mm x 250 mm (što je omogućavalo zračenje nekoliko miševa), u istom akceleratoru. Oči i organi van lobanje bili su zaštićeni od radijacionog polja. Primenjeni raspored zračenja je klinički relevantan: njegova biološka aktivnost je u opsegu uobičajeno prepisivanih 60 Gy u frakcijama po 2 Gy za pacijente koji pate od malignog glioma, uz pretpostavku α/βod ∼10 u linearnom kvadratnom modelu, uzimajući u obzir kratko vreme zračenja od 3 dana.
In vivo multifotonska laserska skenirajuća mikroskopija (MPLSM)
Snimanje pomoću MPLSM sprovedeno je primenom Zeiss mikroskopa od 7 MP (Zeiss, Nemačka), opremljenog Coherent kameleonskim Ultrall laserom (Coherent, Škotska). Za ekscitaciju su korišćene sledeće talasne dužine: 750 nm (dsRed, FITC-dekstran, tdTomato), 840 nm (Fluo-4AM), 850 nm (GFP, TRITC-dekstran, Rhod-2AM), 860 nm (CFP, za FRET snimke) i 950 nm (tdTomato, YFP). Korišćeni su odgovarajući kompleti filtera [BP 500-550/ BP 575-610 i BP 460-500/ BP 525-560 (za FRET)]. Standardna podešavanja za snimanje su bila sa dobicima između 650 i 750 (u zavisnosti od dubine, intenziteta fluorescencije fluorofore i kvaliteta prozora), i z-interval od 3 μm. Snaga lasera podešena je na najnižu moguću vrednost.
U toku procedure snimanja, telesna temperatura miševa održavana je konstantnom pomoću rektalnog termometra i grejnog jastučeta. Koncentracija izofluorana (u 100% O2) podešena je na najmanju moguću (0,5-1,5%) kako bi se izbegla interferencija sa kalcijumskom komunikacijom između ćelija astrocitoma. Fluorescentni dekstrani [FITC (2M MW)- ili TRITC (500.000 MW) -konjugovani, 10 mg/ml, Sigma] ubrizgani su intravenski kako bi se dobili angiogrami, koji su omogućavali određivanje relativne pozicije ćelija glioma u toku vremena.
Za ablaciju pojedinačnih ćelija astrocitoma in vivo, samo je zapremina prostora u kojoj su GFP-obeležena ćelijska jedra izložena kontinualnom skeniranju laserom velike snage, pa je laser zaustavljen u trenutku kada je postala vidljiva dezintegracija jedra. Ta regija je snimljena odmah nakon smrti izazvane laserom, pa ponovo nakon 1,5h, 12h, 24h, 40h i 60h. Da bi se ispitala reakcija TM nakon svetlosnog oštećenja šireg regiona mozga, veća zapremina (0,5-1 x 10<6>μm<3>) je repetitivno skenirana tokom oko 8 minuta primenom visoke snage, što je dovelo do ukupne doze fotona koja je >50 veća nego tokom „dijagnostičkog” snimanja.
Za ispitivanje TTYH1, korišćen je BP500-550/BP 575-610 filter i sledeće talasne dužine: 850 nm (GFP, TRITC-dekstran) i 950 nm (tdTomato). Korišćeni su z-intervali od 3 μm i dobici između 620 i 750. Snaga lasera podešena je na najmanju moguću kako bi se izbegla fototoksičnost. Za snimanje in vivo, miševi su narkotizovani izofluranom (u 100% O2). Miševi su fiksirani pomoću implantiranog titanijumskog prstena posebno napravljenog za te namene, kako bi se osigurala stabilna i bezbolna fiksacija tokom procedura repetitivnog snimanja. Prsten je takođe služio kao rezervoar za vodu, što je omogućilo dužu akviziciju snimaka. Visokomolekulski TRITC-Dekstran (500kDa; 52194, Sigma Aldrich; 10 μg ml<-1>) ubrizgan je u repnu venu za potrebe angiografije. Površinski angiogrami su omogućili pronalaženje istovetnog regiona tokom repetitivnog snimanja u različitim vremenskim tačkama, a arhitektura krvnih sudova je pomogla u identifikaciji određenih ćelija tokom dužeg vremenskog perioda. U toku procedure snimanja, telesna temperatura održavana je konstantnom pomoću rektalnog termometra i grejnog jastučeta.
Snimanje kalcijumskih talasa in vivo pomoću MPLSM
Korišćeni su sledeći niskomolekulski indikatori kalcijuma: za tumorske ćelije sa transficiranim GFP: 2mM Rhod-2AM (Life Technologies, R-1244); za one sa transficiranim RFP: 2mM Fluo-4AM (Life Technologies, F-14201). Rastvorene boje su nanesene na površinu mozga tokom 45 minuta. Korišćene su regije sa sličnom gustinom tumorskih ćelija. Za kombinaciju radioterapije i snimanja kalcijumskih talasa, miševi su prethodno tretirani sa Fluo-4AM i snimani nakon buđenja niskom dozom izoflurana (0,5%). Jedan čas nakon terapije zračenjem, isti regioni su ponovo snimani kako bi se detektovale promene u aktivnosti kalcijuma. Farmakološka inhibicija međućelijskih veza postignuta je superfuzijom sa inhibitorom pukotinaste međućelijske veze CBX (100 μm, kontrolna supstanca: vanćelijski
2
fiziološki rastvor; n=3 miša po grupi). Druge supstance korišćene za superfuziju su suramin (100 μM, antagonist ATP-a) i 2-aminoetoksidifenil borat (2-APB, 100 μM, inhibitor IP3 receptora).
Dva genetski kodirana kalcijumska inhibitora su lentiviralno transducirana u GBMSC ćelije: (A) Lck-GCaMP3 senzor u rrl-CAG-IGC3 vektoru (CAG promoter kojim se kontroliše ekspresija DsRed i Ca<2+>senzor koji prati promene u [Ca<2+>]iu blizini membrane). (B) Radiometrijski kalcijumski senzor Twitch-3 korišćen je za određivanje unutarćelijskih koncentracija kalcijuma pomoću Forsterovog transfera rezonantne energije (eng. Förster Resonance Energy Transfer,(FRET)), kao što je u struci poznato.
MRI ispitivanja
MRI snimci su dobijeni na dan 72 nakon implantacije tumora za životinje koje nisu podvrgnute zračenju, i na dan 115 za miševe koji su zračeni (60 dana nakon radioterapije; ove vremenske tačke su odabrane kada su prve kontrolne životinje razvile neurološke simptome i(li) izgubile 20% telesne težine, i morale da budu žrtvovane). Sva snimanja su izvedena na horizontalnom MR skeneru od 9,4 T (BioSpec 94/20 USR, Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Nemačka) sa površinskim kalemom sa četvorokanalnim faznim nizom. Životinje su držane pod inhalacionom anestezijom. Sekvence brze akvizicije sa post-kontrastnim pojačanjem na T2 sekvencama sa refokusiranim ehom (RARE) su snimane kako bi se odredila zapremina tumora.
MRI snimci su dobijeni na dan 72 (shKontrola) i dan 75 (S24 shTTYH1) nakon implantacije tumorskih ćelija, na MR skeneru sa horizontalnom sondom (BioSpec 94/20 USR, Bruker BioSpin GmbH) sa površinskim kalemom sa četvorokanalnim faznim nizom. Da bi se odredila zapremina tumora, korišćene su sekvence brze akvizicije sa post-kontrastnim pojačanjem na T2 sekvencama sa refokusiranim ehom (RARE).
Ćelijske linije i eksperimenti sa kulturama ćelija
Linije tumorskih ćelija dobijene iz glioma dobijenih resekcijom gajene su u podlozi DMEM-F12 u uslovima bez seruma (uslovi koji pogoduju razvoju oblika nalik matičnim ćelijama (eng. „stemlike“)) (GBMSC; P3, S24, T1, T269, T325, WJ). Ovih 6 linija GBMSC ćelija odabrano je zato što su bile u stanju da dovedu do rasta tumora u mozgu miševa. Dve ćelijske linije oligodendroglioma koje nose tipičnu 1p/19q kodeleciju (BT088 i BT054) su držane u istim uslovima gajenja u kulturi; samo BT088 su mogle da formiraju tumore kod miševa. Da bi se osigurala autentičnost, tipične genetske promene glioblastoma potvrđene su za S24 primenom komparativne genomske hibridizacije (CGH, videti sliku 2i); T1, T269, T325
2
i WJ linije su već prethodno bile okarakterisane, kao i linija P3. Ćelije su redovno proveravane na infekcije mikoplazmama i za autentičnost.
Tumorske ćelije su transducirane lentiviralnim vektorima za potrebe snimanja u više boja, i za in vivo detekciju različitih ćelijskih odeljaka. Za citosolnu ekspresiju GFP korišćen je pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP_shnon-target-vektor (SHC016 Sigma Aldrich), za citosolnu ekspresiju RFP (tdTomato) LeGo-T2 vektor (poklon od A. Trumpp, na kome smo zahvalni), dok je nuklearna ekspresija GFP (H2B-GFP) postignuta transfekcijom sa pLKO.1-LV-GFP (Addgene 25999, Elaine Fuchs). Transdukcija sa pLenti6.2 hygro/V5-Lifeact-YFP (poklon od P. Friedl, na kome smo zahvalni) omogućila je in vivo snimanje dinamike aktinskih filamenata, dok je FUmGW (Addgene 22479, Connie Cepko) omogućio in vivo ilustraciju ćelijskih membrana. Mikrotubule su označene pomoću LentiBrite™ GFP-Tubulin Lentiviral Biosensor (17-10206, Merck Millipore). Lentivirusne čestice su proizvedene kao što je u struci poznato. Za praćenje miozina II in vivo izvedena je plazmidna transfekcija sa FuGENE® HD (Promega) pomoću Myosin-IIA-GFP vektora (Addgene 38297, Matthew Krummel).
Proizvodnja lentivirusnih vektora za smanjenje ekspresije Cx43 (pLKO1.1-puro-CMV-tGFP-vektor, Sigma Aldrich, ciljna sekvenca: GCCCAAACTGATGGTGTCAAT; Sekv. sa ID br.: 19) i GAP-43 (pLKO1.1-puro-CMV-vektor, Sigma Aldrich, ciljna sekvenca: TGTAGATGAAACCAAACCTAA; Sekv. sa ID br.: 3) pomoću shRNA tehnologije izvedena je kao što je u struci poznato. Kontrolne ćelije su inficirane odgovarajućim shRNA lentiviralnim ćelijama koje ne nose ciljni molekul (non_target) (SHC016, Sigma Aldrich). Za preteranu ekspresiju GAP-43 otvoreni ram za čitanje GAP-43 je kloniran u vektorski skelet pCCL.PPT.SFFV.MCS.IRES.eGFP.WPRE (poklon od H. Glimm, na kome smo zahvalni). Proizvodnja lentiviralnih čestica i njihova transdukcija u ciljne ćelije sprovedene su kao što je u struci poznato.
Tumorske ćelije su inkubirane sa sakupljenim virusom i 8 mg/ml polibrena (Merck Millipore, Darmstadt, Nemačka) tokom 24 h. Za neke svrhe, ćelije su transducirane sekvencijalno pomoću različitih vektora. Efikasnost transdukcije je proveravana putem intenziteta fluorescencije GFP i vestern blot analizom. Kvantitativno određivanje je pokazalo 80% smanjenje ekspresije za Cx43 i 92,5% za GAP-43 (vestern blot analiza). Ukoliko je bilo potrebno, tumorske ćelije su selektovane za određene fluorofore pomoću FACS sortiranja (BD FACSAria™ II Cell Sorter) ili antibioticima.
Za praćenje mitohondrija, korišćena je tehnologija BacMam 2.0 (CellLight® Mitochondria-GFP, BacMam 2.0, C10600, Life Technologies). Ćelijske linije humanog primarnog glioblastoma (GBMSC: S24, T269, T325, T1) gajene su u podlozi DMEM-F12
2
(31330-038, Gibco) u uslovima bez seruma, koji pogoduju adherenciji, uz B27 suplement (12587-010, Gibco), 5 μg ml<-1>insulina (I9278, Sigma Aldrich), 5 μg ml<-1>heparina (H4784, Sigma Aldrich), 20 μg ml<-1>epidermalnog faktora rasta (rhEGF, 236-EG, R&D Systems) i 20 μg ml<-1>osnovnog faktora rasta fibroblasta (bFGF, PHG0021, ThermoFisher Scientific). Za postizanje adherentnih uslova, S24 ćelije glioma su gajene u podlozi DMEM (D6429, Sigma Aldrich) sa 10% FBS (F7524, Sigma Aldrich).
GBMSC su stabilno transducirane pomoću lentivirusnih vektora kako bi se ćelije pratile tokom in vivo MPLSM. Ekspresija citosolnog RFP (tdTomato) postignuta je transdukcijom sa LeGo-T2 vektorom (poklon od A. Trumpp). Lentiviralno smanjenje ekspresije TTYH1 (plKO.1-puro-CMV-vektor, Sigma Aldrich, ciljna sekvenca: TCAGACATCCTGAGCTATTAT (Sekv. sa ID br.: 12; za smanjenje ekspresije kod S24), GCTCTGACCACTAACACTCTT (Sekv. sa ID br.: 16; za smanjenje ekspresije kod T269) i VGF (ciljna sekvenca nije prikazana) pomoću shRNA tehnologije izvedeni su kao što je poznato u struci. ShRNA sekvence su izabrane iz grupe koja se sastoji od pet različitih ciljnih sekvenci koje su testirane, prema njihovoj sposobnosti da proizvedu maksimalno smanjenje ekspresije proteina dok istovremeno na najbolji način čuvaju sposobnosti rasta tumorskih ćelija in vivo. Kontrolne ćelije su transducirane odgovarajućim lentiviralnim česticama plKO.1-puro-CMV-TurboGFP_shnon-target-vektora (SHC016, Sigma Aldrich). Za transdukciju, ćelije su inkubirane sa lentiviralnim česticama i sa 10 μg ml<-1>polibrena (TR-1003-G, Merck Millipore) tokom 24 časa.
