RS60835B1 - Metoda za lečenje osteoporoze - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se generalno odnosi na metode za povećanje mineralne gustine kostiju i lečenje osteoporoze korišćenjem antitela protiv sklerostina.

STANJE TEHNIKE

[0002] Osteoporoza je bolest sa tendencijom slabosti kod ljudi i karakterisana je primetnim smanjenjem skeletne koštane mase i mineralne gustine, strukturnim pogoršanjem kostiju, uključujući, degradaciju mikroizgradnje kostiju i odgovarajuće povećanje lomljivosti kostiju (tj. smanjenje jačine kostiju) i osetljivošću prema prelomima kod pogođenih pojedinaca. Kod ljudi osteoporozi obično prethodi klinička osteopenija, stanje koje se javlja kod oko 25 miliona ljudi u Sjedinjenim Državama. U Sjedinjenim Državama je dijagnostikovano još oko 7-8 miliona pacijenata sa kliničkom osteoporozom. Učestalost osteoporoze u humanoj populaciji se povećava sa godinama. Među belcima, osteoporoza je pretežna kod žena koje u Sjedinjenim Državama obuhvataju 80% objedinjenih pacijenta sa osteoporozom. Povećana lomljivost i prijemčivost prelomima skeletnih kostiju je pogoršana sa godinama sa povećanim rizikom od slučajnih padova kod ove populacije. Slomljeni kukovi, zglobovi i pršljenovi su među najčešćim povredama povezanim sa osteoporozom i niskom mineralnom gustinom kostiju. Posebno su prelomi kuka izuzetno neugodni i skupi za pacijenta, a za žene su u korelaciji sa visokom stopom mortaliteta i morbiditeta.

SUŠTINA PRONALASKA

[0003] Pronalazak je usmeren na antitelo protiv sklerostina koje sadrži CDR-H1 od SEK ID BR:245, CDR-H2 od SEK ID BR:246, CDR-H3 od SEK ID BR:247, CDR-L1 od SEK ID BR:78, CDR-L2 od SEK ID BR:79 i CDR-L3 od SEK ID BR:80, za upotrebu u postupku za povećanje mineralne gustine kostiju kod žena u postmenopauzi, metoda obuhvata primenu pomenutog antisklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi koje pate od osteoporoze, u količini i tokom perioda lečenja efikasnog za povećanje mineralne gustine kostiju lumbalnih pršljenova (BMD) za najmanje oko 9% od početne vrednosti pre lečenja, tokom dvanaest meseci nakon inicijalne primene anti-sklerostinskog antitela; pri čemu je primenjena količina anti-sklerostinskog antitela otprilike 140 mg ili otprilike 210 mg i primenjena količina anti-sklerostinskog antitela je u intervalu koji nije češći od jednom mesečno.

[0004] Metoda može da obuhvata primenu anti-sklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi sa osteoporozom, u količini od oko 70 mg do oko 210 mg, u intervalu jednom mesečno. Opciono, anti-sklerostinsko antitelo se primenjuje tokom perioda lečenja od oko tri meseca do oko 18 meseci. U različitim realizacijama pronalaska, metoda obuhvata primenu anti-sklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi sa osteoporozom, u količini od oko 140 mg do oko 210 mg, u intervalu od svaka tri meseca, opciono, tokom perioda lečenja od oko šest meseci do oko 18 meseci.

[0005] Upotreba anti-sklerostinskih antitela prema bilo kojoj od metoda, koje su ovde obelodanjene ili za pripremu lekova za primenu, prema bilo kojoj od ovde opisanih metoda je posebno razmatrana pronalaskom. U vezi s tim, pronalazak uključuje anti-sklerostinsko antitelo za upotrebu u postupku povećanja mineralne gustine kostiju kod žena u postmenopauzi, postupak obuhvata primenu antisklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi koje imaju T-skor lumbalnog pršljena manji od ili jednak -2, u količini i za vreme koje je efikasno za povećanje mineralne gustine kosti lumbalnog pršljena (BMD) za najmanje oko 9% od početne vrednosti pre lečenja, tokom dvanaest meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela. Pronalazak dalje obuhvata anti-sklerostinsko antitelo, za upotrebu u postupku za lečenje osteoporoze, postupak obuhvata primenu antisklerostinskih antitela kod žena u postmenopauzi sa osteoporozom, u količini od oko 70 mg do oko 210 mg, u intervalu od jednom mesečno tokom perioda lečenja, opciono, od oko tri meseca do oko 18 meseci. Pronalazak dalje obuhvata anti-sklerostinsko antitelo, za upotrebu u postupku za lečenje osteoporoze, postupak obuhvata primenu anti-sklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi sa osteoporozom, u količini od oko 140 mg do oko 210 mg, u intervalu od jednom na svaka tri meseca tokom perioda lečenja, opciono, od oko šest meseci do oko 18 meseci.

[0006] Pored toga, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-sklerostinskog antitela u izradi leka za povećanje mineralne gustine kostiju kod žena u postmenopauzi koja ima T-skor lumbalnog pršljena koji je manji ili jednak -2, u količini koja je efikasna za povećanje mineralne gustine kostiju lumbalnih pršljenova (BMD) za najmanje oko 9% od početne vrednosti pre lečenja, za dvanaest meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela.

[0007] Pronalazak takođe, obuhvata upotrebu anti-sklerostinskog antitela za pripremu leka za lečenje osteoporoze kod žena u postmenopauzi, u količini od oko 70 mg do oko 210 mg primenjenog u intervalu jednom mesečno u periodu lečenja, opciono, od oko tri meseca do oko 18 meseci, kao i upotrebu anti-sklerostinskog antitela u izradi leka za lečenje osteoporoze, u količini od oko 140 mg do oko 210 mg, primenjenog u intervalu jednom na svaka tri meseca tokom perioda lečenja, opciono, od oko šest meseci do oko 18 meseci.

[0008] Prethodni sažetak nije namenjen da definiše svaki aspekt pronalaska i dodatni aspekti su opisani u drugim odeljcima, kao što je Detaljni opis. Celokupni dokument je namenjen da bude povezan kao objedinjeno otkriće i treba razumeti da su razmatrane sve kombinacije karakteristika koje su ovde opisane, čak i ako se kombinacija karakteristika ne nalazi zajedno u istoj rečenici, paragrafu ili delu ovog dokumenta. S obzirom na aspekte pronalaska koji su opisani ili zahtevani sa "jedan" ili "izvestan", trebalo bi shvatiti da ovi izrazi podrazumevaju "jedan ili više", osim ako kontekst nedvosmisleno zahteva značenje koje je više ograničeno. Izraz "ili" treba shvatiti da obuhvata stavke alternativno ili zajedno, osim ako kontekst nedvosmisleno zahteva drugačije. Ako su aspekti pronalaska opisani kao "koji obuhvataju" karakteristike, takođe, razmatrana su i izvođenja "koja se sastoje od’ ili "koja se suštinski sastoje od’ karakteristike.

KRATAK OPIS SLIKA

[0009] Slika 1 je grafikon koji prikazuje aminokiselinske sekvence i identifikatore sekvenci za aminokiselinske sekvence različitih anti-sklerostinskih antitela, ovde opisanih. Identifikatori sekvenci se odnose na aminokiselinske sekvence obezbeđene u Listingu sekvenci koji je ovde podnet. Aminokiselinske sekvence su takođe, navedene u Američkoj patentnoj publikaciji br.

20070110747, Međunarodnoj patentnoj publikaciji WO 2008/115732, Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2009/047356 i Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2010/130830.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0010] Pronalazak obezbeđuje antitelo protiv sklerostina koje sadrži CDR-H1 od SEK ID BR:245, CDR-H2 od SEK ID BR:246, CDR-H3 od SEK ID BR:247, CDR-L1 od SEK ID BR:78, CDR-L2 od SEK ID BR:79 i CDR-L3 od SEK ID BR:80, za upotrebu u postupku za povećanje mineralne gustine kostiju kod žena u postmenopauzi, metoda obuhvata primenu pomenutog antisklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi koje pate od osteoporoze, u količini i tokom perioda lečenja koji je efikasan za povećanje mineralne gustine kostiju lumbalnih pršljenova (BMD) za najmanje 9% od početne vrednosti pre lečenja, za dvanaest meseci nakon početne primene antisklerostinskog antitela; pri čemu je primenjena količina anti-sklerostinskog antitela otprilike 140 mg ili otprilike 210 mg i količina anti-sklerostinskog antitela je primenjena u intervalu koji nije češći od jednom mesečno. Količina i vreme primene su efikasni za povećanje BMD lumbalnog pršljena najmanje 9% od početne vrednosti pre lečenja, za dvanaest meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela.

[0011] Kod procene rizika, prisustva ili progresije osteoporoze (ili drugih bolesti povezanih sa gubitkom BMD-a), BMD pacijenta se generalno poredi sa gustinom pika zdrave osobe starosti od 30 godina (tj. "mlada odrasla osoba"), stvarajući takozvani "T-skor". Tipično, BMD je meren na "ukupnom telu" (npr. glava, trup, ruke i noge) ili na kuku (npr. ukupni bok i / ili vrat femora), kičmi (npr. lumbalni pršljen), zglobu, prstu, goleničnoj kosti (tibia) i / ili peti. Pacijent može imati različite T-rezultate koji odgovaraju različitim mestima merenja (npr. T-skor lumbalnog pršljena, ukupni T-skor boka i T-skor femoralnog vrata, koji svi mogu sadržati različite vrednosti). BMD pacijenta takođe, može biti poređen sa gustinom kostiju "usaglašene starosti" (videti, npr., Naučna grupa Svetske zdravstvene organizacije za Prevenciju i upravljanje osteoporozom, "Prevencija i upravljanje osteoporozom: izveštaj naučne grupe SZO". Serija tehničkih izveštaja SZO; 921, Ženeva, Švajcarska (2003)). Razlika između BMD pacijenta i onog kod zdrave, mlade odrasle osobe se konvencionalno odnosi u smislu višestruke "standardne devijacije", koja obično iznosi oko 10% do oko 12% smanjenja gustine kostiju. Svetska zdravstvena organizacija je predložila četiri dijagnostičke kategorije zasnovane na T-rezultatima BMD-a. Vrednost BMD-a u okviru 1 standardne devijacije referentne sredine kod mlade odrasle osobe (T-skor ≥ -1) je "normalna". Niska koštana masa (osteopenija) je označena pomoću BMD vrednosti veće od 1 standardne devijacije ispod srednje vrednosti kod odrasle osobe, ali manje od 2,5 standardnih devijacija (T-rezultat < -1 i > -2,5). T-rezultat od 2,5 standardnih devijacija ili viši od 2,5 standardnih odstupanja ispod norme podržava dijagnozu osteoporoze (T-skor ≤ -2,5). Ako pacijent dodatno pati od jedne ili više fraktura, pacijent se kvalifikuje kao da ima ozbiljnu osteoporozu.

