RS57259B1

RS57259B1 - Prolaktin receptor vezujući proteini i njihova upotreba

Info

Publication number: RS57259B1
Application number: RS20180622A
Authority: RS
Inventors: Mark Anderson; Jieyi Wang; Archana Thakur; Debra Chao; Chung-Ming Hsieh; Qian Zhang; Edward B Reilly; Enrico L Digiammarino; Kenton L Longenecker; Russell A Judge; David A Egan; Charles W Hutchins
Original assignee: Abbvie Inc
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2018-08-31
Also published as: RU2664463C2; PT2935331T; CA2896058A1; TR201807416T4; US20210074147A1; NO2968312T3; HUE037586T2; EP2935331B1; JP2020188775A; MX2015008299A; AU2019202725A1; CN105102480B; AU2021202954A1; SG11201504943QA; AU2013370548A1; DK2935331T3; TW201920283A; US20190153110A1; RU2018129572A; ES2671506T3

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na prolaktin receptor (PRLR) vezujuće proteine i njihovu upotrebu pri sprečavanju i/ili tretiranju različitih bolesti uključujući kancer.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Prolaktin receptor (PRLR) je transmembranski receptor koji interaguje sa prolaktinom (PRL), peptidni hormon. PRLR sadrži jedan transmembranski domen i homologan je za receptore za citokine, kao što su IL2, IL3, IL4, IL6, IL7, eritropoitein, i GM-CSF. PRLR je prisutan u žlezdama sisara, jajnicima, hipofiznim žlezdama, srcu, plućima, timusu, slezini, jetri, pankreasu, bubrezima, nadbubrežnoj žlezdi, materici, skeletnom mišiću, koži i površinama centralnog nervnog sistema (Mancini, i dr., Endocrinol Metab Clin North Am, 2008, 37(1):67-99). Nakon aktiviranja od strane prolaktina, PRLR se dimerizuje, što se ispoljava aktiviranjem Janus kinaze 2, tirozinske kinaze koja započinje JAK-STAT put i takođe se ispoljava u aktiviranju mitogen-aktivirane proteinske kinaze i Src kinaze. Hormon rasta takođe se vezuje za PRLR i aktivira receptor.

[0003] PRLR je uključen u više bioloških funkcija, uključujući rast ćelija, diferencijaciju, razvoj, laktaciju i reprodukciju. Ljudska PRLR cDNK je originalno izolovana iz biblioteka hepatoma i kancera dojke (Boutin i dr., Molec. Endocr.3: 1455-1461, 1989). Nukleotidna sekvenca predvidela je zreli protein od 598 amino kiselina sa mnogo dužim citoplazmatskim domenom nego PRLR jetre pacova. PRLR gen se nalazi u istom regionu hromozoma kao i gen receptora rasta hormona, koji je mapiran kao 5p13-p14 (Arden, i dr., Cytogenet. Cell Gene 53: 161-165, 1990).

[0004] Genomska organizacija humanog PRLR gena je određena (Hu, Z.-Z. i dr., J. Clin. Endocr. Metab.84: 1153-1156, 1999).5-osnovni-neprevedeni region PRLR gena sadrži 2 alternativna prva eksona: E13, ljudski parnjak E13 miša ili pacova, i novi ljudski tip alternativnog prvog eksona nazvanog E1n.5-osnovni-neprevedeni region takođe sadrži zajednički ekson 2 i deo eksona 3, koji sadrži kodon započinjanja prevođenja. E13 i E1N eksoni su unutar 800 međusobnih baznih parova. Ova 2 eksona izražena su u ljudskom tkivu dojke, ćelijama kancera dojke, polnim žlezdama i jetri. Uopšteno, transkript koji sadrži E13 preovladava u većini tkiva. Proizvod PRLR gena kodiran je od strane eksona 3-10, gde ekson 10 kodira većinu unutarćelijskog domena. E13 i E1N eksoni transkribovani su iz alternativnih promotera PIII i PN, respektivno. PIII promoter sadrži Sp1 i C/EBP elemente koji su identični sa onima kod promotera kod glodara i 81% je sličan sa regionom -480/- 106 kod pacova i miša. PN promoter sadrži predviđena mesta vezivanja za ETS familiju proteina i polu-mesto za nuklearne receptore.

[0005] PRLR u više različitih izoformi koje se razlikuju u dužini svojih citoplazmatskih domena. Četiri PRLR mRNK izoforme (L, I, S1a i S1b) pronađene su tkivu subkutane abdominalne adipoze ljudi i tkivu adipoze dojke (Ling, C. i dr., J. Clin. Endocr. Metab.88: 1804-1808, 2003). Dodatno, izražavanje oba, L-PRLR i I-PRLR i uočena je kod tkiva subkutane abdominalne adipoze ljudi i tkivu adipoze dojke upotrebom imunoblot analize. Nedavni izveštaji ukazuju da je PRLR izražen i aktiviran u tikvu kancera dojke kod ljudi i kancera prostate (Li i dr., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill i dr., J Clin Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine i dr., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998). Zabeleženo je da su Stat5 aktivacija i PRLR izražavanje povezani sa visokom histološkom stopom kod 54% uzorka kancera prostate (Li i dr., iznad). Druge beleške ukazuju da uzorci primarnih kancera dojke reaguju na PRL u testu formiranja kolonija i da je koncentracija PRL u plazmi u korelaciji sa rizikom od kancera dojke (Tworoger i dr., Cancer Res., 64:6814-6819, 2004; Tworoger i dr., Cancer Res., 66:2476-2482, 2006). Druga beleška ukazuje da PRL transgeni miševi razvijaju maligne karcinome dojke ili hiperplaziju prostate (Wennbo i dr., J Clin Invest., 100:2744-2751, 1997; Wennbo i dr., Endocrinology, 138:4410-4415, 1997).

[0006] PRLR monoklonalno antitelo pokazalo je da smanjuje učestalost tumora dojke kod miševa (Sissom i dr., Am. J. Pathol. 133:589-595, 1988). Dodatno, PRL antagonist (S179D mutant PRL) pokazao je da inhibira proliferaciju ćelijske linije karcinoma prostate kod ljudi, DU-145, in vitro i DU-145 uzrokovanih tumora in vivo (Xu i dr., Cancer Res., 61:6098-6104,

[0007] WO 2011/069798 obelodanjuje monoklonalna antitela protiv PRLR koja inhibiraju PLRL signaliziranje. Prema tome, preostaje potreba za PRLR vezujućim proteinima koji mogu biti korišćeni za terapeutske svrhe tretiranja kancera.

REZIME PRONALASKA

[0008] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na PRLR vezujuće proteine i njihove konjugate. Vezujući proteini prema pronalasku obuhvataju antitela i njihove antigen vezujuće fragmente koji su u stanju da vežu humani PRLR. Dalje, pronalazak daje metode za pravljenje i upotrebu PRLR vezujućih proteina prema pronalasku i njihovih konjugata.

[0009] Predmetni pronalazak daje antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji je u stanju da veže prolaktin receptor (PRLR), koji sadrži antigen vezujući domen sa bar dva CDR kompleta varijabilnih domena iz grupe koja se sastoji od:

(1) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:40, 41 i 42 ili SEQ ID Nos:46, 47 i 42, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos:49, 50 i 51;

(2) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:56, 57 i 58 ili SEQ ID Nos: 62, 63 i 58, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos 65, 66 i 67;

(3) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos: 71, 72 i 73 ili SEQ ID Nos: 71, 77 i 73, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos: 79, 80 i 81; i

(4) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:85, 86 i 87 ili SEQ ID Nos: 149, 150 i 87, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos: 92, 93 i 94. Predmetni pronalazak takođe daje konstrukt antitela koji sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, navedeni konstrukt antitela dalje sadrži polipeptidni veznik ili konstantni region imunoglobulina.

[0010] Predmetni pronalazak takođe daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu antitela ili njegovo antigen vezujućeg fragmenta prema pronalasku.

[0011] Predmetni pronalazak takođe daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu konstrukta antitela prema pronalasku.

[0012] Predmetni pronalazak takođe daje vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema pronalasku.

[0013] Predmetni pronalazak takođe daje ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema pronalasku.

[0014] Predmetni pronalazak takođe daje metodu za proizvodnju proteina prema pronalasku koji je u stanju da veže PRLR, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku u medijumu kulture pod uslovima dovoljnim za proizvodnju vezujućeg proteina koji je u stanju da veže PRLR.

[0015] Predmetni pronalazak takođe daje farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0016] Predmetni pronalazak takođe daje antitelo ili antigen vezujući fragment prema pronalasku za upotrebu u metodi za redukovanje PRLR aktivnosti kod ljudi.

[0017] Predmetni pronalazak takođe daje antitelo ili antigen vezujući fragment prema pronalasku za upotrebu pri redukovanju PRLR aktivnosti kod ljudi kod ljudskog pacijenta koji boluje od poremećaja u kojem je PRLR aktivnost štetna, ili preti pacijentu koji ima poremećaj u kom je PRLR aktivnost štetna. U jednom otelotvorenju antitelo ili antigen vezujući fragment prema pronalasku je za upotrebu kada je poremećaj kancer dalje opciono melanom, kancer endometrijuma, limfom, kancer dojke, kancer jajnika, kancer bubrega, gastrointestinalni kancer, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer pankreasa ili kancer prostate.

[0018] Predmetni pronalazak takođe daje anti-PRLR konjugate antitela i leka (ADC) koji sadrže anti-PRLR antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema pronalasku konjugovane u bar jedan lek.

[0019] Predmetni pronalazak takođe daje farmaceutski sastav koji sadrži ADC prema pronalasku.

[0020] Predmetni pronalazak takođe daje ADC prema pronalasku za upotrebu pri tretiranju kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, opciono gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji iz melanoma, kancera endometrijuma, limfoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bubrega, gastrointestinalnog kancera, kancera debelog creva, kancera pluća, kancera pankreasa i kancera prostate.

[0021] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje odnosi se na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji sadrži antigen vezujući domen, navedeni vezujući protein je u stanju da veže prolaktin receptor (PRLR), navedeni antigen vezujući domen sadrži bar jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos:97, 98, 99, 100, 101, 102, 151 i 152. U jednom aspektu, bar jedan CDR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos:40-42, 46, 47, 49-51, 56-58, 62, 63, 65-67, 71-73, 77, 79-81, 85-87, 92-94, 149 i 150. U drugom otelotvorenju, vezujući protein npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži bar 3 CDR. U još jednom drugom otelotvorenju, 3 CDR su CDR komplet varijabilnog domena teškog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 40, 41, i 42; SEQ ID NOs: 46, 47, i 42; SEQ ID NOs: 56, 57, i 58; SEQ ID NOs: 62, 63, i 58; SEQ ID NOs: 71, 72, i 73; SEQ ID NOs: 71, 77, i 73; SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 149, 150, i 87. Alternativno ili u kombinaciji 3 CDR su CDR komplet varijabilnog domena lakog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 49, 50, i 51; SEQ ID NOs: 65, 66, i 67; SEQ ID NOs: 79, 80, i 81; i SEQ ID NOs: 92, 93, i 94.

[0022] U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži bar jedan CDR komplet varijabilnog domena teškog lanca i bar jedan CDR komplet varijabilnog domena lakog lanca. U nekim aspektima, bar dva CDR kompleta varijabilnog domena izabrana su iz grupe koja se sastoji od:

1) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:40, 41 i 42 ili SEQ ID Nos:46, 47 i 42, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos:49, 50 i 51;

(4) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:85, 86 i 87 ili SEQ ID Nos: 149, 150 i 87, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos: 92, 93 i 94..

[0023] U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, dalje sadrži okvir ljudskog primaoca. U nekim aspektima, okvir ljudskog primaoca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos: 14-38. U drugim aspektima, okvir ljudskog primaoca sadrži bar jedan supstituciju amino kiseline okvirnog regiona, gde je aminokiselinska sekvenca okvira bar 65% identična sa sekvencom navedenog okvira ljudskog primaoca i sadrži bar 70 aminokiselinskih ostataka identičnih sa navedenim okvirom ljudskog primaoca. Alternativno, okvir ljudskog primaoca sadrži bar jednu supstituciju amino kiseline okvirnog regiona pri ključnom ostatku, navedeni ključni ostatak izabran je iz grupe koja se sastoji od:

ostatka susednom CDR;

ostatka mesta glikozilacije;

zadnjeg ostatka;

ostatka koji je u stanju da interaguje sa humanim PRLR;

ostatka koji je u stanju da interaguje sa CDR;

kanoničnog ostatka;

dodirnog ostatka između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca;

ostatka unutar Vernier zone; i

ostatka u regionu koji se preklapa između Chothia-definisanog varijabilnog CDR1 teškog lanca i Kabat-definisanog prvog okvira teškog lanca.

[0024] U drugim aspektima, ključni ostatak izabran je iz grupe koja se sastoji od 2L, 43L, 48L, 58L, 64L, 87L, 27H, 48H, 60H, 63H, 64H, 65H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 93H. U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je konsenzusni ljudski varijabilni domen.

[0025] U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži bar jedan varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 123. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži dva varijabilna domena, gde su dva navedena varijabilna domena aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(1) jedne od SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 45; i jedne od SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO:54;

(2) jedne od SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 ili SEQ ID NO: 61; i jedne od SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68 ili SEQ ID NO: 69;

(3) jedne od SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75 ili SEQ ID NO: 76; i jedne od SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:82 ili SEQ ID NO: 83; i

(4) jedne od SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 ili SEQ ID NO: 123; i jedne od SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:95 ili SEQ ID NO:96.

[0026] U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, sadrži bar jedan varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 95; i SEQ ID NO: 96.

[0027] U posebnom otelotvorenju, vezujući protein sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (j) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (k) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (1) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (m) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (n) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (o) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (p) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (q) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (r) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (s) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (t) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (u) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (v) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (w) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (x) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (y) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (z) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (aa) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (bb) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (cc) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (dd) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (ee) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (ff) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (gg) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (hh) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (ii) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (jj) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (kk) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (11) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (mm) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (nn) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (oo) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; i (pp) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0028] U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje PRLR. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u stanju da modulira biološku funkciju PRLR. U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u stanju da neutralizuje PRLR. U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ima konstantu brzine vezivanja (Kon) za PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: bar od 102M-1s-1; bar oko 103MM-1s-1; bar oko 104M-1s-1; bar oko 105M-1s-1; i bar oko 106M-1s-1; kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom. U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ima konstantu brzine disocijacije (K za PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: najviše 10-off)

3s-1; najviše oko 10<-4>s<-1>; najviše oko 106<-5>s<-1>; i najviše oko 10<-6>s<-1>, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom. U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ima konstantu disocijacije (KD) za PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: najviše oko 10<-7>M; najviše oko 10<-8>M; najviše oko 10<-9>M; najviše oko 10<-10>M; najviše oko 10<-11>M; najviše oko 10<-12>M; i najviše 10<-13>M.

[0029] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji je u konkurenciji sa antitelom. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(1) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45; i varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO:54;

(2) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61; i varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68 i SEQ ID NO: 69;

(3) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; i SEQ ID NO: 123; i varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:95 i SEQ ID NO:96;

(4) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:112 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:103;

(5) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:113 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:104;

(6) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:114 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO: 105;

(7) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:116 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:107;

(8) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:117 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:108;

(9) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:118 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:109;

(10) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:119 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:110; i (11) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:120 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO: 111.

[0030] U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(6) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:114 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO: 105; i (7) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:120 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO: 111.

[0031] U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:119 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:110.

[0032] U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(1) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO: 115 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:106;

(2) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:116 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:107; i (3) varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca iznete u SEQ ID NO:117 varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca iznete u SEQ ID NO:108.

[0033] U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45; i varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO:54. U drugim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži varijabilne aminokiselinske sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; i SEQ ID NO: 123; i varijabilne aminokiselinske sekvence lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:95 i SEQ ID NO:96.

[0034] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein koji je u stanju da veže PRLR koji je u konkurenciji sa antitelom koje sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od (a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125; (j) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126; (k) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; (1) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128; (m) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (n) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (o) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (p) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (q) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (r) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (s) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132; (t) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; (u) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; (v) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (w) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (x) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (y) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (z) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (aa) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (bb) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138; (cc) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (dd) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140; (ee) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (ff) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (gg) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (hh) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (ii) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (jj) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (kk) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144; (ll) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; (mm) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146; (nn) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (oo) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; i (pp) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0035] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili sve od aminokiselinskih ostataka E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitope sadrži bar pet aminokiselinskih ostataka. U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži sve aminokiselinske ostatke E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab1, Ab6, chAb6, i Ab14-Ab25.

[0036] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili sve od aminokiselinskih ostataka E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži bar pet aminokiselinskih ostataka. U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži sve aminokiselinske ostatke E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab4, Ab7, chAb7, Ab35-Ab43 i Ab53-Ab55.

[0037] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili sve aminokiselinske ostatke R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191, i W194 od SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži bar 15 aminokiselinskih ostataka. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži sve aminokiselinske ostatke R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191, i W194 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab3, Ab8, chAb8 i Ab44-Ab52.

[0038] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži bar jednu, dve, tri, četiri ili sve aminokiselinske ostatke R25, K185, D187, H188 ili W191 od SEQ ID NO:2. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR, vezuje se za epitop, gde epitop sadrži sve aminokiselinske ostatke R25, K185, D187, H188 ili W191 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab1, Ab3, Ab4, Ab6-Ab8, chAb6, chAb7, chAb8, Ab14-Ab25 i Ab35-Ab55.

[0039] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži amino kiseline 91-96 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab1, Ab4, Ab6, Ab7, chAb6, chAb7, Ab14-Ab25, Ab35-Ab43 i Ab53-Ab55.

[0040] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR koji se vezuje za epitop koji ima ostatke bar u okviru amino kiselina 8-100, 185-191, 8-143, ili 183-194 od SEQ ID NO:2. U posebnom aspektu, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koja se sastoji od Ab1, Ab3, Ab4, Ab6-Ab8, chAb6, chAb7, chAb8, Ab14-Ab25 i Ab35-Ab55.

[0041] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji je u stanju da veže PRLR i koji ima istu specifičnost epitopa kao antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo izabran iz grupe koja se sastoji od Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15 Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 i Ab55.

[0042] U različitim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je u stanju da modulira biološku funkciju PRLR. U drugim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje ligand koji vezuje D1 domen PRLR.

U drugim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje epitop PRLR koji ne inhibira dimerizaciju PRLR. U sledećim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, ne vezuje D2 domen PRLR. U sledećim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje ligand koji vezuje region D1 domena PRLR. U dodatnim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, nije u konkurenciji sa antitelom LFA102 za vezivanje PRLR. U dodatnim daljim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, blokira vezivanje prolaktina za PRLR.

[0043] U posebnim otelotvorenjima bilo kog od daljih otelotvorenja prema pronalasku, vezujući protein je antitelo, ili njegov antigen vezujući deo. U posebnim aspektima bilo kojeg od daljih aspekata prema pronalasku, vezujući protein je ljudsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo.

[0044] U drugom aspektu, vezujući protein prema bilo kom od daljih aspekata prema obelodanjivanju je kristalizovani vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment.

[0045] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na konstrukt antitela koji sadrži vezujući protein gde navedeni konstrukt dalje sadrži polipeptidni veznik ili konstantni domen imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, vezujući protein navedenog konstrukta antitela izabran je iz grupe koja se sastoji od molekula imunoglobulina, Fv vezanog sa disulfidom, monoklonalnog antitela, scFv himernog antitela, , CDR-kalemljenog antitela, diatela, humanizovanog antitela, multispecifičnog antitela, Fab,a dvostrukog specifičnog antitela, Fab’, bispecifičnog antitela, F(ab’)2, i Fv,

[0046] Alternativno, ili dodatno, vezujući protein navedenog konstrukta antitela može sadržati konstantni domen imunoglobulina teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od humanog IgM konstantnog domena, humanog IgG4 konstantnog domena, humanog IgG1 konstantnog domena, humanog IgE konstantnog domena, humanog IgG2 konstantnog domena, i humanog IgG3 konstantnog domena, humanog IgA konstantnog domena.

[0047] U drugim otelotvorenjima, konstrukt antitela sadrži konstantni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos:10-13.

[0048] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat antitela koji sadrži konstrukt antitela kao što je prethodno opisano, gde navedeni konjugat antitela dalje sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoadhezionog molekula, agensa za prikazivanje, terapeutskog agensa i citotoksičnog agensa. U jednom otelotvorenju, konjugat antitela dalje sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od radio oznake, enzima, fluorescentne oznake, luminiscentne oznake, bioluminiscentne oznake, magnetne oznake i biotina. U drugom aspektu, konjugat antitela dalje sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od:<3>H,<14>C,<35>S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, i 153Sm. U drugim otelotvorenjima, konjugat antitela dalje sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od: antimetabolita, agensa za alkilaciju, antibiotika, faktora rasta, citokina, anti-angiogenog agensa, anti-mitotičkog agensa, antracilina, toksina i apoptotičkog agensa. Na primer, anti-mitotički agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od dolastatina, auristatina, maitanzinoida, alkaloida biljke, taksana i vinka alkaloida. U nekim aspektima, vezujući protein navedenog konstrukta antitela poseduje ljudski šablon glikozilacije.

[0049] U određenim aspektima, konstrukt antitela je kristalizovani konstrukt antitela. U nekim aspektima, kristalizovani konstrukt antitela je kristalizovani konstrukt antitela sa farmaceutski kontrolisanim oslobađanjem bez nosača. U drugom aspektu, konstrukt antitela ima veći polu raspad in vivo od rastvorljivog suprotnog dela navedenog konstrukta antitela. U nekim aspektima, konstrukt antitela zadržava biološku aktivnost.

[0050] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, aminokiselinske sekvence. U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira konstrukt antitela aminokiselinske sekvence, kao što je ovde opisano, gde navedeni konstrukt antitela dalje sadrži polipeptidni veznik ili konstantni domen imunoglobulina.

[0051] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje vektor koji sadrži navedenu izolovanu nukleinsku kiselinu. U drugom otelotvorenju, navedeni vektor izabran je iz grupe koja se sastoji od pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, i pBJ.

[0052] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje ćeliju domaćina koja sadrži navedeni vektor. U drugom aspektu, navedena ćelija domaćina je prokariotska ćelija, dok u drugim otelotvorenjima, navedena ćelija domaćina je E. Coli. U drugim aspektima, navedena ćelija domaćina je eukariotska ćelija. U nekim aspektima, navedena eukariotska ćelija izabrana je iz grupe koja se sastoji od ćelije protista, ćelije životinje, ćelije biljke i ćelije gljive.

U još nekim aspektima, eukariotska ćelija je ćelija životinje izabrana iz grupe koja se sastoji od: ćelije sisara, ćelije ptice, i ćelije insekta, dok u drugim otelotvorenjima, ćelija domaćina je CHO ćelija. U drugom aspektu, ćelija domaćina je COS, dok u drugim otelotvorenjima, ćelija domaćina je ćelija kvasca. U nekim aspektima, navedena ćelija kvasca je Saccharomyces cerevisiae. U drugim aspektima, ćelija domaćina je Sf9 ćelija insekta.

[0053] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na metodu za proizvodnju proteina koji je u stanju da veže PRLR, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kao što je opisano iznad, na primer, obuhvatajući vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu konstrukta antitela kao što je opisano iznad, u medijumu kulture pod uslovima dovoljnim da se vezujući protein koji je u stanju da veže PRLR. U jednom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na protein proizveden prema navedenoj metodi.

[0054] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na sastav za oslobađanje vezujućeg proteina, npr., antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, gde navedeni sastav sadrži: (a) formulaciju gde navedena formulacija sadrži kristalizovani vezujući protein, kao što je ovde opisano, i sastojak; i (b) bar jedan polimerni nosač. U jednom aspektu, polimerni nosač je polimer izabran iz jedne ili više grupa koje se sastoje od: poli (akrilne kiseline), poli (cijanoakrilata), poli (amino kiselina), poli (anhidrida), poli (depsipeptida), poli (estera), poli (mlečne kiseline), poli (mlečne-ko-glikolne kiseline) ili PLGA, poli (b-hidroksibutriata), poli (kaprolaktona), poli (dioksanona); poli (etilen glikola), poli ((hidroksipropila) metakrilamida, poli [(organo) fosfazena], poli (orto estra), poli (vinil alkohola), poli (vinilpirolidona), kopolimera maleinskog anhidrida- alkil vinil etra, pluronskih poliola, albumina, alginata, celuloze i derivata celuloze, kolagena, fibrina, želatina, hijaluronske kiseline, oligosaharida, glikaminoglikana, sulfatnih polisaharida, njihovih mešavina i kopolimera. U drugom aspektu, navedeni sastojak se bira iz grupe koja se sastoji od albumina, sukroze, trehaloze, laktitola, želatina, hidroksipropil-β-ciklodekstrina, metoksipolietilen glikola i polietilen glikola. U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na metodu za tretiranje sisara koja obuhvata korak davanja sisaru efektivne količine navedenog sastava.

[0055] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom aspektu, navedeni farmaceutski prihvatljiv nosač funkcioniše kao adjuvans od koristi za povećanje adsorpcije, ili disperzije vezujućeg proteina, npr., antitela, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugom aspektu, navedeni adjuvans je hijaluronidaza.