Vestern blot analiza je pokazala 95% smanjenje ekspresije za VGF i 30% smanjenje ekspresije za TTYH1 u S24 GBMSC ćelijskoj liniji, kao i 96% smanjenje ekspresije u T269 GBMSC ćelijskoj liniji. Sve ćelije su redovno testirane na infekcije mikoplazmama, a kontrole vrste su izvođene radi potvrde autentičnosti.
Imunohistohemija (IHC) i imunocitohemija (ICC)
Za IHC i ICC korišćeni su standardni protokoli. Za analizu humanog mozga, tanki (3 μm) preseci tkiva fiksirani u formalinu dobijeni su od Odeljenja za neuropatologiju u Hajdelbergu, u skladu sa odobrenjem lokalnog etičkog odbora. Preseci humanog tkiva inkubirani su sa anti-IDH1 R132H (H09, Dianova), anti-Cx43 (C 6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling), anti-NGF (ab52918, Abcam), anti-NT4 (ab150437, Abcam), anti-TrkA (ab76291, Abcam) i anti-TrkB (ab134155, Abcam) antitelima. Ukoliko nije eksplicitno navedeno, svi oligodendrogliomi su imali 1p/19q kodeleciju, dok su svi astrocitomi bili bez 1p/19q kodelecije (eng. non-codeleted). Da bi se detektovale ćelije kontralateralnih tumora u
2
ljudskom mozgu, veliki preseci su analizirani kao što je u struci poznato. Za imunofluorescentnu detekciju IDH1 R132H-pozitivnih tumorskih ćelija u debelim presecima tumora mozga, uzorci humanih tkiva fiksirani u paraformaldehidu (PFA) su isečeni na isečke od 100 μm i inkubirani 24 časa sa IDH1 R132H antitelom.
Za analizu mišjeg mozga, kod životinja je primenjena transkardijalna perfuzija PBS, a zatim 4,5% PFA. Za ICC, ćelije su gajene na staklenim slajdovima 4 dana i fiksirane pomoću PFA. Sledeća antitela su korišćena za isečke od 10 μm na kriotomu, za ICC: anti-nestin (ab6320, Abcam, specifično bojenje humanog nestinskog intermedijernog filamenta, koji je izrazito obilno eksprimiran u GBMSC ali se ne može detektovati u normalnom mozgu miša), u kombinaciji sa anti-β-katenin (ab16051, Abcam), anti-β-parvin (sc-50775, Santa Cruz), antibeta tubulin III (ab18207, Abcam), anti-Cx26 (ab59020, Abcam), anti-Cx31 (ab156582, Abcam), anti-Cx37 (ab185820, Abcam), anti-Cx43 (C6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling), anti-GFAP (Z0334, Dako), anti-Ki-67 (M7240, Dako), anti-miozin IIa (ab24762, Abcam), anti-myosin X (22430002, Novus Bioscience), anti-N-Cadherin (ab18203, Abcam) i anti-PDI (ab3672, Abcam) antitelima. Slike su snimljene pomoću konfokalnog mikroskopa Leica SP5.
U TTYH1 ispitivanjima, za imunohistohemiju, miševi sa potpuno jasno uspostavljenim tumorima mozga su podvrgnuti kadrijalnoj perfuziji PBS-om, zatim 4,5% rastvorom formaldehida u fosfatnom puferu (Roti-Histofix 4.5 %, 2213, Carl Roth). Mozak je inkubiran u 30% rastvoru saharoze preko noći zarad krioprotekcije, nakon čega je zamrznut. Pre imunohistohemijskog bojenja, izvedeno je toplotno prikazivanje epitopa sa 0,01 M citratnim puferom (pH = 6). Za imunocitohemiju, ćelije su gajene na poklopcima 3 dana i fiksirane sa 4,5% rastvorom formaldehida (Roti-Histofix 4.5 %, 2213, Carl Roth), ili acetonom. Sledeća antitela su korišćena za bojenje 10 μm isečaka sa kriotoma i za ICC: anti-nestin (ab6320, Abcam), anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich), anti-Integrin α5 (ab6131, Abcam), anti-VGF (PA5-20523, ThermoFisher Scientific). Kao sekundarna antitela, korišćena su kozja antimišji IgG, Alexa Fluor 488 konjugovana (A-11029, ThermoFisher Scientific) i kozja anti-zečji IgG, Alexa Fluor 633 konjugovana antitela (A-21070, ThermoFisher Scientific). Za prikazivanje ćelijskih podtipova u uzorcima humanih astrocitoma sa IDH1 mutacijom, uzorci humanog tumora mozga su fiksirani u 4% PFA pa su isečci od 100 μm isečeni na vibratomu. Prikazivanje antigena indukovano toplotom je izvedeno pomoću Tris-EDTA pufera. Slobodno plivajući isečci su inkubirani sa primarnim antitelom antiIDH1 R132H (DIA H09; Dianova) tokom 24 časa. Korišćeno je AF488 konjugovano anti-mišje sekundarno antitelo (A11029, Life Technologies). Za smanjenje autofluorescencije korišćen je rastvor Sudan Black pigmenta. Za
2
istovremeno bojenje IDH1/TTYH1 u uzorcima humanih astrocitoma, 3 μm isečci uzoraka tkiva potopljenih u parafin su oslobođeni parafina, pa je izvedeno toplotno otkrivanje antigena pomoću rastvora Cell Conditioning Solution (pH=6,0) (CC2, #950-123, Ventana). Korišćena su primarna antitela anti-IDH1 R132H (DIA H09; Dianova) i anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich).
Konfokalni imunohistohemijski i imunocitohemijski snimci snimljeni su pomoću Leica TCS SP5 mikroskopa.
Fotooksidacija GFP i serijska skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) isečaka Deset S24 GBMSC blokova tkiva tumora mozga pripremljeno je za fotooksidaciju kao što je u struci poznato. Serijski isečci debljine 70 nm fotooksidovanog tkiva utopljenog u epon proizvedeni su uz pomoć 3D SEM kao što je u struci poznato. Snimljena je zapremina od 747 μm<3>, pa je 6 od 51 analiziranih filamenata tumora iz te zapremine rekonstruisano za analizu prečnika TM. Kao ilustracija, rekonstruisani su i aksoni. Uzorci su snimljeni pomoću Zeiss 1530 skenirajućeg elektronskog mikroskopa. Slike su ručno poravnate. Plazma membrane TM i aksona su ručno iscrtane u svakom isečku, čime je dobijen komplet kontura.
Za EM sferoida, sferoidi stari 5 dana su fiksirani u 4% PFA/0,5% GA, inkubirani u kakodilnoj kiselini a nakon toga tretirani 1,5% kalijum ferocijanidom i 2% osmijum tetroksidom. Isečci su dehidrirani i čuvani u smeši epoksi/propilenoksid (1:1) preko noći. Isečci su fiksirani epoksi smolom. Pripremljena je serija isečaka, pa je analizirana zapremina od 2692 μm<3>.
Vestern blot
Vestern blot analize izvedene su u skladu sa standardnim protokolima. Lizati ukupnih proteina (20-50 μg) su elektroforetski razdvojeni na 10% SDS-PAGE. Nakon blotovanja i blokiranja, sledeća antitela korišćena su preko noći na 4°C: anti-Cx26 (ab59020, Abcam), anti-Cx31 (ab156582, Abcam), anti-Cx37 (ab185820, Abcam), anti-Cx43 (C 6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling). Za kontrolu vezivanja korišćeni su anti-GAPDH antitelo (C4780, Linaris) ili antialfa-tubulin antitelo (T9026, Sigma).
Za ispitivanja TTYH1, gelovi su inkubirani sa anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich) i anti-VGF (PA5-20523, ThermoFisher Scientific) antitelima nakon blotovanja i blokiranja preko noći na 4 °C. Blotovi su inkubirani sa magarećim anti-zečjim sekundarnim antitelima vezanim za HRP (NA9340-1ml, GE Healthcare) na sobnoj temperaturi, 1 čas. Kao kontrola vezivanja korišćena su anti-GAPDH (C4789, Linaris) i magareća anti-kozji IgG-HRP (sc-2020, Santa Cruz Biotechnology) antitela. Nivoi ekspresije proteina mereni su pomoću ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) nakon digitalizacije Super RX-N filmova (Fujifilm).
Elektroporacija/mikroinjekcija
Horizontalni uskougaoni isečci mozga dobijeni su od 2 NMRI golokoža miša sa S24 starim 131 dan, kao što je u struci poznato. Flaster-elektrode sa otporom 5-10 MΩ su napunjene lucifer žutom (5 mg/ml, LO259, Sigma Aldrich) i približene identifikovanim tumorskim ćelijama pod vizuelnom kontrolom pomoću 63x NA 1,0 potapajućeg sočiva (Zeiss). Boja je prebačena u tumorske ćelije pomoću instrumenta Axoporator 800A (Axon instruments) pulsevima sa kvadratnim naponom u trajanju od 1 ms na 50 Hz. Amplituda pulsa je podešena između -5V i -20V a trajanje celokupnog skupa impulsa podešeno je na 3 s kako bi se u cilju ćeliju dopremilo dovoljno obeleživača. Nakon elektroporacije, dobili smo dve sekvencijalne konfokalne kolone sa bojom (LSM 5, Zeiss).
Obrada slika
MPLSM slike su snimljene pomoću ZEISS ZEN softvera (Zeiss, Nemačka). Nakon primarnog računanja slika (npr., oduzimanja različitih kanala da se ukloni nespecifična pozadina), slike su prebačene u softver Imaris (Bitplane, Švajcarska) kako bi se omogućila 3D vizuelizacija, renderovanje i analiza podataka (videti ispod za detalje). Ovde je podskup slika filtriran Gausovim filterom nakon analize, a pre ekstrakcije. Za ilustrovanje različitih uglova pojedinačnih ravni, korišćene su slike sa projekcijama maksimalnog intenziteta (MIP) ili slike u 3D. Za primer ilustracije međusobnog povezivanja tumorskih ćelija i TM grana, z-kolone su ručno renderovane (tela tumorskih ćelija: funkcija površine; TM: funkcija praćenja filamenata). Kada je TM počinjala od jedne ćelije a završavala se u drugoj, te ćelije su označavane kao povezane. Serijske elektronske mikrografije su rekonstruisane pomoću OpenCAR softvera. 3D analiza EM slika izvedena je pomoću softvera Amira 5.4.6 (Visage Imaging, Richmond, Australija). Neki od podataka (npr. snimanje kalcijumskih struja) prebačeni su u ImageJ softver (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, SAD). Video snimci su izvezeni iz ZEN ili Imaris softvera i uređivani u softveru Adobe Premiere (Adobe Premiere Pro CS6, SAD).
1
Kvantitativno određivanje histologije i podataka dobijenih na osnovu MPLSM snimaka U tkivu tumora dobijenom od pacijenata (samo iz resekcija primarnih tumora), merena je maksimalna dužina TM u standardnim tankim IDH1-IHC presecima od 3 μm. Tu su TM podeljene u 3 grupe: <50 μm (koje se ne kvalifikuju kao definitivne TM, jer bi druge ćelijske strukture mogle da budu pogrešno identifikovane kao filamentozne strukture ove dužine); kraće TM od 50-100 μm, i duže TM od >100 μm. Kvantitativna analiza humanog IHC izvedena je pomoću Histo-Score (opseg 0-300) kao što je u struci poznato.
Za podatke dobijene snimanjem in vivo, brojevi TM, grane/TM i veze/ćeliji su brojane ručno, dok su dužine TM merene ručno u „slice” programu rada u softveru Imaris. Za kvantitativno određivanje i analizu tumorskih ćelija/TM pre i nakon radioterapije, ćelije su brojane u istim regionima pre zračenja ili lažnog tretmana, kao i u različitim vremenskim tačkama nakon toga. Ćelije bez veza preko TM definisane su kao „nepovezane” ćelije a ćelije sa najmanje jednom vezom preko TM kao „povezane“. Da bi se analizirao broj TM pre i nakon zračenja, TM pojedinačnih, identičnih ćelija brojane su u obe vremenske tačke. Izračunati su odnosi kako bi se odredile relativne promene brojeva ćelija i TM s protokom vremena. Za merenje zapremine tumora kod BT088 tumora pre i nakon radioterapije, analizirana su dva regiona po životinji pomoću funkcije za obradu površine softvera Imaris. Srednja vrednost brzine invazije tumorskih ćelija kod S24 shKontrola naspram shGAP-43 tumora određivana je analizom snimaka iz tri uzastopna dana, snimanih sa 24 časa razmaka, in vivo. Razdaljine tumorskih ćelija od glavne mase tumora (definisane kao poluprečnika od 0,5 mm oko centra glavnog tumora) analizirane su i grupisane, ili su prikazane kao pojedinačne razdaljine do centra glavnog tumora kod onih tumora koji su bili mnogo manje invazivni (oligodendrogliomi). Jedra i mitohondrije (podaci snimanja sa protokom vremena) označeni su pomoću funkcije tačke u softveru Imaris. Oni su povezani za markere za praćenje, pa je izračunata srednja brzina pomeranja markera za praćenje. Mitohondrije su klasifikovane kao mitohondrije koje se nalaze unutar TM („TM“) ili u telu tumorskih ćelija („soma“). Za kvantitativno određivanje i analizu intenziteta fluorescencije nakon primene SR101, sve tumorske ćelije koje eksprimiraju GFP u određenoj zapremini markirane su pomoću iste funkcije tačke softvera Imars, a zatim su srednje vrednosti intenziteta za SR101 kanal za ove tačke izračunate i međusobno upoređene.