[0012] U različitim realizacijama inventivne metode, žena u postmenopauzi ima T-skor lumbalnog pršljena ≤ -1, kao što je T-skor lumbalnog pršljena < -1 i > -2,5 (npr., T-skor lumbalnog pršljena manji od ili jednak -2) ili T-skor lumbalnog pršljena ≤ -2.5. Alternativno (ili dodatno), žena u postmenopauzi ima ukupni T-skor kuka ≤ -1, kao što je ukupni T-skor kuka < -1 i > -2,5 (npr. ukupni T-skor kuka manji od ili jednak -2) ili ukupni T-skor kuka ≤ -2.5.

[0013] Žena u postmenopauzi pati od osteoporoze.

Alternativno ili dodatno, žena u postmenopauzi je pri povećanom ili visokom riziku od preloma, tj. subjekt ima istoriju osteoporoznog preloma ili višestrukih faktora rizika za frakturu. U različitim realizacijama pronalaska, anti-sklerostinsko antitelo je primenjeno kod žena u postmenopauzi, u količini i tokom vremena efikasnog za smanjenje rizika od vertebralnih i / ili nevertebralnih preloma. Alternativno ili dodatno, ženi u postmenopauzi opciono nedostaje ili je netolerantna prema drugim dostupnim terapijama za osteoporozu, kao što su, ali ne ograničavajući se na, inhibitore RANK liganda (RANKL), kao što su anti-RANKL antitela (npr. PROLIA®); bisfosfonati (npr., zoledronska kiselina (RECLAST®), natrijum alendronat (FOSAMAX®) ili natrijum ibandronat (BONIVA®)); ili paratiroidni hormon ili njegovi analozi (npr., teriparatid, rekombinantni humani analog paratiroidnog hormona (1-34) (FORTEO®)). U različitim realizacijama, žene u postmenopauzi su lečene sa bilo kojom od navedenih terapija osteoporoze navedenih u prethodnom tekstu, pre primene anti-sklerostinskog antitela. Pokazano je da pacijenti koji su prethodno tretirani bisfosfonatima imaju neosetljiv odgovor na teriparatid (FORTEO®). Prethodno lečenje sa bisfosfonatima neće dovesti do sličnog odgovora na lečenje antisklerostinskim antitelima. Stoga će pacijenti koji su prethodno lečeni bisfosfonatima uživati u punom terapeutskom potencijalu lečenja anti-sklerostinskih antitela.

[0014] Antitelo protiv sklerostina je primenjeno kod žena u postmenopauzi, u količini i za vreme efikasno za postizanje povećanja BMD-a lumbalnog pršljena pri najmanje 9% od osnove prethodnog tretmana, za dvanaest meseci nakon početne primene anti sklerostinskog antitela. Lumbalna kičma je jedno od mnogih skeletnih lokacija za BMD merenje. Druge pogodne skeletne lokacije uključuju kuk (npr., ukupni kuk ili femoralni vrat), podlakticu, prst, zglob i petu. "Osnova prethodnog tretmana" se odnosi na BMD merenje na skeletnoj lokaciji pre inicijalne primene antisklerostinskog antitela. Prema tome, BMD se meri na skeletnom mestu pre lečenja sa antisklerostinskim antitelom da bi se dobilo BMD merenje osnove, koje se poredi sa BMD merenim na istoj skeletnoj lokaciji, u vremenskoj tački nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela, kao što je dvanaest meseci nakon inicijalne primene. U različitim aspektima pronalaska, antisklerostinsko antitelo je primenjeno u količini i za vreme koje je efikasno za povećanje BMD lumbalnog pršljena (ili BMD na drugom skeletnom mestu) pri najmanje jednoj standardnoj devijaciji (npr.1,5 standardnih odstupanja, 2 standardne devijacije ili 2,5 standardnih odstupanja) od početnog stanja pre tretmana, za dvanaest meseci nakon početne primena anti-sklerostinskog antitela. Dodatno, anti-sklerostinsko antitelo, može biti primenjeno u količini i za vreme efikasno za povećanje ukupnog BMD kuka za najmanje oko 3% od početne vrednosti pre tretmana, za dvanaest meseci nakon inicijalne primene anti-sklerostinskog antitela.

[0015] Kod ljudi, mineralna gustina kostiju se često određuje klinički korišćenjem dvostruke rentgenske absorptiometrije (DXA). Ostale tehnike uključuju, kvantitativnu kompjuterizovanu tomografiju (QCT), ultrasonografiju, jednostruku-energetsku rentgensku absorptiometriju (SXA), magnetnu rezonancu, radiografiju i radiografsku absorptiometriju. Osim ultrasonografije, Američko medicinsko udruženje primećuje da tehnike BMD obično uključuju, korišćenje rentgenskih zraka i zasnivaju se na principu da slabljenje zračenja zavisi od debljine i sastava tkiva u dometu zračenja. Često, tehnike uključuju poređenje rezultata u normativnu bazu podataka.

[0016] Količina anti-sklerostinskog antitela za primenu kod žena u postmenopauzi, kao što je opisano sadrži najmanje oko 70 mg anti-sklerostinskog antitela. Na primer, u različitim aspektima, primenjena količina antitela protiv sklerostina je oko 140 mg ili oko 210 mg, npr., antisklerostinskog antitela. Primenjena količina anti-sklerostinskog antitela u metodi prema pronalasku nije viša od oko 350 mg anti-sklerostinskog antitela, npr. nije viša od oko 280 mg antisklerostinskog antitela, nije viša od oko 210 mg anti-sklerostinskog antitela, nije viša od oko 140 mg anti-sklerostinskog antitela ili nije viša od oko 120 mg anti-sklerostinskog antitela (npr. oko 120 mg antitela). Na drugi način, pojedinačna primena ili doza anti-sklerostina obuhvata, na primer, ne više od oko 350 mg antitela (iako se pojedinačna doza može primenjivati putem više istovremenih injekcija (npr. dve injekcije od 105 mg antitela da se postigne doza od 210 mg)). Stoga, u različitim realizacijama prema pronalasku, metoda obuhvata primenu antitela protiv sklerostina, u količini od oko 70 mg do oko 350 mg, kao što je oko 70 mg do oko 280 mg, ili oko 120 mg do oko 350 mg, ili oko 140 mg do oko 350 mg, ili oko 210 mg oko 350 mg, ili oko 280 mg do oko 350 mg. Opciono, pojedinačna doza anti-sklerostinskog antitela sadrži oko 70 mg do oko 210 mg anti-sklerostinskog antitela, kao što je oko 70 mg do oko 120 mg (npr. kko 70 mg) anti-sklerostinskog antitela, ili oko 70 mg do oko 140 mg anti-sklerostinskog antitela, ili oko 120 mg do oko 210 mg anti-sklerostinskog antitela ili oko 120 mg do oko 140 mg anti-sklerostinskog antitela. Pojedinačna doza antisklerostinskog antitela sadrži 140 mg do 210 mg (npr., oko 140 mg ili oko 210 mg) antisklerostinskog antitela. Količina anti-sklerostinskog antitela (tj. doza anti-sklerostinskog antitela) se primenjuje u intervalu koji nije češći od jednom mesečno (ili četiri nedelje), opciono za period lečenja od najmanje oko tri meseca (ili 12 nedelja). Period lečenja obuhvata ne više od oko 18 meseci (tj., oko tri meseca do oko 18 meseci). Drugim rečima, period čekanja od najmanje jednog meseca prolazi između primena anti-sklerostinskog antitela kod žene u postmenopauzi, a tok lečenja opciono traje najmanje oko tri meseca i ne duže od oko 18 meseci (npr. oko tri meseca do oko 18 meseci). U različitim aspektima, višestruke doze anti-sklerostinskog antitela se primenjuju u periodu lečenja od oko tri meseca do oko 15 meseci, ili oko tri meseca do oko 12 meseci, ili oko tri meseca do oko devet meseci, ili oko tri meseca do oko šest meseci, ili oko šest meseci do oko 18 meseci, ili oko šest meseci do oko 15 meseci, ili oko šest meseci do oko 12 meseci, ili oko šest meseci do oko 9 meseci, ili oko 9 meseci do oko 18 meseci, ili oko 9 meseci do oko 15 meseci, ili oko 9 meseci do oko 12 meseci, ili oko 12 meseci do oko 18 meseci, ili oko 12 meseci do oko 15 meseci, ili oko 15 meseci do oko 18 meseci (npr. oko tri meseca, oko šest meseci, oko devet meseci, oko 12 meseci, oko 15 meseci, ili oko 18 meseci). Opciono, višestruke doze anti-sklerostinskog antitela se primenjuju tokom perioda lečenja od oko 12 nedelja do oko 52 nedelja, ili oko 12 nedelja do oko 36 nedelja, ili oko 12 nedelja do oko 24 nedelja, sa dozama koje se primenjuju jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom na svake četiri nedelje, jednom svakih šest nedelja, jednom svakih 8 nedelja, ili jednom svakih 12 nedelja. U jednom aspektu prema pronalasku, količina anti-sklerostinskog antitela se primenjuje u intervalu koji nije češći od jednom na svaka tri meseca (npr. jednom svakih 12 nedelja), opciono za period lečenja od oko šest meseci do oko 18 meseci.

[00147 Režim doziranja i vremenski periodi koji su ovde opisani (npr. oko 70 mg, oko 140 mg ili oko 210 mg, primenjivani jednom mesečno (QM) ili na svaka tri meseca (Q3M) tokom perioda lečenja, na primer, oko 12 meseci), pokazano je da su efikasni u povećanju mineralne gustine kostiju lumbalnih pršljenova za najmanje oko 5% (npr. najmanje oko 6%, najmanje oko 7%, najmanje oko 8%, najmanje oko 9%, najmanje oko 10% ili najmanje oko 11%) za 12 meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela i / ili najmanje oko 4% (npr., najmanje oko 5%, najmanje oko 6%, najmanje oko 7 %, ili najmanje oko 8%) za 6 meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela. Na primer, kada se primenjuje subkutano u količini od oko 210 mg jednom mesečno u trajanju od tri meseca, antitelo protiv sklerostina povećava mineralnu gustinu kostiju lumbalnih pršljenova za najmanje oko 5%. Pokazano je da je režim doziranja i vremenski period primene prema inventivnom postupku efikasan u povećanju ukupne mineralne gustine kostiju kuka za najmanje oko 1% (npr. najmanje oko 2%, najmanje oko 3% ili najmanje oko 4%), za 12 meseci nakon inicijalne primene antitela protiv sklerostina. Pokazano je da je režim doziranja i vremenski period primene koji je ovde opisan bio efikasan u povećanju mineralne gustine kosti femoralnog vrata za najmanje oko 0,5% (npr. najmanje oko 1%, najmanje oko 1,5%, najmanje oko 2%, najmanje oko 2,5%, najmanje oko 3%, najmanje oko 3,5% ili najmanje oko 4%) za 12 meseci nakon inicijalne primene anti-sklerostinskog antitela.