[0056] U drugom aspektu, farmaceutski sastav dalje sadrži bar jedan dodatni terapeutski agens za tretiranje poremećaja u kojem je PRLR aktivnost štetna. Na primer, dodatni agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: terapeutskog agensa, agensa za predstavljanje, citotoksičnog agensa, inhibitora angiogeneze; inhibitora kinaze; ko-stimulativnih blokatora molekula; adhezionih blokatora molekula, anti-citokinog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta; metotreksata; ciklosporina; rapamicina; FK506; detektabilne oznake ili reportera; TNF antagonista; anti-reumatika; relaksanta mišića, narkotika, ne-steroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativna, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikroba, antipsoriatika, kortikosteroida, anabiličkog steroida, eritropoiteina, imunizaciju, imunoglobulina, imunosupresiva, hormona rasta, leka za zamenu hormona, radiofarmaceutika, antidepresanta, antipsihotika, stimulansa, leka za astmu, beta agoniste, steroida za inhalaciju, oralnog steroida, epinefrina ili analoga, citokina i citokinskog antagoniste.

[0057] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metodu za redukovanje humane PRLR aktivnosti dovođenjem humanog PRLR u kontakt sa vezujućim proteinom prema pronalasku, npr., antitelom, ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, tako da se aktivnost humanog PRLR redukuje.

[0058] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metodu za redukovanje humane PRLR aktivnost kod ljudskog pacijenta koji boluje od poremećaja u kojem je PRLR aktivnost štetna, davanjem ljudskog pacijentu vezujući protein prema pronalasku, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, tako da se aktivnost humanog PRLR u ljudskom pacijentu redukuje.

[0059] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metodu za tretiranje pacijenta za bolest ili poremećaj u kojem je PRLR aktivnost štetna davanjem pacijentu vezujući protein prema pronalasku, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, tako da se postigne tretiranje. U jednom aspektu, poremećaj je kancer. U drugom aspektu, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera endometrijuma, limfoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bubrega , gastrointestinalnog kancera, kancera debelog creva, kancera pluća, kancera pankreasa i kancera prostate. U još jednom drugom aspektu, kancer je kancer dojke. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, daje se pacijentu na bar jedan način iz grupe koja se sastoji od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginog, intrakavitarnog, intraćelijskog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastričnog, intrahepatskog, intrmiokardinalnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardiatičnog, intraperitonealnog, intraprostatnog, intrapulmonarnog, intrarektalnog, intrearenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterusnog, intravezikalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog davanja.

[0060] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje anti-PRLR antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji je specifično u konkurenciji sa anti-PRLR vezujućim proteinom kao što je ovde opisano, gde navedena konkurencija može biti uočena u testu konkurentnog vezivanja upotrebom navedenog antitela, humanog PRLR polipeptida, i anti-PRLR vezujućeg proteina.

[0061] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) koji sadrži anti-PRLR antitelo prema pronalasku, njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku, i bar jedan lek, gde antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, sadrži bar 3 CDR

[0062] Na primer, obelodanjivanje daje anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) gde antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, sadrži bar 3 CDR izabrane iz CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) koji se sastoji od SEQ ID NOs: 40, 41, i 42; SEQ ID NOs: 46, 47, i 42; SEQ ID NOs: 56, 57, i 58; SEQ ID NOs: 62, 63, i 58; SEQ ID NOs: 71, 72, i 73; SEQ ID NOs: 71, 77, i 73; SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 149, 150, i 87. Alternativno ili u kombinaciji, obelodanjivanje daje anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) gde antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, sadrži bar 3 CDR izabrane iz CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) koji se sastoji od SEQ ID NOs: 49, 50, i 51; SEQ ID NOs: 65, 66, i 67; SEQ ID NOs: 79, 80, i 81; i SEQ ID NOs: 92, 93, i 94.

[0063] U drugom otelotvorenju ADC iznetom iznad, lek je izabran iz grupe koju čine mitotički inhibitor, antitumorski antibiotik, imunomodulirajući agens, vektor za terapiju gena, agens za alkilaciju, antiangiogeni agens, antimetabolit, agens koji sadrži bor, hemoprotektivni agens, hormon, antihormonski agens, kortikosteroid, fotoaktivni terapeutski agens, oligonukleotid, radionukleotidni agens, inhibitor topoizomeraze, inhibitor tirozinske kinaze, i radiosensitizer. U drugom otelotvorenju, pronalazak daje ADC, gde je lek izabran iz grupe koju čine Ixempra, dolastatin 10, dolatstin 15, auristatin E, auristatin PE, monometil auristatin D (MMAD ili auristatin D derivat), monometil auristatin E (MMAE ili auristatin E derivat), monometil auristatin F (MMAF ili auristatin F derivat), auristatin F fenilendiamin (AFP), auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), 5-benzoilpentanska kiselina-AE ester (AEVB), metotreksat, daunorubicin, vinkristin, maitansin, maitansinol, C-3 estri maitansinola, ansamitocin P1, ansamitocin P2, ansamitocin P3, ansamitocin P4, docetaksel, paklitaksel, paklitaksel nanočestica, vindesin sulfat, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, aktinomicini, pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini, pirolobenzodiazepin (PBD) dimeri, aktinomicin D, antramicin, hicamicin A, DC-18, DC-81, mazetramicin, neotramicin A, neotramicin B, porotramicin, protrakarcin B, SG2285, sibanomicin, sibiromicin, tomaimicin, antraciklini, daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, kaliheamicini, γ II1; α2, α3, N-acetyl-γ

1, PSAG, θ

1, duokarmicini, adozelesin, bizelesin, i carzelesin, bleomicin, mitomicin, plikamicin, bacillus calmette-guerin (BCG), levamizol, vakcine za kancer, vakcine za rekombinantni bivalentni humani papilomavirus (HPV) tipovi 16 i 18 vakcine, vakcine za rekombinantni kvadrivalentni humani papilomavirus (HPV) tipa 6, 11, 16 i 18, sipuleucel-T, citokini, paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinski hormoni kao što je hormon za stimulisanje folikula (FSH), hormon za stimulisanje štitne žlezde (TSH), i hormon za luteniziranje (LH), hepatski faktor rasta; firoblastni faktor rasta, prolaktin, placentni laktogen, faktor nekroze tumora, milerijanskeinhibirajuće supstance, peptid povezan sa gonadotropinom miša, inhibin, ativin, vaskularni endotelijalni faktor rasta, integrin, trombopoietin (TPO), nervni faktori rasta kao što je NGF, plateletni faktor rasta, transformirajući faktori rasta (TGF), nalik insulinu faktori rasta-I i -II, eritropoitein (EPO), osteoinduktivni faktori, interferoni kao što je interferon α, β, i γ, faktori stimulisanja kolonija (CSF), granulocit-makrofag-C-SF (GM-CSF), i granulocit-CSF (G-CSF), interleukini (IL) kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, faktori nekroze tumora i drugi polipeptidni faktori koji obuhvataju LIF i komplet ligand (KL), faktori stimulisanja kolonija, eritropoitein (epoetin), filgrastim, sargramostim, promegapoietin, Opreliekin, terapeutici imunomodulirajućih gena, nukleinska kiselina koja kodira funkcionalni, terapeutski gen koji se koristi za zamenjivanje mutiranog ili na drugi način nefunkcionalnog (npr. skraćenog) gena povezanog sa kancerom, nukleinska kiselina koja kodira ili na drugi način daje proizvodnju terapeutskog proteina za tretiranje kancera, alkil sulfonati, busulfan, azotni iperiti, hlorambucil, ciklofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, i melfalan, nitrosouree, karmustin, fotemustin, lomustin, nimustin, streptozocin, triazini i hidrazini, dakarbazin, prokarbazin, temozolomid, etilenimimi, tiopeta, diazikvon, mitomicin C, metilamin derivati, epoksidi, altretamin, dianhidrogalaktitol, dibromodulcitol, angiostatin, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, EGF vakcina, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, Erlotinib, angiostatin, arestin, endostatin, BAY 12-9566 i w/fluorouracil ili doksorubicin, kanstatin, karboksiamidotriozol i sa paklitakselom, EMD121974, S-24, vitaksin, dimetilksantenon sirćetna kiselina, IM862, Interleukin-12, Interleukin-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, angiozim, IMC-1C11, Neovastat, marimstat, prinomastat, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, sa paklitakselom, sa gemcitabinom i cisplatinom, i sa irinotecanom i cisplatinom i sa radijacijom, tekogalan, temozolomid i PEG interferon α2b, tetratiomolibdat, TNP-470, talidomid, CC-5013 i sa taksoterom, tumstatin, 2-metoksiestradiol, VEGF trap, mTOR inhibitori (deforolimus, everolimus, i temsirolimus), inhibitore tirozinske kinaze (npr., imatinib, gefitinib, dasatinib, sunitinib, nilotinib, lapatinib, sorafenib, fosfoinositid 3-kinaze (PI3K), antagonisti folne kiseline, metotreksat, 4-aminofolna kiselina, lometreksol, pemetreksed, trimetreksat, pirimidin antagonisti, azacitidin, kapecitabin, citarabin, dekitabin, 5-fluorouracil, 5-fluoro-2'-dezoksiuridin 5'-fosfat, 5-fluorouridin trifosfat, gemcitabin, foksuridin, purin antagonist azatioprin, kladribin, merkaptopurin, fludarabin, pentostatin, 6-tioguanin, inhibitori adenozin deaminaze, kladribin, fludarabin, nelarabin, pentostatin, boroficin, bortezomib, hemoprotektivni agensi, amifostin, deksrazoksan, mesna, androgeni, estrogeni, medroksiprogesteron acetat, progestini, aminoglutetimid, anastrozol, bicalutamid, hlorotrianize, ciproteron acetat, degareliks, eksemestan, flutamid, fulvestrant, goserelin, letrozol, leuprolid, lupron, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, tamoksifen, triptorelin, asparaginaza, dakarbazin, hidroksiurea, levamizol, mitotan, prokarbazan, tretinoin, glukokortikoidi, prednizon, hromageni, boje, antismisao oligonukleotidi koji se ili prirodno javljaju ili su sintetisani upotrebom standardnih i/ili nestandardnih nukleotida (uključujući RNK interferencu (RNKi)), dvo-lančana RNK (dsRNK), mala interferirajuća RNK (siRNK), mikroRNK (miRNK), aptameri, CpG oligonukleotidi, ribozimi, angiozim, 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y I25I, I31I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se , 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, I09Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 211'Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-1111, Sb-119,1-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211 , Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, 11C, 13N, 150, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, I03Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, !66Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201T1225Ac, 76Br, I69Yb, taksan, cisplatin, metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicin C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nikotinamid, 5-bromodezoksiuridin (BUdR), 5-jododezoksiuridin (IUdR), bromodezoksicitidin, fluorodezoksiuridin (FUdR), hidroksiurea, hematoporfirin derivati, fotofrin(r), benzoporfirin derivati, NPe6, tin etioporfirin (SnET2), feoborbid a, bakteriohlorofil a, naftalocianini, ftalocianini, cink ftalocianin, kamptotecini, irinotekan, topotekan, amsakrin, daunorubicin, doksotrubicin, epipodofilotoksini, elipticini, epirubicin, etoposid, razoksan, teniposid, aksitinib, bosutinib, cediranib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lestaurtinib, nilotinib, semaksanib, sunitinib, vandetanib, abrin, abrin A lanac, alfa toksin, Aleurites fordii proteini, amatoksin, krotin, curcin, diantin proteini, dipteria toksin, difteria A lanac, nevezujući aktivni fragmenti difteria toksina, dezoksiribonucleaza (Dnaza), gelonin, mitogelin, modekcin A lanac, momordica charantia inhibitor, neomicin, onkonaza, fenomicin, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), antivirusni protein vinobojke, pseudomonas endotoksin, pseudomonas egzotoksin, egzotoksin A lanac iu pseudomonas aeruginosa, restriktocin, ricin, ricin A lanac, ribonukleaza (Rnaza), sapaonaria officinalis inhibitor, saporin, alfa-sarcin, enterotoksin-A stafilokoka, tetanus toksin, cisplatin, karboplatin, i oksaliplatin (Eloksatin, Sanofi Aventis), inhibitori proteazoma, PS-341, HDAC inhibitori, vorinostat, belinostat, entinostat, mocetinostat, panobinostat, COX-2 inhibitori, supstituisane uree, inhibitori proteina toplotnog šoka, geldanamicin, adrenokortikal supresanti, trihoteceni, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, alfaIR3, ScFV/FC, EM/164, matuzumab, erbituks,vektibiks, mAb 806, nimotuksumab, AVEO, AMG102, 5D5 (OA-5d5), H244G11, Ab #14 (MM 121-14), herceptin, 1B4C3; 2D1D12, NVP-AEW541-A, BMS-536,924 (1H-benzoimidazol-2-il)-1H-piridin-2-on), BMS-554,417, cikloligan, TAE226, PQ401 , Iressa, CI-1033 (PD 183805), lapatinib (GW-572016), tikerb, Tarceva, PKI-166, PD-158780, EKB-569, tirfostin AG 1478 (4-(3-hloroanilino)-6,7-dimetoksikvinazolin), PHA665752, ARQ 197, kapecitabin, 5-trifluorometil-2'-dezoksiuridin, metotreksat natrijum, raltitreksed, pemetreksed, tegafur, citozin arabinozid (citarabin), 5-azacitidin, 6-merkaptopurin (merkaptopurin, 6-MP), azatioprin, 6-tioguanin, pentostatin, fludarabin fosfat, kladribin (2-CdA, 2-hlorodezoksiadenozin), inhibitor ribonukleotid reduktaze, ciklofosfamid, neosar, ifosfamid, tiotepa, BCNU→ 1,3-bis(2-hloroetil)-1-nitosourea, CCNU→ 1, -(2-hloroetil)-3-cikloheksil-1-nitrosourea (metil CCNU), heksametilmelamin, busulfan, prokarbazin HCL, dakarbazin (DTIC), hlorambucil, melfalan, karboplatin, oksaliplatin, doksorubicin HCL, daunorubicin citrat, mitoksantron HCL, aktinomicin D, etopozid, topotekan HCl, tenipozid, irinotekan HCL(CPT-ll), vinkristin, vinblastin sulfat, vinorelbin tartrat, vindesin sulfat, paklitaksel, docetaksel, abraksan, iksabepilon, imatinib mezilat, sunitinib malat, sorafenib toslat, nilotinib hidrohlorid monohidrat, L-asparaginaza, alfa interferon, avastin, IL-2, aldesleukin, proleukin, IL-12, toremifen citrat, fulvestrant, raloksifen HCL, anastrazol, letrozol, fadrozol (CGS 16949A), eksemestan, leuprolid acetat, lupron, goserelin acetat, triptorelin pamoat, buserelin, nafarelin, cetroreliks, bikalutamid, nilutamid, megestrol acetat, somatostatin analogi, prendinzolon, deksametason, ketokonazol, sirolimus, temsirolimus (CCI-779), deforolimus (AP23573), i everolimus (RAD00I).

[0064] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži ADC prema pronalasku. U još jednom drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na metodu za tretiranje kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, navedena metoda obuhvata davanje ADC kao što je opisano iznad, tako da se pacijent može tretirati.

[0065] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na metodu za tretiranje kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, navedena metoda obuhvata davanje ADC kao što je opisano iznad, tako da se pacijent tretira, gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, melanoma, kancera endometrijuma, limfoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bubrega , gastrointestinalnog kancera, kancera debelog creva, kancera pluća, kancera pankreasa i kancera prostate. U drugim aspektima, obelodanjivanje se odnosi na to metodu za tretiranje kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, navedena metoda obuhvata davanje ADC kao što je opisano iznad, tako da se pacijent tretira, gde je kancer kancer dojke. U drugim aspektima, obelodanjivanje se odnosi na metodu za tretiranje kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, navedena metoda obuhvata davanje ADC kao što je opisano iznad, tako da se pacijent tretira, gde se ADC daje pacijentu na način izabran iz grupe koja se sastoji od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginog, intrakavitarnog, intraćelijskog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastričnog, intrahepatskog, intrmiokardinalnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardiatičnog, intraperitonealnog, intraprostatnog, intrapulmonarnog, intrarektalnog, intrearenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterusnog, intravezikalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog davanja.

KRATAK OPIS SLIKA

[0066]

Slika 1. Usaglašavanje varijabilnih sekvenci teškog lanca za mišija antitela Ab5 (SEQ ID NO:112), Ab6 (SEQ ID NO:113), Ab7 (SEQ ID NO:114), Ab8 (SEQ ID NO:115), Ab9 (SEQ ID NO:116), Ab10 (SEQ ID NO:117), Ab11 (SEQ ID NO: 118), Ab12 (SEQ ID NO:119) i Ab13 (SEQ ID NO:120).

Slika 2. Usaglašavanje varijabilnih sekvenci lakog lanca za mišija antitela Ab5 (SEQ ID NO:103), Ab6 (SEQ ID NO:104), Ab7 (SEQ ID NO:105), Ab8 (SEQ ID NO:106), Ab9 (SEQ ID NO:107), Ab10 (SEQ IDNO:108), Ab11 (SEQ ID NO:109), Ab12 (SEQ ID NO:110) i Ab13 (SEQ ID NO:111).

Slika 3. Usaglašavanje varijabilnih sekvenci teškog lanca za mišija antitela Ab5 (SEQ ID NO:112), Ab6 (SEQ ID NO:113), Ab7 (SEQ ID NO:114) i Ab8 (SEQ ID NO:115); i humanizovane varijabilne sekvence teškog lanca izvedene iz njih, tj., Ab1 VH.1z (SEQ ID NO:39), Ab1 VH.1 (SEQ ID NO:43), Ab1 VH.1a (SEQ ID NO:44), Ab1 VH.1b (SEQ ID NO:45), Ab2 VH.1z (SEQ ID NO:55), Ab2 VH.1 (SEQ ID NO:59), Ab2 VH.1a (SEQ ID NO:60), Ab2 VH.1b (SEQ ID NO:61), Ab3 VH.1z (SEQ ID NO:70) Ab3 VH.1 (SEQ ID NO:74), Ab3 VH.1a (SEQ ID NO:75), Ab3 VH.1b (SEQ ID NO:76), Ab4 VH.1z (SEQ ID NO:84), Ab4 VH.1 (SEQ ID NO:88), Ab4 VH.1a (SEQ ID NO:89), Ab4 VH.1a.2 (SEQ ID NO:121), Ab4 VH.1a.3 (SEQ ID NO:122), Ab4 VH.1b (SEQ ID NO:123), i Ab4 VH.1b.2 (SEQ ID NO:90).

Slika 4. Usaglašavanje varijabilnih sekvenci lakog lanca za mišija antitela Ab5 (SEQ ID NO:103), Ab6 (SEQ ID NO: 104), Ab7 (SEQ ID NO: 105) i Ab8 (SEQ ID NO:106); i humanizovane varijabilne sekvence teškog lanca izvedene iz njih, tj., Ab1 VL.1 (SEQ ID NO:48), Ab1 VL.1a (SEQ ID NO:52), Ab1 VL.2 (SEQ ID NO:53), Ab1 VL.2a (SEQ ID NO:54), Ab2 VL.1 (SEQ ID NO:64), Ab2 VL.1a (SEQ ID NO:68), Ab2 VL.1b (SEQ ID NO:69), Ab3 VL.1 (SEQ ID NO:78), Ab3 VL.1a (SEQ ID NO:82), Ab3 VL.1b (SEQ ID NO:83), Ab4 VL.1 (SEQ ID NO:91), Ab4 VL.1a (SEQ ID NO:95) i Ab4 VL.1b (SEQ ID NO:96).

Slika 5. Efekat anti-PRLR antitela na rast Nb2-11 ćelija postavljenih u SCID-bež miševe. Antitela su dozirana na ukazan dan ispitivanja (dan 7, 14 i 21). Error-bar dijagrami ukazuju standardnu grešku srednje vrednosti (videti Primer 3).

Slika 6. Pregled grupisanja epitopa PRLR antitela za mišija antitela Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11 i Ab12, i za LFA102 antitelo (videti Primer 4).

Slika 7. Rezultati testa simultanog vezivanja za himerna i humanizovana antitela chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48 i Ab49, i za LFA102 antitelo demonstriraju da humanizacija himernih antitela nije značajno izmenila jezgro epitopa za svako koreno antitelo (videti Primer 4).

Slika 8. Pregled grupisanja epitopa PRLR antitela za himerna i humanizovana antitela chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48 i Ab49, i za LFA102 antitelo (videti Primer 4).

Slika 9. Opis površina epitopa za Ab6 i LFA102 mapirane na strukturi PRL-PRLR trostrukog kompleksa (videti Primer 5).

Slika 10. Poređenje vezivanje određenih anti-PRLR antitela za huPRLR, cyPRLR i muPRLR kao što sledi (videti Primer 10).

Slika 11. Poređenje vezivanje određenih anti-PRLR antitela nakon humaniziranja iz himernog antitela.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0067] Ovo obelodanjivanje se odnosi na humane PRLR vezujuće proteine, naročito na anti-PRLR antitela ili njihove delove koji se vezuju za antigen, koji vezuju PRLR, i koriste ih. Razni aspekti pronalaska odnose se na antitela i fragmente antitela, njihove konjugate i njihove farmaceutske sastave, kao i nukleinske kiseline, vektore rekombinantne ekspresije i ćelije domaćina za stvaranje takvih antitela i fragmenata. Metode korišćenja antitela pronalaska za otkrivanje humanog PRLR, da inhibiraju humanu PRLR aktivnost, bilo in vitro ili in vivo; i za sprečavanje ili tretiranje poremećaja kao što je kancer dojke takođe su obuhvaćeni pronalaskom.

[0068] Ukoliko se ovde ne definiše drugačije, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa ovim pronalaskom imaju značenja koja se obično razumeju od strane stručnjaka iz oblasti. Međutim, smisao i opseg pojmova bi trebalo da budu jasni, u slučaju bilo kakve latentne dvosmislenosti, definicije koje su ovde sadržane imaju presedan nad bilo kojim rečnikom ili spoljnom definicijom. Dalje, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, jedinstveni pojmovi uključuju množine i pojmovi u množini uključuju jednine. U ovoj primeni, upotreba „ili” znači „i/ili” osim ako nije drugačije navedeno. Štaviše, upotreba termina „uključujući”, kao i drugih oblika, kao što su „uključuje” i „je uključeno”, nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su „element” ili „komponenta” obuhvataju i elemente i komponente koji sadrže jednu jedinicu i elemente i komponente koji sadrže više od jedne pod-jedinice, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0069] Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike ćelijske i kulture tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i proteina i hemije nukleinske kiseline i hibridizacije opisane ovde su poznate i najčešće se koriste u tehnici. Metode i tehnike predmetnog pronalaska se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike i kako su opisani u raznim opštim i specifičnijim referencama koje se citiraju i razmatraju u celoj ovoj specifikaciji osim ako nije drugačije naznačeno. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode u skladu sa specifikacijama proizvođača, što se obično postiže u struci ili kako je ovde opisano. Nomenklature koje se koriste u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde su poznate i najčešće se koriste u tehnici. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulaciju i isporuku i tretiranje pacijenata.

[0070] Da bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, odabrani termini su definisani u nastavku.

[0071] Pojam „polipeptid” koji se ovde koristi, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. Termini „peptid” i „protein” koriste se naizmenično sa terminom polipeptid, a takođe se odnose na polimerni lanac aminokiselina. Pojam „polipeptid” obuhvata prirodne ili veštačke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge proteinske sekvence.

Polipeptid može biti monomerni ili polimerni.

[0072] Termin „izolovani protein” ili „izolovani polipeptid” je protein ili polipeptid koji zbog svog porekla ili izvora derivacije nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u svom izvornom stanju; suštinski bez drugih proteina iste vrste; izražava ćelija iz različite vrste; ili se ne javlja u prirodi. Prema tome, polipeptid koji je hemijski sintetisan ili sintetisan u ćelijskom sistemu koji je različit od ćelije iz koje prirodno potiče, biće „izolovan” iz prirodno povezanih komponenti. Takođe, protein može biti suštinski slobodan od prirodno povezanih komponenti izolacijom, koristeći tehnike prečišćavanja proteina koje su dobro poznate u ovoj oblasti.

[0073] Termin „oporavljanje” kako se ovde koristi, odnosi se na proces izrade hemijskog tipa, kao što je polipeptid koji je u suštini bez prirodno povezanih komponenti putem izolacije, na primer, koristeći tehnike prečišćavanja proteina koje su dobro poznate u ovoj oblasti.

[0074] Termini „humani PRLR” i „humani PRLR divljeg tipa” (skraćeni ovde kao hPRLR, hPRLRvt), kako se ovde koriste, odnose se na jedan citokini receptor koji obuhvata jedan membranski sloj. Humani PRLR uključuje vanćelijski region koji se vezuje za prolaktin, transmembranski region i citoplazmatski region. Termin humani PRLR ima za cilj uključivanje rekombinantnog humanog PRLR (rhPRLR), koji se može pripremiti standardnim metodama rekombinantne ekspresije. Tabela 1 daje aminokiselinsku sekvencu humanog PRLR (tj., SEQ ID NO:1) i njegovog vanćelijskog domena (tj., SEQ ID NO:2), koji su poznati u stanju tehnike. Pored toga, razni izoformi hPRLR su poznati u struci i navedeni su u Tabeli 1 u nastavku.

