RS60259B1 - Izlučivanje polipeptida koji obuhvataju hem - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupke i materijal za proizvodnju polipeptida koji sadrže hem, a preciznije, na proizvodnju polipeptida koji obuhvataju hem u ćelijama rekombinantnih bakterija kao što su Bacillus ćelija ili rekombinantnih biljaka ili ćelija biljaka.

STANJE TEHNIKE

[0002] Postoji neprekidna potreba za postupcima za proizvodnju proteina u većoj razmeri u industrijske i prehrambene svrhe. Bacillus vrste je moguće koristiti u proizvodnji industrijskih enzima kao što su lipaze i proteaze. Pored nekih prehrambenih aditiva kao glukoamilaze, lipaze, i amilaze moguće je proizvesti kod ovih domaćina, obezbeđuju dugu istoriju bezbedne upotrebe u prehrambenoj industriji. Bacillus vrste mogu izlučiti visoke nivoe proteina u podlozi u kojoj se nalaze bakterije. Vrste biljaka, kao što je Nicotiana tabacum ili Glycine max je takođe moguće koristiti za proizvodnju proteina.

[0003] Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti teški da se izluče kao kofaktor je neophodno umetnuti u polipeptid i ostaju povezani sa polipeptidom u celom postupku izlučivanja u njegovoj nativnoj konfiguraciji. Bacillus vrste mogu koristiti dva različita sistema da se izluče proteini (SEC i TAT). SEC putanja odvija protein dok prolaze kroz membranu ćelije. TAT sistem može da izluči proteine u uvijenom stanju. Međutim, nejasno je da li rekombinantni hemoprotein koji obuhvata nekovalentno vezanu hem grupu može biti izražen, izlučen i uvijen propisno od strane Bacillus sistema, sve dok se to ne uradi uspešno.

[0004] WO98/12913 A1 opisuje genetski inženjering biljaka za pospešenu asimilaciju i korišćenje kiseonika, specifično transgenske biljke su projektovane da bi izrazile proteine globina kao što je hemoglobin, mioglobin i hemoproteini.

KRATAK OPIS

[0005] Ovaj pronalazak se odnosi na stavke kao što je formulisano u patentnim zahtevima

[0006] Ovaj dokument otkriva ćeliju rekombinantne bakterije (npr., Bacillus ćelija kao što je Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, ili Bacillus licheniformis ćelije) koja može da izluči polipeptid koji obuhvata hem. Ćelija obuhvata barem jednu egzogenu nukleinsku kiselinu, egzogena nukleinska kiselina obuhvata prvu i drugu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline kodira signalni peptid i sekvenca druge nukleinske kiseline kodira polipeptid koji obuhvataju hem, pri čemu su prva i druga sekvenca nukleinske kiseline funkcionalno povezane da proizvedu polipeptid fuzije koji obuhvata signalni peptid i polipeptid koji obuhvata hem. Egzogena nukleinska kiselina takođe može da obuhvata treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oznaku kao što je oznaka afiniteta. Ćelija može da izluči polipeptid koji obuhvata hem iz ćelije, i posle izlučivanja, signalni peptid je uklonjen iz polipeptida koji obuhvata hem. Signalni peptid obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline koja ima barem 60% identiteta na signalni peptid iznet u SEK ID BR: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, ili 93. Na primer, signalni peptid može obuhvatiti ili se sastojati od sekvence amino kiseline koja ima identičnost sekvence amino kiseline od najmanje 60% prema sekvenci amino kiseline iznetoj u SEK ID BR:55 ili prema ostacima 1-52 od SEK ID BR:55

[0007] Ovaj dokument takođe karakteriše postupak za proizvodnju polipeptida koji obuhvata hem. Ovaj postupak obuhvata kultivisanje ćelije rekombinantne bakterije (npr., Bacillus ćelija kao što je Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, ili Bacillus licheniformis ćelija) u podlozi kulture pod uslovima koji dozvoljavaju polipeptid koji obuhvata hem da bude izlučen u podlogu kulture, ćelija rekombinantne bakterije obuhvata barem jednu egzogenu nukleinsku kiselinu, egzogenu nukleinsku kiselinu koja obuhvata prvu i drugu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline kodira signalni peptid i druga sekvenca nukleinske kiseline kodira polipeptid koji obuhvata hem, pri čemu prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su funkcionalno povezane da proizvedu polipeptid fuzije koji obuhvata signalni peptid i polipeptid koji obuhvata hem, i pri čemu posle izlučivanja polipeptida fuzije iz ćelije u podlogu kulture, signalni peptid je uklonjen iz polipeptida koji obuhvata hem. Taj postupak još može obuhvatiti oporavljanje polipeptid koji obuhvata hem iz podloge kulture. Signalni peptid obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline koja ima barem 60% identiteta na signalni peptid iznet u SEK ID BR: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, ili 93. Na primer, signalni peptid može obuhvatiti ili se sastojati od sekvence amino kiseline koja ima identičnost sekvence amino kiseline od najmanje 60% prema sekvenci amino kiseline iznetoj u SEK ID BR:55 ili prema ostacima 1-52 od SEK ID BR:55.

[0008] Dodatno, ovaj dokument otkriva rekombinantnu biljku ili ćeliju biljke (biljka ili ćelija biljke Glycine max, Zea mays, Hordeum vulgare, ili Arabidopsis thaliana) koja proizvodi polipeptid koji obuhvata hem. Biljka ili ćelija biljke može obuhvatiti najmanje jednu egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, pri čemu je biljka ili ćelija biljke iz vrsta koje nisu Nicotiana vrsta. Egzogena nukleinska kiselina još može obuhvatiti regulatorni kontrolni element kao što je promoter (npr., promoter specifičan za tkivo kao što je lišće, korenje, stabla, ili semenke). Egzogena nukleinska kiselina takođe može da kodira signalni peptid koji cilja polipeptid koji obuhvata hem na podćelijsku lokaciju kao što je uljno telo (struktura koja obuhvata lipid a nalazi se u ćelijama biljke, vakuola, plastid (itd., hloroplast), ili druga organela.

[0009] Ovaj dokument takođe karakteriše postupak proizvodnje polipeptida koji obuhvata hem izabranog iz grupe koja obuhvata Ieghemoglobin, eritrokruorin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, protoglobin, zarubljeni (nedostatak prve zavojnice) 2/2 globin, HbN, HbO, i Glb3. Ovaj postupak obuhvata rast rekombinantne biljke (npr. Glycine max, Zea mays, Hordeum vulgare, ili Arabidopsis thaliana biljke), rekombinantna biljka obuhvata barem jednu egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, pri čemu je ta biljka iz vrsta koje nisu Nicotiana, i prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem iz tkiva biljke.

[0010] Ovaj dokument još obuhvata vektor koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem; i sekvencu polinukleotida koja kodira signalni peptid, pri čemu taj signalni peptid obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline koja ima identičnost sekvence amino kiseline od najmanje 60% prema signalnom peptidu datom u Tabeli 1. Na primer, signalni peptid može obuhvatiti sekvencu amino kiseline koja ima identičnost sekvence amino kiseline od najmanje 60% prema sekvenci amino kiseline iznetoj u SEK ID BR:55 ili prema ostacima 1-52 od SEK ID BR:55. U nekim slučajevima, signalni peptid obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiseline ostataka 1-52 od SEK ID BR:55. Sekvenca polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem može da bude funkcionalno spojena na promoter.

[0011] Povrh toga, ovaj dokument opisuje supstancu koja obuhvata prečišćeni polipeptid koji obuhvata hem; i rekombinantnu ćeliju Bacillus (npr., Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, ili Bacillus licheniformis ćeliju) ili ćeliju rekombinantne biljke koja nije ćelija biljke Nicotiana (npr., komponenta koja se ne javlja kao prirodan deo rekombinantne Bacillus ćelije ili rekombinantne ćelije biljke). U nekim primerima, polipeptid koji obuhvata hem se ne javlja prirodno u ćeliji domaćinu. Ćelija biljke može biti, na primer, Glycine max ćelija biljke, Zea mays ćelija biljke, ili Arabidopsis thaliana ćelija biljke. Supstanca može obuhvatiti najmanje 1 deo po milijardi pomenute komponente ćelije ili najviše 1% (tež./tež.) komponente ćelije.

[0012] Ovaj dokument takođe obuhvata vektor koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, signalni peptid; i oznaku, pri čemu eksprimovanje sekvence polinukleotida u ćeliji domaćinu proizvodi protein fuzije koji obuhvata polipeptid koji obuhvata hem, signalni peptid, i oznaku (npr., oznaku afiniteta kao što je 6- histidin oznaka ili detektibilna oznaka) i genetski modifikovani organizmi koji obuhvataju takav vektor. Vektor dalje može da obuhvati sekvencu polinukleotida koja kodira barem jedno od: a) linker aminokiseline između sekvence koja kodira oznaku i sekvence koja kodira polipeptid koji obuhvata hem; i b) linker aminokiseline između sekvence koja kodira signalni peptid i sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem.

[0013] Ovaj dokument opisuje postupak za izlučivanje polipeptida koji obuhvata hem iz bakterije (npr., Bacillus ćelija kao što je Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, ili Bacillus licheniformis ćelija) koja obuhvata kultivisanje rekombinantne bakterije pod uslovima koji obuhvataju polipeptid koji obuhvata hem koji treba da bude izlučen iz bakterije, rekombinantna batkerija koja obuhvata egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, signalni peptid, i oznaku.

[0014] Ovaj dokument takođe obuhvata prečišćeni polipeptid fuzije koji obuhvata polipeptid koji obuhvata hem i oznaku. Polipeptid još može da obuhvati linker između oznake i polipeptida koji obuhvata hem. U nekim slučajevima, oznaka može da bude postavljena na C-terminalni kraj polipeptida koji obuhvata hem bilo direktno vezana na C-terminalni kraj ili preko linkera.

[0015] Osim ako nije drugačije navedeno, u svim drugim postupcima, supstancama, rekombinantnim ćelijama bakterija, rekombinantnim biljkama ili ćelijama biljaka, ili vektorima, polipeptid koji obuhvata hem može biti izabran iz grupe koja obuhvata androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, leghemoglobin, eritrokruorin, beta hemoglobin, alfa hemoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, histoglobin, neuroglobin, protoglobin, i zarubljeni globin (npr., zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, ili Glb3). Na primer, polipeptid koji obuhvata hem može imati identičnost sekvence najmanje 60% prema sekvenci aminokiseline iznetu u SEK ID BR: 1-31.

[0016] Ovde je takođe opisan vektor koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, i sekvencu polinukleotida koja kodira signalni peptid. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid je za sekretornu putanju. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid može biti pomenut kao signalni peptid ili signalni peptid izlučivanja. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid usmerava pomenuti polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, u sekretornu putanju. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid obuhvata sekvencu aminokiseline koja ima sličnost najmanje 60% sa signalnim peptidom datim u Tabeli 1. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid obuhvata sekvencu aminokisleine koja ima identičnost najmanje 60% prema PhoD signalnom peptidu (npr., barem oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid je PhoD signalni peptid. U nekim varijantnim rešenjima, sekvenca polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, je funkcionalno povezana na promoter. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata hem je izabran iz grupe koja obuhvata: androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, leghemoglobin, eritrokruorin, beta hemoglobin, alfa hemoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, flavohemoglobin, histoglobin, neuroglobine, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i, Glb3. Ovde je takođe opisan genetski modifikovan organizam koji obuhvata vektor koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, i sekvencu polinukleotida koja kodira signalni peptid. U nekim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan organizam je neka gram pozitivna vrsta bakterija. U nekim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan organizam su Bacillus vrste. U nekim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan organizam je izabran iz grupe koja obuhvata Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, i Bacillus licheniformis. U nekim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan organizam je Nicotiana vrste. U nekim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan organizam su Bacillus tabacum.

[0017] U jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje supstancu koja se ne javlja prirodno koja je zamena za meso, koja obuhvata prečišćeni polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, i komponentu ćelije domaćina koja obuhvata zid ćelije, podćelijsku pregradu (kao što je Goldžijev (Golgi) kompleks, endoplazmni retikulum, ili nucleus), nukleinsku kiselinu, protein, genomsku DNK, i/ili plazma membranu. Polipeptid koji obuhvata hem je globin koji se ne javlja prirodno u pomenutoj ćeliji domaćinu. Ćelija domaćin je izabrana iz grupe koja obuhvata Glycine max ćeliju biljke, Zea mays ćeliju biljke, i Arabidopsis thaliana ćeliju biljke. U nekim izvođenjima, ta supstanca obuhvata najmanje 1 deo po milijardi pomenutog dela ćelije domaćina. U nekim izvođenjima, supstanca obuhvata najviše 1% (tež./tež.tež./tež.) pomenutog dela ćelije domaćina. Polipeptid koji obuhvata hem je izabran iz grupe koja obuhvata: leghemoglobin, eritrokruorin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i, Glb3. U nekim izvođenjima, polipeptid koji obuhvata polipeptid koji obuhvata identičnost sekvence aminokiseline od najmanje 60% prema sekvenci aminokiseline dat u SEK ID BR: 1-17 ili 21-31 (npr., barem oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminokiseline). U nekim izvođenjima, polipeptid koji obuhvata hem obuhvata oznaku, npr., je kovalentno vezan na oznaku, npr., na C ili N-terminalnom kraju. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata polipeptid koji obuhvata hem kao što je opisano ovde. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata barem 0,001% (tež./tež.tež./tež.) od polipeptid koji obuhvata hem. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata najviše 10% (tež./tež.tež./tež.) globina. U nekim izvođenjima, proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata kopiju izabranu iz grupe koja obuhvata: kopiju masnoće, kopiju vezivnog tkiva, i kopiju mišića, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi precizno ponavlja osnovne karakteristike povezane sa kuvanjem i potrošnjom odgovarajućeg proizvoda mesa izvedenog iz životinja. U nekim izvođenjima, polipeptid koji obuhvata hem je izlučen iz pomenute ćelije domaćina.

[0018] Ovaj opis opisuje postupak za prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem, npr., globina, iz ćelije biljke koja obuhvata umetanje polinukleotida koji obuhvata polinukleotid koji kodira polipeptid koji obuhvata hem, npr., globin, u ćeliju biljke, i prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem. U nekim varijantnim rešenjima, polinukleotid još obuhvata sekvencu koja kodira oznaku. U nekim varijantnim rešenjima, ćelija biljke je Nicotiana vrste. U nekim varijantnim rešenjima, ćelija biljke je Nicotiana tabacum. U nekim varijantnim rešenjima, ćelija biljke je Glycine max. U nekim varijantnim rešenjima, ćelija biljke je izabrana iz grupe koja obuhvata Nicotiana tabacum, Glycine max, Zea mays, i Arabidopsis thaliana. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata hem je iabran iz grupe koja obuhvata: androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, leghemoglobin, eritrokruorin, beta hemoglobin, alfa hemoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, flavohemoglobin, histoglobin, neuroglobine, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i, Glb3. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuvhata hem je globin. U nekim varijantnim rešenjima, globin je leghemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, globin je hemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata hem obuhvata sekvencu aminokiseline koja ima identičnost najmanje 60% prema sekvenci aminokiseline datoj na Slici 9 (npr., barem oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). U nekim varijantnim rešenjima, taj postupak još obuhvata kombinovanje polipeptida koji obuhvata hem sa proizvodom u obliku mesa za ishranu ljudi. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata kopiju izabranu iz grupe koja obuhvata: kopiju masnoće, kopiju mišića, i kopiju vezivnog tkiva, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim varijantnim rešenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata najmanje 0,001% (tež./tež.) pomenutog polipeptida koji obuhvata hem, npr., globin. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata najmanje 10% (tež./tež.) od polipeptid koji obuhvata hem. U nekim izvođenjima, proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi precizno ponavlja ključne karakteristike povezane sa kuvanjem i potrošnjom odgovarajućeg proizvoda mesa izvedenog iz životinja.

[0019] Ovde je opisan postupak za prečišćavanje endogenog polipeptida koji obuhvata hem, npr., globin, iz biljke koja obuhvata izmenu nivoa ekspresije endogenog polipeptida koji obuhvata hem u biljci, i prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem iz pomenute biljke. Kod nekih varijantnih rešenja, modifikacija povećava nivoe ekspresije endogenog polipeptida koji obuhvata hem. U nekim varijantnim rešenjima, modifikacija povećava nivoe ekspresije pomenutog endogenog polipeptida koji obuhvata hem u nekom listu, semenu, semenu iz mahune, ili bilo kojoj drugoj kombinaciji. U nekim varijantnim rešenjima, modifikacija obuhvata modifikaciju nivoa ekspresije proteina u putanje za proizvodnju endogenog polipeptida koji obuhvata hem. U nekim varijantnim rešenjima, biljka je Nicotiana vrsta. U nekim varijantnim rešenjima, ćelija biljke je Nicotiana tabacum. Kod nekih varijantnih rešenja, ćelija biljke jeGlycine max. Kod nekih varijantnih rešenja, ćelija biljke je izabrana iz grupe koja obuhvata: Nicotiana tabacum, Glycine max, Zea mays, i Arabidopsis thaliana. Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid koji obuhvata hem je globin izabran iz grupe koja obuhvata: hemoglobin, leghemoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, i, Glb3. U nekim varijantnim rešenjima, globin je leghemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, globin je hemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokisleine koja ima identičnost najmanje 60% prema sekvenci aminiokiseline datoj na Slici 9 (npr., najmanje oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid koji obuhvata hem obuhvata oznaku.

[0020] Ovde je opisan postupak za izlučivanje polipeptida koji obuhvata hem iz bakterije obuhvata ubacivanje polinukleotida koji obuhvata polinukleotid koji kodira polipeptid koji obuhvata hem i signalni peptid u bakteriju, i izlučivanje polipeptida koji obuhvata hem iz pomenute bakterije. Kod nekih varijantnih rešenja, bakterija je Bacillus species. Kod nekih varijantnih rešenja, bakterija je Bacillus subtilis. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata hem je iabran iz grupe koja obuhvata: androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, leghemoglobin, eritrokruorin, beta hemoglobin, alfa hemoglobin, ne-simbiotski hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, histoglobin, neuroglobine, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i, Glb3. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata hem je globin. Kod nekih varijantih rešenja taj globin je leghemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, globin je hemoglobin. Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline koja ima identičnost najmanje 60% prema sekvenci aminiokiseline datoj na Slici 9 (npr., najmanje oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). Kod nekih varijantnih rešenja, signalni peptid je signalni peptid za sekretornu putanju. Kod nekih varijantnih rešenja, signalni peptid usmerava pomenuti polipeptid koji obuhvata hem u sekretornu putanju. U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid obuhvata sekvencu aminokisleine koja ima identičnost oko 60% prema signalnom peptidu datom u Tabeli 1 (npr., barem oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). U nekim varijantnim rešenjima, sekvenca polinukleotida obuhvata signalni peptid koji obuhvata sekvencu aminokisleine koja ima identičnost najmanje 60% prema PhoD signalnom peptidu (npr., barem oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). Kod nekih varijantnih rešenja, sekvenca polinukleotida kodira PhoD signalni peptid. Kod nekih varijantnih rešenja, taj postupak još obuhvata prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem. Kod nekih varijantnih rešenja, postupak još obuhvata kombinovanje pomenutog prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem sa proizvodom u obliku mesa za ishranu ljudi. Kod nekih varijantnih rešenja, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata kopiju masnoće, kopiju mišića, i kopiju vezivnog tkiva, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata najmanje 0,001% (tež./tež.) pomenutog prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata najviše 10% (tež./tež.) pomenutog prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem. U nekim izvođenjima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi precizno ponavlja ključne karakteristike povezane sa kuvanjem i potrošnjom odgovarajućeg proizvoda mesa izvedenog iz životinja.

[0021] Ovde je opisan postupak za prečišćavanje izlučivanje polipeptida koji obuhvata hem iz bakterije koja obuhvata izmenu nivoa eksprimovanja endogenog polipeptida koji obuhvata hem u bakteriji, i prečišćavanje pomenutog polipeptida koji obuhvata hem iz pomenute bakterije. Kod nekih varijantnih rešenja, modifikacija povećava nivoe ekspresije pomenutog endogenog polipeptida koji obuhvata hem. Kod nekih varijantnih rešenja, modifikacija obuhvata modifikaciju nivoa ekspresije proteina u putanji za proizvodnju endogenog polipeptida koji obuhvata hem. Kod nekih varijantnih rešenja, bakterija je Bacillus species. Kod nekih varijantnih rešenja, bakterija je Bacillus subtilis. Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid koji obuhvata hem je izabran iz grupe koja obuhvata hemoglobin, flavohemoglobin, cijanoglobin, Hell’s gate globin I, bakterijski hemoglobin, HbN, i HbO. Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid je hemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokisleine koja ima identičnost najmanje 60% prema sekvenci aminiokiseline datoj na Slici 9 (npr., najmanje oko 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminiokiseline). Kod nekih varijantnih rešenja, polipeptid koji obuhvata hem obuhvata oznaku. Kod nekih varijantnih rešenja, taj postupak još obuhvata prečišćavanje polipeptida koji obuhvata hem. Kod nekih varijantnih rešenja, taj postupak još obuhvata kombinovanje prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem sa proizvodom u obliku mesa za ishranu ljudi. Kod nekih varijantnih rešenja, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi obuhvata kopiju masnoće, kopiju mišića, i kopiju vezivnog tkiva, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0022] Nove karakteristike opisa su iznete sa specifičnošću u priloženim patentnim zahtevima. Bolje razumevanje karakteristika i prednosti ovog pronalaska će biti dobijeno uvidom u sledeći detaljan opis koji iznosi samo ilustrativna izvođenja, u kojima se principi koriste, i priloženim slikama na kojima:

Slika 1 obuhvata tri SDS-PAGE gela proteina posle Ni-NTA afinitetnog prečišćavanja peleta ćelije, pokazuje poređenje dejstva izlučivanja signalnog peptida (PhoD) na citosoličnu ekspresiju Aquifex aeolicus hemoglobina (AaHb). Slika 1A je kontrolni prazni vektor. Slika 1B je bez izlučivanja signalnog peptida i Slika 1C je sa izlučivanjem signalnog peptida.

Slika 2 je grafikon koji prikazuje sadržaj hema u izraženom polipeptidu unutar citosola (AaHb). Linija koja odgovara praznom vektoru je linija unutar najniže vršne vrednosti. Linija koja odgovara polipeptidu bez signalnog peptida je linija sa najvišom vršnom vrednošću. Linija koja odgovara polipeptidu sa PhoD signalnim peptidom je linija sa drugom najvišom vršnom vrednošću.

Slika 3 obuhvata dva SDS-PAGE gela proteina posle Ni-NTA afinitetnog prečišćavanja podloge, i pokazuje poređenje dejstva izlučivanja signalnog peptida (PhoD) na ekspresiju izlučivanja polipeptida (AaHb).

Slika 3A je kontrolni prazni vektor. Slika 3B je sa izlučivanjem signalnog peptida.

Slika 4 je sekvenca polipeptida fuzije koja obuhvata sekvencu mesta razdvajanja proteaze sintetičkog PhoD (tekst masnim slovima) (kurzivom, ASAA) -AaHb (podvučeno)-His6 (dvostruko podvučeno) sequence (SEK ID BR: 94). Predviđeno mesto prepoznavanja signalne peptidaze I (SPI) je prikazano (SEK ID BR:95), sa naznačenim mestom razdvajanja. Sekvenciranje N-terminalnog kraja (SEK ID BR:96) izlučenog polipeptida prisutnog u podlozi posle citosolne ekspresije PhoD-AaHb polipeptida fuzije je ukazalo da je N-terminalni kraj odgovarao N-terminalnom kraju AaHb proteina.

Slika 5 prikazuje sadržaj hema izlučenog polipeptida (posle ekspresije PhoD-AaHb polipeptida fuzije). Linija koja odgovara praznom vektoru je linija sa najnižom vršnom vrednošću. Linija koja odgovara izlučenom polipeptidu posle ekspresije polipeptida fuzije koja je uključila PhoD signalni peptid je linija sa najvišom vršnom vrednošću. Slika 6 ilustruje 1) detektovanje dva polipeptida fuzije data kao primer (PhoD-yjbI i YwbN-yjbI) u peletu ćelije posle ekspresije endogenog polipeptida (yjbI) fuzionisanog na jedan od dva različita signalna peptida (PhoD ili YwbN), i 2) detektovanje podloge polipeptida pokazuje propisno razdvajanje signalnih peptida.

Slika 7 ilustruje 1) detektovanje dva polipeptida fuzije data kao primer (PhoD-LGB2 i PhoD-HGbI) u peletu ćelije posle ekspresije dva heterologna polipeptida (LGB2 i HGbI) spojena na signalni peptid (PhoD) i 2) detektovanje podloge polipeptida, pokazuje propisno razdvajanje signalnog peptida.

Slika 8 ilustruje detektovanje podloge polipeptida (AaHb) posle spajanja sa podskupom izvesnog broja različitih signalnih peptida izlučivanja datih kao primer (PhoD, TipA, WapA, WprA, YmaC, YolA, YuiC, YwbN, AppB, i BglS), ekspresija, i razdvajanje signalnog peptida izlučivanja. Nalepnice ukazuju na signalni peptid izlučivanja koji je spojen na 5’ kraj polipeptida pre razdvajanja.

Slika 9 obuhvata sekvence aminokiseline polipeptida koji obuhvataju hem date kao primer (SEK ID BR: 1-31).

DETALJAN OPIS

Polipeptidi

[0023] Ovaj opis opisuje supstance i postupke za ekspresiju polipeptida u ćeliji domaćina (npr., bakterije i/ili biljke). Polipeptid može da se odnosi na podjedinice ili domene polipeptida. Polipeptid iz ovog opisa može da bude polipeptid koji obuhvata hem. Pojam polipeptid koji obuhvata hem može da se odnosi na sve proteine ili podjedinice proteina koji mogu da kovalentno ili nekovalentno vežu hem deo. Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu da transportuju ili skladište kiseonik. U nekim primerima polipeptid iz ovog opisa može biti globin. Polipeptidi mogu da obuhvate prevoj globina, koji može da obuhvati niz od osam alfa spirala. Polipeptid može obuhvatiti alfa globin i/ili beta globin. Polipeptid može obuhvatiti karakterističnu višu strukturu (npr., "prevoj mioglobina") generalno povezan sa globinima. Polipeptid može biti oligomer. Polipeptidi mogu biti monomeri, dimeri, trimeri, tetrameri, i/ili oligomeri višeg reda. U nekim primerima, polipeptid može biti polipeptid koji obuhvata gvožđe.