[0018] Fiziološki odgovor subjekta na anti-sklerostinsko antitelo, može biti meren praćenjem nivoa koštanog markera. Koštani markeri su proizvodi nastali tokom procesa remodelovanja kostiju i oslobođeni su od strane kostiju, osteoblasta i / ili osteoklasta. Fluktuacije u nivoima resorpcije kostiju i / ili "markera" obrazovanja kostiju podrazumevaju promene u kostima remodelovanje / modelovanje. Međunarodna fondacija za osteoporozu (IOF) preporučuje korišćenje markera kostiju za praćenje terapija koštane gustine (videti, npr., Delmas et al., Osteoporos Int., Suppl. 6:S2-17 (2000). Markeri indikativni za resorpciju kostiju (ili aktivnost osteoklasta) uključuju, na primer, C-telopeptid (npr. C-terminalni telopeptid tipa 1 kolagena (CTX) ili serumski unakrsno-povezani C-telopeptid), N-telopeptid (N-terminalni telopeptid kolagena tipa 1 (NTX)), deoksipiridinolin (DPD), piridinolin, urinarni hidroksiprolin, galaktozil hidroksilizin i kiselinsku fosfatazu koja je otporna na tartarat (npr. izoforma 5b kisele fosfataze otporne na tartarat). Markeri za formiranje kostiju / mineralizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalne fosfataze specifične za kosti (BSAP), peptide oslobođene iz N- i C-terminalnih proširenja prokolagena tipa I (P1NP, PICP) i osteokalcina (OC). Nekoliko kompleta je komercijalno dostupno za detekciju i kvantifikaciju markera u kliničkim uzorcima, kao što su urin i krv.

[0019] U različitim aspektima prema pronalasku, primena anti-sklerostinskog antitela dovodi do povećanja nivoa markera za formiranje kostiju u, na primer, serumu i / ili urinu lečenog subjekta. Generalno, količine markera za stvaranje kostiju dostižu pik unutar jednog do dva meseca od početne primene anti-sklerostinskog antitela i opadaju tokom narednih (npr., dva do šest) meseci, bez obzira na to da li se primenjuju naknadne doze anti-sklerostinskog antitela. U Primeru 2, na primer, nivoi P1NP, BSAP i OC su opali do približno osnove (količina markera detektovana pre početne primene anti-sklerostinskog antitela) za oko dva do šest meseci nakon početne primene anti-sklerostinskog antitela, uprkos ponovljenim primenama antitela tokom istog vremenskog perioda. Istovremeno, nivoi markera resorpcije kostiju (npr. CTX) se smanjuju nakon primene antisklerostinskog antitela, što ukazuje na nespajanje formiranja kostiju i resorpcije kostiju tokom lečenja. U Primeru 2, na primer, serumski nivoi CTX opadaju ispod osnove već nakon nedelju dana od početne primene anti-sklerostinskog antitela i ostaju ispod osnovnog nivoa tokom dvanaestomesečnog perioda lečenja. Takođe iznenađujuće, BMD nastavlja da se povećava nakon formiranja kostiju i markeri za resorpciju se približavaju osnovnim nivoima.

[0020] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja osteoporoze. Postmenopauzalnoj ženi sa osteoporozom može biti primenjeno anti-sklerostinsko antitelo u količini od oko 210 mg u intervalu jednom mesečno. U različitim aspektima, kod žene u postmenopauzi primenjuje se jednomesečna doza od oko 140 mg anti-sklerostinskog antitela, ili jednomesečna doza od oko 210 mg anti-sklerostinskog antitela. Višestruke primene (tj. doze) antisklerostinskog antitela primenjuju se kod žena u postmenopauzi tokom perioda lečenja, npr. oko tri meseca do oko 18 meseci, kao što je period lečenja od oko tri meseca do oko 15 meseci, ili oko tri meseca do oko 12 meseci, ili oko tri meseca do oko devet meseci, ili oko tri meseca do oko šest meseci, ili oko šest meseci do oko 18 meseci, ili oko šest meseci do oko 15 meseci, ili oko šest meseci do oko 12 meseci, ili oko šest meseci do oko 9 meseci, ili oko 9 meseci do oko 18 meseci, ili oko 9 meseci do oko 15 meseci, ili oko 9 meseci do oko 12 meseci, ili oko 12 meseci do oko 18 meseci, ili oko 12 meseci do oko 15 meseci, ili oko 15 meseci do oko 18 meseci (npr. oko tri meseca, oko šest meseci, oko devet meseci, oko 12 meseci, oko 15 meseci ili oko 18 meseci). Opciono, višestruke doze anti-sklerostinskog antitela se primenjuju tokom perioda lečenja od oko 12 nedelja do oko 52 nedelje, ili oko 12 nedelja do oko 36 nedelja, ili oko 12 nedelja do oko 24 nedelje, sa dozama koje se primenjuju jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom svakih šest nedelja, jednom svakih 8 nedelja, ili jednom na 12 nedelja. U različitim izvođenjima, anti-sklerostinsko antitelo je primenjeno tokom perioda lečenja koji se sastoji od 12 meseci ili 18 meseci.

[0021] Alternativno, metoda prema pronalasku obuhvata primenu anti-sklerostinskog antitela kod žena u postmenopauzi sa osteoporozom, u količini od oko 120 mg do oko 210 mg ili u količini od oko 140 mg do oko 210 mg, u intervalu na svaka tri meseca. U tom pogledu, ženama u postmenopauzi se opciono primenjuje doza od oko 140 mg antitela protiv sklerostina ili doza od oko 210 mg anti-sklerostinskog antitela na svaka tri meseca (npr., oko svakih 90 dana). Višestruke primene (tj. doze) anti-sklerostinskog antitela se primenjuju kod žena u postmenopauzi tokom perioda lečenja u trajanju od oko šest meseci do oko 18 meseci, kao što je period lečenja od oko šest meseci do oko 15 meseci ili oko šest meseci do oko 12 meseci, ili oko šest meseci do oko 9 meseci, ili oko 9 meseci do oko 18 meseci, ili oko 9 meseci do oko 15 meseci, ili oko 9 meseci do oko 12 meseci, ili oko 12 meseci do oko 18 meseci , ili oko 12 meseci do oko 15 meseci, ili oko 15 meseci do oko 18 meseci (npr. oko tri meseca, oko šest meseci, oko devet meseci, oko 12 meseci, oko 15 meseci ili oko 18 meseci). U različitim realizacijama, antitelo protiv sklerostina je primenjeno tokom perioda lečenja koji se sastoji od 12 meseci ili 18 meseci.

[0022] Pod "lečenjem osteoporoze" podrazumeva se poboljšanje, u celini ili delimično, osteoporoze ili zaštita, u celini ili delimično, protiv dalje progresije osteoporoze. Potpuno ukidanje bolesti nije zahtevano u kontekstu pronalaska; posmatrana je bilo koja terapijska korist, uključujući poboljšanje BMD-a i / ili smanjenje rizika od preloma.

[0023] Izraz "antitelo" se odnosi na celokupno antitelo ili njegov vezujući fragment. Antitelo može da sadrži kompletan molekul (imunoglobulin) antitela (uključujući poliklonske, monoklonske, himerne, humanizovane i / ili humane verzije koje imaju teške i / ili lake lance u punoj dužini (npr. IgG antitelo)) ili sadrže njegov antigen vezujući fragment. Fragmenti antitela uključuju, fragmente F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc i Fd i mogu biti inkorporirani u antitela pojedinačnog domena (npr. nanotela), jednolančana antitela, maksitela, minitela, intratela, diatela, triatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (videtii, npr., Hollinger i Hudson, Nature Biotechnology, 23 (9): 1126-1136 (2005)). Polipeptidi antitela, uključujući monotela fibronektinskih polipeptida, takođe su opisani u U.S. patentu broj 6,703,199. Ostali polipeptidi antitela su opisani u U.S. patentoj objavi br.

20050238646. U.S. patentima br-a. 6,395,511 i 6,803,453 i U.S. patentnim objavama br-a.

20040009535 i 20050106683 odnose se uglavnom na antitela protiv sklerostina. Aminokiselinska sekvenca humanog sklerostina je prikazana u SEK ID BR: 1 u listingu sekvenci i data je kao SEK ID BR: 1 U.S. patentne objave br.20070110747. Sklerostin je takođe opisan od strane Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68: 577-589 (2001); i Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10: 537-543 (2001). Dodatne informacije u vezi sa materijalima i metodama za generisanje anti-sklerostinskih antitela, mogu se naći u Američkoj patentnoj publikaciji br.20040158045.

[0024] Fragment antitela, može biti bilo koji sintetski ili genetski konstruisani protein. Na primer, fragmenti antitela uključuju, izolovane fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona lakog lanca ili teškog lanca, fragmenti "Fv" koji se sastoje od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca i rekombinantnih polipeptidnih molekula sa jednim lancem u kojima su spojeni laki i teški varijabilni regioni putem peptidnog linkera (scFv proteina).

[0025] Drugi oblik fragmenta antitela je peptid koji sadrži jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) antitela. CDR regioni (takođe nazvani "minimalnim jedinicama

1

prepoznavanja" ili "hipervarijabilni region"), mogu biti dobijeni konstruisanjem polinukleotida koji kodiraju CDR od interesa. Takvi polinukleotidi se pripremaju, na primer, korišćenjem polimerazne lančane reakcije za sintetizovanje varijabilnog regiona pomoću mRNK ćelija za proizvodnju antitela kao šablona (videti, na primer, Larrick et al., Metode: Pratilac metoda u enzimologiji, 2 : 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetska manipulacija monoklonskih antitela", u proizvodnji monoklonskih antitela, inženjeringu i kliničkoj primeni, Ritter et al. (Eds.), strana 166, Cambridge University Press (1995); i Ward et al.," Genetska manipulacija i ekspresija antitela," u monoklonskim antitelima: Principi i primene, Birch et al., (eds.), str. 137, Wiley-Liss, Inc. (1995)).

[0026] Antitela protiv sklerostina, mogu da se vezuju za sklerostin od SEK ID BR: 1 ili njegovu prirodnu varijantu, sa afinitetom (Kd) manjim od ili jednakim 1 x 10<-7>M, manjim od ili jednakim 1 x 10<-8>M, manjim od ili jednakim 1 x 10<-9>M, manjim od ili jednakim 1 x 10<-10>M, manjim od ili jednakim 1 x 10<-11>M, ili manjim od ili jednakim 1 x 10<-12>M. Afinitet je određen korišćenjem raznih tehnika, od kojih je primer afinitetni ELISA test. U različitim realizacijama, afinitet je određen pomoću testa površinske plazmonske rezonance (npr., testom BIAcore ™). U različitim realizacijama, afinitet je određen kinetičkim metodom. U različitim realizacijama, afinitet je određen metodom ravnoteže/otapanja. U.S. patentna objava br. 20070110747 sadrži dodatni opis ispitivanja afiniteta pogodnih za određivanje afiniteta (Kd) antitela za sklerostin.

[0027] Antitela protiv sklerostina, za upotrebu prema inventivnoj metodi poželjno, modulišu funkciju sklerostina u testu na bazi ćelija, opisanom u Američkoj patentnoj publikaciji br.