TABELA 1: Sekvenca humanog PRLR

[0075] „Biološka aktivnost” kako se ovde koristi, odnosi se na sve inherentne biološke osobine prolaktin receptora. Biološke osobine PRLR uključuju, ali nisu ograničene na vezivanje prolaktina, vezujući hormon rasta, vezujući placentalni laktogen, aktivaciju JAK2 kinaze, aktivaciju transmembranskog receptora proteina tirozin kinaze, anti-apoptotske aktivnosti, signalizaciju receptora na površini ćelija, signalizaciju posredovanu citokinom, uključivanje u implantaciju embriona, aktivnost JAK-STAT kaskade, aktivnost JAK STAT kaskade uključene u signalizaciju rasta hormona, uključivanje u laktaciju, uključivanje u razvoj alveolusa mlečne žlezde, uključivanje u diferencijaciji epitelnih ćelija mlečne žlezde, uključivanje u razvoju epitela u predelu mlečne žlezde, uključivanje u rast žlezda prostate, regulacija adhezije ćelija, regulacija diferencijacije epitelnih ćelija, aktivnost biosintetike steroida i aktivacija T ćelija.

[0076] Termini „specifično vezivanje” ili „specifično vezuje”, kako se ovde koriste, u odnosu na interakciju antitela, proteina ili peptida sa drugom hemijskom vrstom, znači da interakcija zavisi od prisustva određene strukture (npr., antigenska determinanta ili epitop) na hemijskim vrstama; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se za specifičnu strukturu proteina, a ne za proteine uopšte. Ako je antitelo specifično za epitop „A”, prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodni, neoznačen A), u reakciji koja sadrži oznaku „A” i antitelo, smanjiće količinu označenog A vezanog za antitelo .

[0077] Termin „antitelo”, kako se ovde koristi, široko se odnosi na bilo koji molekul imunoglobulina (Ig) koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca ili bilo kojeg funkcionalnog fragmenta, mutanta, varijante ili derivacija koja zadržava suštinske karakteristike vezivanja epitopa Ig molekula. Takvi mutanti, varijante ili derivati formata antitela su poznati u tehnici. Neograničavajuća otelotvorenja o kojima se govori u nastavku.

[0078] U antitelu pune dužine, svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. Regioni VH i VL mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), koji se provlače sa regionima koji su konzervisani, označeni kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoje od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.

[0079] Termin „antigen vezujući deo” antitela (ili jednostavno „deo antitela"), kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (npr., hPRLR). Pokazano je da funkcija vezivanja antigena antitela može biti izvedena fragmentima celokupnog antitela. Takva otelotvorenja antitela mogu takođe biti bispecifičnih, dvospecifičnih ili multispecifičnih formata; posebno vezuju za dva ili više različitih antigena. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom „antigen vezujući deo” antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od domena VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom na zavisnom području; (iii) Fd fragment koji se sastoji iz domena VH i CH1; (iv) Fv fragment koji se sastoji iz VL i VH domena jedne ruke antitela, (v) dAb fragmenta (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546, Winter i dr., PCT objava WO 90/05144 A1), koji sadrži jedinstveni varijabilni domen; i (vi) izolovano područje za određivanje komplementarnosti (CDR). Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genom, mogu se spojiti, koristeći rekombinantne metode, pomoću sintetičkog veznika koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kojem su VL i VH regioni za formiranje monovalentnih molekula (poznatih kao jednolančani Fv (scFv), videti npr., Bird i dr. (1988) Science 242:423-426; i Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe su namenjena da se obuhvate terminom „antigen vezujući deo” antitela. Ostali oblici jednolančanih antitela, kao što su diatela, takođe su obuhvaćeni. Diatela su dvovalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni izraženi u jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći veznik koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se domeni prisiljavaju da se uparuju sa komplementarnim domenima (videti npr., Holliger, P., i dr. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., i dr. (1994) Structure 2:1121-1123). Takvi antigen vezujući delovi su poznati u stanju tehnike (Kontermann i Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

[0080] Termin „konstrukcija antitela” kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji sadrži jedno ili više antitela ili antigen vezujućih fragmenata iz ovog pronalaska vezanog za vezni polipeptid ili konstantni domen imunoglobulina. Vezivni polipeptidi sadrže dva ili više aminokiselinskih ostataka spojenih peptidnim vezama i koriste se za povezivanje jednog ili više antigen vezujućih delova. Takvi vezivni polipeptidi su dobro poznati u stanju tehnike (videti npr., Holliger, P., i dr. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., i dr. (1994) Structure 2:1121-1123). Konstantni domen imunoglobulina odnosi se na konstantni domen teškog ili lakog lanca. Humani IgG teški lanac i sekvence konstantnog domena aminokiselina lakog lanca su poznati u stanju tehnike i prikazani su u Tabeli 2.

[0081] Dodatno, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti deo većih molekula imunoadhezije, formiranih pomoću kovalentne ili nekovalentne asocijacije antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezijskih molekula uključuju upotrebu jezgra streptavidinskog jezgra kako bi se napravio tetramerni scFv molekul (Kipriyanov, S.M., i dr. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i upotrebu ostatka cisteina, markerskog peptida i C-terminalne polihistidinske oznake za bivalentne i biotinilovane scFv molekule (Kipriyanov, S.M., i dr. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2fragmenti, mogu biti pripremljeni od celih antitela koristeći konvencionalne tehnike, kao što su papain ili digestija pepsina, respektivno, čitavih antitela. Štaviše, antitela, delovi antitela i molekuli imunoadhezije mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK, kako je ovde opisano.

[0082] „Izolovano antitelo”, kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje hPRLR je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene, osim hPRLR ). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hPRLR može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su PRLR molekuli iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0083] Termin „humano antitelo”, kako se ovde koristi, želi da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci za germinativnu liniju. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina za germinativnu liniju (npr., mutacije uvedene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-u i posebno CDR3. Međutim, termin „humano antitelo”, kako se ovde koristi, nije namenjen uključivanju antitela u kojima su CDR sekvence dobijene iz germinativne linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, presađene na humanim okvirnim sekvencama.

[0084] Termin „rekombinantno humano antitelo”, kako se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati sva humana antitela koja se pripremaju, vrše ekspresiju, stvaraju ili izoluju pomoću rekombinantnih sredstava, kao što su antitela izražena korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćinu (opisano dalje u Odeljku II C, ispod), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne humane biblioteke antitela (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech.15:62-70; Azzazy H., i Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., i Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., i Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koji je transgenski za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor, L. D., i dr. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295; Kellermann S-A., i Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. i dr (2000) Immunology Today 21:364-370) ili antitela koja su pripremljena, izražena, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvenci genskih imunoglobulina u druge sekvence DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. U nekim otelotvorenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinjski transgeni za sekvence humanih Ig, in vivo somatska mutageneza) i stoga su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako izvedene iz i povezanih sa humanim germinativnim linijama VH i VL sekvenci, ne mogu prirodno da postoje unutar repertoara germinativnih linija humanih antitela in vivo. Jedno otelotvorenje obezbeđuje potpuno humana antitela sposobna za vezivanje humanog PRLR koji se može generisati korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, upotrebu humanih Ig fagnih biblioteka kao što su one obelodanjene u Jermutus i dr., objavi PCT br. WO 2005/007699 A2.

[0085] Termin „himerno antitelo” odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teških i lakih lanaca jedne vrste i sekvence konstantnog regiona druge vrste, kao što su antitela koja imaju varijabilne regione teškog i lakog lanca miševa vezane za humane konstantne regione.

[0086] Termin „CDR-kalemljeno antitelo” odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca jedne vrste, ali u kojoj su sekvence jednog ili više CDR regiona VH i/ili VL zamenjene CDR sekvencama druge vrste, kao što su antitela koja imaju varijabilne regione teških i lakih lanaca u kojima je jedan ili više CDR miša (npr., CDR3) zamenjen humanim CDR sekvencama.

[0087] Termini „Kabat numerisanje”, „Kabat definicije” i „Kabat označavanje” se koriste naizmenično. Ovi termini, koji su prepoznati u struci, odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj., hipervarijabilni) od drugih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela, ili njegov antigen vezujući deo (Kabat i dr. (1971) Ann. NY Acad, Sci.190:382-391 i , Kabat, E.A., i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Za varijabilni region teškog lanca, hipervarijabilni region se kreće od aminokiselinskih pozicija 31 do 35 za CDR1, aminokiselinskih pozicija od 50 do 65 za CDR2, i aminokiselinskih pozicija od 95 do 102 za CDR3. Za varijabilni region lakog lanca hipervarijabilni region se kreće od aminokiselinskih pozicija 24 do 34 za CDR1, aminokiselinskih pozicija od 50 do 56 za CDR2 i aminokiselinskih pozicija od 89 do 97 za CDR3.

[0088] Kako se ovde koristi, termini „primalac” i „primalac antitela” odnose se na antitelo ili sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili 100% sekvenci aminokiselina jednog ili više okvira. U nekim aspektima, termin „primalac” se odnosi na aminokiselinu antitela ili sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira konstantni region(e). U još jednom aspektu, termin „primalac” se odnosi na aminokiselinu antitela ili sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira jedan ili više okvira i konstantne regione. U specifičnom aspektu, termin „primalac” se odnosi na aminokiselinu antitela ili sekvencu nukleinskih kiselina koji obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% % ili 100% sekvenci aminokiselina jednog ili više okvira. U skladu sa ovim aspektom, primalac može sadržati najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, ili najmanje 10 aminokiselinskih ostataka koji se (ne) nalaze na jednoj ili više specifičnih pozicija humanog antitela. Okvirni region primaoca i/ili konstantnog regiona primaoca mogu biti, na primer, izvedeni ili dobijeni iz zrelog gena za germinativnu liniju, zrelog gena antitela, funkcionalnog antitela (npr., antitela dobro poznata u stanju tehnike, antitela u razvoju, ili antitela koja su komercijalno dostupna).

[0089] Kao što se ovde koristi, termin „CDR” se odnosi na region za određivanje komplementarnosti u varijabilnim sekvencama antitela. Postoje tri CDR u svakom od varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca, koji su označeni CDR1, CDR2 i CDR3, za svaki od varijabilnih regiona. Termin „CDR set” koji se ovde koristi odnosi se na grupu od tri CDR koja se javljaju u jednom varijabilnom regionu sposobnom za vezivanje antigena.

Tačne granice ovih CDR su različito definisane prema različitim sistemima. Sistem koji je opisao Kabat (Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) i (1991)) ne samo da obezbeđuje nedvosmislen sistem numerisanja ostataka koji se primenjuje na bilo koji varijabilni region antitela, ali takođe pruža precizne granice ostataka koji definišu tri CDR. Ovi CDR-i mogu se nazvati Kabat CDR-i. Chothia i saradnici (Chothia i dr., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987) i Chothia i dr., Nature 342:877-883 (1989)) utvrdili su da određene pod- identične peptidne konformacijske mreže, uprkos tome što imaju veliku raznolikost na nivou aminokiselinske sekvence. Ovi pod-delovi označeni su kao L1, L2 i L3 ili H1, H2 i H3 gde su „L” i „H” označeni laki lanac i regioni teških lanaca, respektivno. Ovi regioni se mogu nazvati Chothia CDR-i, koji imaju granice koje se preklapaju sa Kabat CDR. Druge granice koje definišu CDR-e koji se preklapaju sa CDR Kabata opisali su Padlan (FASEB J.9:133-139 (1995)) i MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). I dalje druge definicije granica CDR ne mogu striktno pratiti jedan od gore navedenih sistema, ali se ipak preklapaju sa CDR Kabata, mada mogu biti skraćene ili produžene u svetlu predviđanja ili eksperimentalnih nalaza da određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak čitavih CDR-ova nisu značajno uticali na vezivanje antigena. Metode koje se ovde koriste mogu da koriste CDR definisane u skladu sa bilo kojim od ovih sistema, iako preferirani aspekti koriste Kabat ili Chothia definisane CDR.

[0090] Kako se ovde koristi, termin „kanonski” ostatak odnosi se na ostatak u CDR ili okviru koji definiše određenu kanonsku CDR strukturu kao što je definisano od Chothia i dr. (J. Mol. Biol.196:901-907 (1987); Chothia i dr., J. Mol. Biol.227:799 (1992)). Prema Chothia i dr., kritični delovi CDR-ova mnogih antitela imaju gotovo identične konformacije peptidnih potpora uprkos velikoj raznolikosti na nivou aminokiselinske sekvence. Svaka kanonička struktura prvenstveno određuje set peptidnih uglova torzije potpore za susedni segment aminokiselinskih ostataka koji formiraju petlju.

[0091] Kako se ovde koristi, termini „donor” i „donatorsko antitelo” odnose se na antitelo koje pruža jedan ili više CDR-ova. U poželjnom aspektu, donatorsko antitelo je antitelo od vrste različite od antitela iz kojeg se dobijaju ili izvodu okvirni regioni. U kontekstu humanizovanog antitela, termin „donatorsko antitelo” odnosi se na nehumano antitelo koje pruža jedan ili više CDR-ova.

[0092] Kako se ovde koristi, termin „okvir” ili „okvirna sekvenca” odnosi se na preostale sekvence varijabilnog regiona bez CDR. Pošto tačna definicija CDR sekvence može biti određena različitim sistemima, značenje okvirne sekvence podleže odgovarajućim različitim tumačenjima. Šest CDR-ova (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 lakog lanca i CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog lanca) takođe deli okvirne regione na lakom lancu i teškom lancu četiri podregiona (FR1, FR2, FR3 i FR4) na svakom lancu, u kojima je CDR1 pozicioniran između FR1 i FR2, CDR2 između FR2 i FR3, i CDR3 između FR3 i FR4. Bez preciziranja pojedinih podregiona kao FR1, FR2, FR3 ili FR4, okvirni region, kako ga pominju drugi, predstavljaju kombinovane FR u varijabilnom regionu jednog, prirodnog imunoglobulinskog lanca. Kao što se ovde koristi, FR predstavlja jednu od četiri podregiona, a FR predstavlja dva ili više od četiri podregiona koji čine okvirni region.

[0093] Humane sekvence primaoca lakog lanca i teškog lanca su poznati u stanju tehnike. U jednom aspektu, sekvence primaoca humanog teškog lanca i lakog lanca su izabrane iz sekvenci opisanih u Tabeli 3 i Tabeli 4.

[0094] Kako se ovde koristi, termin „gen germinativne linije antigena” ili „genski fragment” odnosi se na imunoglobulinsku sekvencu kodiranu nelimfoidnim ćelijama koje nisu prošle proces sazrevanja što dovodi do genetskog preuređivanja i mutacije za ekspresiju određenog imunoglobulina. (videti, npr., Shapiro i dr., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis i dr., Adv Exp Med Biol.484:13-30 (2001)). Geni germinativne linije antitela su verovatnije od zrelog gena antitela kako bi se očuvale esencijalne strukture aminokiselinskih sekvenci koje su karakteristične za pojedince u toj vrsti, pa je manje verovatno da će ih prepoznati iz stranog izvora kada se terapeutski koriste u toj vrsti.

[0095] Kako se ovde koristi, termin „ključni” ostaci se odnose na određene ostatke unutar varijabilnog regiona koji imaju veći uticaj na specifičnost vezivanja i/ili afinitet antitela, posebno humanizovanog antitela. Ključni ostatak uključuje, ali nije ograničen na, jedno ili više od sledećeg: ostatak koji se nalazi u blizini CDR, potencijalnog mesta glikozilacije (može biti ili N- ili O- mesto glikozilacije), retki ostatak, ostatak sposoban za interakciju sa antigenom, ostatak sposoban za interakciju sa CDR, kanonski ostatak, kontaktni ostatak između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca, ostatka unutar zone Vernier i ostatak u regionu koji se preklapa definicija Chothia varijabilnog teškog lanca CDR1 i definicija Kabata prvog okvira teškog lanca.

[0096] Kao što je ovde korišćeno, termin „humanizovano antitelo” je antitelo ili varijanta, derivat, analog ili njegov fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen koji je od interesa i koji obuhvata okvirni (FR) region koji ima u suštini aminokiselinsku sekvencu humanog antitela i komplementarno determinantni region (CDR) koji ima u suštini aminokiselinsku sekvencu nehumanog antitela. Kako se ovde koristi, termin „u suštini” u kontekstu CDR odnosi se na CDR koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identično sa aminokiselinskom sekvencom nehumanog antitela CDR. Humanizovano antitelo sadrži suštinski sve najmanje jedan, a tipično dva varijabla domena (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima koji nisu humanog imunoglobulina (tj., donatorsko antitelo) i svi ili u suštini svi okvirni regioni su one konvencije humanog imunoglobulina. Poželjno, humanizovano antitelo takođe sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog humanog imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, humanizovano antitelo sadrži i laki lanac, kao i bar varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može obuhvatiti CH1, šarke, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovani laki lanac. U nekim otelotvorenjima, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovani teški lanac. U specifičnim otelotvorenjima, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovani varijabilni domen lakog lanca i/ili humanizovani teški lanac.

[0097] Humanizovano antitelo može se odabrati iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući bez ograničenja IgG 1, IgG2, IgG3 i IgG4. Humanizovano antitelo može sadržati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa, a određeni konstantni domeni mogu biti odabrani da optimizuju željene efektorske funkcije koristeći tehnike dobro poznate u struci.

[0098] Okvirni i CDR regioni humanizovanog antitela ne moraju precizno odgovarati roditeljskim sekvencama, npr., CDR donatorskog antitela ili okvir konsenzusa mogu biti mutagenizovani supstitucijom, umetanjem i/ili uklanjanjem najmanje jednog aminokiselinskog ostatka, tako da CDR ili okvirni ostatak na toj lokaciji ne odgovara niti donatorskom antitelu, niti konsenzusnom okviru. U poželjnom aspektu, takve mutacije, međutim, neće biti opsežne. Obično najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, a najpoželjnije najmanje 95% ostataka humanizovanih antitela će odgovarati onima iz roditeljskih FR i CDR sekvenci. Kako se ovde koristi, termin „konsenzusni okvir” odnosi se na okvirni region u konsenzusnoj imunoglobulinskoj sekvenci. Kao što se ovde koristi, termin „konsenzusna imunoglobulinska sekvenca” odnosi se na sekvencu formiranu od najčešćih aminokiselina (ili nukleotida) u porodici srodnih imunoglobulinskih sekvenci (videti npr., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987.) U porodici imunoglobulina, svaka pozicija u konsenzusnoj sekvenci je zauzimana aminokiselinom koja se najčešće javlja na toj poziciji u porodici. Ako se dve aminokiseline pojavljuju jednako često, bilo koja se može uključiti u konsenzusnu sekvencu.

[0099] Kao što je ovde korišćeno, zona „Vernier” odnosi se na podskup okvira ostataka koji mogu prilagoditi strukturu CDR i fino podesiti sposobnost antigena kao što je opisao Foote i Winter (1992, J. Mol. Biol.224:487-499). Ostaci Vernier zone formiraju sloj koji leži u CDR-u i mogu uticati na strukturu CDR-ova i afinitet antitela.

[0100] Termin „multivalentni vezujući protein” se koristi u ovoj specifikaciji kako bi označio vezujući protein koji sadrži dva ili više mesta za vezivanje antigena. Multivalentni vezujući protein je poželjno projektovan da ima tri ili više mesta za vezivanje antigena i, generalno, nije prirodno antitelo. Pojam „multispecifični vezujući protein” odnosi se na vezujući protein koji može povezati dve ili više srodnih ili nepovezanih meta. Proteini koji vezuju dvostruki varijabilni domen (DVD) kao što se ovde koriste, su vezujući proteini koji sadrže dva ili više mesta za vezivanje antigena i tetravalentni ili multivalentni vezujući proteini. Takvi DVD-ovi mogu biti monospecifični, tj., sposobni da vezuju jedan antigen ili multispecifičan, tj., sposobni da vezuju dva ili više antigena. DVD vezujući proteini koji se sastoje od dva polipeptida teškog lanca i dva polipeptida lakog lanca su upućeni na DVD Ig. Svaka polovina DVD-a Ig sadrži DVD polipeptid teškog lanca, DVD polipeptid lakog lanca i dva antigen vezujuća mesta. Svako mesto vezivanja sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa ukupno 6 CDR-ova koji su uključeni u vezivanje antigena na mestu vezivanja antigena.

[0101] Kako se ovde koristi, termin „neutralizacija” se odnosi na neutralizaciju biološke aktivnosti receptora citokina kada vezujući protein specifično vezuje receptor citokina.

Poželjno, neutralizujući vezujući protein je neutralizirajuće antitelo čije vezivanje za hPRLR rezultira inhibicijom biološke aktivnosti hPRLR. Poželjno, neutralizujući vezujući protein vezuje hPRLR i smanjuje biološku aktivnost hPRLR za najmanje oko 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više. Inhibicija biološke aktivnosti hPRLR pomoću neutralizirajućeg vezujućeg proteina može se proceniti merenjem jednog ili više pokazatelja hPRLR biološke aktivnosti dobro poznate u struci. Na primer, može se meriti inhibicija fosforilacije PRLR, pSTAT5 ili ERK1/2 u PRLR ekspresionoj ćelijskoj liniji, na primer, ćelijska linija T47D karcinoma dojke. Alternativno, inhibicija proliferacije PRLR ekspresivnih ćelijskih linija, npr. Baf3 pro-B limfoidnih ćelija transfektovanih sa humanim PRLR, Nb2-11 ćelijama limfoma ćelija pacova, MDA-MB-231-PRLR karcinom ćelija karcinoma dojke transfektovane sa PRLR ili BT474 karcinomom dojke ćelije, mogu se meriti.

[0102] Termin „aktivnost” obuhvata aktivnosti kao što su vezivanje specifičnosti/afiniteta antitela za antigen, na primer, anti-hPRLR antitelo koje se vezuje za hPRLR antigen i/ili neutralizirajuću potentnost antitela, na primer, anti-hPRLR antitelo čije vezivanje za hPRLR inhibira biološku aktivnost hPRLR, npr. inhibiciju fosforilacije PRLR, pSTAT5 ili ERK1/2 u PRLR ekspresionoj ćelijskoj liniji, npr. ćelijska linija T47D karcinoma dojke ili inhibicija proliferacije PRLR eksprimirajuće ćelijske linije, npr. Ba/F3 pro-B limfoidne ćelije transfektovane sa humanim PRLR, Nb2-11 ćelijama limfoma ćelija pacova, MDA-MB-231-PRLR ćelijama karcinoma dojke transfektovane sa PRLR ili BT474 ćelijama karcinoma dojke.

[0103] Pojam „epitop” obuhvata bilo koju polipeptidnu determinantu sposobnu za specifično vezivanje za vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući deo. U određenim aspektima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil i, u određenim aspektima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike punjenja. U različitim aspektima, epitop može biti linearan ili sekvencijalni epitop, tj. linearna sekvenca aminokiselina, primarne strukture antigena, tj. PRLR.

Alternativno, u drugim aspektima, epitop može biti konformacioni epitop koji ima specifičan trodimenzionalni oblik kada antigen preuzme svoju sekundarnu strukturu. Na primer, konformacioni epitop može sadržati nelinearne, tj., nesekvencijalne, aminokiseline antigena.

[0104] U određenom aspektu, epitop je region antigena koji je vezan za vezujući protein, npr. Antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen. U određenim aspektima, rečeno je da vezujući protein, npr., antitelo ili njegov deo vezivanja antigena specifično vezuju antigen kada prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. U određenom aspektu, epitop antigena, tj. PRLR, uključuje ostatke aminokiselina unutar 4 angstroma (Å) vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela, kada je vezujući protein vezan za antigen.

[0105] Termin „površinska plazmonska rezonanca”, kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu putem detekcije izmena u koncentracijama proteina u biosenzornoj matrici, na primer pomoću BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden i Piscataway, NJ). Za dalje opise, videti Jönsson, U., i dr. (1993) Ann. Biol. Clin.51:19-26; J6nsson, U., i dr. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., i dr. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; i Johnnson, B., i dr. (1991) Anal. Biochem.198:268-277.

[0106] Termin „kon”, kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na konstantu brzine za povezivanje antitela sa antigenom kako bi se formirao kompleks antitela/antigena, kako je poznato u stanju tehnike.

[0107] Termin „koff”, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na konstantnu brzine za disocijaciju antitela iz kompleksa antitela/antigena kao što je poznato u stanju tehnike.

[0108] Termin „KD”, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na konstantu disocijacije određene interakcije antitela/antigena, kako je poznato u stanju tehnike.

[0109] Termin „označeni vezujući protein” kako se ovde koristi, odnosi se na protein sa ugrađenom etiketom koja obezbeđuje identifikaciju vezujućeg proteina. Poželjno, etiketa je detektabilni marker, npr., ugrađivanje radioaktivno označene aminokiseline ili vezivanja na polipeptid biotinilnih grupa koje se mogu detektovati označenim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim metodama). Primeri etiketa za polipeptide obuhvataju, ali bez ograničenja, sledeće: radioizotopi ili radionukleidi (npr.,<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I,<177>Lu, 166Ho, ili 153Sm); fluorescentne etikete (npr., FITC, rodamin, lantanidni fosfor), enzimske etikete (npr., hren peroksidaza, luciferaza, alkalna fosfataza); hemiluminiscentne markere; biotinil grupe; prethodno određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog korespodenta (npr., sekvence para zipera leucina, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domen za vezivanje metala, oznake epitopa); i magnetnih agenasa, kao što su gadolinijumski helati.

