[go: up one dir, main page]

RS60503B1 - Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60503B1
RS60503B1 RS20200801A RSP20200801A RS60503B1 RS 60503 B1 RS60503 B1 RS 60503B1 RS 20200801 A RS20200801 A RS 20200801A RS P20200801 A RSP20200801 A RS P20200801A RS 60503 B1 RS60503 B1 RS 60503B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
binding
human
antigen
Prior art date
Application number
RS20200801A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew J Murphy
Nicholas J Papadopoulos
Jamie M Orengo
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS60503B1 publication Critical patent/RS60503B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su specifični za humani IL-33, za upotrebu u postupku lečenja hronične astme ili hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP).
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Interleukin-33 (IL-33) je ligand za ST2, člana superfamilije toll receptoru sličnih/receptora za intereukin-1 koji su povezani sa pomoćnim proteinom, IL-1RAcP (za revijski pregled, pogledati npr. Kakkar i Lee, Nature Reviews - Drug Discovery 7(10):827-840 (2008), Schmitz i saradnici, Immunity 23:479-490 (2005); Liew i saradnici, Nature Reviews - Immunology 10:103-110 (2010); US 2010/0260770; US 2009/0041718). Nakon aktivacije ST2/IL-1RAcP sa IL-33, pokreće se signalna kaskada posredovana nishodnim molukulima kao što su MyD88 (faktor mijeloidne diferencijacije 88) i TRAF6 (faktor udružen sa TNF receptorom, tipa 6), što dovodi do aktivacije NFκB (nuklearnog faktoraκB), između ostalog. Pretpostavlja se da je IL-33 signalizacija uklјučena kao važan faktor u raznim oboljenjima i poremećajima. (Liew i saradnici, Nature Reviews – Immunology 10:103-110 (2010)).
[0003] WO 2005/079844 opisuje upotrebu IL-33 antagonista za lečenje određenih inflamatornih i imunskih poremećaja. Palmer i saradnici, Nature Reviews - Rheumatology vol. 7, br. 6, str. 321-329 (2011) razmatra biologiju IL-33 i njegovog receptora ST2, kao i ulogu IL-33 i ST2 kako u životinjskim modelima oboljenja, tako i u humanim patologijama. Hayakawa i saradnici, Journal of Biological Chemistry vol. 282, br. 36 strane 26369 - 26380 prijavljuju da solubilan ST2 blokira alergijsku upalu disajnih puteva prouzrokovanu sa IL-33.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0004] Predmetni opis obezbeđuje antitela koja vezuju humani interleukin-33 ("IL-33"). Antitela su korisna, između ostalog, za inhibiranje signalizacije posredovane sa IL-33 i za lečenje oboljenja i poremećaja prouzrokovanih sa ili povezanih sa IL-33 aktivnošću i/ili signalizacijom.
[0005] U predmetnom pronalasku je obezbeđeno humano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupku lečenja hronične astme ili HOBP kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu antitela pacijentu, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, a koji vezuju humani interleukin 33 (IL-33) i sastoje se od varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 274 i varijabilnog regionlakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID BR: 282.
[0006] Antitela mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu sadržavati samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab')2ili scFv fragment), a mogu biti i modifikovana tako da utiču na funkcionalnost, npr. tako da se eliminišu rezidualne efektorske funkcije (Reddy i saradnici, 2000, J. Immunol.164:1925-1933).
[0007] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33 su izolovana, potpuno humana monoklonska antitela.
[0008] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju ili utišavaju signalizaciju posredovanu sa IL-33.
[0009] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, blokiraju interakciju IL-33 i ST2.
[0010] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, blokiraju interakciju IL-33 i ST2 sa IC50vrednošću manjom od oko 10 nM, ili blokiraju interakcije IL-33 i ST2 za više od oko 50%, što je izmereno u in vitro testu vezivanja receptora i liganda na 25°C.
[0011] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, ne blokiraju ili samo delimično blokiraju interakciju IL-33 i ST2.
[0012] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humani IL-33 sa ravnotežnom konstantom disocijacije vezivanja (K)D) koja je manja od oko 1 nM, što je izmereno u testu površinske plazmonske rezonance na 37°C.
[0013] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, vezuju humani IL-33 sa disocijativnim polu-životom (t1⁄2) većim od oko 8 minuta, što je izmereno u testu površinske plazmonske rezonance na 37°C
[0014] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju degranulaciju humanih bazofila posredovanu sa IL-33.
[0015] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju degranulaciju humanih bazofila posredovanu sa IL-33, sa IC50manjom od oko 600 pM, što je izmereno u in vitro testu aktivacije bazofila (BAT).
[0016] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju proizvodnju IFN-gama iz humanih PBMC, posredovanu sa IL-33.
[0017] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju proizvodnju IFN-gama iz humanih PBMC, posredovanu sa IL-33, sa IC50manom od oko 25 nM, što je izmereno u in vitro testu proizvodnje IFN-gama u PBMC.
[0018] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju proizvodnju IFN-gama iz humanih PBMC, posredovanu sa IL-33, sa IC50manjom od oko 3 nM, što je izmereno u in vitro testu proizvodnje IFN-gama u PBMC.
[0019] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju proizvodnju IFN-gama iz humanih PBMC, posredovanu sa IL-33, sa IC50manjom od oko 0,5 nM, što je izmereno u in vitro testu proizvodnje IFN-gama u PBMC.
[0020] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, smanjuju učestalost CD4+ T-ćelija, eozinofila i ILC2 ćelija u plućima, kada se primenjuju u životinjskom modelu upale pluća izazvane alergenom.
[0021] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, smanjuju nivo IL-4 i IL-5 u plućima, kada se primenjuju u životinjskom modelu upale pluća izazvane alergenom.
[0022] U jednom primeru, antitela koja se specifično vezuju za humani interleukin-33, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, kada se primenjuju u životinjskom modelu upale pluća izazvane alergenom, rezultuju smanjenjem nivoa IL-4 od najmanje puta i/ili smanjenjem nivoa IL-5 od najmanje 5 puta, a u poređenju sa životinjama koje su izlagane alergenu i koje su primale izotipsko kontrolno antitelo.
[0023] Predmetni opis obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR) sa aminokiselinskom sekvencom izbaranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 i 308 ili njima suštinski sličnih sekvenci, a koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%.
[0024] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca (LCVR) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 i 316 ili njima suštinski sličnih sekvenci, a koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%.
[0025] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži par HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 i 308/316. U pronalasku, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se sastoje od HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 274 i LCVR koja sadrži aminokiselinu sekvence SEQ ID NO: 282.
[0026] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo, ili fragment antitela koji vezuje antigen, koji sadrži CDR3 domen teškog lanca (HCDR3) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 i 314 ili njima suštinski sličnih sekvenci, a koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%; CDR3 domen lakog lanca (LCDR3) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304 i 322 ili njima suštinski sličnih sekvenci, a koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%.
[0027] U određenim primerima, antitelo ili deo antitela koji vezuje antigen sadrži par HCDR3/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304 i 314/322.
[0028] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji dodatno sadrži CDR1 domen (HCDR1) teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 i 310 ili njima suštinski sličnih sekvenci, a koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%; CDR2 domen teškog lanca (HCDR2) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 i 312 ili njima suštinski sličnih sekvenci koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%; CDR1 domen lakog lanca (LCDR1) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300 i 318 ili njima suštinski sličnih sekvenci koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%; CDR2 domen lakog lanca (LCDR2) sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302 i 320 ili njima suštinski sličnih sekvenci koje su sa navedenim sekvencama identične najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98 % ili najmanje 99%.
[0029] Određeni neograničavajući primeri antitela i fragmenata koji vezuju antigen opisa sadrže HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, tim redom, sa aminokiselinskim sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (npr. H1M9559N); 20-22-24-28-30-32 (npr. H1M9566N); 36-38-40-44-46-48 (npr. H1M9568N); 52-54-56-60-62-64 (npr. H4H9629P); 68-70-72-76-78-80 (npr. H4H9633P); 84-86-88-92-94-96 (npr. H4H9640P); 100-102-104-108-110-112 (npr. H4H9659P); 116-118-120-124-126-128 (npr. H4H9660P); 132-134-136-140-142-144 (npr. H4H9662P); 148-150-152-156-158-160 (npr. H4H9663P); 164-166-168-172-174-176 (npr. H4H9664P); 180-182-184-188-190-192 (npr. H4H9665P); 196-198-200-204-206-208 (npr. H4H9666P); 212-214216-220-222-224 (npr. H4H9667P); 228-230-232-236-238-240 (npr. H4H9670P); 244-246-248-252-254-256 (npr. H4H9671P); 260-262-264-268-270-272 (npr. H4H9672P); 276-278-280-284-286-288 (npr. H4H9675P); 292-294-296-300-302-304 (npr. H4H9676P); i 310-312-314-318-320-322 (H1M9565N).
[0030] U srodnom primeru, opis obuhvata antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen koji specifično vezuje IL-33, pri čemu antitelo ili fragment sadrži CDR domene teškog i lakog lanca koji su sadržani u sekvencama varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (HCVR/LCVR ) izabranim iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 i 308/316. Postupci i tehnike za identifikaciju CDR sekvenci u HCVR i LCVR aminokiselinskim sekvencama su dobro poznati u stanju tehnike i mogu biti upotrebljeni za identifikaciju CDR sekvenci unutar specifičnih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane. Konvencije za primer, koje mogu biti upotrebljene da bi se identifikovale granice CDR sekvenci obuhvataju, npr. definiciju po Kabatu, definiciju po Čotiji i AbM definiciju. Generalno, definicija po Kabatu se zasniva na varijabilnosti sekvenci, definicija po Čotiji se zasniva na mestu regiona sa strukturnim petljama, dok je AbM definicija kompromis između pristupa po Kabatu i Čotiji. Polgedati, npr. Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani i saradnici, J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); i Martin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikaciju CDR sekvenci unutar antitela.
[0031] Prema drugom aspektu, opis obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-IL-33 antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline opisa, kao i ćelije domaćini u koje su takvi vektori uvedeni, takođe su obuhvaćeni opisom, kao i postupci za proizvodnju antitela kultivacijom ćelija domaćina pod uslovima koji dozvolјavaju proizvodnju antitela i izdvajanje proizvedenih antitela.
[0032] U jednom primeru, opis obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji sadrže HCVR kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289 i 307 ili njihovih suštinski identičnih sekvenci koje su im najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologne.
[0033] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji sadrže LCVR kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297 i 315 ili njihovih suštinski identičnih sekvenci koje su im najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologne.
[0034] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo, ili fragment antitela koji vezuje antigen, koji sadrže HCDR3 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295 i 313 ili njihove suštinski identične sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna; i LCDR3 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303 i 321 ili njihove suštinski identične sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna.
[0035] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji dodatno sadrži HCDR1 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291 i 309 ili njihove suštinski identične sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna; HCDR2 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293 i 311 ili njihove suštinski identične sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna; LCDR1 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299 i 317 ili njihove suštinski identične sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna; i LCDR2 domen kodiran nukleotidnom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301 i 319 ili suštinski identične sekvence koja im je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% homologna.
[0036] Prema određenim primerima, antitelo ili njegov fragment sadrži CDR sekvence teškog i lakog lanca koje su kodirane sekvencama nukleinskih kiselina iz SEQ ID NO: 1 i 9 (npr. H1M9559N), 17 i 25 (npr. H1M9566N), 33 i 41 (npr. H1M9568N), 49 i 57 (npr. H4H9629P), 65 i 73 (npr. H4H9633P), 81 i 89 (npr. H4H9640P), 97 i 105 (npr. H4H9659P), 113 i 121 (npr. H4H9660P), 129 i 137 (npr. H4H9662P), 145 i 153 (npr. H4H9663P), 161 i 169 (npr. H4H9664P), 177 i 185 (npr. H4H9665P), 193 i 201 (npr. H4H9666P), 209 i 217 (npr. H4H9667P), 225 i 233 (npr. H4H9670P), 241 i 249 (npr. H4H9671P), 257 i 265 (npr. H4H9672P), 273 i 281 (npr. H4H9675P), 289 i 297 (npr. H4H9676P) ili 307 i 315 (H1 M9565N).
[0037] Anti-IL-33 antitela mogu biti sa modifikovanim obrascem glikozilacije. U pojedinim primenama, modifikacija za uklanjanje nepoželјnih mesta glikozilacije može biti korisna, ili to može biti antitelo kome nedostaje fukozni ostatak prisutan na lancu oligosaharida, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (pogledati Shield i saradnici (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija galaktozilacije može biti uvedena u cilјu modifikacije citotoksičnosti zavisne od sistema komplemenata (CDC).
[0038] Prema drugom aspektu, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantno humano antitelo, ili njegov fragment, koji se specifično vezuju za IL-33, i farmaceutski prihvatlјiv nosač. Prema srodnom aspektu, opis ističe kompoziciju koja je kombinacija anti-IL-33 antitela i drugog terapijskog agensa. U jednom primeru, drugi terapijski agens je bilo koji agens sa kojim kombinacija sa anti-IL-33 antitelom predstavlja prednost. Primeri agenasa sa kojim kombinacija sa anti-IL-33 antitelom predstavlja prednost obuhvataju, bez ograničenja, druge agense koji inhibiraju aktivnost IL-33 (uklјučujući druga antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, inhibitore peptida, antagoniste tipa malih molekula itd.) i/ili agense koji ne vezuju direktno IL-33, ali ipak ometaju, blokiraju ili utišavaju signalizaciju posredovanu sa IL-33. U jednom primeru, drugi terapijski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID), kortikosteroida, bronhijalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, antagoniste limfopoetina strome timusa (TSLP), antagoniste IL-13, antagoniste IL-4, dvostrukog antagoniste IL-4/IL-13, antagoniste IL-5, antagoniste IL-6, antagoniste IL-12/23, antagoniste IL-22, antagoniste IL-25, antagoniste IL-17, antagoniste IL-31, oralnog inhibitora PDE4 i drugog antagoniste IL-33 ili različitog antitela za IL-33.
[0039] U određenim primerima, citokinski antagonista može biti inhibitor tipa malog molekula (sintetski ili prirodno dobijen) ili protein (npr. antitelo) koje interaguje bilo sa samim citokinom ili sa receptorom za citokin, ili sa kompleksom koji sadrži i citokin i njegov(e) receptor(e) (npr. antitelo na IL-4 ili IL-6, ili antitelo na receptor za IL-4 ili IL-6). Dodatne kombinovane terapije i koformulacije koje uklјučuju anti-IL-33 antitela, opisane su ovde u drugim delovima teksta.
[0040] Prema još jednom aspektu, opis obezbeđuje terapijske postupke za inhibiranje aktivnosti IL-33, upotrebom anti-IL-33 antitela ili dela antitela koji vezuje antigen opisa, pri čemu terapijski postupci obuhvataju primenu terapijski efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen iz opisa. Poremećaj koji se leči je bilo koje oboljenje ili stanje koje se poboljšava, ublažava, inhibira ili sprečava uklanjanjem, inhibicijom ili smanjenjem aktivnosti ili signalizacije IL-33. Anti-IL-33 antitela ili fragmenti antitela mogu funkcionisati tako da blokiraju interakciju između IL-33 i partnera koji se vezuje za IL-33 (npr. komponente IL-33 receptora) ili tako što na neki drugi način inhibiraju signalnu aktivnost IL-33.
[0041] U jednom primeru, opis obezbeđuje postupak za lečenje inflamatornog oboljenja ili poremećaja, ili najmanje jednog simptoma povezanog sa inflamatornim oboljenjem ili poremećajem, pri čemu postupak obuhvata primenu antitela koje se specifično vezuje za IL-33, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, pacijentu kome je to potrebno, pri čemu se inflamatorno oboljenje ili poremećaj ublažava, ili se smanjuje ozbilјnost, trajanje ili učestalost njegove pojave, ili se ublažava najmanje jedan simptom povezan sa inflamatornim oboljenjem ili poremećajem, ili se smanjuje njegova ozbilјnost, trajanje ili učestalost pojave.
[0042] U jednom primeru, inflamatorno oboljenje ili stanje je izabrano iz grupe koja se sastoji od astme, atopijskog dermatitisa, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), inflamatornog oboljenja creva, multiple skleroze, artritisa, alergijskog rinitisa, eozinofilnog ezofagitisa i psorijaze. Prema pronalasku, antitelo ili fragment koji vezuje antigen je za upotrebu u postupku lečenja hronične astme ili HOBP.
[0043] U jednom primeru, opis obezbeđuje postupak za lečenje pacijenta kod koga je prisutna osetlјivost na alergen, postupak koji obuhvata primenu efektivne količine antitela koje se specifično vezuje za IL-33, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo koje se specifično vezuje za IL-33, ili njegov fragment koji vezuje antigen, pacijentu kome je to potrebno, pri čemu pacijenta karakteriše smanjena osetljivost na, ili smanjena alergijska reakcija na alergen, ili pacijent nije iskusio bilo kakvu senzitivnost ili alergijsku reakciju na, ili anafilaktički odgovor na alergen, nakon primene antitela ili kompozicije koja sadrži antitelo.
[0044] U jednom primeru, opis obezbeđuje primenu efektivne količine drugog terapijskog agensa koji je koristan za ublažavanje inflamatornog oboljenja ili poremećaja, ili najmanje jednog simptoma inflamatornog oboljenja ili poremećaja, ili za smanjenje alergijske reakcije na alergen. Kao što je prethodno navedeno, drugi terapijski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID), kortikosteroida, bronhalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, antagoniste limfopoetina strome timusa (TSLP), antagoniste IL-13, antagoniste IL-4, antagoniste IL-5, antagoniste IL-6, antagoniste IL-25, antagoniste IL-17 i drugog antagoniste IL-33 ili različitog antitela na IL-33.
[0045] Prema srodnom aspektu, opis obezbeđuje anti-IL-33 antitelo opisa, ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u lečenju oboljenja ili poremećaja koje je povezano sa ili je prouzrokovano sa IL-33 aktivnošću kod pacijenta. U jednom primeru, bolest ili poremećaj povezan sa ili prouzrokovan aktivnošću IL-33 kod pacijenta je inflamatorno oboljenje ili poremećaj, pri čemu je inflamatorno oboljenje ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od astme, atopijskog dermatitisa, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), inflamatornog oboljenja creva, multiple skleroze, artritisa, alergijskog rinitisa, eozinofilnog ezofagitisa i psorijaze.
[0046] Predmetni opis takođe obuhvata upotrebu anti-IL-33 antitela opisa, ili dela antitela koji vezuje antigen, u proizvodnji leka za lečenje oboljenja ili poremećaja koje je povezano sa ili prouzrokovano aktivnošću IL-33 kod pacijenta. U jednom primeru, oboljenje ili poremećaj povezan sa, ili prouzrokovan aktivnošću IL-33 kod pacijenta, je inflamatorno oboljenje ili poremećaj, pri čemu je inflamatorno oboljenje ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od astme, atopijskog dermatitisa, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), inflamatornog oboljenja creva, multiple skleroze, artritisa, alergijskog rinitisa, eozinofilnog ezofagitisa i psorijaze.
[0047] Ostali primeri izvođenja će postati jasni nakon pregleda detaljnog opisa pronalaska koji sledi.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0048]
Slika 1. Unakrsna kompeticija između anti-IL-33 antitela za humani IL-33
Slika 2. Unakrsna kompeticija između anti-IL-33 antitela za rekombinantni IL-33 majmuna
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0049] Pre opisa predmetnog pronalaska, potrebno je napomenuti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke ili eksperimentalne uslove koji su ovde opisani, pošto takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe, podrazumeva se da je terminologija koja je ovde upotrebljena navedena samo u svrhu opisa određenih primera izvođenja i da nije predviđeno da bude ograničavajuća, pošto će područje predmetnog pronalaska biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima.