20070110747 i / ili in vivo testu opisanom u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747 i / ili antitela protiv sklerostina, za upotrebu u opisanom postupku se vezuju za jedan ili više epitopa opisanih u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747 i / ili unakrsno blokiraju vezivanja jednog od antitela opisanih u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747 i / ili su unakrsnoblokirana od vezivanja sklerostina pomoću jednog od antitela opisanih u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747.

[0028] U različitim realizacijama, anti-sklerostinsko antitelo se vezuje za sklerostinski polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SEK ID BR: 1 i vezuje sekvencu SEK ID BR: 6 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5; koja odgovara aminokiselinama 86-111 SEK ID BR: 1). Alternativno ili dodatno, anti-sklerostinsko antitelo prema pronalasku se vezuje za sklerostinski polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 1 i vezuje sekvencu od najmanje jedne od SEK ID BR: 2 (DVSEYSC1RELHFTR; koja odgovara aminokiselinama 51-64 SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 3 (SAKPVTELVC3SGQC4GPAR; koja odgovara aminokiselinama 73-90 SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 4 (WWRPSGPDFRC5IPDRYR; što odgovara aminokiselinama 101-117 SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 5 (LVASC7KC8KRLTR; koja odgovara aminokiselinama 138-149 od SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 70 (SAKPVTELVC3SGQC4; koja odgovara amino kiselinama 73 -86 od SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 71 (LVASC7KC8; koja odgovara aminokiselinama 138-144 od SEK ID BR: 1), SEK ID BR: 72 (C1RELHFTR; koja odgovara aminokiselinama 57-64 SEK ID BR: 1), ili SEK ID BR: 73 (C5IPDRYR, koja odgovara aminokiselinama 111-117 SEK ID BR: 1) unutar SEK ID BR: 1. Na primer, u jednom aspektu, anti-sklerostinsko antitelo vezuje subregion sklerostina SEK ID BR: 1 koji sadrži SEK ID BR-a: 2-5 (i / ili SEK ID BR-a: 70-73), opciono u svojoj prirodnoj tridimenzionalnoj konformaciji. Opciono, anti-sklerostinsko antitelo prema pronalasku vezuje peptid koji se sastoji od jedne ili više od SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4, SEK ID BR: 5, SEK ID BR: 6, SEK ID BR: 70, SEK ID BR: 71, SEK ID BR: 72 ili SEK ID BR: 73 (npr. peptid koji se sastoji od SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5 ili peptid koji se sastoji od SEK ID BR: 70, SEK ID BR: 71, SEK ID BR: 72 i SEK ID BR: 73).

[0029] U različitim aspektima, antitelo protiv sklerostina je sposobno da neutrališe humani sklerostin u testu mineralizacije na bazi MC3T3 ćelija, kada postoji manje od 6-puta viška molova sklerostinskih mesta vezivanja po bazenčiću u poređenju sa brojem molova sklerostina po bazenčiću. Mineralizacija pomoću ćelija roda osteoblasta u kulturi, bilo primarnih ćelija ili ćelijske linije, korišćena je kao in vitro model formiranja kostiju. Primeran test mineralizacije baziran na ćelijama je opisan u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747, na primer, primer 8. MC3T3-E1 ćelije (Sudo i sar., J. Cell Biol., 96: 191-198 (1983)) i subklonovi prvobitne ćelijske linije, mogu da formiraju mineral u kulturi nakon rasta u prisustvu diferencirajućih sredstava. Takvi subklonovi, uključuju MC3T3-E1-BF (Smith et al., J. Biol. Chem., 275: 19992-20001 (2000)). Za oba subklona MC3T3-E1-BF kao i za originalne MC3T3-E1 ćelije, sklerostin može da inhibira jednu ili više sekvenci događaja koji vode do i uključujući taloženje minerala (t.j., sklerostin inhibira mineralizaciju). Anti-sklerostinska antitela koja su u stanju da neutrališu inhibitornu aktivnost sklerostina omogućavaju mineralizaciju kulture u prisustvu sklerostina tako da postoji statistički značajno povećanje npr. taloženja kalcijum fosfata (mereno kao kalcijum) u poređenju sa količinom kalcijuma mereno samo u grupi tretiranoj sklerostinom (tj. bez antitela).

[0030] Prilikom testiranja sa ciljem utvrđivanja da li određeno anti-sklerostinsko antitelo može da neutrališe sklerostin, količina sklerostina koja se koristi u testu poželjno je minimalna količina sklerostina koja uzrokuje najmanje 70%, statistički značajno smanjenje u taloženju kalcijum fosfata (izmereno kao kalcijum) u grupi tretiranoj samo sa sklerostinom, u poređenju sa količinom kalcijuma izmerenog u nesklerostinskoj grupi. Neutrališuće antitelo protiv sklerostina je definisano kao ono koje uzrokuje statistički značajno povećanje taloženja kalcijum fosfata (izmereno kao kalcijum) u poređenju sa količinom kalcijuma merenom samo u grupi tretiranoj sklerostinom (tj. bez antitela). Da bi se utvrdilo da li je anti-sklerostinsko antitelo neutrališuće ili nije, količina antisklerostinskog antitela koja se koristi u analizi mora da bude takva da postoji višak molova sklerostinskih mesta vezivanja po bazenčiću u poređenju sa brojem molova sklerostina po bazenčiću. U zavisnosti od jačine antitela, potrebna količina viška može da bude 24, 18, 12, 6, 3 ili 1,5, a jedan od stručnjaka je upoznat sa rutinskom praksom testiranja više od jedne koncentracije vezujućeg agensa (antitela). Na primer, vrlo jako anti-sklerostinsko neutrališuće antitelo će neutralisati sklerostin kada postoji manje od 6-puta viška molova sklerostinskih mesta vezivanja po bazenčiću u poređenju sa brojem molova sklerostina po bazenčiću. Neutrališuće antitelo protiv sklerostina manje jačine će neutralisati sklerostin samo sa viškom od 12, 18 ili 24 puta.

[0031] Antitelo protiv sklerostina ima opcionalno IC50od 100 nM ili manje, ili 75 nM ili manje, ili 50 nM ili manje, ili 25 nM ili manje za neutralizaciju humanog sklerostina u testu na bazi ćelija, kao što je test koštano specifične alkalne fosfataze, na primer, ispitivanje koštano specifične alkalne fosfataze je opisano u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2008/115732 i U.S. patentu br.

7,744,874. Test koštano specifične alkalne fosfataze je predikativan na sposobnosti sklerostina da smanji nivoe BMP-4 i Wnt3a-stimulisane alkalne fosfataze u multipotencijalnoj ćelijskoj liniji miševa, C2C12. Prema WO 2008/115732, neutrališuće anti-sklerostinsko antitelo posreduje u zavisnosti od doze povećanje aktivnosti alkalne fosfataze u ovom testu. Primeri protokola testova na bazi ćelija su obezbeđeni u Primeru 1.

[0032] Alternativno ili osim toga, anti-sklerostinsko antitelo ima IC50od 100 nM ili manje (npr.75 nM ili manje, ili 50 nM ili manje) za neutralizaciju humanog sklerostina u ćelijskom Wnt signalizacijskom testu u HEK293 ćelijskim linijama, kao što je Wnt test koji uključuje Wnt1-posredovanu indukciju reporterskog gena STF, opisanog u npr. Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2009/047356. Alternativno ili pored toga, anti-sklerostinsko antitelo ima IC50od 500 nM ili manje (npr. 250 nM ili manje, 150 nM ili manje, 100 nM ili manje, ili 50 nM ili manje) za neutralizaciju humanog sklerostina u BMP2-indukovanom testu mineralizacije u MC3T3 ćelijama, kao što je ispitivanje mineralizacije opisano u npr. Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2009/047356. Primerni protokol je obezbeđen u Primeru 1.

[0033] Primeri anti-sklerostinskih antitela, pogodnih za upotrebu u kontekstu prema pronalasku, opisani su u Američkim patentnim publikacijama brojeva 20070110747 i 20070072797. U jednoj realizaciji prema pronalasku, anti-sklerostinsko antitelo unakrsno blokira vezivanje najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-1, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-12, At-19, At-20, At-23 ili At-24 (od kojih su sva opisana u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747 i aminokiselinskih sekvenci koje su prikazane na slici 1) za sklerostin. Alternativno ili pored toga, anti-sklerostinsko antitelo je unakrsno blokirano od vezivanja za sklerostin pomoću najmanje jednog od antitela At-A, At-B, At-1, At-4, At-5, At-6, At-7, At-8, At-9, At-10, At-12, At-19, At-20, At-23 ili At-24 (od kojih su sva opisana u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747). U jednoj realizaciji prema pronalasku, anti-sklerostinsko antitelo unakrsno blokira vezivanje

1

referentnog antitela za sklerostin SEK ID BR: 1 ili je unakrsno-blokirano od vezivanja za sklerostin SEK ID BR: 1 referentnim antitelom, pri čemu referentno antitelo sadrži (a) lake lance koje sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 205 i teške lance koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SEK ID BR: 209; (b) lake lance koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 15 i teške lance koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 19; ili (c) lake lance koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 7 i teške lance koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 11.

[0034] Izrazi "unakrsno-blokira", "unakrsno-blokiran" i "unakrsno-blokiranje" su ovde korišćeni naizmenično tako da označavaju sposobnost antitela da ometa vezivanje drugih antitela za sklerostin. Opseg do kojeg je antitelo sposobno da ometa vezivanje drugog za sklerostin, a stoga i da li se može reći da unakrsno blokira, može biti određeno korišćenjem testova kompetitivnog vezivanja. U nekim aspektima pronalaska, unakrsno-blokirajuće antitelo ili njegov fragment smanjuje sklerostinsko vezivanje referentnog antitela između oko 40% i oko 100%, kao što je oko 60% i oko 100%, konkretno između 70% i 100% i konkretnije između 80% i 100%. Posebno pogodna kvantitativna analiza za otkrivanje unakrsnog-blokiranja koristi Biacore uređaj koji meri stepen interakcija korišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonance. U tom smislu, antisklerostinsko antitelo se opciono vezuje za sklerostin u testu površinske plazmonske rezonance tako da tokom testa u prisustvu referentnog antitela, snimljeno vezivanje je između 80% i 4% (npr. između 75% i 4 % ili između 70% i 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja (tj. suma vezivanja svakog antitela kada prelazi površinu sklerostina samostalno). Još jedan odgovarajući kvantitativni test unakrsnog blokiranja koristi pristup baziran na ELISA tehnici za merenje konkurencije između antitela u smislu njihovog vezivanja za sklerostin. U tom smislu, anti-sklerostinsko antitelo u rastvoru u ELISA testu uzrokuje smanjenje između 60% i 100% (npr. između 70% i 100% ili između 80% i 100%) u količini sklerostina koji je vezan pomoću imobilisanog referentnog antitela i / ili referentno antitelo u rastvoru u ELISA testu uzrokuje smanjenje između 60% i 100% (npr. između 70% i 100% ili između 80% i 100%) u količini sklerostina koji je vezan od strane antisklerostinskog antitela, u poređenju sa količinom sklerostina vezanog u odsustvu antisklerostinskog antitela ili referentnog antitela u rastvoru. Testovi za detekciju unakrsnog blokiranja anti-sklerostinskih antitela i referentnog antitela su dalje opisani u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747.