[0024] Polipeptid iz ovog opisa može obuhvatiti, ali bez ograničavanja na, androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, leghemoglobine, eritrokruorine, beta hemoglobine, alfa hemoglobine, nesimbiotske hemoglobine, flavohemoglobine, protoglobine, cijanoglobine, citoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijske hemoglobine, mioglobine cilia, histoglobine, neuroglobine, hlorokruorin, eritrokruorin, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, Glb3, i citohrome, ribozomne proteine, aktin, heksokinaze, laktat dehidrogenaze, enzime fruktoza bisfosfat aldolaze, fosfofruktokinaze, enzime trioza fosfat izomeraze, fosfoglicerat kinaze, fosfoglicerat mutaze, enolaze, piruvat kinaze, proteaze, lipaze, amilaze, glikoproteine, lektine, mucine, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, piruvat dekarboksilaze, aktine, faktore elongacije translacije , histone, ribuloza-1,5-bisfosfat karbokislaza oksigenaze (rubisko), ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaza oksigenaza aktivaza (rubisko aktivaza), albumine, glicinine, konglicinine, globuline, viciline, konalbumin, gliadin, glutelin, gluten, glutenin, hordein, prolamin, fazeolin (protein), proteinoplast, sekalin, ekstenzine, triticeae gluten, kolageni, zein, kafirin, avenin, dehidrini, hidrofilini, proteini obilja kasne embiogeneze, prirodno neuvijene proteine, bilo koji protein koji skladišti seme, oleozine, kaloleozine, steroleozine ili druge proteine uljnog tela, protein A vegetativnog skladištenja, protein B vegetativnog skladištenja, 8S globulin skladištenja zlatnog mung pasulja, globulin, globuline graška, i albumine graške. U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog opisa može obuhvatiti ili može biti polipeptid dat na Slici 9. U nekim slučajevima, polipeptid može biti uveden u ćeliju domaćina. Na primer, polipeptid može biti izražen, izlučen, i/ili prečišćen iz bakterija kao što su vrste Bacillus. Polipeptid može biti izražen i/ili prečišćen iz neke biljke.

[0025] Polipeptid dat na Slici 9, može biti izražen, ali ne mora biti pravilno izlučen i/ili uvijen korišćenjem postupaka iz ovog opisa. Polipeptid dat na Slici 9 može biti izražen, ali ne mora biti pravilno lokalizovan u ćeliji korišćenjem postupaka iz ovog opisa. Polipeptid dat na Slici 9, može biti izražen, ali ne mora da zadrži nivoe aktivnosti uporedive sa polipeptidom divljeg tipa. Polipeptid dat na Slici 9 može zadržati najmanje oko 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% nivoa aktivnosti polipeptida divljeg tipa. Polipeptid dat na Slici 9 može zadržati najviše oko 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% nivoa aktivnosti polipeptida divljeg tipa. Polipeptid koji obuhvata najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% identičnosti sekvence aminokisleine prema polipeptidu datom na Slici 9 može biti izražen, ali ne mora da bude propisno izlučen i/ili uvijen korišćenjem postupaka iz ovog opisa. Polipeptid koji obuhvata najviše oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline prema polipeptidu datom na Slici 9 može biti izražen, ali ne mora biti pravilno izlučen i/ili uvijen korišćenjem postupaka iz ovog opisa. Polipeptid koji obuhvata najviše oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline prema polipeptidu datom na Slici 9 može biti izražen, ali ne mora da zadrži aktivnost u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa. Polipeptid koji obuhvata najviše oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% identičnosti sekvence aminokiseline prema polipeptidu datom na Slici 9 može biti izražen, ali može da sadrži manji hem kofaktor u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa.

[0026] U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida kojiu treba izraziti u ćeliji domaćinu može biti sekvenca koja obuhvata najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline u poređenju sa sekvencom endogenog polipeptida, npr., endogenog polipeptida koji obuhvata hem, iz ćelije domaćina. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida kojiu treba izraziti u ćeliji domaćinu može biti sekvenca koja obuhvata najviše oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% identičnosti sekvence aminokiseine u poređenju sa sekvencom endogenog polipeptida iz ćelije domaćina. Na primer, polipeptid može biti sekvenca polipeptida nađen u nekoj životinji, sisaru, kičmenjaku, beskičmenjaku, biljci, gljivi, bakteriji, kvascu, algi, arheji, genetski modifikovanom organizmu kao što je genetski modifikovana bakterija ili kvasac. Sekvenca polipeptida može biti hemijski sintetisana, i/ili sintetisana pomoću in vitro sinteze.

[0027] Sekvenca polipeptida može biti bilo koja sekvenca polipeptida, npr., polipeptid koji obuhvata hem, pronađen u biljkama. Neograničavajući primeri biljaka mogu obuhvatiti zrna, kao što je, kukuruzno zrno, kukuruz, ovas, pirinač, pšenicu, ječam, raž, pšenoraž, etiopskom prosu, semenkama za ulja, uključujući, seme kokosa, seme suncokreta, seme šafrana, morsko zelje, podlanak , slačica, repica, lisnate zelene biljke kao što je, npr., salata, spanać, divlji kupus, raštan, bela keleraba, blitva, listovi slačice, listovi maslačka, blitva, zeleni delovi slačice, zeleno maslačka, brokule, kupus, šećerna trska, drveće, korenski usevi kao što je tapioka, slatki krompir, šargarepa, cvekla, repe, biljke iz porodice mahunarki, kao što je, npr., detelina, grašak, kravlji grašak, engleski grašak, žuti grašak, zeleni grašak, razne vrste bobova kao što je, npr., sojino zrno, poljski bob, lima pasulj, obični pasulj, leblebija, zlatni mungo pasulj, boranija, sočiva, leguminoze, grmlje rogača, spiralne mahune (Prosopis pubescens), rogač, soja, i kikiriki, kokos, grahorica (vicia), štitare (stylosanthes), arahis (iz familije bobova), indigofera (žbunaste mahunarke), akacia, leucaena , guar guma, i mahunarke sesbania. Biljke koje ljudi najčešće ne konzumiraju, uključujući useve za biomasu, uključujući, na primer, travu za seno, trava miscanthus, duvan, Arundo donax, energetska trska, sirak, druge trave, alfalfa, kukuruzna slama, alge, ili druge morske trave. Polipeptidi koje je moguće naći u bilo kom organizmu u carstvu buljaka moguće je koristiti u ovom opisu. U nekim slučajevima, biljka može biti soja. U nekim slučajevima, biljka može biti ječam.

[0028] U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida može biti sekvenca, npr., sekvenca polipeptida koji obuhvata hem, pronađena u metazoi. Na primer, sekvenca polipeptida iz opisa može biti sekvenca polipeptida pronađena kod sisara kao što je krava, svinja, pacov, pas, ili konj. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida potiče iz krave. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida potiče iz svinje. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida može biti sekvenca pronađena u protistima. Na primer, sekvenca polipeptida iz ovog opisa može biti sekvenca polipeptida pronađena u protistima kao što je alga. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptida može biti sekvenca pronađena u arhejama. Na primer, sekvenca polipeptida iz ovog opisa može biti sekvenca polipeptida pronađena u arhejama kao što je halobakterija ili pirokokus. U nekim slučajevima, sekvenca polipeptda može biti sekvenca pronađena u eubakterijama (Eubacteriaceae). Na primer, sekvenca polipeptida iz ovog opisa može biti sekvenca polipeptida pronađena u eubakterijama kao što su Bacillus, Clostridia, ili Escherichia.

[0029] Kako je ovde korišćeno, pojam "protein koji obuhvata hem" obuhvata bilo koji polipeptid koji može kovalentno ili nekovalentno da se veže na hem deo. U nekim izvođenjima, polipeptid koji obuhvata hem je globin i može obuhvatiti prevoj globina, koji obuhvata niz od sedam do devet alfa spirala. Proteini tipa globina mogu biti iz bilo koje klase (npr., klase I, klase II, ili klase III), i u nekim izvođenjima, mogu transportovati ili skladištiti kiseonik. Na primer, polipeptid koji obuhvata hem može biti nesimbioznog tipa iz hemoglobina ili leghemoglobina. Polipeptid koji obuhvata hem može biti monomer, t.j., jedan lanac polipeptida, ili mogu biti dimer, trimer, tetramer, i/ili oligomeri višeg reda. Veku upotrebe oksidiranog Fe<2+>stanja polipeptida koji obuhvata hem može biti slično veku upotrebe bioglobina ili ga može premašiti za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% ili više.

[0030] Neograničavajući primeri polipeptida koji obuhvataju hem mogu obuhvatiti androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, hemoglobin, mioglobin, eritrokruorin, beta hemoglobin, alfa hemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, histoglobin, neuroglobin, hlorokruorin, zarubljeni hemoglobin (npr., HbN, HbO, zarubljeni 2/2 globin, hemoglobin 3 (npr., Glb3)), citohrom, ili peroksidaza.

[0031] Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti iz sisara, (npr., životinje sa farmi kao što su krave, koze, ovce, svinje, vo, ili zečevi), ptice, biljke, alge, gljive (npr., kvaci ili vlaknaste gljive), cilijati, ili bakterije. Na primer, polipeptid koji obuhvata hem može biti iz sisara kao što je životinja sa farme (npr., krava, koza, ovca, svinja, vo, ili zec) ili ptica kao što je ćurka ili pile. Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti iz biljke kao što je Nicotiana tabacum ili Nicotiana sylvestris (duvan); Zea mays (kukuruz), Arabidopsis thaliana, mahunarka kao što je Glycine max (sojino zrno), Cicer arietinum (leblebija ili slani bob), Pisum sativum (grašak) vrste kao što je mladi (baštenski) grašak ili slatki grašak, Phaseolus vulgaris vrste običnih bobova kao što su zeleni bobovi, crni bobovi, beli bobovi, sevrni bobovi, ili šareni bobovi, varijeteti Vigna unguiculata (kravlji grašak), Vigna radiate (zlatni mungo bob), Lupinus albus (bela mahunarka), ili Medicago sativa (alfalfa); Brassica napus (repica); Triticum sps. (pšenica, uključujući bele bobice (koljivo), i speltu); Gossypium hirsutum (pamuk); Oryza sativa (pirinač); Zizania sps. (divlji pirinač); Helianthus annuus (suncokret); Beta vulgaris (šećerna repa); Pennisetum glaucum (biserni proso); Chenopodium sp. (kinoa); Sesamum sp. (susam); Linum usitatissimum (lan); ili Hordeum vulgare (ječam). Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti izolovani iz gljiva kao što su Saccharomyces cerevisiae, Pichiapastoris, Magnaporthe oryzae, Fusarium graminearum, ili Fusarium oxysporum. Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti izolovani iz bakterija kao što je Escherichia coli, Bacillus subtilis, Synechocistis sp., Aquifex aeolicus, Methylacidiphilum infernorum, ili termofilne bakterije kao što jeThermophilus.

[0032] Sekvence i struktura brojnih polipeptida koji obuhvataju hem su poznati. Videti na primer, Reedy, et al., Nucleic Acids Research (Ridi, i saradnici, Istraživanje nukleinskih kiselina), 2008, Vol. 36, Database issue (izdanje baze podataka) D307-D313 i Heme Protein Database (Baze podataka proteina hem) dostupno na svetskoj komunikacionoj mreži (vebu) na adresihttp://hemeprotein.info/heme.php.

[0033] Nesimbiozni hemoglobin može biti iz biljke izabrane iz grupe koja obuhvata sojino zrno, klice sojinog zrna, alfalfu, zlatni lan, crni bob, crnooki grašak, severni, leblebija, zlatni mung bob, kravlji grašak, šareni bob, mladi zeleni (mahuna) grašak, kinoa, susam, suncokret, bele bobice, speltu, ječam, divlji pirinač, ili pirinač.

[0034] Bilo koji od polipeptida koji obuhvataju heme opisanih ovde može imati najmanje 60% (npr., najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100%) identičnost sekvence prema sekvenci amino kiseline iz odgovarajućeg divljeg tipa polipeptida koji obuhvata hem ili njegovih fragmenata koji obuhvataju motiv vezivanja hema. Na primer, polipeptid koji obuhvata hem može imati identičnost sekvence najmanje 60% prema sekvenci aminokiseline datoj na SL: 9, uključujući nesimbiozni hemoglobin kao što je onaj iz Vigna radiata (SEK ID BR:1), Hordeum vulgare (SEK ID BR:5), Zea mays (SEK ID BR: 13), Oryza sativa subsp. japonica (pirinač) (SEK ID BR:14), ili Arabidopsis thaliana (SEK ID BR:15), globin I Hell-ovog prolaza kao što je iz Methylacidiphilum infernorum (SEK ID BR:2), flavohemoprotein kao što je iz Aquifex aeolicus (SEK ID BR:3), leghemoglobin kao što je iz Glycine max (SEK ID BR:4), Pisum sativum (SEK ID BR:16), ili Vigna unguiculata (SEK ID BR:17), peroksidaza zavisna od hema kao što je iz Magnaporthe oryzae, (SEK ID BR:6) ili Fusarium oxysporum (SEK ID BR:7), citohrom c peroksidaze iz Fusarium graminearum (SEK ID BR:8), zarubljeni hemoglobin iz Chlamydomonas moewusii (SEK ID BR:9), Tetrahymena pyriformis (SEK ID BR:10, grupa I zarubljeni), Paramecium caudatum (SEK ID BR:11, grupa I zarubljeni), hemoglobin iz Aspergillus niger (SEK ID BR:12), ili protein mioglobin iz sisara kao što je Bos taurus (SEK ID BR:18) mioglobin, Sus scrofa (SEK ID BR:19) mIoglobin, Equus caballus (SEK ID BR:20) mioglobin, Synechocystis PCC6803 (SEK ID BR:21) zarubljeni hemoglobin, Synechococcus sp. PCC 7335 (SEK ID BR:22) zarubljeni hemoglobin, Nostoc commune (SEK ID BR:23) hemoglobin, Vitreoscilla stercoraria (SEK ID BR:24) hemoglobin, Corynebacterium glutamicum (SEK ID BR:25) hemoglobin, Bacillus subtilis (SEK ID BR:26) zarubljeni hemoglobin, Bacillus megaterium (SEK ID BR:27) zarubljeni hemoglobin, Saccharomyces cerevisiae (SEK ID BR:28) flavohemoglobin, Nicotina tobaccum (SEK ID BR:29) nesimbiozni hemoglobin, Medicago sativa (SEK ID BR:30) nesimbiozni hemoglobin, ili Glycine max (SEK ID BR: 31) nesimbiozni hemoglobin.

[0035] Procenat identičnosti između dve sekvence aminokiseline može biti određen kao u nastavku. Prvo, sekvence aminokiseline su poravnate korišćenjem programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) iz samostalne verzije BLASTZ koja obuhvata BLASTP verziju 2.0.14. Ovu samostalnu verziju BLASTZ moguće je dobiti sa Fish & Richardson veb stranice (npr., www.fr.com/blast/) ili veb stranice Nacionalnog centra za biotehnološke informacije vlade SAD (U.S. government’s National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Uputstva koja objašnjavaju kako koristiti B12seq program moguće je naći u tekstualnoj datoteci readme priloženoj uz BLASTZ. B12seq izvodi poređenje između dve sekvence aminokiseline korišćenjem BLASTP algoritma. Da bi se uporedile dve sekvence aminokiseline, opcije za B12seq su date kao u nastavku: -i je postavljen na datoteku koja obuhvata prvu sekvencu aminokiseline koju treba uporediti (npr., C:\seq1.txt); -j je postavljen na datoteku koja obuhvata drugu sekvencu aminokiseline koju treba uporediti (npr., C:\seq2.txt); -p je postavljen na blastp; -o je postavljen na bilo koji željeni naziv datoteke (npr., C:\output.txt); i sve druge opcije su ostavljene na njihovim zadatim postavkama. Na primer, sledeću naredbu je moguće koristiti da bi se generisala izlazna datoteka koja obuhvata poređenje između dve sekvence aminokiseline: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Ako dve upoređene sekvence dele homologiju, onda će naznačena izlazna datoteka prikazati te regione homologije kao poravnate sekvence. Ako dve upoređene sekvence ne dele homologiju, onda naznačena izlazna datoteka neće prikazati poravnate sekvence. Slične postupke moguće je slediti za sekvence nukleinske kiseline izuzev što se koristi blastn.

[0036] Pošto se poravna, broj poklapanja je određen prebrojavanjem broja pozicija gde je prisutan identični ostatak aminokiseline u obe sekvence. Procenat identičnosti je određen deljenjem broja poklapanja sa punom dužinom sekvence aminokiseline polipeptida po dužini posle čega sledi množenje vrednosti dobijene kao rezultat sa 100. Treba napomenuti da je vrednost identičnosti u procentima zaokružena na najbližu desetinu. Na primer, 78,11, 78,12, 78,13, i 78,14 je zaokruženo nadole na 78,1, dok je 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, i 78.19 zaokruženo nagore na 78,2. Takođe se napominje da će vrednost dužine uvek biti celi broj.

[0037] Razume se da će neke od nukleinskih kiselina moći da kodiraju polipeptid koji ima specifičnu sekvencu aminokiseline. Degeneracija genetičkog koda je dobro poznata u ovoj oblasti, t.j., za brojne aminokiseline, postoji više od jednog tripleta nukleotida koji služi kao kodon za aminokiselinu. Na primer, kodoni u sekvenci kodiranja za dati enzim mogu biti modifikovani tako da se dobije optimalna ekspresija u specifičnim vrstama (npr., bakterije ili gljive), korišćenjem odgovarajućih tablica sklonosti kodona za te vrste.

[0038] Polipeptidi koji obuhvataju hem mogu biti ekstrahovani iz materijala izvora (npr., ekstrahovani iz tkiva životinje, ili biljke, gljiva, algi, ili bakterijske biomase, ili iz kulture supernatanta za izlučene proteine) ili iz kombinacije materijala izvora (npr., više vrsta biljaka). Leghemoglobin je lako dostupan kao nekorišćeni nusproizvod useva mahunarki za opštu upotrebu (npr., sojino zrno, alfalfa, ili grašak). Količina leghemoglobina u korenju ovih useva u Sjedinjenim Američkim Državama premašuje sadržaj mioglobina iz svog crvenog mesa potrošenog u Sjedinjenim Američkim Državama.

[0039] Kod nekih izvođenja, ekstrakti polipeptida koji obuhvataju hem obuhvataju jedan ili više polipeptida koji obuhvataju nehem iz materijala izvora (npr., druga životinja, biljka, gljiva, alga, ili bakterijski proteini) ili iz kombinacije materijala zvora (npr., različita životinja, biljka, gljiva, alga, ili bakterija).

[0040] Polipeptid iz ovog opisa (npr., globin, polipeptid koji obuhvata hem, ili protein koji obuhvata gvožđe), može se pomenuti kao "prečišćeni" polipeptid. Polipeptid iz ovog opisa može biti prečišćen iz drugih komponenata materijala izvora (npr., druga životinja, biljka, gljiva, alga, ili bakterijski proteini). Prečišćeni polipeptid može da se pominje kao polipeptid koji je obogaćen u nekoj supstanci, je manipulisan na neki način da bi se uklonile neželjene krhotine (npr., krhotine ćelije, genomske DNK, i/ili drugi polipepidi), i/ili je uklonjen iz ćelije domaćina u kom je sintetisan (npr., transkribovan/translatiran) (npr., lizom ćelije). "Prečišćeni" polipeptid može biti polipeptid ekstrahovan iz njegove ćelije domaćina. U nekim varijantnim rešenjima, "prečišćeni" polipeptid je najmanje 1% čist, npr., najmanje 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% čist. Proteine je moguće odvojiti na bazi njihove molekularne težine, na primer, ekskluzionom hromatografijom, ultrafiltracijom kroz membrane, ili centrifugiranjem gustine. U nekim slučajevima, proteine je moguće odvojiti na bazi njihovog površinskog naelektrisanja, na primer, izoelektričnim taloženjem, precipitation, anjonizmenjivačkom hromatografijom, ili katjonizmenjivačkm hromatografijom. Proteine je takođe moguće odvojiti na bazi njihove rastvorljivosti, na primer, taloženjem amonijak sulfata, izoelektričnim taloženjem, ekstrakcijm surfaktanata, deterdženata ili rastvarača. Proteine je takođe moguće odvojiti prema njihovom afinitetu u odnosu na drugi molekul, korišćenjem, na primer hromatografije na principu hidrofobnih interakcija, reaktivnih boja, ili hidroksiapatita. Afinitetna hromatografija može takođe da obuhvati upotrebu antitela koja imaju specifični afinitet vezivanja za polipeptid koji obuhvata hem, antitelo na protein, nikl NTA za rekombinantne proteine sa His oznakom, lektine da bi se vezali delovi šećera na glikoprotein, ili druge molekule koji specifično vezuju protein.

Hemoglobin

[0041] Hemoglobin (Hb) može da bude glavni konstituent eritrocita koji može da nosi kiseonik iz pluća kroz telo. Kada je sadržan u crvenim krvnim ćelijama, human Hb može da postoji kao struktura tetramera koju čine dva kiseonikom spojena αβ dimera, svaki ima molekularnu težinu od oko 32 kD. Svaka α i β podjedinica svakog dimera mogu imati lanac proteina i hem molekul. Hemoglobin, ili "Hb" mogu da se odnose na (a) respiratorni pigment koji obuhvata gvožđe koje se nalazi u crvenim ćelijama krvi kičmenjaka koji obuhvata globin sastavljen od četiri podjedinice (tetramer) od kojih je svaki povezan na hem molekul, koji funkcioniše za transport kiseonika do tkiva posle pretvaranja oksigeniziranog oblika u škrgama ili plućima, i koji pomažu kod transporta ugljen dioksida nazad u škrge ili pluća pošto predaju svoj kiseonik. Hemoglobin može da se odnosi na rekombinantno proizveden hemoglobin; αβ-dimere hemoglobina, intermolekularno ili intramolekularno umrežen hemoglobin, kao i modifikovane verzije hemoglobina opisanih u ovom opisu, koje mogu da obuhvate ali ne i da se ograniče na modifikacije koje povećavaju ili smanjuju afinitet hemoglobina prema kiseoniku (npr., kao što je supstituisanje alanina, valina, leucina, ili fenilalanina za histidin na poziciji E7 (npr., poziciji 62 od SEK ID BR: 4). Videti, na primer, Hargrove et al., J. Mol. Biol. (1997) 266, 1032-1042. Svi hemoglobini mogu da vežu hem. Hemoglobin može da bude varijantni hemoglobin. Varijantni hemoglobini mogu da obuhvate mutacije aminokiseline, supstitucije, adicije, i/ili delecije. Varijante hemoglobina mogu obuhvatiti hemoglobin Kanzas, hemoglobin S, hemoglobin C, hemoglobin E, hemoglobin D-Pundžab, hemoglobin O-Arab, hemoglobin G-Filadelfija, hemoglobin Hašaron, hemoglobin Lepore, i hemoglobin M.

Leghemoglobin

[0042] U nekim slučajevima, sekvenca (amino kiseline i/ili nukleinske kiseline) leghemoglobina može biti biljna sekvenca leghemoglobina. Različite vrste mahunarki i njihovi varijeteti, na primer, sojino zrno, zrno boba, Lima pasulj, kravlji grašak, engleski grašak, žuti grašak, lupina, obični pasulj, leblebija, kikiriki, alfalfa, seno grahorice, detelina, Lespedeza i kravlji grašak, obuhvata korenove kvržice koje fiksiraju azot u kojima leghemoglobin može imati ključnu ulogu za kontrolisanje koncentracija kiseonika. Leghemoglobini iz različitih vrsta mogu biti homologni i imati slična svojstva boje. Neke biljne vrste mogu izraziti više izoformi leghemoglobina (na primer zrno soje ima četiri izoforme leghemoglobina). Manje varijacije precizne sekvence aminokiseline mogu modifikovati celokupno naelektrisanje proteina na specifičnoj vrednosti pH i mogu modifikovati preciznu strukturnu konformaciju hem grupe koja obuhvata gvožđe leghemoglobin. U nekim slučajevima, alanin, valin, leucin, ili fenilalanin mogu biti supstituisani za histidin na poziciji 62 SEK ID BR:4). Razlike u strukturnoj konformaciji hem grupe različtiih leghemoglobina mogu uticati na brzine oksidacije i redukcije hem gvožđa. Ove razlike mogu doprineti osobinama koje generišu boju i ukus različitih leghemoglobina.

[0043] U drugim slučajevima, sekvenca (aminokiseline i/ili nukleinske kiseline) polipeptida koji obuhvata hem može biti iz organizma koji nije biljni, kao što su životinje (npr., krava, svinja, pas, pacov, ili konj), riba, arheja, protisti, bakterije, gljive, eubakterije, metazoe, ili kvasac.

Varijante

[0044] Polipeptid iz ovog opisa može biti varijanta (npr., obuhvatiti mutaciju kao što je supstitucija aminokiseline, npr., nekonzervativna ili konzervativna supstitucija aminokiseline, delecija aminokiseline, umetanje aminokiseline, ili neprirodna sekvenca). U nekim slučajevima, varijantni polipeptid može biti varijanta polipeptida datog na Slici 9 (videti, npr., SEK ID BR: 1-31). U nekim slučajevima, varijantni polipeptid može obuhvatiti najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, ili 50 mutacija. U nekim slučajevima, varijantni polipeptid obuhvata namanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, ili 50 ili više mutacija. U nekim slučajevima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, ili 50% te sekvence nekog polipeptida iz ovog opisa se može mutirati. U nekim slučajevima, moguće je mutirati najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, ili 50% te sekvence nekog polipeptida iz ovog opisa . U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog opisa može obuhvatiti najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminokiseline prema polipeptidu koji se prirodno javlja iz ovog opisa. U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog opisa može obuhvatiti najviša oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnost sekvence aminokiseline prema polipeptidu koji se prirodno javlja iz ovog opisa.

[0045] U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog opisa obuhvata neprirodnu sekvencu (npr., oznaku ili nalepnicu). Oznaka može da bude kovalentno vezana na sekvencu polipeptida tog polipeptida. Oznaku je moguće vezati na N-terminalni kraj, ili C-terminalni kraj, ili na interventnu aminokiselinu. Oznaku je moguće umetnuti u sekvencu polipeptida (npr., petlju površine dostupne rastvaraču). Primeri oznaka mogu obuhvatiti, ali ne i ograničiti se na, oznake afiniteta (npr., myc, protein vezivanja maltoze, ili 6xhis, peptide helacije metala kao što su moduli histidin triptofana koji omogućavaju prečišćavanje na imobilisanim metalima, domene proteina A koji omogućavaju prečišćavanje na imobilisanom imunoglobulinu, i domen korišćen u FLAGS nastavku/stistemu prečišćavanja afiniteta), i fluorescentne oznake (npr., zeleni fluorescentni protein).

[0046] Oznaka može biti supstanca koju je moguće detektovati spektroskopski, fotohemijski, biohemijski, imunohemijski, hemijski, ili drugim fizičkim sredstvima. Na primer, oznake pogodne za upotrebu u ovom opisu mogu obuhvatiti biotin, digoksigenin, ili haptene kao i proteine koje je moguće detektovati, fluorescentne boje (npr., fluorescein izotiocijanat, Teksas crvenu, rodamin, i slično), radioznake (npr., 3 H, 125 I, 35 S, 14 C, ili 32 P), boje (npr., aleksa, cy3 cy5), hemijske konjugate (npr., kvantne tačkice), enzimi (npr., ren peroksidaza, alkalin fosfataza i druge koje je moguće koristiti u ELISA), i kolorimetrijske oznake kao što je koloidno zlatno, obojeno staklo ili plastične perlice (npr., polistiren, polipropilen, lateks, itd.).