[0110] Termin „konjugat antitelskih lekova” ili „ADC” odnosi se na vezujući protein, kao što je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, hemijski vezan za jedan ili više hemijskih sredstava koji mogu opciono biti terapeutski ili citotoksični agensi. Primeri sredstava koji se mogu koristiti u ADC-u pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, mitotske inhibitore, protitumorne antibiotike, imunomodulirajuće agense, vektore za gensku terapiju, sredstva za alkilovanje, antiangiogeni agensi, antimetaboliti, sredstva koji sadrže bor, sredstva za zaštitu od hemograma, hormoni, antihormonska sredstva, kortikosteroidi, fotoaktivni terapeutski agensi, oligonukleotidi, radionuklidni agensi, inhibitori topoizomeraze, inhibitori tirozin kinaze i radiosenzibilizatori.

[0111] Termin „agens” ili „lek” se ovde koristi da označava hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.

[0112] Termin „citotoksin” ili „citotoksično sredstvo” uključuje bilo koje sredstvo koje šteti (na primer, ubija) ćelije. U jednom aspektu pronalaska, antitelo opisano ovde je konjugovano sa citotoksičnim agensom.

[0113] Termini „kristal” i „kristalizovani” kako se ovde koriste, odnose se na antitelo ili njegov antigen vezujući deo koji postoji u obliku kristala. Kristali su jedan oblik čvrste materije, koji se razlikuje od drugih oblika kao što je amorfno čvrsto stanje ili tečno kristalno stanje. Kristali se sastoje od redovnih, ponavljajućih, trodimenzionalnih nizova atoma, jona, molekula (npr., proteina kao što su antitela) ili molekularnih sklopova (npr., antigen/antitelo kompleksa). Ovi trodimenzionalni nizovi su raspoređeni prema specifičnim matematičkim odnosima koji su dobro razumljivi u oblasti. Osnovna jedinica, ili građevinski blok, koji se ponavlja u kristalu, naziva se asimetrična jedinica. Ponavljanje asimetrične jedinice u aranžmanu koji odgovara datoj, dobro definisanoj kristalnog simetriji daje „jediničnu ćeliju” kristala. Ponavljanje jedinične ćelije redovnim prevodima u sve tri dimenzije obezbeđuje kristal. Videti Giege, R. i Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp.20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)."

[0114] Termin „polinukleotid” kako se ovde koristi odnosi se na polimerni oblik dva ili više nukleotida, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleotida ili modifikovanog oblika bilo kog tipa nukleotida. Termin obuhvata jednostruke i dvostruke vezane forme DNK, ali poželjno je dvostruka DNK.

[0115] Termin „izolovani polinukleotid”, kao što se ovde koristi, označava polinukleotid (npr. genomske, cDNK ili sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije) koji „svojom izolacijom polinukleotida” ne povezuje sa svim ili delom polinukleotida sa kojim se „izolovani polinukleotid” nalazi u prirodi; operativno je povezan sa polinukleotidom koji nije vezan u prirodi; ili se ne pojavljuje u prirodi kao deo veće sekvence.

[0116] Termin „vektor”, kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban za transport druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Jedan tip vektora je „plazmid”, koji se odnosi na kružnu dvostruko vezanu DNK petlju u koju se mogu dopuniti dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu povezati sa virusnim genom. Određeni vektori su sposobni za autonomne replikacije u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i episomalni vektor sisara). Drugi vektori (npr., neepisomalni vektor sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i time se replicira zajedno sa domaćim genomom. Pored toga, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena na koje su operativno povezane. Takvi vektori ovde se nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori” (ili jednostavno, „ekspresioni vektori"). Generalno, vektori ekspresije korisnosti u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U sadašnjoj specifikaciji, „plazmid” i „vektor” mogu se zamenljivo izmeniti, jer je plazmid najčešće koristi oblik vektora. Međutim, cilj pronalaska je da obuhvati i druge oblike vektora ekspresije, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektom, adenovirusi i adeno-pridruženi virusi), koji služe ekvivalentne funkcije.

[0117] Termin „funkcionalno povezan” odnosi se na jednakost u kojem su opisane komponente u odnosu koji dozvoljava da funkcionišu na svoj način. Kontrolna sekvenca „operativno povezana” sa sekvencom kodiranja je ligirana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže u uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama.

„Operativno povezane” sekvence uključuju i sekvencu kontrole ekspresije koja je susedna sa genom interesa za kontrolu ekspresije i ekspresije koji deluju trans ili na daljinu da bi kontrolisali gen koji je interesantan. Termin „sekvenca kontrole ekspresije” kako se ovde koristi odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da bi se učinilo ekspresijom i obradom kodirajućih sekvenci na koje se ligiraju. Serije kontrole ekspresije uključuju odgovarajuće inicijacije transkripcije, terminacije, promotera i pojačivača; efikasni signali za obradu RNK kao što su spajanje i poliadenilacijski signali; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost prevoda (tj. Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; i po potrebi, sekvence koje poboljšavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina; u prokariontima, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotera, mesto vezivanja ribosomala i sekvencu završetka transkripcije; u eukariotima, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotere i sekvencu završetka transkripcije. Termin „kontrolne sekvence” ima za cilj da uključi komponente čije je prisustvo neophodno za ekspresiju i obradu, a takođe mogu uključiti i dodatne komponente čije prisustvo je povoljno, na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera.

Proteinski konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu biti izraženi i prečišćeni korišćenjem vektora ekspresije i ćelija domaćina poznatih u stanju tehnike, uključujući ekspresione kasete, vektore, rekombinantne ćelije domaćine i postupke za rekombinantnu ekspresiju i proteolitičku obradu rekombinantnih poliproteina i pre-proteina iz jedan otvoreni okvir za čitanje (npr., WO 2007/014162).

[0118] „Transformacija”, kako je ovde definisana, odnosi se na bilo koji proces pomoću koga egzogena DNK ulazi u ćeliju domaćina. Transformacija se može javiti u prirodnim ili veštačkim uslovima koristeći različite metode koje su dobro poznate u stanju tehnike.

Transformacija se može oslanjati na bilo koju poznatu metodu za ubacivanje stranih nukleinskih kiselina u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćinu. Metoda je odabrana na osnovu ćelije domaćina koja se transformiše i može uključivati, ali nije ograničena na, virusnu infekciju, elektroporaciju, lipofekciju i bombardovanje čestica. Takve „transformisane” ćelije uključuju stabilno transformisane ćelije u kojima je ubačena DNK sposobna za replikaciju ili kao autonomno replicirajući plazmid ili kao deo hromozoma domaćina. Oni takođe uključuju ćelije koje tranzitno izražavaju ubačenu DNK ili RNK u ograničenom vremenskom periodu.

[0119] Termin „rekombinantna ćelija domaćina” (ili jednostavno „ćelija domaćina"), kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na ćeliju u koju je uveden egzogeni DNK. Treba shvatiti da takvi termini imaju za cilj da se ne odnose samo na određenu ćeliju subjekta, već na potomstvo takve ćelije. Budući da se u narednim generacijama mogu pojaviti određene modifikacije zbog mutacije ili uticaja na životnu sredinu, takva potomstva možda nisu identična sa roditeljskom ćelijom, ali su i dalje obuhvaćena pojmom „ćelija domaćina” kako se ovde koristi. Poželjno ćelije domaćina uključuju prokariotske i eukariotske ćelije odabrane iz bilo kojeg kraljevstva života. Preferirane eukariotske ćelije uključuju protističke, gljivične, biljne i životinjske ćelije. Najpoželjnije ćelije domaćina uključuju, ali nisu ograničene na prokariotske ćelijske linije E.Coli; ćelijske linije sisara CHO, HEK 293 i COS; linija ćelija insekata Sf9; i gljivične ćelije Saccharomyces cerevisiae.

[0120] Standardne tehnike mogu se koristiti za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što se obično postiže u stanju tehnike ili kako je ovde opisano. Prethodne tehnike i postupci mogu se generalno izvesti prema konvencionalnim postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike i kako su opisani u raznim opštim i specifičnijim referencama koji se citiraju i razmatraju u celoj ovoj specifikaciji. Videti, npr., Sambrook i dr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

[0121] „Transgenski organizam”, kako je poznato u struci i kako se ovde koristi, odnosi se na organizam koji ima ćelije koje sadrže transgen, pri čemu transgen uveden u organizam (ili predak organizma) izražava polipeptid koji se prirodno ne izražava u organizmu . „Transgen” je DNK konstrukt, koji se stabilno i operativno integriše u genom ćelije iz koje se razvija transgenski organizam, usmeravajući ekspresiju kodiranog proizvoda gena u jedan ili više ćelija ili tkiva transgenskog organizma.

[0122] Termin „regulišu” i „ ” koriste se izmenjivo i, kako se ovde koristi, odnosi se na promenu ili izmenu u aktivnostima molekula od interesa (npr., biološke aktivnosti hPRLR). Modulacija može biti povećanje ili smanjenje magnitude određene aktivnosti ili funkcije molekula od interesa. Primerne aktivnosti i funkcije molekula uključuju, ali nisu ograničene na, vezivne karakteristike, enzimsku aktivnost, aktivaciju ćelijskog receptora i transdukciju signala.

[0123] U skladu s tim, termin „modulator”, kao što je ovde korišćen, je jedinjenje sposobno za menjanje ili promenu aktivnosti ili funkcije molekula od interesa (npr., biološke aktivnosti hPRLR). Na primer, modulator može prouzrokovati povećanje ili smanjenje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcije uočenih u odsustvu modulatora. U određenim aspektima, modulator je inhibitor, koji smanjuje veličinu najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Primeri inhibitora uključuju, ali bez ograničenja, proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljene hidrate ili male organske molekule. Peptidi su opisani, npr., u WO01/83525.

[0124] Termin „agonist”, kako se ovde koristi, odnosi se na modulator koji, kada se kontaktira sa molekulom od interesa, uzrokuje povećanje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcije uočenih u odsustvu agonista. Posebni agonisti od interesa mogu uključiti, ali bez ograničenja na, hPRLR polipeptide ili polipeptide, nukleinske kiseline, ugljenih hidrata ili bilo kojih drugih molekula koji se vezuju za hPRLR.

[0125] Termin „antagonist” ili „inhibitor”, kako se ovde koristi, odnosi se na modulator koji, kada se kontaktira sa molekulom od interesa, uzrokuje smanjenje magnitude određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcija primećenih u odsustvu antagonista. Posebni antagonisti od interesa uključuju one koji blokiraju ili moduliraju biološku ili imunološku aktivnost hPRLR. Antagonisti i inhibitori hPRLR mogu uključiti, ali bez ograničenja na njih, proteine, nukleinske kiseline, ugljene hidrate ili bilo koje druge molekule koji se vezuju za hPRLR.

[0126] Termin „inhibitori vezivanja za prolaktin” odnosi se na sposobnost vezujućeg proteina da spreči vezivanje prolaktina ("PRL") za hPRLR. Takva inhibicija vezivanja za prolaktin bi rezultirala u smanjenju ili ukidanju biološke aktivnosti posredovane vezivanjem prolaktina na hPRLR.

[0127] Kako se ovde koristi, termin „efikasna količina” odnosi se na količinu terapije koja je dovoljna da smanji ili poboljša ozbiljnost i/ili trajanje poremećaja ili jedan ili više simptoma od toga, spreči napredovanje poremećaja, uzrokuje regresiju poremećaj, sprečava ponovnu pojavu, razvoj, početak ili progresiju jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem, otkrivanje poremećaja ili povećanje ili poboljšanje profilaktičkog ili terapijskog efekta druge terapije (npr. profilaktički ili terapeutski agens).

[0128] Termin „uzorak”, kako se ovde koristi, koristi se u najširem smislu. „Biološki uzorak”, kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na, svaku količinu supstance iz živog ili ranije živog bića. Takve žive stvari uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, miševe, pacove, majmune, pse, zečeve i druge životinje. Takve supstance uključuju, ali nisu ograničene na, krv, serum, urin, sinovijalnu tečnost, ćelije, organe, tkiva, koštanu srž, limfne čvorove i slezinu.

[0129] Kako se ovde koristi, termin „LFA102” odnosi se na humanizovano antitelo anti-PRLR humanog podtipa IgG1 kapa opisanog u WO 2008022295 A2 (Novartis) i koji sadrži teški lanac naveden u SEQ ID NO: 156 i lakom lancu navedenom u SEQ ID N0: 157.

LFA102 se vezuje za predloženi region za dimerizaciju PRLR-a na ne-ligandskom konkurentskom načinu i sprečava signalizaciju indukovanu PRL-om. LFA102 se vezuje za proksimalni D2 domen membrane PRLR, za koji se veruje da sadrži i dimerizacijski interfejs receptora. PRLR se ne vezuje za domen D1 (videti, npr., Damiano i dr., 2013, Molec.Cancer. Therapeuics, 12:295-305). Kao takav, dok je LFA102 sposoban da inhibira PRLR dimerizaciju, jer LFA102 ne pokazuje direktan kontakt sa D1 domenom PRLR-a koji sadrži većinu džepa vezanog za ligand, LFA102 izgleda da dozvoljava simultano vezivanje prolaktina u PRLR (videti npr., Damiano i dr., 2013, Molec.Cancer. Therapeuics, 12:295-305 i van i dr., 2010, J. Mol. Biol., 404:112-26).

I. Antitela koja vezuju humani hPRLR

[0130] Jedan aspekt predmetnog obelodanjivanja sadrži izolovana mišija monoklonska antitela ili njihove delove koji se vezuju za antigen koji se vezuju za PRLR sa visokim afinitetom, brzinom usporavanja i visokim neutralizacijskim kapacitetom. Drugi aspekt obelodanjivanja obezbeđuje himerna antitela koja vezuju PRLR. Treći aspekt obelodanjivanja obezbeđuje humanizovana antitela ili antigen vezujuće delove, koji vezuju PRLR. Poželjno, antitela ili njihovi delovi su izolovana antitela. Poželjno, antitela pronalaska su neutralizujuća humana anti-PRLR antitela.

A. Metod za izradu anti-PRLR antitela

[0131] Antitela iz ovog pronalaska mogu se napraviti bilo kojim od nekoliko tehnika poznatih u stanju tehnike.

1. Anti-PRLR monoklonska antitela koristeći tehnologiju hibridoma

[0132] Monoklonska antitela se mogu pripremiti koristeći širok spektar tehnika poznatih u stanju tehnike, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i fagnih displeja ili njihovih kombinacija. Na primer, monoklonska antitela mogu se proizvoditi koristeći tehnike hibridoma, uključujući one poznate u stanju tehnike i naučene iz, na primer, in Harlow i dr. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling, i dr., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Termin „monoklonsko antitelo” koji se ovde koristi nije ograničen na antitela proizvedena kroz tehnologiju hibridoma. Termin „monoklonsko antitelo” odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, a ne način na koji se proizvodi.

[0133] Metode za proizvodnju i skrining za specifična antitela korišćenjem tehnologije hibridoma su rutinske i dobro poznate u stanju tehnike. U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje metode generisanja monoklonskih antitela, kao i antitela proizvedena postupkom koji obuhvata kultivisanje hibridoma ćelije koja luči antitelo obelodanjivanja, pri čemu se, poželjno, hibridom generiše fuzionim splenocitima izolovanim od miša imuniziranog sa antigen obelodanjivanja sa ćelijama mijeloma i zatim skrining hibridoma koji nastaju iz fuzije za klonove hibridoma koji luče antitelo sposobno za vezivanje polipeptida obelodanjivanja (videti Primer 1). Ukratko, miševi se mogu imunizirati sa PRLR antigenom. U poželjnom aspektu, PRLR antigen se daje sa adjuvansom za stimulisanje imunskog odgovora. Takvi adjuvansi uključuju potpun ili nepotpun Freundov adjuvans, RIBI (muramil dipeptide) ili ISCOM (imunostimulirajuće komplekse). Takvi adjuvansi mogu zaštititi polipeptid od brze disperzije tako što ga uvode u lokalni depozit, ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina da luči faktore koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunološkog sistema. Poželjno, ako se polipeptid primenjuje, raspored imunizacije će obuhvatiti dva ili više davanja polipeptida, raspoređenih tokom nekoliko nedelja.

[0134] Posle imunizacije životinje sa PRLR antigenom, životinje mogu dobiti antitela i/ili ćelije koje proizvode za antitela. Serum koji sadrži anti-PRLR antitelo se dobija od životinje krvarenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti jer se dobija od životinje, može se dobiti imunoglobulinska frakcija iz seruma, ili anti-PRLR antitela mogu biti prečišćena iz seruma. Serum ili imunoglobulini dobijeni na ovaj način su poliklonalni, čime imaju heterogeni niz svojstava.

[0135] Kada se detektuje imuni odgovor, npr., antitela specifična za antigen PRLR su detektovana u serumu miša, slezina miša se sakuplja i izolovani splenociti. Splenociti su onda spojeni poznatim tehnikama sa bilo kojim pogodnim ćelijama mijeloma, na primer ćelijama iz ćelijske linije SP20 dostupne iz ATCC-a. Hibridomi su izabrani i klonirani ograničenim razblaženjem. Klonovi hibridoma se zatim analiziraju metodima poznatim u struci za ćelije koje luče antitela sposobna za vezivanje PRLR. Ascitova tečnost, koja obično sadrži visoke nivoe antitela, može se generisati imunizacijom miševa sa pozitivnim klonovima hibridoma.

[0136] U drugom aspektu, imortalizovani hibridomi koji proizvode antitela mogu se dobiti od imunizovane životinje. Nakon imunizacije, životinja se žrtvuje, a slezinske B ćelije spojene su sa imortalizovanim ćelijama mijeloma, kako je dobro poznato u struci. Videti, npr., Harlow i Lane, supra. U poželjnom aspektu, ćelije mijeloma ne luče imunoglobulinske polipeptide (nesekretornu ćelijsku liniju). Nakon fuzije i selekcije antibiotika, hibridomi se pregledaju koristeći PRLR ili njegov deo ili ćelija koja izražava PRLR. U poželjnom aspektu, početni skrining se izvodi pomoću imuno-testa vezanog enzima (ELISA) ili radio imuno-testa (RIA), poželjno ELISA. Primer ELISA skrininga je dat u WO 00/37504.

[0137] Hibridomi koji proizvode anti-PRLR antitela su selektovani, klonirani i dalje pregledani za poželjne karakteristike, uključujući robustan rast hibridoma, visoku proizvodnju antitela i poželjne karakteristike antitela, kao što je razmatrano dalje u nastavku. Hibridomi mogu biti kultivisani i prošireni in vivo kod singeničnih životinja, kod životinja kojima nedostaje imuni sistem, npr. golih miševa ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Metode izbora, kloniranja i proširenja hibridoma su dobro poznate stručnjacima u stanju tehnike.

[0138] U poželjnom aspektu, hibridomi su hibridomi miševa, kao što je gore opisano. U još jednom poželjnom aspektu, hibridomi se proizvode u ne-humanim, ne-mišijim vrstama kao što su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. U drugom aspektu, hibridomi su humani hibridomi, u kojima je humani ne-sekretorni mijelom spojen sa humanom ćelijom koja izražava anti-PRLR antitelo.

[0139] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu se generisati poznatim tehnikama. Na primer, Fab i F(ab')2fragmenti pronalaska mogu se proizvoditi proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, koristeći enzime kao što je papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2fragmenata). F(ab')2fragmenti sadrže varijabilni region, konstantni region lakog lanca i CHI domen teškog lanca.

2. Anti-PRLR monoklonska antitela koristeći SLAM

[0140] U drugom aspektu obelodanjivanja, rekombinantna antitela se generišu od pojedinačnih, izolovanih limfocita koristeći metodu koja je u struci opisana kao metoda odabira limfocitnih antitela (SLAM), kako je opisano u patentu SAD 5,627,052, PCT objava WO 92/02551 i Babcock, JS i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 93: 7843-7848. U ovoj metodi, pojedine ćelije koje sekretiraju antitela od interesa, npr. limfociti izvedeni iz bilo koje od imunizovanih životinja opisanih u odeljku 1, skrining se koristi antigen-specifični hemolitički test kuge, pri čemu antigen PRLR, podjedinica PRLR, ili njegov fragment, povezan je sa crvenim krvnim zrncima ovaca koristeći veznik, kao što je biotin, i koriste se za identifikaciju pojedinačnih ćelija koje luče antitela sa specifičnostima za PRLR. Posle identifikovanja ćelija koje su od interesa za sekiranje antitela, cDNK varijabilni regioni teških i lakih lanaca izvađene su iz ćelija pomoću reverzne transkriptaze-PCR i onda se ovi promenljivi regioni mogu izraziti u kontekstu odgovarajućih regiona konstantnih imunoglobulina (npr. konstantni regioni), u ćelijama domaćina sisara, kao što su COS ili CHO ćelije. Ćelije domaćina transfektovane sa amplifikovanim imunoglobulinskim sekvencama, izvedenim iz in vivo izabranih limfocita, mogu zatim proći dalju analizu i selekciju in vitro, na primer, pomerajući transfektovane ćelije da izoluju ćelije koje izražavaju antitela u PRLR. Ojačane sekvence imunoglobulina mogu dalje manipulisati in vitro, kao što su in vitro metode sazrevanja afiniteta, kao što su one opisane u PCT objavi WO 97/29131 i PCT objavi WO 00/56772.

3. Anti-PRLR monoklonska antitela koristeći transgenske životinje

[0141] U drugom aspektu predmetnog obelodanjivanja, antitela se proizvode imunizacijom nehumanih životinje koja sadrži neku ili sve lokacije lokusa imunoglobulina sa PRLR antigenom. U poželjnom aspektu, životinja koja nije čovek je transgenski XENOMOUSE miš, projektovan soj miševa koji sadrži velike fragmente humanih imunoglobulinskih lokusa i nedostatak u proizvodnji mišijih antitela. Videti, npr.,Green i dr. Nature Genetics 7:13-21 (1994) i patente SAD 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 i 6,130,364. Videti takođe WO 91/10741, objavljen 25. jula,1991, WO 94/02602, objavljen 3. februara, 1994, WO 96/34096 i WO 96/33735, oba objavljena 31. oktobra, 1996, WO 98/16654, objavljen 23. aprila, 1998, WO 98/24893, objavljen 11. juna, 1998, WO 98/50433, objavljen 12. novembra, 1998, WO 99/45031, objavljen 10. septembra, 1999, WO 99/53049, objavljen 21. oktobra, 1999, WO 0009560, objavljen 24. februara, 2000 i WO 00/037504, objavljen 29. juna, 2000. Transgenski XENOMOUSE miš proizvodi humani repertoar potpuno humanih antitela i stvara humane Mab-ove specifične za antigen.

Transgenski XENOMOUSE miš sadrži oko 80% humanog repertoara antitela kroz uvođenje megabaza, YAC fragmenta humanog teškog lanca i lokusa lakog lanca. Videti Mendez i dr., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998).

4. Anti-PRLR monoklonska antitela koristeći rekombinantne biblioteke antitela [0142] In vitro metode se takođe mogu koristiti za stvaranje antitela iz pronalaska, pri čemu se biblioteka antitela pregleda za identifikaciju antitela sa željenom vezivnom specifičnošću. Metode za takvo skeniranje biblioteka rekombinantnih antitela su dobro poznate u struci i uključuju metode opisane u, na primer, Ladner i dr. patent SAD br.5,223,409; Kang i dr. PCT objava br. WO 92/18619; Dower i dr. PCT objava br. WO 91/17271; Winter i dr. PCT objava br. WO 92/20791; Markland i dr. PCT objava br. WO 92/15679; Breitling i dr. PCT objava br. WO 93/01288; McCafferty i dr. PCT objava br. WO 92/01047; Garrard i dr. PCT objava br. WO 92/09690; Fuchs i dr. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay i dr. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse i dr. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty i dr., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths i dr. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins i dr. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson i dr. (1991) Nature 352:624-628; Gram i dr. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad i dr. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom i dr. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas i dr. (1991) PNAS 88:7978-7982, patentna prijava SAD br.20030186374, i PCT objava br. WO 97/29131.

[0143] Biblioteka rekombinantnog antitela može biti od subjekta koji je imunizovan sa PRLR, ili od dela PRLR-a, kao što je vanćelijski domen. Alternativno, biblioteka rekombinantnih antitela može biti iz naivnog subjekta, tj. onog koji nije bio imunizovan sa PRLR, kao što je biblioteka humanih antitela od humanog subjekta koji nije imunizovan sa humanim PRLR-om. Antitela pronalaska su selektovana skriningom biblioteke rekombinantnih antitela sa peptidom koji obuhvata humani PRLR da bi se na taj način selektovala ona antitela koja prepoznaju PRLR. Metode za sprovođenje takvog skrininga i selekcije su dobro poznate u struci, kao što je opisano u referencama u prethodnom paragrafu. Da bi se odabrala antitela iz ovog pronalaska koja imaju naročito vezujuće afinitete za hPRLR, kao što su ona koja se odvajaju iz humanog PRLR sa određenom konstantnom koffbrzinom, može se koristiti tehnika poznata iz pozadinske plazmonske rezonance za odabir antitela koja imaju željenu konstantnu stopu koff. Da bi se odabrala antitela iz ovog pronalaska koja imaju određenu neutralizujuću aktivnost za hPRLR, kao što su one sa posebnim IC50, mogu se koristiti standardne metode poznate u struci za procenu inhibicije hPRLR aktivnosti.