[0035] Primeri pogodnih anti-sklerostinskih antitela i njihovih fragmenata prema pronalasku, obuhvataju antitela i fragmente antitela koji imaju jedan ili više od CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 specifično obelodanjenih u Američkoj patentnoj publikaciji br.

20070110747. Najmanje jedan od regiona CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, može imati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju (npr. konzervativna aminokiselinska supstitucija), obezbeđeno da antitelo zadržava specifičnost vezivanja ne-supstituisanog CDR-a. Poželjno, antitelo protiv sklerostina je At-4 ili At-5 iz Američke patentne publikacije br.

20070110747.

[0036] Pored toga, antitelo protiv sklerostina iz pronalaska, može da sadrži najmanje jednu CDR sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti (npr.100% identičnosti) sa CDR odabranom od SEK ID BR-a: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 i 360 koje su navedene u listingu sekvenci i obelodanjene u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747. Poželjno, antitelo protiv sklerostina iz pronalaska sadrži najmanje jednu CDR sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti sa CDR odabranim od SEK ID BR-a: 245, 246, 247, 78, 79, 80, 269, 270, 271, 239, 240, i 241, od kojih su sve navedene u listingu sekvenci i opisane u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747. Kao što je opisano u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747, anti-sklerostinsko antitelo iz pronalaska, može da sadrži: a) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 54, 55 i 56 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 51, 52 i 53; b) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 60, 61 i 62 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 57, 58 i 59; c) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 48, 49 i 50 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 45, 46 i 47; d) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 42, 43 i 44 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 39, 40 i 41; e) CDR sekvence SEK ID BR-a: 275, 276 i 277 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 287, 288 i 289; f) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 278, 279 i 280 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 290, 291 i 292; g) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 78, 79 i 80 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 245, 246 i 247; h) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 81, 99 i 100 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 248, 249 i 250; i) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 101, 102 i 103 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 251, 252 i 253; j) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 104, 105 i 106 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 254, 255 i 256; k) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 107, 108 i 109 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 257, 258 i 259; l) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 110, 111 i 112 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 260, 261 i 262; m) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 281, 282 i 283 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 293, 294 i 295; n) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 113, 114 i 115 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 263, 264 i 265; o) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 284, 285 i 286 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 296, 297 i 298; p) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 116, 237 i 238 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 266, 267 i 268; q) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 239, 240 i 241 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 269, 270 i 271; r) CDR sekvence od SEK ID BR-

1

a: 242, 243 i 244 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 272, 273 i 274; ili s) CDR sekvence od SEK ID BR-a: 351, 352 i 353 i CDR sekvence od SEK ID BR-a: 358, 359 i 360.

[0037] Antitelo protiv sklerostina sadrži CDR sekvence koje imaju 100% identičnosti sa CDR od CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 , i CDR-L3 gde CDR-H1 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 245, CDR-H2 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 246, CDR-H3 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 247, CDR-L1 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 78, CDR-L2 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 79 i CDR-L3 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 80, od kojih su sve obezbeđene u listingu sekvenci i opisane u Američkoj patentnoj publikaciji br. 20070110747. Antitelo protiv sklerostina, u različitim aspektima prema pronalasku, sadrži dva od CDR-a ili tri od CDR-a ili šest od CDR-a. Opciono, anti-sklerostinsko antitelo sadrži teške lance koje sadrže SEK ID BR: 378 i lake lance koji sadrže SEK ID BR 376.

[0038] Antitelo protiv sklerostina prema pronalasku takođe, može da sadrži najmanje jednu CDR sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti (npr. 100% identična) sa CDR-om odabranim od CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 , i CDR-L3 gde CDR-H1 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 269, CDR-H2 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 270, CDR-H3 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 271, CDR-L1 ima sekvencu koja je data u SEK ID BR: 239, CDR-L2 ima sekvencu datu u SEK ID BR: 240 i CDR-L3 ima sekvencu datu u SEK ID BR 241, od kojih su sve prikazane u listingu sekvenci i opisane u U.S. patentnoj publikaciji br. 20070110747. Antitelo protiv sklerostina, u različitim aspektima prema pronalasku, sadrži dva CDR-a ili tri CDR-a ili šest CDR-a.

[0039] Alternativno, anti-sklerostinsko antitelo, može imati teški lanac koji sadrži CDR-ove H1, H2 i H3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEK ID BR: 137 ili njegovu varijantu u kojoj su navedeni CDR-i 100% identični sa SEK ID BR: 245, 246 i 247, respektivno i laki lanac koji sadrži CDR-ove L1, L2 i L3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 133 ili njegovu varijantu u kojoj su navedeni CDR-i 100% identični sa SEK ID BR: 78, 79 i 80, respektivno (kao što je opisano u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747).

[0040] Antitelo protiv sklerostina, može imati teški lanac koji sadrži CDR-ove H1, H2 i H3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 145 ili 392 ili njegovu varijantu u kojoj su navedeni CDR-i 100% identični sa SEK ID BR: 245, 246 i 247, respektivno i laki lanac koji sadrži CDR-ove L1, L2 i L3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 141 ili njegovu varijantu u kojoj su pomenuti CDR-i 100% identični sa SEK ID BR: 78, 79 i 80, respektivno (kao što je opisano u Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747).

[0041] Antitelo protiv sklerostina prema pronalasku, može imati teški lanac koji sadrži CDR regione H1, H2 i H3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 335, 331, 345 ili 396 ili varijantu bilo koje od prethodnih u kojoj su CDR-i najmanje 75% (npr. 100%

1

identični) identični sa SEK ID BR: 269, 270 i 271, respektivno, i laki lanac koji sadrži CDR regione L1, L2 i L3 i koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 334 ili 341 ili varijantu bilo koje od prethodnih u kojoj su pomenuti CDR-i najmanje 75% identični (npr.100% identični) sa SEK ID BR: 239, 240 i 241, respektivno (kao što je opisano u Američkoj patentoj publikaciji br. 20070110747). Sve kombinacije sekvenci teškog i lakog lanca su razmatrane pronalaskom (npr., teški lanci koji sadrže SEK ID BR: 335 i laki lanci koji sadrže SEK ID BR: 334; teški lanci koji sadrže SEK ID BR: 331 i laki lanci koji sadrže SEK ID BR: 334 ili 341; i teški lanci koji sadrže SEK ID BR: 345 ili 396 i laki lanci koji sadrže SEK ID BR: 341). Identičnost sekvenci od varijanti može sadržati, npr., najmanje oko 75%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili 100% identičnosti prema referentnoj sekvenci.

[0042] Antitelo protiv sklerostina, može imati teški lanac koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 145 ili 392, i laki lanac koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu obezbeđenu u SEK ID BR: 141; (kao što je opisano u Američkoj patentnoj publikaciji br.

20070110747).

[0043] Primeri antitela protiv sklerostina takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-sklerostinska antitela koja su otkrivena u Međunarodnim patentnim publikacijama brojeva WO 2008/092894, WO 2008/115732, WO 2009/056634, WO 2009/047356, WO 2010/100200, WO 2010/100179, WO 2010/115932 i WO 2010/130830, kao što je antitelo protiv sklerostina koje obuhvata CDR regione od SEK ID BR-a: 20-25 Međunarodne patentne publikacije br. WO 2008/115732 (SEK ID BR-a: 416-421 ovde), antitelo protiv sklerostina koje sadrži CDR regione od SEK ID BR-a: 26-31 Međunarodne patentne publikacije br. WO 2008/115732 (SEK ID BR-a: 422-427 ovde), antitelo protiv sklerostina koje sadrži CDR regione od SEK ID BR-a: 32-37 Međunarodne patentne publikacije br. WO 2008/115732 (SEK ID BR-a : 428-433 ovde), antitelo protiv sklerostina koje sadrži CDR regione od SEK ID BR-a: 4, 15, 26, 37, 48 i 59 Međunarodne patentne publikacije br. WO 2009/047356 (SEK ID BR-a: 443, 454, 465, 476, 487 i 498 ovde), ili antitelo protiv sklerostina koje sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje jedne od SEK ID BR-a: 135-143, 153-161 ili 171-179 Međunarodne patentne publikacije br. WO 2010/130830 (SEK ID BR-a: 745-753, 763-771 ili 781-789 ovde).

[0044] Pronalazak takođe, uključuje primenu antitela protiv sklerostina u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih pogodnih agenasa kod subjekta, od kojih se svaki primenjuje prema režimu pogodnom za to aktivno sredstvo. Strategije primene uključuju, istovremenu primenu (tj. suštinsku istovremenu primenu) i primenu koja nije istovremena (tj. primenu u različitim vremenima, u bilo kom redosledu, bilo da se preklapaju ili ne) antitela protiv sklerostina i jedno ili više dodatnih pogodnih sredstava. Bilo bi poželjno da se različite komponente opciono primenjuju u istim ili u odvojenim kompozicijama, i istim ili različitim načinima primene.

1

[0045] Opciono, dodatni agens(i) angažuju mehanizam dejstva koji se razlikuje od antitela protiv sklerostina i obezbeđuju korist za subjekta. Pogodni dodatni agens(i) uključuju, ali nisu ograničeni na kalcijum; vitamine (npr., vitamin D); agense protiv resorpcije, kao što su RANKL inhibitori (npr., anti-RANKL antitela, kao što je PROLIA®), bisfosfonati (npr. alendronat natrijum (FOSAMAX®), risedronat (ACTONEL®), ibandronat natrijum (BONIVA®) ili zoledronska kiselina (RECLAST®)), kalcitonin, jedinjenja stroncijuma (npr. stroncijum ranelat), selektivne modulatore estrogenskih receptora (SERM) (npr. raloksifen), antagoniste katepsina K (npr. odanakatib) i derivate estrogena (npr. konjugovani konjski estrogen)); anaboličke agense, kao što je paratiroidni hormon ili njegovi analozi (npr., teriparatid (FORTEO®); antibiotike; hormonsku terapiju; i sredstva protiv inflamacije (npr., nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID) ili steroidne antiinflamatorne supstance). Količina dodatnog agensa će varirati u zavisnosti od subjekta i prisustva ili odsustva dodatnih terapijskih potreba. Na primer, u različitim izvođenjima, subjektu se primenjuje najmanje oko 1000 mg kalcijuma i najmanje oko 400 IU vitamina D dnevno, tokom perioda tretmana. Kod subjekata koji imaju nivo vitamina D ispod 40 ng / mL, opciono se primenjuje početna doza od 50,000 IU vitamina D. U različitim realizacijama, jedan ili više dodatnih agensa(asa) se primenjuju nakon perioda terapije kao terapija održavanja.