[0047] Oznaku je moguće detektovati. Na primer, kada je oznaka radioaktivna, sredstva za detekciju mogu obuhvatiti scintilacioni brojač ili fotografski film, kao autoradiografiju. U slučajevima kada je oznaka fluorescentna oznaka, moguće ju je detektovati ekscitacijom fluorohroma sa odgovarajućom talasnom dužinom svetla i detektovanjem fluorescencije dobijene kao rezultat. Fluorescenciju je moguće detektovati vizuelno upotrebom elektronskih detektora kao što su uređaji spojeni na naelektrisanje (CCD) ili fotomultiplikatori i slično. Slično, enzimske oznake je moguće detektovati obezbeđivanjem odgovarajućih supstrata za enzim i detektovanjem proizvoda reakcije dobijenog kao rezultat. Kolorimetrijske ili hemiluminescentne oznake je moguće detektovati jednostavno posmatranjem boje povezane sa tom oznakom.

[0048] U nekim slučajevima, oznaka može biti signalni peptid. Signalni peptid može biti sekvenca peptida obično prisutna na N-terminalnom kraju novosintetisanih sekretornih ili membranskih polipeptida koji usmeravaju polipeptid preko ili u membranu ćelije (membrana plazme u prokariotima ili membrana endoplazmnog retikuluma u eukariotima). Moguće je ukloniti naknadno (npr., proteazom). Specifično signalni peptid može biti sposoban da usmeri polipeptid u sekretornu putanju ćelije. U nekim slučajevima, signalni peptid je signalni peptid sekretorne putanje. U nekim slučajevima, signalni peptid može biti pomenut kao signalni peptid ili signalni peptid izlučivanja.

[0049] Primeri signalnih peptida mogu obuhvatiti, ali ne i ograničiti se na signalne peptide date u Tabeli 1 (SEK ID BR: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, ili 93). Nukleotidi u zagradi u Tabeli 1 mogu ili ne moraju da budu uključeni i samim tim, signalni peptid može ili ne mora da ima ostatke kodirane nukleotidima. Na primer, u nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline data u SEK ID BR:42 ne obuhvata poslednjih 9 nukleotida (t.j., sadržala bi samo nukleotide 1-84 iz SEK ID BR:42) i u skladu sa tim, signalni peptid iznet u SEK ID BR:43 ne obuhvata poslednja tri ostatka (t.j., signalni peptid bi obuhvatao samo aminokiseline 1-28 SEK ID BR:43). Na primer, u nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline data u SEK ID BR:44 ne obuhvata poslednjih 6 nukleotida (t.j., sadržala bi samo nukleotide 1-96 iz SEK ID BR:44) i u skladu sa tim, signalni peptid iznet u SEK ID BR:45 ne obuhvata poslednja dva ostatka (t.j., signalni peptid bi obuhvatao samo aminokiseline 1-32 iz SEK ID BR:45). Na primer, u nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline data u SEK ID BR:54 ne obuhvata poslednjih 12 nukleotida (t.j., sadržala bi samo nukleotide 1-156 iz SEK ID BR:54) i u skladu sa tim, signalni peptid iznet u SEK ID BR:55 ne obuhvata poslednja četiri ostatka (t.j., signalni peptid bi obuhvatao samo aminokiseline 1-52 iz SEK ID BR:55). U nekim slučajevima, signalni peptid može da obuhvati PhoD (npr., SEK ID BR:55 ili ostatke 1-52 SEK ID BR:55). Slično tome, signalni peptidi iz SEK ID BR: 59, 63, 65, 67, 71, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, ili 93 mogu biti bez jedne do četiri aminokiseline C-terminalnog kraja.

[0050] U nekim primerima, signalni peptid može biti signalni peptid iz varijantnog rešenja. Signalni peptid može biti neko od varijantnih rešenja signalnog peptida datog u Tabeli 1 (SEK ID BR: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, ili 93). U nekim primerima, signalni peptid iz varijantog rešenja obuhvata najmanje oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline u odnosu na signalni peptid (npr., signalni peptid dat u Tabeli 1). Na primer, signalni peptid iz varijantnog rešenja može imati najmanje oko 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% identičnosti sekvence u odnosu na signalne peptide date u Tabeli 1. U nekim slučajevima, varijantni signalni peptid može obuhvatiti najviše oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline prema signalnom peptidu (npr., signalnom peptidu datom u Tabeli 1). U nekim slučajevima mesto razdvajanja između signalnog peptida i polipeptid može biti izveden iz signalnog peptida. U nekim slučajevima mesto razdvajanja može biti mesto razdvajanja sintetičke proteaze. Razdvajanje signalnog peptida može kao rezultat imati polipeptid iz ovog opisa obuhvata sve, neke, ili nijedan od signalnog peptida.

Razdvajanje mesta razdvajanja sintetičke proteaze može kao rezultat da ima polipeptid iz ovog opisa obuhvata sve, neke, ili nijedan od mesta razdvajanja sintetiške proteaze.

Protoporfirini

[0051] Polipeptid može da se veže na tetrapirol (npr., protoporfirin). Polipeptid može da se veže na protoporfirin sa njegovim delom vezivanja protoporfirina (npr., domen). Polipeptid može da se veže naprotoporfirin dok se polipeptid se prevodi/uvija. Polipeptid može da se veže na protoporfirin pošto se polipeptid prevede/uvije. Polipeptid može ostati vezan na protoporfirin pošto je podćelijski lokalizovan (npr., lokalizovan na podćelijsku pregradu, izlučen).

[0052] Protoporfirini može obuhvatiti bočne lance uključujući metil grupe, grupe propionske kiseline, i vinil grupe. Pogodne strukture protoporfirina mogu obuhvatiti, ali ne i ograničiti se na, dijododeuteroporfirin, mezoporfirin, metalo-porfirine, i protoporfirin IX. U nekim slučajevima, polipeptid može da unese više od jednog protoporfirina. Polipeptid može da se veže na jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više protoporfirina.

[0053] Protoporfirin može biti protoporfirin IX. Protoporfirin IX (PpIX), feoforbid, u prirodi se javlja kao fotosenzitizer, može biti neposredni prekursor za hem u biosinteznoj putanji hema. Protoporfirin IX se može navoditi kao hem. Hem može obuhvatiti prsten protoporfirina i atom gvožđa, pri čemu je taj atom gvožđa koordinisan elementima tog prstena (npr., atom gvožđa je unutar prstena). U nekim slučajevima protoporfirin može biti hem A, hem B, hem C, hem D, hem I, hem M, hem O ili hem S. U nekim slučajevima, protoporfirin može koordinirati atom koji nije gvožđe (t.j., metaloporfirin). Drugi atomi mogu obuhvatiti na primer, cink, gadolinijum, magnezijum, mangan, kobalt, nikl, kalaj, i bakar.

Vektori i genetički modigikovani organizmi

Eksogene nukleinske kiseline

[0054] Opis objašnjava eksogenu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid iz ovog opisa (npr., polipeptid koji obuhvata hem, globin). Eksogena nukleinska kiselina može da kodira bilo koji od ovde opisanih polipeptida koji obuhvataju hem, npr., polipeptid koji obuhvata heme koji ima najmanje oko 60% identičnosti (npr., najmanje 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% identičnosti) u odnosu na jednu od sekvenci aminokiseline date na Slici 9). Eksogena nukleinska kiselina može biti RNK ili DNK, i može biti jednolančana, dvolančana, i/ili kodonom optimizovana. Eksogena sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid iz ovog opisa može biti transcribovana i/ili prevedena. Pojam "polinukleotid" je ovde moguće koristiti ravnopravno sa "eksogenom nukleinskom kiselinom."

[0055] Pojam "eksogen" kako je ovde korišćen sa pozivom na nukleinsku kiselinu (ili protein) i domaćina se odnosi na nukleinsku kiselinu koja se ne javlja u (i ne može biti dobijena iz) ćelije tog specifičnog tipa kako se nalazi u prirodi ili protein kodiran takvom nukleinskom kiselinom. Dakle, nukleinska kiselina koja se ne javlja prirodno, se smatra eksogenom u odnosu na domaćina jednom kada je u domaćinu. Važno je napomenuti da nukleinske kiseline koje se ne javljaju prirodno mogu da obuhvate sekvence nukleinske kiseline ili fragmente sekvenci nukleinske kiseline koji se nalaze u prirodi su dali nukleinsku kiselinu kao celinu koja ne postoji u prirodi. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji obuhvata cDNK sekvencu unutar vektora ekspresije je nukleinska kiseline koja se ne javlja prirodno, i samim tim je eksogen ćeliji domaćinu pošto se uvede u tu ćeliju domaćinajer molekul nukleinske kiseline kao celina (cDNK plus vektor DNK) ne postoji u prirodi. Dakle, bilo koji vektor, koji autonomno umnožava plazmid, ili virus (npr., retrovirus, adenovirus, ili herpes virus) koji kao celina ne postoji u prirodi se smatra da je nukleinska kiselina koja se ne javlja prirodno. Iz toga sledi da genomski DNK fragmenti proizvedeni PCR ili terapijom restrikcione endonukleaze kao i cDNK se smatraju nukleinskom kiselinom koja se ne javlja prirodno jer oni postoje kao odvojeni molekuli koji se ne nalaze u prirodi. Takođe sledi da bilo koja nukleinska kiselina koja obuhvata regulatorni element (npr., sekvencu promotera i/ili signalnu sekvencu) i sekvenca koja kodira polipeptid koji obuhvata hem (npr., cDNK ili genomsku DNK) u sklopu koji se ne nalazi u prordi je nukleinska kiselina koja se javlja prirodno. Nukleinska kiselina koja se javlja prirodno može biti eksogena na specifičnu ćeliju domaćina (npr., bakterija ili biljka). Na primer, ceo hromozom izolovan iz ćelije biljke x je eksogena nukleinska kiselina u odnosu na ćeliju biljke y pošto se taj hromozom uvede u ćeliju biljke y.

[0056] Nasuprot tome, pojam "endogen" kako je ovde korišćen u vezi sa nukleinskom kiselinom (npr., gen) (ili protein) i domaćin se odnosi na nukleinsku kiselinu (ili protein) koji se ne javlja u (ili može da bude dobijen iz) tog specifičnog domaćina kao što se nalazi u prirodi. Pored toga, ćelija "sa endogenom ekspresijom" nukleinske kiseline (ili proteina) izražava tu nukleinsku kiselinu (ili protein) kao što to radi domaćin istog specifičnog tipa kao što se nalazi u prirodi. Pored toga, domaćin "sa endogenom proizvodnjom" ili koji "endogeno proizvodi" nukleinsku kiselinu, protein, ili drugo jedinjenje proizvodi tu nukleinsku kiselinu, protein, ili jedinjenje kao što to radi domaćin istog specifičnog tipa kao što se nalazi u prirodi.

[0057] Degeneracija genetskog koda može da omogući varijacije sekvence nukleotida, pri čemu i dalje proizvodi polipeptid koji ima identičnu sekvencu aminokiseline kao polipeptid kodiran prirodnom sekvencom polipeptida. Varijacije sekvence polinukleotida moguće je prilagoditi za bilo koji organizam koji je predmet interesovanja. U nekim primerima, polinukleotid koji kodira polipeptid može biti kodon optimizovan za ekspresiju u nekoj bakteriji (npr., gram pozitivnoj bakteriji kao što je B. subtilis). U nekim slučajevima, polinukleotid koji kodira polipeptid može da bude kodon optimizovan za ekspresiju u biljci (npr., N. tabacum).

[0058] Učestalost pojedinačnih sinonimnih kodona za poznate aminokiseline se dosta razlikuje od genoma do genoma kod eukariota i prokariota. Ove razlike u obrascima izbora kodona mogu doprineti nivoima celokupne ekspresije pojedinačnih gena modulisanjem brzina produženja modulacionog peptida.

Bakterijski vektori

[0059] Kao što je ovde opisano, eksogena nukleinska kiselina može obuhvatiti nukleinsku kiselinu koja kodira signalni peptid i nukleinsku kisleinu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem. U nekim slučajevima, eksogena nukleinska kiselina je vektor. Vektor može biti pogodan a ekspresiju prokariota (npr., bakterija).

[0060] Ovde opisani vektori generalno obuhvataju regulatorne kontrolne sekvence, (npr., transkripcione ili translacione sekvence) neophodne za ekspresiju polipeptida. Pogodne regulatorne kontrolne sekvence mogu da obuhvate ali ne i da se ograniče na mesto početka kopijacije, promoter, promoter, regione vezivanja represora, mesta pokretanja transkripcije, mesta vezivanja ribozoma, mesta pokretanja translacije, ili mesta završetka za transkripciju i translaciju.

[0061] U nekim varijantnim rešenjima, taj vektor može obuhvatiti sekvencu polinukleotida koja kodira dva ili više polipeptida (npr., polipeptide koji obuhvataju hem ili enzime putanje biosinteze hema), koji mogu biti prisutni na istom vektoru. U nekim varijantnim rešenjima, kada su prisutni na istom vektroru, polinukleotidi su raspoređeni tako da formiraju operon, (t.j., transkripcija polinukleotida će generisati policistroničnu informacionu RNK). U nekim slučajevima, dva ili više polinukleotida je moguće rasporediti na istom vektoru tako da su funkcionalno povezani na njihov vlastiti promoter.

[0062] Mesto početka kopijacije (generalno se pominje kao ori sekvenca) može dozvoliti kopijaciju vektora u ćeliji domaćinu. Izbor ori može zavisiti od tipa ćelija domaćina koje se koriste. Kada su ćelije domaćini prokarioti, vektor ekspresije može obuhvatiti ori usmerenu autonomnu kopijaciju tog vektora unutar prokariotskih ćelija. Neograničavajući primeri ove klase ori obuhvataju pMBl, pUC, ColE1 kao i druge izvore bakterija.

[0063] Ćelija domaćin može obuhvatiti polinukleotid koji kodira polipeptid iz opisa rekombinantne proizvodnje, pri čemu je taj polipeptid moguće povezati na funkcionalnu signalnu sekvencu (npr., sekvencu koja kodira signalni peptid). Sekvence koje kodiraju signalne peptide mogu obuhvatiti, na primer, one koje su izvedene iz spA, phoA, protein vezivanja riboze, pelB, ompA, ompT, dsbA, torA, torT, i tolT, signalne peptide date u Tabeli 1, ili signalne peptide iz TAT putanje izlučivanja u bakterijama. Takođe su uključene u obim ovog opisa signalne sekvence izvedene iz eukariotskih ćelija koje takođe funkcionišu kao signalne sekvence u prokariotskim ćelijama domaćina.

[0064] Vektori mogu obuhvatiti selektibilni marker kao što je gen koji kodira protein neophodan za opstanak ili rast ćelije domaćina transformisane u tom vektoru. Marker gen može biti nošen na drugoj sekvenci polinukleotida takođe uvedenoj u ćeliju domaćina. Samo one ćelije domaćini u koje je selektibilni gen uveden mogu opstati i/ili rasti pod selektivnim uslovima. Uobičajeni geni selekcije kodiraju protein(e) koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, (npr., ampicillin, kanamicin, neomicin, G418, metotreksat, itd.); (b) dopunjuju auksotropne nedostatke; ili (c) dopremaju ključne nutritijente koji nisu dostupni iz kompleksnih podloga.

[0065] Vektor može obuhvatiti sekvencu polinukleotida koja kodira oznaku. Sekvenca oznake može da bude u okviru na sekvencu kodiranja polipeptida iz ovog opisa, tako da je posle translacije te sekvence, polipeptid iz ovog opisa kovalentno vezan, npr., spojen, na oznaku (npr., jeste protein fuzije). Oznaku je moguće odvojiti od polipeptida iz ovog opisa pomoću linkera, npr., polipeptidnog linkera. Vektor može da obuhvati sekvencu polinukleotida koja kodira linker između sekvence koja kodira oznaku i sekvence koja kodira polipeptid iz ovog opisa.

[0066] Ovde opisane vektore moguće je dobiti korišćenjem rekombinantnih postupaka kloniranja i/ili hemijske sinteze. Tehnike rekombinantnog kloniranja mogu da obuhvate PCR, restrikcionu endonukleazu razgradnje i ligacije. Podatke sekvence, je moguće locirati u javnim ili privatnim bazama podatka, moguće je koristiti da bi se dobio željeni vektor bilo kojim načinima sinteze. Pored toga, korišćenje tehnika restrikcije i ligacije, odgovarajuće sekvence je moguće ekscizovati iz različitih DNK izvora i integrisati u funkcionalni odnos sa eksogenim sekvencama koje treba da budu eksprimovane u skladu sa ovim opisom.

[0067] U nekim slučajevima, vektor može da obuhvati regulatorni element (ovde se takođe pominje kao regulatorni element). Regulatorni element može obuhvatiti, na primer, mesto početka kopijacije, promotere, TATA kutije, promotere, mesta vezivanja ribozoma, regione vezivanja represora, mesta započinjanja transkripcije, mesta završetka transkripcije, nenativne sekvece (npr., oznake) i neprevedene regione. U nekim slučajevima, regulatorni element može biti promoter. Promoter može biti konstruktivan, induktibilni, i/ili specifičan za tkivo. Primeri promotera obuhvataju i konstitutivne promotrere i induktibilne promotere. Prirodni promoter moguće je modifikovati zamenom, supstitucijom, dodavanjem ili eliminacijom jednog ili više nukleotida bez promena njegove funkcije.

[0068] U nekim varijantnim rešenjima, pored sekvence promotera, sekvenca polinukleotida takođe obuhvata region završetka transkripcije nizvodno od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid da bi se dobio efikasan završetak (terminacija). U nekim varijantnim rešenjima, region završetka moguće je dobiti iz istog gena kao sekvencu promotera, dok ga je u drugim varijantnim rešenjima moguće dobiti iz drugog gena.

[0069] U nekim slučajevima, vektor može obuhvatiti sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid iz ovog opisa i neku oznaku. U nekim slučajevima, ta oznaka može biti signalni peptid.

[0070] U nekim varijantnim rešenjima, pošto se dobije željeni oblik polipeptida, sekvence nukleinske kiseline, homologa, njegova varijanta ili fragment, moguće je izvršiti modifikaciju na brojne načine. Pri čemu sekvenca obuhvata nekodirajuće prirubne regione, ti prirubni regioni mogu biti podvrgnuti resekciji, mutagenezi, itd. Dakle, tranzicije, transverzije, brisanja, i umeci mogu biti izvedeni na sekvenci koja se prirodno javlja.

[0071] U nekim specifičnim varijantnim rešenjima, polinukleotid koji kodira polipeptid može obuhvatiti sekvencu kodiranja za najmanje jedan polipeptid (npr., globin), ili njegovu vaijantu(e): (i) u izolaciji; (ii) u kombinaciji sa dodatnim kodirajućim sekvencama; takav protein fuzije ili sekvence kodiranja signalnog peptida, pri čemu je kodirajuća sekvenca; i/ili (iii) u kombinaciji sa nekodirajućim sekvencama, kao što su kontrolni elementi, kao što su elementi promotera ili terminatora ili 5’ i/ili 3’ netranslatirani regioni, delotvorni za ekspresiju kodirajuće sekvence u pogodnom domaćinu.

[0072] U nekim varijantnim rešenjima, polinukleotid koji kodira polipepid, zajedno sa neogovarajućim promoterom i kontrolnim sekvencama, moguće je uvesti u bakterijske ćelije domaćina da bi se omogućilo ćelijama da izraze najmanje jedan polipeptid (npr.g., globin) ili njihove varijante.

[0073] Prirodni ili sintetički fragmenti polinukleotida koji kodiraju polipeptid (npr., polipeptid koji obuhvata hem, globin) mogu biti inkorporirani u vektore, koji su sposobni za uvođenje, i kopijaciju u, bakterijskoj ćeliji. Bilo koji vektor je moguće koristiti dokle god je moguća njegova kopijacija i održivost u ćelijama u koje je uveden. Odgovarajuću DNK sekvencu je moguće umetnuti u plazmid ili vektor bilo kojim pogodnim postupkom. Generalno, DNK sekvenca se umetne u odgovarajuće mesto(a) restrikcije endonukleaze tehnikama rekombinantne molekularne biologije.

[0074] U nekim slučajevima, opis opisuje genetički modifikovan organizam. U nekim slučajevima, genetički modifikovan organizam može obuhvatiti polipeptid iz ovog opisa. Genetički modifikovan organizam može obuhvatiti polinukleotid koji kodira polipeptid koji obuhvata hem.

Vektori biljke

[0075] Ovaj opis opisuje vektore za uvođenje eksogene nukleinske kiseline u postupak prema ovom opisu koji može naći primenu u ekspresiji nukleinske kiseline u ćeliji biljke, specifičnim tkivima biljke kao što je list, koren, seme ili mahuna, ili specifičnoj pregradi ćelije.

[0076] Ćelije transgene biljke i biljke opisane ovde obuhvataju najmanje jednu eksogenu nukleinsku kiselinu. Kao što je ovde opisano, eksogena nukleinska kiselina može obuhvatiti nukleinsku kiselinu koja kodira signalni peptid i nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji obuhvata hem. Biljku ili ćeliju biljke je moguće transformisati tako što se konstrukt integriše u njen genom, t.j., može da bude stabilno transformisan. Stabilno transformisane ćelije obično zadrže uvedenu nukleinsku kiselinu u svaku deobu ćelije. Biljku ili ćeliju biljke je takođe moguće prelazno transformisati tako da se konstrukt ne integriše u njen genom. Prelazno transformisane ćelije obično gube sve ili neki deo uvedenog konstrukta nukleinske kisleine sa svakom deobom ćelije tako da uvedenu nukleinsku kiselinu nije moguće detektovati u ćelijama ćerke posle dovoljnog broja deoba ćelije. I prelazno transformisane i stabilno transformisane transgenske biljke i ćelije biljaka mogu biti korisne u ovde opisanim postupcima.

[0077] Najčešće, Ćelije transgene biljke korišćene u ovde opisanim postupcima čine deo ili sve neke cele biljke. Takve biljke mogu rasti na način pogodan za vrste koje se razmatraju, bilo u komori za rast, plasteniku, ili u polju. Transgene biljke moguće je uzgajati po želji za specifičnu namenu, npr., da bi se uvela rekombinantna nukleinska kiselina u druge linije, da bi se prenela rekombinantna nukleinska kiselina u druge vrste ili proizveo željeni polipeptid. Alternativno, transgenske biljke je moguće vegetativno razmnožavati za one vrste koje su pogodne za takve tehnike. Potomstvo obuhvata potomke specifične biljke ili linije biljke ukoliko potomak nasledi transgen. Potomak instant biljke obuhvata semena formirana na F1, F2, F3, F4, F5, F6 i biljke naknadne generacije, ili semena formirana na BC1, BC2, BC3, i biljke naknadne generacije, ili semena formirana na F1BC1, F1BC2, F1BC3, i biljkama naknadne generacije. Semena proizvedena transgenskom biljkom mogu da se uzgajaju i zatim vegetativno razmnože (ili prenesu i vegetativno razmnože) da bi se dobila semena homozigota za eksogenu nukleinsku kiselinu.

[0078] Ćelije transgene biljke raste u kulturi suspenzije, ili tkivu ili kulturi organa, mogu biti korisne za ekstrakciju polipeptida. Moguće je koristiti tehnike kulture čvrsto i/ili tečnog tkiva. Prilikom upotrebe čvrste podloge, ćelije transgene biljke moguće je staviti direktno na podlogu ili ih je moguće staviti na tankoslojni filter koji se zatim postavi u dodir sa tom podlogom. Prilikom korišćenja tečne podloge, ćelije transgene biljke moguće je staviti na floatacioni uređaj, npr., poroznu membranu koja dovodi u kontakt tečnu podlogu. Čvrsta podloga se obično pravi iz tečne podloge dodavanjem agara. Na primer, čvrsta podloga može da bude Murašige (Murashige) i Skog (Skoog) (MS) podloga koja sadrži agar i pogodnu koncentraciju auksina, npr., 2,4- dihlorofenoksisirćetna kiselina (2,4-D), i pogodna koncentracija citokin, npr., kinetin.

[0079] U nekim varijatnim rešenjima, taj opis opisuje postupak pri čemu Agrobacterium ćelije obuhvataju elemente sekvence koja obuhvata vektor, koji su ključni za održavanje i kopijaciju plazmida u Escherichia coli i/ili Agrobacterium ćelije, i za prenos T-DNK na ćeliju biljke, i još T-DNK region, obuhvata sekvencu kodiranja polipeptida koja je pod kontrolom regulatornih elemenata funkcionalnih u nekoj biljci i, opciono, selektibilni marker gen biljke.

[0080] U bilo kom od postupaka transformacije, vektor može da obuhvati selektibilni marker biljke kao što je selektibilni marker na bazi antibiotika (npr., spektinomicin, kanamicin, streptomicin). Selektibilni marker može biti marker fluorescentnog proteina i/ili kolorimetrijski marker (npr., LacZ). U nekim primerima, selektibilni marker biljke može da obuhvati peptidnu deformilazu. Peptidna deformilaza može da hidrolizuje N-formil grupu na metioninu koji se pokreće. Aktivnost peptidna deformilaze može da bude ključna za održivost ćelije. PA peptidna deformilaza može da potiče iz izvesnog broja gena uključujući DEF1 i DEF2. Biljke koje izražavaju selektibilni marker peptidne deformilaze mogu da budu otporne na inhibitore peptidne deformilaze (npr., aktinonin). Geni selektibilnog markera mogu da budu ekscizovani. Ekscizija može nastati rekombinacijom specifičnom za mesto (npr., Cre, Int rekombinacija), transpozoni (npr., transpozoni Ac/Ds familije), meganukleaze (npr., homing endonukleaze, I-sceI), intrahromozomna homologna rekombinacija, Cas9/CRISPR endonukleaze, i/ili cinkovi prsti. Videti, na primer, donju diskusiju re homologne rekombinacije.

[0081] U nekim slučajevima, prekid specifičan za mesto u genomu biljke se koristi bilo da u velikoj meri pospeši ciljanu homologno-rekombinacijom-zasnovanu mutaciju/zamenu endogenih sekvenci (t.j., da bi se reprogramirao globalni gen) ili da bi se u većoj meri pospešila brzine mutacije ili rekombinacije na specifičnim mestima (npr., promoter gena globina ili promoter gena globina/promoter visoko endospermno izraženog gena da bi se ponovo ciljala ekspresija globina na semenima ili drugim ciljanim tkivima). Prekid specifičan za mesto može nastati pomoću TALENS (faktorom transkripcije biljke izvedenih nukleaza koje koriste jednostavan sistem za projektovanje elemenata DNK prepoznavanja da bi se stvorile sintetisane endonukleaze sa dovoljno visokom specifičnošću da bi se razdvojilo pojedinačno genomsko mesto in vivo) ili Cas9/Crispr sistem.

[0082] U nekim slučajevima, vektor može obuhvatiti jedan ili više od sledećih elemenata nukleinske kiseline: a) prvi element nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira selektibilni marker (npr., koji može da bude funkcionalan u Escherichia coli i/ili Agrobacterium vrstama); b) drugi element nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prvog mesta početka kopijacije koji može biti funkcionalan za Escherichia coli; c) treći element nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira protein inicijator kopijacije; i/ili d) četvrti element nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida drugog mesta početka kopijacije, što može biti drugačije od prvog mesta početka kopijacije i koji je funkcionalan za Agrobacterium, pri čemu su gornji elementi nukleinske kiseline dati na kružnom molekulu polinukleotida i odvojeni su izbrisanim sekvencama nukleotida koje nemaju funkciju za kopijaciju, održavanje ili prenos nukleinske kiseline, i pri čemu pomenute izbrisane sekvence nukleotida čine manje od 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 45% ukupne veličine vektora.