Za analizu ćelija u koje je ubrizgana lucifer žuta, ove ćelije su grupisane kao „povezane” ili „nepovezane” u zavisnosti od njihove sposobnosti da prenesu boju u susedne ćelije pre analize srednjih vrednosti intenziteta fluorescencije lucifer žute u ovim ćelijama.
2
Ćelije pozitivne na Ki67 su brojane u dva regiona (masa glavnog tumora)/životinja, i podeljene ukupnim brojem jedara u tim regionima koji se boje pomoću DAPI.
Kvantitativno određivanje i analiza podataka snimanja kalcijumskih talasa
Tumorske ćelije ili nemaligni moždani astrociti ručno su obeleženi pomoću funkcije ROI Manager softvera ImageJ. Srednje vrednosti za sivu boju merene su u toku prolaska vremena. Ovi podaci su obrađeni u programu GNU Octave 3.8.1 (John W. Eaton, GPL): slike su normalizovane za pozadinsku fluorescenciju pomoću kliznog intervala od ± 10 slika. Lokalni maksimumi kalcijumskih signala detektovani su pomoću funkcije za pronalaženje maksimuma „findpeaks” (signal package, Octave-Forge). Tako je određen broj kalcijumskih maksimuma za svaku ćeliju (N) pa je izračunata frekvencija (f). Frekvencija je standardizovana za broj ćelija u svakom regionu, kako bi se osigurala uporedivost. Određene su sinhrone ćelije, broj sinhronih komunikacija i vremenska tačka u kojoj je došlo do sinhronog okidanja. Usled činjenice da su slike snimane u linijskom programu rada, što dovodi do latencije u detekciji signala, analiza je izvedena uzimajući u obzir pod 2 frejma oko svakog maksimuma. To je omogućilo ocenjivanje sinhroniciteta S (S∈R<÷>U {0}), koji je definisan kao udeo celog broja sinhronih ćelija (N_Syn) podeljen brojem kalcijumskih maksimuma za datu ćeliju (N_Ca). U slučaju da ćelije nisu bile aktivne, dodeljen im je sinhronicitet nula.
Stoga sinhronicitet navodi prosečan broj interakcija u istoj vremenskoj tački. Na primer, u sistemu koji ima sinhronicitet od 1, ćelija koja pušta signal („okida“) interaguje sa još jednom ćelijom. Za sinhronicitet od 10, jedna aktivna ćelija komunicira sa 10 drugih ćelija.
Za poređenje između različitih blokatora in vivo, sinhronicitet je normalizovan na neku početnu vrednost.
Konačno, rezultati su sumarno dati na toplotnoj mapi. Broj kalcijumskih maksimuma ovih ćelija kodiran je na toplotnoj mapi. Ćelije sa sinhronicitetom su povezane linijama, dok boja opisuje vremensku tačku u kojoj dolazi do sinhronog okidanja signala.
Za merenje relativnih promena u intenzitetu fluorescencije, tumorske ćelije su ponovo ručno obeležene, pa su izračunate relativne promene (deltaF/F0). F0 je definisana kao prosečan intenzitet 20% najnižih vrednosti za sivu u ROI.
Za kvantitativno određivanje unutarćelijskih koncentracija kalcijuma, intenziteti fluorescencije cpVenusCD i CFP su mereni u ćelijama povezanim preko TM i u nepovezanim ćelijama, pre i 2 dana nakon radioterapije, pomoću funkcije tačke softvera Imaris. Za svaku ćeliju, ove vrednosti su unesene u grafik pa je izvedena analiza putem linearne regresije. Veće vrednosti za r2 predstavljaju homogenu koncentraciju kalcijuma u različitim populacijama, dok niske vrednosti za r2 odslikavaju heterogene koncentracije kalcijuma u populaciji ćelija.
Kvantitativno određivanje i analiza MRI snimaka
Odabrani su isečci sa najvećom površinom tumora kod datog miša, pa su i tumor (hiperintenzivan na slikama sa post-kontrastnim pojačanjem na T2 sekvencama) i ceo mozak miša ručno segmentirani. Odnos ove dve površine je određen i upoređen između različitih grupa (n=6 miševa po grupi, t-testovi). Funkcionalna karakterizacija diferencijalne ekspresije iRNK
Sirovi podaci o sekvenciranju RNK (mapirani na gene) i obrađeni podaci za IDH-1/2 mutacije preuzeti su sa portala sa podacima The Cancer Genome Atlas (TCGA) 30. januara 2015. godine, a poslednji put ažurirani 6. maja 2015. Uz to, preuzete su i oznake za broj kopija (pomoću GISTIC 2.0) sa portala cBioPortal64 i 450k- kao i rezultati CNV-NMF-grupisanja sa portala Broad GDAC Firehose (http://gdac.broadinstitute.org/). Samo uzorci IDH mutanata koji su jasno grupisani ili u grupi sa kodelecijom, ili u grupi bez nje (i koji imaju odgovarajući profil sa brojem kopija) – 197 uzoraka (127 bez kodelecije, 70 sa kodelecijom) – sačuvani su za dalju analizu. Prvo je izvedena normalizacija i analiza diferencijalne ekspresije gena za brojače RNK sekvenciranja pomoću EdgeR package65 softvera, koja pretpostavlja negativnu binomnu distribuciju podataka dobijenih brojanjem, čime se filtriraju transkripti sa niskom ekspresijom. Diferencijalno aktivirani signalni putevi i nishodni efekti između IDH-mutantnih tumora sa kodelecijom i bez kodelecije su analizirani pomoću softvera Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN, Redwood City, CA, SAD) pomoću filtera za faktor promene od |1.5| i FDR-q< 0,0566 za listu sa ulaznim podacima. Ukratko, ovaj softver računa i vrednost preklapanja p (na osnovu Fišerovog egzaktnog testa) i aktivacionu ocenu z, koja se zasniva na statusu ekspresije aktivirajućih i inhibirajućih gena, za ručno unesene puteve i nishodne biološke funkcije. Za ovu eksplorativnu studiju, koja postavlja hipoteze, sačuvani su oni rezultati gde je p < 0,1 i z ocena > |1,5|.
4
Statistika
Rezultati analize slika prebačeni su u softver SigmaPlot (Systat Software, Inc., San Jose California, SAD) kako bi se testirala statistička značajnost odgovarajućim testovima (podaci su testirani za normalnost, primenom Šapiro-Vilk-Testa za jednaku varijansu). Kvantitativno određivanje su sprovodila dva nezavisna istraživača, pod „slepim” uslovima. Statistička značajnost je ocenjena dvosmernim Studentovim t-testom za podatke sa normalnom distribucijom. U suprotnom, za distribucije koje nisu normalne distribucije, korišćen je Man-Vitnijev test. Za više od dve grupe izvedena je jednosmerna ANOVA ili ANOVA za rang. Za analizu preživljavanja po Kaplan-Mejeru, izveden je log-rang test. Rezultati su smatrani statistički značajnim ako je p vrednost bila manja od 0,05. Veličine grupa životinja su empirijski odabrane, dok su longitudinalna merenja omogućavala smanjenje broja životinja uz održanje adekvatne moći. Ako je primenjen neki tretman, životinje su podeljene u grupe za te procedure metodom slučajnog odabira. Kvantitativni podaci za in vivo su obično prikazani kao srednja vrednost ± standardna devijacija. Izračunata frekvencija za snimke kalcijuma i vrednosti sinhroniciteta korigovane su za ekstremne vrednosti pomoću Nalimovljevog testa.
Za ispitivanja TTYH1, dobijeni kvantitativni podaci su prebačeni u softver SigmaPlot (Systat Software GmbH, Nemačka), da bi se ispitala statistička značajnost pomoću odgovarajućih testova. Skupovi podataka su testirani na normalnu raspodelu pomoću Šapiro-Vilkovog testa. Statistička značajnost podataka sa normalnom raspodelom ocenjivana je dvostranim Studentovim t-testom. Podaci koji nisu sa normalnom raspodelom procenjivani su primenom Man-Vitnijevog testa sume rangova. Za statističku analizu skupova podataka sa više od dve grupe, korišćena je ANOVA ili ANOVA za rangove sa odgovarajućim post-hoc testovima (Takijev test za ANOVU, Student Njuman Kejls i Danov test za ANOVU za rangove). Za analizu preživljavanja po Kaplan-Mejeru, izveden je log-rang test. Za korelaciju između koncentracije TTYH1 proteina i koeficijent korelacije, izvedena je analiza linearnom regresijom. Rezultati su smatrani statistički značajnim ako je p vrednost bila manja od 0,05.
Podaci sa kvantitativne MPLSM in vivo su prikazani preko srednje vrednosti, dok duži sa greškama prikazuju standardne devijacije. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001
Test invazije
Za proučavanje kapaciteta humanih GBMSC ćelija za invaziju in vivo, pojedinačni sferoidi GBMSC su zasejani u gel sa matriksom od kolagena I (Collagen I, A1048301, ThermoFisher Scientific; MEM, 31095-029, Gibco; Fibronectin, F2006, Sigma Aldrich) pa je širenje pojedinačnih GBMSC praćeno snimanjem na svetlosnom mikroskopu nakon 0 i 48 časova. Za kvantitativno određivanje, izmereno je radijalno rastojanje 60 najdaljih ćelija glioma koje su izvršile invaziju u punom obimu sferoida (oko 1 ćelija na 6°) i izraženo kao razlika u odnosu na srednje radijalno rastojanje sferoida nakon 0 časova.
Kvantitativno određivanje MPLSM snimaka i MRI podataka
Za ispitivanje TTYH1, podaci dobijeni putem MPLSM in vivo su analizirani pomoću softvera Imaris (Bitplane, Švajcarska) i ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Za merenje dužine TM, TM su merene ručno u programu rada za isečke („slice“) programa Imaris. Za merenje razdaljine invazije, radijalna razdaljina svih tumorskih ćelija koje su izvršile invaziju od granice glavne mase tumora merena je u Imaris softveru, u „slice” programu rada. Brzina invazije različitih podgrupa GBMSC in vivo određivana je praćenjem pojedinačnih tumorskih ćelija u toku tri vremenske tačke u roku od 24 časa na dan 20 (+/-1) od ubrizgavanja tumora. Udaljenost tumorskih ćelija od glavne mase tumora (definisane kao zone sa radijalnom širinom od 500 μm) merena je na slici iz jedne ravni. Broj TM po ćeliji, povezanost i brojevi ćelija pre i nakon terapije zračenjem određivani su ručno u istim regionima, u različitim vremenskim tačkama. Ćelija je klasifikovana kao povezana ako je najmanje jedna od njenih TM bila direktno povezana sa dva tela tumorskih ćelija. Za koeficijent invazije, broj ćelija na više od 1500 μm od centra glavne mase tumora stavljen je u proporciju sa površinom glavne mase tumora.
Za kvantitativno određivanje odnosa površine tumora/mozga na MRI snimcima, površine tumora i celog mozga merene su ručno na slajdovima sa post-kontrastnim pojačanjem na T2 sekvencama na kojima se nalazi najveća ekspanzija tumora.
RNK mikroniz i IPA analiza
Za analizu RNK mikroniza, ćelije su gajene ili u uslovima bez seruma, kojima se promoviše neadherencija, ili pod uslovima u kojima se promoviše adherencija, tokom 4 nedelje. Biološki uzorci u triplikatu su uzeti, pa su RNK izolovane pomoću RNeasy Mini kit (74104, Qiagen). RNK je eluirana u smeši TE/voda. Kvalitet ukupne RNK je proveren gel analizom pomoću testa na čipu za ukupnu RNK RNA Nano sa uređajem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technolgies GBMH, Berlin, Nemačka). Za analizu profila ekspresije odabrani su samo oni uzorci kod kojih je vrednost RNK indeksa bila veća od 8,5. Illumina Human Sentrix-12 BeadChip nizovi (Illumina, Inc.) su pripremljeni u skladu sa procedurom za obeležavanje uzoraka koju preporučuje Illumina, na osnovu modifikovanog Eberwine protokola. Skeniranje mikroniza je izvršeno pomoću iScan skenera. Podaci su izvučeni za svaku kvržicu (eng. bead) pojedinačno, dok su ekstremne vrednosti uklanjane kada bi apsolutna razlika u odnosu na medijanu bila veća od 2,5 puta MAD (2.5 Hampel postupak). Svi ostali podaci za pojedinačne kvržice su zatim kvantilno normalizovani. Da bi se ispitala značajnost, korišćen je Studentov t-test na vrednostima za ekspresiju za svaku kvržicu, za dve posmatrane grupe. U slučaju značajnosti ekspresije u odnosu na pozadinu, testirali smo tražeći veću od svih negativnih tačaka za taj uzorak, dok smo u slučaju poređenja odvojenih grupa testirali nejednakost srednjih vrednosti datih grupa. U oba slučaja primenjena je Benjamini-Hohberg korekcija na ceo komplet p-vrednosti svih ProbelD na čipu. Prosečna vrednost za ekspresiju računa se kao srednja vrednost izmerenih ekspresija zajedno sa standardnom devijacijom kvržica.