[0050] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljeni, sa istim su značenjem koje se i uobičajeno podrazumeva od strane prosečno iskusnih stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj pronalazak pripada. Kao što se ovde upotrebljava, pojam "oko", kada se upotrebljava u vezi sa određenom navedenom numeričkom vrednošću, označava da vrednost može varirati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde upotrebljava, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99,1; 99,2; 99,3; 99,4 itd.).
[0051] Iako u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska može biti upotrebljen bilo koji postupak i materijal koji je sličan ili ekvivalentan onima koji su ovde opisani, u tekstu dalje sledi opis poželјnih postupaka i materijala.
Definicije
[0052] Izrazi "interleukin-33", "IL-33" i slično, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na humani IL-33 protein, nabavljen od kompanije, na primer, R&D Systems, kat. br.3625-IL-010/CF. Predviđeno je da se svako upućivanje na proteine, polipeptide i proteinske fragmente odnosi na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta, osim ukoliko nije izričito naznačeno da su ista iz vrste različite od čoveka (npr. „mišji IL-33“, „IL-33 majmuna“ itd.).
[0053] Kako se ovde upotrebljava, "antitelo koje vezuje IL-33" ili "anti-IL-33 antitelo" obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju solubilni fragment IL-33 proteina. Solubilni
1
IL-33 molekuli obuhvataju prirodne IL-33 proteine, kao i rekombinantne varijante IL-33 proteina, poput npr. monomernih i dimernih IL-33 konstrukata.
[0054] Termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, označava bilo koji molekul koji vezuje antigen ili molekulski kompleks koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) i koji se specifično vezuje za ili interaguje sa određenim antigenom (npr. sa IL-33). Termin "antitelo" obuhvata imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr. IgM). Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde je skraćenica HCVR ili VH) i konstantno region teškog lanca. Konstantna region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde je skraćenica LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantna region lakog lanca sadrži jedan domen (C)L1). VHi VLregioni dalje mogu biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji se naizmenično smenjuju sa regionima koji su više očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR sekvence, raspoređene od amino-kraja ka karboksilnom kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. FR sekvence anti-IL-33 antitela (ili njegovog dela koji vezuje antigen) mogu biti identične humanim germinativnim sekvencama ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovane. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca može biti definisana na osnovu analize upoređivanja dve ili više CDR sekvenci.
[0055] Termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, takođe obuhvata fragmente koji vezuju antigen iz molekula antitela pune dužine. Termini "deo koji vezuje antigen" antitela, "fragment koji vezuje antigen" antitela i slični, kako se ovde upotrebljavaju, obuhvataju bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, koji se može dobiti dejstvom enzima, sintetisati ili dobiti postupcima genetičkog inženjeringa, a koji se specifično vezuje za antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr. iz antitela pune dužine upotrebom bilo koje pogodne standardne tehnike kao što su proteolitička digestija ili tehnike genetičkog inženjeringa, koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i, po izboru, konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uklјučujući, npr. fagne biblioteke antitela), ili može biti sintetisana. DNK može biti sekvencirana i sa njom se može manipulisati hemijski ili upotrebom tehnika molekularne biologije, na primer, da bi se preuredio jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modifikovale, adirale ili delecijom uklonile aminokiseline itd.
[0056] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen obuhvataju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) jedinice minimalnog prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovan region koja određuje komplementarnost (CDR), kao što je CDR3 peptid) ili kruti FR3-CDR3-FR4 peptid. Ostali konstruisani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela iz kojih je delecijom uklonjen domen, himerna antitela, antitela sa ugrađenim CDR sekvencama, dimerna antitela, trimerna antitela, tetramerna anatitela, mini-antitela, nano antitela (npr. monovalentna nano antitela, bivalentna nano antitela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni morskih pasa, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen", kako se on ovde upotrebljava.
[0057] Fragment antitela koji vezuje antigen obično sadrži najmanje jedan varijabilan domen. Varijabilan domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i obično sadrži najmanje jedan CDR koji je susedan ili je sa istim okvirom čitanja kao jedna ili više uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen, sa VHdomenom povezanim sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni jedan u odnosu na drugog prema bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilan region može biti dimeran i sadržavati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomerni VHili VLdomen.
[0058] Fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće konfiguracije varijabilnih i konstantnih domena za primer koje se mogu naći u fragmentu antitela koji vezuje antigen obuhvataju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od prethodno navedenih konfiguracija za primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedni sa drugima ili mogu biti povezani posredstvom potpunog ili dela zglobnog ili linkerskog regiona. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr. 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultuje fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od prethodno navedenih konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena koje su nekovalentno povezane jedna sa drugom i/ili sa jednim ili sa više od monomernih VHili VLdomena (npr. disulfidnom vezom/vezama).
[0059] Kao i kod potpunih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen obično sadrži najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično vezuje za poseban antigen ili drugačiji epitop na istom antigenu. Bilo koji format multipecifičnog antitela, uklјučujući ovde opisane primere formata bispecifičnih antitela, može biti prilagođen za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji vezuje antigen, upotrebom rutinskih tehnika koje su dostupne u oblasti tehnike.
[0060] Antitela mogu funkcionisati putem citotoksičnosti zavisne od sistema komplemenata (CDC) ili ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). "Citotoksičnost zavisna od sistema komplemenata" (CDC) se odnosi na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen, posredstvom antitela i u prisustvu proteina iz sistema komplemenata. "Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" (ADCC) se odnosi na reakciju posredovanu ćelijama, u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na cilјnoj ćeliji i time dovode do lize cilјne ćelije. CDC i ADCC mogu biti mereni upotrebom testova koji su dobro poznati i dostupni u stanju tehnike. (pogledati npr. U.S. Patent No 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes i saradnici (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i da posreduje u citotoksičnosti koja je posredovana ćelijama. Stoga, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželјno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.
[0061] U određenim primerima opisa, anti-IL-33 antitela su humana antitela. Prema pronalasku, antitelo je humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela koja sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. sa mutacijama su koje su uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR sekvencama, a posebno u CDR3 sekvenci. Ipak, nije predviđeno da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih sekvenci drugih vrsta sisara, poput mišjih, ugrađene u humane uokvirujuće sekvence.
[0062] Antitela mogu, u pojedinim primerima, biti rekombinantna humana antitela. Predviđeno je da termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sva humana antitela koja su pripremlјena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na rekombinantne načine, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnih ekspresionih vektora koji su transfekcijom uvedeni u ćeliju domaćina (opisano dodatno u tekstu koji sledi), antitela izolovana iz rekombinatornih, kombinatornih biblioteka humanih antitela (opisano dodatno u tekstu koji sledi), antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene (pogledati npr. Taylor i saradnici (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ili antitela pripremlјena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje obradu humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci ili drugih DNK sekvenci. Takva rekombinantna humana antitela sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U određenim primerima,
1
međutim, takva rekombinantna humana antitela se podvrgavaju in vitro mutagenezi (ili, kada se upotrebljava životinja koja je transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza), čime i aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela predstavljaju sekvence koje su, iako su izvedene iz i srodne su humanim germinativnim VHi VLsekvencama, ne mogu postojati u prirodi unutar germinativnog repertoara humanih antitela in vivo.
[0063] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su u vezi sa heterogenošću zglobnog regiona. U jednom obliku, imunoglobulinski molekul sadrži stabilan konstrukt sa četiri lanca od približno 150-160 kDa, u kome su dimeri povezani međulančanom disulfidnom vezom između teških lanaca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i obrazuje se molekul od oko 75-80 kDa koji se sastoji od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (poluantitela). Ovakve oblike je izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.
[0064] Učestalost pojave drugog oblika u raznim intaktnim IgG izotipovima nastaje usled, ali ne ograničavajući se na, strukturnih razlika koje su povezane sa zglobnim regione izotipa antitela. Jedna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu humanog IgG4 zgloba može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal i saradnici (1993) Molecular Immunology 30:105), do nivoa koji se obično uočava pri upotrebi humanog IgG1 zglobnog regiona. Antitela mogu sadržavati jednu ili više mutacija u zglobnom, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, a da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.
[0065] Antitela mogu biti izolovana antitela. "Izolovano antitelo", kako se ovde upotrebljava, označava antitelo koje je identifikovano i izdvojeno iz i/ili razdvojeno od najmanje jedne komponente njegovog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je izdvojeno ili uklonjeno iz najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, predstavlja „izolovano antitelo“. Izolovano antitelo takođe obuhvata antitelo in situ, unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Izolovano antitelo može suštinski biti oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0066] Predmetni opis obuhvata neutralizaciju i/ili blokiranje anti-IL-33 antitela. Predviđeno je da se "neutrališuće" ili "blokirajuće" antitelo, kako se ovde upotrebljava, odnosi na antitelo čije vezivanje za IL-33: (i) ometa interakciju između IL-33 ili fragmenta IL-33 i komponente IL-33 receptora (npr. ST2, IL-1 RAcP itd.); i/ili (ii) rezultuje inhibicijom najmanje jedne biološke funkcije IL-33. Inhibicija prouzrokovana neutralizacijom ili blokiranjem antitela za IL-33 ne mora biti potpuna, sve dok se može detektovati upotrebom odgovarajućeg testa. Testovi za detekciju inhibicije IL-33 za primer su ovde opisani u praktičnim Primerima.
[0067] Anti-IL-33 antitela koja su ovde opisana, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca, u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije mogu lako biti utvrđene upoređivanjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama koje su dostupne u, na primer, javnim bazama podataka za sekvence antitela. Antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, mogu biti izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu je jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirana u odnosu na odgovarajući ostatak/ostatke u geminativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno, ili u odnosu na odgovarajuće geminativni ostatak/ostatke (takve promene u sekvenci se ovde kolektivno označavaju kao "germinativne mutacije"). Prosečno iskusan sručnjak iz obasti tehnike lako može proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim primerima, svi uokvirujući i/ili CDR ostaci unutar VHi/ili VLdomena se povratno mutiraju u ostatke originalne germinativne sekvence, npr. to su samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar zadnjih 8 aminokiselina FR4, ili su samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3 sekvenci. U drugim primerima, jedan ili više od uokvirujućih i/ili CDR ostataka je mutiran u odgovarajuće ostatke drugačije geminativne sekvece (tj. geminativne sekvece koja je različita od geminativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržani ili se mutiraju u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više željenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, pobolјšana ili pojačana antagonistička ili agonistička biološka osobina (što može biti slučaj), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način, obuhvaćeni su predmetnim opisom.
[0068] Predmetni opis takođe obuhvata anti-IL-33 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, sa jednom ili sa više konzervativnih supstitucija. Na primer, anti-IL-33 antitela mogu sadržavati HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr.10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od ovde opisanih HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci.
[0069] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Tako, različita antitela se mogu vezivati za različita područja antigena i mogu imati različita biološka dejstva. Epitopi mogu biti bilo konformacioni ili linearni.
1
Konformacioni epitop može nastati od aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca koje se prostorno postavljaju tako da su susedne. Linearan epitop je onaj koji se nastaje od susednih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. U određenim uslovima, epitop antigena može uključivati ostatke saharida, fosforilnih grupa ili sulfonilnih grupa.
[0070] Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnata sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), uz razmatranje odgovarajućih nukleotidnih insercija ili delecija, postoji identičnost nukleotidnih sekvenci u najmanje oko 95%, a poželјnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, što se meri bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identifikaciju sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, a što se dodatno razmatra u nastavku teksta. Molekul nukleinske kiseline koji je značajno identičan sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u određenim primerima, kodirati polipeptid koji je iste ili suštinski slične aminokiselinske sekvence kao polipeptid koji je kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0071] Kada se primenjuje na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je u okviru programa GAP ili BESTFIT, uz upotrebu zadatih parametara praznina, karakteriše identičnost sekvenci od najmanje 95%, a još poželјnije identičnost sekvenci od najmanje 98% ili 99%. Poželјno je i da pozicije ostataka koji nisu identični budu različiti i da budu tipa konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji sadrži bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr. slično naelektrisanje ili hidrofobnost). U principu, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna u odnosu na drugu u vidu konzervativnih supstitucija, procenat identičnosti sekvenci ili stepen sličnosti može biti podešen naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini uvođenja ovih podešavanja su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Poledati, npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje su sa bočnim lančima sličnih hemijskih osobina obuhvataju aminokiseline (1) sa alifatičnim bočnim lancima: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) sa alifatičnim-hidroksilnim bočnim lancima: serin i treonin; (3) sa bočnim lancima koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) sa aromatičnin bočnim lancima: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) sa baznim bočnim lancima: lizin, arginin i histidin; (6) sa kiselim bočnim lancima: aspartat i glutamat, i (7) sa bočnim lancima koji sadrže sumpor, kao što su to cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativnih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena sa pozitivnom vrednošću u PAM250 matrici logaritma verovatnoće, koja je opisana u Gonnet i saradnici (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno
1
konzervativna" zamena je svaka promena sa vrednošću koja nije negativna u u PAM250 matrici logaritma verovatnoće.
[0072] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe označava kao identičnost sekvenci, obično se meri upotrebom kompjuterskog programa za analizu sekvenci. Kompjuterski program za analizu uparuje slične sekvence merenjima sličnosti koje su dodeljene raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uklјučujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG program sadrži programe kao što su Gap i Bestfit, a koji mogu biti upotrebljeni uz zadate parametre, da bi se utvrdila homologija sekvenci ili identičnost sekvenci između dva blisko srodna polipeptida, kao što su to homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili pak između proteina divlјeg tipa i njegovog mutiranog oblika. Pogledati npr. GCG verzije 6.1. Polipeptidne sekvence mogu biti upoređene i upotrebom FASTA, korišćenjem zadatih ili proporučenih parametara, u okviru GCG programa verzije 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti sekvenci regiona sa najbolјim preklapanjem između sekvence koja se ispituje i sekveci za poređenje (Pearson (2000), navedeno iznad). Drugi poželјni algoritam prilikom poređenja sekvence sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, uz upotrebu zadatih parametara. Pogledati npr. Altschul i saradnici (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul i saradnici (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-402.
[0073] "Inflamatorno oboljenje ili poremećaj", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na oboljenje, poremećaj ili patološko stanje kod koga patologija, u celosti ili delimično, proizilazi iz, npr. promena u broju, promena u stopi migracije ili promena u aktivaciji ćelija imunskog sistema. Ćelije imunskog sistema obuhvataju, npr. T-ćelije, B-ćelije, monocite ili makrofage, ćelije koje prezentuju antigen (APC), dendritične ćelije, mikrogliju, NK ćelije, neutrofile, eozinofile, mastocite ili bilo koju drugu vrstu ćeliju koja je specifično povezana sa imunologijom, na primer, endotelne ili epitelijalne ćelije koje proizvode citokine. Kao što se ovde upotrebljava, „inflamatorno oboljenje ili poremećaj“ je imunski poremećaj ili stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od astme (uklјučujući astmu rezistentnu na steroide, astmu osetljivu na sterodie, eozinofilnu astmu ili astmu koja nije eozinofilna, alergiju, anafilaksu, multiplu sklerozu, inflamatorni poremećaj creva (npr. Kronovu bolest ili ulcerozni kolitis), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP, koja može ili ne mora biti povezana sa, delimično prouzrokovana sa ili biti primarni ili sekndarni rezultat izlaganja dimu cigareta), lupusa, atopijskog dermatitisa, psorijaze, skleroderme i drugih fibrotičnih oboljenja, sjogrenovog sindroma, vaskulitisa (behčetove bolesti, arteritisa džinovskih ćelija, Henoch-Schonlein-ove purpure i Churg-Strauss sindroma) i artritisa. U drugom primeru, artritis je izabran iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, osteoartritisa i psorijatičnog artritisa. U sledećem primeru, "inflamatorno obljenje ili poremećaj" je imunski poremećaj ili stanje koje uključuje TH1- tip odgovora ili TH2- tip odgovora.
1
[0074] Izraz "Inhibira ili utišava signalizaciju posredovanu sa IL-33", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na stepen do koga IL-33 stimuliše signalnu transdukciju putem ST2 i IL-1RAcP, koji se smanjuje u prisustvu antagoniste, kao što je IL-33 antitelo koje je ovde opisano, a u odnosu na stepen do koga IL-33 stimuliše signalnu transdukciju putem ST2 i IL-1RAcP u odsustvu antagoniste kao što je IL-33 antitelo koje je ovde opisano. Da bi se ispitao obim inhibicije, uzorak se tretira sa potencijalnim inhibitorom/antagonistom i upoređuje se sa kontrolnim uzorkom u kome je inhibitor/antagonista odsutan. Kontrolnim uzorcima, tj. onima koji nisu tretirani sa antagonistom, dodelјena je vrednost relativne aktivnosti od 100%. Inhibicija se postiže kada je vrednost aktivnosti u odnosu na kontrolnu oko 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30 %, 25% ili 20% ili manje. Krajnji ishod inhibicije može podrazumevati unapred određenu količinu ili procenat, npr. pokazatelјa inflamacije ili degranulacija ćelije, izlučivanja ili aktivacije, kao što je oslobađanje citokina. Inhibicija signalne transdukcije IL-33 putem ST2 i IL-1RAcP može biti utvrđena ispitivanjem signalne trasdukcije IL-33 u in vitro testu, kao što je test koji je ovde opisan u Primeru 6. Dodatno, mogu biti upotrebljeni in vivo testovi da bi se utvrdilo da li je molekul antagonisa za IL-33. Na primer, in vivo test poput onog koji je opisan u Primerima 11 i 12, može biti upotrebljen za utvrđivanje efekta antitela za IL-33 na upalu pluća kod životinja koje su senzitivisane na alergen i koje su homozigotne za ekspresiju humanog IL-33. Nakon senzibilizacije životinja alergenom, podgrupa životinja se tretira ili sa anti-IL-33 antitelom, kao što je ovde opisano, ili sa negativnim izotipskim kontrolnim antitelom. Nakon toga, životinje se žrtvuju i izoluju se pluća da bi se utvrdilo prisustvo ćelijskih infiltrata, kao i da bi se izmerili nivoi citokina (IL-4 i IL-5). IL-33 antitelo koje je efektivno kao antagonista, trebalo bi da ispolji trend ka smanjenja u inflamatornim ćelijama u plućima, kao i trend ka smanjenju citokina poput IL-4 i IL-5.
Biološke karakteristike antitela
[0075] Predmetni opis obuhvata anti-IL-33 antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji vezuju humani IL-33 i inhibiraju ili utišavaju signalizaciju posredovanu sa IL-33. Smatra se da anti-IL-33 antitelo "inhibira ili utišava signalizaciju posredovanu sa IL-33" ukoliko antitelo npr.ispoljava jednu ili više osobina izabranih iz grupe koju čine: (1) inhibicija signalizacije posredovane sa IL-33, u biološkoj analizi zasnovanoj na ćelijama; (2) inhibicija degranulacije humanih bazofila prouzrokovane sa IL-33; (3) inhibicija proizvodnje IFNγu humanim PBMC, prouzrokovane sa IL-33; (4) smanjenje nivoa citokina koji su povišeni kod sisara kao rezultat izlaganju alergenu, npr. IL-4 ili IL-5; i (5) inhibicija upale pluća koja je posledica akutnog ili hroničnog izlaganja alergenu (npr. grinjama kućne prašine (HDM)).
[0076] Inhibicija signalizacije posredovane sa IL-33 u biološkoj analizi zasnovanoj na ćelijama označava da anti-IL-33 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, inhibira ili smanjuje signal
1
proizveden u ćelijama koje eksprimiraju IL-33 receptor i reporterski element koji proizvodi signal koji se može detektovati, kao odgovor na vezivanje IL-33, npr. upotrebom formata analize koji je ovde definisan u Primeru 6, ili formata analize koji je suštinski sličan. Na primer, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati signalizaciju posredovanu sa IL-33 u ćelijama koje eksprimiraju humani ST2, sa IC50manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 900 pM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 350 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 250 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 150 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 90 pM, manjom od oko 80 pM, manjom od oko 70 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 20 pM ili manjom od oko 10 pM, što je izmereno biološkom analizom blokiranja koja je zasnovana na ćelijama, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 5 ili formata analize koji je suštinski sličan.