[0083] Ovaj opis opisuje postupak, pri čemu regulatorne sekvence funkcionalne za biljku ili ćeliju biljke obuhvataju promoter koji može da pogoni i/ili kontroliše ekspresiju gena koji je predmet interesovanja. Pogodni promoteri mogu obuhvatiti mirabilis mozaičkog virusa (MMV), mozaičkog virusa biljke smokve (FMV) ili promotera hlornih brazda kikirikija (PCLSV). Drugi primeri pogodnih promotera mogu obuhvatiti 35S promoter mozaičkog virusa karfiola, 35S promoterpromoter modifikovanog mozaičkog virusa karfiola, dvostruki 35S promoter mozaičkog virusa karfiola, minimalni 35 S promoter, promoter sintaze nopalina, promoter mozaičkog virusa kravljeg graška, HT-CPMV promoter, CPS2p promoter sintaze kopalila duvana, promoter dihidrina, promoter plastocijanina, 35S/HT-CPMV promoter, promoteri transkriptora pune dužine (FLt), promoteri podgenomskog transkripta, i brojni drugi promoteri koji su izvedeni iz DNK virusa koji pripadaju familiji Caulimoviridae virusa.

[0084] Brojne takve promotere je moguće modifikovati povezivanjem više kopija, na primer dve kopije, njihove sekvence promotera u tandemu da bi se pospešila aktivnost promotera, kao što je ali bez ograničenja na dvostruki CaMV 35S promoter (35Sx2), dvostruki MMV promoter (MMVx2), ili dvostruki FMV promoter (FMVx2). Funkcionalne fragmente ovih promotera moguće je koristiti u vektoru iz ovog opisa. Sekvence nukleotida koje su najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične nukleotidnim sekvencama ovih sekvenci promotera i koje su funkcionalne u omogućavanju ekspresije u biljkama funkcionalno povezane sekvence nukleotida moguće je koristiti takođe u vektorima iz ovog opisa.

[0085] Vektori ekspresije biljke koji mogu biti funkcionalni u ćeliji biljke i mogu biti korišćeni unutar postupka iz ovog opisa da bi pogonio i/ili kontroliše ekspresiju gena interesa u biljci može takođe da obuhvati, ako želi, regulatorni region promotera (na primer, jedan koji daje induktibilnu ili konstitutivnu, ekološku ili razvojnu regulisanu, ili za ćeliju specifičnu ili za tkivo specifičnu ekspresiju), mesto početka pokretanja transkripcije, mesto vezivanja ribozoma, procesni signal RNK, mesto završetka transkripcije, i/ili signal poliadenilacije. Regulatorni elementi koje treba koristiti unutar postupaka opisa mogu biti prisutni u molekulu vektora (npr., binarni vektor) funkcionalno povezan na sekvencu nukleotida koja kodira sekvencu nukleotida polipeptid iz ovog opisa. U nekim slučajevima, regulatorni element može biti prisutan u T-DNK regionu binarnog vektora (npr., minimalno dimenzioniran binarni vektor).

[0086] U nekim primerima, ekspresija gena koji kontrolišu promotere to rade na način koji je uslovljen tkivom i u skladu sa stadijumom razvoja biljke. Sekvence transgena opisa pogonjene ovim tipom promotera mogu biti izražene u tkivima pri čemu je poželjan transgeni proizvod, ostavljajući ostatak tkiva u biljci nemodifikovano transgenskom ekspresijom. Promoteri specifični za tkiva mogu uvedeni endogenim ili eksogenim činiocima. Primeri specifični za tkiva mogu da obuhvate ali bez ograničenja na promotere gena beta amilaze ili promotere gena horteina u ječmu (za ekspresiju gena semena), promotere gena paradajza pz7 i pz130 (za ekspresiju gena jajnika), promoter gena RD2 duvana (za ekspresiju gena korena), promoter TRX banane i promoter aktina dinje (za ekspresiju gena voća). U nekim varijantnim rešenjima, promoteri specifični za tkivo mogu biti izabrani da ciljaju ekspresiju polipeptida na glomazne i lako ubirive delove biljke kao što su semenke, voćke, krtole i listovi.

[0087] Vektori ekspresije biljke mogu još da obuhvataju sekvencu nukleotida koja kodira signalni peptid koji može da cilja novoizraženi protein na podćelijskoj lokaciji. Signalni peptidi koje je moguće koristiti unutar takvih molekula vektora mogu da budu, na primer, sekvenca ciljanja vakuola, sekvenca ciljanja hloroplasta, sekvenca ciljanja mitohondrija, sekvenca koja indukuje formiranje tela proteina u ćeliji biljke, sekvenca koja indukuje specifično ciljanje proteina spojenog na specifičnu organelu unutar biljke ili ćelije biljke, ili sekvenca koja indukuje formiranje uljnih tela u ćeliji biljke.

[0088] U nekim primerima, ciljajuća sekvenca može biti signalni peptid za eksport proteina u vanćelijski prostor. Signalni peptidi mogu biti tranzitni peptidi koji su smešteni na krajnjem N-terminalnom kraju proteina i razdvojeni kotranslaciono tokom translokacije preko plazma membrane.

[0089] U nekim varijantnim rešenjima, signalni peptid može biti sekvenca koja kada se spoji na protein daje kao rezultat formiranje nesekretornih skladišnih organela za endoplazmni retikulum.

[0090] Endogene nukleinske kiseline moguće je modifikovati tehnikama homologne rekombinacije. Na primer, endonukleaze specifične za sekvencu (npr., nukleaze cinkovog prsta (ZFNs)) i meganukleaze moguće je koristiti da bi se stimulisala homologna rekombinacija na endogenim genima biljke. Vidti, npr., Townsend et al., Nature 459:442-445 (2009); Tovkach et al., Plant J., 57:747-75725 (2009); and Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2232-2237 (2005). CRISPR Cas (Xie and Yang, Mol. Plant 2013, 6:1975-1983) i TALEN (Zhang et al., Plant Physiology 2013161:20-27) tehnike uređivanja genoma takođe je moguće koristiti da bi se zamenila endogena nukleinska kiselina.

[0091] U nekim varijantnim rešenjima, vektor može dodatno da obuhvata T-DNK region mesto rekombinacije specifično za neku lokaciju za rekombinaciju specifičnu za mesto. U nekim varijantnim rešenjima, mesto rekombinacije specifično za lokaciju moguće je locirati nizvodno od regulatornog elementa biljke. U nekim varijantnim rešenjima, mesto rekombinacije specifično za lokaciju moguće je locirati uzvodno od regulatornog elementa biljke. U nekim varijantnim rešenjima, mesto rekombinacije može biti LoxP mesto i deo Cre-Lox sistema rekombinacije specifične za mesto. Sistem rekombinacije specifičan za mesto Cre-Lox može da koristi cikličnu rekombinazu (Cre), koja može da katalizuje rekombinaciju između specifičnih mesta (LoxP) koja obuhvataju specifična mesta vezivanja za Cre.

[0092] U nekim varijantnim rešenjima, mesto rekombinacije može da bude Gateway mesto odredišta. Na primer, polinukleotidi mogu biti klonirani u komercijalno dostupan "ulazni vektor" i naknadno rekombinovani u "vektor odredišta". Vektor odredišta je moguće koristiti za analizu aktivnosti promotera date sekvence nukleinske kiseline ili broja sekvenci, za analizu funkcije, za lokalizaciju proteina, za interakciju protein-protein, za utišavanje datog gena ili za eksperimente afinitetnog prečišćavanja. Gateway tehnologiju kloniranja je moguće kupiti iz Invitrogen Inc., USA.

[0093] U nekim varijantnim rešenjima, ciljane lezije se stvaraju homolognom rekombinacijom ili drugim tehnikama uređivanja gena u blizini endogene nukleinske kiseline koja kodira hemoprotein ili globin i u blizini željenih specifičnih promotera tkiva i mutanata se pregledaju za ekspresiju željenog endogenog hemoproteina ili globina u tkivima koja su obilna, i kojima se može pristupiti. U nekim varijantnim rešenjima, ciljane lezije su stvorene u blizini željenih specifičnih promotera tkiva i mutanata se pregledaju za ekspresiju željenog endogenog hemoproteina ili globina u tkivima koja su obilna, i kojima se može pristupiti. Primeri postupaka za stvaranje ovih ciljanih lezija obuhvataju ali se ne ograničavaju na TALENS i cas9/crispr sistem kao što je razmatrano gore u tekstu.

[0094] U nekim varijantnim rešenjima, biljke dobijene kao rezultat mogu da obuhvataju više ciljnog proteina nego originalna biljka. Na primer biljka dobijena kao rezultat može da izrazi više od 2X nivoa ciljnog prirodnog proteina u poređenju sa originalnom biljkom. U nekim varijantnim rešenjima biljka dobijena kao rezultat može da izrazi prirodni ciljani protein u nekom tkivu, kao što je seme ili list, u kom se uobičajeno ne nalazi. Prirodni ciljni protein može da bude izražen u tkivu u kom se normalno ne nalazi i to 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 6-struko, 7-struko, 8-struko, 9-struko, 10-struko ili više ili niže na nivoima prirodnog ciljanog proteina u tom tkivu u kom se uobičajeno nalazi. U nekim varijantnim rešenjima ciljni protein je hemoglobin kao što je leghemoglobin Glycine max (npr., SEK ID BR:4) ili nesimbiozni hemoglobin ječma (SEK ID BR:5) proizveden u genetski modifikovanim biljkama soje ili ječma, prema opisanom redosledu.

[0095] U nekim varijantnim rešenjima biljka dobijena kao rezultat ne obuhvata stranu DNK. U nekim slučajevima, lezije u blizini endogenog polipetida iz ovog opisa i/ili promotera specifičnih za tkivo mogu biti korišćene za genetičko modifikovanje ekspresije polipeptida iz ovog opisa. Postupci za procenu ovog tipa genetičkog modifikovanja mogu da obuhvate pregledanje za proizvdonju endogenog polipeptida.

Postupci ekspresije u bakterijama

[0096] Ovaj opis opisuje postupke za ekspresiju polipeptida (npr., globin) u ćeliji domaćinu (npr., bakteriji). Pogodne bakterije za ekspresiju polipeptida iz ovog opisa mogu biti gram negativne ili gram pozitivne bakterije. Na primer, bakterija mogu biti vrste Escherichia (npr., E. coli) ili vrsta Bacillus (e.g., B. subtilis, B. licheni- formis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, ili B. thuringiensis). U nekim slučajevima, bakterije pogodne za ekspresiju polipeptida iz ovog opisa mogu biti B. subtilis.

[0097] U nekim slučajevima, ekspresija polipeptida može obuhvatiti uvođenje vektora koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira polipeptid u ćeliju domaćina, i indukovanje ekspresije polipeptida.

[0098] U nekim varijantnim rešenjima, postupci iz ovog opisa opisuju ćeliju domaćina koja obuhvata stabilno integrisanu sekvencu koja je predmet interesovanja (t.j., nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid). Međutim, u alternativnim primerima, postupci iz ovog opisa opisuju održavanje samokopijujućeg ekstrahromozomnog vektora transformacije.

[0099] Postupci uvođenja polinukleotida u ćelije za ekspresiju sekvence polinukleotida mogu obuhvatiti, ali bez ograničenja na elektroporaciju, transformaciju, transdukciju, bombardovanje velikom brzinom sa DNK obloženim mikroprojektilima, infekcija sa modifikovanim virusnim (npr., fag) nukleinske kiseline; hemijski posredovanom transformacijom, ili kompetentnošću. U nekim slučajevima, polinukleotidi koji kodiraju polipeptid iz ovog opisa mogu biti transkribovani in vitro, i RNK dobijenu kao rezultat moguće je uvesti u ćeliju domaćina.

[0100] Posle uvođenja polinukleotida koji obuhvata sekvencu kodiranja za polinukleotid iz ovog opisa, ćelija domaćin može da bude odgajana u uobičajenoj hranljivoj podozi modifikovanoj kako je pogodno za aktiviranje promotera, odabir transformanata, i/ili pojačavanje ekspresije polinukleotida koji kodira polipeptid. Uslovi kulture, kao što je temperatura, pH i slično, mogu biti oni koji su prethodno korišćeni za tu ćeliju domaćina izabranu za ekspresiju. Za potomka ćelija u koji su uvedeni takvi konstrukti polinukleotida se može smatrati da obuhvata polinukleotid koji kodira polipeptid.

[0101] U nekim varijantnim rešenjima, polipeptid ili njegova varijanta može biti izražen kao protein fuzije pomoću bakterijske ćelije domaćina. Iako je razdvajanje polipeptida fuzije da bi se otpustio željeni protein često može da bude korisno, nije neophodno. Polipeptidi i njihove varijante izražene i izlučene kao proteini fuzije mogu zadržati njihovu funkciju.

[0102] Ekspresija polipeptida iz ovog opisa može obuhvatiti prelaznu ekspresiju i/ili konstitutivnu ekspresiju (npr., razvoj stabilne linije ćelije).

Ekspresija rekombinantnih polipeptida

[0103] Ekspresija polipeptida može obuhvatiti indukovanje ćelije domaćina da transkribuje i/ili prevede polipeptid kodiran u polinukleotid uveden u ćeliju domaćina. Indukcija može nastati pošto se ćelija domaćin kultiviše tokom najmanje oko 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više sati. Indukcija može nastati pošto kultura ćelije domaćina ima optičku gustinu (OD) od najmanje oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, ili 1,5 ili više. Indukcija može nastati pošto kultura ćelije domaćina ima optičku gustinu (OD) od najviše oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 5, 10, ili 20 ili više. Indukciju može prouzrokovati dodavanje hemikalija kao što je IPTG, arabinoza ili kao odgovor na ograničeni nutrijent kao što je azot, fosfor, glukoza ili kiseonik. U nekim slučajevima polipeptid je povezan na promoter, kao što je aprE, liaG, lepA, cry3Aa, ili gsiB koji vodi konstitutivnoj ekspresiji tog polipeptida.

[0104] U nekim slučajevima, hemijska sredstva mogu biti dodata u ovu podlogu. U nekim slučajevima, hemijska sredstva mogu doprineti stabilnosti, sadržaju hema, i/ili sposobnosti uvijanja proteina izraženog polipeptida. Hemijsko sredstvo može da obuhvati mali molekul kao što je metal. Primeri pogodnih metala za dodavanje u podlogu mogu obuhvatiti gvožđe fluoride (podloga gvožđa može uključiti gvožđe fluoride (gvožđe difluorid, gvožđe trifluorid), gvožđe dihlorid, gvožđe trihlorid, gvožđe dibromid, gvožđe tribromid, gvožđe dijodid, gvožđe trijodid, gvožđe oksid, digvožđe trioksid, trigvožđe tetraoksid, gvožđe sulfid, gvožđe persulfid, gvožđe selenid, gvožđe telurid, di-gvožđe nitrid, gvožđe pentakarbonil, digvožđe nonakarbonil, trigvožđe dodekakarbonil, gvožđe dihlorid dihidrat, gvožđe trifluorid trihidrat, gvožđe di- bromid heksahidrat, gvožđe dihlorid tetrahidrat, gvožđe nitrat heksahidrat, gvožđe trihlorid heksahidrat, gvožđe difluorid tetrahidrat, gvožđe sulfat heptahidrat, gvožđe trinitrat nonahidrat, digvožđe trisulfat nonahidrat, gvožđe hromat, gvožđe citrat, gvožđe glukonat, magnezijum gvožđe heksahidrid, gvožđe laktat, gvožđe fosfat, gvožđe pentakarbonil, amonijak gvožđe sulfat, amonijak gvožđe(III) citrat, gvožđe(III) oksalat, i trigvožđe difosfat oktahidrat.

[0105] Hemijsko sredstvo može biti dodat u podlogu u finalnoj koncentraciji od najmanje oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 ili više milimolara. Hemijsko sredstvo može biti dodato u podlogu u finalnoj koncentraciji od najviše oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 ili više milimolara.

[0106] U nekim slučajevima, hemijsko sredstvo može da bude hem derivat. Hem derivat može povećati sadržaj hema izraženog polipeptida (npr., poveća broj molekula globina koji obuhvataju hem). Pogodni derivati hema mogu obuhvatiti delta-aminolevulinsku kiselinu, derivate hema A, derivate hema B, derivate hema C, derivate hema O, prekursore hema, derivate hema I, derivate hema m, derivate hema D, i derivate hema S. Derivat hema je moguće dodati u podlogu u krajnjoj koncentraciji od najmanje oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 ili više milimolara. Derivat hema može biti dodat u podlogu u finalnoj koncentraciji od najviše oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 ili više milimolara. U nekim slučajevima, u podlogu se ne dodaje derivat hema.

[0107] Posle indukovanja polipeptida, ćelija domaćina može biti kultivisana tokom vremenskog perioda koji pogoduje maksimalnim nivoima ekspresije polipeptida. Na primer, polipeptid može biti izražen tokom najmanje oko 0,1 sat, 0,5 sati, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati , 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 ili više nedelja. Polipeptid može biti izražen u ćeliji domaćinu tokom najviše oko najmanje oko 0,1 sat, 0,5 sata, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati , 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, ili 10 ili više nedelja.

[0108] Polipeptid može biti izražen na različitim temperaturama. Polipeptid može biti izražen na temperaturi od najmanje oko 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50°C. Polipeptid može biti izražen na temperaturi od najviše oko 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50°C.

[0109] Pomoćni proteini kao što je tiol-disulfid oksidoreduktaze ili pratioci (šaperoni) mogu biti korisni tako što će pomoći prasavijanje polipeptida u njegovu aktivnu konformaciju. Tiol-disulfid oksidoreduktaze i protein disulfid izomeraze mogu katalizovati formiranje pravilnih veza disulfida u tom proteinu. Ekspresija bdbDC operona u B. subtilis se pokazala korisnom za proizvodnju polipeptida sa disulfidnim vezama. Pratioci mogu da pomognu proteinu koji se izlučuje da se uvije vezivanjem na izložene hidrofobne regione u neuvijenim stanjima i sprečavanjem nepoželjnih interakcija i prolil peptidil cis-trans izomeraza pomažu u formiranju pravilne konformacije lanca peptida susednog ostacima prolina. U nekim varijantnim rešenjima, ćelije domaćini mogu biti transformisane sa vektorom ekspresije koji kodira najmanje jednu tiol- disulfid oksidoreduktazu ili pratilac.

[0110] U nekim slučajevima, frakcija propisno uvijenog polipeptida može biti povećana dodavanjem hemikalija na podlogu za rast koja smanjuje/oksidira veze disulfida, i/ili menja opšti redoks potencijal, i/ili hemikalija koje menjaju svojstva rastvarača i tako utiču na konformaciju i agregaciju proteina. U nekim slučajevima, reagens koji smanjuje veze disulfida, kao što je 2-merkaptoetanol, može da poveća frakciju pravilno uvijenog proteina. U nekim slučajevima i zavisno od korišćene podloge, drugi reagensi redukcije ili oksidacije disulfida (npr., DTT, TCEP, su redukovali i oksidirali glutation, cistein, cistin, cisteamin, tioglikolat, S2O3<2>, S2O4<2>, S2O5<2>, SO3<2>, S2 O7<2>, Cu+, itd.), bilo korišćen sam ili u kombinaciji, mogu da pronađu upotrebu u ovom opisu. Može se smatrati da drugi adjuvansi koji menjaju svojstva rastvarača, (npr., urea, DMSO, TWEEN®-80, itd.), bilo dodati u podlogu za rast smi ili preporučljivo u kombinaciji sa sredstvima redukcije/oksidacije disulfida, kao što je βME, mogu takođe da povećaju frakciju pravilno presavijenog proteina izlučivanja i da pronađu upotrebu u različitim slučajevima iz ovog opisa. U nekim slučajevima, βME je moguće korisititi u koncentracijama koje se kreću u opsegu od 0,5 do 4 mM, ili od oko 0,1 mM do 10 mM.

[0111] Polipeptid može biti oporavljen iz te kulture (npr., centrifugiranjem, prečišćavanjem, itd.), kao što je opisano dole u tekstu i ovde.

Parametri fermentacije

[0112] Ovaj opis opisuje postupke fermentacije za kultivaciju bakterijskih vrsta. Kultivaciju je moguće izvesti u podlozi za rast koja obuhvata vodenu podlogu mineralne soli, faktore organskog rasta, ugljenik i materijal koji je izvor energije, molekularni kiseonik (za aerobne i fakultativne bakterije), i, naravno, početni inokulum jedne ili više specifičnih vrsta mikroorganizama koji će biti korišćeni.

[0113] Pored ugljenka i izvora energije, kiseonik, azot koji je moguće asimilovati, i inokulum mikroorganizma, može biti neophodno da se dopreme pogodne količine u propisnim udelima mineralnih hranljivih sastojaka da bi se osigurao pravilan rast mikroorganizma, povećala asimilacija ugljenika i izvora energije pomoću ćelija u postupku mikrobne konverzije, i da bi se postigli maksimalni ćelijski prinosi sa maksimalnom gustinom ćelije u podlozi fermentacije.

[0114] Moguće je koristiti različite podloge kulture. Moguće je koristiti standardnu bakterijsku podlogu kulture. Ova podloga može obuhvatiti, pored azota, pogodne količine fosfora, magnezijum, kalcijum, kalijum, sumor, i natrijum, u pogodnim rastvorljivim jonskim i kombinovanim oblicima koje je moguće asimilovati, i može takođe obuhvatiti izvesne elemente u tragovima kao što je bakar, mangan, molibden, cink, gvožđe, bor, i jod, i drugi, ponovo u pogodnom obliku koji je moguće asimilovati.

[0115] U slučajevima, reakcija fermentacije može da obuhvati aerobni proces u kom je potrebno da bude dopremljen molekularni kiseonik pomoću gasa koji sadrži molekularni kiseonik kao što je vazduh, vazduh obogaćen kiselinikom, ili čak pretežno čist molekularni kiseonik, obezbeđen da održi sadržaje ferementacione posude sa pogodnim delimičnim pritiskom kiseonika delotvornim da se pomogne rast vrsta mikroorganizma na uspešan način. Kao efekat, upotreba oksidiranog ugljovodoničnog supstrata, neophodan kiseonik za rast mikroorganizma je moguće smanjiti. Pored toga, molekularni kiseonik moguće je dopremiti za rast aerobnih i u manjoj meri, fakultativnih organizama.

[0116] Iako stopa prozračivanja može da bude različita tokom značajnog opsega, prozračivanje generalno može da se izvede brzinom koja je u opsegu od oko 0,5 do 10 ili od oko 0,5 do 7 zapremina (na pritisku korišćenom i na 25°C.) gasa koji obuhvata kiseonik po zapremini u uređaju za fermentaciju po minuti. Ovu količinu je moguće zasnovati na vazduhu normalnog sadržaja kiseonika koji se doprema do reaktora, i u uslovima čistog kiseonika odgovarajući opsezi mogu biti od oko 0,1 do 1,7, ili od oko 0,1 do 1,3, zapremina (na pritisku korišćenom i na 25°C) kiseonika po zapremini tečnosti u uređaju za fermentaciju po minuti.

[0117] Opsezi korišćenog pritiska za postupak mikrobne konverzije mogu u velikoj meri da variraju. Prtisci mogu generalno da budu unutar opsega od oko 0 do 50 psig, od oko 0 do 30 psig, ili najmanje blago iznad atmosferskog pritiska, kao ravnoteža opreme i troškova rada naspram postignute rastvorljivosti kiseonika. Vrednosti veće od atmosferskog pritiska mogu povećati koncentraciju rastvorenog kiseonika u vodenom fermentu, što zauzvrat može pomoći da se povećaju brzine rasta ćelija.

[0118] Temperatura fermentacije može u nekoj meri da varira, ali za većinu bakterijskih vrsta domaćina korišćenih u ovom pronalasku, ta temperatura može generalno da bude u opsegu od oko 20°C do 40°C, ili u opsegu od oko 28°C do 37°C, zavisno od soja izabranog mikroorganizma.

[0119] U nekim slučajevima, mikroorganizmi mogu zahtevati izvor azota koji je moguće asimilovati. Izvor azota koji je moguće asimilovati može biti bilo koje jedinjenje ili jedinjenja sa azotom koje može da otpusti azot u obliku pogodnom za metaboličko korišćenje putem mikroorganizma. Iako je moguće da raznovrsna jedinjenja kao izvori organskog azota, kao što su hidrolizati proteina, budu korišćeni, obično je moguće koristiti jedinjenja koja obuhvataju jeftin azot kao što je amonija, amonijak hidroksid, urea, i različite soli amonijaka kao što je amonijak fosfat, amonijak sulfat, amonijak pirofosfat, amonijak hlorid, ili različita druga jedinjenja amonijaka. Sam amonija gas može biti praktičan za operacije velikih razmera, i može biti korišćen bubrenjem kroz vodeni ferment (podloga fermentacije) u pogodnim količinama. U isto vreme, to jedinjenje amonija može biti korišćeno da se pomogne kontrola pH vrednosti.

[0120] Opseg pH vrednosti u vodenom mikrobnom fermentu (mešavina fermencije) može biti u primeru opsega od oko 2,0 do 8,0. Međutim, optimalna vrednost pH opsega za izvesne mikroorganizme može da bude zavisna od podloge korišćene u nekoj meri, kao i od specifičnog mikroorganizma, i samim tim da se u nekoj meri promeni sa promenom podloge.

[0121] Prosečno vreme zadržavanja mešavine fermentacije u uređaju za fermentaciju može da varira u značajnoj meri, a to delimično zavisi i od temperature fermentacije i od korišćene kulture. U nekim varijantnim rešenjima, ta fermentacija može biti izvedena na takav način da supstrat koji obuhvata ugljenik može da bude kontrolisan kao ograničavajući faktor, čime se obezbeđuje dobro pretvaranje supstrata koji obuhvata ugljenik u ćelije i izbegava kontraminacija tih ćelija sa značajnom količinom nepretvorenog supstrata. Ovaj poslednji ne mora da bude problem sa supstratima rastvorljivim u vodi, jer je lako moguće ukloniti svaki preostali trag. Može, međutim, biti problem, u slučaju supstrata koji nisu rastvorljivi u vodi, i mogu se koristiti dodatni koraci tretiranja proizvoda kao što su koraci pogodnog pranja. Vreme potrebno da se dostigne ovaj nivo graničnog supstrata može varirati sa specifičnim mikroorganizmom i postupkom fermentacije koji se izvodi. Fermentaciju je moguće izvesti kao šaržnu ili kontinualnu operaciju, polušaržna operacija može biti korišćena da bi se olakšala kontrola, proizvodnja uniformnih količina proizvoda, i najekonomičnije upotrebe celokupne opreme.