[0144] U jednom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na izolovano antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen, koji vezuje humani PRLR. Poželjno, antitelo je neutralizujuće antitelo. U različitim aspektima, antitelo je rekombinantno antitelo ili monoklonsko antitelo.

[0145] Na primer, antitela iz ovog pronalaska takođe mogu biti generisana korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatih u tehnici. U metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koji nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. U konkretnom slučaju, takva faga može se koristiti za prikazivanje antigenvezujućih domena izraženih iz biblioteke repertoara ili kombinatornog antitela (npr., čoveka ili miševa). Fag, koji izražava antigen vezujući domen koji vezuje antigen koji je u interesu, može se odabrati ili identifikovati sa antigenom, npr., koristeći označeni antigen ili antigen vezan ili zarobljen na čvrstoj površini ili zglobu. Fag korišćen u ovim metodama je tipično filamentni fag, uključujući fd i M13 vezujuće domene izražene fagom sa Fab, Fv ili disulfidima stabilizovanim Fv domenima antitela rekombinantno spojenim sa bilo fagnim genom III ili genom VIII proteinom. Primeri metoda prikaza faga koji se mogu koristiti za stvaranje antitela iz ovog pronalaska obuhvataju one obelodanjene u Brinkman i dr., J.

Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i dr., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough i dr., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic i dr., Gene 1879-18 (1997); Burton i dr., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT prijava br.

PCT/GB91/01134; PCT objave WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; patenti SAD br.5,698,426; 5,223,409;

5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.

[0146] Kao što je opisano u gore navedenim referencama, nakon izbora faga, regioni za kodiranje antitela iz faga mogu se izolovati i koristiti za stvaranje celih antitela uključujući humana antitela ili bilo koji drugi željeni antigen vezujući fragment i izraženi u bilo kojem željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, insekata ćelije, biljne ćelije, kvasac i bakterije, npr., kao što je detaljno opisano u nastavku. Na primer, tehnike za rekombinantno proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2fragmenata takođe mogu biti korišćene korišćenjem metoda poznatih u struci kao što su oni obelodanjeni u PCT objavi WO 92/22324; Mullinax i dr., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); i Sawai i dr., AJRI 34:26-34 (1995); i Better i dr., Science 240:1041-1043 (1988. Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju FZ-ova i jednolančanih antitela uključuju one opisane u patentu SAD br- 4,946,778 i 5,258,498; Huston i dr., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i dr., PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra i dr., Science 240:1038-1040 (1988).

[0147] Alternativno za skrining biblioteka rekombinantnih antitela fagnim prikazivanjem, druge metode koje su poznate u struci za skrining velikih kombinatornih biblioteka mogu se primeniti za identifikaciju dvojnih specifičnosti antitela iz ovog pronalaska. Jedna vrsta alternativnog sistema ekspresije je ona u kojoj se biblioteka rekombinantnih antitela izražava kao fuzije RNK-proteina, kako je opisano u PCT objavi br. WO 98/31700 od Szostak i Roberts, i u Roberts, R.W. i Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. U ovom sistemu stvorena je kovalentna fuzija između mRNK i peptida ili proteina koji kodira in vitro translaciju sintetičkih mRNK koje nose puromicin, peptidil primalac antibiotik, na svom 3' kraju. Tako, specifična mRNK može biti obogaćena iz kompleksne smeše mRNK (npr., kombinatorna biblioteka) zasnovana na svojstvima kodiranog peptida ili proteina, npr., antitela ili njegovog dela, kao što je vezivanje antitela ili njegovog dela, na antigen dvostruke specifičnosti. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili njihove delove, koje se dobijaju od skrininga takvih biblioteka mogu se izraziti rekombinantnim sredstvima kao što je gore opisano (npr., u ćelijama domaćina sisara) i, pored toga, mogu biti podvrgnute dodatnom sazrevanju afiniteta bilo dodatnim krugovima skrininga mRNK-peptidnih fuzija u kojima su mutacije uvedene u prvobitno odabranu sekvencu ili druge metode za sazrevanje afiniteta in vitro rekombinantnih antitela, kao što je gore opisano.

[0148] U drugom pristupu mogu se generisati antitela iz ovog pronalaska korišćenjem metoda prikaza kvasca poznatih u stanju tehnike. U metodama prikaza kvasca, genetske metode se koriste za domen lančanih antitela do ćelijskog zida kvasca i prikazuju ih na površini kvasca. Konkretno, takav kvasac može se koristiti za prikaz antigen vezujućih domena izraženih iz biblioteke repertoara ili kombinatornog antitela (npr., čoveka ili miševa). Primeri metoda prikaza kvasca koji se mogu koristiti za stvaranje antitela iz ovog pronalaska uključuju one obelodanjene u Wittrup i dr. (U.S. Patent No.6,699,658).

B. Proizvodnja rekombinantnih PRLR antitela

[0149] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu se proizvesti bilo kojim od tehnika poznatih u stanju tehnike. Na primer, ekspresija iz ćelija domaćina, pri čemu ekspresioni vektor (i) koji kodira teške i lake lance (transfekcije) transfektuje u ćeliju domaćina pomoću standardnih tehnika. Razni oblici ekspresije „transfekcija” imaju za cilj da obuhvate široku lepezu tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, precipitacija kalcijum-fosfata, DEAE-dekstran transfekcija i slično. Iako je moguće izraziti antitela pronalaska u ili prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, poželjna je ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama i najpoželjnija kod ćelija domaćina sisara, jer su takve eukariotske ćelije (a naročito ćelije sisara) veće verovatnoće nego prokariotske ćelije da sakupe i luče ispravno preklopljeno i imunološki aktivno antitelo.

[0150] Poželjne ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela iz ovog pronalaska obuhvataju jajnike kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, upotrebljene sa DHFR odabranim markerom, npr., kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni vektori ekspresije koji kodiraju gene antitela u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivacijom ćelija domaćina u vremenskom periodu koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili, poželjnije, sekreciju antitela u kulturu medija u kome se gaji ćelije. Antitela se mogu dobiti iz medija za kulturu koristeći standardne metode prečišćavanja proteina.

[0151] Kućne ćelije se takođe mogu koristiti za stvaranje fragmenta funkcionalnih antitela, kao što su fragmenti Fab ili scFv molekuli. Biće shvaćeno da su varijacije u gore navedenom postupku u okviru sadašnjeg obelodanjivanja. Na primer, može biti poželjno transfektovati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira funkcionalne fragmente ili lakog lanca i/ili teškog lanca antitela iz ovog pronalaska. Rekombinantna DNK tehnologija može se takođe koristiti za uklanjanje neke ili sve DNK koja kodira bilo koji ili oba laka i teška lanca koja nije neophodna za vezivanje za antigene od interesa. Pored toga, mogu se proizvesti bifunkcionalna antitela u kojima jedan težak i jedan laki lanac predstavlja antitelo iz pronalaska, a drugi teški i lagani lanac su specifični za antigen koji nije antigen koji je interesantan unakrsnim povezivanjem antitela iz pronalaska na druga antitela standardnim metodama hemijskog unakrsnog povezivanja.

[0152] U poželjnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela obelodanjivanja, rekombinantni vektor ekspresije koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela, se unosi u dhfr-CHO ćelije transfekcijom posredovanom kalcijum fosfatom. U rekombinantnom ekspresionom vektoru, geni teškog i lakog lanca antitela su svaki operativno povezani sa regulatornim elementima promotora CMV/AdMLP promotera za pokretanje visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji dozvoljava odabir CHO ćelija koje su transfektovane sa vektorom koristeći selekciju/amplifikaciju metotreksata. Odabrane ćelije domaćina transformanata su kultivisane da bi se omogućila ekspresija antitela teških i lakih lanaca, a netaknuto antitelo se regeneriše iz medija za kulturu. Standardne molekularne biološke tehnike koriste se za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfektuju ćelije domaćina, selektuju za transformante, kultivišu ćelije domaćine i vraćaju antitelo iz medija za kulturu. Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak sinteze rekombinantnog antitela prema pronalasku kultivacijom ćelije domaćina pronalaska u odgovarajućem medijumu za kulturu sve dok se rekombinantno antitelo iz ovog pronalaska ne sintetiše. Ova metoda može dalje obuhvatiti izolovanje rekombinantnog antitela iz medijuma za kulturu.

1. Humanizovana anti PRLR antitela

[0153] Tabela 5 je lista aminokiselinskih sekvenci VH i VL regiona preferiranih humanizovanih anti-hPRLR antitela iz obelodanjivanja.

[0154] Kako se ovde koristi, termin „Ab1” se odnosi na antitelo koje sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39; SEQ ID N0: 43; SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 54.

[0155] Kako se ovde koristi, termin „Ab2” odnosi se na antitelo koje sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 69.

[0156] Kako se ovde koristi, termin „Ab3” odnosi se na antitelo koje sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 70; SEQ ID N0: 74; SEQ ID NO: 75 i SEQ ID NO: 76; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 i SEQ ID NO: 83

[0157] Kako se ovde koristi, termin „Ab4” se odnosi na antitelo koje sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 123; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 i SEQ ID NO: 96.

[0158] U posebnim aspektima, predmetno obelodanjivanje pruža humanizovana antitela Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 i Ab55 koje imaju sekvence teškog lanca i lakog lanca, kako je navedeno u Tabeli 6 ispod:

TABELA 6: Humanizovana PRLR antitela i njihove sekvence

[0159] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab14 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.

[0160] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab15 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.

[0161] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab16 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.

[0162] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab17 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128.

[0163] U jednom aspektu, sadašnje obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab18 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.

[0164] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab19 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.

[0165] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab20 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.

[0166] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab21 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128.

[0167] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab22 koji sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.

[0168] U jednom aspektu, ovo otkriće odnosi se na antitelo Ab23 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.

[0169] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab24 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.

[0170] U jednom aspektu, ovo otkriće odnosi se na antitelo Ab25 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128.

[0171] U jednom aspektu, sadašnje obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab26 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132.

[0172] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab27 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133.

[0173] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab28 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.

[0174] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab29 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132.

[0175] U jednom aspektu, ovo otkriće odnosi se na antitelo Ab30 koji sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133.

[0176] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab31 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.

[0177] U jednom aspektu, sadašnje obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab32 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132.

[0178] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab33 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133.

[0179] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab34 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.

[0180] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab35 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.

[0181] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab36 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0182] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab37 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140.

[0183] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab38 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.

[0184] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab39 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0185] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab40 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140.

[0186] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab41 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.

[0187] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab42 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0188] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab43 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140.

[0189] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab44 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.

[0190] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab45 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145.

[0191] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab46 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146.

[0192] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab47 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i laki lanac koji ima

aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.

[0193] U jednom aspektu, sadašnje obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab48 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145.

[0194] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab49 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146.

[0195] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab50 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144.

[0196] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab51 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145.

[0197] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab52 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146.

[0198] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab53 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0199] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab54 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0200] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na antitelo Ab55 koje sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

[0201] Prethodno izdvojene CDR sekvence anti-PRLR antitela uspostavljaju novu familiju PRLR vezujućih proteina, izolovanih u skladu sa ovim obelodanjivanjem, i koji sadrže polipeptide koji uključuju CDR sekvence navedene u Tabeli 7a ili 7b ispod. Da bi se generisali i izabrali CDR-ovi obelodanjivanja koji imaju poželjan PRLR vezujuću i/ili neutralizujuću aktivnost u odnosu na hPRLR, standardne metode poznate u struci za stvaranje vezujućih proteina sadašnjeg obelodanjivanja i procenu PRLR vezivanja i/ili neutralizirajućih karakteristika tog vezivanja proteina se može koristiti, uključujući, ali ne ograničavajući se na one specifično opisane ovde.

TABELA 7a: Konsenzusni PRLR CDR afinitetni ligandi zasnovani na mišijim antitelima (alternativni ostaci su navedeni ispod svake pozicije aminokiselina, - pokazuje da ostatak može biti odsutan).

TABELA 7b: Konsenzusni PRLR CDR afinitetni ligandi bazirani na mišijim i humanizovanim antitelima (alternativni ostaci su navedeni ispod svake pozicije aminokiselina, - ukazuje da ostatak može biti odsutan).

N (

2. Anti PRLR himerna antitela

[0202] Himerno antitelo je molekul u kojem različiti delovi antitela potiču iz različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja imaju varijabilni region izveden iz mišijeg monoklonog antitela i humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona. Metode za proizvodnju himernih antitela poznate su u stanju tehnike. Videti, npr., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i dr., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i dr., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; patenti SAD br.5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397. Dodatno, tehnike razvijene za proizvodnju „himernih antitela” (Morrison i dr., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger i dr., 1984, Nature 312:604-608; Takeda i dr., 1985, Nature 314:452-454) spajanjem gena iz molekula antitela miševa odgovarajućeg antigen specifičnosti zajedno sa genom iz molekula antitela čoveka odgovarajuće biološke aktivnosti može se koristiti.

[0203] U specifičnom aspektu, himerno antitelo opisa sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO:119 ili SEQ ID NO:120 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 110 ili SEQ ID NO: 111 kako je navedeno u tabeli 8 u daljem tekstu.

TABELA 8: Mišija Anti-PRLR antitela sekvenci varijabilnog lanca

[0204] Prikaz usaglašavanja promenljivih aminokiselinskih sekvenci teškog lanca za mišija antitela Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12 i Ab13 prikazano je na slikama 1 i 3. Usaglašavanje varijabilnih aminokiselinskih sekvenci lakog lanca za mišija antitela Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12 i Ab13 je prikazano na slikama 2 i 4.

[0205] Kako se ovde koristi, termin „Ab5” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO:112 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca postavljenu u SEQ ID NO:103. Kao što se ovde koristi, termin „chAb5” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedene u SEQ ID NO:112, konstanta aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca postavljena u SEQ ID NO:10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prikazane u SEQ ID NO:103 i sekvencu aminokiseline konstantnog lakog lanca koje su navedene u SEQ ID NO:12.

[0206] Kako se ovde koristi, termin „Ab6” odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 113 i varijantu aminokiselina varijabilnog laka lanca postavljenu u SEQ ID NO: 104. Kako se ovde koristi, termin „chAb6” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 113, konstantu aminokiselinske sekvence teškog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 104 i sekvencu aminokiseline konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0207] Kako se ovde koristi, termin „Ab7” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 114 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 105. Kao što se ovde koristi, termin „chAb7” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 114, konstantu aminokiselinske sekvence teškog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 105 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12

[0208] Kako se ovde koristi, termin „Ab8” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 115 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 106. Kako se ovde koristi, termin „chAb8” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 115, konstantu aminokiselinske sekvence teškog lanca postavljenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 106 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0209] Kako se ovde koristi, termin „Ab9” odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 116 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 107. Kao što je ovde korišćeno, termin „chAb9” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 116, konstantu aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 107 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0210] Kako se ovde koristi, termin „Ab10” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 117 i sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 108. Kako se ovde koristi, termin „chAb10” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 117, konstantu aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 108 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0211] Kako se ovde koristi, termin „Ab11” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 118 i sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 109. Kako se ovde koristi, termin „ chAb11” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 118, konstantu aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 109 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0212] Kako se ovde koristi, termin „Ab12” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 119 i sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 110. Kako se ovde koristi, termin „ chAb12” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 119, konstantu aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 110 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

[0213] Kako se ovde koristi, termin „Ab13” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 120 i sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 111. Kako se ovde koristi, termin „ chAb13” se odnosi na himerno antitelo koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 120, konstantu aminokiselinske sekvence konstantnog teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 10, varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 111 i sekvencu aminokiselinske sekvence konstantnog lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 12.

3. Generacija-PRLR humanizovanih antitela

[0214] Humanizovana antitela su molekuli antitela iz antitela ne-humanog tipa koja vezuju željeni antigen koji ima jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) od ne-humanih vrsta i okvira regiona od molekula čoveka imunoglobulina. Poznate humane sekvence obelodanjene su, npr.,www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Takve uvezene sekvence mogu se koristiti za smanjenje imunogenosti ili smanjenje, poboljšanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, brzine vezivanja, brzine disocijacije, avidnosti, specifičnosti, vremena polu-života ili bilo koje druge pogodne karakteristike, kako je poznato u stanju tehnike.

[0215] Okvirni ostaci u humanim okvirima mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom iz antitela donorskog CDR da bi se promenilo, poželjno poboljšalo vezivanje antigena. Ove okvirne supstitucije se identifikuju metodama poznatim u stanju tehnike, npr., modeliranjem interakcija CDR i okvirnih ostataka za identifikaciju okvirnih ostataka važnih za vezivanje antigena i poređenje sekvence kako bi se identifikovali neobični okvirni ostaci na određenim pozicijama. (Videti, npr., Queen i dr., patent SAD br.5,585,089; Riechmann i dr., Nature 332: 323 (1988).) Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli su često dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Na raspolaganju su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatske imunoglobulinske sekvence, tj., analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidatskog imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti odabrani i kombinovani iz konsenzusa i importovanih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen (e). Uopšteno, ostaci CDR su direktno i najčešće uključeni u uticaj na vezivanje antigena. Antitela se mogu humanizovati upotrebom različitih tehnika poznatih u stanju tehnike, kao što su, ali nisu ograničene na one opisane u Jones i dr., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen i dr., Science 239:1534 (1988)), Sims i dr., J. Immunol.151: 2296 (1993);

Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901 (1987), Carter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

89:4285 (1992); Presta i dr., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka i dr., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. i dr. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT objava WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, patenti SAD br.5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.

[0216] Primeri anti-PRLR humanizovanih antitela su navedeni u odeljku 1 iznad.

4. Dodatna konkurentna antitela

[0217] Termin „konkurentna antitela” ovde se odnosi na bilo koji broj antitela koja ciljaju isti molekulski ili stabilno ali nekovalentno povezan supermolekularni entitet, poželjno isti molekul, tj. PRLR, pri čemu je najmanje jedan sposoban za specifično smanjenje merljivog vezivanja drugog , poželjno sterično ometajući pristup drugom svom ciljnom epitopu ili indukcijom i/ili stabilizacijom konformacije u ciljnom entitetu koji smanjuje afinitet ciljne grupe za drugo antitelo, poželjnije direktnim blokiranjem pristupa ciljanom epitopu druge strane vezivanjem na epitop u dovoljnoj meri u blizini prvog, preklapajući se sa prvim ili identičnim sa prethodnim, najpoželjnije preklapajući ili identični, posebno identični. Ovde se kaže da se dva epitopa „preklapaju” ako dele deo njihovih hemijskih struktura, poželjno njihove aminokiselinske sekvence, i da su „identični”, ako su njihove hemijske strukture, poželjno njihove aminokiselinske sekvence, identične.

[0218] U konkretnim aspektima, konkurentno antitelo ili njihov antigen vezujući deo je antitelo ili njegov antigen vezujući deo koji su u konkurenciji sa Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 ili Ab55. U različitim aspektima, vezivanje može biti analizirano prema protokolu navedenom u Primeru 4.

[0219] U jednom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab1, tj., sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39; SEQ ID N0: 43; SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 54.

[0220] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab2, tj., Sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 69.

[0221] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab3, tj., sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 70; SEQ ID N0: 74; SEQ ID NO: 75 i SEQ ID NO: 76; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82 i SEQ ID NO: 83.

[0222] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab4, tj., sadrži (i) jedan varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 123; i (ii) jedan varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 i

SEQ ID NO: 96.

[0223] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab5, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 112 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 103.

[0224] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab6, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 113 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 104.

[0225] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab7, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 114 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 105.

[0226] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab8, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 115 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 106.

[0227] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab9, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 116 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 107.

[0228] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab10, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 117 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 108.

[0229] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab11, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 118 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 109.

[0230] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab12, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 119 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 110.

[0231] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab13, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 120 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 111.

[0232] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab14, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 124 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 125.

[0233] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab15, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 124 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 126.

[0234] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab16, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 124 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 127.

[0235] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab17, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 124 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 128.

[0236] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab18, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 129 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 125.

[0237] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab19, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 129 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 126.

[0238] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab20, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 129 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 127.

[0239] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab21, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 129 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 128.

[0240] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab22, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 130 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 125.

[0241] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab23, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 130 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 126.

[0242] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab24, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 130 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 127.

[0243] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab25, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 130 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 128.

[0244] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab26, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 131 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 132.

[0245] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab27, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 131 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 133.

[0246] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab28, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 131 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 134.

[0247] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab29, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 135 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 132.

[0248] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab30, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 135 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 133.

[0249] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab31, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 135 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 134.

[0250] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab32, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 136 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 132.

[0251] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab33, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 136 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 133.

[0252] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab34, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 136 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 134.

[0253] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab35, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 137 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 138.

[0254] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab36, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 137 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0255] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab37, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 137 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 140.

[0256] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab38, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 141 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 138.

[0257] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab39, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 141 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0258] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab40, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 141 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 140.

[0259] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab41, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 142 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 138.

[0260] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab42, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 142 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0261] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab43, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 142 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 140.

[0262] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab44, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 143 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 144.

[0263] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab45, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 143 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 145.

[0264] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab46, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 143 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 146.

[0265] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab47, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 147 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 144.

[0266] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab48, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 147 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 145.

[0267] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab49, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 147 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 146.

[0268] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab50, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 148 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 144.

[0269] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab51, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 148 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 145.

[0270] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab52, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 148 i

varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 146.

[0271] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab53, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 153 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0272] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab54, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 154 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0273] U drugom aspektu, obelodanjivanje odnosi se na antitelo koje se takmiči sa Ab55, tj., sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 155 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 139.

[0274] U određenom aspektu, predmetno obelodanjivanje odnosi se na vezujući protein, na primer, antitelo koje se takmiči sa antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koju čine:

(1) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39; SEQ ID N0: 43; SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45; i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 54;

(2) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61; i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68 i SEQ ID NO: 69;

(3) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID N0: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122; i SEQ ID NO: 123; i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 i SEQ ID NO: 96;

(4) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 112 i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 103;

(5) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 113 i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 104;

(6) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 114 i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 105; i

(7) varijabilni teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 120 i varijabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 111.

[0275] U još jednom posebnom aspektu, ovo obelodanjivanje odnosi se na vezujući protein, na primer, antitelo koje se takmiči sa antitelom koje sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 119 i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca u SEQ ID NO: 110.

5. PRLR epitopi

[0276] U sledećem aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili sve ostatke aminokiselina E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži najmanje pet amino kiselinskih ostataka. U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži sve ostatke aminokiselina E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 SEQ ID NO:2.

[0277] U određenom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čine Ab1, Ab6, chAb6, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, i Ab25.

[0278] U sledećem aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili sve ostatke aminokiselina E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži najmanje pet aminokiselinskih ostataka. U drugom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži sve ostatke aminokiselina E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 SEQ ID NO:2.

[0279] U posebnom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čine Ab4, Ab7, chAb7, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42 , Ab43, Ab53, Ab54 i Ab55. U drugom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čine Ab2, Ab5, chAb5, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 i Ab34.

[0280] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, na primer, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili sve ostatke aminokiselina R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191, i W194 SEQ ID NO:2. U jednom aspektu, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži najmanje 15 od ostataka aminokiselina. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži sve ostatke aminokiselina R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191, i W194 SEQ ID NO:2.

[0281] U određenom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čine Ab3, Ab8, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 i Ab52.

[0282] U sledećem aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, na primer, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri ili sve aminokiselinske ostatke R25, K185, D187, H188 ili W191 SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući deo, sposoban za vezivanje PRLR, se vezuje za epitop, pri čemu epitop sadrži sve aminokiselinske ostatke R25, K185, D187, H188 ili W191 SEQ ID NO : 2.

[0283] U određenom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čine Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 i Ab55.

[0284] U još jednom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop u PRLR koji sadrži aminokiseline 91-96 iz SEQ ID NO: 2.

[0285] U određenom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, izabran iz grupe koju čine Ab1, Ab4, Ab6, Ab7, chAb6, chAb7, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab53, Ab54 i Ab55. U drugom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, izabran iz grupe koju čine Ab2, Ab5, chAb5, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 i Ab34.

[0286] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, sposoban za vezivanje PRLR koji se vezuje za epitop koji ima ostatke u okviru najmanje aminokiselina 8-100, 185-191, 8-143, ili 183-194 SEQ ID NO: 2. U određenom aspektu, vezujući protein koji se vezuje za navedeni epitop je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, izabran iz grupe koju čine Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 i Ab55.

[0287] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji je sposoban za vezivanje PRLR i koji ima istu epitopsku specifičnost kao antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, izabran iz grupe koju čineAb1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab12, chAb12, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 i Ab55.

[0288] U različitim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, može da moduliše biološku funkciju PRLR-a. U drugim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, može da neutrališe PRLR. U drugim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje epitop PRLR koji ne inhibira dimerizaciju PRLR. U sledećim aspektima prethodno navedenih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, ne vezuje D2 domen PRLR-a. U daljim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje region vezivanja liganda D1 domene PRLR. U dodatnim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, ne konkuriše antitelom LFA102 za vezivanje PRLR. U dodatnim aspektima prethodnih aspekata, vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, blokira vezivanje prolaktina na PRLR.