[0077] Inhibicija degranulacije humanih bazofila prouzrokovane sa IL-33 označava da anti-IL-33 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, inhibira ili smanjuje obim degranulacije bazofila prouzrokovane sa IL-33 in vitro, npr. kao što je izmereno upotrebom sistema za analizu iz Primera 7 ili analizom koja je suštinski slična. Na primer, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu inhibirati degranulaciju humanih bazofila u prisustvu humanog IL-33 (npr. u finalnoj koncentraciji od oko 100 pM), sa IC50manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 350 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 250 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 150 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 90 pM, manjom od oko 80 pM, manjom od oko 70 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 20 pM ili manjom od oko 10 pM, što je izmereno u in vitro analizi degranulacije humanih bazofila, npr. upotrebom formata analize koji je ovde definisan u Primeru 7 ili formata analize koji je suštinski sličan.
[0078] Inhibicija proizvodnje IFNγu humanim PBMC, prouzrokovane sa IL-33, označava da anti-IL-33 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, inhibira ili smanjuje količinu IFNγ koji se oslobađa iz PBMC tretiranih sa humanim IL-33 u prisustvu humanog IL-12, npr. kao što je izmereno upotrebom sistema za analizu iz Primera 8 ili analizom koja je suštinski slična. Na primer, antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu inhibirati oslobađanje IFNγprouzrokovano sa IL-33, u prisustvu humanog IL-12, sa IC50manjom od oko 50 nM, manjom od oko 25 nM, manjom od oko 20 nM, manjom od oko 15 nM, manjom od oko 10 nM, manjom od oko 5 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 900 pM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM ili manjom od oko 300 pM, što je izmereno u analizi oslobađanja IFNγ prouzrokovanog sa IL-33, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 8 ili formata analize koji je suštinski sličan.
1
[0079] U određenim primerima, anti-IL-33 antitela i fragmenti koji vezuju antigen blokiraju vezivanje IL-33 za IL-33 receptor (npr. ST2). Na primer, anti-IL-33 antitela mogu blokirati vezivanje IL-33 za ST2 in vitro, sa IC50vrednošću manjom od oko 15 nM, što je izmereno imunološkom analizom zasnovanom na ELISA postupku, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 4 ili formata analize koji je suštinski sličan. U određenim primerima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati vezivanje IL-33 za ST2 in vitro sa IC50vrednošću manjom od oko 10 nM, manjom od oko 5 nM, manjom od oko 900 pM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 280 pM, manjom od oko 260 pM, manjom od oko 250 pM, manjom od oko 240 pM, manjom od oko 230 pM, manjom od oko 220 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 180 pM, manjom od oko 160 pM ili manjom od oko 150 pM, što je izmereno u imunološkoj analizi zasnovanoj na ELISA postupku, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 4 ili formata analize koji je suštinski sličan.
[0080] U drugim primerima, međutim, određena anti-IL-33 antitela i fragmenti koji vezuju antigen, uprkos tome što imaju sposobnost inhibicije ili utišavanja signalizacije posredovane sa IL-33, ne blokiraju ili samo delimično blokiraju interakciju IL-33 i ST2. Takva antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, mogu ovde biti označeni kao „indirektni blokatori“. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da indirektni blokatori deluju vezivanjem za IL-33 na epitopu koji se preklapa, ili samo delimično preklapa, sa domenom IL-33 koji vezuje ST2, ali ipak ometa signalizacija posredovanu sa IL-33 bez direktnog blokiranja interakcije IL-33 i ST2.
[0081] Predmetni opis obuhvata anti-IL-33 antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji vezuju solubilne IL-33 molekule sa visokim afinitetom. Na primer, predmetni opis obuhvata antitela, i fragmente antitela koji vezuju antigen, koji vezuju IL-33 (npr. na 25°C ili 37°C) sa KDmanjom od oko 10 nM, što se meri površinskom plazmonskom rezonancom, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 3. U određenim primerima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati IL-33 sa KDmanjom od oko 5 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 180 pM ili manjom od oko 160 pM, izmerenom površinskom plazmonskom rezonancom, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 3 ili formata analize koji je suštinski sličan.
[0082] Predmetni opis obuhvata i anti-IL-33 antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji se specifično vezuju za IL-33 sa polu-životom disocijacije (t1⁄2) većim od oko 10 minuta, izmerenim površinskom rezonancom plazmona na 25°C ili 37°C, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Pimeru 3 ili formata analize koji je suštinski sličan. U određenim primerima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati IL-33 sa t1⁄2 većim od oko 20 minuta, većim od
2
oko 30 minuta, većim od oko 40 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, većim od oko 80 minuta, većim od oko 90 minuta, većim od oko 100 minuta, što se meri površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je to ovde definisano u Primeru 3 ili formata analize koji je suštinski sličan.
[0083] Antitela predmetnog pronalaska mogu posedovati jednu illi više od prethnodno navedenih karakteristika ili bilo koju od njihovih kombinacija. Ostale biološke karakteristike antitela predmetnog pronalaska će biti očigledne prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike nakon daljeg pregleda predmetnog opisa, uključujući i Primere primene koji su ovde navedeni.
Anti-IL-33 antitela koja sadrže Fc varijante
[0084] Anti-IL-33 antitela mogu sadržavati Fc domen sa jednom ili sa više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr. na kiselom pH, u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, anti-IL-33 antitela mogu sadržavati mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(mutacije) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiselom okruženju (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Rezultat takvih mutacija može biti povećanje poluživota antitela u serumu prilikom primene životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija obuhvataju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr. 308F, V308F) i 434. U jednom primeru, modifikacija podrazumeva modifikaciju 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S); modifikaciju 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju 433K (npr. H433K) i 434 (npr.434Y); modifikaciju 252, 254 i 256 (npr.252Y, 254T i 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr. T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr.308F ili 308P). U još jednom primeru, modifikacija obuhvata 265A (npr. D265A) i/ili modifikaciju 297A (npr. D297A).
[0085] Anti-IL-33 antitela mogu sadržavati Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupe mutacija izabrane iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr. T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr. M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Sve moguće kombinacije prethodno navedenih mutacija Fc domena, i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela koje su ovde opisane, razmatraju se kao one koje pripadaju području predmetnog opisa.
[0086] Predmetni opis takođe obuhvata anti-IL-33 antitela koja sadrže himerni konstantni region teškog lanca (CH), pri čemu himerni CHregion sadrži segmente izvedene iz CHregiona više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela mogu sadržavati himerni CHregion koji sadrži deo ili celokupan CH2 domen izveden iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula, u kombinaciji sa delom ili sa celokupnim CH3 domenom izvedenim iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. Prema određenim primerima, antitela mogu sadržavati himerni CHregion koji sadrži himerni zglobni region. Na primer, himerni zglobni region može sadržavati aminokiselinsku sekvencu „gornjeg dela zglobnog regiona” (aminokiselinski ostaci od pozicije 216 do 227, prema EU numeraciji) izvedenu iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, koja je spojena sa sekvencom “donjeg dela zglobnog regiona” (aminokiselinski ostaci od pozcije 228 do 236, prema EU numeraciji) izvedenom iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim primerima, himerni zglobni region sadrži aminokiselinske ostatke dobijene iz gornjeg dela zglobnog regiona humanog IgG1 ili humanog IgG4 i aminokiselinske ostatke dobijene iz donjeg dela zglobnog regiona humanog IgG2. Antitelo koje sadrži himerni CHregion koji je ovde opisan, može, u određenim primerima, ispoljiti modifikovane Fc efektorske funkcije bez neželjenog uticaja na terapijske ili farmakokinetičke osobine antitela. (Pogledati, npr. WO2014/121087, koji zahteva prioritet u odnosu na Američku privremenu prijavu br. 61/759,578, predatu 1. februara 2013.god.).
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0087] Predmetni opis obuhvata anti-IL-33 antitela koja stupaju u interakciju sa jednom ili sa više aminokiselina iz IL-33. Na primer, predmetni opis obuhvata anti-IL-33 antitela koja stupaju u interakciju sa jednom ili sa više aminokiselina smeštenih unutar domena IL-33 koji interaguje sa ST2. Epitop za koji se antitela vezuju se može sastojati od jednog uzastopnog niza od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina IL-33. Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) koje u IL-33 nisu postavljene u kontinuitetu .
[0088] Razne tehnike poznate prosečno iskusnim stručanjacima, mogu biti upotrebljene za utvrđivanje da li antitelo "stupa u interakciju sa jednom ili sa više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Tehnike za primer obuhvataju, npr. rutinsku analizu unakrsnog blokiranja kao što je analiza opisana u Antibodies, Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), mutaciona analiza za skeniranje alanina, analiza peptidnih blotova (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) i analiza digestijom peptida. Pored toga, mogu biti upotrebljeni i postupci poput isecanja epitopa, ekstrakcije epitopa i hemijske modifikacije antigena (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Još jedan postupak koji može biti upotrebljen za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima antitelo interaguje je vodonik/deuterijumska izmena koja se detektuje masenom spektrometrijom. Uopšteno posmatrano, postupak vodonik/deuterijumske izmene obuhvata obeležavanje proteina od interesa sa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein koji je obeležen deuterijumom. Kompleks proteina i antitela se zatim prebacuje u vodu da bi se omogućila izmena vodonika i deuterijuma na svim ostacima, osim na ostacima koji su zaštićeni antitelom (i koji ostaju obeleženi deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, cilјni protein se podvrgava digestiji proteazama i analizi masnom spektrometrijom, čime se detektuju ostaci koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo stupa u interakciju. Pogledati, npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A.
[0089] Predmetni opis dalјe obuhvata anti-IL-33 antitela koja se vezuju za isti epitop, kao i bilo koja od specifičnih antitela za primer koja su ovde opisana (npr. H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N, H4H9629P, H4H9633P, H4H9640P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P, H4H9676P, H1M9565N itd). Slično navedenom, predmetni opis takođe obuhvata anti-IL-33 antitela koja su u kompeticiji vezivanja za IL-33 sa bilo kojim od specifičnih antitela za primer koja su ovde opisana (npr. H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N, H4H9629P, H4H9633P, H4H9640P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P, H4H9676P, H1M9565N itd).
[0090] Moguće je lako utvrditi da li se antitelo vezuje za isti epitop kao, ili je u kompeticiji vezivanja sa referentnim anti-IL-33 antitelom, upotrebom rutinskih postupaka koji su poznati u stanju tehnike i koji su ovde navedeni u vidu primera. Na primer, da bi se utvrdilo da li se ispitivano antitelo vezuje za isti epitop kao i referentno anti-IL-33 antitelo, omogućava se napre da se referentno antitelo veže za IL-33 protein. Procenjuje se zatim sposobnost ispitivanog antitela da se vezuje za IL-33 molekul. Ukoliko je ispitivano antitelo sposobno da se vezuje za IL-33 nakon vezivanja referentnog anti-IL-33 antitela u zasićenju, može se zaklјučiti da se isptivano antitelo vezuje za drugačiji epitop od referentnog anti-IL-33 antitela. S druge strane, ukoliko ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za molekulu IL-33 nakon vezivanja referentnog anti-IL-33 antitela u zasićenju, tada se ispitivano antitelo može vezivati za isti epitop kao i epitop za koga se vezuje referentno anti-IL-33 antitelo. Dalje mogu biti urađeni dodatni rutinski eksperimenti (npr. analize mutacija i vezivanja peptida), da bi se potvrdilo da li je uočeno odsustvo vezivanja ispitivanog antitela zapravo posledica vezivanja za isti epitop za koji se vezuje i referentno antitelto ili je za odsustvo vezivanja odgovorno sterično blokiranje (ili neki drugi fenomen). Eksperimenti ove vrste mogu biti izvedeni upotrebom ELISA, RIA, Biacore postupaka, protočne citometrije ili bilo koje druge kvantitativne ili kvalitativne analize vezivanja antitela koja je dostupna u oblasti tehnike. U skladu sa određenim primerima predmetnog pronalaska, dva antitela se vezuju za isti (ili preklapajući) epitop ukoliko, npr. višak od 1, 5, 10, 20 ili 100 puta jednog antitela inhibira vezivanje drugoga za najmanje 50%, ali poželјnije za 75%, 90% ili čak 99%, što se meri analizom kompetitivnog vezivanja (pogledati, npr. Junghans i saradnici, Cancer Res.
1990:50:1495-1502). Alternativno, smatra se da se dva antitela vezuju za isti epitop ukoliko suštinski
2
sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu i vezivanje drugog. Smatra se i da dva antitela imaju „preklapajuće epitope“ ukoliko samo podgrupa aminokiselinskih mutacija koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.
[0091] Da bi se utvrdilo da li je antitelo u kompeticiji vezivanja (ili unakrsnoj kompeticiji vezivanja) sa referentnim anti-IL-33 antitelom, izvodi se metodologija vezivanja koja je prethodno navedena, na dva načina: u prvoj orjentaciji, omogućava se referentnom antitelu da se veže za IL-33 protein u uslovima zasićenja, nakon čega se procenjuje vezivanje ispitivanog antitela za molekul IL-33. U drugoj orjentaciji, omogućava se da se ispitivano antitelo veže za IL-33 protein u uslovima zasićenja, nakon čega se procenjuje vezivanje referentnog antitela za molekul IL-33. Ukoliko je u oba slučaja samo prvo (vezano u zasićenju) antitelo sposobno da se vezuje za molekulu IL-33, onda se zaklјučuje da su ispitivano antitelo i referentno antitelo u kompeticiji vezivanja za IL-33. Potrebno je ipak napomenuti prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike da se antitelo koje je u kompeticiji vezivanja sa referentnim antitelom, ne mora nužno vezivati za isti epitop kao referentno antitelo, već da može sterično blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem za preklapajući ili susedni epitop.
Priprema humanih antitela
[0092] Postupci za generisanje monoklonskih antitela, uklјučujući potpuno humana monoklonska antitela su poznati u stanju tehnike. U kontekstu predmetnog pronalaska, može biti upotrebljen bilo koji od takvih poznatih postupaka za pravlјenje humanih antitela koja se specifično vezuju za humani IL-33.
[0093] Upotrebom VELOCIMMUNE™ tehnologije, na primer, ili bilo kog drugog poznatog postupka za generisanje potpuno humanih monoklonskih antitela, inicijalno se izoluju himerna antitela na IL-33 visokog afiniteta, koja sadrže humani varijabilni region i konstatni region miša. Kao što je navedeno u eksperimentalnom delu teksta u nastavku, antitela se karakterišu i odabir se vrši na osnovu poželjnih karakteristika, uklјučujući afinitet, selektivnost, epitop vezivanja itd. Ukoliko je potrebno, mišji konstantni regioni se zamenjuju želјenim humanim konstantnim regionom, na primer regionom divljeg tipa ili onima iz modifikovanog IgG1 ili IgG4, da bi se generisalo potpuno humano anti-IL-33 antitelo. Iako odabran konstantan region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena sa visokim afinitetom i ciljne specifičnosti, vezane su za varijabilni region. U određenim primerima, potpuno humana anti-IL-33 antitela su izolovana direktno iz B-ćelija koje su pozitivne na antigen.
Biološki ekvivalenti
[0094] Anti-IL-33 antitela i fragmenti antitela predmetnog opisa obuhvataju proteine koji sadrže aminokiselinske sekvence koje variraju u odnosu opisana antitela, ali zadržavaju sposobnost vezivanja humanog IL-33. Ovakva varijantna antitela i fragmenti antitela sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je suštinski ekvivalentna onoj koja karakteriše opisana antitela. Slično navedenom, DNK sekvence koje kodiraju anti-IL-33 antitela predmetnog opisa obuhvataju sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukleotida u poređenju sa opisanom sekvencom, a koje kodiraju anti-IL-33 antitelo ili fragment antitela koji je suštinski biološki ekvivalent anti-IL-33 antitelu ili fragmentu antitela opisa. Primeri takve varijanti aminokiselinskih i DNK sekvenci su razmatrani u prethodnom delu teksta.
[0095] Dva proteina koja vezuju antigen, ili antitela, smatraju se biološkim ekvivalentima ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čije stope i obim apsorpcije ne karakterišu značajne razlike prilikom primene u istoj molarnoj dozi i pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo u vidu pojedinačnih doza ili višestruka doza. Pojedina antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentna u pogledu apsorpcije, ali ne i u pogledu stope apsorpcije, mada se ipak mogu smatrati bioekvivalentnima pošto su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odraz su obeležavanja, a nisu suštinski bitne za efektivnu koncentraciju leka u organizmu, npr. prilikom hronične upotrebe; smatraju se i medicinski nerelevantnima za određeni ispitivan lekoviti proizvod.
[0096] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su biološki ekvivalentna ukoliko nisu prisutne klinički značajne razlike u njihovom profilu bezbednosti, čistoći i potenciji.
[0097] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su biološki ekvivalentna ukoliko pacijent može prelaziti jedan ili više puta sa referentnog proizvoda na biološki proizvod bez očekivanog povećanja rizika od štetnih efekata, uklјučujući klinički značajnu promenu u imunogenosti ili u umanjivanju efektivnosti, u poređenju sa kontinuiranom terapijom, bez prebacivanja.
[0098] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su biološki ekvivalentna ukoliko oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja od značaja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.
[0099] Biološka ekvivalencija može biti pokazana in vivo i in vitro postupcima. Mere biološke ekvivalencije uklјučuju, na primer, (a) in vivo analizu na ljudima ili drugim sisarima, u kojoj se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti u funkciji vremena; (b) in vitro analizu koja je u korelaciji sa i koja je razumno prediktivna za podatke biološke raspoloživosti kod ljudi in vivo; (c) in vivo analizu na lјudima ili drugim sisarima u kojoj se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo antitela (ili njegovog ciljnog molekula) meri u funkciji
2
vremena; i (d) dobro kontrolisano kliničko ispitivanje kojim se uvrđuje bezbednoostt, efikasnost ili biološka raspoloživost ili biološka ekvivalencija antitela.
[0100] Bioekvivalentne varijante anti-IL-33 antitela mogu biti konstruisane, na primer, uvođenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijom terminalnih ili internih ostataka ili sekvenci koji nisu potrebni za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu bitni za biološku aktivnost mogu biti uklonjeni delecijom ili zamenjeni sa drugima aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili nepravilnih međumolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U ostalim kontekstima, biološki ekvivalentna antitela mogu obuhvatati varijante anti-IL-33 antitela koje sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, npr. mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.
Selektivnost za vrstu i unakrsna reaktivnost među vrstama
[0101] Predmetni opis, prema određenim primerima, obezbeđuje anti-IL-33 antitela koja se vezuju za humani IL-33, ali ne i za IL-33 iz drugih vrsta. Predmetni opis takođe obuhvata anti-IL-33 antitela koja se vezuju za humani IL-33 i IL-33 iz jedne ili više vrsta različitih od čoveka. Na primer, anti-IL-33 antitela pronalaska se mogu vezivati za humani IL-33 i mogu se vezivati ili ne, u zavisnosti od slučaja, za jedan ili više od IL-33 iz miša, pacova, zamorca, hrčaka, gerbila, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, cinomolgus majmuna, marmoseta, rezus majmuna ili iz šimpanze. Prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđena su anti-IL-33 antitela koja specifično vezuju humani IL-33 i IL-33cinomolgus majmuna (npr. iz Macaca fascicularis).