[0046] Različiti putevi primene antitela kod subjekta su poznati u struci i razmatrani su u, na primer, Američkoj patentnoj publikaciji br.20070110747. Na primer, u različitim realizacijama, poželjno je da se farmaceutski preparat koji sadrži antitela protiv sklerostina isporuči subkutano, parenteralno, intravenozno, intramuskularno ili čak intraperitonealno. Takvi pristupi su dobro poznati stručnjacima, od kojih su neki dalje opisani, na primer, u Američkim patentima brojeva 5,543,158; 5,641,515; i 5,399,363. Opciono, anti-sklerostinsko antitelo je primenjeno kod žena u postmenopauzi subkutano. Ilustrativni fiziološki-prihvatljivi (na pr., farmaceutski) oblici pogodni za upotrebu, uključuju, sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremu ex tempore sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija (na primer, videti U.S. Patent br. 5,466,468). Oblik mora biti sterilan i poželjno je tečnost u meri u kojoj postoji lako ubrizgavanje (tj. nije previše viskozan, tako kao da sprečava prolaz kroz špric). Bilo koji volumen nosača je pogodan za primenu anti-sklerostinskog antitela; u različitim realizacijama, anti-sklerostinsko antitelo se primenjuje subkutano u zapremini od dva mililitara ili manje (npr., 1,5 mL ili manje, 1 mL ili manje, 0,88 mL ili manje, ili 0,5 mL ili manje). Za isporuku željene doze, mogu se koristiti više injekcija (npr. željena doza od 210 mg anti-sklerostinskog antitela je primenjena putem dve subkutane injekcije od 105 mg anti-sklerostinskog antitela rastvorenog u 0,88 ml nosača). Farmaceutski preparat koji sadrži anti-sklerostinsko antitelo, može biti smešten u kontejnere (npr. bočice ili špriceve), zajedno sa pakovnim materijalom koji obezbeđuje uputstva u vezi sa upotrebom takvih farmaceutskih preparata. Generalno, takva uputstva će uključiti konkretan izraz koji opisuje koncentraciju

1

reagensa, kao i u okviru određenih realizacija, relativne količine sastojaka ekscipijenasa ili razblaživača (npr., vode, fiziološkog rastvora ili PBS-a) koji bi mogli biti potrebni za konstituisanje farmaceutskog preparata.

[0047] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima. Primer služi samo da ilustruje pronalazak i nije namenjen da na bilo koji način ograniči obim pronalaska.

PRIMERI

Primer 1

[0048] Ovaj primer opisuje različite testove neutralizacije zasnovane na ćelijama koje su korisne za karakterizaciju aktivnosti neutralizacije anti-sklerostinskog antitela.

[0049] Test mineralizacije baziran na ćelijama MC3T3 - Askorbinska kiselina i B-glicerofosfat su korišćeni da indukuju diferencijaciju ćelija MC3T3-E1-BF, što dovodi do mineralnog taloženja. Primeran protokol skrininga, u formatu od 96 bazenčića, uključuje nanošenje ćelija u danu 1, nakon čega sledi sedam promena medijuma tokom perioda od 12 dana, pri čemu se većina mineralnih taloženja odvija u poslednjih osamnaest sati. Specifični vremenski periodi i stepen mineralnog taloženja se mogu razlikovati u zavisnosti, delimično od posebnog lot broja seruma koji je korišćen. Kontrolni eksperimenti će omogućiti da se takve varijable obračunaju, kao što je to dobro poznato u tehnici eksperimentisanja ćelijske kulture uopšte. Za statističku analizu (korišćenje MS Excel i JMP), jedno-faktorska ANOVA, praćena Dunnett-ovim upoređivanjem, može se koristiti za određivanje razlika između grupa. Prosečne grupe za svaki skup podataka se smatraju značajno različitim kada je vrednost P manja od 0,05 (P <0,05).

[0050] Ćelijska kultura za ekspanziju ćelija MC3T3-E1-BF je izvedena na sledeći način. Ćelijska kultura je izvedena na 37 ° C i 5% CO2. Banka ćelija, može biti generisana za potrebe skrininga za antitela koja neutrališu sklerostin. Jedna bočica zamrznutih MC3T3-E1-BF ćelija je odmrznuta mešanjem u vodenom kupatilu od 37 ° C. Odmrznute ćelije su stavljene u 10 mililitara medijuma za širenje (Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu) u 50 ml epruveti i blago centrifugirane 5 minuta. Ćelije se zatim resuspendovene u 4 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon utvrđivanja broja ćelija korišćenjem tripan plavog i hemacitometra, 1 x 10<6>ćelija je naneto u 50 mililitara Alfa-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu medija u jednoj T175-boci.

[0051] Kada je taj prolaz konfluentan (na otprilike 7 dana), ćelije se tripsinizovane sa tripsinom / EDTA (0,05% tripsina, 0,53 mM EDTA), blago centrifugirane tokom 5 minuta i zatim resuspendovane u 5 mililitara Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon određivanja broja ćelija korišćenjem tripan plavog i hemacitometra, ćelije su nanošene pri 1 x 10<6>ćelija u 50 mls

1

Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu medija po jednoj T175 boci. Broj boca T175 korišćenih za nanošenje u ovoj tački zavisi od ukupnog broja dostupnih ćelija i željenog broja boca koje treba proslediti u naredni prolaz.

[0052] Kada je taj prolaz konfluentan (oko 3-4 dana), ćelije su tripsinizovane sa tripsinom / EDTA (0,05% tripsin, 0,53 mM EDTA), blago centrifugirane tokom 5 minuta i zatim resuspendovane u 5 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon utvrđivanja broja ćelija korišćenje tripan plavog i hemacitometra, ćelije su nanošene pri 1 x 10<6>ćelija u 50 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu medija po jednoj boci T175. Broj boca T175 koje se koriste za nanošenje u ovoj tački zavisi od ukupnog broja ćelija na raspolaganju i željenog broja boca koje treba proslediti u naredni prolaz.

[0053] Kada je taj prolaz konfluentan (oko 3-4 dana), ćelije su tripsinizovane sa tripsinom / EDTA (0,05% tripsin, 0,53 mM EDTA), nežno centrifugirane tokom 5 minuta i zatim resuspendovane u 5 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon utvrđivanja broja ćelija koristeći tripan plavo i hemacitometar, ćelije su nanesene pri 1 x 10<6>ćelija u 50 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu medija po jednoj boci T175. Broj boca T175 koje se koriste za nanošenje u ovoj tački zavise od ukupnog broja ćelija na raspolaganju i željenog broja boca koje treba proslediti u naredni prolaz. Ekstra ćelije su zamrznute pri 1-2 x 10<6>živih ćelija / ml u 90% FBS / 10% DMSO.

[0054] Kada je taj prolaz konfluentan (oko 3-4 dana), ćelije su tripsinizovane sa tripsinom / EDTA (0,05% tripsin, 0,53 mM EDTA), blago centrifugirane tokom 5 minuta i zatim resuspendovane u 5 mls Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon utvrđivanja broja ćelija korišćenjem tripan plavog i hemacitometra, ćelije su zamrznute pri 1-2 x 10<6>živih ćelija / ml u 90% FBS / 10% DMSO. Ovaj "završni prolaz" zamrznutih ćelija je prolaz koji je korišćen za test skrininga.

[0055] Ćelijska kultura za mineralizovanje MC3T3-E1-BF ćelija je izvedena na sledeći način. Ćelijska kultura je izvedena na 37 ° C i 5% CO2. Poželjno je minimizirati temperaturu i % fluktuacije CO2tokom postupka mineralizacije ćelijske kulture. Odgovarajući broj "završnih prolaznih" bočica pripremljenih, kao što je gore opisano, odmrznut je mešanjem u vodenom kupatilu od 37 ° C. Odmrznute ćelije su postavljene u 10 mililitra ekspanzionog medijuma (Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu) u 50 ml epruveti i blago centrifugirane tokom 5 minuta. Ćelije su zatim resuspendovane u 4 mililitara Alpha-MEM / 10% FBS / PenStrepGlu. Nakon određivanja broja ćelija pomoću tripan plavog i hemacitometra, 2500 ćelija je nanošeno u 200 mikrolitara ekspanzionog medija po bazenčiću, na pločama sa 96 bazenčića obloženim sa kolagenom I (Becton Dickinson Labware, kat # 354407).

[0056] Primerna procedura ćelijske kulture je sledeća. Početni dan za nanošenje ćelija je označen da bude sreda. Ako se drugi dan u nedelji koristi kao početni dan za nanošenje ćelija, taj dan će pokrenuti dnevni raspored za uklanjanje i dodavanje medija tokom čitavog procesa, kao što je

2

navedeno u nastavku. Na primer, ako su ćelije nanošene u utorak, mediji ne bi trebalo da se uklanjaju i dodaju prvog petka i subote, niti drugog petka i subote. Sa početkom u utorak, ploče će biti pripremljene za analizu kalcijuma u poslednjoj nedelji. Ćelije su nanošene u sredu pri 2500 ćelija u 200 μl ekspanzionog medija. U četvrtak je uklonjen sav ekspanzioni medijum i dodato je 200 μl medija za diferencijaciju. U petak je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. U ponedjeljak je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. U utorak je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. U sredu je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. U četvrtak je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. U petak je uklonjeno 100 μl medija i dodato je 100 μl svežeg diferencijacijskog medija. Sledećeg ponedeljka ploče su pripremljene za analizu kalcijuma na sledeći način: Ploče su isprane jednom sa 10 mM Tris, HCl pH 7-8. Radeći pod zaštitom od pare, po jednom bazenčiću je dodato 200 μl 0,5 N HC1. Ploče su onda zamrznute na -80 ° C. Neposredno pre merenja kalcijuma, ploče su dvaput zamrznute-odmrznute, a zatim se trituracija pomoću višekanalne pipete koristi za disperziju sadržaja ploče. Zatim je omogućeno da se sadržaj ploče slegne na 4 ° C tokom 30 minuta, pri tački u kojoj je uklonjena odgovarajuća količina supernatanta za merenje kalcijuma, korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta kalcijuma. Primeran i ne ograničavajući komplet je kalcijum (CPC) Liquicolor, Kat.0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.

[0057] U ovom testu na bazi ćelija, sklerostin inhibira jednu ili više sekvenci događaja koji vode do i uključujući taloženje minerala (t.j., sklerostin inhibira mineralizaciju). Stoga, u eksperimentima u kojima je sklerostin uključen u eksperimentu određene ćelijske kulture, rekombinantni sklerostin se dodaje u medije polazeći od prvog četvrtka i svakog dana hranjenja nakon toga. U slučajevima kada se antitelo protiv sklerostina ispituje na sposobnost neutralizacije sklerostina, tj. omogućujući mineralizaciju neutralisanjem sposobnosti sklerostina da inhibira mineralizaciju, antitelo se dodaje u medije počevši od prvog četvrtka i svakog dana hranjenja nakon toga. Antitelo je prethodno inkubirano sa rekombinantnim sklerostinom u medijumu diferencijacije tokom 45-60 minuta na 37 ° C, a zatim je ovaj medijum korišćen za hranjenje ćelija.