[0122] Po želji, deo ili sav ugljenik i materijal koji je izvor energije i/ili deo izvora azota koji je moguće asimilovati kao što je amonija moguće je dodati u vodenu mineralnu podlogu pre dovođenja vodene mineralne podloge u uređaj za fermentaciju. Takođe, svaka od struja uvedenih u reaktor može biti kontrolisana na unapred određenoj brzini, ili kao odgovor na potrebu koju je moguće odrediti nadgledanjem takve koncentracije ugljenika i supstrata energije, pH, rastvorenog kiseonika, kiseonika ili ugljen dioksida u sagorelim gasovima iz uređaja za fermentaciju, gustini ćelije koju je moguće izmeriti prenosom svetlosti, ili sličnim. Brzine dovoda različitih materijala moguće je varirati tako da se dobije što je moguće brži rast ćelije, u skladu sa efikasnim korišćenjem ugljenika ili izvora energije, da bi se dobio što je moguće viši prinos ćelija mikroorganizama u odnosu na naelektrisanje supstata, i da bi se dobila najviša proizvodnja željenog proteina po jedinici zapremine.

[0123] U šarži, opremi, reaktoru, ili uređajima za fermentaciju, posudi ili kontejneru, cevovodu, pratećim uređajima za cirkulaciju ili hlađenje, i sličnom, moguće je početno sterilisati, obično korišćenjem pare na oko 121°C tokom najmanje oko 15 minuta. Sterilisani reaktor je moguće inokulisati kulturom izabranog mikroorganizma u prisustvu svih neophodnih hranljivih materija, uključujući kiseonik, i supstrat koji obuhvata ugljenik.

Postupci izlučivanja bakterija

[0124] U nekim slučajevima, eksprimovani polipeptid moguće je izlučiti iz ćelije domaćina (npr., bakterija). Izlučivanje polipeptida može obuhvatiti ispuštanje polipeptida iz ćelije ili podćelijske pregrade u ćeliji (npr., nukleusa, zida ćelije, plazma membrane). Izlučivanje može nastati kroz plazma membrane, koje okružuju ćelije i/ili podćelijske pregrade. U nekim slučajevima, izlučivanje može da se odnosi na otpuštanje polipeptida na omotač ćelije. U nekim slučajevima, izlučivanje može da se odnosi na otpuštanje polipeptida u vanćelijski prostor (npr., u podlogu kulture).

[0125] Ćelija domaćin iz ovog opisa može obuhvatiti putanje izlučivanja, koje mogu obuhvatiti neke proteine koji funkcionišu zajedno da bi se izlučio protein. U nekim slučajevima, ćelija domaćin može obuhvatiti putanju izlučivanja za arginin-arginin, tzv. twin-arginin, translokaciju (TAT). U nekim slučajevima, organizam može da obuhvati SEC putanju izlučivanja. TAT putanja izlučivanja može obuhvatiti izlučivanje polipeptida (npr., globina) u uvijenom stanju. TAT putanja izlučivanja može transportovati proteine preko plazma membrane (npr., lipidnog sloja, t.j., lipidnog dvosloja).

[0126] Ovaj opis opisuje faktore izlučivanja i postupke koje je moguće koristiti u ćelijama domaćina da bi se poboljšale smetnje za izlučivanje proteina i proizvodnju proteina u izlučenom obliku, posebno kada su polipeptidi rekombinantno uvedeni i eksprimovani pomoću ćelije domaćina. Ovaj opis opisuje faktore izlučivanja TatC i TatA izvedene iz Bacillus subtilis. Specifično, TatAdCd i TatAyCy peptid, kao i geni koji ih kodiraju su takođe pogodni faktori izlučivanja. PhoD od B. subtilis, može biti izlučen arginin-arginin, tzv. twinarginin, translokacije (TAT). TatAdCd je od presudnog značaja za izlučivanje PhoD, pri čemu TatAyCy ne mora da bude neophodan za ovaj postupak.

Ekspresija polipeptida kod biljaka

[0127] Polipeptid može biti eksprimovan kod monokotilnih biljaka i/ili dikotilnih biljaka. Tehnike uvođenja nukleinskih kiseline u biljke su poznate u ovoj oblasti, i uključuju, bez ograničenja, Agrobacterium-posredovanu transformaciju, virusnim vektorom posredovanu transformaciju, elektroporaciju, i čestične pištolj transformacije (takođe se pominje i kao biolistična transformacija). Videti, na primer, patent iz SAD br. U.S.

5,538,880; 5,204,253; 6,329,571; i 6,013,863; Richards et al., Plant Cell. Rep.20:48-20 54 (2001); Somleva et al., Crop Sci.42:2080-2087 (2002); Sinagawa-Garcia et al., Plant Mol Biol (2009) 70:487-498; and Lutz et al., Plant Physiol., 2007, Vol.145, pp.1201-1210.

U nekim slučajevima, intergenska transformacija plastida može biti korišćena kao postupak uvođenja polinukleotida u ćeliju domaćina. U nekim slučajevima, postupak uvođenja polinukleotida u biljku obuhvata transformaciju hloroplasta. U nekim slučajevima, listovi i/ili stabla mogu biti ciljno tkivo uvedenog polinukleotida. Ako se ćelija ili odgajeno tkivo koristi kao tkivo primalac za transformaciju, biljke je moguće regenerisati iz transformisanih kultura po želji, tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0128] Drugi pogodni postupci za uvođenje polinukleotida obuhvataju elektroporaciju protoplasta, polietilen glikolom posredovanu isporuku ogoljene DNK u protoplaste biljke, direktnu transformaciju gena kroz imbibiciju (npr., uvođenje polinukleotida u dehidriranu biljku), transformaciju u protoplaste (što može obuhvatiti prenos polinukleotida kroz osmotske ili električne šokove), hemijsku transformaciju (koja može obuhvatiti upotrebu polibren-spermidin supstance), mikroinjektiranje, transformaciju putanje polen-tube (što može obuhvatiti isporuku polinukleotida kroz ovulu biljke), transformaciju preko lipozoma, postupak transformacije vrha izdanka (koji obuhvata uvođenje polinukleotida u izdanak i regeneraciju tog izdanka), postupak tansformacije sonikacijom asistrane transformacije agrobakterijuma (SAAT), infiltraciju (koja može obuhvatiti umakanje cvetova, ili injektiranje špricem u specifičan deo biljke (npr., list), transformacija posredovana silikonkarbidom (SCMT) (koja može da obuhvati dodavanje vlakana silikon karbida u tkivo biljke i polinukleotid od interesa), elektroporaciju, i elektroforezu.

[0129] Polipeptid može biti izražen u brojnim različitim vrstama biljaka, uključujući, na primer zrna, kao što je, kukuruzno zrno, kukuruz, ovas, pirinač, pšenicu, ječam, raž, pšenoraž, etiopsko proso, semenkama za ulja, uključujući, seme kokosa, seme suncokreta, seme šafrana, morsko zelje, podlanak , slačica, repica, lisnate zelene biljke kao što je, npr., salata, spanać, divlji kupus, raštan, bela keleraba, kelj, listovi slačice, listovi maslačka, blitva, zeleni delovi slačice, zeleno maslačka, brokule, kupus, šećerna trska, drveće, korenski usevi kao što je tapioka, slatki krompir, šargarepa, cvekla, repe, biljke iz porodice mahunarki, kao što je, npr., detelina, grašak, kravlji grašak, engleski grašak, žuti grašak, zeleni grašak, razne vrste bobova kao što je, npr., sojino zrno, poljski bob, lima pasulj, obični pasulj, leblebija, zlatni mungo pasulj, boranija, sočiva, leguminoze, grmlje rogača, spiralne mahune (Prosopis pubescens), rogač, soja, i kikiriki, kokos, grahorica (vicia), štitare (stylosanthes), arachis (iz familije bobova), indigofera (žbunaste mahunarke), akacia, leucaena, guar guma (Cyamopsis tetragonoloba), i mahunarke sesbania (iz mahunarki kao što je grašak). Biljke koje ljudi najčešće ne konzumiraju, uključujući useve za biomasu, uključujući travu za seno, miskantus, duvan, Arundo donax, energetsku trsku, sirak, druge trave, alfalfa, kukuruzna slama, alge, ili druge morske trave. Polipeptidi koje je moguće naći u bilo kom organizmu u carstvu buljaka moguće je koristiti u ovom opisu. U nekim slučajevima, ta biljka može biti soja (Glycine max). U nekim slučajevima, ta biljka može biti ječam (Hordeum vulgare). U nekim slučajevima, ta biljka može biti Nicotiana tabacum. U nekim slučajevima, ta biljka ili ćelija biljke nije Nicotiana biljka ili ćelija biljke.

[0130] U nekim slučajevima, Nicotiana tabacum vrsta, soj, ili sorta može biti N. tabacum pristupni broj PM016, PM021, PM92, PM102, PM132, PM204, PM205, PM215, PM216 ili PM217 kako je deponovano kod NCIMB, Aberdeen, Scotland, ili DAC Mata Fina, P02, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, P02, Wislica, Simmaba, Turkish Samsun,AA37-1, B13P, F4 iz ukrštenog BU21 x Hoja Parado line 97, Samsun NN, Izmir, XanthiNN,Karabalgar, Denizli i P01.

[0131] Ekspresija polipeptida iz ovog opisa može obuhvatiti prelaznu ekspresiju i/ili konstitutivnu ekspresiju (npr., razvoj stabilne linije ćelije).

Agrobacterium vrste i sojevi

[0132] Ovaj opis opisuje Agrobacterium sojeve za upotrebu u postupcima za proizvodnju polipeptida ekspresijom sekvence koju je moguće eksprimovati (npr., sekvence koja kodira polipeptid iz ovog opisa). Jedan od Agrobacterium sojeva je moguće koristiti da se infiltrira unapred izabran varijetet biljke kako bi se optimizovao prinos tog polipeptida. U izvesnim slučajevima, Agrobacterium vrste koje je moguće koristiti u postupku prema ovom opisu mogu obuhvatiti ali ne i ograničiti se na Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi, Argobacterium vitis. U nekim varijantnim rešenjima, barem jedan Agrobacterium soj obuhvata Agrobacterium tumefaciens. Korišćeni sojevi Agrobacterium mogu biti divljeg tipa (npr., virulentni) ili razoružani (neonkogeni) soj. Pogodni sojevi Agrobacterium mogu da obuhvate sojeve divljeg tipa (npr., kao što je Agrobacterium tumefaciens) ili sojeve kod kojih jedan ili više gena mutira da bi povećao efikasnost transformacije, (npr., kao što su sojevi Agrobacterium pri čemu je ekspresija vir gena i/ili njegovo uvođenje promenjeno usled prisustva mutanta ili himernih virA ili virG gena), Agrobacterium sojevi obuhvataju ekstra kopije virG gena, kao što je super virG gena izveden iz pTiBo542, spojen na višestruku kopiju plazmida. Drugi pogodni sojevi obuhvataju, ali bez ogrnaičenja na: A. tumefaciens C58C1, A136; LBA4011, LBA4404; EHA101; EHA105; AGL1; i A281. U nekim slučajevima, izabrani Agrobacterium soj može biti AGL1, EHA105, GV2260, GV3101, ili Chry5.

[0133] U nekim slučajevima, višestruke suspenzije Agrobacterium ćelija, svaka izražava različite gene mogu biti korišćene da se proizvede polipeptid, ili da se pospeši nivo ekspresije polipeptida iz tog opisa. U takvim slučajevima, smatra se da Agrobacterium ćelije u različitim suspenzijama Agrobacterium ćelija mogu da budu istog soja ili različitih sojeva. Alternativno, ili dodatno, jedan Agrobacterium soj može da obuhvata više sekvenci koje obuhvataju različite polinukleotide, specifično polinukleotide koji kodiraju polipeptide iz ovog opisa. Različiti geni mogu biti obuhvaćeni unutar pojedinačnog molekula nukleinske kiseline (npr., pojedinačni vektor) ili mogu biti obezbeđeni u različitim vektorima. Neograničavajući primer drugog gena koji može biti izraćen u biljci domaćina je gen koji kodira supresor utišavanja, koji je virusnog porekla.

[0134] Ekspresija polipeptida u ćeliji domaćina (npr., ćeliji biljke), može nastati tokom najmanje oko 0,1 sat, 0,5 sati, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati , 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 15 nedelja, 20 nedelja, 30 ili više nedelja. Polipeptid može biti izražen u ćeliji domaćinu tokom najviše oko najmanje oko 0,1 sat, 0,5 sata, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati , 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 24 sata, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, ili 10 nedelja, 15 nedelja, 20 nedelja, 30 ili više nedelja.

[0135] Polipeptid može biti izražen na različitim temperaturama. Polipeptid može biti izražen na temperaturi od najmanje oko 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50°C. Polipeptid može biti izražen na temperaturi od najviše oko 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50°C.

Pospešenje endogenih polipeptida

[0136] Ovaj opis opisuje pospešenu proizvodnju endogenog polipeptida (npr., endogenog polipeptida koji obuhvata hem). Pospešena proizvodnja endogenog polipeptida može biti izvedena modulacijom putanje koja proizvodi endogeni polipeptid. Modulacija može da se odnosi na modulaciju transkripcije, translacije, podćelijske lokalizacije, lokalizaciju različitih tkiva, vremensko usklađivanje ekspresije, uvijanja, afiniteta za partnere vezivanja, i slično. Modulacija može nastati na nivou DNK (npr., laboratorijski gen, laboratorijski promoter (element promotera). Modulacija može nastati na nivou RNK (npr., utiša gen preko RNK interferencije). Modulacija može nastati na nivou proteina (npr., modulacija alosternim inhibitorima, vezivačima malog molekula).

[0137] U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa endogenog polipeptida za najmanje oko 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko 20-struko, 50-struko, ili 100-struko ili više ili niže u odnosu na nivoe divljeg tipa endogenog polipeptida. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa endogenog polipeptida za najmanje oko 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko 20-struko, 50-struko, ili 100-struko ili više ili niže u odnosu na nivoe divljeg tipa endogenog polipeptida. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa endogenog polipeptida za najmanje oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% nivoa divljeg tipa endogenog polipeptida. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa endogenog polipeptida za najmanje oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% nivoa divljeg tipa endogenog polipeptida.

[0138] U nekim slučajevima, polipeptidi u putanji biosinteze hema koji mogu da proizvedu kofaktor hem mogu biti modulisani. Videti, na primer, Tanaka and Tanaka, Annu. Rev. Plant Biol. 2007. 58:321-46, koji opisuju modifikacije na putanji biosinteze tetrapirola u biljkama. Modulacija polipeptida u putanji biosinteze hema može da bude na nivou DNK, RNK, ili na nivou proteina. U nekim slučajevima, modulacija drugih polipeptida u toj putanji može da se odnosi na povećanje nivoa i/ili aktivnosti aktivatora te putanje. U nekim slučajevima, modulacija drugih polipeptida u toj putanji može da se odnosi na smanjenje nivoa i/ili aktivnosti suzbijača (supresora) te putanje.

[0139] U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa polipeptida u putanji biosinteze hema (uključujući kofaktor hem koji se dovodi u vezu sa polipeptidom koji obuhvata hem iz ovog opisa) za najmanje oko 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko, 20-struko, 50-struko, ili 100-struko ili više ili niže u odnosu na nivoe divljeg tipa polipeptida u toj putanji. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa polipeptida u putanji biosinteze hema (uključujući hem kofaktor) za najviše oko 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko 20-struko, 50-struko, ili 100-struko ili više ili niže u odnosu na nivoe divljeg tipa polipeptida u toj putanji. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa polipeptida u putanji biosinteze hema (uključujući kofaktor hem) za najmanje oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% nivoa divljeg tipa polipeptida u toj putanji. U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu aktivnosti i/ili nivoa polipeptida u putanji biosinteze hema (uključujući kofaktor hem) za najmanje oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% nivoa divljeg tipa polipeptida u toj putanji.

[0140] U nekim slučajevima, modulacija može da se odnosi na promenu nivoa ekspresije endogenog polipeptida u specifičnoj lokaciji ćelije domaćina. Na primer, nivoi ekspresije endogenog polipeptida mogu biti promenjeni u listu, semenu, mahuni, peteljci (stablu), ksilemu, prašniku, i latici, ili bilo kojoj kombinaciji navedenih.

Postupci prečišćavanja

[0141] Eksprimovani i/ili izlučeni polipeptid iz ovog opisa može biti oporavljen (npr., iz podloge kulture ili iz tkiva biljke). Na primer, kada je eksprimovan polipeptid koji obuhvata hem izlučen iz bakterijskih ćelija, taj polipeptid je moguće prečistiti iz podloge kulture. U nekim slučajevima, ćelije domaćina koje eksprimuju polipeptid mogu biti uklonjene iz podloge pre prečišćavanja tog polipeptida (npr., centrifugiranjem).

[0142] Kada eksprimovani rekombinantni željeni polipeptid nije izlučen iz ćelije domaćina, ta ćelija domaćin može biti prekinuta i polipeptid može biti otpušten u vodeni "ekstrakt" što može biti prvi stadijum prečišćavanja. Ekspresiju ćelija domaćina je moguće prikupiti iz podloga pre prekida ćelije. Prekid ćelije je moguće izvesti upotrebom bilo kojih pogodnih sredstava, kao što je lizozim ili razgradnja beta-glukanaze, mlevenje, sonikacija, homogenizacija, mrvljenje ili propuštanjem ćelija kroz visok pritisak.

[0143] Oporavljeni polipeptid može biti prečišćen. Prečišćavanje je moguće izvesti pomoću soli (npr., amonijak sulfata) ili niskom pH (najčešće manje od 3) pranjem/frakcionisanjem ili hromatografskih postupaka (npr., jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, hromatografijom na principu hidrofobnih interakcija, hromatografijom na principu indukovanja hidrofobnog naelektrisanja, ekskluzione hromatografije po veličini itd.). Tokom prečišćavanja, kumulativno obilje prema masi komponenata proteina koje nije precizirani protein, koje može biti pojedinačne monomerne ili višemerne vrste proteina, može biti smanjeno za faktor od 2 ili više, 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 50 ili više, 100 ili više ili 1000 ili više u odnosu na materijal izvora iz kog je izolovan navedeni protein.

[0144] U nekim slučajevima, polipeptid može biti oporavljen iz uređaja za fermentaciju. Fermentacioni preprarat može generalno da obuhvata ćelijske krhotine, uključujući ćelije, različite suspendovane čvrste supstance ili druge kontaminante biomase, kao i željeni proizvod proteina, koji je moguće ukloniti iz fermentacionog preparata. Pogodni postupci za takvo uklanjanje mogu obuhvatiti uobičajene tehnike odvajanja čvrste supstancetečnosti (npr., centrifugiranje, filtaciju, dijalizu, mikrofiltraciju, rotacionu vakuumsku filtraciju, ili druge poznate postupke), da bi se proizveo filtrat bez ćelije. U nekim varijantnim rešenjima, može biti prihvatljivo da se dodatno koncentruje fermentacioni preparat ili filtrat bez ćelije pre postupka prečišćavanja ili kristalizacije korišćenjem tehnika kao što je ultrafiltracija, isparavanje i/ili taloženje. U nekim slučajevima je polipeptid još prečišćen da bi smanjio kumulativno obilje prema masi komponenata proteina koje nije precizirani protein, što mogu biti pojedinačne monomerne ili višemerne vrste proteina, za faktor od 2 ili više, 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 50 ili više, 100 ili više ili 1000 ili više u odnosu na materijal izvora iz kog je izolovan navedeni protein. Prečišćavanje može biti izvedeno pomoću soli (npr., amonijak sulfata) ili na nisoj pH vrednosti pH (obično manje od 3) pranja/frakcionisanja ili hromatografskih procedura (npr., jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, hromatografije na principu hidrofobnih interakcija, hromatografijom na principu indukovanja hidrofobnog naelektrisanja, itd).

Karakterizacija polipeptida

[0145] Prečišćeni polipeptid može biti karakterisan čistoćom, sadžajem hema, stanjem oligomerizacije, stabilnošću, razgradnjom, afinitetom vezivanja i sličnim. Za neke primene polipeptidi (npr., globini) proizvedeni upotrebom ovog opisa mogu da budu veoma visoke čistoće (npr., imati čistoću veću od 99%). Prečišćeni polipeptid može da bude karakterisan mirisom, ukusom ili bojom.

[0146] Prečišćeni polipeptid može biti najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% čist. Prečišćeni polipeptid može biti najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% čist. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najmanje oko 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99% nečistoća. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najviše oko 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99% nečistoća. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova na milion nečistoća. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova na milion nečistoća. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova na milijardu nečistoća. Prečišćeni polipeptid može obuhvatiti najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova na milijardu nečistoća.

[0147] U nekim slučajevima, prečišćeni globin može biti testiran za aktivnost, stanje oligomerizacije, pravilno uvijanje proteina, stabilnost, sekundarnu strukturu i/ili sadržaj hema. Aktivnost, stanje oligomerizacije, uvijanje proteina, i/ili stabilnost mogu biti određeni brojem postupaka koji obuhvataju spektroskopiju, ELISA, oglede vezivanja, analitičko ultracentrifugiranje, cirkularni dihroizam, rendgensku kristalografiju, rezonancu površinskog plazmona, spektrometriju mase, ili NMR.

[0148] Polipeptid iz ovog opisa može imati slična svojstva mioglobinu izolovanom iz tkiva životinja. U jednom varijantnom rešenju moguće je zatražiti od grupe ljudi da ocene mioglobin izolovan iz tkiva životinje, prema svojstvima koja opisuju mioglobin. Ove ocene je moguće koristiti kao indikaciju svojstava mioglobina izvedenog iz tkiva životinje. Polipeptid iz ovog opisa moguće je zatim uporediti sa globinom izvedenim iz životinje da bi se odredilo koliko je sličan polipeptid iz ovog opisa sa mioglobinom izvedenim iz tkiva životinje. Dakle, u nekim slučajevima, polipeptid se ocenjuje kao sličan mioglobinu izvedenom iz tkiva životinje prema proceni od strane ljudi. U nekim varijantnim rešenjima polipeptid je nerazlučiv od mioglobina izvedenog iz tkiva životinje prema proceni koju radi ljudsko biće.

[0149] U nekim slučajevima, polipeptidi iz ovog opisa se porede sa mioglobinom izvedenim iz tkiva životinje na osnovu očitavanja olfaktornim meračem. U različitim varijantnim rešenjima, olfaktorni merač može biti korišćen da se proceni koncentracija mirisa i granične vrednosti mirisa, supra granične vrednosti mirisa uz poređenje sa referentnim ocenama za gas i hedoničnu skladu da bi se odredio stepen sviđanja, ili relativni intenzitet mirisa. U nekim varijantnim rešenjima olfaktorni merač omogućava obuku i automatsku procenu ekspertskih panela. U nekim slučajevima proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi je proizvod koji prouzrokuje slična ili identična olfaktorna očitavanja. U nekim varijantnim rešenjima je dovoljno da sličnost bude preko granične vrednosti detekcije humane percepcije.

[0150] Spektrometrija mase gasnom hromatografijom (GCMS) je postupak koji kombinuje karakteristike gas-tečne hromatografije i masene spektrometrije da bi se odvojile i identifikovale različite supstance unutar probnog uzorka. GCMS može, u nekim varijantnim rešenjima, biti korišćen da se procene svojstva polipeptida iz ovog opisa. Na primer, isparljive hemikalije je moguće izolovati iiz glavnog prostora oko mioglobina izvedenog iz tkiva životinje. Ove hemikalije je moguće identifikovati korišćenjem GCMS. Na taj način se stvara profil isparljivih hemikalija u glavnom prostoru oko mioglobina izvedenog iz tkiva životinje. U nekim slučajevima svaka vršna vrednost GCMS može biti dodatno procenjena. Na primer, čovek bi mogao oceniti iskustvo mirisanja hemikalije odgovrno za izvesnu vršnu vrednost. Ovu bi informaciju bilo moguće koristiti da se dodatno prečisti profil. GCMS bi onda mogao biti korišćen da se procene svojstva polipeptida iz ovog opisa. GCMS profil bi mogao biti korišćen da se prečisti polipeptid.

[0151] Sadržaj hema može da se odnosi na procenat molekula polipeptida koji obuhvataju pravilnu količinu delova hema. Na primer, ako polipeptid iz ovog opisa veže jedan deo hema, onda sadržaj hema može da se odnosi na broj polipeptida koji se vežu na deo hema. Sadržaj hema polipeptida može biti najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100%. Sadržaj hema polipeptida može biti najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100%. U nekim slučajevima, sadržaj hema može biti izražen kao molarni odnos koncentracije polipeptida prema koncentraciji hema. Molarni odnos sadržaja hema može biti najmanje oko 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, ili 1:40 ili manje. Molarni odnos sadržaja hema može biti najviše oko 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, ili 1:40 ili manje. Sadržaj hema može biti 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko, 15-struko, 20-struko, 30-struko, ili 40-struko ili više niži od sadržaja hema potpuno zauzetog sadržaja polipeptida (npr., polipeptid je 100% zauzet sadržajem hema). Sadržaj hema može biti 1-struko, 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko, 15-struko, 20-struko, 30-struko, ili 40-struko ili više viši od sadržaja hemom potpuno nezauzetog sadržaja polipeptida (npr., polipeptid je 0% zauzet sadržajem hema). Sadržaj hema je moguće odrediti brojem postupaka koji uključuju spektroskopiju (Raman, UV-Vis), elektronsku paramagnetnu rezonancu (EPR), oglede denaturacije proteina, oglede krađe hema, i oglede redukcije hema.

Postupci za korišćenje polipeptida u proizvodu u obliku mesa za ishranu ljudi

[0152] Opis obuhvata postupke za upotrebu polipeptida iz ovog opisa u proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi. Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može da se takmiči sa, dopuni ili zameni namirnice u obliku mesa na bazi zamena životinjskog porekla predviđene za ishranu ljudi. Na primer proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu biti kopije mesa mogu u potpunosti da budu iz biljnih izvora. Proizvode u obliku mesa za ishranu ljudi je moguće napraviti da oponašaju isečeno meso ili izgled mesa kako se sada prodaje. Na primer proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu biti vizuelno slični ili neprepoznatljivih razlika od mlevene govedine ili specifičnog isečenog komada govedine. Alternativno, proizvode u obliku mesa za ishranu ljudi je moguće napraviti sa jedinstvenim izgledom ili tako da su im slični. Na primer proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi bi mogli da obuhvate uzorke ili slova koji se zasnivaju na strukturi proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi. U nekim slučajevima proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu da izgledaju kao tradicionalni proizvodi od mesa po kojima se i pripremaju. Na primer proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu biti proizvodi koji su veći od tradicionalno isečenog komada govedine ali koje, pošto se proizvod za ishranu seče na komade i kuva izgleda kao tradicionalno kuvano meso. U nekim slučajevima proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu da liče na tradicionalni oblik mesa u dve dimenzije, ali ne u trećoj. Na primer, proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu ličiti na isečeni komad mesa u dve dimenzije (na primer kada se gleda odozgo), ali može biti mnogo duži (ili deblji) od tradicionalno isečenog komada. Proizvod za ishranu ljudi u obliku mesa (npr., zamena) može imati slične fizičke karakteristike kao tradicionalno meso (ukus, teksturu, jačinu, hranljive sastojke). U nekim slučajevima, proizvod za ishranu ljudi u obliku mesa može obuhvatiti sličnu karakteristiku gubitka pri kuvanju kao meso. U nekim varijantnim rešenjima proizvod za ishranu ljudi u obliku mesa obuhvata sličan sadržaj masnoća i proteina kao mleveno meso ima isto smanjenje veličine kada se kuva kao stvarno mleveno meso. Postupci za proizvodnju proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi su opisani u PCT/US2012/046560.