Spisak diferencijalno eksprimiranih gena unesen je u IPA analizu Ingenuity Pathways Analysis (Qiagen, Redwood City, CA, SAD) uz primenu faktora promene > |2.5| i FDR-prilagođene p-vrednosti < 0,05 kao kriterijuma za uključivanje. Ukratko, ovaj softver računa i vrednost preklapanja p (na osnovu Fišerovog egzaktnog testa) i aktivacionu ocenu z, koja se zasniva na statusu ekspresije aktivirajućih i inhibirajućih gena, za ručno unesene biološke funkcije. Da bi se dobila aktivaciona ocena za kategorije funkcija, računamo srednju aktivacionu ocenu z za sve funkcije obuhvaćene datom kategorijom, dok paralelno generišemo statistiku za tekući zbir koja se poveća za 1 kada se funkcija aktivira (z > 0) i smanji za 1 kada se funkcija inhibira (z < 0) i na kraju podeli brojem funkcija u datoj kategoriji. Ocena za kategoriju aktivacije računa se kao srednja z ocena * |tekući zbir| kako bi se naglasile homogeno aktivirane kategorije.
Primer 1:
Membranske cevčice kod progresije glioma
Da bi se proučila pojava i dinamika membranskih cevčica u tumorima sisara, gliomi koji rastu u mozgu miša praćeni su in vivo multifotonskom laserskom skenirajućom mikroskopijom (MPLSM) u tri dimenzije do dubine od 750 μm, u toku jedne godine. Nakon transplantacije ćelijskih linija glioblastoma dobijenih iz pacijenta (n=6), koje su gajene u uslovima bez seruma kojima se promoviše oblik nalik matičnim ćelijama (GBMSC; slika 2), mnoge tumorske ćelije su formirale izrazito duge ćelijske cevčice (nastavke). Ovi nastavci su se infiltrirali u normalno moždano tkivo na frontu invazije (slika 1a), gde su ih ćelije astrocitoma pružale i povlačile nazad u programu rada skeniranja. Analiza dinamike vrha nastavka (cevčice) pokazala je veliku pokretljivost (slika 21), slično kao kod konusa rasta neurona u toku razvoja. Kada je dolazilo do progresije tumora, broj ćelijskih cevčica se dalje povećavao, pri čemu su neke prevazilazile dužinu od 500 μm (slika 1b). Dobijene membranske cevčice su korišćene za praćenje kretanja jedara ćelija, npr. nakon ćelijske deobe (slika 1c). Posmatrani sumarno, ovi podaci ukazuju da je nastanak membranskih cevčica delotvoran način rasejavanja tumora, što je još jedan dodatak na poznate strategije.
Sve membranske cevčice bile su bogate aktinom (slika 1d), što je takođe karakteristično za većinu membranskih nanocevčica (MN). Dalje, imunohistohemija i snimanje u živom organizmu otkrili su da su one zaista okružene kontinualnom ćelijskom membranom i pozitivne na prisustvo miozina IIa, mikrotubula i proteina disulfid izomeraze; delimično su pozitivne na β-katenin, β-parvin i marker astrocita GFAP; ali uglavnom su negativne za N-kadherin, miozin X i neuronski marker β-tubulin III (slika 3a, b). Ovo sve zajedno ukazuje da ove membranske cevčice imaju jedinstven sastav i moćnu mašineriju za pokretljivost; nju dele sa drugim izduženim delovima ćelije, kao što su MN, filopode i neuriti. Dendritsko grananje bilo je često, sa tanjim membranskim cevčicama koje izviru iz debljih (slika 1 d, e). Iako su deblje cevčice često ostajale stabilne duži vremenski period, čak i do više od 100 dana (slika 3c), manje bočne grane su bile dinamičnije (slika 1e). Da bi se omogućila ultrastrukturna analiza ovih cevčica poreklom iz tumorskih ćelija u mozgu miša elektronskom mikroskopijom (EM), izvedena je fotooksidacija delova mozga. Ovo je dovelo do stvaranja tamnog taloga u ćelijskim cevčicama astrocitoma koji eksprimiraju zeleni fluorescentni protein (GFP) (slika 3d). Skenirajuća elektronska mikroskopija sa serijskim presecima (3D SEM) otkrila je da cevčice, okružene membranom, imaju površinu poprečnog preseka od 1,57 ± 0,33 μm<2>(n=6, slika 3e), i sadrže mitohondrije i vezikule (slika 1f), što ukazuje na lokalnu produkciju ATP-a i promet vezikula kroz cevčice. Zanimljivo je da su se mitohondrije brže kretale u tim membranskim mikrocevčicama, nego u telima ćelija (slika 3f). Dalje, 3D SEM je otkrila da relevantan broj membranskih mikrocevčica prati aksone u mozgu (19,6% od n=51; slika 1f, slika 3g), koji su poznate strukture koje usmeravaju rasejavanje tumorskih ćelija kod astrocitoma.
Snimanje razvoja membranskih cevčica in vivo u toku vremena otkrilo je da sve veći broj polazi od jedne, a završava se na drugoj ćeliji astrocitoma, stvarajući višećelijsku anatomsku mrežu (slika 1g, h). Velika količina međućelijskih membranskih cevčica takođe je pronađena u genetskom modelu astrocitoma gde ekspresiju GFP pokreće promoter „bezrepog” nuklearnog receptora (eng. nuclear receptor tailless) (Tlx), što označava subpopulaciju tumorskih ćelija sa karakteristikama matičnih ćelija (slika 3h). Međućelijske membranske cevčice bile su delimično rezultat deobe ćelija, sa dugotrajnim stabilnim kontaktom ćerki ćelija na velike razdaljine (slika 1c), ali su i rezultat spajanja ćelija astrocitoma koje nisu u srodstvu (slika 4a-f). Čini se da je nastanak membranskih cevčica u tumorskim ćelijama urođena odlika ćelija astrocitoma, koja nije ograničena na mikrookruženje unutar mozga (slika 4g). Mali deo ćelija astrocitoma koje nose membranske cevčice ostao je u fazi mirovanja mesecima, često u perivaskularnoj niši koja se dovodi u vezu sa svojstvom ćelija glioma da budu nalik matičnim ćelijama (slika 4h, i).
Međućelijski položaj mnogih membranskih cevčica astrocitoma, zajedno sa njihovim visokim sadržajem F-aktina, podseća na MN; ipak, MN koje su do sada opisane imale su širinu manju od 1 μm; dužinu od obično nekoliko desetina, retko nekoliko stotina μm; i dokumentovani životni vek kraći od 60 minuta. Ove razlike su dovele do predloga da se koristi novi izraz „tumorske mikrocevčice” ili TM za otkrivene ekstremno dugačke, dugoživeće i deblje membranske produžetke ćelija astrocitoma. Ovo ne isključuje mogućnost da bi MN tumorskih ćelija in vitro mogle da budu model za TM in vivo, gde su bili dostupni mnogo duži intervali za rast, u smislu dimenzija, stepena međućelijske povezanosti i povećanja funkcionalnosti.
Primer 2:
Tumorske mikrocevčice odlikuju gliome otporne na tretman
Da bi se ispitalo da li su TM takođe karakteristične za tumore mozga kod ljudi, obojena su tkiva glioma WHO II<o>-IV<o>dobijenih resekcijom, od pacijenata. Da bi se nedvosmisleno detektovale strukture izvedene iz tumorskih ćelija unutar parenhima mozga koji je bogat filamentima, korišćeno je antitelo protiv IDH1-R132H, specifično za mutaciju. Kao i kod mišjih modela astrocitoma, TM su bile obilate i kod humanih astrocitoma (slika 5a): 63% ćelija astrocitoma imalo je međućelijske TM (n=196 ćelija u 100 μm debelim isečcima n=8 WHO II°-III° tumora bez 1p/19q kodelecije). Ovaj broj se posebno dobro ogleda u ćelijskoj liniji S24 GBMSC u kasnijim vremenskim tačkama rasta unutar mozga miševa (slike 1b, h; dan 60), te je ovaj model izabran kao glavni model za dalje studije in vivo.
Nasuprot tome, samo 0,7% ćelija oligodendroglioma u uzorcima humanih tumora imalo je međućelijske TM (slika 5b; n=150 ćelija iz n=3 oligodendroglioma sa 1p/19q kodelecijom), kao i kod ćelija oligodendroglioma dobijenim iz pacijenata koje su izgradile tumore kod miševa (slika 6a, b). Dalja analiza 105 humanih glioma otkrila je da na nastanak TM snažno utiču tip i gradus tumora, sa veoma jasnom pozitivnom korelacijom dužine TM i nepovoljne prognoze; npr., bona-fide TM sa minimalnom dužinom od 50 μm u standardnim tankim isečcima mogle su da se detektuju kod samo 19% oligodendroglioma WHO II<o>ali kod 93% astrocitoma WHO IV<o>(=glioblastoma) (slika 5c). Kod astrocitoma, TM su čak otkrivene u kontralateralnoj hemisferi mozga koja je, makroskopski, bila bez tumora (slika 6c). Kod glioma koji su histološki klasifikovani kao WHO II-III<o>oligoastrocitomi, status 1p/19q kodelecije snažno je određivao dužinu TM u ovim, inače morfološki sličnim tumorima (slika 5d, slika 6d). Dalje, status 1p/19q davao je bolju predikciju pojave TM od morfološke klasifikacije glioma (slika 5e).
Ukratko, TM su karakteristične za gliome bez 1p/19q kodelecije, gde međusobno povezuju pojedinačne tumorske ćelije, ali najčešće nisu prisutne kod tumora sa 1p/19q delecijom. Ovo je prvi znak da bi TM mogle da igraju neku ulogu u otpornosti na tretman.
Primer 3:
Mreža koja komunicira
Unutarćelijski talasi kalcijuma (ICW) mogu da koordinišu aktivnosti pojedinačnih ćelija u višećelijskim tkivima, stvarajući funkcionalnu mrežu koja komunicira, a koja obuhvata astrocite normalnog mozga, neurone, i radijalne ćelije glije u toku razvoja CNS. Ispitivano je da li veze preko TM prenose ICW između rasejanih ćelija astrocitoma koji su povezani preko TM. Zaista, kombinovanjem i niskomolekulskih i genetski kodiranih kalcijumskih senzora u MPLSM in vivo, primećeni su obilni ICW dugog dometa, koji uključuju veliki broj ćelija astrocitoma u različitim regijama tumora. ICW su propagirani duž TM u oba smera (slika 7a, slika 8a). Dalja analiza je potvrdila da su ICW, mereni sinhronicitetom fluktuacija kalcijuma (videti odeljak Postupci za detaljne informacije) uglavnom bili ograničeni na ćelije astrocitoma sa TM vezama koje su mogle da se detektuju (slika 7 b, c), omogućavajući komunikaciju pojedinačnih ćelija sa ponovljivim obrascem (slika 7c, d; slika 8b, c).
Za MN, objavljeno je da su međućelijske veze in vitro ili sa otvorenim krajem, ili povezane preko pukotinastih međućelijskih veza. Ono što je zanimljivo jeste da se čini da je ovo drugo preduslov za propagaciju ICW. Tako je ispitana hipoteza da su pukotinaste međućelijske veze, koje omogućavaju razmenu malih molekula između ćelija, uključene u ICW u kojima posreduju TM. Zaista, farmakološka blokada pukotinastih međućelijskih veza smanjila je učestalost i sinhronicitet ICW kod GBMSC ćelija astrocitoma in vivo, ali ne i u istovremeno registrovanim astrocitima u regionu tog tumora (slika 7e). Inhibicija inozitol trifosfata (IP3), koji prolazi kroz međućelijsku vezu i koji je efektor propagacije ICW u kojoj posreduju pukotinaste međućelijske veze takođe je smanjivala ICW između ćelija astrocitoma (slika 8d). ATP receptori su još jedna komponenta propagacije ICW, a njihova blokada je smanjila ICW i kod malignih i kod normalnih astrocita (slika 8d). Funkcionalna veza pojedinačnih ćelija astrocitoma putem međućelijskih veza koje se dovode u vezu sa TM proverena je brzom distribucijom boje sulfohordamin 101 koja može da prođe kroz pukotinastu
4
međućelijsku vezu u ćelijskoj mreži tumorskih ćelija povezanih preko TM in vivo nakon lokalne injekcije (slika 7f), koja je inhibirana blokadom pukotinaste međućelijske veze (slika 7g). Dalji eksperimenti su potvrdili da je još jedan molekul koji može da prođe kroz pukotinastu međućelijsku vezu prenošen između ćelija koje su povezane preko TM (slika 8e-g), dok veliki molekuli koji ne mogu da prođu kroz pukotinastu međućelijsku vezu nisu bili prenošeni (slika 4c).