Imunokonjugati
[0102] Pronalazak obuhvata i anti-IL-33 monoklonska antitela konjugovana sa terapijskom strukturom ("imunokonjugate"), kao što je citotoksin, hemoterapijski lek, imunosupresiv ili radioizotop. Citotoksični agensi podrazumevaju bilo koji agens koji štetno deluje na ćelije. Primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutika za obrazovanje imunokonjugata su poznati u oblasti tehnike (pogledati, na primer, WO 05/103081).
Multispecifična antitela
[0103] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržavati domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog cilјanog polipeptida. Pogledati npr. Tutt i saradnici, 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer i saradnici, 2004, Trends Biotechnol.22:238-
2
244. Anti-IL-33 antitela predmetnog pronalaska mogu biti povezana ili istovremeno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezan (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili sa više drugih molekulskih entiteta, poput drugog antitela ili fragmenta antitela, da bi se dobilo bispecifično ili multispecifično antitelo sa sekundarnom specifičnošću vezivanja. Na primer, predmetni pronalazak obuhvata bispecifična antitela u kojima je jedan krak imunoglobulina specifičan za humani IL-33 ili njegov fragment, dok je drugi krak imunoglobulina specifičan za drugi terapijski cilјni molekul ili je konjugovan sa terapijskom strukturom.
[0104] Format bispecifičnog antitela za primer, koji može biti upotrebljen u kontekstu predmetnog pronalaska, uključuje upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domen i drugog Ig CH3 domena, pri čemu su prvi i drugi Ig CH3 domeni međusobno razlikuju jedan od drugog u najmanje jednoj aminokiselini i pri čemu najmanje jedna razlika u aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselinama. U jednom primeru izvođenja, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, dok drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje za protein A, poput modifikacije tipa H95R (prema IMGT numeraciji egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može dalje sadržavati modifikaciju tipa Y96F (prema IMGT; Y436F prema EU). Dodatne modifikacije koje se mogu naći unutar drugog CH3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (prema IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije u bispecifičnom formatu antitela koje su prethodno razmatrane unutar su područja predmentog pronalaska.
[0105] Ostali bispecifični formati za primer, koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvataju, bez ograničenja, npr. bispecifične formate zasnovane na scFv ili dimerne formate, IgG-scFv fuzije, dvostruko varijabilan domenski (DVD)-Ig, kvadrome, fuzije tipa “dugme-urupicu” (engl. knobs into-holes), uobičajen laki lanac (npr. uobičajen laki lanac sa fuzijom tipa “dugme-u-rupicu” itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)antitelo, leucinski zipper, dualno antitelo (engl. Duobody), IgG1/IgG2, dvostruko delujući Fab (DAF)-IgG i Mab<2>bispecifične formate (pogledati, npr. Klein i saradnici, 2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference koje su citirane, radi pregleda prethodno navedenih formata). Bispecifična antitela mogu biti konstruisana i upotrebom konjugata peptida i nukleinskih kiselina, npr. kada se aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću koje se ne javljaju u prirodi, upotrebljavaju za generisanje konjugata antitela i oligonukleotida specifičnih za mesto, koji se zatim međusobno udružuju u multimerne komplekse sa definisanim sastavom,
2
valencom i geometrijom. (pogledati npr. Kazane i saradnici, J. Am. Chem. Soc. [elektronska vezija objavljena: 4. decembra, 2012]).
VEZIVANJE U ZAVISNOSTI OD pH
[0106] Antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, mogu vezivati IL-33 na način koji je zavisan od pH. Na primer, anti-IL-33 antitelo može karakterisati smanjeno vezivanje za IL-33 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Alternativno, anti-IL-33 antitelo može karakterisati pojačano vezivanje za njegov antigen pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH.
[0107] U određenim primerima, „smanjeno vezivanje za IL-33 na kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH“ izražava se u vidu odnosa KDvrednosti vezivanja antitela za IL-33 na kiselom pH i KDvrednosti vezivanja antitela za IL-33 na neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može se razmatrati kao ono koje karakteriše „smanjeno vezivanje za IL-33 na kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH“ ukoliko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, karakteriše odnos KDu kiselim i neutralnim uslovima od oko 3,0 ili više. U određenim primerima, odnos KDu kiselim i neutralnim uslovima za antitelo ili fragment koji vezuje antigen može biti oko 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0; 11,5; 12,0; 12,5; 13,0; 13,5; 14,0; 14,5; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 100,0 ili više
[0108] Antitela sa karakteristikama vezivanja koje zavise od pH, mogu biti dobijena, npr. pregledom populacije antitela u pogledu smanjenog (ili pojačanog) vezivanja za određeni antigen na kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Pored toga, modifikacije domena koji vezuje antigen na nivou aminokiselina, mogu obezbediti antitela sa karakteristikama koje zavise od pH. Na primer, supstitucijom jedne ili više aminokiselina u domenu koji vezuje antigen (npr. u CDR) sa ostatkom histidina, može se dobiti antitelo sa smanjenim vezivanjem antigena pri kiselom pH u odnosu na neutralan pH. Kako se ovde upotrebljava, izraz "kiseli pH" označava pH od oko 6,0 ili manji, oko 5,5 ili manji ili oko 5,0 ili manji. Termin "kiseli pH" obuhvata pH vrednosti od oko 6,0; 5,95; 5,9; 5,85; 5,8; 5,75; 5,7; 5,65; 5,6; 5,55; 5,5; 5,45; 5,4; 5,35; 5,3; 5,25; 5,2; 5,15; 5,1; 5,05; 5,0 ili manje. Kako se ovde upotrebljava, izraz "neutralan pH" označava pH od oko 7,0 do oko 7,4. Izraz "neutralan pH" obuhvata pH vrednosti od oko 7,0; 7,05; 7,1; 7,15; 7,2; 7,25; 7,3; 7,35 i 7,4.
Terapijska formulacija i primena
[0109] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-IL-33 antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije pronalaska su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju pobolјšan prenos, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija se može naći u publikaciji
2
koja je poznata svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ovakve formulacije obuhvataju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulјa, lipide, vezikule koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski, poput LIPOFECTIN™-a, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulja-uvodi i vode-u-ulju, emulzije sa karbonilnim voskovima (polietilen glikolima raznih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže karbonilne voskove. Pogledati takođe Powell i saradnici, "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0110] Doza antitela koja se primenjuje pacijentu može varirati u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, cilјanog oboljenja, stanja, puta primene i sličnog. Poželјna doza se obično izračunava prema telesnoj težini ili površini tela. Kada se antitelo upotrebljava za lečenje stanja ili oboljenja povezanog sa aktivnošću IL-33 kod odraslog pacijenta, može biti korisno da se antitelo primeni intravenski, normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još poželјnije od oko 0,02 do oko 7, od oko 0,03 do oko 5 ili od oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbilјnosti stanja, učestalost i trajanje tretmana se može podešavati. Efektivne doze i rasporedi primene anti-IL-33 antitela mogu biti određeni empirijski; na primer, napredak pacijenta može biti praćen periodičnim procenama i doza se može prilagođavati shodno parametrima koji se zapažaju. Štaviše, skaliranje doza među vrstama može biti sprovedeno upotrebom postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike (npr. Mordenti i saradnici, 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).
[0111] Poznati su i razni drugi sistemi za isporuku koji mogu biti upotrebljeni za primenu farmaceutske kompozicije pronalaska, npr. to može biti inkapsulacija u lipozomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantnim ćelijama sposobnim da eksprimiraju mutirane viruse, kao i endocitozom posredovanom receptorima (pogledati npr. Wu i saradnici, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Postupci uvođenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, supkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve primene. Kompozicija može biti primenjena bilo kojim konvencionalnim putem primene, na primer, infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili ovojnice koje čine služokožu (npr. putem oralne sluzokože, rektalne ili crevne sluzokože itd.), a može biti primenjena i zajedno sa drugim biološki aktivnim agenskima. Primena može biti sistemska i lokalna.
[0112] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti isporučena i supkutano ili intravenski, upotrebom standardne igle i šprica. Dodatno, u pogledu supkutane isporuke, česta je upotreba i uređaja za isporuku tipa olovke (pen-uređaja), čija je svrha upravo isporuka farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za isporuku tipa olovke može biti za višekratnu upotrebu ili za jednokratnu upotrebu. Pen-uređaj za višekratnu upotrebu obično koristi uložak koji se može zameniti, a koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada je celokupna farmaceutska
2
kompozicija koja se nalazi unutar uloška primenjena i uložak je prazan, prazan uložak se lako može odbaciti i zameniti novim uloškom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku tipa olovke se tada može ponovo koristiti. U pen-uređaju za jednokratnu upotrebu nema uloška koji se može zameniti. Umesto toga, pen-uređaj za jednokratnu upotrebu se nabavlja kao uređaj koji je prethodno napunjen sa farmaceutskom kompozicijom i koja je sadržana u rezervoaru unutar uređaja. Jednom kada se rezervoar sa farmaceutskom kompozicijom isprazni, ceo uređaj se odbacuje.
[0113] Brojni pen-uređaji za višekratnu upotrebu i uređaji za automatsko injeciranje imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Engleska), pen-uređaj tipa DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Švajcarska), pen-uređaj tipa HUMALOG MIX 75/25™, pen-uređaj tipa HUMALOG™, pen-uređaj tipa HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD™ pen-uređaj (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Nemačka), da napomenemo samo nekoliko. Primeri pen-uređaja za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u supkutanoj isporuci farametuskih kompozicija predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na, pen-uređaj tipa SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), kao i autoinjektor tipa SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i pen-uređaj tipa HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), da napomenemo samo nekoliko.
[0114] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena sistemom sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom primeru izvođenja, može biti upotrebljena pumpa (pogledati Langer, navedeno prethodno; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom primeru izvođenja, mogu biti upotrebljani polimerni materijali; pogledati, Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (ur.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom primeru izvođenja, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može biti postavljen u neposrednoj blizini ciljnog mesta delovanja kompozicije, tako da je potreban samo deo sistemske doze (pogledati, npr. Goodson, 1984, u Medical Applications of Controlled Release, naveden prethodno, vol.2, str.115-138). Ostali sistemi sa kontroliranim oslobađanjem se razmatraju u preglednom članku Langer-a, 1990, Science 249:1527-1533.
[0115] Preparati za injeciranje mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuziju u kapima itd. Ovakvi preparati za injeciranje mogu biti pripremljeni postupcima koji su opšte poznati. Na primer, preparati za injeciranje mogu biti pripremljeni, npr. rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli koja je prethodno opisana, u sterilnom vodenom medijumu ili ulјanom medijumu koji se konvencionalno upotrebljava za injekcije. Kao vodeni medijumi za injekcije, na primer, postoje fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agensei itd., a koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za solubilizaciju kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilenski (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulјa)] itd. Kao ulјani medijum, koristi se npr. sezamovo ulјe, sojino ulјe itd., koja se mogu koristiti u kombinaciji sa agensom za solubilizaciju poput benzil benzoata, benzil alkohola itd. Poželjno je da se ovako pripremlјena injekcija pakuje u odgovarajuću ampulu.
[0116] Prednost je da se farmaceutske kompozicije za oralnu i parenteralnu upotrebu koje su prethodno opisane, pripremaju u doznim oblicima koji predstavljaju jediničnu dozu, pogodnu za lako prilagođavanje doze aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd. Količina prethodno navedenog antitela koje je sadržano u doznom obliku, obično iznosi od oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku, u jediničnoj dozi; posebno je od važnosti oblik za injeciranje, a poželјno je da ostali dozni oblici sadrže od oko 5 do oko 100 mg i od oko 10 do oko 250 mg.
Terapijske upotrebe antitela
[0117] Eksperimenti sa mišjim modelima, sprovedeni od strane predmetnih pronalazača, doprineli su identifikaciji raznih oboljenja i stanja koja mogu biti lečena, sprečena i/ili ublažena antagonizmom IL-33. Na primer, rezultat hidrodinamičke isporuke mišje IL-33 DNK je indukcija nakuplјanja sluzi u plućima i povećanje ukupnog serumskog IgE kod miševa. Pored toga, rezultat isporuke mIL-33 DNK je pozitivna regulacija ST2 i raznih nishodnih citokina, što je izmereno analizama sa genskim ekspresionim čipovima. Eksperimenti sprovedeni od strane predmetnih pronalazača, upotrebom miševa kojima je genetičkim inženjeringom izbačen IL-33 (engl. knock-out), takođe su ukazali na razne potencijalne terapijske koristi IL-33 antagonizma. Na primer, pronađeno je da su makroskopska procena i infiltrati u koži uporedivi između miševa divlјeg tipa i IL-33<-/->miševa, u modelu psorijaze indukovane sa IMQ. Štaviše, IL-33<-/->miševi su pokazali smanjenu eozinofiliju i akumulaciju rezidualne sluzi u modelu upale pluća prouzrokovane alergenom.
[0118] Antitela opisa su korisna, između ostalog, za lečenje, prevenciju i/ili pobolјšanje bilo kog oboljenja ili poremećaja koji je povezan sa ili posredovan ekspresijom, signalizacijom ili aktivnošću IL-33, ili koji se može lečiti blokiranjem interakcije između IL-33 i liganda IL-33 (npr. ST2), ili koji na drugi način inhibira aktivnost i/ili signalizaciju IL-33. Na primer, predmetni opis obezbeđuje postupke lečenja astme (npr. alergijske astme, nealergijske astme, ozbiljne refraktorne astme, pogoršanja u astmi, kao i astme rezistentne na steroide, astme osetlјive na steroide, eozinofilne astme ili astme
1
koja nije eozinofilna itd), atopijskog dermatitisa, psorijaze, drugih inflamatornih poremećaja, alergije, anafilakse, kardiovaskularnih oboljenja, oboljenja centralnog nervnog sistema, bolnih stanja, artritisa (nrp. reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, psorijatičnog artritisa itd.), artritisa džinovskih ćelija, vaskulitisa (behčetove bolesti i Churg-Strauss-ovog sindroma), Henoch-Schonlein-ove purpure, multiple skleroze, inflamatornog poremećaja creva (npr. Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa), lupusa i sjogrenovog sindroma. Prema pronalasku, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu biti upotrebljeni u postupku lečenja hronične astme ili HOPB.
[0119] Antitela predmetnog opisa su takođe korisna za lečenje, prevenciju i/ili pobolјšanje jedne ili više od fibrotičnih bolesti. Primeri fibrotičnih bolesti koje se mogu lečiti primenom anti-IL-33 antitela opisa, obuhvataju plućnu fibrozu (npr. idiopatsku plućnu fibrozu, plućnu fibrozu prouzrokovanu bleomicinom, plućnu fibrozu prouzrokovanu azbestom i sindrom bronhiolitisa obliterans), hroničnu astmu, fibrozu povezanu sa akutnom povredom pluća i akutnim respiratornim distresom (npr. fibrozu prouzrokovanu bakterijskom pneumonijom, fibrozu prouzrokovanu traumom, fibrozu prouzrokovanu virusnom upalom pluća, fibrozu prouzrokovanu upotrebom respiratora, fibrozu prouzrokovanu nepulmonarnom sepsom i fibrozu prouzrokovanu aspiracijom), silikozu, fibrozu prouzrokovanu zračenjem, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP, koja može, ali ne mora biti povezana sa, prouzrokovana delom sa ili biti rezultat primarnog ili sekundarnog izlaganja dimu cigareta), sklerodermu, okularnu fibrozu, fibrozu kože (npr. sklerodermu), fibrozu jetre (npr. cirozu, fibrozu jetre prouzrokovanu alkoholom, nealkoholni steatohepatitis (NASH), povredu žučnog kanala, primarnu bilarnu cirozu, fibrozu jetre prouzrokovanu infekcijom ili virusom, autoimuni hepatitis, fibrozu bubrega, srčanu fibrozu, aterosklerozu, stent restenozu i mijelofibrozu.
[0120] U kontekstu postupaka lečenja koji su ovde opisani, anti-IL-33 antitelo može biti primenjeno kao monoterapija (tj. kao jedini terapijski agens) ili u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa (čiji su primeri ovde opisani u drugom delu teksta).
Kombinovane terapije i formulacije
[0121] Predmetni opis obuhvata kompozicije i terapijske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde opisanih anti-IL-33 antitela, u kombinaciji sa jednom ili sa više dodatnih terapijski aktivnih komponenti, kao i postupke lečenja koji podrazumevaju primenu takvih kombinacija subjektima kojima je to potrebno.
[0122] Anti-IL-33 antitela predmetnog pronalaska mogu biti formulisana zajedno sa i/ili primenjivana u kombinaciji sa, na primer, inhibitorima citokina, uklјučujući inhibitore citokina tipa malih molekula i antitela koja se vezuju za citokine kao što su IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, IL-25, IL-26 ili antagonisti njihovih odgovarajućih receptora.
2
[0123] Anti-IL-33 antitela pronalaska se takođe mogu primenjivati i/ili formulisati zajedno u kombinaciji sa antiviralnim lekovima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima, steroidima, kiseonikom, antioksidansima, helatorima metala, IFN-gama i/ili sa NSAID.
[0124] Dodatna terapijski aktivna komponenta(komponente) može biti primenjena neposredno pre, istovremeno sa ili nedugo nakon primene anti-IL-33 antitela predmetnog pronalaska; (za potrebe predmetnog opisa, takvi režimi primene se smatraju primenom anti-IL-33 antitela "u kombinaciji sa" dodatnom terapijski aktivnom komponentom). Predmetni pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije u kojima je anti-IL-33 antitelo predmetnog pronalaska ko-formulisano sa jednom ili sa više dodatnih terapijski aktivnih komponenti, kao što je opisano u drugim delovima teksta.
Režimi primene
[0125] Prema određenim primerima predmetnog opisa, višesturke doze anti-IL-33 antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju anti-IL-33 antitela i bilo kog drugog terapijski aktivnog agensa koji je ovde naveden) mogu biti primenjene subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu opisa, obuhvataju sekvencijalnu primenu višestrukih doza anti-IL-33 antitela predmetnog pronalaska subjektu. Kao što se ovde upotrebljava, "sekvencijalna primena" označava da se svaka doza anti-IL-33 antitela primenjuje subjektu u različitoj vremenskoj tački, npr. različitim danima koji su razdvojeni unapred određenim intervalom (npr. satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetni opis obuhvata i postupke koji podrazumevaju sekvencijalnu primenu jedne početne doze anti-IL-33 antitela pacijentu, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza anti-IL-33 antitela, a po izboru, nakon toga može slediti i jedna ili više tercijarnih doza anti-IL-33 antitela.
[0126] Termini "početna doza", "sekundarne doze" i "tercijarne doze" se odnose na vremensku sekvencu primene anti-IL-33 antitela pronalaska. Tako, "početna doza" je doza koja se primenjuje na početku režima lečenja (označena ovde i kao "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje se primenjuju nakon početne doze; i "tercijarne doze" su doze koje se primenjuju nakon sekundarnih doza. Početne, sekundarne i tercijarne doze mogu sadržavati istu količinu anti-IL-33 antitela, ali se generalno mogu razlikovati jedna od druge u pogledu učestalosti primene. U određenim primerima, međutim, količina anti-IL-33 antitela koja je sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama varira jedna u odnosu na drugu (npr. prilagođava se na veću ili manju dozu prema potrebi). U određenim primerima, dve ili više (npr. 2, 3, 4 ili 5) doza se primenjuju na početku režima lečenja u vidu "početno visoke/pune doze", nakon čega slede naredne doze koje se primenjuju sa manjom učestalošću (npr. one su "doze održavanja").
[0127] U određenim oglednim primerima, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se primenjuje 1 do 26 (npr. 1, 11⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2 ili više) nedelјa nakon prve prethodne doze. Fraza "neposredno prethodna doza", kako se ovde upotrebljava, označava, u sekvenci višestrukih primena, dozu anti-IL-33 antitela koja se primenjuje pacijentu pre primene sledeće doze u nizu, bez interventnih doza.