C. Proizvodnja antitela i linije za proizvodnju antibiotika

[0289] Poželjno, anti-PRLR antitela iz ovog pronalaska, pokazuju visok kapacitet da smanje ili neutrališu aktivnost PRLR, npr., kao što je procenjeno bilo kojim od nekoliko in vitro i in vivo analiza poznatih u stanju tehnike. Na primer, može se meriti inhibicija fosforilacije PRLR, pSTAT5 ili ERK1/2 u PRLR ekspresionoj ćelijski liniji, na primer, ćelijska linija T47D karcinoma dojke. Alternativno, može se meriti inhibicija proliferacije PRLR ekspresivnih ćelijskih linija, na primer, limfoidnih ćelija Baf3 pro-B, transfektovanih sa humanim PRLR ili Nb2-11 ćelijama limfoma ćelija pacova. U poželjnim aspektima, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući deo vezuje humani PRLR, pri čemu se antitelo ili njegov antigen vezujući deo razdvaja od humanog PRLR sa konstantnom brzinom disocijacije koffod oko 0.1s<-1>ili manje, kako se određuje površinskom plazmonskom rezonancom, ili koja inhibira humanu PRLR aktivnost sa IC50od oko 1 x 10-6M ili manje.

Alternativno, antitelo ili njegov antigen vezujući deo može se disocirati iz humanog PRLR sa konstantnom brzinom disocijacije koffod oko 1 x 10-2s-1 ili manje, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, ili može inhibirati humanu PRLR aktivnost sa IC50od oko 1 x 10-7M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov antigen vezujući deo može se disocirati iz humanog PRLR sa konstantnom brzinom disocijacije koffod oko 1 x 10-3s-1 ili manje, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, ili može inhibirati humani PRLR sa IC50od oko 1 x 10-8M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov antigen vezujući deo može se disocirati iz humanog PRLR sa konstantnom brzinom disocijacije koffod oko 1 x 10-4s-1 ili manje, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, ili može inhibirati PRLR aktivnost IC50od oko 1 x 10-9M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov antigen vezujući deo može se disocirati iz humanog PRLR sa konstantnom brzinom disocijacije koffod oko 1 x 10-5s-1 ili manje, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, ili može inhibirati PRLR sa IC50od oko 1 x 10-10M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov antigen vezujući deo može se disocirati iz humanog PRLR sa konstantnom stopom koda od oko 1 x 10-5s-1 ili manje, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, ili može inhibirati PRLR aktivnost IC50od oko 1 x 10-11M ili manje.

[0290] Prolaktin se vezuje za PRLR i indukuje homodimerizaciju. PRLR nema intrinzičnu aktivnost kinaze, već je povezan sa protein kinazama kao što su FYN i JAK2 (Kline, J.B., i dr. (1999) J. Biol. Chem.274:35461-35468). Vezivanje prolaktina aktivira transduktor signala i aktivator transkripcije-5 (STAT5) preko JAK2 i kinaze-1 i -2 vezanih za ekstracelularne signale (ERK1 i ERK2) (Huang, Y., i dr., (2006) Oncogene 25:7565-7576). JAK2 fosforilisani STAT5A i STAT5B formiraju homo- i heterodimere i moduliraju ekspresiju gena koji utiče na rast ćelija i diferencijaciju (Hennighausen, L., i Robinson, G.W. (2001) Develop. Cell 1:467-475). Aktivacija PRLR-a samo prolaktinom stimuliše proliferaciju ćelija, a u kombinaciji sa deksametazonom stimuliše ekspresiju genetski specifičnih gena u ćelijskim linijama, npr., γ-kaesinu (Sasaki, M., i dr. (1996) Endocrine J.

43:45-52). Štaviše, utvrđeno je da je PRLR previše izražen u karcinomu dojke i tkivu kancera prostate (Li i dr., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill i dr., J Clin Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine i dr., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998). Ispitivanja fosforilacije i proliferacije pokazala su da antitela koja su ovde opisana inhibiraju fosforilaciju i proliferaciju posredovanu prolaktinom. Na primer, kako je navedeno u Primeru 2 i u tabelama 13 i 14, pokazano je da PRLR antitela inhibiraju fosforilaciju PRLR. Osim toga, kao što je navedeno u Primeru 2 i u Tabelama 13 i 14, pokazano je da PRLR antitela inhibiraju proliferaciju PRLR ekspresivnih ćelijskih linija, npr., Baf3 pro-B limfoidnih ćelija transfektovanih sa humanim PRLR i Nb2-11 ćelijama limfoma ćelija. Štaviše, kako je navedeno u Primeru 3, pokazano je da PRLR antitela, naročito AB5, smanjuju rast tumora u in vivo studijama. Jedno posebno obelodanjeno antitelo, tj., Ab12, pokazuje aktivnost PRLR agonista.

[0291] Antitela su humanizovana kao što je opisano u Primeru 1. Okvirne povratne mutacije uvedene su u CDR-cepanim sekvencama antitela de novo sintezom varijabilnog domena ili mutagenim oligonukleotidnim prajmerima i polimeraznom lančanom reakcijom, ili obe omogućavaju različite kombinacije mutacija u leđima i druge mutacije za svaki CDR-kalemi. Humanizovani varijabilni regioni mišijih monoklonskih PRLR antitela klonirani su u vektore ekspresije IgG za funkcionalnu karakterizaciju.

[0292] U određenim aspektima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca, kao što je konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Poželjno, konstantni region teškog lanca je konstantni region teškog lanca IgG1 ili konstantni region teškog lanca IgG4. Štaviše, antitelo može sadržati konstantni region lakog lanca, ili konstantni region lakog lanca ili konstantni region lambda lakog lanca. Poželjno, antitelo sadrži konstantni region kappa lakog lanca. Alternativno, deo antitela može biti, na primer, Fab fragment ili Fv fragment sa jednim lancem.

[0293] Zamena aminokiselinskih ostataka u Fc delu da bi se promenila efektorska funkcija antitela poznata su u stanju tehnike (Winter, i dr. patenti SAD br.5,648,260; 5624821). Fc deo antitela posreduje nekoliko značajnih efektorskih funkcija, npr. indukciju citokina, ADCC, fagocitozu, zavisnu citotoksičnost zavisno od komplementa (CDC) i brzinu poluživota/čišćenja antitela i kompleksa antigena-antitela. U nekim slučajevima ove efektorske funkcije su poželjne za terapeutsko antitelo, ali u drugim slučajevima može biti nepotrebno ili čak štetno, zavisno od terapijskih ciljeva. Određeni humani IgG izotopi, posebno IgG1 i IgG3, posreduju ADCC i CDC putem vezivanja na FcgRs i komplement C1q, respektivno. Neonatalni Fc receptori (FcRn) su kritične komponente koje određuju cirkulišući polu-život antitela. U još jednom aspektu barem jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen u konstantnom regionu antitela, na primer Fc region antitela, tako da se promene efektorske funkcije antitela.

[0294] Jedan aspekt obezbeđuje označeni vezujući protein u kome je antitelo ili deo antitela obelodanjivanja derivatizovan ili povezan sa jednim ili više funkcionalnih molekula (npr., drugi peptid ili protein). Na primer, označeni vezujući protein obelodanjivanja može se izvesti funkcionalnim povezivanjem antitela ili dela antitela obelodanjivanja (hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili drugim) na jedno ili više drugih molekularnih jedinki, kao što je drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili diatela), detektabilni agens, farmaceutski agens, protein ili peptid koji može posredovati asocijaciju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je region streptavidina ili polihistidin oznaka) i/ili citotoksično ili terapeutsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od mitotski inhibitor, antitumorski antibiotik, imunomodulatorni agens, vektor za gensku terapiju, sredstvo za alkilovanje, antiangiogeni agens, antimetabolit, sredstvo koje sadrži bor, hemoprotektivno sredstvo, hormon, antihormonsko sredstvo, kortikosteroid, terapeutsko sredstvo, oligonukleotid, radionukleotidno sredstvo, inhibitor topoizomeraze, inhibitora tirozin kinaze, radiosenzibilizator i njihove kombinacije.

[0295] Korisni detektivi agensi sa kojima antitelo ili deo antitela prema pronalasku mogu biti derivatizovani uključuju fluorescentna jedinjenja. Primeri fluorescentnih detektabilnih sredstava obuhvataju fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin i slično. Antitelo može takođe biti derivatizovano sa detektabilnim enzima, kao što su alkalna fosfataza, hren peroksidaza, glukoza oksidaza i slično. Kada se antitelo derivatizuje sa detektabilnim enzimom, detektuje se dodavanjem dodatnih reagensa koje enzim koristi za proizvodnju detektabilnog proizvoda reakcije. Na primer, kada je prisutna deterdžentska hrana peroksidaza, dodavanje vodonik-peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog proizvoda reakcije, koji se može detektovati. Antitelo može takođe biti derivatizirano sa biotinom i detektovano posrednim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina.

[0296] Drugi aspekt obelodanjivanja obezbeđuje kristalizovani vezujući protein. Poželjno, obelodanjivanje se odnosi na kristale celokupnih anti-PRLR antitela i njihovih fragmenata kao što je ovde obelodanjeno, i formulacije i preparati koji sadrže takve kristale. U jednom aspektu, kristalizovani vezujući protein ima veći polu-život in vivo nego rastvorljivi peptid vezujućeg proteina. U drugom aspektu, vezujući protein zadržava biološku aktivnost nakon kristalizacije.

[0297] Kristalizovani vezujući protein obelodanjivanja može se proizvesti prema metodama poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u WO 02072636.

[0298] Još jedan aspekt obelodanjivanja daje glikozilovani vezujući protein u kojem antitelo ili njegov antigen vezujući deo sadrži jedan ili više ostataka ugljenih hidrata. Proizvodnja in vivo proteina može biti podložna daljem obradi, poznata kao post-translacijska modifikacija. Konkretno, šećerni (glikozil) ostaci mogu biti dodati enzimski, proces poznat kao glikozilacija. Dobijeni proteini koji nose kovalentno povezane oligosaharidne lance su poznati kao glikozilovani proteini ili glikoproteini. Antitela su glikoproteini sa jednim ili više ostataka ugljenih hidrata u domenu Fc, kao i varijabilni domen. Ostatak ugljenih hidrata u Fc domenu ima značajan uticaj na efektorsku funkciju Fc domena, sa minimalnim efektom na vezivanje antigena ili polu-život antitela (R. Jefferis, Biotechnol. Prog.21 (2005), pp.11-16). Nasuprot tome, glikozilacija varijabilnog domena može imati uticaj na aktivnost vezivanja antigena antitela. Glikozilacija u varijabilnom domenu može imati negativan uticaj na afinitet vezivanja antitela, verovatno zbog steričnog ometanja (Co, M.S., i dr., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), ili rezultiraju povećanim afinitetom za antigen (Wallick, S.C., i dr., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., i dr., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).

[0299] Jedan aspekt sadašnjeg obelodanjivanja je usmeren na stvaranje mutanata na mestu glikozilacije u kojima je mutirano mesto glikozilacije O- ili N vezujućeg proteina. Jedan stručnjak u ovoj oblasti može generisati takve mutante koristeći standardne poznate tehnologije. Mutanti na mestu glikozilacije koji zadržavaju biološku aktivnost, ali imaju povećanu ili smanjenu vezujuću aktivnost, drugi su predmet ovog obelodanjivanja.

[0300] U još jednom aspektu, glikozilacija antitela ili dela obelodanjivanja antigena je modifikovana. Na primer, može se napraviti aglikozlirano antitelo (tj., antitelu fali glikozilacija). Glikozilacija se može promeniti da, na primer, poveća afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, promenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se napraviti jedna ili više supstitucija aminokiselina koje rezultiraju eliminacijom jedne ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Ovakav pristup je detaljnije opisan u objavi PCT WO2003016466A2 i patentima SAD br.5,714,350 i 6,350,861.

[0301] Dodatno ili alternativno, može se napraviti modifikovano antitelo obelodanjivanja koje ima izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukosilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozilnih ostataka ili antitelo koje je povećalo bisekciju GlcNAc struktura. Takvi izmenjeni modeli glikozilacije dokazani su da povećavaju sposobnost antitela ADCC-a. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići, na primer, ekspresijom antitela u ćeliji domaćina sa izmenjenim mašinama za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenim metodama glikozilacije opisane su u stanju tehnike i mogu se koristiti kao ćelije domaćina u kojima se izražavaju rekombinantna antitela iz ovog pronalaska, čime se proizvodi antitelo sa izmenjenim glikozilacijom. Vidite, na primer, Shields, R. L. i dr. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana i dr. (1999) Nat. Biotech.17:176-1, kao i, evropski patent br.: EP 1,176,195; PCT objava WO 03/035835; WO 99/5434280.

[0302] Glikozilacija proteina zavisi od aminokiselinske sekvence proteina od interesa, kao i ćelije domaćina u kojoj je ekspresivan protein. Različiti organizmi mogu proizvesti različite enzime glikozilacije (npr., glikoziltransferaze i glikozidaze) i imaju različite supstrate (nukleotidne šećere) na raspolaganju. Zbog takvih faktora, uzorak proteina glikozilacije i sastav glikozilnih ostataka, može se razlikovati u zavisnosti od sistema domaćina u kojem se izražava određeni protein. Ostaci glikozila mogu uključivati, ali bez ograničenja na njih, glukozu, galaktozu, manozu, fukozu, n-acetilglukozamin i sijalu kiselinu. Poželjno, glikozilovani vezujući protein sadrži glikozilne ostatke tako da je oblik glikozilacije humani.

[0303] Poznato je stručnjacima iz ove oblasti da različita proteinska glikozilacija može rezultirati različitim karakteristikama proteina. Na primer, efikasnost terapeutskog proteina koji je proizveden u domaćinu mikroorganizma, kao što je kvasac, i glikozilovani korišćenjem endogenog puta kvasca, može se smanjiti u poređenju sa istim proteinom izraženim u ćeliji sisara, kao što je CHO ćelijska linija. Takvi glikoproteini takođe mogu biti imunogeni kod ljudi i pokazuju smanjeni polu-život in vivo nakon primene. Specifični receptori kod ljudi i drugih životinja mogu prepoznati specifične glikozilne ostatke i promovisati brzi klirens proteina iz krvotoka. Ostali štetni efekti mogu uključivati promene u preklapanju proteina, rastvorljivosti, osetljivosti na proteaze, trgovanju, transportu, izdvajanju, seciranju, prepoznavanju drugih proteina ili faktora, antigenosti ili alergenosti.

Shodno tome, lekar može preferirati terapeutski protein sa specifičnim sastavom i šablonom glikozilacije, na primer sastavom glikozilacije i šablonom identičnim ili barem sličnim, onom koji se proizvodi u humanim ćelijama ili u specifičnim ćelijama željene predmetne životinje.

[0304] Izražavanje glikozilovanih proteina različitih od onih u ćeliji domaćina može se postići genetskim modifikovanjem ćelije domaćina kako bi se izrazili heterologni enzimi glikozilacije. Korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike, lekar može da generiše antitela ili njihove antigen vezujuće delove koji pokazuju humani proteinski glikozilat. Na primer, sojevi kvasca su genetski modifikovani da izražavaju enzime koji se ne pojavljuju u prirodi, tako da glikozilovani proteini (glikoproteini) koji se proizvode u ovim sondama kvasca pokazuju proteinsku glikozilaciju identičnu sa proteinskim glikozilacijama identičnim ćelijama životinja, posebno humanim ćelijama (patent SAD br.20040018590 i 20020137134 i PCT objava WO2005100584 A2).

[0305] Osim vezujućih proteina, sadašnje obelodanjivanje je takođe usmereno na antiidiotipično (anti-Id) antitelo specifično za takve vezujuće proteine obelodanjivanja. Anti-Id antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koji su uglavnom povezani sa regionom koji vezuje antigene drugog antitela. Anti-Id se može pripremiti imunizacijom životinje sa vezujućim proteinom ili njegovim regionom koji sadrži CDR. Vakcinisana životinja će prepoznati i reagovati na idiotipske determinante imunizirajućeg antitela i proizvesti anti-Id antitelo. Anti-Id antitelo se takođe može koristiti kao „imunogen” da indukuje imuni odgovor u još jednoj životinji, stvarajući tzv. anti-anti-Id antitelo.

[0306] Nadalje, stručnjak iz oblasti će ceniti da se protein iz interesa može izraziti pomoću biblioteke ćelija domaćina genetski projektovanih da izražava različite enzime glikozilacije, tako da ćelije domaćina ćelije biblioteke proizvode protein u interakciji sa varijantnom glikozilacijskih obrazaca. Stoga lekar može odabrati i izolovati protein koji je interesantan sa određenim novim šablonima glikozilacije. Poželjno, protein koji ima posebno odabran nov model glikozilacije pokazuje poboljšana ili izmenjena biološka svojstva.

II. Anti-PRLR lekovi konjugata antitela (ADC)

[0307] Anti-PRLR antitela opisana ovde mogu biti konjugovana sa agensom kako bi se formirao anti-PRLR antigenski konjugat lekova (ADC). Konjugati lekova antitela (ADC) mogu povećati terapeutsku efikasnost antitela u tretiranju bolesti, npr., kancera, zbog sposobnosti ADC-a da selektivno isporuči jedan ili više sredstava za ciljanje tkiva, kao što je antigen povezan sa tumorom , npr., PRLR koji izražava tumore. Prema tome, pronalazak obezbeđuje anti-PRLR ADC za terapeutsku upotrebu, npr., tretiranje kancera.

[0308] Anti-PRLR ADC iz ovog pronalaska sadrži anti-PRLR antitelo prema pronalasku, tj. antitelo koje se specifično vezuje za PRLR, povezano sa jednim ili više delova lekova.

Specifičnost ADC pronalaska je definisana specifičnošću antitela, tj. anti-PRLR. U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je povezano sa jednim ili više citotoksina koji se interno isporučuju transformisanim ćelijama karcinoma koje izražavaju PRLR.

Primeri lekova koji se mogu koristiti u anti-PRLR ADC pronalasku su navedeni u nastavku, kao i veznici koji se mogu koristiti za konjugovanje antitela i jednog ili više lekova. Termini „lek” i „agens” se ovde koriste izmenjivo. Termini „povezani” i „konjugovani” takođe se koriste naizmenično.

A. Lekovi za konjugovanje

[0309] Anti-PRLR antitela prema pronalasku mogu se koristiti u ADC-u da ciljaju jedan ili više lekova u ćeliju od interesa, npr., transformisanu ćeliju kancera koji izražava PRLR. Anti-PRLR ADC pronalaska obezbeđuje ciljanu terapiju koja može, na primer, smanjiti neželjene efekte koji se često vide kod terapija protiv karcinoma, pošto jedan ili više lekova bude isporučeno određenoj ćeliji. Primeri lekova koji se mogu koristiti u ADC-ovi pronalaska, tj. lekovi koji mogu biti konjugovani anti-PRLR antitelima prema pronalasku, su navedeni u nastavku, i uključuju mitotske inhibitore, antitumorne antibiotike, imunomodulatorne agense, vektore genske terapije, alkilovanje agensi, antiangiogeni agensi, antimetaboliti, agensi koji sadrže bor, hemoprotektivni agensi, hormonski agensi, glukokortikoidi, fotoaktivni terapeutski agenti, oligonukleotidi, radioaktivni izotopi, radiosenzibilizatori, inhibitori topoizomeraze, inhibitori tirozin kinaze i njihove kombinacije.

1. Mitotički inhibitori

[0310] Anti-PRLR antitela prema pronalasku mogu biti konjugovana sa jednim ili više mitotskih inhibitora za tretiranje kancera. Termin „mitotski inhibitor”, kako se ovde koristi, odnosi se na citotoksično i/ili terapeutsko sredstvo koje blokira mitozu ili deljenje ćelija, biološki proces koji je naročito važan za ćelije kancera. Mitotički inhibitor poremećuje mikrotubule tako da se sprečava deljenje ćelija često utičući na polimerizaciju mikrotubula ili depolimerizaciju mikrotubula. Tako, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa jednim ili više mitoloških inhibitora koji ometaju formiranje mikrotubula inhibiranjem polimerizacije tubulina. U jednom otelotvorenju, mitotski inhibitor koji se koristi u ADC-ovi pronalaska je Ixempra (iksabepilon). Primeri mitotskih inhibitora koji se mogu koristiti u anti-PRLR ADC pronalasku su navedeni u nastavku.

a. Dolastatini

[0311] Antitelo anti-PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim dolastatinom. Dolastatini su kratka peptidna jedinjenja izolovana iz morskog zeca u Indijskom okeanu Dolabella auricularia (videti Pettit i dr., J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 4677).Primeri dolastatina uključuju dolastatin 10 i dolastatin 15. Dolastatin 15, sedampodjedinica depsipeptida izvedenih iz Dolabella auricularia, i potencijalni antimitotički agens strukturno povezan sa antitubulinskim agensom dolastatin 10, pet podjedinica peptida dobijenih iz istog organizma. Prema tome, u jednom otelotvorenju anti-PRLR ADC pronalaska sadrži anti-PRLR antitelo, kako je ovde opisano, i najmanje jedan dolastatin. Auristatini, opisani u nastavku, su sintetički derivati dolastatina 10.

b. Auristatini

[0312] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednom auristatinom. Auristatini predstavljaju grupu analoga dolastatina za koje se generalno pokazalo da poseduju antikancerogenu aktivnost tako što ometaju dinamiku mikrotubula i GTP hidrolizu, čime inhibiraju ćelijsku deobu. Na primer, Auristatin E (patent SAD br.

5,635,483) je sintetički analog mišijeg prirodnog proizvoda dolastatina 10, jedinjenja koja inhibira polimerizaciju tubulina vezivanjem na istu lokaciju na tubulinu kao antikancerogeni lek vinkristin (GR Pettit, Prog Chem Nat., Prod., 70: 1-79 (1997)). Dolastatin 10, auristatin PE i auristatin E su linearni peptidi koji imaju četiri aminokiseline, od kojih su tri jedinstvena za klasu jedinjenja dolastatina. Primeri otelotvorenja auristatinske podklase mitotskih inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na, monometil auristatin D (MMAD ili derivat auristatin D), monometil auristatin E (derivat MMAE ili auristatin E), monometil auristatin F (MMAF ili derivat auristatin F), auristatin F fenilendiamin (AFP), auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP) i ester 5-benzoilvalerne kiseline (AEV). Sinteza i struktura derivata auristatina su opisani u objava patentne prijave SAD br.2003-0083263, 2005-0238649 i 2005-0009751; internacionalna patentna objava br. WO 04/010957, internacionalna patentna objava br o. WO 02/088172, i patenti SAD br.6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; i 4,486,414. U jednom aspektu, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim MMAF (monometiluraristatin F). Monometil auristatin F (MMAF) inhibira deljenje ćelija blokiranjem polimerizacije tubulina. Ima napunjen C-terminalni fenilalaninski ostatak koji smanjuje njegovu citotoksičnu aktivnost u poređenju sa svojim nezaobilaznim kolenom MMAE. Zbog suprotne toksičnosti, on se ne može koristiti kao sam lek, već može biti povezan sa monoklonim antitelom (mAb) koji ga usmerava do ćelija karcinoma. U jednom aspektu, veznik prema anti-PRLR antitelu je stabilan u vanćelijskoj tečnosti, ali se odvaja od katepsina kada je konjugat ušao u tumorsku ćeliju, čime se aktivira anti-mitotički mehanizam.

[0313] U jednom aspektu, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednom MMAE (mono-metil auristatin E). Monometil auristatin E (MMAE, vedotin) inhibira deljenje ćelija blokiranjem polimerizacije tubulina. Zbog svoje supstance toksičnost se takođe ne može koristiti kao sam lek. U novijim događajima za terapiju karcinoma, povezan je sa monoklonim antitelom (mAb) koji prepoznaje specifični markerski termin u ćelijama karcinoma i usmerava MMAE u ćelije karcinoma. U jednom aspektu, veznik koji povezuje MMAE sa anti-PRLR antitelom je stabilan u vanćelijskoj tečnosti (tj. medijum ili okolina koja je spoljna od ćelija), ali se odvaja od katepsina kada se ADC vezuje za specifični antigen ćelija kancera i ulaze u ćeliju kancera, čime otpuštaju toksični MMAE i aktiviraju snažni anti-mitotički mehanizam. Strukture MMAF i MMAE su date u nastavku.

c. Maitansinoidi

[0314] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednom maitansinoidom. Maitansinoidi su potencijalni antitumorski agensi koji su prvobitno bili izolovani iz članova viših biljnih porodica Celastraceae, Rhamnaceae i Euphorbiaceae, kao i neke vrste mahovine (Kupchan i dr, J. Am. Chem. Soc.94:1354-1356 [1972]; Wani i dr, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 390: [1973]; Powell i dr, J. Nat. Prod.46:660-666 [1983]; Sakai i dr, J. Nat. Prod.51 :845-850 [1988]; i Suwanborirux i dr, Experientia 46:117-120 [1990]). Dokazi sugerišu da maitansinoidi inhibiraju mitozu inhibiranjem polimerizacije proteina tubulina mikrotubule, čime se sprečava stvaranje mikrotubula (videti npr., patent SAD br. 6,441,163 i Remillard i dr., Science, 189, 1002-1005 (1975)). Za maitansinoide se pokazalo da inhibiraju rast tumora ćelija in vitro koristeći modele ćelijske kulture i in vivo koristeći laboratorijske životinjske sisteme. Štaviše, citotoksičnost maitansinoida je 1000 puta veća od konvencionalnih hemoterapeutskih sredstava, kao što su, na primer, metotreksat, daunorubicin i vinkristin (videti, npr., patent SAD br.5,208,020).