[0058] Gore opisan je 12-dnevni protokol mineralizacije za MC3T3-E1-BF ćelije. Mineralizacija originalnih MC3T3-E1 ćelija je inhibirana pomoću rekombinantnog sklerostina i ova inhibicija je blokirana korišćenjem neutrališućeg antitela protiv sklerostina, npr. anti-sklerostinsko antitelo koje sadrži CDR-ove od SEK ID BR: 245-247 i 78-80. Test neutralizacije na bazi ćelija je dalje opisan u Američkoj patentnoj publikaciji br.7,592,429 kod, na primer, primera 8

[0059] Ispitivanje alkalne fosfataze specifične za kosti - Primer ispitivanja koštano specifične alkalne fosfataze je opisan u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2008/115732 i Američkom patentu br.7,744,874. Primerni protokol je sledeći. C2C12 ćelije (ATCC, CRL 1772) su nanošene pri 3000-5000 ćelija / bazenčić u ploči za kulturu tkiva sa 96 bazenčića u MEM medijumu uz dodatak 5% fetalnog telećeg seruma. Ploča je inkubirana na 37 ° C u 5% CO2 preko noći. Antitelo je razblaženo u 0,5X Wnt3a-kondicioniranom medijumu (pripremljenom kao što je opisano u WO 2008/115732) do različitih završnih koncentracija. Medijum je uklonjen iz zasejanih ćelija i dodat je prethodno izmešan antitelo-BMP4-sklerostinski rastvor (humani ili cynomologous majmuna) (150 μl), obezbeđujući završnu koncentraciju antitela od 30 μg / ml do 0,5 μg / ml, završnu koncentraciju BMP-4 od 25 ng / ml, završnu koncentraciju sklerostinskog proteina od 1,0 μg / ml, a kondicionirani medijum je pri koncentraciji 0,5X. Ploča je zatim inkubirana na 37 ° C u 5% C02 tokom 72 sata. Medijum je uklonjen iz ćelija, koje su isprane jednom sa PBS-om, a zamrznute i odmrznute tri puta naizmenično između -80 ° C i 37 ° C. Aktivnost alkalne fosfataze je merena dodavanjem supstrata alkalne fosfataze (1-step PNPP, Pierce # 37621) (150 μl / bazenčić). Ploča od ćelija je inkubirana tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi, pri čemu je optička gustina (OD) merena na 405 nm za određivanje aktivnosti alkalne fosfataze. Izračunavanja IC50mogu biti izvedena korišćenjem, na primer, SigmaPlot Regression Wizard sa jednačinom za 4 parametra Sigmoida.

[0060] BMP2-indukovani test mineralizacije MC3T3 ćelije - Primeran BMP2-indukovani test mineralizacije u MC3T3 ćelijama je opisan u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2009/047356. Ukratko, ćelije MC3T31b se zasejane u ploče sa 96 bazenčića (npr., 6 x 10<3>ćelija / bazenčić ili 2 x 10<3>ćelija / bazenčić) u 100 μl ispitivanog medijuma za kulturu (održavanje medijuma kulture bez G418) i inkubiranog tokom tri dana da bi se dostiglo sastavljanje. Ispitivani medijum kulture je menjan i jedinjenja koja se testiraju su dodata sa 10 mM b-glicerofosfatom i 50 μM askorbinske kiseline. Pre dodavanja ćelijama, sklerostin i kandidatsko antitelo su prethodno inkubirani na zasebnoj ploči tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Za ispitivanje ploča sa 96 bazenčića, primenjeno je 2,1 ili 2,8 nM BMP-2 (R & D sistemi, Kat # 355-BM-010) pre nanošenja smeše sklerostin-antitelo. Ćelije su inkubirane tokom 14 dana. Na kraju inkubacije, ćelije su isprane dvaput sa 200 μl PBS / bazenčić, u svaki bazenčić je dodato 50 μl 0,5 M HC1, a ploče su zamrznute na -20 ° C u trajanju od najmanje 24 sata. Ploče su odmrznute na sobnoj temperaturi tokom 2 sata radi testiranja. Deset mikrolitara iz svakog bazenčića je preneseno na novu ploču i izloženo kalcijumskom radnom rastvoru (1: 5) (200μ1). Optička gustina je merena nakon perioda inkubacije 5-30 minuta na 595 nm na čitaču mikroploča. Apsorbancija je prevedena u mikrograme kalcijuma u skladu sa standardnom krivom, omogućavajući određivanje veličine BMP-2-indukovane mineralizacije.

[0061] Ispitivanje wnt signalizacije na osnovu ćelija - Primeran test signalizacije na bazi ćelija koji koristi super top flash (STF) reporterski protein je opisan u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br.

WO 2009/047356. HEK293 ćelije su transfektovane sa pcDNA3+ (480 ng); SuperTopFlash (STF) (20 ng); i phRL-CMV (0,5 ng) za kontrolne bazenčiće i pcDNA-wnt1 (20 ng); pcDNA3+ (460 ng); SuperTopFlash (STF) (20 ng); i phRL-CMV (0,5 ng) za Wnt1 ispitivane bazenčiće. Plazmidi su pomešani sa 1,6 μl Lipofektamina 2000 razblaženog u 50 μl OptiMEM® i inkubirani tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi pre primene na ćelijama. Nakon nanošenja, ćelije su inkubirane na 37 ° C u 5% CO2 tokom pet sati.

[0062] Antitela su prethodno izmešana sa SOST za generisanje serija razblaženja. Pripremljen je jedan ml medijuma za svako razblaženje, i nakon uklanjanja transfekcionih mešavina u svaki bazenčić je dodato 450 μl. Ćelije su inkubirane sa smešama antitela-SOST tokom 18-20 sati. Na kraju inkubacije, medijum je uklonjen i dodato je 300 μl 1X pasivnog pufera za lizu (Promega, Kat # E194A) u rastvorene ćelije. Zatim je izmerena aktivnost luciferaze korišćenjem Dual-Glo Luciferase sistema (Promega, Kat # E2940) sa 30 μl lizata u duplikatima. Tipično, korišćeno je 30 μl Dual-Glo luciferaze (firefly luciferase; za STF) i 30 μl Dual-Glo Stop i Glo (Renilla luciferase; za kontrolu efikasnosti transfekcije) supstrata. Luminescentni signali su mereni pomoću Mithras LB940 instrumenta (Berthold Technologies). Izračunava se odnos firefly prema Renilla luciferazama. Konačni rezultati su izraženi postavljanjem vrednosti Wnt1 bez SOST-a kao 1. Dodatni detalji analize su navedeni u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2009/047356.

Primer 2

[0063] Ovaj primer opisuje in vivo studije gde je antitelo protiv sklerostina poboljšalo mineralnu gustinu kostiju kod žena u postmenopauzi.

[0064] Sprovedena je multicentrična, međunarodna, randomizovana, paralelna grupna studija kod žena u postmenopauzi sa niskim BMD u lumbalnim pršljenovima, totalnog boka ili femoralnog vrata. 419 subjekata je randomizovano da prima jedan od pet režima antitela protiv sklerostina, placebo, otvoreno označen alendronat (ALN) ili otvoreno označen teriparatid (TPTD) tokom 12 meseci. Placebo grupa je bila dalje randomizovana kako bi se podudarala sa rasporedima koji odgovaraju antitelima protiv sklerostima u pet režima. Distribucija subjekata je bila sledeća: 52 subjekta u grupi placebo, 51 subjekta u ALN grupi, 55 subjekta u TPTD grupi, a 51, 54, 51, 53 i 52 subjekta za anti-sklerostinsko antitelo 70 mg QM, 140 mg Q3M, 140 mg QM, 210 mg Q3M i 210 mg QM grupe, respektivno. 383 subjekta je završilo 12-mesečnu studiju. Među svim ispitanicima upisanim u studiju, prosečna starost je bila 66,8 godina, 86,4% ispitanika su bili belci, a početni BMD T-rezultati proseka pre tretmana lumbalnih pršljenova i ukupno kuka su bili -2,29 i -1,53, respektivno. Primarna analiza se dogodila nakon što su svi subjekti imali priliku da završe studijsku 12-mesečnu posetu. BMD je meren pomoću DXA. Ukupno, proporcije pacijenata koji su

2

prijavljivali neželjene događaje su bile uravnotežene između placebo grupe i grupa antisklerostinskih antitela.

Mineralna gustina kostiju

[0065] Promena BMD procenta lumbalnih pršljenova od osnove pre tretmana u šestom mesecu: U šestom mesecu, prosečna promena procenta BMD lumbalnih pršljenova od osnovne pre tretmana u kontrolnim grupama je bila u placebo grupi 0,3%, u grupi alendronata 2,6% i u TPTD grupi 4,8%. U grupama anti-sklerostinskih antitela, srednja procentualna promena BMD lumbalnih pršljenova od osnovne pre tretmana je bila u 70 mg QM grupi 4,1%, u 140 mg Q3M grupi 4,2%, u 210 mg Q3M grupi 4,4%, u 140 mg QM grupi 7,1% i u 210 mg QM grupi 8,2%. U poređenju sa placebo grupom, svaka od grupa antitela protiv sklerostina značajno povećava BMD lumbalnih pršljenova u šestom mesecu (p-vrednosti <0,0001).

[0066] BMD procenat lumbalnih pršljenova se menja od početnog nivoa lečenja u 12 mesecu: u 12 mesecu, prosečna promena procenta BMD lumbalnih pršljenova od osnovnog pre lečenja u kontrolnim grupama je bila u placebo grupi -0,1%, u grupi alendronata 4,1% i u grupi TPTD-a 7,1%. U grupama anti-sklerostinskih antitela, prosečna promena procenta BMD lumbalnog pršljena od osnovnog pre lečenja je bila u 70 mg QM grupi 5,4%, u 140 mg Q3M grupi 5,4%, u 210 mg Q3M delu 5,5%, u 140 mg QM grupi 9,1% i u 210 mg QM grupi 11,3%. Svaka od grupa antisklerostinskih antitela je značajno povećala BMD lumbalnih pršljenova u dvanaestom mesecu (pvrednosti <0,0001) nakon podešavanja za mnoštvo. Prosečna procentna promena u odnosu na početnu liniju prethodnog lečenja BMD-a lumbalnih pršljenova putem poseta i upoređivanja sa aktivnim otvoreno-obeleženim kontrolama je rezimirana u tabeli A.

TABELA A: Promena BMD % lumbalnih pršljenova od osnovnog za 12 meseci

[0067] Ukupni BMD procenat kuka se menja od osnove pre tretmana u mesecima 12 i 6: U 12 mesecu, srednja procentna promena ukupnog BMD kuka od osnovne pre tretmana je bila u kontrolnim grupama u placebo grupi -0,7%, u grupi alendronata 1,9% i u TPTD grupi 1,3%. U grupama anti-sklerostinskih antitela, ukupna srednja procentna promena BMD kuka od početnog nivoa pre lečenja je bila u 70 mg QM grupi 1,3%, u 140 mg Q3M grupi 1,3%, u 210 mg Q3M grupi 1,9%, u 140 mg QM grupi 3,4%, i u 210 mg QM grupi 4,1%. U poređenju sa placebo grupom, svaka od grupa anti-sklerostinskih antitela je značajno povećala BMD ukupnog kuka u toku 12 meseci (p-vrednosti <0,0001). U šestom mesecu, povećanje ukupnog BMD-a kuka u svakoj od grupa anti-sklerostinskog antitela je bilo značajno veće od onog u placebo grupi (p-vrednosti <0,0061). Prosečna procentualna promena od početne vrednosti pre tretmana u ukupnom BMD kuka nakon poseta i upoređivanjem sa aktivnim otvoreno-obeleženim kontrolama u 12 meseci je prikazana u Tabeli B.