Ukratko, ovi podaci pokazuju da su TM od suštinskog značaja za povezivanje dve pojedinačne ćelije astrocitoma u funkcionalnu mrežu, preko pukotinastih međućelijskih veza, u čemu učestvuju i zona čvrstog tumora, i zona infiltracije tumora.
Primer 4:
Koneksin 43 povezuje TM
Da bi se odredilo koji je od 21 humanih koneksina koji grade pukotinastu međućelijsku vezu uključen u međućelijsku komunikaciju u kojoj posreduju TM kod astrocitoma, postavljena je hipoteza da nedostatak TM kod glioma sa 1p/19q kodelecijom može takođe da dovede do niže ekspresije odgovarajućih koneksina koji se dovode u vezu sa TM. Do danas su za različite koneksine, u vezi sa patologijom glioma, objavljeni međusobno suprotstavljeni rezultati, kao i višestruke funkcije. Analiza 197 uzoraka IDH mutantnih glioma iz TCGA skupa podataka otkrila je spisak diferencijalno eksprimiranih gena između tumora bez 1p/19q kodelecije i onih sa njom (tabela 1).
Tabela 1:
4
4
4
4
4
Od 20 koneksina za koji su mapirana očitavanja, samo koneksin 43 (Cx43, GJA1) je diferencijalno eksprimiran, i pronađeno je da je među 100 gena sa najjačim pojačanjem ekspresije (eng. upregulation) kod tumora bez 1p/19q kodelecije. Cx43 je jedan od važnijih koneksinskih proteina, takođe je veoma intenzivno eksprimiran u astrocitima, povezujući ih u funkcionalne i otporne višećelijske mreže. Kod glioma, potvrđena je snažna veza između zadržavanja 1p/19q i ekspresije Cx43 gena u tkivu tumora dobijenom iz pacijenata (slika 9a), kao i u primarnim ćelijskim linijama glioma (slika 8h). Konfokalna mikroskopija je pokazala tačkastu imunoreaktivnost Cx43, posebno u TM ćelija astrocitoma (slika 9b), što nije primećeno kod drugih koneksina kao što su Cx31 ili Cx37 (koji se nalaze na hromozomu 1p)
4
ili Cx26 (eksprimiran u normalnim astrocitima; slika 8i). Bitno je uočiti da je imunoreaktivnost Cx43 često bila locirana baš na mestu gde su se ukrštale dve TM (slika 9b). Mesta dodira pojedinačnih TM sa direktnim kontaktom membrana-membrana, takođe su otkrivena pomoću 3D SEM (slika 9c). Daljom analizom naših podataka o ICW otkrili smo da kalcijumski talasi mogu da se propagiraju preko tih ukrštanja, sa jedne TM na drugu (slika 7a, crvena strelica). Posmatrano zajedno, pukotinaste međućelijske veze sa Cx43 koje se dovode u vezu sa TM, uključujući i one između različitih TM na njihovim čestim mestima ukrštanja, stvaraju gustu mrežu za međućelijsku komunikaciju kod astrocitoma.
Da bi se ispitala funkcionalna uloga Cx43 proteina pukotinastih međućelijskih veza u progresiji astrocitoma, izvedeno je stabilno smanjenje ekspresije Cx43 pomoću shRNA kod GBMSC ćelija. Ovim je značajno smanjen sinhronicitet ICW in vivo (slika 9d) i udeo ćelija astrocitoma sa višestrukim TM u kasnijim vremenskim tačkama (slika 9e), što ukazuje na ulogu komunikacije u kojoj posreduju pukotinaste međućelijske veze preko Cx43 u dugoročnoj stabilizaciji TM. U skladu sa predloženom ulogom funkcionalnih TM u progresiji tumora, nedostatak Cx43 doveo je do manje veličine tumora na MRI snimcima (slika 9f) i boljeg preživljavanja (slika 9g).
Primer 5:
Otporna mreža koja sama popravlja svoja oštećenja
Da bi se razumela uloga TM u integritetu i otpornosti tumora, iskorišćena je činjenica da pojedinačne ćelije astrocitoma pokazuju izrazitu heterogenost tokom progresije tumora: dok se udeo ćelija povezanih preko TM povećavao s vremenom, značajan deo ćelija astrocitoma ostao je nepovezan (slika 1h). Ova heterogenost je omogućila ispitivanje diferencijalnih bioloških ponašanja TM-povezanih ćelija naspram TM-nepovezanih tumorskih ćelija. Da bi se ispitala uloga TM u popravljanju oštećenja in vivo, izvedena je selektivna ablacija pojedinačnih ćelija astrocitoma primenom fatalne doze laserskog zračenja na jedan mali deo zapremine njihovog jedra (1 μm<3>). Ako je ćelija astrocitoma u kojoj je izvršena ablacija prethodno bila deo mreže povezane preko TM, nove TM bi se pružile ka mrtvoj ćeliji, stabilizovale je, i u roku od nekoliko dana novo jedro putovalo bi, putem tih istih TM, na mesto gde je bila prethodna ćelija (slika 10a; n=8 rekonstitucionih događaja kod 8 tumorskih ćelija sa svetlosnim oštećenjem iz n=3 životinje). Ako bi ablacija bila izvršena kod ćelije koja nije povezana sa TM, takav mehanizam popravke je samo retko viđan (2/8 događaja kod n=3 životinje; p<0,01, Fišerov egzaktni test). Subletalno fotonsko oštećenje veće zapremine (0,5-1 x 10<6>μm<3>) koja se sastoji od 6-10 ćelija astrocitoma i normalnog moždanog parenhima dovodilo je do vidnog povećanja sadržaja tumorskih ćelija u roku od 2 dana (slika 10b). To je bila posledica brzog pružanja TM u tu oštećenu zonu, praćenog povećanjem gustine tumorskih ćelija (slika 10c).
Zatim je ispitivano da li su mreže tumorskih ćelija povezanih preko TM takođe otporne na citotoksične efekte radioterapije, koja je standardni tretman za gliome. Dok su ćelije povezane preko TM bile u velikoj meri zaštićene od ćelijske smrti, nepovezane tumorske ćelije su umirale, u relevantnim brojevima, nakon radioterapije (slika 10d, slika 11a, b). Dalje, ćelije astrocitoma povezane preko TM povećale su i broj svojih TM (slika 10e) i svoju kalcijumsku komunikaciju (slika 10 f, g) kao reakcija na radioterapiju. Slično tome, smanjenje ekspresije Cx43 smanjilo je radioprotektivni efekat međusobnih veza preko TM, dok su ćelije astrocitoma koje nisu povezane preko TM pokazale regresiju kao kod kontrolnih tumora (slika 10h). To govori o ulozi funkcionalnih pukotinastih međućelijskih veza sa Cx43 u otpornosti na radioterapiju u kojoj posreduju TM.
Da bi se istražili mogući mehanizmi zaštite od citotoksičnosti u kojoj učestvuju TM, merene su početne koncentracije unutarćelijskog kalcijuma pre i tokom radioterapije, pomoću ratiometrijskog indikatora za kalcijum. Bazalne koncentracije kalcijuma bile su veoma homogene u neozračenim ćelijama, kao u kod ćelija povezanih preko TM tokom radioterapije, dok su nepovezane ćelije razvile visoku varijabilnost svojih unutarćelijskih koncentracija kalcijuma tokom zračenja (slike 11 c-f). Povećanje unutarćelijskih koncentracija kalcijuma potrebno je za citotoksičnost koju izaziva radioterapija, i čak i mala povećanja kalcijuma učestvuju u urođenoj apoptozi ćelija glioma. Može se spekulisati da unutarćelijske TM mogu da služe kao sredstvo za pojedinačne ćelije da distribuiraju male molekule poput kalcijuma unutar većih mreža, čime se postižu koncentracije koje nisu smrtonosne.
Sve ovo zajedno doprinosi argumentu da međućelijska komunikacija putem TM igra važnu ulogu u primarnoj i adaptivnoj otpornosti na radioterapiju. Ukratko, ovi rezultati govore u prilog ulozi TM u rezistenciji ćelija astrocitoma na stres iz okruženja kao i u komunikaciji u slučaju neželjenih događaja, što na kraju dovodi do koordinisanog preživljavanja i, ukoliko je potrebno, popravke oštećenja.
Primer 6:
GAP43: pokretač nastanka TM
Zatim su napori usmereni ka identifikaciji ključnih molekulskih puteva koji pokreću nastanak TM, kako bi se bolje razumela njihova priroda i kako bi se pronašli dodatni dokazi za njihovu ulogu u progresiji i rezistenciji tumora. Za ove svrhe prvo su analizirani skupovi podataka humanih glioma sa 1p/19q kodelecijom naspram onih bez te kodelecije in silico
1
(tabela 1) pomoću IPA analize. Ovde su putevi koji su bili značajno aktivirani u gliomima bez 1p/19q kodelecije obuhvatali „ćelijsko kretanje” i „međućelijsku signalizaciju i interakciju“, što govori u prilog predloženoj funkciji TM u ovim tumorima (slika 12a, b). Vrlo je zanimljivo da su pronađeni mnogi putevi koji su uključeni u rast neurita, i membranskih nastavaka nalik neuritima, a koji su bili više aktivirani kod glioma bez 1p/19q kodelecije, uključujući integrin, fosfolipazu C, GTPaze iz Rho familije, HMGB1 kao i protipični signalni put neurotrofin/TPK (slika 12c). Ovaj poslednji je potvrđen na proteinskom nivou kod humanih glioma, gde su NGF (koji se nalazi na 1p) i NT-4 (19q) smanjeno eksprimirani kod tumora sa 1p/19q kodelecijom, kao i njihovi odgovarajući membranski receptori TrkA i TrkB, što je opisano i ranije (slika 13a). Svi zajedno, ovi podaci ukazuju da nastanak TM u tumorskim ćelijama i neuritima (i produžecima nalik neuritima) u nemalignim ćelijama dele ne samo mnoge morfološke, već potencijalno i molekulske karakteristike.
Prilikom pregleda literature za poznate nishodne efektore koji bi bili od posebnog značaja za nastanak neurita i membranskih nastavaka nalik neuritima, protein GAP-43 koji se dovodi u vezu sa rastom (eng. growth-associated protein, GAP) izbio je na istaknuto mesto. GAP-43 je visoko eksprimiran u konusima aksona u kojima se odvija rast aksona, indukuje ga signalizacija preko neurotrofinskog receptora, i on pokreće ćelijsku migraciju neuronskih progenitorskih ćelija. Fascinantno je da je preterana ekspresija GAP-43 dovoljna za rast membranskih cevčica u neuronima, pa čak i u ćelijama koje nisu neuroni. Zapravo, GAP-43 je značajno više eksprimiran u humanim gliomima bez 1p/19q kodelecije (slika 14a), i primarnim ćelijskim linijama (slika 14a, slika 13b) u poređenju sa onima sa 1p/19q kodelecijom. Treba uočiti da je GAP-43 preferencijalno lokalizovan na konusnim vrhovima TM koje se tek pojavljuju, a koji su negativni za nestin (slika 14c), slično kao što je obilno prisutan u konusima u kojima se odvija rast nerava (eng. nerve growth cone).
Da bi se omeo nastanak TM u toku progresije astrocitoma, izrađene su GBMSC ćelije sa genetski smanjenom ekspresijom GAP-43. Iako vijabilnost ovih ćelija in vitro nije pretrpela nikakve promene, njihove TM in vivo bile su strukturno abnormalne, sa smanjenim grananjem (slika 14d). To je dovedeno u vezu sa smanjenim rasejanjem tumorskih ćelija (slika 14e, slika 13c), koja je posledica i njihove smanjene brzine invazije (slika 14f) i kapaciteta za deobu (slika 14g) u mozgu miša. Važno je uočiti da su međućelijske veze preko TM (slika 14h) i ICW (slika 14i) smanjene kod tumora deficijentnih za GAP-43, što prati i selektivno smanjenje ekspresije proteina Cx43 za pukotinaste međućelijske veze (slika 13d). Ovi nedostaci u funkcionalnostima progresije tumora u kojima posreduju TM dovode do vidnog smanjenja dimenzija tumora u mozgu miša (slika 14j), kao i do boljeg preživljavanja životinja (slika 14k).
2
Kada je primenjena radioterapija, deficijencija GAP-43 dovela je do povećane regresije tumorskih ćelija, što se videlo na repetitivnim MPLSM in vivo. Ovo je potvrđeno pomoću MRI 60 dana nakon zračenja, kada nije bilo moguće otkriti nikakve promene signala kod životinja koje su nosile shGap43 tumor, dok su shRNA kontrolni tumori bili veliki, dovodeći do neuroloških simptoma kod miševa (slika 14m). Histološka analiza u ovoj vremenskoj tački potvrdila je rasprostranjen i difuzan rast tumora u kome učestvuje kontralateralna hemisfera kod kontrolnih životinja, ali samo male ostatke tumorskih ćelija deficijentnih za proliferaciju kod tumora sa smanjenom ekspresijom GAP-43 (slika 14n).
Konačno, protein GAP-43 je preterano eksprimiran u ćelijama primarnog oligodendroglioma sa 1p/19q kodelecijom, kako bi se postigle koncentracije proteina slične onima u ćelijskim linijama GBMSC koje ne nose 1p/19q kodeleciju (slika 13e), koje su gajene u kulturi u uslovima kojima se promoviše nastanak ćelija nalik matičnim. To je dovelo do morfološke promene ka fenotipu koji je bogat TM cevčicama i nalik astrocitomu u ćelijama oligodendroglioma koje preterano eksprimiraju GAP-43 (slika 14 o, p). Zanimljivo je da je indukcija izgradnje TM u ovim tumorima dovela do povećanja invazije tumorskih ćelija u mozak (slika 14q), kao i do povećane rezistencije na zračenje (slika 14r); i jedna i druga bile su komparativno niskog nivoa kod kontrolnih oligodendroglioma.