[0153] U nekim slučajevima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može obuhvatiti polipeptid iz ovog opisa. Polipeptid iz ovog opisa moguće je koristiti kao sredstvo za bojenje ili indikator kuvanja proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi.

[0154] U nekim slučajevima, opis opisuje postupak za ekspresiju polipeptida (npr., globin), u ćeliji domaćinu, izlučivanje tog polipeptida iz ćelije domačina, prečišćavanje izlučenog polipeptida, i mešanje prečišćenog polipeptida sa masnoćama i lipidima da bi se proizvela zamena za meso.

[0155] U nekim slučajevima, ovaj opis opisuje postupak za pospešivanje ekspresije endogenog polipeptida (npr., globin) u ćeliji domaćinu, prečišćavanje polipeptida iz ćelije, i mešanje prečišćenog polipeptida sa masnoćama i lipidima da bi se proizvela zamena za meso.

[0156] U nekim slučajevima, opis opisuje postupak za eksprimovanje polipeptida (npr.

globin), u ćeliji domaćinu (npr., biljka), prečišćavanje izlučenog polipeptida, i mešanje prečišćenog polipeptida sa masnoćama i lipidima da bi se proizvela zamena za meso.

Supstance

[0157] U nekim slučajevima, taj opis opisuje susptancu koja obuhvata polipeptid iz ovog opisa. Supstanca može da obuhvati podogu u koju je izlučen taj polipeptid. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% (tež./tež.) ili više podloge. Supstanca može da obuhvati najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% ili više podloge. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu podloge. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu podloge. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi podloge. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi podloge.

[0158] Supstanca može da obuhvati ćeliju domaćina (supstanca može da obuhvati ćeliju domaćina (npr., bakteriju). Ćelija domaćin supstance može da bude ćelija domaćin iz koje je polipeptid eksprimovan i/ili izlučen. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% (tež/tež) ili više ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi ćelija domaćina. Supstanca može da bude najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez ćelije domaćina. Supstanca može da bude najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez ćelije domaćina.

[0159] Supstanca može da obuhvati komponentu rekombinantne ćelije domaćina (npr., rekombinantne bakterijske ćelije ili biljne ćelije). Komponenta ćelije domaćina može da obuhvati, na primer, zid ćelije, podćelijsku pregradu (npr., Goldžijev (Golgi) kompleks, endoplazmni retikulum, ili nukleus), nukleinsku kiselinu, protein, genomsku DNK, i/ili plazma membranu. Za bakterijsku ćeliju, komponenta takođe može da obuhvati flagele (bičeve), i za biljku ili biljnu ćeliju, komponenta može da bude bilo koji deo biljke kao što je izdanak, stablo, seme, mahuna, list, tkivo ksilema, rozeta, koren. Komponenta ćelije domaćina može biti komponenta ćelije domaćina iz koje je taj polipeptid eksprimovan i/ili izlučen. Na primer, supstanca može obuhvatiti komponentu rekombinantne ćelije domaćina koja se ne javlja prorodno kao što je protein fuzije ili eksogena nukleinska kiselina. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% (tež/tež) ili više neke komponente neke ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu komponente bakterije. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 7, 9, ili 10% delova po milionu neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da bude najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da bude najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina.

Supstance proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi

[0160] U nekim slučajevima, supstanca iz ovog opisa može obuhvatiti proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i ćeliju domaćina (npr., bakteriju, deo bakterije, i/ili deo biljke). U nekim slučajevima, supstanca može još da obuhvati polipeptid iz ovog opisa. U nekim slučajevima supstanca obuhvata polipeptid i proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi (t.j., zamenu za meso) (kao što je opisano u PCT/US2012/046560).

[0161] Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može da se odnosi na proizvod sličan mesu (npr., zamenu za meso) koji nije napravljen od mesa. Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može da se odnosi na zamenu za meso koja je napravljena od proizvoda neživotinjskog porekla (npr., biljka). Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi mogu da budu kopije mesa napravljene potpuno iz biljnih izvora. Namirnice mogu takođe da budu napravljene iz kombinacije izvora na bazi biljke i izvora na bazi životinje. Proizvode u obliku mesa za ishranu ljudi je moguće napraviti da oponašaju isečeno meso ili izgled mesa kako se sada prodaje. Na primer proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu biti vizuelno slični ili neprepoznatljivih razlika od mlevene govedine ili specifičnog isečenog komada govedine. U nekim slučajevima proizvodi u obliku mesa za ishranu ljudi mogu da izgledaju kao tradicionalni proizvodi od mesa po kojima se i pripremaju. Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može pretežno ili potpuno da bude sačinjen od sastojaka izvedenih iz neživotinjskih izvora, a ipak da ponavlja ključna svojstva koja se povezuju sa kuvanjem i potrošnjom ekvivalentnom proizvodu od mesa izvedenom iz životinja.

[0162] Supstanca može da obuhvati neki proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i polipeptid iz ovog opisa. Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može obuhvatiti najmanje oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100% (tež/tež) jednog ili više polipeptida iz ovog opisa. U nekim slučajevima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može obuhvatiti najviše oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100% jednog ili više polipeptida iz ovog opisa.

Proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može obuhvatiti najmanje oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100% težine/zapremine jednog ili više polipeptida iz ovog opisa. U nekim slučajevima, proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može obuhvatiti najviše oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100% težine/zapremine jednog ili više polipeptida iz ovog opisa.

[0163] Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i ćeliju domaćina (npr., bakterija). Ćelija domaćin supstance može da bude ćelija domaćin iz koje je polipeptid eksprimovan i/ili izlučen. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% (tež/tež) ili više ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milionu ćelija domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milijardi ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i može da bude najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez ćelije domaćina.

[0164] Supstanca može da obuhvati deo proizvoda u obliku mesa za ishranu ljudi i sadržaj ćelije domaćina (npr., deo bakterije). Komponenta ćelije domaćina može da obuhvati zid ćelije, podćelijsku pregradu (npr., Goldžijev (Golgi) kompleks, endoplazmni retikulum, nukleus), flagelu, nukleinsku kiselinu, protein genomsku DNK, ili plazma membranu. Komponenta ćelije domaćina može biti deo neke bakterije iz koje je polipeptid eksprimovan i/ili izlučen. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% ili više delova ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milionu ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milion neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i može da bude najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina.

[0165] Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i komponentu ćelije domaćina (npr., biljke, npr., biljke duvana, t.j., Nicotiana tabacum vrsta ili biljke iz koje se dobija sojino zrno, t.j., Glycine max vrsta). U nekim slučajevima, ćelija domaćin nije Nicotiana biljka. Deo ćelije domaćina može da obuhvati zid ćelije, podćelijsku pregradu (npr., Goldžijev (Golgi) kompleks, endoplazmni retikulum, nucleus), izdanak, stablo, list, seme, mahunu, ksilem, rozetu, koren, nukleinsku kiselinu, protein, genomsku DNK, i plazma membranu. Komponenta ćelije domaćina može biti deo neke biljke iz koje je polipeptid eksprimovan i/ili izlučen. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% ili više neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10% neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milion neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milion neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i najviše oko 11, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 delova po milijardi neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i može biti najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina. Supstanca može da obuhvati proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi i može da bude najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% bez neke komponente neke ćelije domaćina.

[0166] U nekim slučajevima, ovaj opis opisuje proizvod u obliku mesa za ishranu ljudi može pretežno ili potpuno da bude sačinjen od sastojaka izvedenih iz neživotinjskih izvora, a ipak da ponavlja ključna svojstva koja se povezuju sa kuvanjem i potrošnjom proizvoda ekvivalentnog mesu izvedenom iz životinja. Proizvod ekvivalentan mesu može da bude neko belo meso ili neko tamno meso. Proizvod ekvivalentan mesu moguće je izvesti iz bilo koje životinje. Neograničavajući primeri životinja korišćenih da bi se izveo proizvod ekvivalentan mesu obuhvataju životinje sa farme kao što je, npr., stoka, ovca, svinja, kokoška, ćurka, guska, patka, konj, pas ili divljač (bilo divlja ili uzgajana) kao što je, npr., zec, jelen, bizon, bivo, vepar, zmija, fazan, prepelica, medved, severni jelen, antilopa, golub, grlica, tetreb, lisica, divlja svinja, koza, kengur, emi, aligator, krokodil, kornjača, nutrija, marmot, oposum, jarebica, veverica, rakun, kit, morski pas, noj, kapibara (iz familije morske prasadi), nutrija, morsko prase, pacov, miševi, voluharica, bilo koja vrsta insekta ili drugog zglavkara, morska hrana kao što je, npr. riba, rak, jastog, kamenica, dagnja, morska školjka (školjka svetog Jakova), morski puž (artropod), lignja, hobotnica, morski jež, plaštaš i druge. Veliki broj mesnih proizvoda se obično izvodi iz skeletnog mišića životinje ali se podrazumeva da meso može da bude i iz drugih mišića ili organa te životinje. U nekim slučajevima, proizvod ekvivalentan mesu se seče od mesa izvedenog iz skeletnog mišića. U nekim varijantama, proizvod ekvivalentan mesu je organ kao što je, npr., bubreg, srce, jetra, žučna kesa, creva, želudac, koštana srž, mozak, timus, pluća, jezik. S tim u skladu, u nekim slučajevima, supstance iz ovog pronalaska su potrošne supstance slične skeletnim mišićima ili organima.

[0167] U nekim slučajevima, opis opisuje proizvode koji su zamena za meso koji obuhvataju jednu ili više od prve supstance koja obuhvata kopiju mišićnog tkiva, druga supstanca obuhvata kopiju adipoznog tkiva, i/ili treća supstanca obuhvata kopiju vezivnog tkiva, pri čemu jedna ili više supstanci jesu kombinovane na način da se ponavlja fizička organizacija mesa. U drugim slučajevima, ovaj opis opisuje supstance za kopiju mišićnog tkiva (ovde se pominje kao ''kopija mišića''), kopiju adipoznog tkvia (ovde se pominje kao ''kopija masnoće''), i kopiju vezivnog tkiva (ovde se pominje kao 'kopija vezivnog tkiva''). U nekim slučajevima, supstance i proizvodi zamena za meso su u suštini ili u potpunosti sastavljeni od sastojaka izvedenih iz neživotinjskih izvora. U alternativnim varijantnim rešenjima su, mišić, masnoća, i/ili kopija vezivnog tkiva, ili proizvodi koji su zamena za meso obuhvataju jednu ili više od pomenutih kopija, delimično izvedeni iz životinja kao izvora ali su dopunjeni sastojcima izvedenim iz neživotinjskih izvora.

[0168] U nekim slučajevima, proizvodi od mesa mogu biti pretežno izvedeni iz životinja kao izvora ali koji su dopunjeni jednom ili više kopija mišićnog tkiva, kopija masnoće, i/ili kopija vezivnog tkiva, pri čemu te kopije mogu da budu izvedene pretežno ili potpuno iz neživotinjskih izvora. Neograničavajući primer mesnog proizvoda je proizvod nemasne mlevene govedine dopunjen sa kopijom masnoće izvedenom iz izvora koji nije životinja što može popraviti teksturu i ukus u ustima a da se očuvaju prednosti za zdravlje namirnice koja ima nizak sadržaj masnoće životinjskog porekla. Takva alternativna varijantna rešenja mogu kao rezultat imati proizvode sa svojstvima koja bliže ponavljaju ključne karakteristike povezane sa dobijanjem i potrošnjom mesa ali koje su manje skupe i dovode se u vezu sa manjim uticajem po životnu sredinu, manje utiču na dobrobit životinja, ili imaju poboljšane zdravstvene blagodati za potrošača.

[0169] Fizička organizacija proizvoda koji je zamena za meso može da bude manipulisana kontrolisanjem lokalizacije, organizacije, sklopa, ili orijentacije mišića, masnoće, i/ili kopija vezivnog tkiva opisanih ovde. U nekim slučajevima proizvod je projektovan na takav način da se ovde opisane kopije povezuju jedna sa drugom kao u mesu. U nekim slučajevima namirnica je projektovana tako da se posle kuvanja kopije opisane ovde povezuju jedna sa drugom kao u kuvanom mesu. U nekim varijantnim rešenjima, jedna ili više kopija mišića, masnoće, i/ili vezivnog tkiva se kombinuje na način koji ponavlja fizičku organizacju različitih odrezaka ili preparata od mesa. U jednom varijantnom rešenju, kopije se kombinuju na način koji približava fizičku organizaciju prirodnog samlevenog mesa. U drugim varijantnim rešenjima, kopije se kombinuju na način koji približava različite odreske govedine, kao što je, npr. filet minjona, londonski odrezak, između ostalog.

Indikatori za kuvanje mesa

[0170] U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog opisa je moguće koristiti u supstanci iz ovog opisa kao indikator za kuvanje mesa. Otpuštanje mirisa posle kuvanja je važan aspekt potrošnje mesa. U nekim varijantnim rešenjima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je karakteristična za kuvanu govedinu. U nekim slučajevima, namirnica kada je skuvana generiše aromu ljudima prepoznatljivu kao kuvanu svinjetinu. U nekim slučajevima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je uobičajena za kuvanu slaninu. U nekim slučajevima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je karakteristična za kuvanu piletinu. U nekim varijantnim rešenjima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je karakteristična za kuvanu jagnjetinu. U nekim slučajevima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je uobičajena za kuvanu ribu. U nekim slučajevima, namirnica je kopija mesa potpuno sastavljena od proizvoda koji ne potiču od životinja koji kada se skuvaju generišu aromu prepoznatljivu za ljude koja je karakteristična za kuvanu ćuretinu. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa u suštini ili u potpunosti napravljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji ne potiču od životinja, sa mirisom koji se otpušta posle kuvanja. U nekim varijantnim rešenjima namirnica je kopija mesa u principu ili u potpunosti napravljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji ne potiču od životinja, sa mirisom koji je proizveden hemijskim reakcijama koje se odvijaju posle kuvanja. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa u principu ili u potpunosti satavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji ne potiču od životinja, obuhvata polipeptid iz ovog opisa i mešavine proteina, peptida, aminokiselina, nukleotida, šećera i polisaharida i masnoća u kombinacijama i prostornim rasporedima koji omogućavaju ovim jedinjenjima da prođu hemijske reakcije tokom kuvanja da bi proizveli mirise i jedinjenja koja proizvode ukus. U nekim varijantnim rešenjima namirnica je kopija mesa u principu ili potpuno napravljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji ne potiču od životinja (npr., polipeptid iz ovog opisa), sa isparljvim ili nestabilnim mirisom koji se otpušta posle kuvanja. U nekim slučajevima namirnica je postupak za dobijanje kopije mesa pri čemu su kopije mesa u principu ili u potpunosti sačinjene od sastojaka izvedenih iz izvora koji ne potiču od životinja se zagrevaju da bi otpustili isparljiv ili nestabilni miris.

[0171] Mirisi otpušteni tokom kuvanja mesa se generišu reakcijama koje mogu obuhvatiti kao reaktante masnoće, protein, aminokiseline, peptide, nukleotide, organske kiseline, jedinjenja sumpora, šećere i druge ugljovodonike. U nekim slučajevima, reaktant može biti polipeptid iz ovog opisa (npr., globin, izlučeni globin). U nekim slučajevima mirisi koji se kombinuju tokom kuvanja mesa se identifikuju i lociraju jedan pored drugog u namirnici, tako da posle kuvanja namirnice ti mirisi kombinuju. U nekim varijantnim rešenjima, karakterističan ukus i miris komponenata se proizvode tokom postupka kuvanja hemijskim reakcijama koje obuhvataju aminokiseline, masnoće i šećere koji se nalaze u biljkama kao i u mesu. U nekim slučajevima, karakteristične komponente ukusa i mirisa se uglavnom proizvode tokom procesa kuvanja hemijskim reakcijama koje obuhvataju jednu ili više aminokiselina, masnoća, peptida, nukleotida, organskih kiselina, sumpornih jedinjenja, šećera i drugih karbohidrata koji se nalaze u biljkama kao i u mesu.

[0172] Neke reakcije koje generišu mirise otpuštene tokom kuvanja mesa moguće je katalizovati gvožđem, posebno gvožem hema, koji može biti sadržan (npr., vezan) polipeptidom iz ovog opisa). Dakle u nekim slučajevima, neke od karakterističnih komponenata ukusa i mirisa se proizvode tokom procesa kuvanja hemijskim reakcijama koje katalizuje gvožđe. Dakle u nekim varijantnim rešenjima, neke od karakterističnih komponenata ukusa i mirisa se proizvode tokom procesa kuvanja hemijskim reakcijama koje katalizuju gvožđe. U nekim slučajevima, neke od karakterističnih komponenata ukusa i mirisa se proizvode tokom procesa kuvanja hemijskim reakcijama koje su katalizovane gvožđem hema u leghemoglobinu. U nekim slučajevima, neke od karakterističnih komponenata ukusa i mirisa se proizvode tokom procesa kuvanja hemijskim reakcijama katalizovanim gvožđem hema u proteinu hema (npr., polipeptidima navedenim na Slici 9, hemoglobin, mioglobin, neuroglobin, citoglobin, leghemoglobin, nesimbiozni hemoglobin, globin I Hell-ovog prolaza (Hell’s gate), bakterijski hemoglobini, ciliat mioglobini , flavohemoglobini, androglobin, citoglobin, globin E, globin X, globin Y, mioglobin, leghemoglobini, eritrokruorini, beta hemoglobini, alfa hemoglobini, nesimbiozni hemoglobini, protoglobini, cijanoglobini, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobini, ciliat mioglobini, histoglobini i neuroglobini, itd).

Indikatori boje

[0173] Boja mesa je važan deo iskustva kuvanja i jedenja mesa. Na primer, odresci govedine imaju karakterističnu crvenu boju u sirovom stanju i postepeno prelaze u braon boju tokom kuvanja. Kao još jedan primer, bela mesa kao što je piletina ili svinjetina imaju karakterističnu roze boju u svom svežem satnju i postepeno prelaze u belu ili braonkastu boju tokom kuvanja. Količina prelaza boje se koristi da bi označila napredovanje kuvanja govedine i titriraju vreme kuvanja i temperaturu da bi se proizvelo željeno stanje pripremljenosti. Opis opisuje proizvod koji je zamena za meso a nije na bazi mesa koji obezbeđuje vizuelni indikator napredovanja kuvanja. U nekim slučajevima, vizuelni indikator je indikator boje koji prolazi prelaz boje tokom kuvanja. U specifičnim primerima, indikator boje ponavlja prelaz boje odreska mesa kako meso napreduje od sirovog do skuvanog stanja. U nekim varijantnim rešenjima, boje indikatora boje proizvod koji je zamena za meso u crvenu boju pre kuvanja da bi označili sirovo stanje i prouzrokovali da proizvod koji je zamena za meso poprimi braon boju tokom samog procesa kuvanja. U nekim slučajevima, boje indikatora boje proizvod koji je zamena za meso u roze boju pre kuvanja da bi označili sirovo stanje i prouzrokovali da proizvod koji je zamena za meso poprimi belu ili braon boju tokom samog procesa kuvanja.

[0174] Glavni determinant definicije hranljivosti boje mesa je koncentracija proteina koji nose gvožđe u tom mesu. U jednoj komponenti skeletnog mišića proizvoda od mesa, jedan od glavnih proteina koji nose gvožđe je mioglobin. Dakle, u nekim slučajevima, supstanca je namirnica od mesa (npr., kopija) koja obuhvata protein koji nosi gvožđe. U nekim varijantnim rešenjima, supstanca obuhvata oko 0,05%, oko 0,1%>, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 1.1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, oko 2%, ili više od oko 2% proteina koji nosi gvožđe prema suvoj težini ili ukupnoj težini. U nekim slučajevima, supstanca obuhvata najmanje oko 10% polipeptida iz ovog opisa. U nekim slučajevima, supstanca obuhvata najviše oko 10% polipeptida iz ovog opisa. U nekim slučajevima, protein koji nosi gvožđe je izolovan i prečišćen iz izvora. U drugim slučajevima, protein koji nosi gvožđe nije izolovan i prečišćen. U nekim slučajevima, izvor proteina koji nosi gvožđe ima kao izvor životinju, ili ima kao izvor nešto što nije životinja kao što je biljka, gljiva, ili genetički modifikovani organizmi kao što je, npr., bakterija ili kvasac. U nekim slučajevima, protein koji nosi gvožđe je mioglobin. U nekim slučajevima ta supstanca obuhvata namirnicu koja je kopija mesa na bazi biljke koja ima dodat životinjski mioglobin. Dakle, na primer kopija mlade govedine može imati oko 0,4-1%) mioglobina. U nekim slučajevima, protein koji nosi gvožđe je leghemoglobin. U nekim varijantim rešenjima ta supstanca obuhvata namirnicu koja je kopija mesa na bazi biljke koja ima dodat leghemoglobin. Dakle, na primer kopijakopij mlade govedine može imati oko 0,4-1%) leghemoglobina. U nekim slučajevima, protein koji nosi gvožđe je citohrom.

U nekim varijantim rešenjima ta supstanca obuhvata namirnicu koja je kopija mesa na bazi biljke koja ima dodat citohrom. Dakle, na primer kopija mlade govedine može imati oko 0,4-1%) citohroma. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa na bazi biljke koja obuhvata hemoglobin. U nekim slučajevima, protein koji nosi gvožđe je polipeptid iz ovog opisa (npr., globin).

[0175] Proteini koji sadrže dodatno gvožđe postoje u prirodi. U nekim slučajevima ta supstanca (npr., namirnica) obuhvata protein koji obuhvata gvožđe koji nije mioglobin. U nekim varijantnim rešenjima (npr., namirnica) koja ne obuhvata mioglobin. U nekim slučajevima te supstance (npr., namirnica) ne obuhvata hemoglobin. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa koja obuhvata protein koji obuhvata gvožđe koji nije mioglobin ili hemoglobin (npr., globini navedeni na Slici 9, i opisani ovde, npr., hemoglobin, mioglobin, neuroglobin, citoglobin, leghemoglobin, nesimbiozni hemoglobin, globin I Hell-ovog prolaza (Hell’s gate), bakterijske hemoglobine, mioglobine ciliata, flavohemoglobine).

[0176] U nekim slučajevima ta supstanca obuhvata namirnicu koja je kopija mesa u suštini ili u potpunosti sastavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji nisu životinja, uključujući kopiju mišićnog tkiva, kopiju adipoznog tkiva, kopiju vezivnog tkiva, i leghemoglobin. U nekim varijantnim rešenjima supstanca obuhvata namirnicu koja je u suštini kopija mesa ili je u potpunosti sastavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji nisu životinja, koji obuhvataju protein hema. U nekim slučajevima supstanca obuhvata namirnicu koja je u suštini kopija mesa ili je u potpunosti sastavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji nisu životinja, koji obuhvataju leghemoglobin. U nekim slučajevima supstanca obuhvata namirnicu koja je u suštini kopija mesa ili je u potpunosti sastavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji nisu životinja, koji obuhvataju element porodice proteina globina. U nekim slučajevima supstanca obuhvata namirnicu koja je u suštini kopija mesa ili je u potpunosti sastavljena od sastojaka izvedenih iz izvora koji nisu životinja, sa visokim sadržajem gvožđa. U nekim varijantnim rešenjima sadržaj gvožđa je sličan mesu. U nekim slučajevima, namirnica ima distinktivnu crvenu boju mesa, kao što je boja koju obezbeđuje leghemoglobin.

[0177] Leghemoglobin se, u nekim slučajevima koristi kao indikator da je za tu namirnicu završeno kuvanje. U nekim varijantnim rešenjima ovog opisa je opisan postupak za kuvanje namirnica koji obuhvata detektovanje hemoglobina koji je migrirao iz unutrašnjosti te namirnice na površinu kada je proizvod skuvan. U nekim varijantnim rešenjima ovog opisa opisan je postupak za kuvanje namirnice koji obuhvata detekovanje promene u boji od crvene do braon kada je proizvod skuvan.

[0178] Stanje oksidacije jona gvožđa u leghemoglobinu može biti važno zbog njegove boje. Leghemoglobin sa gvožđem hema u stanju 2 oksidacije može da ima intenzivno crvenu boju, dok leghemoglobin sa gvožđem hema u stanju 3 oksidacije može da ima braonkasto crvenu boju. Dakle, pri upotrebi leghemoglobina kao izvora crvene boje u replici mesa na primer, može biti poželjno da se smanji gvožđe hema iz stanja 3 u stanje 2. Gvožđe hema u leghemoglobinu moguće je promeniti iz oksidiranog (+3) stanja u redukovano (+2) stanje sa redukujućim reagensima.

[0179] Protein hem može, u nekim slučajevima, da se koristi kao indikator da je za tu namirnicu završeno kuvanje. U nekim je opisan postupak za kuvanje namirnica koji obuhvata detektovanje hemoglobina koji je migrirao iz unutrašnjosti te namirnice na površinu kada je proizvod skuvan. U nekim slučajevima, opisan je postupak za kuvanje namirnice koji obuhvata detekovanje promene u boji od crvene do braon kada je proizvod skuvan.

[0180] Protein hema (npr., hemoglobin, mioglobin, neuroglobin, citoglobin, leghemoglobin, nesimbiotski hemoglobin, globin I Helovog prolaza (Hell’s gate), bakterijski hemoglobini, mioglobini ciliata, flavohemoglobini), mogu biti, u nekim slučajevima, korišćeni kao indikator da je za tu namirnicu završeno kuvanje. Dakle, u nekim slučajevima, opisan je postupak za kuvanje namirnica koji obuhvata detektovanje hemoglobina koji je migrirao iz unutrašnjosti te namirnice na površinu kada je proizvod skuvan. Ovaj opis opisuje postupak za kuvanje namirnice koji obuhvata detekovanje promene u boji od crvene do braon kada je proizvod skuvan.

Prehrambene namirnice koje obuhvataju prečišćeni polipeptid

[0181] U nekim slučajevima polipeptid iz ovog opisa (npr., polipeptid koji obuhvata hem, globin kao što je leghemoglobin) je dodat u meso da bi se pospešila svojstva mesa. Videti, na primer, WO 2014/110532, WO 2014/110539, i WO 2013/010042. Na primer, rastvor koji obuhvata polipeptid može biti injektiran u sirovo ili skuvano meso. U nekom drugom primeru rastvor koji obuhvata polipeptid iz ovog opisa se nakapa preko mesa ili namirnice da bi se pospešio izgled. U nekim slučajevima reklamiranje, fotografisanje, ili videografisanje prehrambenih proizvoda kao što je meso ili zamena za meso se pospeši sa leghemoglobinom.