[0128] Postupci prema ovom aspektu opisa mogu obuhvatati primenu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza anti-IL-33 antitela pacijentu. Na primer, u određenim primerima, pacijentu se primenjuje samo jedna sekundarna doza. U drugim primerima izvođenja, pacijentu se primenjuju dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza. Slično navednom, u određenim primerima, pacijentu se primenjuje samo jedna tercijarna doza. U drugim primerima, pacijentu se primenjuju dva ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza.
[0129] U primerima koji podrazumevaju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti primenjena sa istom učestalošću kao i ostale sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može biti primenjena pacijentu 1 do 2 nedelјe ili 1 do 2 meseca nakon neposredno prethodne doze. Slično navedenom, u primerima koji podrazumevaju više tercijarnih doza, svaka tercijalna doza može biti primenjena sa isitom učestalošću kao i ostale tercijarne doze. Na primer, svaka tercijalna doza može biti primenjena pacijentu 2 do 12 nedelјa nakon neposredno prethodne doze. U određenim primerima, učestalost primene sekundarnih i/ili tercijarnih doza pacijentu može varirati tokom režima lečenja. Učestalost primene takođe može biti podešena tokom trajanja tretmana od strane lekara, u zavisnosti od potreba pojedinog pacijenta nakon kliničkog pregleda.
[0130] Predmetni opis podrazumeva režime primene u kojima se pacijentu primenjuju od 2 do 6 punih doza sa prvom učestalošću (npr. jednom nedelјno, jednom u dve nedelјe, jednom u tri nedelјe, jednom mesečno, jednom na dva meseca itd.), nakon čega sledi primena dve ili više doza održavanja pacijentu sa manjom učestalošću. Na primer, prema ovom aspektu opisa, ukoliko se početne doze primenjuju sa učestalošću o jednom mesečno, tada se doza održavanja može primenjivati pacijentu jednom na svakih šest nedelja, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca itd.).
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0131] Anti-IL-33 antitela predmetnog opisa mogu takođe biti upotrebljena za detekcijui/ili merenje IL-33 ili ćelija koje eksprimiraju IL-33 u uzorku, npr. u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-IL-33 antitelo ili njegov fragment, može biti upotrebljeno za postavljanje dijagnoze stanja ili oboljenja koga karakteriše aberantna ekspresija (npr. prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, odsustvo ekspresije itd.) IL-33. Dijagnostički testovi za IL-33 za primer, mogu obuhvatati npr. dovođenje
4
uzorka, dobijenog iz pacijenta, u kontakt sa anti-IL-33 antitelom opisa, pri čemu je anti-IL-33 antitelo obeleženo sa obeleživačem koji se može detektovati ili sa reporterskim molekulom. Alternativno, neobeleženo anti-IL-33 antitelo može biti upotrebljeno u dijagnostičkim primenama, u kombinaciji sa sekundarnim antitelima koja su sam po sebi obeležena obeleživačem koji se može detektovati. Obeleživač koji se može detektovati ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,
<32>P,<35>S ili<125>J; fluorescentna ili hemiluminescentna grupa kao što je fluorescein izotiocijanat ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Specifične analize za primer koje mogu biti upotrebljene za detekciju ili merenje IL-33 u uzorku obuhvataju imunosorbentni test povezan sa enzimom (ELISA), radioimunoanalizu (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS).
[0132] Uzorci koji mogu biti upotrebljeni u u dijagnostičkim ispitivanjima IL-33 prema predmetnom opisu, obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti iz pacijenta, a koji sadrži količine IL-33 proteina, ili njegovih fragmenata, koje se mogu detektovati u normalnim ili patološkim uslovima. U principu, nivoi IL-33 u određenom uzorku dobijenom iz zdravog pacijenta (npr. pacijenta koji nije pogođen bolešću ili stanjem povezanim sa abnormalnim nivoima ili aktivnošću IL-33) biće izmeren na početku da bi ustanovio osnovni ili standardni nivo IL-33. Ovakav osnovni nivo IL-33 se tada može upoređivati sa nivoima IL-33 koji se mere u uzorcima dobijenim iz osoba za koje se sumnja da su pogođeni bolešću ili stanjem povezanim sa IL-33.
PRIMERI
[0133] Primeri koji slede su navedeni da bi se prosečno iskusnim stručnjacima obezbedio potpun opis pronalska, kao i opis kako napraviti i upotrebljavati postupke i kompozicije pronalaska. Ipak, nije predviđeno da isti budu ograničavajući za područje onoga što pronalaziči smatraju njihovim pronalaskom. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu upotrebljenih brojeva (npr. količina, temperature itd.), ali je potrebno uračunati i prisustvo eksperimentalnih grešaka i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska maura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je atmosferski ili blizak atmosferskom.
Primer 1. Generisanje humanih antitela na humani IL-33
[0134] Imunogen koji sadrži humani IL-33 je primenjen direktno, sa adjuvansom za stimulisanje imunog odgovora, VELOCIMMUNE® mišu koji je sadržavao DNK koja kodira varijabilne regione humanih imunoglobulinskih teških i kapa lakih lanaca. Imuni odgovor sa antitelom je praćen imunološkom analizom specifičnom za IL-33. Kada je želјeni imunološki odgovor postignut, prikupljeni su splenociti koji su dalje fuzionisani sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se očuvala njihova vijabilnost i da bi se obrazovale hibridomske ćelijske linije. Hibridoma ćelijske linije su pregledane i selektovane da bi se identifikovale ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za IL-33. Upotrebom ove tehnike, dobijeno je nekoliko himernih anti-IL-33 antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene); antitela za primer koja su generisana na ovaj način, označena su kao što sledi: H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N i H1M9565N. Humani varijabilni domeni iz himernih antitela su potom klonirani u humane konstantne domene da bi se napravila potpuno humana anti-IL-33 antitela, kao što je ovde opisano.
[0135] Anti-IL-33 antitela su takođe izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B-ćelija bez fuzije sa mijelomskim ćelijama, kao što je opisano u US 2007/0280945A1. Upotrebom ovog postupka, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-IL-33 antitela (tj. dobijena su antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene); antitela za primer koja su generisana na ovaj način, označena su kao što sledi: H4H9629P, H4H9633P, H4H6940P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P i H4H9676P.
[0136] Određene biološke osobine anti-IL-33 antitela za primer koja su generisana u skladu sa postupcima ovog Primera, detalјno su opisana u Primerima navedenim u tekstu koji sledi.
Primer 2. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca
[0137] Tabela 1 sadrži parove aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, kao i CDR sekvence odabranih anti-IL-33 antitela i njihovih odgovarajućih identifikatora antitela.
Tabela 1
[0138] Antitela se ovde obično navode prema sledećoj nomenklaturi: najpre sa prefiksom Fc (npr. "H1M" ili "H4H"), nakon koga sledi brojčani identifikator (npr. "9559", "9566" ili "9629", kao što je prikazano u Tabeli 1), a potom i sa sufiksksom "P" ili "N". Tako, prema ovoj nomenklaturi, antitelo se ovde može navoditi kao, npr. "H1M9559N", "H1M9566N, "H4H9629P" itd. U oznakama antitela, prefiksi H1M i H4H se ovde upotrebljavaju da bi ukazali na određeni Fc region izotipa antitela. Na primer, "H1M" antitelo sadrži mišji IgG1 Fc, dok antitelo "H4H" sadrži humani IgG4 Fc. Kao što će prosečno iskusnom stručnjaku biti odmah očigledno, antitela sa određenim Fc izotipom mogu biti prevedena u antitelo sa drugačijim Fc izotipom (npr. antitelo sa mišjim IgG1 Fc može biti prevedeno u antitelo sa humanim IgG4 itd.), ali u svakom slučaju, varijabilni domeni (uklјučujući CDR sekvence) -koji su naznačeni brojčanim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1 - ostaće isti, a očekuje se da će svojstva vezivanja biti identična ili suštinski slična bez obzira na prirodu Fc domena.
Primer 3. Vezanje antitela za humani IL-33, određeno površinskom plazmonskom rezonancom
[0139] Ravnotežne konstante disocijacije (KDvrednosti) vezivanja IL-33 za prečišćena monoklonska anti-IL-33 antitela, određene su upotrebom biosenzora za površinsku plazmonsku rezonancu u realnom vremenu, upotrebom Biacore 4000 instrumenta. Površina Biacore senzora je najpre derivatizovana aminskim kuplovanjem bilo sa poliklonskim zečjim anti-mišjim antitelom (GE, kat.br. BR-1008-38) ili sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, kat.br. BR-1008-39) radi hvatanje anti-IL-33 monoklonskih antitela koja su eksprimirana sa mišjim ili sa humanim IgG4 konstantnim regionima, tim redom. Sve studije vezivanja na Biacore sistemu, urađene su u 0,01M ADA pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA i sa 0,05% v/v surfaktanta Tween-20 (ABS-ET pufer protoka). Različite koncentracije humanog IL-33 (hIL-33; R&D Systems, kat.br. 3625-IL-010/CF) ili IL-33 cinomolgus majmuna, eksprimiranih sa heksahistidinskim tagom na C kraju (MfIL-33-6His; SEQ ID NO: 305), pripremlјene ABS-ET puferu za protok (u opsegu od 100 nM do 3,7 nM, trostruka razblaženja), injecirane su preko površine prevučene anti-IL-33 monoklonskim antitelima pri brzini protoka od 30µL/min. Asocijacija bilo hIL-33 ili MfIL-33-6His sa zarobljenim monoklonskim antitelima je praćena tokom 4 minuta, pa je njihova disocijacija u ABS-ET puferu za protok praćena tokom 10 minuta. Uticaj smanjenog pH na vezivanje svakog anti-IL-33 antitela od strane bilo hIL-33 ili MfIL-33-6His, ispitan je upotrebom formata testa za paralelno ispitivanje uticaja pH sa 0,01M ADA pH 6,0, 0,15M NaCl, 3mM EDTA i 0,05% v/v surfaktanta Tween-20 (ABS-ET pH6 pufer). Da bi se navedeno postiglo, tokom 4 minuta je praćena asocijacija bilo hIL-33 ili MfIL-33-6His sa zaroblјenim monoklonskim antitelom u ABS-ET puferu za protok. Nakon disocijacije od 30 sekundi, bilo za hIL-33 ili MfIL-33-6His, u ABS-ET puferu za protok, injeciran je ABS-ET pH6 pufer tokom 3 minuta, pa je izmerena disocijacija analita pod uslovima niskog pH. Svi kinetički eksperimenti vezivanja su izvođeni i na 25°C i na 37°C. Kinetičke konstante asocijacije (ka) i disocijacije (kd) su određivane uklapanjem senzograma u realnom vremenu u model vezivanja od 1:1, upotrebom kompjuterskog programa za uklapanja krivih Scrubber 2.0c. Ravnotežne konstante disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživoti (t1⁄2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao:
[0140] Kinetički parametri vezivanja za hIL-33 i MfIL-33-6His vezivanje sa različitim anti-IL-33 monoklonskim antitelima na 25°C i 37°C su prikazani u Tabelama od 2 do 5. Na 25°C, hIL-33 se vezivao za anti-IL-33 antitela sa KDvrednostima u rasponu od 78pM do 757pM, kao što je prikazano u Tabeli 2. Na 37°C, hIL-33 se vezivao za anti-IL-33 antitela sa KDvrednostima u rasponu od 411pM do 2,03nM, kao što je prikazano u Tabeli 3. Na obe temperature, i na 25°C i na 37°C, jedno anti-IL-33 antitelo je ispoljilo slabo vezivanje i stoga kinetički parametri njegovog vezivanja nisu mogli biti uklopljeni upotrebom modela vezivanja od 1:1. Na 25°C, MfIL-33-6His se vezivao za anti-IL-33 antitela sa KDvrednostima u rasponu od 333pM do 38nM, kao što je prikazano u Tabeli 4. Na 37°C, MfIL-33-6His se vezivao za anti-IL-33 antitela sa KDvrednostima u rasponu od 1 nM do 48,6nM, kao što je prikazano u Tabeli 55.
Tabela 2: Kinetički parametri vezivanja anti-IL-33 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani IL-33 na 25°C.
Tabela 3: Kinetički parametri vezivanja anti-IL-33 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani IL-33 na 37°C.
4
Tabela 4: Kinetički parametri vezivanja anti-IL-33 monoklonskih antitela koja se vezuju za MfIL-33-6His na 25°C.
Tabela 5: Kinetički parametri vezivanja anti-IL-33 monoklonskih antitela koja se vezuju za MfIL-33-6His na 37°C.
Primer 4. Anti-IL-33 antitela blokiraju vezivanje IL-33 za humani ST2 receptor
[0141] Sposobnost anti-IL-33 antitela da blokiraju vezivanje bilo humanog IL-33 (hIL-33) ili IL-33 cinomologus majmuna za humani ST2 receptor, merena je upotrebom kompetitivnog sendvič ELISA postupka. Deo ektodomena humanog ST2 proteina koji je bio eksprimiran sa C-terminalnim humanim IgG1 Fc tagom (hST2-hFc; SEQ ID NO: 306), nanet je na mikrotitarske ploče sa 96 mesta u koncetraciji od 1µg/mL u PBS puferu, pa su ploče inkubirane preko noći na 4°C. Mesta nespecifičnog vezivanja su naknadno blokirana upotrebom 0,5% (w/v) rastvora BSA u PBS-u. Konstantne koncentracije bilo biotiniziranog hIL-33 proteina od 30 pM (R&D Systems, kat.br. 3625-IL/CF) (biotin-hIL-33) ili IL-33 cinomologus majmuna od 150 pM, eksprimiranog sa heksahistidinskim tagom (MfIL-33-6His; SEQ ID NO: 305), odvojeno su dodavane u serijska razblaženja antitela, tako da su finalne koncentracije antitela bile opsega od 0 do 100 nM. Smeše antitela i IL-33 su zatim inkubiranje tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, pre nego što su prebačene na mikrotiter ploče obložene sa hST2-hFc. Nakon inkubacije od 1 sata na sobnoj temperaturi, bunarići su isprani i biotin-hIL-33 koji je bio vezan za ploču je detektovan upotrebom streptavidina konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) (Thermo Scientific, kat.br. N200), dok je MfIL-33-6His koji je bio vezan za ploču detektovan sa anti-His monoklonskim antitelom konjugovanim sa HRP (Qiagen, kat.br.34460). Svi uzorci su razvijani sa TMB rastvorom (BD biosciences, kat.br. 51-2607KC) da bi se proizvela kolorimetrijska reakcija, a zatim je reakcija zaustavljena zakišelјavanjem sa 1M sumpornom kiselinom, pre merenja apsorbancije na 450 nm na Victor X5 čitaču ploča. Analiza podataka je rađena upotrebom sigmoidalnog modela doze i odgovora u kompjuterskom programu Prism™. Izračunata IC50vrednost, definisana kao koncentracija antitela koja je potrebna za smanjenje maksimalnog signala vezivanja biotin-hIL-33 ili MfIL-33-6His za ploče obložene sa hST2-hFc od 50%, upotrebljena je kao pokazatelj potencije blokiranja. Procenat blokade je izračunat kao odnos smanjenja u signalu koji je zabeležen u prisustvu antitela u odnosu na razliku između signala samo sa IL-33 i signala pozadine (signal HRP-konjugovanog sekundarnog antitela ili streptavidina samostalno). Apsorpcija izmerena za konstantnu koncentraciju biotin-hIL-33 ili MfIL-33-6HS samostalno je definisana kao blokiranje od 0%, dok je apsorpcija izmerena bez dodavanja IL-33 definisana kao blokada od 100%. Vrednosti apsorpcije bunarića koji su sadržavali najveću koncentraciju svakog antitela su upotrebljene za određivanje procenta maksimalnog blokiranja.
Tabela 6: Blokiranje vezivanja biotin-hIL-33 ili MfIL-33-6His za hST2-hFc sa anti-IL-33 antitelom
(ELISA)
4
[0142] Eksperimenti vezivanja za 20 antitela su urađeni u dva odvojena dana, kao što je naznačeno u Tabeli 6. Svih 20 anti-IL-33 antitela je blokiralo vezivanje biotin-hIL-33 za hST2-hFc sa IC50vrednošćui u opsegu od 140pM do 22nM i sa procentom maksimalnog blokiranja u rasponu od 46% do 88%. Osamnaest od 20 anti-IL-33 antitela je blokiralo vezivanje MfIL-33-6His za hST2-hFc, sa IC50vrednostima raspona od 220pM do 13nM i sa procentom maksimalnog blokiranja od 38% do 92%, kao što je prikazano u Tabeli 6. Dva ispitivana antitela, H4H9629P i H4H9633P, nisu pokazala merlјivu blokadu MfIL-33-6His vezivanja za hST2-hFc.
Primer 5. Inhibicija vezivanja IL-33 za anti-IL-33 monolonsko antitelo sa ST2, pokazana Biacore analizom
[0143] Sposobnost anti-IL-33 antitela da se vezuju za prethodno obrazovan kompleks Il-33 sa ST2, ispitana je upotrebom Biacore T-200 instrumenta koji je bio opremlјen biosenzorom za površinsku plazmonsku rezonancu u relanom vremenu. Eksperiment je izveden na 25°C sa puferom za protok koji je bio sastavljen od 0,01M HEPES-a pH 7,4; 0,15M NaCl, 3mM EDTA i 0,05% v/v surfaktanta Tween-20 (HBS-ET). Površina Biacore senzora je najpre derivatizovana aminskim kuplovanjem monoklonskog antitela specifičnog za anti-myc obeleženog sa tagom (Klon br. 9E10), nakon čega je na ovako derivatizovan senzor vezano približno 160 jedinica odgovora (RU) humanog ST2 proteina eksprimiranog sa C-terminalnim myc-myc-heksahistadinskim tagom (hST2-MMH; SEQ ID NO: 323). Površina obložena sa hST2-MMH je zasićena injeciranjem 100 nM humanog IL-33 (hIL-33; R&D Systems, kat.br.3625-IL-010/CF) tokom 3 minuta, nakon čega je usledilo injeciranje 100 nM rastvora anti-IL-33 monoklonskog antitela u trajanju od 3 minuta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom celog trajanja eksperimenta, a uočen odgovor vezivanja u 3. minutu nakon injeciranja anti-IL-33 antitela u smešu prethodno obrazovanog kompleksa hIL-33 i vezanog hST2-MMH je snimljen i tabelarno prikazan u Tabeli 7. Nije uočeno nespecifično vezivanje anti-IL-33 monoklonskog antitela za površinu obloženu anti-myc tagom. Kao što je prikazano u Tabeli 7, 17 ispitivanih antitela nije ispoljilo merlјivo vezivanje za hIL-33 nakon što je on uveden u prethodno obrazovan kompleks sa hST2-MMH, dok su se tri antitela (H1M9565N, H1M9566N i H1M9568N) vezala za hIL-33 nakon uvođenja u prethodno obrazovan kompleksa sa hST2-MMH.