[0315] Maitansinoidi su u struci poznati tako da uključuju maitansin, maitansinol, estre C-3 maitansinola i druge analgetike i derivate maitansinola (videti, npr., patente SAD br.

5,208,020 i 6,441,163, od kojih je svaki uključen ovde referencom). C-3 estri maitansinola mogu biti prirodni ili sintetički izvedeni. Štaviše, i prirodni i sintetički estri C-3 maitansinol estri mogu se klasifikovati kao estar C-3 sa jednostavnim karboksilnim kiselinama ili estrom C-3 sa derivatima N-metil-L-alanina, a drugi je citotoksičniji od prethodnog. Sintetički analiza maitansinoida takođe su poznata u struci i opisana su, na primer, Kupchan i dr., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978).

[0316] Pogodni maitansinoidi za upotrebu u ADC pronalasku mogu biti izolovani iz prirodnih izvora, sintetički proizvedeni ili polu-sintetički proizvedeni korišćenjem metoda poznatih u stanju tehnike. Štaviše, maitansinoid može biti modifikovan na odgovarajući način, sve dok se u konačnom molekulu konjugata sačuva dovoljna citotoksičnost. U tom pogledu, maitansinoidi nemaju odgovarajuće funkcionalne grupe na koje se antitela mogu povezati. Poželjno se povezuje vezujući deo za povezivanje maitansinoida sa antitelom kako bi se formirao konjugat, i opisan je detaljnije u odeljku IIB. Struktura primernog maitansinoida, mertansina (DM1), dati je u daljem tekstu.

[0317] Reprezentativni primeri maitansinoida uključuju, ali bez ograničenja, DM1 (N<2>'-deacetil-N2'-(3-merkapto-1-oksopropil)-maitansin, koji se takođe naziva mertansin, mamantansinoid lek 1, ImmunoGen, Inc. takođe Chari i dr. (1992) Cancer Res 52:127), DM2, DM3 (N2'-deacetil-N2'- (4-merkapto-l-oksopentil)-maitansin), DM4 (4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-maitansin) i maitansinol (sintetički analgetik maitansinoida). Drugi primeri maitansinoida opisani su u američkom patentu broj 8,142,784. Ansamitocini su grupa maitansinoidnih antibiotika koji su izolovani iz različitih bakterijskih izvora. Ova jedinjenja imaju potentne antitumorske aktivnosti. Reprezentativni primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na ansamitocin P1, ansamitocin P2, ansamitocin P3 i ansamitocin P4.

[0318] U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim DM1. U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim DM2. U jednom aspektu, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim DM3. U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim DM4.

d. Biljni alkaloidi

[0319] Anti-PRLR antitelo prema pronalasku može biti konjugovano sa najmanje jednim alkaloidom biljke, npr. alkanidom taksana ili vinke. Biljni alkaloidi su hemoterapijski tretmani izvedeni iz određenih vrsta biljaka. Vinka alkaloidi su izrađeni od biljke perivinkle (catharanthus rosea), dok su taksani izrađeni iz kore pacifičkog stabla (takus). Oba alkaloida vinka i taksana su takođe poznati kao agensi antimikrotubule i detaljnije su opisani u nastavku.

Taksani

[0320] Antitelo anti-PRLR pronalaska može biti konjugovano sa bar jednim taksanom. Termin „taksan”, kako se ovde koristi, odnosi se na klasu antineoplastičnih agenasa koji imaju mehanizam delovanja mikrotubula i imaju strukturu koja uključuje strukturu taksanskog prstena i stereospecifični bočni lanac koji je potreban za citostatičku aktivnost. Takođe uključeni u termin „taksana” su različiti poznati derivati, uključujući i hidrofilne derivate i hidrofobne derivate. Derivati taksana uključuju, ali nisu ograničeni na, derivate galaktoze i manoze opisane u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 99/18113; piperazino i drugi derivati opisani u WO 99/14209; derivate taksana opisane u WO 99/09021, WO 98/22451 i patentu SAD br.5.869.680; 6-tio derivati opisani u WO 98/28288; derivati sulfenamida opisani u patentu SAD br.5,821,263; i derivat taksola opisan u patentu SAD br. br. 5,415,869, od kojih je svaka uključena ovde. Takođe su opisana taksanska jedinjenja u patentima SAD br.5,641,803, 5,665,671, 5,380,751, 5,728,687, 5,415,869, 5,407,683, 5,399,363, 5,424,073, 5,157,049, 5,773,464, 5,821,263, 5,840,929, 4,814,470, 5,438,072, 5,403,858, 4,960,790, 5,433,364, 4,942,184, 5,362,831, 5,705,503, i 5,278,324. Dodatni primeri taksana uključuju, ali bez ograničenja, docetaksel (Taxotere; Sanofi Aventis), paklitaksel (Abraxane ili Taxol; Abraxis Oncology) i nanočesticu paklitaksel (ABI-007/Abraxene; Abraxis Bioscience).

[0321] U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim doksetakselom. U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa bar jednom paklitakselom.

Vinka alkaloidi

[0322] U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim vinka alkaloidom. Vinka alkaloidi su klasa lekova specifičnih za ćelijski ciklus, koji deluju tako što inhibiraju sposobnost ćelija kancera da se dele putem tubulina i sprečavaju stvaranje mikrotubula. Primeri vinka alkaloida koji se mogu koristiti u ADC pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja, vindesin sulfat, vinkristin, vinblastin i vinorelbin.

2. Antitumorski antibiotici

[0323] Anti-PRLR antitela pronalaska mogu biti konjugovana sa jednim ili više antitumorskih antibiotika za tretiranje kancera. Kako se ovde koristi, termin „antitumorski antibiotik” označava antineoplastični lek koji blokira rast ćelija mešanjem sa DNK i napravljen je od mikroorganizma. Često, antitumorski antibiotici razbijaju DNK niti ili usporavaju ili zaustavljaju DNK sintezu. Primeri antitumorskih antibiotika koji mogu biti uključeni u anti-PRLR ADC pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, aktinomicine (npr., pirolo [2,1-c][1,4] benzodiazepini), antracikline, kalheheamicine i duokarmicini, opisani su detaljnije u nastavku.

a. Aktinomicini

[0324] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim aktinomicinom. Aktinomicini su podklasa antitumorskih antibiotika izolovanih iz bakterija roda Streptomyces. Reprezentativni primeri aktinomicina uključuju, ali nisu ograničeni na, aktinomicin D (Cosmegen [poznat i kao aktinomicin, daktinomicin, aktinomicin IV, aktinomicin C1], Lundbeck, Inc.), antramicin, cicamicin A, DC-18, mazetramicin, neotramicin A, neotramicin B, porotramicin, protracarcin B, SG2285, sibanomicin, sibiromicin i tomamicin. U jednom aspektu, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim pirolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepinom (PBD). Primeri PDB uključuju, ali nisu ograničeni na, antramicin, cicamicin A, DC-81, mazetramicin, neotramicin A, neothramicin B, porotramicin, protracarcin B, SG2285, sibanomicin, sibiromicin i tomaimicin. Prema tome, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednom aktinomicinom, npr., aktinomicinom D ili bar jednom PBD, npr., dimer pirolobenzodiazepina (PBD).

b. Antraciklini

[0325] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antraciklinom. Antraciklini su podklasa antitumorskih antibiotika izolovanih iz bakterija roda Streptomyces. Reprezentativni primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na, daunorubicin (Cerubidine, Bedford Laboratories), doksorubicin (Adriamycin, Bedford Laboratories, koji se takođe nazivaju dokorubicin hidrochloride, hidrokidaunorubicin i Rubek), epirubicin (Ellence, Pfizer) i idarubicin (Idamycin; Pfizer Inc.). Prema tome, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim antraciklinom, npr. doksorubicinom.

c. Kaliheamicini

[0326] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim kaliheamicinom. Kaliheamicini su porodica enediinskih antibiotika izvedenih iz organizma za tlo Micromonospora echinospora. Kaliheamicini vezuju manje žlebove DNK i indukuju dvostruke DNK, što dovodi do smrti ćelije sa povećanjem od 100 puta u odnosu na druge hemoterapeutike (Damle i dr. (2003) Curr Opin Pharmacol 3: 386). Priprema kaliheamicina koje se mogu koristiti kao konjugati za lekove u pronalasku poznate su u struci, videti patente SAD br.5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296. Strukturni analogi kaliheamicina koji se mogu koristiti mogu uključivati, ali bez ograničenja, γ I I

1α2, α3, N-acetil-γ1, PSAG i θ

1(Hinman i dr., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode i dr., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i pomenuti patenti SAD br.

5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296). Prema tome, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim kaliheamicinom.

d. Duokarmicini

[0327] Antitelo anti- PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim duokarmicinom. Duokarmicini su podklasa antitumorskih antibiotika izolovanih iz bakterija roda Streptomyces. (videti Nagamura i Saito (1998) Chemistry of Heterocyclic Compounds, Vol. 34, No.12). Duokarmicini se vezuju za manji žleb DNK i alkiliraju nukleobazni adenin na poziciji N3 (Boger (1993) Pure i Appl Chem 65(6):1123; i Boger i Johnson (1995) PNAS USA 92:3642). Sintetički analozi duokarmicina uključuju, ali nisu ograničeni na, adozelesin, bizelesin i karzelesin. Prema tome, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednim duokarmicinom.

e. Drugi antitumorski antibiotici

[0328] Pored gore navedenog, dodatni antitumorski antibiotici koji se mogu koristiti u anti-PRLR ADC iz ovog pronalaska uključuju bleomicin (Blenoxane, Bristol-Myers Squibb mitomicin i plicamicin (takođe poznat kao mitramicin).

3. Imunomodulatorni agensi

[0329] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim imunomodulacijskim agensom. Kako se ovde koristi, termin „imunomodulatorni agens” se odnosi na sredstvo koje može stimulisati ili modifikovati imuni odgovor. U jednom otelotvorenju, imunomodulatorni agens je imunostimulator koji poboljšava imunološki odgovor subjekta. U još jednom otelotvorenju, imunomodulatorni agens je imunosupresiv koji sprečava ili smanjuje imunološki odgovor subjekta. Imunomodulatorni agens može modulisati mijeloidne ćelije (monocite, makrofage, dendritične ćelije, meagakariocite i granulocite) ili limfoidne ćelije (T ćelije, B ćelije i ćelije prirodnog ubice (NK)) i bilo koju drugu diferenciranu ćeliju. Reprezentativni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, bacillus calmette-guerin (BCG) i levamisol (Ergamisol). Ostali primeri imunomodulacionih sredstava koji se mogu koristiti u ADC pronalasku uključuju, ali se ne ograničavaju na, vakcine protiv karcinoma, citokine i imunomodulirajuću gensku terapiju.

a. Vakcine protiv kancera

[0330] Anti- PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa vakcinom protiv kancera. Kako se ovde koristi, termin „vakcina protiv karcinoma” odnosi se na sastav (npr., tumorski antigen i citokin) koji izaziva tumorski specifični imunološki odgovor. Odziv se izvodi iz sopstvenog imunološkog sistema subjekta primenom vakcine protiv karcinoma ili, u slučaju ovog pronalaska, davanje ADC-a koji sadrži anti-PRLR antitelo i vakcinu protiv kancera. U poželjnim otelotvorenjima, imuni odgovor dovodi do eradikacije tumorskih ćelija u telu (npr. primarne ili metastatske tumorske ćelije). Upotreba vakcina protiv kancera obično podrazumeva davanje određenog antigena ili grupe antigena koje su, na primer, prisutne na površini određene kancerogene ćelije ili prisutni na površini određenog infektivnog agensa koji je prikazan kako bi se olakšalo formiranje kancera. U nekim otelotvorenjima, upotreba vakcina protiv kancera je u profilaktičke svrhe, dok je u drugim otelotvorenjima upotreba u terapijske svrhe. Neograničavajući primeri vakcina protiv kancera koji se mogu koristiti u anti-PRLR ADC iz ovog pronalaska uključuju rekombinantne bivalentne humane papiloma virusne (HPV) vakcine tipa 16 i 18 vakcine (Cervarix, GlaxoSmithKline) rekombinantni četvorovalentni humani papiloma virus (HPV) tipa 6, 11, 16 i 18 vakcina (Gardasil, Merck & Company) i sipuleucel-T (Provenge, Dendreon). Prema tome, u jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitelo prema pronalasku je konjugovano sa najmanje jednom vakcinom protiv kancera koja je ili imunostimulator ili je imunosupresiv.

b. Citokini

[0331] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim citokinom. Termin „citokin” se uglavnom odnosi na proteine koji se izdaju od strane jedne ćelijske populacije koja deluje na drugu ćeliju kao međućelijski medijatori. Citokini direktno stimulišu imuno efektorske ćelije i stromalne ćelije na mestu tumora i povećavaju prepoznavanje tumorskih ćelija pomoću citotoksičnih efektorskih ćelija (Lee i Margolin (2011) Cancers 3:3856). Brojne studije modela tumora životinja pokazale su da citokini imaju široku anti-tumorsku aktivnost i ovo je prevedeno u brojne pristupe zasnovane na citokinskoj terapiji karcinoma (Lee i Margoli, supra). Poslednjih godina su viđeni brojni citokini, uključujući GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-21, uvedeni su u klinička ispitivanja kod pacijenata sa naprednim kancerom (Lee i Margoli, supra).

[0332] Primeri citokina koji se mogu koristiti u ADC pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relakin; prorelakin; glikoproteinski hormoni kao što je stimulišući hormon folikula (FSH), stimulišući hormon štitaste žlezde (TSH) i luteinizacijski hormon (LH); faktor rasta jetre; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; placentalni laktogen; faktor tumorske nekroze; milerijanske inhibirajuće supstance; mišiji gonadotropin-pridruženi peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelijalni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); faktori rasta nerva kao što su NGF; faktor rasta trombocita; transformisani faktori rasta (TGF); insulin-nalik faktor rasta-I i -II; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferon α, β, i γ faktori koji stimulišu kolonije (CSF); granulocit-makrofag-C-SF (GM-CSF); i granulocit-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- IL-12; faktor tumorske nekroze; i druge polipeptidne faktore uključujući LIF i kit ligand (KL). Kao što je ovde korišćeno, termin citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente citokina sa izvornom sekvencom. Prema tome, u jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje ADC koji sadrži ovde opisano anti-PRLR antitelo i citokin.

c. Stimulativni faktori kolonija (CSF)

[0333] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano bar jednom faktoru stimulacije kolonija (CSF). Faktori stimulacije kolonija (CSF) su faktori rasta koji pomažu koštanoj srži u stvaranju crvenih krvnih zrnaca. Budući da neki tretmani kancera (npr., hemoterapija) mogu uticati na bela krvna zrnca (koja pomažu u borbi protiv infekcije), faktori koji stimulišu kolonije mogu se uvesti kako bi se podržali nivoe belih krvnih zrnaca i ojačali imuni sistem. Stimulativni faktori kolonija takođe se mogu koristiti nakon transplantacije koštane srži kako bi se pomoglo novoj srži u proizvodnji belih krvnih zrnaca. Reprezentativni primeri CSF-a koji se mogu koristiti u anti-PRLR ADC iz ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na eritropoetin (epoetin), filgrastim (Neopogen (poznat i kao faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF); Amgen, Inc ), sargramostim (leukin (granulocitni makrofagne kolonije-stimulativni faktor i GM-CSF), Genzime Corporation), promegapoetin i Oprelvekin (rekombinantni IL-11; Pfizer, Inc.). Stoga, u jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje anti-PRLR antitelo koje sadrži ADC opisano ovde i CSF.

4. Genska terapija

[0334] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano na najmanje jednu nukleinsku kiselinu (direktno ili indirektno preko nosača) za gensku terapiju. Genska terapija se uglavnom odnosi na uvođenje genetskog materijala u ćeliju, pri čemu je genetski materijal dizajniran za tretiranje bolesti. Kako se odnosi na imunomodulatorna sredstva, genska terapija se koristi da stimuliše prirodnu sposobnost subjekta da inhibira proliferaciju ćelija kancera ili da ubije ćelije kancera. U jednom aspektu anti-PRLR ADC pronalaska sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira funkcionalni, terapeutski gen koji se koristi za zamenu mutiranog ili drugačije disfunkcionalnog (npr., skraćenog) gena povezanog sa kancerom. U drugim otelotvorenjima, anti-PRLR ADC pronalaska sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira ili na drugi način obezbeđuje proizvodnju terapeutskog proteina za tretiranje kancera.

Nukleinska kiselina koja kodira terapeutski gen može biti direktno konjugovana anti-PRLR antitelom, ili alternativno, može biti konjugovana sa anti-PRLR antitelom preko nosača. Primeri nosača koji se mogu koristiti za isporuku nukleinske kiseline za gensku terapiju obuhvataju, ali bez ograničenja, virusne vektore ili lipozome.

5. Agensi za alkilovanje

[0335] Antitelo protiv PRLR pronalaska može biti konjugovano sa jednim ili više sredstava za alkilaciju. Alkilacioni agensi su klasa antineoplastičnih jedinjenja koji pripisuju alkil grupu DNK. Primeri alkilacionih sredstava koji se mogu upotrebiti u ADC-ovima pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, alkil sulfonat, etilenimim, derivate metilamina, epokside, azotni iperit, nitrozourease, triazine i hidrazine.

a. Alkil sulfonati

[0336] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa bar jednim alkil sulfonatom. Alkil sulfonati su podklasa alkilacionih sredstava sa opštom formulom: R-SO2-OR1, gde su R i R1 tipično alkil ili aril grupe. Reprezentativni primer alkil sulfonata uključuje, ali nije ograničen na, busulfan (Myleran, GlaxoSmithKline; Busulfex IV, PDL BioPharma, Inc.).

b. Azotni iperit

[0337] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim azotnim iperitom. Reprezentativni primeri ove podklase antikancerogenih jedinjenja uključuju, ali se ne ograničavaju na hlorambucil (Leukeran, GlaxoSmithKline), ciklofosfamid (Cytoxan, Bristol-Myers Squibb; Neosar, Pfizer, Inc.), estramustin (estramustin fosfat natrij ili Estracyt), Pfizer, Inc.), ifosfamid (Ifex, Bristol-Myers Squibb), mehloretamin (Mustargen, Lundbeck Inc.) i melfalan (Alkeran ili L-Pam ili fenilalanin iperit, GlaxoSmithKline).

c. Nitrozoureja

[0338] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednom nitrozourejom. Nitrozoureje su podklasa alkilacionih sredstava koja su rastvorljiva lipidom. Reprezentativni primeri uključuju, ali se i ne ograničavaju na, karmustin (BCNU [poznat i kao BiCNU, N, N-Bis (2-hloroetil)-N-nitrozourea, ili 1, 3-bis (2-hloroetil)-l-nitrozourea], Bristol-Myers Squibb), fotemustin (poznat i kao Muphoran)), lomustin (CCNU ili 1-(2-hloroetil)-3-ciclohekil-1-nitrozoureja, Bristol-Myers Squibb), nimustin (poznat i kao ACNU) , i streptozocin (Zanosar, Teva Pharmaceuticals).

d. Triazini i Hidrazini

[0339] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim triazinom ili hidrazinom. Triazini i hidrazini su podklasa alkilacionih sredstava koja sadrže azot. U nekim otelotvorenjima ova jedinjenja se spontano raspadaju ili mogu biti metabolizovana kako bi se proizveli alkil diazonijumi intermedijari koji olakšavaju prenos alkil grupe u nukleinske kiseline, peptidi i/ili polipeptidi, čime uzrokuju mutagene, kancerogene ili citotoksične efekte. Reprezentativni primeri uključuju, ali nisu ograničeni samo na dakarbazin (DTIC-Dome, Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc.), prokarbazin (Mutalane, Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc.) i temozolomid (Temodar, Schering Plough).

e. Drugi agensi za alkilovanje

[0340] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim etileniminom, derivatom metilamina ili epoksidom. Etilenimini su podklasa alkilacionih sredstava koja tipično sadrže bar jedan aziridinski prsten. Epoksidi predstavljaju podklase alkilacionih sredstava koja se karakterišu kao ciklični etri sa samo tri atoma prstena.

[0341] Predstavnici primera etilenimina uključuju, ali se ne ograničavaju na, tiopeta (Thioplex, Amgen), diazikon (poznat i pod nazivom aziridinil benzokinon (AZK)) i mitomicin C. Mitomicin C je prirodni proizvod koji sadrži aziridinski prsten i izgleda da indukuje citotoksičnost preko unakrsne veze DNK (Dorr RT, i dr. Cancer Res.1985;45:3510; Kennedy KA, i dr Cancer Res.1985;45:3541). Reprezentativni primeri derivata metilamina i njihovih analoga uključuju, ali bez ograničenja, altretamin (Hexalen, MGI Pharma, Inc.), koji je poznat i kao heksametilamin i heksastat. Reprezentativni primeri epoksida ove klase jedinjenja protiv kancera uključuju, ali se ne ograničavaju na dianhidrogalaktitol.

Dianhidrogalaktitol (1,2:5,6- dianhidrogalaktitol) je hemijski vezan za aziridine i generalno olakšava prenos alkil grupe kroz sličan mehanizam kao što je gore opisano. Dibromodulcitol se hidrolizuje u dianhidrogalaktitol i stoga je pro-lek za epoksid (Sellei C, i dr. Cancer Chemother Rep. 1969;53:377).

6. Antiangeogeni agensi

[0342] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano barem jednom antiangeogenom agensu. Antiangeogeni agensi inhibiraju rast novih krvnih sudova.

Antiangiogeni agens vrši svoje efekte na različite načine. U nekim otelotvorenjima, ovi agensi ometaju sposobnost faktora rasta da dostigne svoj cilj. Na primer, vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) je jedan od primarnih proteina uključenih u iniciranje angiogeneze vezivanjem za određene receptore na površini ćelije. Prema tome, određeni antiangeogeni agensi koji sprečavaju interakciju VEGF sa svojim kognatnim receptorima, sprečavaju VEGF da inicira angiogenezu. U drugim otelotvorenjima, ovi agensi ometaju intracelularne signalne kaskade. Na primer, kada jednom aktivira određeni receptor na površini ćelija, započinje se kaskada drugih hemijskih signala kako bi se promovisao rast krvnih sudova. Tako, određeni enzimi, na primer, neke tirozin kinaze, za koje je poznato da olakšavaju intracelularne signalne kaskade koje doprinose, na primer, proliferaciji ćelija, su mete za tretiranje karcinoma. U drugim otelotvorenjima, ovi agensi međusobno mešaju intracelularne signalne kaskade. Ipak, u drugim izvođenjima, ovi agensi onemogućavaju specifične ciljeve koji aktiviraju i promovišu rast ćelija ili direktno ometaju rast ćelija krvnih sudova. Inhibitorne karakteristike angiogeneze otkrivene su u više od 300 supstanci sa brojnim direktnim i indirektnim inhibitornim efektima.

[0343] Reprezentativni primeri antiangeogenih agenasa koji se mogu koristiti u ADC pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja, angiostatin, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, EGF vakcina, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225 (Erbitux, ZD1839 (Iressa), OSI-774, Erlotinib (tarceva), angiostatin, arestin, endostatin, BAY 12-9566 i w/ fluorouracil ili doksorubicin, kanstatin, karboksiamidotriozol i sa paklitakselom, EMD121974, S-24, vitaksin, dimethylxanthenone acetic acid, IM862, Interleukin-12, Interleukin-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, angiozyme (ribozyme), IMC-1C11, Neovastat, marimstat, prinomastat, BMS-275291,COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, sa paklitakselom, sa gemcitabinom i cisplatinom, i sa irinotekanom i cisplatinom i sa zračenjem, tekogalanom, temozolomidom i PEG interferonom α2b, tetratiomolibdat, TNP-470, thlidomid, CC-5013 sa taksoterom, tumstatinom, 2-metoksiestradiolom, VEGF zamenom, mTOR inhibitorima (deforolimus, everolimus (Afinitor, Novartis Pharmaceutical Corporation), i temsirolimus (Torisel, Pfizer, Inc.)), tyrosine kinase inhibitors (e.g., erlotinib (Tarceva, Genentech, Inc.), imatinib (Gleevec, Novartis Pharmaceutical Corporation), gefitinib (Iressa, AstraZeneca Pharmaceuticals), dasatinib (Sprycel, Brystol-Myers Squibb), sunitinib (Sutent, Pfizer, Inc.), nilotinib (Tasigna, Novartis Pharmaceutical Corporation), lapatinib (Tykerb, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals), sorafenib (Nexavar, Bayer i Onyx), fosfoinositid 3-kinaze (PI3K).