[0182] Polipeptidi, na primer leghemoglobin i hemoglobin, mogu biti kombinovani sa drugim komponenatama kopije mesa na bazi biljke. U nekim slučajevima polipeptidi se uhvate u gel koji obuhvata druge komponente, na primer lipide i/ili proteine. U nekim slučajevima više gelova se kombinuje sa proteinima hema koji nisu na bazi gela. U nekim slučajevima kombinacija polipeptida i drugih jedinjenja namirnice se radi da bi se osiguralo da proteini hema mogu da se difuziraju kroz tu namirnicu. U nekim varijantnim rešenjima namirnica obuhvata rastvor koji obuhvata protein hema, na primer rastvor leghemoglobina. U nekim slučajevima namirnica se potopi u rastvor koji obuhvata protein hema, na primer rastvor leghemoglobina tokom 1, 5, 10, 15, 20 ili 30 sati. U nekim varijantnim rešenjima, namirnica se potopi u rastvor koji obuhvata hem, na primer rastvor leghemoglobina tokom 1, 5, 10, 15, 30, ili 45 minuta.

Kopije mišića

[0183] Veliki broj proizvoda od mesa obuhvata visoki udeo skeletnih mišića. Sa tim u skladu, ovaj opis opisuje supstancu izvedenu iz izvora koji nisu životinja koji kopiraju ili se približavaju ključnim karakteristikama skeletnog mišića životinje. Ovaj opis takođe opisuje proizvod koji je zamena za meso koji obuhvata supstancu izvedenu iz izvora koji nisu životinja koja umnožava ili se približava izgledu skeletnog mišića životinje. Takva će supstanca ovde biti označena kao "kopija mišića". U nekim slučajevima, kopija mišića i/ili proizvod zamena za meso koji obuhvata kopiju mišića su delimično izvedeni iz izvora koji je životinja. U nekim slučajevima, kopija mišića i/ili proizvod zamena za meso koji obuhvata kopiju mišića su potpuno izvedeni iz izvora koji nije životinja.

[0184] Brojni proizvodi od mesa obuhvataju visok udeo izbrazdanog skeletnog mišića u kom su pojedinačna mišićna vlakna organizovana uglavnom na izotropni način. S tim u skladu, u nekim varijantnim rešenjima kopija mišića obuhvata vlakna koja su u nekoj meri organizovana izotropno. U nekim slučajevima vlakna obuhvataju komponentu proteina. U nekim slučajevima, vlakna obuhvataju oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%), oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više komponente proteina. Skeletni mišić životinje obično obuhvata oko 1% mioglobina, ali može da bude i 7% mišićne mase u nekim mišićima kita. U nekim varijantnim rešenjima kopija mišića obuhvata hemoglobine iz ovog opisa.

[0185] U nekim slučajevima, komponenta proteina obuhvata jedan ili više izolovanih, prečišćenih proteina. Na primer jedan ili više izolovanih, prečišćenih proteina može da obuhvati 8S globulin iz semena zlatnog mung pasulja, ili belančevina ili frakcije globulina iz semena graška. Ovi proteini obezbeđuju primere proteina sa poželjnim svojstvima za konstruisanje kopija mesa zbog njihove sposobnosti da formiraju gelove sa teksturama mišiću ili masnom tkivu životinje. Primeri jednog ili više izolovanih, prečišćenih proteina su opisani ovde. Spisak potencijalnih kandidata ovde je u suštini otvoren i može da obuhvata Rubisco, bilo koje proteine pohranjene u većem semenu, proteine izolovane iz gljiva, bakterija, arheja, virusa, ili genetički projektovanih mikroorganizama, ili in vitro sintetisanih. Ovi proteini mogu biti veštački projektovani da emuliraju fizička svojstva tkiva mišića životinje. Ovi proteini mogu biti veštački projektovani da emuliraju fizička svojstva tkiva mišića životinje. U nekim varijantnim rešenjima, jedan iil više izolovanih proteina, prečišćenih proteina iznosi oko 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili više proteinske komponente prema težini.

[0186] Skeletni mišić životinja kao što je goveče obično obuhvata značajne količine glikogena, koje mogu da budu reda veličine od 1%> mase mišićnog tkvia u vreme klanja. Posle klanja, frakcija ovog glikogena i dalje ostaju proizvodi koji daju metabolisani prinos uključujući mlečnu kiselinu, što doprinosi sniženju pH vrednosti mišićnog tkiva, poželjnog kvaliteta za meso. Glikogen je razgranati polimer glikoze povezan sa alfa (1->4) glikozidnim vezama u linearnim lancima, sa tačkama granjanja koje obuhvataju alfa (1->6) glikozidne veze. Skrobovi iz biljaka, posebno amilopektina su takođe razgranati polimeri glikoze povezani međusobno alfa (1->4) glikozidnim vezama u linearnim lancima, sa tačkama granjanja koje obuhvataju alfa (1->6) glikozidne veze i mogu samim tim da budu korišćene kao analog glikogena za konstruisanje kopija mesa. Dakle u nekim slučajevima, mišić ili kopija mesa obuhvata skrob ili pektin.

[0187] Dodatne komponente tkiva mišića životinje obuhvataju natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, druge metale jona, mlečnu kiselinu, druge organske kiseline, slobodne aminokiseline, peptide, nukleotide i jedinjenja sumpora. Dakle u nekim slučajevima, kopija mišića može da obuhvati natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, druge jone metala, mlečnu kiselinu, druge organske kiseline, slobodne aminokiseline, peptide, nukleotide i jedinjenja sumpora. U nekim slučajevima, koncentracija natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, drugih jona metala, mlečne kiseline, drugih organskih kiselina, slobodnih aminokiselina, peptida, nukleotida i/ili jedinjenja sumpora u replici mišića ili namirnici su unutar 10%> od koncentracija pronađenih u mišiću ili mesu koje se replicira.

[0188] Ovaj opis opisuje postupke za pravljenje kopije mišića. U nekim slučajevima, supstanca se formira u asimetrična vlakna pre inkorporiranja u namirnicu. U nekim slučajevima ova vlakna kopiraju vlakna mišića. U nekim slučajevima vlakna su upletena vlakna. U drugim varijantnim rešenjima vlakna su ekstrudirana vlakna. S tim u skladu, ovaj opis opisuje postupke za proizvodnju asimetričnih ili upletenih vlakana proteina. U nekim slučajevima, vlakna se formiraju ekstruzijom komponente proteina kroz ekstruder.

[0189] U nekim slučajevima ekstruziju je moguće izvesti korišćenjem MPF19 ekstrudera sa dva puža (APV Baker, Grand Rapids, Mich.) sa listom za hlađenje. List za hlađenje može da ohladi ekstrudat pre vraćanja ekstrudata u atmosferski pritisak, čime se pretežno inhibira ekspanzija ili bubrenje krajnjeg proizvoda. U aparatu MPF19, suvi dovod i tečnost mogu biti dodati odvojeno i pomešani u cevi. Parametri ekstruzije mogu biti, na primer, brzina puža od 200 ob./min., temperatura proizvoda na mestu lista od 150 C, brzina dovoda od 23 g/min, i brzina protoka vode od 11 g/min. Temperaturu proizvoda je moguće izmeriti tokom ekstruzije pomoću termospojnice na kraju ekstruzione cevi. Zapažanja je moguće napraviti o boji, zamućenosti, strukturi, i teksturi za svaki prikupljeni uzorak. Prikupljene uzorke je moguće opciono osušiti na sobnoj temperaturi tokom noći, zatim samleti u fin prah (<60 mrežica) korišćenjem Braun seckalice za hranu. Vrednosti pH uzoraka moguće je izmeriti u duplikatu upotrebom 10% (tež./zap.) emulzija u praškastom uzorku u destilovanoj vodi.

Kopija masnoće

[0190] Životinjska mast je važna za iskustvo jedenja skuvanog mesa. Sa tim u skladu, ovaj opis opisuje supstancu izvedenu iz izvora koji nisu životinja koji ponavljaju ključne karakteristike životinjske masti. Pored toga ovaj opis opisuje proizvod koji je zamena za meso koji obuhvata supstancu izvedenu iz izvora koji nije životinja koji liči na životinjsku mast. Takva supstanca će biti označena ovde kao ''kopija masti''. U nekim slučajevima, kopija masti i/ili proizvod zamena za meso koji obuhvata kopiju masti su delimično izvedeni iz izvora koji je životinja.

[0191] U nekim slučajevima proizvod koji je zamena za meso ima komponentu masti. U nekim slučajevima sadržaj masti namirnice je 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ii 60%) masti. U nekim varijantnim rešenjima, kopija masti obuhvata gel sa kapljicama masti koje su ubačene u njega. U nekim slučajevima, gel je mek, elastičan gel koji obuhvata proteine i opciono ugljenohidrate. U specifičnim varijantnim rešenjima, proteini korišćeni u gelu su biljni ili mikrobni proteini. U nekim slučajevima, proteini korišćeni u replici masti mogu obuhvatiti Rubisco, bilo koje proteine pohranjene u većem semenu, proteine izolovane iz gljiva, bakterija, arheja, virusa, ili genetički projektovanih mikroorganizama, ili in vitro sintetisanih. Ovi proteini mogu biti veštački projektovani da oponašajući dostižu (emuliraju) fizička svojstva životinske masti. Ovi proteini mogu biti veštački projektovani da oponašajući dostižu fizička svojstva životinske masti.

[0192] Kapljice masti korišćene u nekim varijantnim rešenjima iz ovog opisa mogu biti iz različitih izvora. U nekim slučajevima, ti izvori nisu životinjskog porekla. U specifičnim primerima, izvori su biljnog porekla. Neograničavajući primeri ulja obuhvataju kukuruzno ulje, maslinovo ulje, sojino ulje, kikiriki ulje, ulje lešnika, bademovo ulje, susamovo ulje, ulje semena pamuka, ulje semena repice, kanola ulje, šafranovo ulje, suncokretovo ulje, ulje semena lana, ulje morskih algi, palmino ulje, ulje palminog jezgra, ulje kokosa, ulje babasu, puter vitelarije (ši), mango puter, kakako puter, ulje pšeničnih klica, ulje pirinčane pleve, ulje proizvedeno pomoću bakterija, algi, arheja ili gljiva ili genetički modifikovanih bakterija, aligi, arheja ili gljiva, triglicerida, monoglicerida, diglicerida, sfingozida, glikolipide, lecitin, lizolecitin, fosfatidinskih kiselina, lizofosfatidinskih kiselina, oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske (pelargonske) kiseline, undekanoinske kiselne, linoleinske kiseline, 20:1 arahidinske kiseline (eikozanoinska kiselina), arahidinske kiseline undekanoinske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozaheksaenoinska kiselina, 18:2 konjugovana linolna kiselina, konjugovana oleinska kiselina, ili estri od: oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske (pelargonijske) kiseline, undekanoinske kiseline, liolne kiseline, 20:1 arahidinske kiseline (eikozanoinske kiseline), arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozoheksaenoinske kiseline, 18:2 konjugovane linolne kiseline, ili konjugovane oleinske kiseline, ili glicerol estara oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske (pelargonske) kiseline, undekanoinske kiseline, linolne kiseline, 20:1 arahidinske kiseline (eikozanoinske kiseline), arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozohekaenoinske kiseline, 18:2 konjugovane linolne kiseline, ili konjugovane oleinske kiseline, ili derivati triglicerida oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske kiseline (pelargonske kiseline), undekanoinske kiseline, linolne kiseline, 20:1 eikozanoinske kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozohekaenoinske kiseline, 18:1 konjugovane linolne kiseline, ili konjugovane oleinske kiseline.

[0193] U nekim slučajevima, kapljice masti se izvode iz ulja pulpe ili semena. U drugim slučajevima izvor mogu biti kvasac ili mahovina (buđ). Na primer, u jednom varijantnom rešenju kapljice masti obuhvataju trigliceride izvedene iz Mortierella isabellina.

[0194] U nekim varijantnim rešenjima biljna ulja se modifikuju da liče na životinjske masti. Biljna ulja je moguće modifikovati aromom ili drugim sredstvima da bi podsetila na ukus i miris mesa tokom i posle kuvanja. S tim u skladu, neka varijantna rešenja ovog opisa obuhvataju postupke za testiranje kvalitativne sličnosti između osobenosti kuvanja životinjske masti i osobenosti kuvanja biljnih ulja u nekoj namirnici.

[0195] U nekim slučajevima, kopija masti obuhvata komponentu proteina koja obuhvata jedan ili više izolovanih, prečišćenih proteina. Prečišćeni proteini doprinose ukusu i teksturi kopije mesa. U nekim varijantnim rešenjima prečišćeni proteini mogu stabilizovati emulzifikovane masti. U nekim slučajevima prečišćeni proteini mogu formirati gelove posle denaturacije ili enzimskog umrežavanja, koji kopiraju izgled i teksturu životinjske masti. Primeri i varijante jednog ili više izolovanih, prečišćenih proteina su opisani ovde. U specifičnim slučajevima, jedan ili više izolovanih proteina obuhvata protein izolovan iz familije mahunarki. Neograničavajući primeri mahunarki su opisani ovde, iako su moguće varijacije sa drugim mahunarkama. U nekim slučajevima, mahunarka je biljka graška. U nekim slučajevima izolovani prečišćeni proteini stabilizuju emulzije. U nekim slučajevima izolovani prečišćeni proteini formiraju gelove posle umrežavanja ili enzimskog umrežavanja. U nekim varijantnim rešenjima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju proteine pohranjene u semenu. U nekim slučajevima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju belančevinu. U nekim slučajevima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju globulin. U specifičnom varijantnom rešenju, izolovani, prečišćeni protein je prečišćeni protein belančevine graška. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, izolovani, prečišćeni protein je prečišćeni protein globulin graška. U drugom specifičnom varijantnom rešenju izolovani prečišćeni protein je 8S globulin zlatnog mung pasulja. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, izolovani, prečišćeni protein je oleosin. U jednom drugom specifičnom varijantnom rešenju, izolovani, prečišćeni protein je kaloleosin. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, izolovani, prečišćeni protein je Rubisko. U nekim varijantnim rešenjima, komponenta proteina obuhvata oko 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili više kopije masti prema suvoj težini ili ukupnoj težini. U nekim varijantnim rešenjima, komponenta proteina obuhvata oko 0,1-5%, oko 0,5-10%, oko 1-20%, oko 5-30%, oko 10-50%, oko 20-70%, ili oko 30-90% ili više kopije masti prema suvoj težini ili ukupnoj težini. U nekim varijantnim rešenjima, komponenta proteina obuhvata rastvor koji obuhvata jedan ili više izolovanih, prečišćenih proteina.

[0196] U nekim slučajevima, kopija masti obuhvata umrežavanje enzima koji katalizuju reakcije koje vode do kovalentnih umrežavanja između proteina. Umrežavanje enzima moguće je koristiti da bi se stvorila i stabilizovala željena struktura i tekstura kopije adipoznog tkiva, da bi se oponašala željena tekstura ekvivalenta željene životinjske masti. Neograničavajući primeri umrežavanja enzima obuhvataju, npr., transglutaminaze, lizil oksidaze, ili druge oksidaze amina (npr. Pichia pastoris lizil oksidaze). U nekim slučajevima, umreženi enzimi se izoluju i prečiste iz izvora koji nije životinjskog porekla, čiji su primeri i verzije ovde opisani. U nekim slučajevima, kopija masti obuhvata najmanje 0,0001%, ili najmanje 0,001%, ili najmanje 0,01%, ili najmanje 0,1%, ili najmanje 1% (tež./zapr.) umreženog enzima. U specifičnim varijantnim rešenjima, umreženi enzim je transglutaminaza.

[0197] Ovaj opis još opisuje postupke za pravljenje kopije masti. U nekim slučajevima, kapljice masti su umetnute u nekom gelu. U nekim varijantnim rešenjima ovaj opis opisuje postupke za proizvodnju kapljica masnoće umetnutih u gel. Ovu masnoću je moguće izolovati i homogenizovati. Na primer mešavina organskog rastvarača može biti korišćena da se pomogne mešanje lipida. Rastvarač je zatim moguće ukloniti. U ovoj tački lipid može biti zamrznut, liofilisan, ili skladišten. Zato u nekim varijantnim rešenjima ovaj opis opisuje postupak za izolovanje i skladištenje lipida koji je izabran da ima karakteristike slične karakteristikama životinjske masti. Tečna tankoslojna obloga ili pogača može zatim da bude hidrirana. Hidracija može da koristi mešanje ili promene temperature. Hidracija može nastati u rastvoru prekursoru gela. Posle hidatacije, suspenzija lipida može da bude sonikovana ili ekstrudirana da bi dodatno promenila svojstva lipida u tom rastvoru.

[0198] U nekim slučajevima, kopija masti se sklopi da bi se približila organizaciji adipoznog tkiva u mesu. U nekim slučajevima neke ili sve od komponenata kopije masti su ubačene u gel. U različitim varijantnim rešenjima gel može biti belančevinasti gel, hidrogel, organogel, ili kserogel. U nekim varijantnim rešenjima, gel može biti zgušnjen do željene konzistencije korišćenjem sredstva na bazi polisaharida ili proteina. Na primer biljni skrob (fekula), arourut, kukuruzni skrob, katakuri skrob, krompirov skrob, sago, tapioka, alginin, guar guma, karuba guma, ksantan guma, kolagen, belance jaja, furcelaran, želatin, agar, karageenan, celuloza, metilceluloza, hidroksimetilceluloza, akadija guma, konjak, skrob, pektin, amilopektin ili proteini izvedeni iz mahunarki, zrna, orašastih plodova, drugih semena, listova, algi, bakterija, gljiva moguće je koristiti same ili u kombinaciji sa zgusnutim gelom, formiranje arhitekture ili strukture za namirnicu.

[0199] U specifičnim varijantnim rešenjima, kopija masti je emulzija koja obuhvata rastvor jednog ili više proteina i jedne ili više masti ubačenih kao kapljice. U nekim slučajevima, emulzija se stabilizuje jednim ili vše enzima koji se umrežavaju u gel. U nekim slučajevima, jedan ili više proteina u rastvoru su izolovani, prečišćeni proteini. U nekim slučajevima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju prečišćenu frakciju obogaćenu belančevinom graška. U nekim slučajevima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju prečišćenu frakciju obogaćenu globulinom graška. U nekim slučajevima, prečišćeni proteini obuhvataju prečišćenu frakciju obogaćenu globulinom 8S zlatnog mung pasulja. U nekim slučajevima, izolovani, prečišćeni proteini obuhvataju Rubisco obogaćenu frakciju. U nekim slučajevima, jedna ili više masti se izvodi iz ulja na bazi biljaka. U nekim slučajevima, jedna ili više masti se izvodi iz jednog ili više od: kukuruznog ulja, maslinovog ulja, sojinog ulja, kikirikijevog ulja, orahovog ulja, bademovog ulja, susamovog ulja, ulja semena pamuka, ulja semena repice, kanola ulja, šafranovog ulja, suncokretovog ulja, ulja semena lana, alginog ulja, palminog ulja, ulja palminog jezgra, kokosovog ulja, babasu ulja, putera vitelarije (ši), mango putera, kakao putera, ulja pšeničnih klica, ulja pirinčanih mekinja (pleve), ulja proizvedenih od bakterija, algi, arheja ili gljiva ili genetički modifikovanih bakterija, algi, arheja ili gljiva, triglicerida, monoglicerida, diglicerida, sfingozida, glikolipida, lecitina, lizolecitina, fosfatidinskih kiselina, lizofosfatidinskih kiselina, oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, pelargonske kiseline, undekanoinske kiseline, linolne kiseline, 20: 1 eikozanoinske kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozaheksaenoinske kiseline, 18:2 konjugovane linolne kiseline, konjugovane oleinske kiseline, ili estara iz: oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kisleine, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske (pelargonske) kiseline, undekanoinske kiseline, liolne kiseline, 20: 1 eikozanoinske kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozoheksaenoinske kiseline, 18:2 konjugovane linolne kiseline ili konjugovane oleinske kiseline, ili glicerol estara oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske (pelargonske) kiseline, undekanoinske kiseline, linolne kiseline, 20: 1 eikozanoinske kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozohekaenoinske kiseline, 18:2 konjugovane linolne kiseline, ili konjugovane oleinske kiseline, ili derivata triglicerida oleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, palmitinske kiseline, miristinske kiseline, laurinske kiseline, miristoleinske kiseline, kaproinske kiseline, kaprinske kiseline, kaprilne kiseline, nonanske kiseline (pelargonske kiseline), undekanoinske kiseline, linolne kiseline, 20: 1 eikozanoinske kiseline, arahidonske kiseline, eikozapentanoinske kiseline, dokozohekaenoinske kiseline, 18:1 konjugovane linolne kiseline ili konjugovane oleinske kiseline. U još nekim specifičnijim varijantim rešenjima, jedna ili više masti je ulje pirinčanih mekinja. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, jedna ili više masti je kanola ulje. U nekim varijantnim rešenjima, umreženi enzim je transglutaminaza, lizil oksidaza, ili druga amin oksidaza. U nekim varijantnim rešenjima, umreženi enzim je transglutaminaza. U specifičnim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina prečišćene belančevine graška emulzifikovane sa 40-80% ulja prinčanih mekinja, stabilizovano sa 0,5-5% (tež./zap.) transglutaminaze u gel. U specifičnim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina delimično prečišćenog 8S globulina zlatnog mung pasulja emulzifikovane sa 40-80%) ulja prinčanih mekinja, stabilizovane sa 0,5-5% (tež./zap.) transglutaminaze u gel. U nekim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina delimično prečišćenog 8S globulina zlatnog mung pasulja emulzifikovanog sa 40-80%) kanola ulja, stabilizovana sa 0,5-5% (tež./zap.) transglutaminaze u gel. U nekim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina prečišćene belančevine graška emulzifikovane sa 40-80%> ulja prinčanih mekinja, stabilizovana sa 0,0001-1% (tež./zap.) transglutaminaze u gel. U nekim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina delimično prečišćenog 8S globulina zlatnog mung pasulja emulzifikovana sa 40-80%) ulja prinčanih mekinja, stabilizovana sa 0,0001% (tež./zap.) transglutaminaze u gel. U nekim varijantnim rešenjima kopija masti je veoma masna emulzija koja obuhvata rastvor proteina delimično prečišćenog 8S globulina zlatnog mung pasulja emulzifikovana sa 40-80%) kanola ulja, stabilizovana sa 0,0001-1% (tež./zap.) transglutaminaze u gel.

Kopija vezivnog tkiva

[0200] Vezivno tkivo životinje obezbeđuje ključne teksturalne karakteristike koje su važna komponenta iskustva konzumacije mesa. Sa tim u skladu, ovaj opis opisuje supstancu izvedenu iz izvora koji nisu životinja koja ponavlja ključne karakteristike vezivnog tkiva životinje. Ovaj opis još objašnjava proizvod koji je zamena za meso koji obuhvata supstancu izvedenu iz izvora neživotinjskog porekla koji ponavlja najvažnije teksturne i vizuelne odlike vezivnog tkiva životinje. Takva supstanca će ovde biti označena kao "kopija vezivnog tkiva". U nekim varijantnim rešenjima, kopija vezivnog tkiva, i/ili proizvoda koji je zamena za meso, obuhvata kopiju vezivnog tkiva su delimično izvedeni iz izvora životinjskog porekla.

[0201] Vezivno tkivo životinje moguće je generalno podeliti u fascija tip tkiva i hrskavični tip tkiva. Fascija tip tkiva je visoko vlaknasta, otporna protiv izdužavanja (ima visok modulus elastičnosti), i ima visok sadržaj proteina, umereni sadržaj vode (oko 50%), i nizak do nikakav sadržaj masti i polisaharida. Prema tome, ovaj pronalazak opisuje kopiju vezivnog tkiva koja ponavlja ključne osobenosti tkiva fascija tipa. U nekim slučajevima, kopija vezivnog tkiva obuhvata oko 50% proteina ukupne težine, oko 50% težine tečnosti, i ima nizak sadržaj komponente masti i polisaharida.

[0202] Sadržaj proteina većine vezivnih tkiva fascija tipa se uglavnom sastoji od kolagena. Kolagen karakteriše visoka frakcija prolina i alanina, i takođe je sklopljen u karakteristične izdužene fibrile ili štapićaste, fleksibilne strukture. Prolamini su jedna familija proteina koja se nalazi u izvorima koji nisu životinjskog porekla, kao što su biljke. Prolamini su veoma obilno prisutni u biljkama i slični su kolagenu u sastavu aminokiseline. Među proteinima koje smo testirali u ovu svrhu, prolamini su bili specifično pogodni zbog njihove niske cene i sposobnosti da lako formiraju vlakna ili ploče kada se upletu ili ekstrudiraju. Neograničavajući primeri familije proteina prolamina obuhvataju, npr., zein (nalazi se u kukuruzu), ovi obuhvataju hordein iz ječma, gliadin iz pšenice, sekalin, ekstenzine iz raži, kafirin iz sirka, avenin iz ovsa. U vezivnom tkivu fascia tipa, familija proteina prolamina, pojedinačno ili u kombinacijama, pokazuje pogodnost za komponentu proteina jer su visoko obilni, slični globalnom sastavu aminokiseline prema kolagenu (visoka frakcija prolina i alanina), i pogodni su za preradu u tankoslojne obloge i vlakna. Pored zeina (koji se nalazi u kukuruzu), oni obuhvataju i hordein iz ječma, gliadin iz pšenice, sekalin, ekstenzine iz raži, kafirin iz sirka, avenin iz ovsa. Drugi proteini mogu biti neophodni da dopune prolamine da bi podstigli ciljne specifikacije za psihohemijska i hranljiva svojstva. Spisak potencijalnih kandidata ovde je u suštini otvoren i može da obuhvata Rubisco, bilo koje proteine pohranjene u većem semenu, proteine izolovane iz gljiva, bakterija, arheja, virusa, ili genetički projektovanih mikroorganizama, ili in vitro sintetisanih. Proteini mogu biti veštački projektovani da emuliraju fizička svojstva vezivnog tkiva životinja, iz životinje izveden ili rekombinantni kolagen, ekstenzine (hidroksiprolinom bogate glikoproteine kojih ima u izobilju u zidovima ćelije npr.

Arabidopsis thaliana, monomere koji su "kolagenu slični" štapićasti fleksibilni molekuli). Ovi proteini mogu biti veštački projektovani da emuliraju fizička svojstva vezivnog tkiva životinje.

[0203] Postupci za formiranje vezivnog tkiva fascija tipa će biti oni koji su ispitivani u ovoj oblasti uz sklonost prema postupcima koji proizvode vlaknaste ili vlaknima slične strukture biološkim, hemijskim, ili fizičkim sredstvima, pojedinačno ili u kombinaciji, serijski ili paralelno, pre konačnog formiranja. Ovi postupci mogu obuhvatiti ekstruziju ili vrtloženje.

[0204] Tkivo tipa hrskavice može da bude makroskopski homogeno, otporno protiv sabijanja, ima viši sadržaj vode (najviše 80%), niži sadržaj proteina (kolagen), i visoke sadržaje polisaharida (proteoglikana) (oko.10% svaki).

[0205] Što se tiče strukture, vezivno tkivo tipa hrskavice može biti veoma slično vezivnom tkivu fascija tipa sa relativnim odnosima svakog podešenim prema što bližoj kopiji vezivnog tkiva 'mesa'.

[0206] Postupci za formiranje vezivnog tkiva tipa hrskavice mogu biti slični onima za vezivno tkivo fascija tipa, ali sa naklonošću prema postupcima koji proizvode izotropno homogene strukture.