Tabela 7: Vezivanje anti-IL-33 antitela za prethodno obrazovan kompleks hIL-33 i hST2-MMH
4
Primer 6. Inhibicija signalizacije receptora posredovane sa IL-33 anti-IL-33 antitelima
[0144] Interleukin-33 (IL-33) je ligand za ST2, člana superfamilije toll receptoru sličnih/receptora za interleukin-1 koji asocira sa pomoćnim proteinom, IL-1 RAcP (radi revijskog pregleda, pogledati Kakkar i Lee, 2008). Nakon aktivacije ST2/ IL-1 RAcP sa IL-33, pokreće se signalna kaskada kroz seriju nishodnih molekula kao što su MyD88 (faktor mijeloidne diferencijacije 88) i TRAF6 (faktor povezan sa TNF receptorom tipa 6), što dovodi do aktivacije NFkB (nuklearnog faktora -κB), između ostalih. Da bi se razvio biološki relevantan sistem biološkog testiranja za ispitivanje anti-IL-33 antitela, ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK293) su stabilno transfektovane da bi se ekprimirao humani ST2 (aminokiseline 1-556 iz pristupnog broja NP_057316) zajedno sa luciferaznim reporterom [element odgovora na NFκB (5x)-luciferaza-IRES-GFP] (HEK293/hST2/NFkB-luciferarazna ćelijska linija). HEK293 ćelijska linija endogeno eksprimira IL-1 RAcP, a NFkB aktivacija sa IL-33 u HEK293 ćelijama je ranije prikazana (Schmitz i saradnici, Immunity 23:479-490 (2005)). Stabilna ćelijska linija je izolovana i gajena u 10% FBS, DMEM-u, NEAA, penicilinu/streptomicinu i G418.
[0145] Za biološku analizu, HEK293/hST2/NFkB-luciferazne ćelije su zasejane na ploče za ispitivanje sa 96 mesta, u gustini od po 10,000 ćelija po bunariću, u medijumu sa niskim sadržajem seruma koji je sadržavao i 0,1% w/v FBS i OPTIMEM (Invitrogen, kat.br. 31985-070), nakon čega su ćelije inkubirane na 37°C u 5% CO2preko noći. Sledećeg dana, za određivanje odgovora na dozu IL-33, serijski su razblaženi bilo humani IL-33 (hIL-33; R&D Systems, kat.br. 3625-IL) ili IL-33 cinomolgus majmuna, eksprimirani sa C-terminalnim heksahistidinskim tagom (MfIL-33 -6His; SEQ ID NO: 305), u odnosu 1:3, pa su dodati ćelijama polazeći od 10 nM i smanjujući opseg do 0,0002 nM, zajedno sa kontrolnim uzorkom koji nije sadržavo IL-33. Da bi se izmerila inhibicija, antitela su serijski razblaživana i dodata ćelijama, nakon čega je sledilo dodavanje konstantnih koncentracija IL-33 (10 pM hIL-33 za analizu humanog, i 5 pM MfIL-33-6His za analizu IL-33 majmuna). Pre dodavanja ćelijama, pripremljena su trostruka serijska razblaženja antitela, polazeći od 100 pM i smanjujući do opsega od 0,002 nM ili polazeći od 10 nM i smanjujući se do opsega od 0,0002 nM. Pored serije razblaženja antitela, uključeni su i bunarići koji su sadržavali konstantne koncentracije IL-33, ali koji su bili bez bilo kakvog antitela. Nakon 5,5 sati inkubacije na 37°C u 5% CO2, aktivnost luciferaze je detektovana upotrebom Victor X čitača ploča (Perkin Elmer), a rezultati su analizirani upotrebom nelinearne regresije (logistika sa 4 parametra) u Prism 5 programu. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.
4
Tabela 8: Inhibicija aktivacije HEK293/hST2/NFkB-luciferaraznih ćelija indukovane sa humanim IL-33 i IL-33 mamuna u otrebom anti-IL33 antitela
[0146] Osamnaest od 20 anti-IL33 antitela je blokiralo stimulaciju HEK293/hST2/NFkB-luciferaraznih ćelija sa humanim IL-33, uz IC50vrednosti u rasponu od 7,5 pM do 29 nM, kao što je prikazano u Tabeli 8. Dva od ispitivanih antitela, H1M9566N i H1M9568N, delimično su inhibirala hIL-33 sa maksimalnom inhibicijom od 48% i 66% i sa IC50vrednostima od 950 pM, odnosno 250 pM, tim redom. Osamnaest od 20 anti-IL33 antitela je blokiralo stimulaciju HEK293/hST2/NFkB-luciferaraznih
4
ćelija sa MfIL-33-6His, uz IC50vrednosti u rasponu od 660pM do 130nM, kao što je prikazano u Tabeli 8. Dva od ispitivanih antitela, H1M9566N i H1M9568N, delimično su inhibirala MfIL-33-6His sa maksimalnom inhibicijom od 61% i 34% i sa IC50vrednostima od 1,5 nM i 3,5 nM, tim redom.
Primer 7. Inhibicija IL-33-indukovane degranulacije humanih bazofila sa anti-IL-33 antitelima
[0147] Da bi se dalјe ispitale in vitro karakteristike izabranih anti-IL-33 antitela, merena je njihova sposobnost da blokiraju degranulaciju bazofila prouzrokovanu sa IL-33. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su prečišćene iz sveže pune krvi dva različita humana donora, centrifugiranjem u gradijentu gustine. Puna krv u K2 EDTA je razblažena sa RPMI 1640 od odnosa od 1:1, pa je pažljivo naneta na Ficoll-Pakque gradijent (GE Healthcare, kat.br. 17-1440-03) i centrifugirana, da bi se odvojile PBMC. Interfazni sloj koji je sadržavao PBMC je izdvojen aspiracijom, pa je prebačen u novu epruvetu i ispran dva puta sa MACS puferom koji je sadržavao razblaženje MACS BSA rastvora u odnosu od 1:20 (Militenyi Biotec, kat.br.130-091-376) u MACS rastvoru za ispiranje (Militenyi Biotec, kat.br. 130-091-222). Prečišćene PBMC su zatim zasejane u mikrotitare ploče sa 96 mesta, sa dnom bunarića V oblika, u finalnoj koncentraciji od 3,0x10<6>ćelija/mL u 100µL MACS pufera. U svrhu prajmovanja bazofila sadržanih u PBMC populaciji, u ćelijsku suspenziju je dodat 1 ng IL-3 (Sigma, kat.br. H7166-10UG) u 50µl Dulbecco-vog fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora bez Ca<++>ili Mg<++>(DPBS), nakon čega je suspenzija inkubirana na 37°C tokom 10 minuta.
[0148] Napravlјena su zatim serijska razblaženja dva različita anti-IL-33 antitela za primer (H4H9675P i H4H9659P) ili izotipskog kontrolnog antitela, opsega od 10 nM do 4,6 pM, zajedno sa kontrolom koja nije sadržavala antitelo. Rastvori su pomešani sa fiksnom koncentracijom od 100 pM (finalna koncentracija) humanog IL-33 (R&D Systems, kat.br.3625-IL/CF) ili sa negativnom kontrolom bez IL-33, pre dodavanja u PBMC. Svi uslovi su ispitivani u duplikatu.
[0149] Posle dodavanja humanog IL-33 i antitela ćelijama, ćelije su inkubirane na 37°C tokom 20 minuta da bi se olakšala degranulacija bazofila. Degranulacija je zatim zaustavlјena hlađenjem ploče za ispitivanje na vlažnom ledu tokom 5 minuta. Da bi se omogućila analiza populacije bazofila koja je upotrebljavana za merenje degranulacije, u svaki uzorak je dodato po 20µL svakog (prema uputstvima proizvođača) od anti-HLA-DR-FITC (Beckman Coulter, kat.br. IM0463U), anti-CD123-APC (BD, kat.br. 560087) i anti-CD203c-PE (Beckman Coulter, kat.br. IM3575), pa su uzorci držani na 4°C tokom 20 minuta u mraku. Ćelije su potom centrifugirane, isprane sa DPBS i resuspendovane u 2% formaldehidu (pufer za fiksaciju) na 4°C. Sledećeg dana, fiksirane ćelije su analizirane na BD FACSCanto II uređaju da bi se utvrdili nivoi degranulacije bazofila. Rezultati su sumarno prikazani u Tabelama 9 i 10.
4
Tabela 9: Procenat degranulacije humanih bazofila prouzrokovane izlaganjem humanom IL-33
Tabela 10: Anti-IL-33 antitelo koje blokira degranulaciju humanih bazofila prouzrokovanu sa humanim IL-33
[0150] Kao što je prikazano u Tabeli 9, pri 100 pM, srednja vrednost degranulacije bazofila prouzrokovane sa humanim IL-33 kod dva donora je iznosila 68,8% za donora 655687 i 61,6% za donora 655688,
[0151] Kao što je prikazano u Tabeli 10, jedno anti-IL33 antitelo, H4H9675P, blokiralo je degranulaciju bazofila indukovanu izlaganjem humanom Il-33 u koncentraciji od 100 pM sa IC50vrednošću od 132,9 pM kod donora 655687 i IC50vrednošću od 97,12 pM kod donora 655688. Drugo anti-IL33 antitelo, H4H9659P, blokiralo je degranulaciju bazofila indukovanu izlaganjem humanom Il-33 u koncentraciji od 100 pM sa IC50vrednošću od 578,6 pM kod donora 655687 i IC50vrednošću od 446,5 pM kod donora 655688. Nasuprot navedenom, izotipska kontrola nije blokirala degranulaciju bazofila kod bilo kog od ispitivanih donora.
Primer 8. Inhibicija IFN-gama indukovanog sa IL-33 iz humanih PBMC sa anti-IL-33 antitelima
[0152] Za dalјu karakterizaciju anti-IL-33 antitela, korišćena je analiza zasnovana na primarnim ćelijama, upotrebom mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Analiza upotrebljena u ovom Primeru, zasnivala se na rezultatima koje su objavili Smithgall I saradnici, u International Immunology, 2008, vol.20 (8) str.1019-1030. Za ovu analizu, PBMC su prečišćene iz sveže pune krvi tri različita donora, centrifugiranjem u gradijentu gustine. Ukratko, K2 EDTA puna krv je razblažena dva puta u RPMI 1640, pažlјivo je naslojena preko Ficoll-Paque-a (GE Healthcare, kat. br.17-1440-03), pa je centrifugirana tokom 20 minuta. Interfazni sloj koji je sadržavao PBMC je izdvoje aspiracijom, pa je prebačen u novu epruvetu i dvaput ispran PBS-om. Izolovane PBMC su zasejane u mikrotitar ploče sa 96 mesta okruglog oblika dna, u finalnoj koncentraciji od 5x10<5>ćelija/mL u RPMI 1640 u koji je bilo dodato 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina i 100µg/mL streptomicina. Ćelije su zatim
4
inkubirane sa 50 g/mL humanog IL-12 (hIL-12; R&D Systems, kat. br. 219-IL-025/CF) i sa serijskim razblaženjem humanog IL-33 (hIL-33; R&D Systems, kat. br.3625 -IL-010/CF) samostalno, opsega od 10 nM do 0,64 pM, ili sa 260 pM hIL-33 u kombinaciji sa serijskim razblaženjima antitela od 100 nM do 6,4 pM. Finalna zapremina je iznosila 200µl po bunariću. Svaki uslov je ispitivan u triplikatu. Kada su antitela bila prisutna, dodata su ćelijama nakon 30 minuta prethodne inkubacije sa hIL-33.
[0153] Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2, a zatim su izmereni nivoi IFNγ u supernatantu kulture, ELISA postupkom (R&D Systems, kat. br. DY285). Za ELISA postupak, mikrotitarske ploče sa 96 mesta sa ravnim dnom su obložene antitelom za hvatanje, prema uputstvima proizvođača. Nakon pranja i blokiranja, u ploče je dodato po 100µl nerazblaženog supernatanta kulture, pa su ploče inkubirane tokom 2 sata. Naredna pranja i detekcija su rađeni prema uputstvima proizvođača.
[0154] Humani IL-33, u prisustvu hIL-12, poruzrokovao je oslobađanje IFNγ iz ukupnih humanih PBMC tri različita ispitivana donora, sa EC50vrednostima između 274pM i 39pM, kao što je prikazano u Tabeli 11. Jedanaest anti-IL-33 antitela je ispitano upotrebom PBMC iz donora br. 603486 i br.
603487, dok su 3 anti-IL-33 antitela ispitana sa PBMC iz donora br.603491. Svih 11 anti-IL-33 antitela koja su ispitivana na donorima br. 603486 i br. 603487, blokirala su oslobađanje IFNγ iz humanih PBMC koje je bilo indukovano sa 260pM IL-33, sa IC50vrednostima u opsegu od 175 pM do 22 nM, kao što je prikazano u Tabeli 12. Nijedno od tri IL-33 antitela ispitivana na donoru br. 603491 nije blokiralo oslobađanje IFNγ iz humanih PBMC, indukovano sa 260pM hIL-33, već su prouzrokovala porast u oslobađanju IFNγ sa EC50vrednostima između 56,1pM i 189nM.
Tabela 11: Oslobađanje IFNγ iz humanih PBMC iz tri donora, indukovano sa hIL-33.
Tabela 12: Anti-IL-33 antitela koja blokiraju oslobađanje IFN-γ iz humanih PBMC, indukovano sa IL-33, kod donora br.603486 i br.603487
Tabela 13: Anti-IL-33 antitela koja blokiraju oslobađanje IFN-γ iz humanih PBMC, indukovano sa IL-33, kod donora br.603491.
[0155] Nije predviđeno da područje predmetnog pronalaska bude ograničeno specifičnim primerima izvođenja koji su ovde opisani. Zaista, razne modifikacije pronalaska, pored onih koje su ovde opisane, postaće očigledne stručnjacima iz oblasti tehnike iz prethodno navedenih opisa i pridruženih slika. Predviđeno je da takve modifikacije pripadaju području pridruženih patentnih zahteva.
Primer 9. Unakrsna kompeticija humanog IL-33 – analiza interferometrijom u biološkom sloju
[0156] Kompeticija u vezivanja za panele različitih anti-IL-33 monoklonskih antitela, određena je upotrebom interferometrijske analize u biološkom, neobeleženom sloju, na Octet® HTX biosenzoru (ForteBio, ogranak Pall Life Sciences). Eksperiment je izveđen na 25°C, upotrebom pufera sa 0,01 M HEPES-a pH 7,4; 0,15M NaCl, 0,05% v/v surfaktanta Tween-20 i sa 0,1 mg/ml BSA (HBS-ET kinetički pufer) uz treskanje ploča pri brzini od 1000rpm. Da bi se utvrdilo da li su dva antitela bila sposobna da budu u kompeticiji vezivanja za humani IL-33 jedno sa drugim, upotrebljen je format analize sa prethodnim mešanjem u kome je 100 nM humanog IL-33 (R&D Systems; kat. br. 3625-IL-010/CF) prethodno pomešano sa 500 nM rastvorom različitih anti-IL-33 monoklonskih antitela (naknadno navedenih kao mAb-2) tokom najmanje 2 sata pre početka analize kompeticije vezivanja. Biosenzori tipa Octet obloženi bilo sa anti-mišjim Fc poliklonskim antitelom (Pall ForteBio Corp., kat. br. 18-5088; naknadno naveden kao AMC) ili sa anti-humanim Fc poliklonskim antitelom (Pall ForteBio Corp., kat. br. 18-5060; naknadno naveden kao AHC), najpre su potoplјeni u bunariće koje su sadržavali 20µg/mL pojedinačnih anti-IL-33 monoklonskih antitela, u trajanju od 3 minuta, da bi se “uhvatila” anti-IL-33 monoklonska antitela koja su eksprimirana bilo sa mišjim Fc, ili sa humanim Fc, (naknadno navedena kao mAb-1). Nakon koraka hvatanja, nezauzeto anti-mišje Fc poliklonsko antitelo i anti-humano Fc poliklonsko antitelo na biosenzorima tipa Octet je saturisano njihovim potapanjem tokom 4 minuta u bunariće koji su sadržavali 200µg/mL nespecifičnog monoklonskog
1
antitela sa mišjim Fc ili sa humanim Fc. Konačno, biosenzori tipa Octet su uronjeni na 4 minuta u bunariće u kojima su bili prethodno pomešani uzorci od 100 nM humanog IL-33 i 500 nM mAb-2. Na kraju svakog ciklusa, nekovalentno zaroblјena anti-IL-33 antitela, zajedno sa vezanim prethodno obrazovanim kompleksom humanog IL-33 i mAb-2, uklonjeni su sa biosenzora primenom tri naizmenična uranjanja od 20 sekundi u 10 mM HCI, nakon čega je sledilo potapanje u HBS-ET kinetički pufer. Biosenzori su prani u HBS-ET kinetičkom puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom događaja vezivanja, a odgovor u vezivanju (u nm jedinicama) je beležen na kraju svakog koraka. Tokom analize, od utvrđenog signala za sve događaje vezivanja mAb-2 (duž kolone u matrici unakrsne kompeticije) oduzet je pojedinačan signal vezivanja za pozadinu za dato Ab-2 (gde je mAb-1 = mAb-2, tj. duž je dijagonale matrice) , nakon čega su tako korigovani rezultati u pogledu signala pozadine prikazani na Slici 1. Odgovor mAb-1 vezivanja za prethodno obrazovan kompleks humanog IL-33 i svakog od različitih mAb-2 uzoraka, bio je meren da bi se odredilo kompetitivno/nekompetitivno ponašanje različitih anti-IL-33 monoklonskih antitela jednih sa drugima.
[0157] Kao što je prikazano na Slici 1, svetlo siva polja sa crnim brojkama predstavlјaju odgovor vezivanja u slučaju kompeticije antitela samih sa sobom. Odgovor antitela koja su u kompeticiji jedna sa drugima u oba pravca, nezavisno od redosleda vezivanja, predstavljen je crnim poljima i belim brojkama. Polja naznačena tamno sivo bojom sa crnim brojkama označavaju odgovor anti-IL-33 monoklonskog antitela koje se slabo vezuje za humani IL-33, što rezultuje uočenom jednosmernom unakrsnom kompeticijom. Vrednosti za izotipske kontrole upotrebljene u eksperimentu, predstavlјene su tamno sivim poljima sa belim brojkama. Bela polja sa crnim brojkama ne predstavlјaju kompeticiju između antitela, što ukazuje da svako antitelo karakteriše vezivanje za jasno različit epitop vezivanja.
Primer 10. Unakrsna kompeticija IL-33 majmuna – analiza interferometrijom u biološkom sloju
[0158] Kompeticija u vezivanja za panele različitih anti-IL-33 monoklonskih antitela, određena je upotrebom interferometrijske analize u biološkom, neobeleženom sloju, na Octet® HTX biosenzoru (ForteBio, ogranak Pall Life Sciences). Eksperiment je izveđen na 25°C, upotrebom pufera sa 0,01 M HEPES-a pH 7,4; 0,15M NaCl, 0,05% v/v surfaktanta Tween-20 i sa 0,1 mg/ml BSA (HBS-ET kinetički pufer) uz treskanje ploča pri brzini od 1000rpm. Da bi se utvrdilo da li su dva antitela bila sposobna da budu u kompeticiji vezivanja za IL-33 rekombinantnog majmuna eksprimiran sa C-terminalnim heksahistidinskim tagom (MfIL-33-6His; SEQ ID: 305), približno 0,15 nm vezujućih jedinica MfIL-33-6His je najpre vezano za anti-penta-His antitela kojima su bili obloženi biosenzori tipa Octet (Fortebio Inc, kat. br. 18-5079) potapanjem biosenzora u trajanju od 85 sekundi u bunariće koji su sadržavali
2
2µg/mL MfIL-33-6His. Biosenzori sa zarobljenim antigenima su potom zasićeni sa prvim anti-IL-33 monoklonskim antitelom (naknadno navedenim kao mAb-1), potapanjem u bunariće koji su sadržavali 50µg/mL rastvora mAb-1, tokom 5 minuta. Zatim su biosenzori uronjeni u bunariće koji su sadržavali 50µg/mL rastvora drugog anti-IL-33 monoklonskog antitela (naknadno navedenogm kao mAb-2), tokom 4 minuta. Biosenzori su prani u HBS-ET kinetičkom puferu između svakog koraka eksperimenta. Reakcija vezivanja je praćena tokom eksperimenta u realnom vremenu, pa je zabeležen maksimalan odgovor vezivanja za svaki korak vezivanja. Izmeren je i odgovor vezanja mAb-2 za MfIL-33-6His koji je prethodno obrazovao kompleks sa mAb-1, a utvrđeno je kompetitivno/nekompetitivno ponašanje različitih anti-IL-33 monoklonskih antitela jednih sa drugima.