Primer 7:
Ttyh1: još jedan pokretač nastanka TM
Kako bi se pronašlo još ključnih molekulskih pokretača nastanka i funkcionalnosti TM, poređeni su profili ekspresije gena GBMSC ćelija gajenih u uslovima kojima se promoviše nastanak neurosfera nalik matičnim ćelijama (koje su u stanju da kolonizuju mozak posredstvom TM u roku od 7 dana), i GBMSC ćelijskih linija gajenim u uslovima u kojima se promoviše adherencija, sa serumom (ne mogu da formiraju TM i da kolonizuju mozak miša u roku od 100 dana). Ovde je GAP-43 protein pokazao najveću diferencijalnu ekspresiju, pojačan kod GBMSC nalik matičnim ćelijama, što je potvrdilo ključni značaj GAP-43 za izgradnju TM i funkciju ukratko opisanu u primeru 6. Dalje, kod ovog skrininga, identifikovan je i Ttyh1, koji je ranije doveden u vezu sa razvojem neurona i homeostazom kalcijuma, a koji je treći po redu diferencijalne ekspresije gena (od više od 10.000 gena mapiranih u ovom skriningu), opet povećano eksprimiran kod GBMSC nalik matičnim ćelijama. Ono što je zanimljivo je da se Ttyh1 nalazi na hromozomu 19q, a da je ekspresija proteina bila viša kod GBMSC bez 1p/19q kodelecije nego kod ćelija oligodendroglioma sa 1p/19q kodelecijom. Shodno tome, i ekspresija iRNK za Ttyh1 je značajno povećana u humanim gliomima bez 1p/19q kodelecije, u poređenju sa onima sa ovom kodelecijom (8-struko, p=1,74 x 10<-16>, Tabela 1). Podršku hipotezi o centralnoj ulozi Ttyh1 u nastanku TM daje činjenica da je deficijencija za Ttyh1 dovela do manjeg broja i veoma aberantih TM kod astrocitoma (slika 15a). Shodno tome, invazija u mozak i proliferacija bile su drastično smanjene kada je smanjena ekspresija Ttyh1 (slika 15b), što je dovelo do snažne inhibicije rasta tumora u mozgu miša (slika 15c), i konačno do vremena preživljavanja koja su bila više nego duplo duža u poređenju sa kontrolnim životinjama (slika 15d).
Primer 8:
Skrining za otkrivanje novih gena relevantnih za TM
Da bi se ispitao nastanak i funkcije TM kao i da se prostudiraju potencijalni molekulski pokretači, ćelije primarnog glioblastoma iz tumora izvađenih resekcijom gajene su u uslovima u kojima ne dolazi do diferencijacije i adhezije, već se promoviše nastanak ćelija nalik matičnim (GBMSC), te je praćen dinamični rast tumora u mozgu miševa pomoću repetitivne multifotonske laserske skenirajuće mikroskopije (MPLSM) in vivo. Ova tehnika omogućava proučavanje rasta tumora mozga, i ćelijskog ponašanja pojedinačnih ćelija tumora, u toku minuta, časova, dana, čak i po nekoliko meseci, duboko u mozgu živih miševa. Već nakon 2 nedelje od implantacije, GBMSC su tipično pružale veći broj TM u mozgu živih miševa, i počinjale sa delotvornom invazijom (slike 16 A, C). Nasuprot tome, gajenje istih ćelija glioblastoma u uslovima koji dovode do diferencijacije, sa serumom, tokom četiri nedelje in vitro dovelo je do značajnog ometanja nastanka TM in vivo tokom mnogo nedelja, što je pratila značajno ometena invazija tumorskih ćelija u mozak miša (slika 16 B-D). Zanimljivo je da, kada je proces praćen mesecima intravitalnom mikroskopijom, ovi inhibitorni efekti na TM i invaziju bili su reverzibilni. Oko stotog dana sporog rasta in vivo, gliomi izvedeni iz onih ćelija glioblastoma koje su gajene u kulturi pod uslovima kojima se promoviše diferencijacija in vitro naglo su se transformisali u invazivne tumore koji obilno grade TM, koji u tom trenutku nisu bili mnogo različiti od njihovih brzo napredujućih parnjaka u slučajevima gde su ćelije glioblastoma gajene u uslovima kojima se favorizuje nastanak ćelija nalik matičnim ćelijama in vitro (Slika 16 E, F). Uzimajući u obzir ove nalaze postavljena je hipoteza da uslovi za gajenje ćelijske kulture in vitro u kojima se favorizuje diferencijacija nisu u potpunosti istrebili subpopulacije tumorskih ćelija sa relevantnim TM, već su smanjili ekspresiju gena relevantnih za TM i za invaziju u široj populaciji tumorskih ćelija – što je, u načelu, reverzibilno kada se ove ćelije kasnije ponovo obrazuju u mikrookruženju unutar mozga. Tako je bilo moguće da se izvede analiza mikroniza za ekspresiju gena u kojoj su poređene ćelije glioblastoma gajene
4
pod jednim i pod drugim uslovima. IPA analiza i ocena relativne aktivacije puta otkrile su da su putevi koji učestvuju u ćelijskom kretanju ti koji se najviše aktiviraju u uslovima u kojima se promoviše nastanak ćelija sličnih matičnim ćelijama, u poređenju sa uslovima sa serumom (slika 16G, slika 17). Ova tri gena: za protein koji se dovodi u vezu sa rastom 43 (GAP-43), VGF (nema akronim) i za tweety homolog 1 (TTYH1) eksprimirani su u najvećoj meri u uslovima u kojima se promoviše nastanak ćelija sličnih matičnim ćelijama u poređenju sa uslovima u kojima se promoviše diferencijacija (Tabela 2), što je potvrđeno na proteinskom nivou (slika 17A). Sva tri gena već su ranije dovedena u vezu sa razvojem CNS-a (posebno neuronalnim). GAP-43 je jedini gen za koji se do sada zna da promoviše nastanak i funkciju TM, koji što govori u prilog potencijalu ovog skrininga za identifikaciju gena relevantnih za TM.
Tabela 2
Primer 9:
Dva nova kandidata za nastanak TM
Čini se i da VGF i TTYH1 imaju funkciju u rastu neurita, zbog čega je interesantno bilo ispitati da li su geni, koji su u prethodnom skrining testu bili na drugom i trećem mestu po broju bodova, takođe uključeni u rast TM. Iako je VGF eksprimiran u GBMSC ćelijama, moguće ga je detektovati i u ćelijskim telima kao i u TM (slika 18B), vidno smanjenje njegove ekspresije pomoću shRNA (slika 18C) nije dovelo ni do kakvih razlika u obrascu rasta glioma u mozgu, uključujući i nastanak TM (slika 18D). Ovaj očigledni izostanak funkcionalnog uticaja VFG ukazao je da treba nastaviti analizu TTYH1. Da bi se otkrili subcelularni odeljci u kojima je lokalizovan TTYH1, izvedeno je imunocitohemijsko bojenje GBMSC, koje je pokazalo da je TTYH1 preferencijalno lokalizovan u tačkastim strukturama unutar tela ćelija, duž membrane ćelijskih nastavaka nalik na TM i, najuočljivije, na njihovim konusnim vrhovima (slika 19A). Dalje, sprovedeno je imunohistohemijsko bojenje S24 glioma i uzoraka humanih tumora da bi se ispitalo da li TTYH1 može takođe da se nađe u TM u mozgu miša, kao i u humanom astrocitomu. Kako je TTYH1 donekle eksprimiran u normalnom mozgu, izvedeno je ko-imunofluorescentno bojenje anti-TTYH1 antitelom zajedno sa bojenjem specifičnim za ćeliju (antitelo specifično za IDH1-R132H mutaciju za uzorke humanih tumora, anti-humani nestin za GBMSC ćelije koje rastu u mozgu miša). Ovo omogućava nedvosmislenu detekciju tumorskih ćelija i njihovih filamentoznih TM nastavaka u parenhimu mozga koji je bogat filamentima. Bojenje je otkrilo heterogenu ekspresiju: dok su neke TM bile snažno pozitivne na prisustvo TTYH1 (vrhovi strelica na slikama 19B i C), mnoge TM su bile negativne za prisustvo TTYH1 (strelice na slikama 19 B-D). Treba uočiti da su pojedinačne ćelije tumora imale i TM pozitivne, i TM negativne za TTYH1 (slika 19C). Kod humanih astrocitoma, velika većina (86,4 ± 5,35%, 6 regiona iz n=3 pacijenta) svih tela tumorskih ćelija bila je pozitivna na TTYH1, a neke su imale TM jasno pozitivne na TTYH1 (slika 19D). Dalje, pronađena je kolokalizacija TTYH1 i integrina α5, koja je najintenzivnija na konusnom vrhu sa kojeg raste TM (slika 19E). Ovi nalazi zajedno ukazuju na potrebu da se ispita uloga Ttyh1 u formiranju i funkciji TM, uz istovremeno preispitivanje relevantnosti TTYH1 za sve TM i(li) za sve funkcije koje su u vezi sa TM.
Primer 10:
TTYH1 pokreće invaziju ćelija glioma i od ključnog je značaja za morfologiju TM Ekspresija proteina TTYH1 u različitim GBMSC ćelijama (slika 20A) je u korelaciji sa sposobnošću ovih ćelijskih linija da delotvorno izvrše invaziju u moždano tkivo in vivo (slika 20B). Ovo je prva indikacija da bi TTYH1 mogao zaista da bude funkcionalno relevantan za invaziju ćelija glioma. Smanjenje ekspresije TTYH1 pomoću shRNA potom je izvedeno kod tri visoko invazivne GBMSC ćelijske linije koje eksprimiraju TTYH1 – S24, T269 i T1, kako bi se ispitalo da li smanjena ekspresija TTYH1 dovodi do smanjenja nastanka i(li) funkcije TM. T1 GBMSC ćelije nisu preživele ovo smanjenje ekspresije, te su uginule in vitro, dok su kontrolne ćelije sa transduciranom shKontrola preživele. Nasuprot tome, kod S24 i T269 GBMSC, ukupna vijabilnost ćelija in vitro nije ni malo oštećena (podaci nisu prikazani) smanjenjem ekspresije TTYH1 (slika 21A).
Kako je TTYH1 bio obogaćen i u invazivnom vrhu TM, i korelirao je sa kapacitetom za invaziju različitih GBMSC ćelijskih linija, sledeće ispitivanje proučavalo je kapacitet za invaziju kod tumorskih ćelija koje su transducirane sa shRNA i shKontrola in vitro i in vivo. In vitro, smanjenje ekspresije TTYH1 dovelo je do smanjene invazije u matriks kolagena I (slika 20 C). Da bi se ispitalo da li je ovo inhibitorno dejstvo takođe prisutno u kompleksnom vanćelijskom matriksu i mikrookruženju živog mozga, trodimenzionalna migracija pojedinačnih ćelija glioma u rastućem tumoru mozga praćena je tokom 24 časa primenom in vivo MPLSM. Ovim je otkriveno skoro četvorostruko smanjenje prosečne brzine invazije tela ćelija kod onih ćelija kod kojih je smanjena ekspresija TTYH1 (slike 20 D-F). Ćelije glioma u kontrolnim tumorima efikasno su izvršile invaziju u mozak, dinamički pružajući svoje TM (slika 20D), ali je invazija smanjena na minimum kod shTTYH1 GBMSC ćelija (slika 20 E, F).
Nakon implantacije u mozak miša, mogle su se uočiti izrazite odlike shTTYH1 GBMSC ćelija: njihove TM, koje su glavni način invazije (slika 20 D, E) često su pokazivale morfološke abnormalnosti nalik na niske kvržica (slika 20 G, H). Ovaj fenomen ranije je uočen nakon in vitro utišavanja (eng. silencing) TTYH1 u neuronima u hipokampusu. Iznenađujuće je da morfologija subpopulacije GBMSC sa višestrukim vezama preko TM sa drugim tumorskim ćelijama nije izmenjena smanjenjem ekspresije TTYH1 posredstvom shRNA, što obuhvata i normalan izgled njihovih TM in vivo (slika 21B). Iako je i TTYH1 lociran u nekim TM u ovoj subpopulaciji (slika 19C), on nije imao nikakvo očigledno morfološko dejstvo na ovu podvrstu ćelija i njihove TM.
Primer 11:
Heterogenost i invazivnost ćelija i TTYH1
U toku analize ponašanja pojedinačnih GBMSC ćelija u živom mozgu, uočeno je da postoje jasno odvojene podgrupe ćelija, u smislu intenziteta i obrasca formiranja TM, koje se mogu reprodukovati u različitim GBMSC ćelijskim linijama (slika 22 A, slika 21C). Ovi morfološki podtipovi takođe su mogli da se nađu u uzorcima humanih astrocitoma (slika 22 B), gde su tumorske ćelije slično podeljene u subkategorije prema broju svojih TM. Najjasnije su se izdvojila četiri podtipa: tumorske ćelije bez TM; sa 1 TM (unipolarne ćelije); sa 2 TM (bipolarne ćelije) i sa više od 4 TM (multipolarne ćelije).