[0207] Mast može biti suspendovana u gel. Ovaj opis opisuje postupke za proizvodnju kapljica masti umetnutih u proteinasti gel. Mast može biti izolovana iz tkiva biljke i emulzifikovana. Emulzifikacija može da koristi sjedinjavanje velikom brzinom, homogenizaciju, mešanje ili promene temperature. Suspenzija lipida može da bude sonikovana ili ekstrudirana da bi dodatno promenila svojstva lipida u tom rastvoru. U ovoj tački, u nekim slučajevima druge komponente namirnica se dodaju u rastvor posle čega sledi sredstvo za želiranje. U nekim slučajevima sredstva za umrežavanje (npr. transglutaminaze ili lizil oksidaze) se dodaju da bi se vezale komponente namirnice. U drugim varijantnim rešenjima sredstvo za želiranje je dodato i suspenzija lipida/gela je kasnije kombinovana sa dodatnim komponentama namirnice. U vezivnom tkivu fascia tipa, familija proteina prolamina, pojedinačno ili u kombinacijama, pokazuje pogodnost za komponentu proteina jer su visoko obilni, slični globalnom sastavu aminokiseline prema kolagenu (visoka frakcija prolina i alanina), i pogodni su za preradu u tankoslojne obloge. Pored zeina (koji se nalazi u kukuruzu), oni obuhvataju i hordein iz ječma, gliadin iz pšenice, sekalin, ekstenzine iz raži, kafirin iz sirka, avenin iz ovsa. Drugi proteini mogu biti neophodni da dopune prolamine da bi podstigli ciljne specifikacije za psihohemijska i hranljiva svojstva. Spisak potencijalnih kandidata ovde je u suštini otvoren i može da obuhvati sve proteine pohranjene u većem semenu, iz životinje izveden ili rekombinantni kolagen, ekstenzine (hidroksiprolinom bogate glikoproteine obilne u zidovima ćelije npr. Arabidopsis thaliana, monomere kojih su "bez kolagena" štapiću slični fleksibilni molekuli).

[0208] U nekim slučajevima neke ili sve komponente namirnice su umetnute u gel. U različitim slučajevima gel može da bude hidrogel, organogel, ili kserogel. Gel može da bude napravljen gustim upotrebom sredstva na bazi polisaharida ili proteina. Na primer biljni skrob (fekula), arourut, kukuruzni skrob, katakuri skrob, krompirov skrob, sago, tapioka, alginin, guar guma, karuba gumu, ksantan gumu, kolagen, belance jaja, furcelaran, želatin, agar, karageenan, celulozu, metilcelulozu, hidroksimetilcelulozu, akadija gumu, konjak, skrob, pektin, amilopektin ili proteine izvedene iz mahunarki, zrna, orašastih plodova, drugih semena, listova, algi, bakterija, gljiva moguće je koristiti same ili u kombinaciji sa zgusnutim gelom, formiranje arhitekture ili strukture za namirnicu. Enzimi koji katalizuju reakcije vode do kovalentnih umrežavanja između proteina moguće je takođe koristiti same ili u kombinaciji da bi se formirala arhitektura ili struktura za namirnicu. Na primer transglutaminaze, lizil oksidaze, ili druge amin oksidaze (npr. Pichia pastoris lizil oksidaza (PPLO)) moguće je koristiti same ili u kombinaciji da formiraju arhitekturu ili strukturu za namirnicu. U nekim slučajevima više gelova sa različitim komponentama se kombinuje da bi se formirala namirnica. Na primer gel koji obuhvata protein na bazi biljke moguće je povezati sa gelom koji obuhvata mast na bazi biljke. U nekim slučajevima vlakna ili niske proteina su orijentisana paralelno jedni na druge i onda se drže na mestu primenom gela koji obuhvata masti na bazi biljke.

[0209] Supstance iz ovog opisa mogu da nabubre ili ekspandiraju zagrevanjem, kao što je prženje, pečenje, zagrevanje u mikrotalasnoj rerni, zagrevanje u sistemu prisilnog kruženja vazduha, zagrevanje u vazdušnom tunelu, i slično.

[0210] U nekim slučajevima više gelova sa različitim komponentama se kombinuje da bi se formirala namirnica. Na primer gel koji obuhvata protein na bazi biljke moguće je povezati sa gelom koji obuhvata mast na bazi biljke. U nekim verzijama vlakna ili niske proteina su orijentisana paralelno jedni na druge i onda se drže na mestu primenom gela koji obuhvata masti na bazi biljke.

[0211] U nekim slučajevima, kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, ima manje od 1% pšeničnog glutena, nema betilceluloze, nema karageenana, nema boje karamela i nema aromu konjaka, nema arapsku gumu, i nema gumu akaciju. U nekim varijantnim rešenjima, kopija mesa je bez prozivoda životinskog porekla, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez prozivoda životinskog porekla, bez izolata proteina soje, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima, kopija mesa je bez prozivoda životinskog porekla, bez koncentrata proteina soje, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima, kopija mesa je bez prozivoda životinjskog porekla, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima, kopija mesa je bez prozivoda životinjskog porekla, bez tofua, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, bez tofua, i bez pšeničnog glutena. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, bez proteina soje, i bez pšeničnog glutena. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez metilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela, bez ukusa konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla i ima manje od 5% ugljenohidrata.

[0212] U nekim varijantnim rešenjima, kopija mesa je bez prozivoda životinskog porekla, bez pšeničnog glutena, bez betilceluloze, bez karageenana, bez boje karamela i bez arome konjaka, bez arapske gume, i bez gume akacije i manje od 5% ugljenohidrata. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla i ima manje od 1% celuloze. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla i ima manje od 5% nerastvorljivih ugljenohidrata. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, bez proteina soje, i ima manje od 1% celuloze. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla. bez proteina soje, i ima manje od 5% nerastvorljivih ugljenohidrata. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, bez pšeničnog glutena, i ima manje od 1% celuloze. U nekim varijantnim rešenjima kopija mesa je bez proizvoda životinjskog porekla, bez pšeničnog glutena, i ima manje od 5% nerastvorljivih ugljenohidrata.

[0213] Procenat različitih komponenata moguće je i kontrolisati. Na primer zamene za mišić koji nije na bazi životinje, tkivo masti, vezivno tkivo, i komponente krvi moguće je kombinovati u različitim odnosima i fizičkim organizacijama da bi se najbolje približili izgledu i ukusu mesa. Različite je komponente moguće rasporediti tako da se osigura doslednost između zalogaja namirnice. Komponente je moguće rasporediti tako da se osigura da nema generisanog otpada iz namirnice. Na primer, kako tradicionalni isečak mesa može imati delova koji se obično ne jedu, kopija mesa može da se poboljša prema mesu neuključivanjem ovih nejestivih delova. Takva poboljšanja omogućavaju da se sve od proizvoda napravi ili isporuči za potrošnju u ishrani, što smanjuje otpad i troškove dostave. Alternativno, kopija mesa može da obuhvati nejestive delove da bi se kopiralo iskustvo potrošnje mesa. Takvi delovi mogu da obuhvate kost, hrskavicu, vezivno tkivo, ili druge materijale koji se često pominju hrskavica, ili materijale koji kada se uključe simuliraju ove komponente. U nekim slučajevima, namirnica može da obuhvata simulirane nejestive delove mesnih proizvoda koji su projektovani da služe sekundarnim funkcijama. Na primer simulirana kost može biti projektovana da rasipa toplotu tokom kuvanja, čini kuvanje namirnice bržim ili ujednačenijim od mesa. U drugim slučajevima simulirana kost može takođe da služi da se čuva namirnica na konstantnoj temperaturi tokom dostave. U drugim primerima, simulirani nejestivi delovi mogu biti i biorazgradivi.

[0214] U nekim slučajevima supstance koje su zamena za meso su bez životinjskog proteina, i sadrže između 10-30% proteina, između 5-80% vode, između 5-70% masti, sadrže jedan ili više izolovanih prečišćenih proteina. U specifičnim varijantnim rešenjima, supstance zamena za meso obuhvataju transglutaminaze. U nekim slučajevima, namirnica sadrži komponente koje kopiraju komponente mesa. Glavna komponenta mesa je obično skeletni mišić. Skeletni mišić se obično sastoji od grubo 75 procenta vode, 19 procenta proteina, 2,5 procenta međumišićne masti, 1,2 procenta ugljenohidrata i 2,3 procenta drugih rastvorljivih neproteinskih supstanci. One obuhvataju organske kiseline, jedinjenja sumpora, azotna jedinjenja, kao što su aminokiseline i nukleotidi, i neorganske supstance kao što su minerali.

[0215] Prema tome, neka varijantna rešenja ovog opisa opisuju približavanja kopija ove supstance za tu namirnicu. Na primer, u nekim slučajevima namirnica je kopija mesa na bazi biljke može obuhvatati grubo 75% vode, 19%> proteina, 2,5% masti, 1,2% ugljohidrata; i 2,3 procenta drugih rastvorljivih neproteinskih supstanci. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa na bazi biljke koja obuhvata između 60-90%) vode, 10-30%) proteina, 1-20% masti, 0,1-5%) ugljenohidrata; i 1-10 procenta drugih rastvorljivih neproteinskih supstanci. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa na bazi biljke koja obuhvata između 60-90%) vode, 5-10%) proteina, 1-20% masti, 0,1-5%) ugljenohidrata; i 1-10 procenta drugih rastvorljivih neproteinskih supstanci. U nekim slučajevima namirnica je kopija mesa na bazi biljke koja obuhvata između 0-50%> vode, 5-30% proteina, 1-80%> masti, 0,1-5%) ugljenohidrata; i 1-10 procenta drugih rastvorljivih neproteinskih supstanci. U nekim slučajevima, kopija obuhvata između 0,01%) i 5% težine proteina hema. U nekim slučajevima, kopija obuhvata između 0,01% i 5%o težine leghemoglobina. Neko meso obuhvata i mioglobin, hem protein, što čini većinu crvene boje i sadržaja gvožđa nekog mesa. U nekim slučajevima, kopija obuhvata između 0,01% i 5% težine proteina hema. U nekim slučajevima, kopija obuhvata između 0,01% i 5%o težine leghemoglobina. Jasno je da ovi procenti mogu da variraju u mesu i kopije mesa je moguće proizvesi da bi se približilo prirodno odstupanje u mesu. Pored toga, u nekim slučajevima, ovaj opis opisuje poboljšane kopije mesa, koje obuhvataju ove komponente u uobičajeno neprirodnim procentima. Na primer kopiju mesa je moguće proizvesi sa višim od uobičajenog prosečnog sadržaja masti. Procente ovih komponenata moguće je takođe promeniti da bi se povećala druga poželjna svojstva.

[0216] U nekim slučajevima kopija mesa je projektovana tako da, kada se skuva, procenti komponenata su slični skuvanom mesu. Dakle, u nekim slučajevima, neskuvana namirnica ima različite procente komponenata od neskuvanog mesa, ali kada se skuva namirnica je slična skuvanom mesu. Na primer, kopija mesa može biti napravljena sa višim od uobičajenog sadržaja vode za sirovo meso, ali kada se skuva u mikrotalasnoj rerni proizvod koji se dobije kao rezultat ima procente komponenata slične mesu skuvanom iznad vatre.

[0217] U nekim varijantnim rešenjima namirnica je kopija mesa sa nižim od uobičajenog sadržaja vode za meso. U nekim slučajevima opis opisuje postupke za hidrataciju kopija mesa da bi se prouzrokovalo da kopija mesa ima sadržaj sličan mesu. Na primer kopija mesa sa sadržajem vode koji bi bio nizak za meso, na primer 1%, 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% vode, se hidrira do grubo 75% vode. Pošto se hidrira, u nekim slučajevima, kopija mesa se zatim skuva za potrošnju od strane ljudi.

[0218] Iako su poželjna izvođenja ovog pronalaska prikazana i opisana ovde, biće očigledno stručnjacima u ovoj oblasti da su takva izvođenja data samo kao primer. Brojne varijacije, promene, i supstitucije će sada biti očigledne stručnjacima u ovoj oblasti bez udaljavanja od ovog opisa. Treba razumeti da je različite alternative izvođenjima ovog pronalaska moguće koristiti za praktičnu primenu ovog pronalaska. Predviđeno je da patentni zahtevi dati u nastavku definišu obim ovog opisa i postupke i strukture u okviru obima ovih patentnih zahteva i njihovi ekvivalenti će biti obuhvaćeni ovde.

Primeri

PRIMER 1: POSTUPAK PROIZVODNJE I KARAKTERIZACIJA POLIPEPTIDA KOJI OBUHVATA HEM

[0219] Proizveden je plazmid tako da obuhvata sekvencu polinukleotida iz Aquifex aeolicus koja kodira hemoglobin (AaHb), pri čemu je sekvenca nukleotida bila optimizovan kodon za E. coli. Plazmid je bio podkloniran u pBE- S vektor ekspresije obezbeđen u B.subtilis sistemu ekspresije sekretornim proteinom (Secretory Protein Expression System (Takara Bio)). Ovaj vektor je sadržao aprE sekvencu promotera da bi se pospešila konstruktivna ekspresija AaHb u B. subtilis i oznaka 6-histidina C-terminalnog kraja. Polinukleotid koji kodira signalni peptid izlučivanja iz od Twin arginin translokacije (Tat)-zavisnog B. subtilis proteina PhoD je sintetisan i kloniran u okviru na 5’ kraju AaHb, koji zamenjuje aprE signalni peptid izlučivanja unutar pBE-S okosnice. Da bi se generisao citosolni konstrukt AaHb ekspresije, aprE signalni peptid izlučivanja je obrisan iz 5’ kraja AaHb otvorenog okvira čitanja korišćenjem inverzne PCR posle čega je usledila ligacija.

[0220] Plazmidi ekspresije su transformisani u B.subtilis soj RIK1285. AaHb ekspresija je nadgledana uzgajanjem transformisanih sojeva u LB podlogama, 10 µg/ml kanamicin, 0,1 mM FeCl3, i 20 µg/ml d-aminolevulinske kiseline. Ekspresija je izvedena na 37°C, sa vibratorom na 200 OB./MIN tokom 24 sata. Posle ekspresije, kultura je prikupljena i izlučeni polipeptid je odvojen iz bakterija.

[0221] Citosolna i izlučena ekspresija AaHb je nadgledana pomoću Ni-NTA afinitetnog prečišćavanja peleta ćelije i supernatanta posle čega je usledilo SDS-PAGE i kumasi bojenje frakcija eluacije. Ubacivanje hema je nadgledano UV-vis analizom prečišćenih frakcija koje su sadržale AaHb.

[0222] Kao što je prikazano na Slici 1, citosolna ekspresija AaHb u B.subtilis je upoređena sa (Slika 1C) i bez (Slika 1B) signalnog peptida izlučivanja. PhoD peptid izlučivanja nije prekinuo citosolnu ekspresiju AaHb polipeptida. Citosolni AaHb je testiran za sadržaj hema korišćenjem UV-Vis spektroskopije. Kao što je prikazano na Slici 2, dodavanje PhoD signalnog peptida nije ometalo AaHb hem vezivanje u citosolu.

[0223] Kao što je prikazano na Slici 3, kada je AaHb polipeptid spojen fuzijom na PhoD peptid izlučivanja, protein fuzije je delotvorno izlučen izvan ćelije domaćina (Sl.3B, trake A, B). Pored toga, pokazano je da je PhoD peptid izlučivanja propisno razdvojen jer su oba oblika polipeptida (razdvojen i nerazdvojen) lokalizovani u frakciji peleta ćelije (npr., unutar ćelije domaćina) (Sl.3B traka ''pelet ćelije''). Međutim, samo je razvojena verzija AaHb polipeptida fuzije izlučena, što je ukazalo na propisnu funkciju PhoD signalnog peptida.

[0224] Kao podrška delotvornosti PhoD signalnog peptida, izvedeno je sekvenciranje N-terminalog proteina na izlučenom polipeptidu. Slika 4 prikazuje sekvencu proteina iz PhoD-AaHb sekvence proteina fuzije (koja takođe obuhvata His6 oznaku). Spoj proteina je uklonjen iz gela za analizu sekvenciranja N-terminalnog kraja proteina. Ovaj spoj je odgovarao izlučenom proteinu zbog obilja i veličine na gelu. Rezultati sekvenciranja N-terminalnog kraja su pokazali da je PhoD peptid bio razdvojen (npr., veličina nije bila uslovljena nespecifičnom razgradnjom) na pravilnom mestu jer je N-terminalni kraj rezultata sekvenciranja odgovarao predviđenom mestu isecanja proteaze.

[0225] Izlučeni AaHb je dodatno bio karakterisan za sadržaj hema nadgledanjem UV-vis apsorpcije AaHb prečišćene iz podloge. Slika 5 ilustruje dejstva PhoD signalnog peptida na sadržaj hema izlučenog AaHb. Izlučeni AaHb je bio hem vezan, što je dokazano primetnom vršnom vrednošću apsorpcije na približno 415 nm.

[0226] Uzeti zajedno, ovi rezultati nagoveštavaju daPhoD signalni peptid ne ometa citosolno izlučivanje polipeptida, propisno je razdvojen, pospešuje izlučivanje polipeptida, i zadržava sadržaj hema izlučenog polipeptida.

PROROČKI PRIMER 1: POSTUPAK KORIŠĆENJA POLIPEPTIDA U NAMIRNICI U OBLIKU MESA

[0227] U nekim slučajevima, polipeptid u ovom opisu će biti izražen i prečišćen kako je opisano u Primeru 1.

[0228] U nekim slučajevima, analog mišićnog tkiva će biti konstruisan kao polipeptid i protein vicilina graška korišćenjem umrežavanja transglutaminazom.

[0229] U nekim slučajevima, analog mišićnog tkiva će biti konstruisan formiranjem toplog/hladnog gela od prečišćenih proteina vicilina graška. Polipeptid koji obuhvata hem će biti detaljno pomešan sa delimično želiranim mišićnim tkivom posle hlađenja na sobnoj temperaturi.

[0230] U nekim slučajevima, analog mišićnog tkiva će biti konstruisan koekstrudiranjem polipeptida koji obuhvata hem sa prečišćenim proteinima vicilin graška.

[0231] U nekim slučajevima, analog tkiva masti će biti tumačen emulzifikovanjem proteina belančevina graška, kokosovog ulja, i lecitina kroz homogenizaciju visokim pritiskom posle čega sledi toplo/hladna obrada. Polipeptid koji obuhvata hem će biti detaljno pomešan sa delimično želiranim adipoznim tkivom posle hlađenja do sobne temperature.

[0232] U nekim slučajevima, analog vezivnog tkiva će biti pripremljen sa izvorom zein proteina ekstruzijom ili elektrospiningom.

[0233] U nekim slučajevima, kopija mlevene govedine (npr., namirnica od mesa) će biti pripremljena kombinovanjem mišićnog analoga koji obuhvata prečišćeni polipeptid iz ovog opisa sa različitim količinama analoga masnog tkiva i analoga vezivnog tkiva. U nekim slučajevima, različita tkiva je moguće kombinovati korišćenjem mašine za mlevenje mesa. Namirnica od mesa dobijena kao rezultat može biti skuvana pre jela. Postupak kuvanja će indukovati crvenu boju potrošnog mesa da bi se promenila u braon boju, što označava kuvanje. U nekim slučajevima, crvena boja namirnice od mesa je usled prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem iz ovog opisa. Postupak kuvanja će katalizovati otpuštanje ukusa i aroma mesa. U nekim slučajevima, ukusi i arome namirnice od mesa su usled prečišćenog polipeptida koji obuhvata hem iz ovog opisa.

PRIMER 2: POSUPAK ZA MODULISANJE EKSPRESIJE I IZLUČIVANJA ENDOGENOG POLIPEPTIDA KOJI OBUHVATA HEM

[0234] Dva plazmida su proizvedena, transformisana, i kultivisana kao što je opisano u Primeru 1. Oba plazmida obuhvataju sekvencu polinukleotida iz B. subtilis koja kodira endogeni zarubljeni gen hemoglobina, yjbI (Slika 9, SEK ID BR:26). U slučaju prvog plazmida, polinukleotid koji kodira signalni peptid izlučivanja od Twin arginin translokacije (Tat)-zavisnog B. subtilis proteina PhoD (Tabela 1) je sintetisana i klonirana u okviru na 5’ kraju yjbI gena (PhoD-yjbI). Drugi plazmid je obuhvatio signalni peptid YwbN (Tabela 1), koji je takođe sintetisan i kloniran u okviru na 5’ kraju yjbI gena (YwbN-yjbI), kao što je opisano u Primeru 1.

[0235] Kao što je prikazano na Slici 6, posle 24 sata rasta, nadgledana je citosolna i izlučena ekspresija yjbI. Pelet ćelije i frakcije podloge su odvojeni upotrebom SDS-PAGE, preneti na PVDF membranu, i ispitivani sa anti-His6 antitelom (Abcam). Specifično, slika pokazuje detekciju fuzijom spojenih polipeptida (PhoD-yjbI i YbwN- yjbI) u peletu ćelije posle ekspresije endogenog polipeptida iz eksogene nukleinske kiseline, i detekcije podloge polipeptida, što je indikovalo propisno razdvajanje signalog peptida.

PRIMER 3: POSTUPAK ZA MODULISANJE EKSPRESIJE I IZLUČIVANJE HETEROLOGNOG POLIPEPTIDA KOJI OBUHVATA HEM

[0236] Dva plazmida su proizvedena, transformisana, i kultivisana kao što je opisano u Primeru 1. Prvi plazmid je obuhvatio sekvencu polinukleotida iz Glycine max (sojino zrno) koja je kodirala LGB2 (Slika 9, SEK ID BR:4). Drugi plazmid je obuhvatio protein koji kodira sekvencu polinukleotida iz M. infernorum, HGbI (Slika 9, SEK ID BR: 2). U oba plazmida, polinukleotid koji kodira signalni peptid izlučivanja iz Twin arginin translokacije (Tat)-zavisni B. subtilis protein PhoD (Tabel 1) je sintetisan i kloniran u okviru na 5’ kraju svake sekvence polinukleotida (PhoD-LGB2 and PhoD-HGbI).

[0237] Kao što je prikazano na Slici 7, posle 24 sata rasta, nadgledana je citosolna ekspresija dva polipeptida. Pelet ćelije i frakcije podloge su ovdojeni upotrebom SDS-PAGE, preneti na PVDF membranu, i ispitivani sa anti-His6 antitelom (Abcam). Specifično slika pokazuje detekciju fuzionisanih polipeptida (PhoD- LGB2 i PhoD-HGbI) u peletu ćelije posle ekspresije svakog heterolognog polipeptida, i detekciju podloge svakog heterolognog polipeptida, što je ukazalo na svako razdvajanje signalnog peptida.

PRIMER 4: POSTUPAK PROIZVODNJE I KARAKTERISANJA POLIPEPTIDA KOJI

OBUHVATA HEM SPOJENOG FUZIJOM NA RAZLIČITE SIGNALNE PEPTIDE

[0238] Niz plazmida je proizvedeno, transformisano, i kultivisano kao što je opisano u Primeru 1. Svaka plazmom obuhvaćena sekvenca polinukleotida iz Aquifex aeolicus koji kodira hemoglobin (AaHb). Na 5’ kraj AaHb sekvence, sekvenca nukleinske kisleine koja kodira signalni peptid izlučivanja izabran iz AbnA, AlbB, AppB, BglS, LipA, OppA, SpoIIIJ, TipA, WapA, WprA, YkpC, YmaC, YolA, YuiC, ili YwbN (Table 1) je spojen fuzijom kao što je prethodno opisano.

[0239] Kao što je prikazano na Slici 8, posle 24 sata rasta, supernatanti podloge podskupa polipeptida fuzije su odvojeni pomoću SDS-PAGE, preneti na PVDF membranu, i stavljeni u boce sa anti-His6 antitelom (Abcam). Slika prikazuje detektovanje podlogom endogenog polipeptida (AaHb) posle spajanja fuzijom sa podskupom broja iz različitih signalnih peptida izlučivanja uzetih kao primer (PhoD, TipA, WapA, WprA, YmaC, YolA, YuiC, YwbN, AppB, i BglS), ekspresija, i razdvajanje signalnog peptida izlučivanja.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Postupak proizvodnje polipeptida koji obuhvata hem izlučen iz grupe koja obuhvata leghemoglobin, eritrokruorin, nesimbiozni hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, cilijat mioglobin, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i Glb3, pomenuti postupak obuhvata rast rekombinantne biljke pri čemu rekombinantni deo obuhvata najmanje jednu eksogenu nukleinsku kisleinu barem jednu eksogenu nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti polipeptid koji obuhvata 5, pri čemu je pomenuta biljka iz vrsta koje nisu Nicotiana, i prečišćavanje pomenutg polipeptida koji obuhvata hem iz tkiva pomenute biljke.

2. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu pomenuto tkivo obuhvata listove, korene, stabljike, ili semena.

3. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 1-2, pri čemu pomenuti polipeptid koji obuhvata hem ima najmanje 60% identičnost sekvence prema sekvenci aminokiseline iznetoj u SEQ ID BR: 1-17 ili 21-31.

4. Posupak iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je pomenuta biljka Glycine max, Zea mays, ili Arabidopsis thaliana biljka.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu je taj postupak za proizvodnju zamene za meso, i još obuhvata mešanje prečišćenog polipeptida sa mastima i/ili lipidima da bi se proizvela zamena za meso.

6. Supstanca obuhvata:

(a) prečišćeni polipeptid koji obuhvata hem izabran iz grupe koja obuvata leghemoglobin, eritrokruorin, nesimbiozni hemoglobin, flavohemoglobin, protoglobin, cijanoglobin, globin I Hell-ovog prolaza, bakterijski hemoglobin, ciliat mioglobin, protoglobin, zarubljeni 2/2 globin, HbN, HbO, i Glb3; i

(b) komponentu rekombinantne biljne ćelije domaćina iz koje je polipeptid izražen i/ili izlučen, pri čemu je ćelija domaćin Glycine max biljna ćelija, ili Zea mays biljna ćelija, ili Arabidopsis thaliana biljna ćelija, pri čemu je polipeptid koji obuhvata hem bio eksogen na pomenutu ćeliju;

pri čemu ta komponenta obuhvata zid ćelije, podćelijsku pregradu (kao što je Goldžijev kompleks, endoplazmni retikulum, ili nukleus), nukleinsku kiselinu, protein, genomičku DNK, i/ili plazma membranu; pri čemu je ta supstanca zamena za meso.

7. Supstanca iz bilo kog od 6 patentnih zahteva pri čemu pomenuta supstanca obuhvata najmanje 1 deo po milijardi pomenute komponente pomenute ćelije.

8. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 6-7, pri čemu pomenuta supstanca obuhvata najviše 1 % (tež./tež.) pomenute komponente pomenute ćelije.

9. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 6-8, pri čemu pomenuti polipeptid koji obuhvata hem ima najamnje 60% identičnost sekvence prema sekvenci aminokiseline iznetoj u SEK ID BR: 1-17 ili 21-31.

10. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu je rekombinantna biljka napravljena korišćenjem TALENS-a.

11. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu je rekombinantna biljka napravljena korišćenjem Cas9/Crispr sistema.

12. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu je rekombinantna biljka napravljena korišćenjem Agrobacterium-posredovane transformacije.