[0159] Kao što je prikazano na Slici 2, svetlo siva polja sa crnim brojkama (duž dijagonale) predstavlјaju odgovor u slučaju auto-kompeticije (gde je mAb-1 = mAb-2). Odgovor antitela koja su u dvosmernoj kompeticiji, nezavisno od redosleda vezivanja, predstavlјen je crnim poljima i belim brojkama. Bela polja sa crnim brojkama predstavljaju odsustvo kompeticije između antitela, što ukazuje da svako antitelo karakteriše vezivanje za različit epitop vezivanja. Tamno siva polja sa belim brojkaa predstavljaju vrednosti dobijene za izotipsku kontrolu koja je korišćena u eksperimentu.
PRIMER 11. Ispitivanje mAt u in vivo modelu; Model akutne inflamacije pluća indukovan sa HDM da bi se proučila uloga IL-33 u inflamaciji pluća
[0160] Da bi se odredio efekat anti-IL-33 antitela, H4H9675P, u relevantnom in vivo modelu, sprovedena je studija akutne HDM-indukovane upale pluća kod miševa koji su bili homozigotni u ekspresiji humanog IL-33 umesto mišjeg IL-33 (IL-33 HumIn miševi).
[0161] IL-33 HumIn miševima je intranazalno primenjivano bilo 50µg ekstrakta grinja iz kućne prašine (HDM; Greer, kat. br. XPB70D3A2.5), razblaženog u 20µl 1Xfiziološkog rastvora puferisanog fosfatima (PBS) (n=17) ili 20µl 1X PBS-a (n=3), 5 dana u nedelјi tokom 2 nedelјe. Podgrupa miševa izlaganih HDM, supkutano je injecirana sa 25 mg/kg bilo anti-IL-33 antitela, H4H9675, (n=6) ili izotipskog kontrolnog antitela (n=6) počevši od tri dana pre prve primene HDM, nakon čega je sledila primena dva puta nedeljno do kraja izlaganja HDM-u. Svi miševi su žrtvovani 15. dana nakon prve intranazalne primene HDM i izvađena su im pluća. Eksperimentalni protokol primene doza i lečenja za grupe miševa je prikazan u Tabeli 14.
Tabela 14: Eksperimentalni protokol primene doza i lečenja za grupe miševa
Uzorkovanje pluća za analizu citokina:
[0162] Nakon eksangvinacije, kranijalni i srednji režnjevi desnog pluća iz svakog miša su uklonjeni i stavlјeni u epruvete koje su sadržavale rastvor reagensa za ekstrakciju proteina iz tkiva (1x T-PER reagens; Pierce, kat. br.78510) u koji je bio dodat 1X Halt koktel inhibitora proteaza (Pierce, kat. br.
78430). Svi dalјi koraci su izvođeni na ledu. Zapremina T-PER reagensa (koji je sadržavao koktel inhibitora proteaza) je prilagođena svakom uzorku tako da odgovara odnosu tkiva i T-PER od 1:8 (w/v). Uzorci pluća su ručno homogenizovani u epruvetama, upotrebom tučkova za jednokratnu upotrebu (Kimble Chase, kat. br. 749625-0010). Rezultirajući lizati su centrifugirani da bi se istaložio debris. Supernatanti koji su sadržavali solubilne ekstrakte proteina su prebačeni u nove epruvete i čuvani na 4 °C do dalјe analize.
[0163] Ukupan sadržaj proteina u ekstraktima proteina pluća je izmeren upotrebom Bradfordovog postupka. Za postupak, po 10µl razblaženih uzoraka ekstrakata je nanošeno u mikrotitar ploče sa 96 mesta u duplikatima, pa je dodato po 200µl 1x reagensa sa bojom (Biorad, kat. br. 500-0006) i sve izmešano. Serijska razblaženja goveđeg serumskog albumina (Sigma, kat. br. A7979), počevši od 700µg/mL u 1x T-Per reagensu, korišćena su kao standard za određivanje tačne koncentracije proteina u ekstraktima. Nakon inkubacije od 5 minuta na sobnoj temperaturi, merena je apsorpcija na 595nm upotrebom Molecular Devices SpectraMax M5 čitača ploča. Analiza podataka za utvrđivanje ukupnog sadržaja proteina je urađena upotrebom GraphPad Prism™ kompjuterskog programa.
[0164] Koncentracije citokina u proteinskim ekstraktima pluća su izmerene upotrebom mulitpleksnog kompleta za imunoanalize tipa Proinflammatory Panel 1 (miš) (MesoScale Discovery, kat. br. K15048D-2), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, po 50µl/bunariću kalibatora i uzoraka (razblaženih u Razblaživaću 41), dodato je u ploče koje su prethodno bile obložene antitelom za
4
hvatanje, nakon čega su ploče inkubirane na sobnoj temperaturi uz treskanje od 700 o/min, tokom 2 sata. Ploče su zatim isprane 3 puta sa 1x PBS-om koji je sadržavao 0,05% (w/v) Tween-20, nakon čega je sledilo dodavanje 25µl rastvora za detekciju antitela, razblaženog u Razblaživaču 45. Nakon još 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi uz treskanje, ploča je isprana 3 puta, pa je u svaki bunarić dodato po 150µl 2x pufera za očitavanje. Elektrohemiluminescencija je odmah očitana na MSD Spector® instrumentu. Analiza podataka je urađena upotrebom GraphPad Prism™ kompjuterskog programa.
[0165] Koncentracija svakog citokina u ukupnim proteinskim ekstraktima pluća iz svih miševa u svakoj grupi, normalizovana je na ukupan sadržaj proteina u ekstraktima koji je izmeren Bradfordovim postupkom, a vrednosti za svaku grupu su predstavljene kao prosečna količina citokina u pg po mg ukupne količine proteina pluća (pg/mg proteina pluća, ± SD) kao što je prikazano u Tabeli 15.
Uzorkovanje pluća za analizu citokina:
[0166] Nivo citokina IL-4 i IL-5 koji se oslobađaju u plućima IL-33 HumIn miševa koji su primali HDM u trajanju od 2 nedelјe bio je značajno viši nego kod IL-33 HumIn miševa koji su izlagani fiziološkom rastvoru. Nasuprot navedenom, postoja je trend smanjenja nivoa IL-4 i IL-5 u plućima IL-33 HumIn miševa koji su lečeni anti-IL-33 antitelom tokom akutnog izlaganja HDM-u, u poređenju sa IL-33 HumIn miševima kod kojih je HDM primenjen bez lečenja ili sa izotipskom kontrolom.
Tabela 15: Koncentracija citokina u proteinskim ekstraktima pluća
Uzorkovanje pluća za analizu ćelijskih infiltrata u plućima
[0167] Nakon eksangvinacije, uklonjen je kaudalni režanj desnog pluća iz svakog miša, isečen je na kocke veličine od oko 2 do 3 mm, pa je tkivo stavlјeno u epruvetu koja je sadržavala rastvor DNaze koncentracije 20 µg/mL (Roche, kat. br. 10104159001) i 0,7 U/mL Liberaze TH (Roche, kat. br.
05401151001), razblažene u Hank-ovom balansiranom rastvoru soli (HBSS) (Gibco, kat. br. 14025). Rastvor je dalje inkubiran u vodenom kupatilu na 37°C tokom 20 minuta i dalje je vorteksovan na svakih 5 minuta. Reakcija je zaustavlјena dodavanjem etilendiamintetrasirćetne kiseline (Gibco, kat. br. 15575) u finalnoj koncentraciji od 10 mM. Svako plućno tkivo je zatim homogenizovano upotrebom gentleMACS® disocijatora (Miltenyi Biotec, kat. br. 130-095-937), pa je homogenate profiltriran kroz filter sa porama od 70 µm i centrifugiran. Dobijeni talog je resuspendovan u 1 mL 1X puferu za liziranje crvenih krvnih zrnaca (Sigma, kat. br. R7757) da bi se uklonile crvene krvne ćelije. Nakon inkubacije tokom 3 minuta na sobnoj temperaturi, dodato je 3 ml 1x DMEM-a da bi se deaktivirao pufer za liziranje crvenih krvnih ćelija. Ćelijske suspenzije su dalje centrifugirane, a dobijeni talog ćelija je resuspendovan u 5 mL MACS pufera (autoMACS Runfer Buffer; Miltenyi Biotec, kat. br.130-091-221). Resuspendovani uzorci su profiltrirani kroz filter sa porama od 70 µm, pa je po 1x10<6>ćelija po bunariću zasejano u mikrotitar ploče sa 96 mesta i sa V oblikom dna bunarića. Ćelije su ponovo centrifugirane i talog je ispran u 1x PBS-om. Nakon drugog centrifugiranja, ćelijski talog je ponovo resuspendovan u 100µl LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell boje (Life Technologies, kat. br. L34957), razblažene 1:1000 u 1x PBS-u, da bi se utvrdila vijabilnost ćelija nakon inkubiranja tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, uz zaštitu od svetlosti. Nakon još jednog pranja u 1x PBS-u, ćelije su inkubirane u rastvoru MACS pufera koji je sadržavao 10µg/mL prečišćenog pacovskog anti-mišjeg CD16/CD32 Fc bloka (Klon: 2.4G2; BD Biosciences, kat. br.553142) tokom 10 minuta na 4°C. Ćelije su ponovo jednom isprane, pa su inkubirane u odgovarajućoj smeši antitela (opisano u Tabeli 16), razblaženih u MACS puferu, tokom 30 minuta na 4°C, uz zaštitu od svetlosti. Nakon inkubacije antitela, ćelije su isprane dva puta u MACS puferu, resuspendovane u BD citofiks reagensu (BD Biosciences, kat. br. 554655) i dalje inkubirane 15 minuta na 4°C, uz zaštitu od svetlosti. Ćelije su konačno isprane, resuspendovane u MACS puferu i prebačene u BD FACS epruvete (BD Biosciences, kat. br.352235) radi analize eozinofila, urođenih limfoidnih ćelija tipa 2 (ILC2) i limfocita, protočnom citometrijom.
[0168] Aktivirane CD4 T-ćelije su definisane kao ćelije koje su bile žive, CD45<+>, SSC<Lo>, FSC<Lo>, CD3<+>, CD19-, CD4<+>, CD8<->i CD69<+>. Aktivirane B-ćelije su definisane kao ćelije koje su bile žive, CD45<+>, SSC<Lo>, FSC<Lo>, CD3-, CD19<+>i CD69<+>. Eozinofili su definisani kao žive, CD45<+>, GR1-, CD11c<lo>, SiglecF<hi>ćelije. ILC2 ćelije su definisane kao žive, CD45<+>, linija- (linija: CD19, CD3, CD11b, CD11c, F4/80), CD127+, Sca-1<+>, ST2<+>. Podaci za aktivirane CD4 ćelije, izraženi kao učestalost aktiviranih ćelija (CD69<+>) unutar originalne populacije (CD4, ± SD), prikazani su u Tabeli 17.
Tabela 16: Antitela upotrebljena za analizu protočnom citometrijom
Analiza ćelijskih infiltrata u plućima:
[0169] Kao što je prikazano u Tabeli 17, učestalost aktiviranih CD4<+>T-ćelija, eozinofila i ILC2 u plućima IL-33 HumIn miševa koji su primali HDM u trajanju od 2 nedelјe, bila je značajno veća nego kod IL-33 HumIn miševa koji su izlagani 1x PBS-u kao kontroli. Nasuprot navedenom, uočen je trend smanjene učestalosti ovih infiltrata kod IL-33 HumIn miševa kada su lečeni anti-IL-33 antitelom tokom akutnog izlaganja HDM u poređenju sa IL-33 HumIn miševima koji su izlagani HDM bez lečenja ili su tretirani izotipskim kontrolnim antitelom.
[0170] Utvrđen je trend povećanja u učestalosti aktiviranih B-ćelija u plućima IL33 HumIn miševa koji su izlagani HDM tokom dve nedelјe, u poređenju sa IL33 Humin miševima koji su izlagani 1x PBS kontroli. Nakon lečenja sa anti-IL-33 antitelima, uočeno je značajno smanjenje u učestalosti plućnih aktiviranih B-ćelija u plućima IL33 HumIn miševa koji su izlagani HDM, u poređenju sa IL-33 HumIn miševima kod kojih je primenjivan HDM bez lečenja ili koji su tretirani izotipskom kontrolom.
Tabela 17: Učestalost ćelijskih infiltrate u plućima, određena protočnom citometrijom
PRIMER 12: Ispitivanje mAt u in vivo modelu; Model hronične fibroze indukovana sa HDM i teške upale pluća za proučavanje uloge IL-33 u upali pluća
[0171] Da bi se odredio efekat anti-IL-33 antitela, H4H9675P, u relevantnom in vivo modelu, sprovedena je studija hronične fibroze indukovane sa HDM i teške upale pluća na miševima koji su bili homozigotni za ekspresiju humanog IL-33 umesto mišjeg IL-33 (IL-33 HumIn miševi).
[0172] IL-33 HumIn miševima je intranazalno primenjivano bilo 50µg ekstrakta grinja iz kućne prašine (HDM; Greer, kat. br. XPB70D3A2.5), razblaženog u 20µl 1Xfiziološkog rastvora puferisanog fosfatima (PBS) (n=17) ili 20µl 1X PBS-a, 5 dana u nedelјi tokom 12 nedelјe. Drugoj kontrolnoj grupi IL33 HumIn miševa je primenjivano 50µg HDM ekstrakta razblaženog u 20µl 1x PBS-a, 5 dana nedelјno u trajanju od 4 nedelјe, kako bi se procenila ozbiljnost oboljenja na početku lečenja antitelom. Dve grupe miševa izlaganih HDM-u su supkutano injecirane sa 25 mg/kg bilo anti-IL-33 antitela, H4H9675P, ili izotipskog kontrolnog antitela, počevši od 4. nedelje nakon počeka izlaganja HDM-u, a zatim dva puta nedeljeno do kraja HDM izlaganja (8 nedelja lečenja antitelom). Svi miševi su žrtvovani 85. dana studije i prikupljena su im pluća. Eksperimentalni protokol primene doza i lečenja za grupe miševa je prikazan u Tabeli 18.
Tabela 18: Eksperimentalni protokol primene doza i lečenja za grupe miševa
Uzorkovanje pluća za analizu citokina:
[0162] Nakon eksangvinacije, kranijalni i srednji režnjevi desnog pluća iz svakog miša su uklonjeni i stavlјeni u epruvete koje su sadržavale rastvor reagensa za ekstrakciju proteina iz tkiva (1x T-PER reagens; Pierce, kat. br.78510) u koji je bio dodat 1X Halt koktel inhibitora proteaza (Pierce, kat. br.
78430). Svi dalјi koraci su izvođeni na ledu. Zapremina T-PER reagensa (koji je sadržavao koktel inhibitora proteaza) je prilagođena svakom uzorku tako da odgovara odnosu tkiva i T-PER od 1:8 (w/v). Uzorci pluća su ručno homogenizovani u epruvetama, upotrebom tučkova za jednokratnu upotrebu (Kimble Chase, kat. br. 749625-0010). Rezultirajući lizati su centrifugirani da bi se istaložio debris. Supernatanti koji su sadržavali solubilne ekstrakte proteina su prebačeni u nove epruvete i čuvani na 4 °C do dalјe analize.
[0163] Ukupan sadržaj proteina u ekstraktima proteina pluća je izmeren upotrebom Bradfordovog postupka. Za postupak, po 10µl razblaženih uzoraka ekstrakata je nanošeno u mikrotitar ploče sa 96 mesta u duplikatima, pa je dodato po 200µl 1x reagensa sa bojom (Biorad, kat. br. 500-0006) i sve izmešano. Serijska razblaženja goveđeg serumskog albumina (Sigma, kat. br. A7979), počevši od 700µg/mL u 1x T-Per reagensu, korišćena su kao standard za određivanje tačne koncentracije proteina u ekstraktima. Nakon inkubacije od 5 minuta na sobnoj temperaturi, merena je apsorpcija na 595nm upotrebom Molecular Devices SpectraMax M5 čitača ploča. Analiza podataka za utvrđivanje ukupnog sadržaja proteina je urađena upotrebom GraphPad Prism™ kompjuterskog programa.
[0164] Koncentracije citokina u proteinskim ekstraktima pluća su izmerene upotrebom mulitpleksnog kompleta za imunoanalize tipa Proinflammatory Panel 1 (miš) (MesoScale Discovery, kat. br.
K15048D-2), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, po 50µl/bunariću kalibatora i uzoraka (razblaženih u Razblaživaću 41), dodato je u ploče koje su prethodno bile obložene antitelom za hvatanje, nakon čega su ploče inkubirane na sobnoj temperaturi uz treskanje od 700 o/min, tokom 2 sata. Ploče su zatim isprane 3 puta sa 1x PBS-om koji je sadržavao 0,05% (w/v) Tween-20, nakon čega je sledilo dodavanje 25µl rastvora za detekciju antitela, razblaženog u Razblaživaču 45. Nakon još 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi uz treskanje, ploča je isprana 3 puta, pa je u svaki bunarić dodato po 150µl 2x pufera za očitavanje. Elektrohemiluminescencija je odmah očitana na MSD Spector® instrumentu. Analiza podataka je urađena upotrebom GraphPad Prism™ kompjuterskog programa.
[0165] Koncentracija svakog citokina u ukupnim proteinskim ekstraktima pluća iz svih miševa u svakoj grupi, normalizovana je na ukupan sadržaj proteina u ekstraktima koji je izmeren Bradfordovim postupkom, a vrednosti za svaku grupu su predstavljene kao prosečna količina citokina u pg po mg ukupne količine proteina pluća (pg/mg proteina pluća, ± SD) kao što je prikazano u Tabeli 19.
Tabela 19: Koncentracija citokina u proteinskim ekstraktima pluća
Analiza citokina u plućima:
[0177] Nivo citokina IL-4 i IL-5 oslobođenih u plućima IL-33 HumIn miševa koji su primali HDM tokom 4 i 12 nedelјa, bio je značajno viši nego u IL-33 HumIn miševa koji su bili izlagani 1x PBS-u. Nasuprot navedenom, postojao je trend smanjenja nivoa IL-4 i IL-5 u plućima IL-33 HumIn miševa lečenih anti-IL-33 antitelom tokom hroničnog HDM izlaganja u poređenju sa IL-33 HumIn miševima kojima je primenjivan HDM bez lečenja ili tretman sa izotipskom kontrolom.
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Humano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupku lečenja hronične astme kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu, pacijentu, antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji vezuje humani interleukin 33 (IL-33) i sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 274 i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 282.
2. Humano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupku lečenja hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP) kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu, pacijentu, antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji vezuje humani interleukin 33 (IL-33) i sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 274 i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 282.
3. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je HOBP rezultat ili je delimično prouzrokovan primarnim ili sekundarnim izlaganjem dimu cigarete.
4. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu postupak dodatno obuhvata primenu efektivne količine drugog terapijskog agensa korisnog za ublažavanje hronične astme ili HOBP, po izboru gde je drugi terapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAID), kortikosteroida, bronhijalnog dilatatora, antihistaminika, epinefrina, dekongestiva, antagoniste limfopoetina iz strome timusa (TSLP), antagoniste IL-13, antagoniste IL-4, dvosturkog antagoniste IL-4/IL-13, antagoniste IL-5, antagoniste IL-6, antagoniste IL-12/23, antagoniste IL-22, antagoniste IL-25, antagoniste IL-17, antagoniste IL-31, oralnog PDE4 inhibitora i drugog antagoniste IL-33 ili različitog antitela na IL-33.
5. Humano monoklonsko antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentih zahteva od 1 do 4 koje je IgG1 antitelo.