Smanjenje ekspresije TTYH1 smanjilo je relativni udeo ćelija sa 1 ili 2 TM, dok je populacija onih sa 4 TM bila relativno (ali ne i apsolutno) povećana (slika 22C). Da bi se bolje razumeli ovi potencijalni podtipovi ćelija i da bi se isključila mogućnost da već sama integracija u gusto tkanu višećelijsku mrežu sama po sebi ometa migraciju ćelija glioma, analizirana je brzina invazije tumorskih ćelija u populacijama sa 0 TM naspram onih sa 1 ili 2 TM, naspram onih sa >4 TM, za kontrolne ćelije i za shTTYH1 gliome. Ova analiza otkrila je da tela tumorskih ćelija tumora mozga sa 1 ili 2 TM značajno brže vrše invaziju od ćelija bez TM, ili onih sa više od 4 TM (slika 22D). Video analiza ćelijskog kretanja in vivo u toku 2-3 časa potvrdila je da kontrolne tumorske ćelije sa 1-2 TM pokazuju intenzivnu dinamiku u živom mozgu, dok su one sa mnogo TM pokazivale mirniji fenotip. Smanjenje ekspresije TTYH1 smanjilo je brzinu invazije ove populacije tumorskih ćelija koje su izrazito pokretljive, a koje imaju 1-2 TM (slika 22D). Nasuprot tome, posebno bogate međućelijske veze u kojima posreduju TM kod onih GBMSC ćelija koje imaju više od 4 TM, što bi moglo da smanji njihov invazioni kapacitet, bile su očuvane kod shTTYH1 tumora u poređenju sa kontrolama (slika 21D). Sve u svemu, ovi podaci ukazuju da je smanjenje invazionog kapaciteta ćelija kod kojih je smanjena ekspresija TTYH1 kombinovano dejstvo proporcionalnog smanjenja posebno invaziono-kompetentne subpopulacije tumorskih ćelija sa 1 ili 2 TM, i dodatni deficit pokretljivosti kod preostalih ćelija ovog podtipa.
Primer 12:
Rast glioma je značajno smanjen kod TTYH1 deficijencije
Da bi se ispitalo da li kompromitovana morfologija i funkcija TM kod shTTYH1 GBMSC ćelija sprečava njihovu delotvornu kolonizaciju mozga, izvedeno je in vivo MPLSM snimanje velikih regija mozga. Dok su kontrolni tumori pokazali difuznu infiltraciju u cele hemisfere mozga, pri čemu su mnoge ćelije migrirale dalje od 1 mm od glavnog tumora (slika 23A), S24 GBMSC ćelije kod kojih je smanjena ekspresija TTYH1 rasle su samo u okviru mesta implantacije, sa tek nekoliko tumorskih ćelija koje su izvršile invaziju u mozak (slika 23 B, E). Kod T269 GBMSC, visokoinvazivne ćelijske linije glioma koja pokazuje veoma difuzan obrazac rasta, smanjenje ekspresije TTYH1 pomoću shRNA dovelo je do vidnog smanjenja ukupne tumorigeničnosti in vivo, sa tek nekoliko preostalih tumorskih ćelija koje se mogu detektovati u parenhimu mozga nakon mnogo nedelja (slike 23 C, D, F).
Da bi se ispitalo dejstvo smanjenja ekspresije TTYH1 na bruto rast tumora mozga, S24 tumori su analizirani posle više od 70 dana rasta pomoću MRI visokog polja. Model S24 je odabran zbog toga što je, od sve tri testirane ćelijske linije GBMSC, na S24 GBMSC ćelije najmanje uticalo smanjenje ekspresije TTYH1, uz očuvanje određenog kapaciteta za kolonizaciju mozga in vivo. Vidno smanjenje veličine tumora na MRI snimcima usled smanjenja ekspresije TTYH1 bilo je očigledno, uz minimalne promene signala poreklom od tumora, i sa srednjom vrednošću pomeranja središnje linije od samo 0,08 (±0,07) mm (slika 23G). Istovremeno, kontrolni tumori su bili veoma veliki i zauzimali dosta prostora, šireći se preko cele hemisfere (slika 23G), što je dovelo do značajnog efekta mase sa srednjom vrednošću za pomeranje središnje linije od 1,35 mm (0,16 mm) (p=<0,001) i neurološkim simptomima. Ono što je najvažnije, jeste da je inhibicija progresije glioma smanjenjem ekspresije TTYH1 značajno unapredila klinički tok bolesti, sa ogromnim povećanjem medijane vremena preživljavanja (sa 75 na 182 dana; slika 23H) u ovom životinjskom modelu malignog glioma, koji umnogome blisko odslikava ovu bolest kod ljudi.
Primer 13:
Što je mreža tumorskih ćelija bolje međusobno povezana, to je otpornija na zračenje Konačno, cilj je bio da se pojasni da li smanjenje ekspresije TTYH1 takođe utiče na drugu ključnu funkciju u kojoj posreduju TM: međusobnu povezanost pojedinačnih ćelija glioma u jednu veliku, otpornu višećelijsku mrežu. Kako je relativni udeo ćelija koje nose više TM bio smanjen u malim tumorima u kojima je smanjena ekspresija TTYH1 sa niskom gustinom ćelija (slika 22C), ispitivano je da li to dovodi do nastanka višećelijskih mreža koje su intenzivnije međusobno povezane. Zaista, anatomsko međućelijsko povezivanje preko TM bilo je povećano u tumorima u kojima je smanjena ekspresija TTYH1 (slika 24A).
Pokazano je da veća međusobna povezanost TM dovodi do veće rezistencije ćelija glioma na citotoksična dejstva radioterapije. Shodno tome, retke i deficijentne u pogledu invazivnosti, ali gušće međusobno povezane ćelije glioma u kojima je smanjena ekspresija TTYH1 bile su veoma rezistentne na terapiju zračenjem, u poređenju sa kontrolnim tumorima (slika 24B). Bliža analiza otkrila je da su citotoksični efekti zračenja zaista uglavnom ograničeni na tumorske ćelije koje nisu povezane preko TM, dok su GBMSC ćelije povezane preko TM bile uglavnom zaštićene (slika 24 C) – i to je bilo veoma slično kod shTTYH1 i kontrolnih glioma (slika 24 C). Zajedno, ovi podaci govore o funkcionalno neometanim međusobnim vezama između tumorskih ćelija u kojima posreduju TM uprkos deficijenciji za TTYH1, čime je očuvana radiorezistencija ovih tumora, koji su inače deficijentni u pogledu rasta.
Diskusija:
U neuroonkologiji se već dugo postavlja pitanje zašto je kodelecija hromozomskih delova 1p i 19q kod glioma povezana sa mnogo boljim tokom bolesti, a posebno unapređenim preživljavanjem nakon citotoksične terapije. Takođe, razlog za agresivno biološko ponašanje glioma bez kodelecije, koji obuhvataju primarne glioblastome, nije u potpunosti razjašnjen. Ovde je pokazano da je sposobnost građenja izrazito dugih i visoko funkcionalnih TM putem adekvatne ekspresije GAP-43 i Ttyh1 važna determinanta napredovanja bolesti i otpornosti na terapiju kod tumora mozga bez 1p/19q kodelecije.
Konačno, ovi podaci podržavaju ideju da su tumori kompleksni organi, što je dosad pripisivano doprinosu nemalignih tipova ćelija, uključujući neurone, tumorima mozga. Ova studija dopunjava ovaj koncept time što pokazuje da pojedinačne ćelije kancera u jednom tumoru međusobno komuniciraju i sarađuju jedne sa drugima na kompleksan, ali uređen način koji i sam podseća na funkcionalni organ. Postalo je jasno da tumori mogu da otmu programe koji su deo normalnog razvoja tkiva. Ključni nalaz ove studije je da TM, koje nastaju sličnim mehanizmima kojima nastaju i aksoni u neuronima, predstavljaju način na koji tumorske ćelije koje su izvršile invaziju komuniciraju sa svojim srodnim ćelijama na velikim razdaljinama, što dovodi do optimalne funkcionalnosti, efikasne progresije tumora i – specifično preko GAP-43 – otpornosti na neželjene događaje kao što je radioterapija (slika 13f). Tako usmeravanje farmakološke intervencije na izgradnju i funkciju TM doprinosi pokušajima da se nađe Ahilova tetiva tumora mozga rezistentnih na tretman.
Ne samo to, rezultati predmetne studije ukazuju da postoje najmanje dve različite podvrste ćelija glioma koje uspešno grade TM: jedna, koja je naročito invazivna, sa po 1-2 TM, gde je TTYH1 od funkcionalnog značaja, i druga, sa višestrukim TM, koja obično gradi višećelijsku mrežu sa drugim ćelijama glioma; na ovu drugu, čini se, ne utiče ometanje TTYH1.
Prvo je sprovedena analiza mikroniza u kojoj su poređene ćelije primarnog glioblastoma koje su gajene u dva različita skupa uslova in vitro (koji su ih činili ili veštim u formiranju TM, ili privremeno deficijentnim za TM in vivo), koja ne samo da je potvrdila da je GAP-43 pokretač formiranja TM, već je i identifikovala nove kandidate, VGF i TTYH1. Od ova dva kandidata, samo je smanjenje ekspresije TTYH1 dovelo do značajnog fenotipa GBMSC in vitro i in vivo. Dalje potvrđujući validnost ovog pristupa skriningu, gen OLIG2,
1
koji je identifikovan kao rangiran na petom mestu po stepenu pojačanja ekspresije (upregulation) u uslovima rasta u kojima se promoviše sličnost matičnim ćelijama, povezan za to svojstvo sličnosti sa matičnim ćelijama kod ćelija glioblastoma, kao i za razvoj CNS-a. U sličnom skriningu koji je izveden sa 6 različitih ćelijskih linija primarnih glioblastoma, sva tri gena GAP-43, TTYH1 i OLIG2 su bila među 20 najviše rangiranih gena po stepenu pojačanja ekspresije u uslovima koji promovišu sličnost sa matičnim ćelijama, naspram onih koji promovišu diferencijaciju.
TTYH1 je membranski protein koji ima hloridnu provodljivost i aktivnost vezivanja kalcijuma, koji je normalno ograničeno eksprimiran u neuralnim tkivima i u testisima, posebno tokom rasta. Iako do sada nije objavljeno mnogo radova u vezi sa TTYH1, implicirano je da je on uključen u strukturnu plastičnost neurona, homeostazu kalcijuma i embrionalni razvoj. Ono što je zanimljivo jeste da preterana ekspresija samo TTYH1 jeste bila dovoljna da dovede do vidnog produžavanja neurita, tj. dugačkih membranskih nastavaka koji učestvuju u formiranju aksona i dendrita, u neuralnim kao i u ne-neuralnim ćelijama, dok je smanjenje ekspresije TTYH1 dovodilo do morfoloških promena tih nastavaka, koja se često opisuju kao stvaranje kvržica na neuritima. Ova poslednja fenotipska promena takođe je bila očigledna kod ćelija glioma in vivo nakon smanjenja ekspresije TTYH1 pomoću shRNA u ovoj studiji. Kasniji izveštaji su ukazivali na to da je TTYH1 takođe eksprimiran u reaktivnim i migrirajućim astrocitima, u kojima se koncentrovao uz prednju ivicu filopodije, što je slično kao i rezultati ove studije u pogledu subćelijske distribucije TTYH1 proteina u ćelijama glioma. Bazalna ekspresija u nereaktivnim astrocitima bila je niska, što ukazuje na funkciju ograničenu na migratornu podgrupu ćelija, što je opet u skladu sa našim nalazima u ćelijama glioma. Zanimljivo je da je pokazano da neuronalna aktivnost promoviše proliferaciju i rast glioma visokog gradusa, kroz sekreciju Neurolignina-3 regulisanu aktivnošću, što se dovodi u vezu sa (iako to nije funkcionalno provereno) povećanom ekspresijom TTYH tokom skrininga za ekspresiju gena.
Kako jedna od predloženih funkcija TTYH1 obuhvata hloridni kanal aktiviran Ca<2+>jonima, moguće je da on svoju migratornu funkciju vrši preko svojih sposobnosti za prenos hlorida. Gliomi akumuliraju jone hlora i tako stvaraju hloridni gradijent od unutrašnjosti ka spoljašnjosti. Izlazak hlorida zatim prati i izlazak vode što omogućava ćeliji koja se kreće da prilagodi svoj oblik dok migrira kroz uske vanćelijske prostore. Blokada ili smanjena ekspresija hloridnog kanala dovodi do smanjenog kapaciteta za invaziju, sličnog efektima smanjenja ekspresije TTYH1. Ometanje hloridnih jonskih kanala i transportera trenutno se ispituje kao potencijalna meta terapija u kliničkim studijama. Ovo bi moglo da objasni zašto TTYH1 igra
2
funkcionalnu ulogu preliminarno u TM podtipa migratornih ćelija glioma sa 1-2 TM, iako je taj protein prisutan u mnogim TM svih podtipova ćelija glioma. Uočene kvržice niz filament, do kojih dolazi nakon smanjene ekspresije TTYH1 mogle bi da budu ekvivalent lokalnog oticanja ćelija, kojim se ometa delotvorna adaptacija oblika ćelije, što je od ključnog značaja za translokaciju ćelija kroz gusti neuropil.