2

TABELA B: Promena ukupnog BMD% kuka od početne osnove za 12 meseci

[0068] BMD procenat femoralnog vrata se menja u odnosu na početnu osnovu pre lečenja u mesecima 12 i 6: U dvanaestom mesecu, srednja procentualna promena BMD femoralnog vrata od osnovne pre tretmana je bila u kontrolnim grupama u grupi placeba -1,1%, u grupi alendronata 1,2% i u TPTD grupi 1,1%. U grupama antitela protiv sklerostina, srednja procentualna promena BMD femoralnog vrata od osnovne pre tretmana je bila u 70 mg QM grupi 0,6%, u 140 mg Q3M grupi 1,8%, u 210 mg Q3M grupi 1,4%, u 140 mg QM grupi 4,2%, i u 210 mg QM grupi 3,7%. U poređenju sa placebo grupom, svaka od grupa antitela protiv sklerostina je značajno povećala BMD femoralnog vrata u 12 mesecu (p-vrednosti <0,0044). U šestom mesecu, povećanje BMD femoralnog vrata u grupama anti-sklerostinskih antitela 140 mg QM, 210 mg QM i 210 mg Q3M je bilo značajno veće od onog u placebo grupi (p-vrednosti <= 0,0164). Povećanje se nije značajno razlikovalo od placeba u grupama anti-sklerostinskih antitela 70 mg QM i 140 mg Q3M (najniže doze za svaki raspored). Prosečna procentualna promena od osnovne pre tretmana u BMD-u femoralnog vrata putem posete i upoređivanja sa aktivnim otvoreno-obeleženim kontrolama je rezimirana u Tabeli C.

2

TABELA C: Promena BMD% femoralnog vrata od osnove za 12 meseci

[0069] Distalni 1/3 radijus BMD procenat se menja od početnog nivoa pre tretmana u mesecu 12: U mesecu 12, srednja procentualna promena distalnog 1/3 radijusa BMD-a od osnove pre lečenja je bila u kontrolnim grupama u grupi placeba -0,9%, u grupi alendronata -0,3% i u TPTD grupi -1,7%. U grupama antitela protiv sklerostina, srednja procentualna promena BMD-a femoralnog vrata od osnovne linije pre lečenja je bila u 70 mg QM grupi -1,8%, u 140 mg Q3M grupi -1,1%, u 210 mg Q3M grupi -0,4%, u 140 mg QM grupi -1,0% i u 210 mg QM grupi -1,2%. U poređenju sa placebo grupom, nema značajnog smanjenja distalnog 1/3 poluprečnika u 12 mesecu u bilo kojoj od grupa antitela protiv sklerostina.

Markeri kostiju

[0070] Procenat promene markera resorpcije kostiju (CTX): Za sve doze antitela protiv sklerostina, serumski CTX je na početku smanjen od početnog nivoa pre lečenja. Najveći srednji pad za sve grupe anti-sklerostinskih antitela je bio u prvoj nedelji, a veće doze su ostale ispod osnovice pre lečenja do 12 meseci.

[0071] Procenat promene u markerima formiranja kostiju (P1NP, BSAP i osteokalcina (OC)): Za sve doze antitela protiv sklerostina, P1NP, BSAP i OC su bili povećani od početnog nivoa pre tretmana u prvoj nedelji, dostigli maksimum u prvom mesecu i vratili se na osnovu pre tretmana između drugog meseca i šestog meseca . Na kraju 12. meseca posmatranja, markeri formiranja kostiju su se smanjili do nivoa ili ispod nivoa osnovne linije pre terapije. Ukupno, tri markera formiranja kostiju su pokazala slične profile.

2

[0072] Ovaj primer ilustruje sposobnost inventivne metode da značajno povećava BMD lumbalnih pršljenova, ukupnog kuka i femoralnog vrata. Dve najveće mesečne doze, 140 mg QM i 210 mg QM, značajno su povećale BMD lumbalnih pršljenova, ukupnog kuka i vrata femora u poređenju sa dva aktivna upoređivača, teriparatidom (QD) i alendronatom (QW). Veličina BMD-a posredovanog anti-sklerostinskim antitelom se povećava praćenjem modela doznog odgovora.

[0073] Smanjenje u koštanoj resorpciji povezano sa lečenjem antitelima protiv sklerostina, kao što je procenjeno sa CTX-om seruma primećeno u nedelji 1 (najranije izmerena vremenska tačka), a za QM režime je ostao ispod osnovnog nivoa pre lečenja tokom svih 12 meseci. Markeri formiranja kostiju su se povećali rano nakon početka lečenja antitelima protiv sklerostina i smanjivali su se tokom vremana u zavisnosti od doze, pri čemu su najviše doze povezane sa povećanim markerima u dužem vremenskom periodu. Nivoi markera formiranja kostiju su opadali na približno početne nivoe pre lečenja u roku od dva do šest meseci od početka lečenja. Sličan adaptivni odgovor nije bio primećen za alendronat ili teriparatid. Na primer, markeri za formiranje kostiju su ostali povišeni tokom lečenja teriparatidom. Osobito, BMD kod subjekta koji prima anti-sklerostinsko antitelo je nastavio da raste uprkos normalizaciji nivoa markera (tj. smanjenje nivoa markera za stvaranje kostiju od početnih nivoa pika i vraćanje nivoa resorpcije kostiju ka osnovnim nivoima). Na primer, u 140 mg QM grupi, BMD lumbalnih pršljenova je povećan oko 2% od šestog meseca do dvanaestog meseca od perioda lečenja, dok su markeri za obrazovanje kostiju bili na približno početnim nivoima pre lečenja.

2

Claims (11)

Patentni zahtevi

1.Antitelo protiv sklerostina obuhvata CDR-H1 iz SEK ID BR:245, CDR-H2 iz SEK ID BR:246, CDR-H3 iz SEK ID BR:247, CDR-L1 iz SEK ID BR:78, CDR-L2 iz SEK ID BR:79 i CDR-L3 iz SEK ID BR:80, za upotrebu u postupku za povećanje mineralne gustine kosti kod žena u postmenopauzi, taj postupak obuhvata isporuku ženi u postmenopauzi koja boluje od osteoporoze pomenutog antitela protiv sklerostina u količini i za period lečenja delotvoran da se poveća mineralna gustina kosti (BMD) pršljenova u lumbalnom delu najmanje 9% od polazne vrednosti pre terapije dvanaest meseci posle prvobitne isporuke antitela proitv sklerostina; pri čemu isporučena količina antitela protiv sklerostina jeste 140 mg do 210 mg i količina antitela protiv sklerostina je isporučena u vremenskom intervalu koji nije češći od jednom mesečno.

2.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se antitelo protiv sklerostina isporučuje u nekoj količini i tokom perioda lečenja dolotvornog da se poveća mineralna gustina kosti pršljenova lumbalnog dela kičme najmanje jedno standardno odstupanje od prvobitne vrednosti dvanaest meseci posle početne isporuke pacijentu antitela protiv sklerostina.

3.Antitelo proitv sklerostina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu se količina antitela protiv sklerostina isporučuje učestalošću od jednom mesečno tokom perioda lečenja od tri meseca do 18 meseci.

4.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu isporučena količina antitela protiv skelrostina iznosi 210 mg.

5.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu

(i) količina i period lečenja jesu delotvorni da bi se smanjio rizik od preloma pršljena i/ili nepršljenskih preloma;

i/ili

(ii) količina i period lečenja su delotvorni za povećanje ukupne mineralne gustine kostiju (BMD) kuka najmanje 3% od polazne vrednosti pre lečenja i to dvanaest meseci posle početne isporuke antitela protiv sklerostina.

6.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu antitelo protiv sklerostina jeste imunoglobulin koji obuhvata teške lance i lake lance.

7.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu to antitelo protiv sklerostina jeste IgG antitelo.

2

8.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, pri čemu to antitelo protiv sklerostina

(i) pokazuje afinitet vezivanja za sklerostin od SEK ID BR: 1 od manje od ili jednako sa 1 x 10<-7>M; (ii) sposobno da neutralizuje sklerostin kod ljudi u ogledu mineralizacije na bazi ćelije MC3T3 pri čemu postoji manje nego 6-struki višak molova mesta za vezivanje sklerostina po pregradi u poređenju sa brojem molova sklerostina po pregradi;

(iii) ima IC50od 100 nM ili manje, 50 nM ili manje, ili 25 nM ili manje za neutralizovanje sklerostina kod ljudi u ogledu na bazi ćelije, kao što je ogled alkalne fosfataze specifične za kost;

(iv) ima IC50od 100 nM ili manje za neutralizovanje sklerostina kod ljudi u ogledu signalizacije Wnt na bazi ćelije u HEK293 linijama ćelije;

(v) ima IC50od 500 nM ili manje za neutralizovanje sklerostina kod ljudi u BMP2 indukovanom ogledu mineralizacije u MC3T3 ćelijama;

(vi) se vezuje na polipeptid sklerostin koji obuhvata sekvencu aminokiseline iznetu datu u SEK ID BR:

1, pri čemu se pomenuto antitelo protiv sklerostina vezuje na sekvencu SEK ID BR: 6; ili (vii) unakrsno blokira vezivanje najmanje jednog od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-1, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab- 9, Ab-10, Ab-12, Ab-19, Ab-20, Ab-23, i Ab-24 do sklerostina i/ili unakrsno blokiranih za vezivanje na sklerostin pomoću najmanje jednog od antitela Ab-A, Ab-B, Ab-1, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-12, Ab-19, Ab- 20, Ab-23, i Ab-24.

9.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu to antitelo protiv sklerostina

(i) obuhvata teške lance koji obuhvataju SEK ID BR: 378 i lake lance koji obuhvataju SEK ID BR 376; ili

(ii) ima teške lance iz SEK ID BR: 145 ili SEK ID BR: 392 i lake lance iz SEK ID BR: 141.

10.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu to antitelo protiv sklerostina jeste

(i) monoklonalno antitelo; i/ili

(ii) humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

11.Antitelo protiv sklerostina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu je antiresorptiv isporučen čoveku posle perioda lečenja, opciono posle perioda lečenja od 12 meseci.

ntitelo protiv sklerostina za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 pri čemu je taj antiresorptiv:

(i) bisfosfonat;

(ii) RANKL inhibitor;

(iii) RANKL inhibitor pri čemu je taj RANKL inhibitor neko antitelo protiv RANKL; ili (iv) RANKL inhibitor pri čemu je taj RANKL inhibitor to denosumab antitelo protiv RANKL.

1