6. Humano monoklonsko antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentih zahteva od 1 do 4 koje je IgG4 antitelo.
RS20200801A 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe RS60503B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361778687P 2013-03-13 2013-03-13
US201361819018P 2013-05-03 2013-05-03
EP14722008.1A EP2970460B1 (en) 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antibodies and uses thereof
PCT/US2014/023930 WO2014164959A2 (en) 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60503B1 true RS60503B1 (sr) 2020-08-31

Family

ID=50678269

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240631A RS65586B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe
RS20200801A RS60503B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240631A RS65586B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-12 Anti-il-33 antitela i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
US (6) US9453072B2 (sr)
EP (3) EP3683235B1 (sr)
JP (2) JP6479755B2 (sr)
KR (1) KR102103159B1 (sr)
CN (1) CN105051063B (sr)
AU (1) AU2014248839B2 (sr)
CA (1) CA2902172C (sr)
CL (2) CL2015002469A1 (sr)
DK (2) DK3683235T3 (sr)
EA (1) EA031745B1 (sr)
ES (2) ES2983609T3 (sr)
FI (1) FI3683235T3 (sr)
HR (2) HRP20240774T1 (sr)
HU (2) HUE067119T2 (sr)
IL (2) IL240354A0 (sr)
JO (1) JO3532B1 (sr)
LT (2) LT2970460T (sr)
MX (2) MX377712B (sr)
MY (3) MY201923A (sr)
PH (1) PH12015501656A1 (sr)
PL (2) PL2970460T3 (sr)
PT (2) PT3683235T (sr)
RS (2) RS65586B1 (sr)
SG (1) SG11201505745WA (sr)
SI (2) SI2970460T1 (sr)
TW (1) TWI633119B (sr)
UY (1) UY35417A (sr)
WO (1) WO2014164959A2 (sr)
ZA (1) ZA201505376B (sr)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG192945A1 (en) 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
US9890218B2 (en) 2011-06-30 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
JP6124800B2 (ja) 2011-11-30 2017-05-10 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
UY34813A (es) 2012-05-18 2013-11-29 Amgen Inc Proteínas de unión a antígeno dirigidas contra el receptor st2
KR102307248B1 (ko) 2012-08-21 2021-10-01 사노피 바이오테크놀로지 Il-4r 길항제의 투여에 의한 천식의 치료 또는 예방 방법
BR112015001955A2 (pt) 2012-08-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd variante de região fc específica de fcgamariib
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CA2904377C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-33 antagonists and uses thereof
JP6598680B2 (ja) 2013-04-02 2019-10-30 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
TWI563003B (en) 2013-12-26 2016-12-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Human anti-il-33 neutralization monoclonal antibody
MX2016009047A (es) * 2014-01-10 2017-04-13 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (il-33).
WO2015164354A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 The Childen's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating cytokine-related disorders
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
MX386297B (es) 2014-09-29 2025-03-18 Univ Duke Moleculas biespecificas que comprenden un brazo orientado a la envoltura vih-1.
US10093730B2 (en) * 2014-11-10 2018-10-09 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
US11708608B2 (en) 2014-11-10 2023-07-25 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for IL-33-mediated disorders
EP4600372A3 (en) 2014-12-19 2025-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
EP3265107B1 (en) * 2015-03-02 2024-10-02 180 Therapeutics LP Method of treating a localized fibrotic disorder using a tnf receptor 2 antagonist
AU2016239331C1 (en) * 2015-03-31 2020-01-30 Medimmune Limited A novel IL33 form, mutated forms of IL33, antibodies, assays and methods of using the same
EP3991848A3 (en) * 2015-04-06 2022-07-20 Meso Scale Technologies, LLC. High throughput system for performing assays using electrochemiluminescence including a consumable shaking apparatus
TWI899515B (zh) 2015-08-04 2025-10-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017062456A2 (en) 2015-10-06 2017-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers related to interleukin-33 (il-33)-mediated diseases and uses thereof
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
AU2017208099A1 (en) * 2016-01-14 2018-08-09 Anaptysbio, Inc. Inhibition of allergic reaction using an IL-33 inhibitor
EP3445783A2 (en) 2016-04-18 2019-02-27 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
MA45294A (fr) * 2016-04-22 2019-02-27 Medimmune Llc Plasticité fonctionnelle d'ilc2, immunité et copd
EA037960B1 (ru) 2016-04-27 2021-06-15 Эббви Инк. Способ лечения эозинофильного эзофагита с применением антитела против il-13
CN109415436A (zh) * 2016-04-27 2019-03-01 辉瑞公司 抗il-33抗体及其组合物、方法及用途
KR102102734B1 (ko) 2016-08-05 2020-04-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
EP3504328A1 (en) 2016-08-24 2019-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
WO2018069500A2 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 Symphogen A/S Anti-lag-3 antibodies and compositions
JOP20190093A1 (ar) 2016-10-28 2019-04-25 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ il-33 واستخداماتها
TWI784988B (zh) * 2016-12-01 2022-12-01 美商再生元醫藥公司 治療發炎症狀的方法
EP3580240A1 (en) 2017-02-10 2019-12-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
CN108456251A (zh) * 2017-02-21 2018-08-28 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
IL314591A (en) 2017-04-13 2024-09-01 Regeneron Pharma Treatment and prevention of inflammatory lung diseases in patients with risk alleles in the genes encoding IL33 and IL1RL1
CN118994394A (zh) 2017-06-12 2024-11-22 蓝鳍生物医药公司 抗-il1rap抗体和抗体药物缀合物
CN110914293B (zh) 2017-07-06 2024-08-13 里珍纳龙药品有限公司 用于制备糖蛋白的细胞培养工艺
CN115920031A (zh) * 2017-08-31 2023-04-07 田边三菱制药株式会社 含有il-33拮抗剂的子宫内膜异位症治疗剂
JP7731196B2 (ja) 2017-11-14 2025-08-29 中外製薬株式会社 抗Ｃ１ｓ抗体および使用方法
CA3084059A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method for characterizing drug product impurities
BR112020013336A2 (pt) 2018-01-31 2020-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. produto farmacêutico proteico, métodos para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, para produção de um anticorpo, e para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, anticorpo, e, sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário.
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
BR112020016172A2 (pt) 2018-02-09 2020-12-15 Genentech, Inc. Métodos de tratamento, métodos para determinar, métodos para selecionar uma terapia, métodos para avaliar uma resposta e monitorar a resposta, kits para identificar um paciente, agentes selecionados, agentes para uso, uso de um agente selecionado e uso de um antagonista
KR20260004591A (ko) 2018-02-28 2026-01-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 바이러스 오염물질을 확인하기 위한 시스템 및 방법
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
IL277264B2 (en) 2018-03-19 2024-03-01 Regeneron Pharma Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
IL277890B2 (en) 2018-04-11 2024-03-01 Regeneron Pharma Methods for quantifying il-33
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
CN112839960B (zh) 2018-08-10 2024-09-06 中外制药株式会社 抗cd137抗原结合分子及其应用
AU2019329686A1 (en) 2018-08-27 2020-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of raman spectroscopy in downstream purification
AU2019333047A1 (en) 2018-08-30 2020-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing protein complexes
US11579150B2 (en) 2019-01-16 2023-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
TW202519263A (zh) 2019-03-21 2025-05-16 美商再生元醫藥公司 含有抗il-33抗體之穩定調配物
KR20220004708A (ko) * 2019-05-01 2022-01-11 사노피 바이오테크놀로지 Il-33 길항제를 투여하여 천식을 치료 또는 예방하는 방법
KR20220007586A (ko) 2019-05-13 2022-01-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 개선된 경쟁적 리간드 결합 검정
CN119798452A (zh) 2019-05-15 2025-04-11 中外制药株式会社 抗原结合分子、药物组合物和方法
BR112022000740A2 (pt) 2019-07-16 2022-07-05 Sanofi Biotechnology Métodos para tratamento ou prevenção de asma por administração de um antagonista de il-4r
CN114667450B (zh) 2019-09-24 2025-05-02 里珍纳龙药品有限公司 用于色谱介质的使用和再生的系统及方法
WO2021064452A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Dasman Diabetes Institute Method for preventing progression to type ii diabetes
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
JP2023501316A (ja) 2019-11-04 2023-01-18 メドイミューン・リミテッド 腎機能障害を治療するための抗ｉｌ－３３治療薬
EP4054711A1 (en) 2019-11-04 2022-09-14 MedImmune Limited Methods of using il-33 antagonists
BR112022009974A2 (pt) 2019-11-25 2022-08-16 Regeneron Pharma Métodos de produção de um polímero ou micropartículas revestidas com polímero, para produzir microesferas poliméricas ou revestidas com polímero e para produzir micropartículas, composição de liberação sustentada, micropartículas, e, composição farmacêutica
JP2023508360A (ja) * 2019-12-23 2023-03-02 サノフィ・バイオテクノロジー Ｉｌ－３３アンタゴニストおよび／またはｉｌ－４ｒアンタゴニストを投与することによりアレルギー性喘息を治療するまたは予防するための方法
CA3165060C (en) 2020-01-21 2023-06-20 Yiming Zhao Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
CN113214395A (zh) * 2020-01-21 2021-08-06 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗st2抗体及其应用
JP7767298B2 (ja) 2020-03-13 2025-11-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗インターロイキン－３３抗体及びその使用
JP2023516497A (ja) 2020-03-13 2023-04-19 メドイミューン・リミテッド Ｉｌ３３にリスクアレルを有する対象を治療するための治療方法
WO2021204707A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Medimmune Limited Treating acute respiratory distress syndrome with il-33 axis binding antagonists
WO2021211414A1 (en) * 2020-04-13 2021-10-21 Maddon Advisors Llc Bispecific antibody compositions and methods for treating covid-19
AU2021270839B2 (en) 2020-05-11 2025-01-02 Medimmune Limited Formulations of anti-IL-33 antibodies
EP4151654A4 (en) * 2020-05-12 2024-11-27 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. St2 antigen binding protein
KR102789102B1 (ko) * 2020-08-18 2025-03-28 성균관대학교산학협력단 Il-33 항체 또는 이의 항원 결합 단편
TW202432837A (zh) 2020-08-31 2024-08-16 美商再生元醫藥公司 用以改良細胞培養效能及減少天冬醯胺序列變異之天冬醯胺饋料策略
CN114249825A (zh) * 2020-09-25 2022-03-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人il-33的抗体、其制备方法和用途
WO2022115588A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
CN116710124A (zh) 2020-12-17 2023-09-05 瑞泽恩制药公司 包封蛋白质的微凝胶的制造
AU2022209730A1 (en) 2021-01-20 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving protein titer in cell culture
BR112023017442A2 (pt) 2021-03-03 2023-09-26 Regeneron Pharma Métodos para identificar regiões em uma proteína e para modificar a viscosidade de uma droga proteica, e, droga proteica
BR112023018665A2 (pt) 2021-03-26 2023-10-03 Regeneron Pharma Métodos e sistemas para desenvolvimento de protocolos de mistura
KR20240015646A (ko) 2021-06-01 2024-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마이크로칩 모세관 전기영동 분석 및 시약
CN113493513B (zh) * 2021-06-30 2022-07-12 深圳大学 抗人il-33中和性自身抗体及其制备方法和应用
CN113603775B (zh) 2021-09-03 2022-05-20 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人白介素-33单克隆抗体及其应用
US20230077710A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HIGH-THROUGHPUT AND MASS-SPECTROMETRY-BASED METHOD FOR QUANTITATING ANTIBODIES AND OTHER Fc-CONTAINING PROTEINS
CA3232463A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Philip Mellors Methods of controlling antibody heterogeneity
US20230110811A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. pH METER CALIBRATION AND CORRECTION
IL311245A (en) 2021-10-07 2024-05-01 Regeneron Pharma Systems and methods for pH modeling and control
EP4423018A1 (en) 2021-10-26 2024-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for generating laboratory water and distributing laboratory water at different temperatures
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
PE20242075A1 (es) * 2022-03-03 2024-10-18 Pfizer Anticuerpos multiespecificos y usos de estos
AU2023233590A1 (en) 2022-03-18 2024-10-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for analyzing polypeptide variants
TW202402790A (zh) 2022-03-25 2024-01-16 英商梅迪繆思有限公司 減少呼吸系統感染之方法
JP2025530672A (ja) 2022-08-19 2025-09-17 メディミューン リミテッド Ｉｌ－３３軸アンタゴニストによる処置のために患者を選択する方法
WO2024130048A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
EP4655595A1 (en) 2023-01-25 2025-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
US20240255519A1 (en) 2023-02-01 2024-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asymmetrical flow field-flow fractionation with mass spectrometry for biomacromolecule analysis
WO2024178213A2 (en) 2023-02-22 2024-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System suitability parameters and column aging
US20240366471A1 (en) 2023-05-01 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multidose antibody drug products using phenol or benzyl alcohol
KR102773101B1 (ko) 2023-08-28 2025-02-26 서울대학교산학협력단 세포독성능을 갖는 제2형 선천성 림프구 세포, 이의 제조방법 및 용도
JP7668943B2 (ja) * 2023-08-30 2025-04-25 ファイザー・インク 多重特異性抗体およびその使用
WO2025054406A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
US20250095773A1 (en) 2023-09-18 2025-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
WO2025072597A2 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Lyophilization using controlled nucleation
US20250129117A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
TW202535934A (zh) 2023-11-02 2025-09-16 美商再生元醫藥公司 利用應力來降低脂酶活性的方法
WO2025120567A1 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Medimmune Limited Method of treatment of asthma
TW202535949A (zh) 2023-12-20 2025-09-16 美商必治妥美雅史谷比公司 靶向IL-18受體β(IL-18RB)之抗體及相關方法
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
WO2025194043A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polysorbate and polyoxyethylene sorbitan as excipients for stable protein formulations
TW202540173A (zh) 2024-04-04 2025-10-16 英商梅迪繆思有限公司 治療及選擇對象之方法
WO2025242618A1 (en) 2024-05-20 2025-11-27 Medimmune Limited Bronchiectasis treatment
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US550362A (en) 1895-11-26 crosby
US1000056A (en) 1910-11-03 1911-08-08 Carlos Van Bergh Threshing-machine.
US1001164A (en) 1911-06-09 1911-08-22 Arthur W Porter Cotton-sweep.
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
US5576191A (en) 1994-06-17 1996-11-19 Immunex Corporation Cytokine that binds ST2
US20070042978A1 (en) 2002-12-19 2007-02-22 Jean-Philippe Girard Nf-hev compositions and methods of use
NZ549040A (en) * 2004-02-17 2009-07-31 Schering Corp Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
WO2007140205A2 (en) 2006-05-24 2007-12-06 Biogen Idec Ma Inc. Methods of treating fibrosis
SI2041177T1 (sl) 2006-06-02 2012-03-30 Regeneron Pharma Visoko afinitetna protitelesa za humani IL receptor
US7560530B1 (en) 2006-07-20 2009-07-14 Schering Corporation IL-33 receptor
IE20080331A1 (en) 2007-04-26 2009-07-08 Trinity College Dublin Products for altering cytokine activity and methods therefor
EP2069784A4 (en) 2007-05-18 2009-11-18 Medimmune Llc IL-33 IN INFLAMMATORY DISEASE
EP2211905A1 (en) 2007-10-26 2010-08-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of caspase i-dependent cytokines in the treatment of neurodegenerative disorders
WO2011031600A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Schering Corporation Use of il-33 antagonists to treat fibrotic disease
US9212227B2 (en) 2012-04-30 2015-12-15 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists for the treatment of ST2L-mediated inflammatory pulmonary conditions
UY34813A (es) 2012-05-18 2013-11-29 Amgen Inc Proteínas de unión a antígeno dirigidas contra el receptor st2
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
CA2904377C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-33 antagonists and uses thereof
TWI563003B (en) 2013-12-26 2016-12-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Human anti-il-33 neutralization monoclonal antibody
MX2016009047A (es) 2014-01-10 2017-04-13 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (il-33).

Also Published As

Publication number Publication date
US20210363236A1 (en) 2021-11-25
SI3683235T1 (sl) 2024-07-31
ZA201505376B (en) 2016-07-27
US20160362487A1 (en) 2016-12-15
PT3683235T (pt) 2024-06-24
US20240425580A1 (en) 2024-12-26
HUE051018T2 (hu) 2021-01-28
JO3532B1 (ar) 2020-07-05
IL240354A0 (en) 2015-09-24
HRP20240774T1 (hr) 2024-09-13
US20140271658A1 (en) 2014-09-18
EP2970460B1 (en) 2020-04-29
EP4403570A2 (en) 2024-07-24
IL261743B (en) 2020-11-30
HRP20200846T1 (hr) 2020-08-21
LT3683235T (lt) 2024-06-25
TWI633119B (zh) 2018-08-21
AU2014248839A1 (en) 2015-08-20
WO2014164959A2 (en) 2014-10-09
WO2014164959A3 (en) 2015-02-19
US10000564B2 (en) 2018-06-19
SI2970460T1 (sl) 2020-07-31
PH12015501656B1 (en) 2015-10-19
HUE067119T2 (hu) 2024-10-28
JP6479755B2 (ja) 2019-03-06
MX2020012416A (es) 2021-02-09
US20180251542A1 (en) 2018-09-06
DK2970460T3 (da) 2020-06-02
TW201522370A (zh) 2015-06-16
HK1220467A1 (en) 2017-05-05
EA031745B1 (ru) 2019-02-28
MY174740A (en) 2020-05-13
US11104729B2 (en) 2021-08-31
CN105051063B (zh) 2019-08-16
PL2970460T3 (pl) 2020-10-05
AU2014248839B2 (en) 2019-01-03
DK3683235T3 (da) 2024-07-08
CN105051063A (zh) 2015-11-11
ES2983609T3 (es) 2024-10-23
KR102103159B1 (ko) 2020-05-29
PT2970460T (pt) 2020-06-02
CA2902172C (en) 2024-04-02
EA201591716A1 (ru) 2016-07-29
KR20150126598A (ko) 2015-11-12
EP4403570A3 (en) 2024-10-02
EP3683235A1 (en) 2020-07-22
ES2804592T3 (es) 2021-02-08
MY201923A (en) 2024-03-23
PH12015501656A1 (en) 2015-10-19
US10519230B2 (en) 2019-12-31
EP3683235B1 (en) 2024-05-22
MX377712B (es) 2025-03-11
US9453072B2 (en) 2016-09-27
PL3683235T3 (pl) 2024-08-05
CA2902172A1 (en) 2014-10-09
US20200071396A1 (en) 2020-03-05
RS65586B1 (sr) 2024-06-28
IL261743A (en) 2018-10-31
CL2015002469A1 (es) 2016-06-10
MY209528A (en) 2025-07-17
UY35417A (es) 2014-10-31
MX2015010599A (es) 2015-12-15
JP6845876B2 (ja) 2021-03-24
LT2970460T (lt) 2020-06-10
BR112015020470A2 (pt) 2017-10-10
JP2016513644A (ja) 2016-05-16
FI3683235T3 (fi) 2024-07-02
SG11201505745WA (en) 2015-08-28
JP2019088311A (ja) 2019-06-13
CL2018000101A1 (es) 2018-07-06
US12037388B2 (en) 2024-07-16
NZ710831A (en) 2021-04-30
EP2970460A2 (en) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240425580A1 (en) Anti-IL-33 Antibodies and Uses Thereof
US11542326B2 (en) Anti-IL-25 antibodies and uses thereof
HK40114832A (en) Anti-il-33 antibodies and uses thereof
HK40032431A (en) Anti-il-33 antibodies and uses thereof
HK40032431B (en) Anti-il-33 antibodies and uses thereof
BR112015020470B1 (pt) Anticorpo monoclonal humano isolado anti-il-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, e composição farmacêutica
NZ710831B2 (en) Anti-il-33 antibodies and uses thereof
HK1220467B (en) Anti-il-33 antibodies and uses thereof