Još jedan potencijalni mehanizam dejstva TTYH1 mogao bi da bude u njegovoj intearakciji sa pro-invazivnim integrinima, jer je pokazano da se TTYH1 nalazi na istim lokacijama kao i α5-integrin, što je takođe primećeno u GBMSC u ovoj studiji. Integrini ostvaruju indirektnu interakciju sa aktinskim skeletom, učestvuju u kretanju konusa rasta i nalaze se u posebno velikim koncentracijama na samom vrhu konusa rasta. Kako TTYH1 može da ostvari direktnu interakciju sa citoskeletom vezivanjem za aktin i tubulun, a oba ova elementa citoskeleta predstavljaju strukturne komponente TM, moguće je da TTYH1 posreduje u interakcijama između integrina i aktina, i da su efekti na citokelet odgovorni za smanjenu invaziju u ćelijama sa smanjenom ekspresijom Ttyh1.
Poredeći kvantitativni uticaj neometane ekspresije TTYH1 na uspešnu kolonizaciju mozga sa uticajem GAP-43, čini se da je TTYH1 možda čak i važniji za invaziju tumorskih ćelija i ukupan rast tumora nego GAP-43. Zapravo, nalazi ove studije ukazuju na konkretno učešće TTYH1 u izduživanju i funkciji dinamičkih TM migratornih ćelija glioma. Predmetni rezultat takođe pokazuje da je smanjenje ekspresije TTYH1 u tri različite ćelijske linije GBMSC bilo smrtonosno za jednu od njih in vitro, uglavnom smrtonosno za drugu liniju in vivo, i značajno smanjilo in vivo rast kod treće linije (S24). Ovo govori u prilog ključnog uticaja adekvatne ekspresije TTYH1 na vijabilnost ćelija, ili, u najmanju ruku, na sposobnost kolonizacije mozga kod različitih glioma. Nasuprot tome, za razliku od GAP-43, smanjenje njegove ekspresije čak je i povećalo relativni broj međusobno dobro povezanih (preko TM), stacionarnijih ćelija glioma kod S24 GBMSC. Može se spekulisati da male dimenzije i deficit invazivnosti tumora u kojima je smanjena ekspresija TTYH1 mogu da olakšaju međusobno povezivanje tumorskih ćelija preko TM, primenom mašinerija nezavisnih od TTYH1, kao što je GAP-43 za formiranje ovog podtipa TM. Konačno, rezultati ove studije govore u prilog nalazu da ćelije glioma međusobno povezane preko TM grade osovinu rezistencije tumora mozga, na koju ne utiču, u nekoj relevantnoj meri, neželjena dejstva radioterapije – bez obzira na to koliko je tumor deficijentan za invaziju i koliko je mali.
Kao zaključak, uz GAP-43, TTYH1 je novi značajni molekulski pokretač specifičnih funkcija TM koji se uglavnom, do sad, dovodio u vezu sa razvojem i popravkama CNS-a. On takođe obezbeđuje važne dodatne informacije o heterogenosti tumorskih ćelija kod glioma u pogledu TM, što ukazuje na neophodnost tačno određenih terapeutskih strategija za svaki od različitih podtipova tumorskih ćelija. Čini se da oba podtipa tumorskih ćelija koji se dovode u vezu sa TM, sa svojim urođenim odlikama difuzne infiltracije (1-2 TM) naspram visoke rezistencije na terapiju (više TM), doprinose aktuelnoj lošoj prognozi kod malignih astrocitoma. Tako je pitanje kada i kako usmeriti intervenciju prema kojim TM, ono koje je translaciono najvažnije. Nasuprot GAP-43, za čiju se inhibiciju čini da najviše obećava u toku radioterapije, terapeutski period koji najviše obećava kada je u pitanju inhibicija TTYH1 mogao bi da bude nakon završetka standardne citotoksične terapije, ili čak umesto nje; trebalo bi izbeći kombinaciju sa radioterapijom. Snažni anti-invazivni i anti-proliferativni efekti genetskog smanjenja ekspresije TTYH1, međutim, i potencijalno ograničen značaj za nemaligni CNS odraslih, čine TTYH1 zanimljivim ciljnim molekulom za budući razvoj lekova.
4

Claims (1)

Patentni zahtevi
1. Sredstvo za upotrebu u lečenju glioma kod pacijenta ometanjem (a) invazije i(li) (b) proliferacije i(li) (c) međućelijske komunikacije i(li) (d) otpornosti na radioterapiju ili hemoterapiju ćelija glioma u kojima posreduju tumorske mikrocevčice (TM), naznačeno time što je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od:
(a1) sredstva koje je u stanju da posreduje u ometanju RNK (RNAi) radi specifičnog smanjenja ekspresije gena za protein vezan za rast 43 (GAP43), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka jednoj od nukleokiselinskih sekvenca datih kao Sek. sa ID br.: 1 do 5;
(a2) sredstva koje je u stanju da posreduje u ometanju RNK (RNAi) za specifično smanjenje ekspresije gena za protein vezan za rast 43 (GAP43), gde je dato sredstvo DNK antisens oligonukleotid (asDNK) koji sadrži jednu od sekvenci nukleinskih kiselina datih kao Sek. sa ID br.: 6 do 8, ili je asRNA koja sadrži jednu od sekvenci nukleinskih kiselina datih kao Sekv. sa ID br.: 9 do 11;
(b) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost GAP43 proteina, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za GAP43 protein;
(c) sredstva koje je u stanju da posreduje u RNAi radi specifičnog smanjenja ekspresije gena za homolog humanog tweety proteina (Ttyh1), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka jednoj od sekvenca nukleinskih kiselina datih kao Sek. sa ID br.: 12 do 16; (d) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost TTYH-1 proteina, gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za TTYH-1 protein;
(e) sredstva koje je u stanju da posreduje u ometanju RNK (RNAi) radi specifičnog smanjenja ekspresije gena za koneksin 43 (Cx43), gde je navedeno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od malih inhibitornih RNK (siRNA), mikroRNK (miRNA), malih RNK u obliku ukosnice (shRNA), antisens oligonukleotida i antisens RNK (asRNA), i gde je navedeno sredstvo usmereno ka nukleokiselinskoj sekvenci datoj kao Sek. sa ID br.: 21;
(f1) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost koneksina 43 (Cx43), gde je navedeno jedinjenje antitelo, fragment antitela ili mimetik antitela koji se specifično vezuje za i(li) funkcionalno blokira Cx43; i
(f2) jedinjenja koje je u stanju da inhibira biološku aktivnost koneksina 43 (Cx43), gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od peptida koji blokira pukotinastu međućelijsku vezu 26 (Sekv. sa ID br.: 17); peptida koji blokira pukotinastu međućelijsku vezu Gap 27 (Sekv. sa ID br.: 18), gliciretinske kliseline; kvinina; anandamida; oktanola; heptanola; antranilne kiseline; fenaminske kiseline; retinske kiseline; i tonabersata.
RS20210578A 2015-08-04 2016-07-06 Sredstva za upotrebu u lečenju glioma RS61846B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15002323 2015-08-04
EP16739411.3A EP3331610B1 (en) 2015-08-04 2016-07-06 Agents for use in the treatment of glioma
PCT/EP2016/001151 WO2017020982A1 (en) 2015-08-04 2016-07-06 Agents for use in the treatment of glioma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61846B1 true RS61846B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=53783019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210578A RS61846B1 (sr) 2015-08-04 2016-07-06 Sredstva za upotrebu u lečenju glioma

Country Status (11)

Country Link
US (3) US11246927B2 (sr)
EP (1) EP3331610B1 (sr)
DK (1) DK3331610T3 (sr)
ES (1) ES2880017T3 (sr)
HR (1) HRP20210735T1 (sr)
HU (1) HUE054065T2 (sr)
PL (1) PL3331610T3 (sr)
PT (1) PT3331610T (sr)
RS (1) RS61846B1 (sr)
SI (1) SI3331610T1 (sr)
WO (1) WO2017020982A1 (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3331610T1 (sl) 2015-08-04 2021-08-31 DC Europa Limited, c/o The Cambridge Partnership Limited Sredstva za uporabo pri zdravljenju gliomov
KR102094442B1 (ko) * 2018-06-28 2020-03-27 성균관대학교산학협력단 알쯔하이머성 치매의 예방 또는 치료용 물질 및 이를 포함하는 조성물
CN113980963B (zh) * 2021-09-03 2024-05-28 中山大学 一种寡核苷酸rna双链分子及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
JP2024535380A (ja) 2021-09-23 2024-09-30 エラスカ・インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ阻害剤の多形形態
CN114854856A (zh) * 2022-01-01 2022-08-05 吴安华 Arpc1b基因的相关用途及药物
WO2024102177A1 (en) * 2022-11-08 2024-05-16 The Regents Of The University Of California Combination therapies for the treatment of brain cancer
CN116052839B (zh) * 2023-02-02 2023-08-15 深圳扬奇医芯智能科技有限公司 基于切伦科夫辐射的剂量验证方法及装置
KR20250009923A (ko) * 2023-07-10 2025-01-20 소바젠 주식회사 Gap43 활성 또는 발현을 조절하기 위한 조성물

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002329799B2 (en) * 2001-08-20 2007-03-15 Maiken Nedergaard Treatment of glial tumors with glutamate antagonists
KR20090084149A (ko) * 2008-01-31 2009-08-05 한국과학기술연구원 뇌암 예방 또는 치료용 조성물
JP2015515282A (ja) * 2012-04-25 2015-05-28 エムユーエスシー ファウンデーション フォー リサーチ ディベロップメント 創傷治癒および組織修復のための組成物および方法
US20160166637A1 (en) 2013-08-02 2016-06-16 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Methods of treating a cancer through targeted disruption of alpha connexin 43-zonula occludens-1 (zo-1) interaction
SI3331610T1 (sl) 2015-08-04 2021-08-31 DC Europa Limited, c/o The Cambridge Partnership Limited Sredstva za uporabo pri zdravljenju gliomov

Also Published As

Publication number Publication date
SI3331610T1 (sl) 2021-08-31
HK1256164A1 (en) 2019-09-13
US12029789B2 (en) 2024-07-09
WO2017020982A1 (en) 2017-02-09
US20220202936A1 (en) 2022-06-30
HRP20210735T1 (hr) 2021-06-11
PL3331610T3 (pl) 2021-09-06
EP3331610A1 (en) 2018-06-13
US20240299538A1 (en) 2024-09-12
US11246927B2 (en) 2022-02-15
ES2880017T3 (es) 2021-11-23
PT3331610T (pt) 2021-05-07
US20180221479A1 (en) 2018-08-09
DK3331610T3 (da) 2021-05-10
HUE054065T2 (hu) 2021-08-30
EP3331610B1 (en) 2021-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS61846B1 (sr) Sredstva za upotrebu u lečenju glioma
JP6902570B2 (ja) 修飾型ｒｎａ（ｍｏｄ−ｒｎａ）を使用する効率的なインビボタンパク質発現
Osswald et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network
Konopka et al. MicroRNA loss enhances learning and memory in mice
Jia et al. Long non-coding RNA H19 regulates glioma angiogenesis and the biological behavior of glioma-associated endothelial cells by inhibiting microRNA-29a
CN102510719B (zh) 用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移
US20200199541A1 (en) Blood vessel organoid, methods of producing and using said organoids
Chen et al. Single dose of intravenous miR199a-5p delivery targeting ischemic heart for long-term repair of myocardial infarction
Chen et al. Apelin protects primary rat retinal pericytes from chemical hypoxia‐induced apoptosis
Arderiu et al. Ets-1 transcription is required in tissue factor driven microvessel formation and stabilization
Calzolari et al. Tumor progression and oncogene addiction in a PDGF-B-induced model of gliomagenesis
Zhao et al. Expression of Ski and its role in astrocyte proliferation and migration
Abshagen et al. Foxf1 siRNA delivery to hepatic stellate cells by DBTC lipoplex formulations ameliorates fibrosis in livers of bile duct ligated mice
US9663585B2 (en) Anti-DCLK1 monoclonal antibodies and methods of production and use thereof
Dong et al. Kindlin-2 controls angiogenesis through modulating Notch1 signaling
Ferrari et al. FAS/FASL are dysregulated in chordoma and their loss-of-function impairs zebrafish notochord formation
WO2005028617A2 (en) Antisense inhibition of laminin-8 expression to inhibit human gliomas
JP6478916B2 (ja) 薬物耐性乳癌の予後判定および処置のための治療アジュバントおよびバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ
HK1256164B (en) Agents for use in the treatment of glioma
ES2310469B1 (es) Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones.
EP3576763B1 (en) Agents that modulate tmem230 as angiogenesis regulators and that detect tmem230 as markers of metastasis
Li et al. Alix Mediated Selective Packaging of β-Catenin into Extracellular Vesicles Enhances Their Pro-Angiogenic Function
Li et al. Tumor Extracellular Vesicles lncOSLMT Drives Lung Inflammatory Premetastatic Niche Formation in Osteosarcoma via m6A‐Dependent hnRNPA2B1/COX‐2 Axis
Reimer Motor neuron differentiation in the developing and the regenerating adult spinal cord of zebrafish Danio rerio
Azam Characterizing a Regulatory Axis of MicroRNA-200b, the RNA-Binding Protein Quaking, and Cyclin D1 in Modulating Tumor Angiogenesis and Metastasis