7. Antimetaboliti

[0344] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antimetabolitom. Antimetaboliti su tipovi terapija hemoterapije koji su veoma slični normalnim supstancama unutar ćelije. Kada ćelije sadrže antimetabolit u ćelijskom metabolizmu, rezultat je negativan za ćeliju, npr., ćelija ne može da se podeli. Antimetaboliti su klasifikovani prema supstancama sa kojima se mešaju. Primeri antimetabolita koji se mogu upotrebiti u ADC pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, antagonist folne kiseline (npr., metotreksat), antimikrobin pirimidin (npr., 5-fluorouracil, foksuridin, citarabin, kapecitabin i gemcitabin), antagonista purina (npr., 6-meraptopurin i 6-tioguanin) i inhibitor adenozin deaminaze (npr., Cladribine, Fludarabine, Nelarabine i Pentostatin), kako je detaljnije opisano u nastavku.

a. Antifolati

[0345] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antifolatom. Antifolati su podklasa antimetabolita koji su strukturno slični folatu.

Reprezentativni primeri uključuju metotreksat, 4-amino-folnu kiselinu (poznatu i kao aminopterin i 4-aminopteroična kiselina), lometreksol (LMTX), pemetreksed (Alimpta, Eli Lilly i Company) i trimetreksat (Neutreksin, Ben Venue Laboratories, Inc.)

b. Antagonisti purina

[0346] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antagonistom purina. Analogi purina su podklasa antimetabolita koji su strukturno slični grupi jedinjenja poznatih kao purini. Reprezentativni primeri antagonista purina uključuju azatioprin (Azasan, Salix; Imuran, GlaxoSmithKline), kladribin (Leustatin [poznat i kao 2-CdA], Janssen Biotech, Inc.), merkaptopurin (purinetol (poznat i kao 6-merkaptoetanol], GlaxoSmithKline), fludarabin (Fludara, korporacija Genzime), pentostatin (Nipent, takođe poznat kao 2'-deoksiksformicin (DCF)), 6-tioguanin (Lanvis [poznat i kao tioguanin], GlaxoSmithKline).

c. Pirimidinski antagonisti

[0347] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim pirimidinskim antagonistom. Pirimidinski antagonisti su podklasa antimetabolita koji su strukturno slični grupi jedinjenja poznatih kao purini. Reprezentativni primeri pirimidinskih antagonista uključuju, ali se ne ograničavaju na azacitidin (Vidaza, Celgene Corporation), kapecitabin (Xeloda, Roche Laboratories), Citarabin (takođe poznati kao citozin arabinozid i arabinosilcitozin, Bedford Laboratories), decitabin (Dacogen, Eisai Pharmaceuticals), 5-fluorouracil (Adrucil, Teva Pharmaceuticals, Efudex, Valeant Pharmaceuticals, Inc), 5-fluoro-2'-deoksiuridin 5'-fosfat (FdUMP), 5-fluorouridin trifosfat i gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly i Company).

8. Agensi koji sadrže bor

[0348] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim bornim sredstvom. Agensi koja sadrže bor sadrži klase terapijskih jedinjenja kancera koje ometaju proliferaciju ćelija. Reprezentativni primeri agenasa koji sadrže bor uključuju, ali nisu ograničeni, na boroficin i bortezomib (Velcade, Millenium Pharmaceuticals).

9. Hemoprotektivni agensi

[0349] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim hemoprotektivnim sredstvom. Hemoprotektivni lekovi su klasa jedinjenja koja pomažu zaštiti tela od specifičnih toksičnih efekata hemoterapije. Hemoprotektivni agensi se mogu davati različitim hemoterapijama kako bi zaštitili zdrave ćelije od toksičnih efekata lekova hemoterapije, istovremeno omogućavajući tretiranje ćelija karcinoma pomoću date hemoterapeutike. Reprezentativni hemoprotektivni agenti uključuju, ali se ne ograničavaju na amifostin (Ethyol, Medimmune, Inc.), koji se koristi za smanjenje toksičnosti bubrega povezane sa kumulativnim dozama cisplatina, deksrazoksana (Totect, Apricus Pharma, Zinecard), za tretiranje ekstravazacije uzrokovanih pomoću antraciklina (Totect) i za tretiranje komplikacija vezanih za srce uzrokovanih primenom antitumornog antibiotika doksorubicina (Zinecard) i mesne (Mesnex, Bristol-Myers Squibb), koji se koristi za sprečavanje hemoragičnog cistitisa tokom hemoterapijskog tretmana sa ifofamidom.

10. Hormonski agensi

[0350] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim hormonskim agensom. Hormonski agens (uključujući sintetičke hormone) je jedinjenje koje ometa proizvodnju ili aktivnost endogenih hormona endokrinog sistema. U nekim otelotvorenjima ova jedinjenja međusobno ometaju rast ćelija ili proizvode citotoksični efekat. Neograničavajući primeri uključuju androgene, estrogene, medroksiprogesteron acetat (Provera, Pfizer, Inc.) i progestine.

11. Antihormonski agensi

[0351] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antihormonskim agensom. „Antihormonski” agens je sredstvo koje potiskuje proizvodnju i/ili sprečava funkciju određenih endogenih hormona. U jednom aspektu, antihormonsko sredstvo ometa aktivnost hormona izabranog iz grupe koja sadrži androgene, estrogene, progesterone i hormone koji sprovode goanadotropin, čime se ometa rast različitih ćelija karcinoma.

Reprezentativni primeri antihormonskih agenasa uključuju, ali se ne ograničavaju na, aminoglutetimid, anastrozol (Arimidex, AstraZeneca Pharmaceuticals), bicalutamid (Casodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), ciproteron acetat (Cyprostat, Bayer PLC), degareliks (Firmagon, Ferring Pharmaceuticals), eksemestan (Aromasin, Pfizer Inc.), flutamid (Drogenil, Schering-Plough Ltd), fulvestrant (Faslodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), goserelin (Zolodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), letrozol (Femara, Novartis Pharmaceuticals Corporation), leuprolid (Prostap), lupron, medroksiprogesteron acetat (Provera, Pfizer Inc.), Megestrol acetat (Megace, Bristol-Myers Squibb Company), tamoksifen (Nolvadex, AstraZeneca Pharmaceuticals), i triptorelin (Decapetyl, Ferring).

12. Kortikosteroidi

[0352] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa bar jednim kortikosteroidom. Kortikosteroidi se mogu koristiti u ADC pronalasku da bi se smanjila inflamacija. Primer kortikosteroida uključuje, ali nije ograničen na, glukokortikoid, na primer, prednizon (Deltasone, Pharmacia & Upjohn Company, a division of Pfizer, Inc.).

13. Fotoaktivni terapeutski agensi

[0353] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim fotoaktivnim terapeutskim agensom. Fotoaktivni terapeutski agensi uključuju jedinjenja koja se mogu primeniti da ubiju tretirane ćelije nakon izlaganja elektromagnetnom zračenju određene talasne dužine. Terapeutski relevantna jedinjenja apsorbuju elektromagnetno zračenje na talasnim dužinama koje prodiru u tkivo. U poželjnim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje u ne-toksičnom obliku koji je sposoban da proizvede fotohemijski efekat koji je otrovan za ćelije ili tkivo nakon dovoljne aktivacije. U drugim poželjnim otelotvorenjima, ova jedinjenja se zadržavaju kanceroznim tkivom i lako se uklanjaju iz normalnih tkiva. Neograničavajući primeri uključuju različite hromagene i boje.

14. Oligonukleotidi

[0354] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim oligonukleotidom. Oligonukleotidi su napravljeni od kratkih lanaca nukleinskih kiselina koji rade tako što ometaju procesiranje genetskih informacija. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi za upotrebu u ADC-u su nemodifikovani jednolančani i/ili dvostruki DNK ili RNK molekuli, dok u drugim otelotvorenjima ovi terapeutski oligonukleotidi su hemijski modifikovani jednolančani i/ili dvostruki DNK ili RNK molekuli. U jednom otelotvorenju, oligonukleotidi koji se koriste u ADC-u ima su relativno kratki (19-25 nukleotida) i hibridiziraju u jedinstvenu sekvencu nukleinske kiseline u ukupnom bazenu ciljeva nukleinske kiseline prisutne u ćelijama. Neke od važnih oligonukleotidnih tehnologija uključuju antisens oligonukleotide (uključujući interferenciju RNK), aptamere, CpG oligonukleotide i ribozi

a. Antisens oligonukleotidi

[0355] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim antisens oligonukleotidom. Antisens oligonukleotidi su dizajnirani da se vezuju za RNK kroz hibridizaciju Watson-Crick. U nekim otelotvorenjima antisens oligonukleotid komplementaran je sa nukleotidom koji kodira region, domen, deo ili segment PRLR. U nekim otelotvorenjima antisens oligonukleotid sadrži od oko 5 do oko 100 nukleotida, od oko 10 do oko 50 nukleotida, od oko 12 do oko 35 i od oko 18 do oko 25 nukleotida. U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% %, najmanje 99% ili najmanje 100% homologni regionu, delu, domenu ili segmentu PRLR gena. U nekim otelotvorenjima postoji znatna homolognizacija sekvence za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ili 100 uzastopnih nukleotida PRLR gena. U poželjnim otelotvorenjima, veličina ovih antisens oligonukleotida se kreće od 12 do 25 nukleotida u dužini, pri čemu je većina antisens oligonukleotida dužine 18 do 21 nukleotida. Postoji više mehanizama koji se mogu eksploatisati da inhibiraju funkciju RNK kada se oligonukleotid vezuje za ciljnu RNK (Crooke ST. (1999). Biochim. Biophys. Acta, 1489, 30-42). Naj-okarakterisaniji antisens mehanizam rezultira cepanjem ciljane RNK endogenim ćelijskim nukleazama, kao što je RNase H ili nukleaza povezana sa mehanizmom interferencije RNK. Međutim, oligonukleotidi koji inhibiraju ekspresiju ciljnog gena nekatalitičkim mehanizmima, kao što je modulacija vezivanja ili prestanka prevođenja, mogu takođe biti potentni i selektivni modulatori funkcije gena.

[0356] Još jedan antisens mehanizam zavisio od RNase-a koji je nedavno dobio veliku pažnju RNKi (Fire i dr. (1998). Nature, 391, 806-811.; Zamore PD. (2002). Science, 296, 1265-1269.). RNK interferencija (RNKi) je post-transkripcijski proces u kome dvolančana RNK inhibira ekspresiju gena na specifičan način. U nekim otelotvorenjima, RNKi efekat se postiže uvođenjem relativno duže dvostruke RNK (dsRNK), dok se u preferiranim otelotvorenjima ovaj RNKi efekat postiže uvođenjem kraćih dvostrukih RNK, npr. mala interferentna RNK (siRNK) i/ili mikroRNK (miRNK). U još jednom otelotvorenjima, RNKi se takođe može postići uvođenjem plazmida koji generišu dsRNK komplementarnu ciljanom genu. U svakom od prethodnih otelotvorenja, dvostruka RNK je dizajnirana da ometa ekspresiju gena određene ciljne sekvence unutar ćelija. Generalno, mehanizam uključuje konverziju dsRNK u kratke RNK koje usmeravaju ribonukleaze u homologne mRNK mete (sumirano, Ruvkun, Science 2294:797 (2001)), što zatim degradira odgovarajuću endogenu mRNK, čime se dobija modulacija ekspresije gena. Zapaženo je da je dsRNK imala antiproliferativna svojstva, što omogućava i planiranje terapijskih primena (Aubel i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:906 (1991)). Na primer, pokazalo se da sintetička dsRNK inhibira rast tumora kod miševa (Levy i dr. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62:357-361 (1969)), aktivan u tretiranju leukemijskih miševa (Zeleznick i dr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.130:126-128 (1969)), i inhibira hemijski indukovanu tumorigenezu u koži miša (Gelboin i dr., Science 167: 205-207 (1970)). Prema tome, u poželjnom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje upotrebu antisens oligonukleotida u ADC-u za tretiranje kancera dojke. U drugim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje sastave i postupke za iniciranje tretmana antisens oligonukleotida, pri čemu dsRNK ometa ekspresiju ciljne ćelije PRLR na nivou mRNK. dsRNK, kao što je prethodno korišćeno, odnosi se na prirodno nastalu RNK, delimično prečišćenu RNK, rekombinantno proizvedenu RNK, sintetičku RNK, kao i izmenjenu RNK koja se razlikuje od prirodne RNK uz uključivanje nestandardnih nukleotida, nukleotidnog materijala, nukleotidni analogi (npr. zaključana nukleinska kiselina (LNK)), deoksiribonukleotidi i bilo koja njihova kombinacija. RNK iz ovog pronalaska treba da bude dovoljno slična prirodnoj RNK da ima sposobnost da posreduje antisens oligonukleotidnom modulacijom koja je ovde opisana.

b. Aptameri

[0357] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim aptamerom. Aptamer je molekul nukleinske kiseline koji je izabran iz slučajnih bazena na osnovu njegove sposobnosti vezivanja drugih molekula. Kao i antitela, aptameri mogu vezati ciljne molekule sa izuzetnim afinitetom i specifičnostima. U mnogim aspektima aptameri pretpostavljaju složene, zavisne od sekvence, trodimenzionalne oblike koji im omogućavaju da komuniciraju sa ciljanim proteinom, što rezultira čvrstim vezanim kompleksom analognim interakciji sa antitelom-antigenom, čime se ometa funkcija navedenog proteina. Poseban kapacitet aptamera da se tesno i specifično vezuju za ciljni protein ističu njihov potencijal kao ciljane molekularne terapije.

c. CpG oligonukleotidi

[0358] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim CpG oligonukleotidom. Poznato je da su bakterijska i virusna DNK snažni aktivatori urođenog i specifičnog imuniteta kod ljudi. Ove imunološke karakteristike su povezane sa nemetilovanim CpG dinukleotidnim motivima pronađenim u bakterijskoj DNK. Zbog činjenice da su ovi motivi retki kod ljudi, imuni sistem čoveka je razvio sposobnost prepoznavanja ovih motiva kao ranog naznaka infekcije i potom inicirati imunološke reakcije. Prema tome, oligonukleotidi koji sadrže ovaj CpG motiv mogu se eksploatisati da iniciraju antitumorski imuni odgovor.

d. Ribozimi

[0359] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim ribozimom. Ribozimi su katalitički RNK molekuli u rasponu od oko 40 do 155 nukleotida u dužini. Sposobnost ribozima da prepoznaju i odseku specifične RNK molekule čine ih potencijalnim kandidatima za terapiju. Reprezentativni primer uključuje angiozim.

15. Radionuklidni agensi (radioaktivni izotopi)

[0360] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim radionuklidnim agensom. Radionuklidna sredstva sadrže agense koji se karakterišu nestabilnim jezgrom koji je sposoban da prolazi kroz radioaktivno raspadanje. Osnova za uspešno tretiranje radionuklida zavisi od dovoljne koncentracije i produženog zadržavanja radionuklida od strane ćelija karcinoma. Drugi faktori koji treba uzeti u obzir uključuju poluživot radionuklida, energiju emitovanih čestica i maksimalni domet koji može emitovati čestica. U poželjnim otelotvorenjima, terapeutsko sredstvo je radionuklid izabran iz grupe koja se sastoji od 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y I25I, I31I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re , 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149PM, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, i<211>Pb. Takođe su poželjni radionuklidi koji se značajno raspadaju sa česticama koje emituju Auger. Na primer, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-1111, Sub-119, I-125, Ho-161, Os-189m i Ir-192. Poželjno su energija raspadanja korisnih nukleida koji emituju beta čestice Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 i Fm-255. Energije raspadanja korisnih radionuklida koji emituju alfa-čestice su poželjno 2,000-10,000 keV, još poželjnije 3,000-8,000 keV, a najpoželjnije 4,000-7,000 keV. Dodatni potencijalni radioizotopi upotrebe uključuju<11>C,<13>N,<15>0,<75>Br,<198>Au,<224>Ac,<126>I,<133>I,<77>Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, I03Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, !66Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br,<I69>Yb, i slično.

16. Radiosenzibilizatori

[0361] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim radiosenzibilizatorom. Termin „radiosenzibilizator”, kako se ovde koristi, definisan je kao molekul, poželjno molekul male molekulske mase, koji se daje životinjama u terapeutski efikasnim količinama kako bi se povećala osetljivost ćelija radiosenzibilizovanog na elektromagnetno zračenje i/ili promovisati terapiju bolesti koje se mogu tretirati elektromagnetnim zračenjem. Radiosenzibilizatori su agensi koji čine ćelije kancera osetljivije na terapiju zračenjem, dok obično imaju mnogo manje efekta na normalne ćelije. Prema tome, radiosenzibilizator se može koristiti u kombinaciji sa radioobeleženim antitelom ili ADC-om. Dodavanje radiosenzibilizatora može dovesti do povećane efikasnosti u poređenju sa tretmanom sa radioaktivno označenim antitelom ili fragmentom antitela.

Radiosenzibilizatori su opisani u D. M. Goldberg (ed.), Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, CRC Press (1995). Primeri radiosenzibilizatora uključuju gemcitabin, 5-fluorouracil, taksan i cisplatin.

[0362] Radiosenzibilizatori se mogu aktivirati elektromagnetnim zračenjem rendgenskih zraka. Reprezentativni primeri radio-senzitizatora koji se aktiviraju putem rentgenskog zračenja uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicin C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nikotinamid, 5-bromodeoksiuridin (BUdR), 5-jododeoksiuridin (IUdR), bromodeoksicitidin, fluorodeoksiuridin (FUdR), hidroksiurea, cisplatin i terapeutski efikasni analogi i derivati istog. Alternativno, radiosenzibilizatori se mogu aktivirati korišćenjem fotodinamičke terapije (PDT). Reprezentativni primeri fotodinamskih radiosenzibilizatora uključuju, ali nisu ograničeni na, derivate hematoporfirina, Photofrin (r), derivate benzoporfirina, NPe6, tin etoporfirin (SnET2), foberobid a, bakteriohlorofil a, naftalocianin, ftalocianin, cink ftalocianin i terapeutski efikasne analoge i derivati istog.

17. Inhibitori topoizomeraze

[0363] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim inhibitorom topoizomeraze. Inhibitori topoizomeraze su hemoterapijska sredstva namenjena da ometaju delovanje enzima topoizomeraze (topoizomeraza I i II), koji su enzimi koji kontrolišu promene strukture DNK tako što katalizuju tada prekidanje i ponovnu vezu fosfodiestarskog db lanca DNK tokom normalnog ćelijskog ciklusa. Reprezentativni primeri inhibitora DNK topoizomeraze I uključuju, ali nisu ograničeni na, kamptotecine i njegove derivate irinotekan (CPT-11, Camptosar, Pfizer, Inc.) i topotekan (Hicamtin, GlakoSmithKline Pharmaceuticals). Reprezentativni primeri inhibitora dno topoizomeraze II uključuju, ali bez ograničenja na, amsacrine, daunorubicin, doktotrubicin, epipodofilotoksine, elipticine, epirubicin, etopozid, razoksan i tenipozid.

18. Inhibitori tirozin kinaze

[0364] Anti-PRLR antitelo pronalaska može biti konjugovano sa najmanje jednim inhibitorom tirozin kinaze. Tirozin kinaze su enzimi unutar ćelije koji funkcionišu da dodaju fosfatne grupe aminokiselinskom tirozinu. Blokirajući sposobnost funkcionisanja proteinskih tirozin kinaza, rast tumora može biti inhibiran. Primeri tirozin kinaza koji se mogu koristiti u ADC pronalasku uključuju, ali bez ograničenja, Axitinib, Bosutinib, Cediranib, Dasatinib, Erlotinib, Gefitinib, Imatinib, Lapatinib, Lestaurtinib, Nilotinib, Semaxanib, Sunitinib i Vandetanib.

19. Ostali agensi

[0365] Primeri drugih agenasa koji se mogu koristiti u ADC-ovi pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, abrin (npr. lanac Abrin A), alfa toksin, Aleurites fordii protein, amatoksin, krotin, curcin, dianthin proteine, toksin dipterije (npr. diftheria A lanac i nezavezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina), dezoksiribonukleaze (Dnase), gelonina, mitogelina, modeccin A lanca, inhibitora momordice charantia, neomicina, onkonaze, fenomicina, protein Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), pokeveed antivirusni protein, Pseudomonas endotoksin, Pseudomonas exotoxin (npr. eksotoksin A lanac (from Pseudomonas aeruginosa)), restrictocin, ricin A lanac, ribonuclease (Rnase), sapaonaria officinalis inhibitor, saporin, alfa-sarcin, Staphylcoccal enterotoxin-A, tetanus toksin, cisplatin, carboplatin, i oksaliplatin (Eloxatin, Sanofi Aventis), proteasom inhibitori (npr. PS-341 [bortezomib ili Velcade]), HDAC inhibitori (vorinostat (Zolinza, Merck & Company, Inc.)), belinostat, entinostat, mocetinostat, i panobinostat), COX-2 inhibitori, supstituisane uree, protein toplotnog šoka inhibitori (e.g. Geldanamycin i njegov veliki broj analoga), adrenokortikalne supresione supstance i trikothecene. (Videti npr., WO 93/21232). Ostali agensi takođe uključuju asparaginazu (Espar, Lundbeck Inc.), hidroksiureu, levamizol, mitotan (Lysodren, Bristol-Myers Squibb), i tretinoin (Renova, Valeant Pharmaceuticals Inc.).

[0366] Treba napomenuti da gore pomenute grupe lekova koje se mogu koristiti u anti-PRLR ADC iz ovog pronalaska nisu ekskluzivne, jer se određeni primeri lekova mogu naći u više od jedne kategorije, npr., ansamitocini su oba mitotska inhibitora i antitumornih antibiotika.

[0367] Svi stereoizomeri navedenih lekova su razmatrani za jedinjenja iz ovog pronalaska, tj. bilo koja kombinacija R i S konfiguracija na hiralnim ugljenicima D.

[0368] Gornja sredstva (tj., goli agensi koji nisu konjugovani antitelom) takođe mogu biti korišćeni u kombinovanim terapijama sa anti-PRLR antitelima koja su ovde opisana. U jednom otelotvorenju, anti-PRLR antitela prema pronalasku se koriste sa bilo kojim prethodnim agensima u kombinovanoj terapiji za tretiranje kancera, gde se sredstvo daje pre, istovremeno kao ili posle primene anti-PRLR antitela subjektu.

B. Veznici

[0369] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-PRLR ADC za ciljanu isporuku lekova. Anti-PRLR ADC pronalaska sadrži anti-PRLR antitelo prema pronalasku i lek, pri čemu antitelo i lek mogu biti povezani preko veznika. Tako, u jednom aspektu, konjugat antitela za lek (ADC) sadrži veznik, citotoksični lek i anti-PRLR antitelo. Termin „veznik”, kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsku grupu koja sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno pripisuju antitelo u deo leka. ADC se priprema koristeći veznik koji ima reaktivnu funkcionalnost za vezivanje za antitelo i lek. Na primer, cistein tiol ili amin. Na primer, N-terminus ili bočni lanac amino kiseline, kao što je lizin, antitela može formirati vezu sa funkcionalnom grupom veznika.

[0370] Veznici su poželjno stabilni vanćelijski. Pre transporta ili isporuke u ćeliju, ADC je poželjno stabilan i ostaje netaknut, tj. antitelo ostaje povezano sa delom leka. Veznici su stabilni izvan ciljane ćelije i mogu se razdvojiti u nekoj efikasnoj brzini unutar ćelije.

Efikasni veznik će: (i) održati specifična vezivna svojstva antitela; (ii) dozvoljava isporuku, npr. intracelularnu isporuku, konjugata ili ostatka leka; i (iii) održavanje citotoksičnog efekta ubijanja ćelija, citostatičkog efekta ili terapeutskog dejstva leka. Stabilnost ADC-a se može meriti pomoću standardnih analitičkih tehnika kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika separacije/analize LC/MS.

[0371] Generalno, ADC-ovi sadrže antitelo kovalentno vezano za najmanje jednu jedinicu leka. Jedinica(e) leka može biti kovalentno vezana direktno ili putem veznika. Kovalentno vezivanje antitela i dela leka zahteva da veznik ima dve reaktivne funkcionalne grupe, tj. bivalentnost u reaktivnom smislu. Poznati su bivalentni veznik reagensi koji su korisni za povezivanje dve ili više funkcionalnih ili biološki aktivnih delova, kao što su peptidi, nukleinske kiseline, lekovi, toksini, antitela, haptene i reporter grupe, a metode su opisane njihovim nastalim konjugatima (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques;

Academic Press: New York, p234-242).

[0372] U nekim aspektima, ADC ima sledeću formulu (formula I):

L-(LU-D)p (I)

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat; gde je:

L je antitelo, npr., anti-PRLR antitelo prema predmetnom pronalasku, i

(LU-D) je deo ostatak leka veznika, u kome:

LU- je jedinica veznik (koja se takođe naziva veznik), i

-D je deo leka koji ima, na primer, citostatičku, citotoksičnu ili drugačiju terapeutsku aktivnost protiv ciljane ćelije, npr., ćelija koja izražava PRLR; i

[0373] U nekim aspektima, p se kreće od 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 do 2. U nekim aspektima, p se kreće od 2 do 10, 2 do 9, 2 do 8, 2 do 7, 2 do 6, 2 do 5, 2 do 4 ili 2 do 3. U drugim aspektima, p je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 U nekim aspektima, p je 2, 4, 6 ili 8.

[0374] U nekim aspektima, ostaci -D su isti. U još jednom aspektu, ostaci -D su različiti.

[0375] U nekim aspektima ADC ima sledeću formulu (II):

L-(Aa-Ww-Yy-D)p(II)

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat, gde:

L je antitelo, npr. anti-PRLR antitelo, i

-Aa-Ww-Yy- je jedinica veznika (LU), u kojoj:

-A- je opcionalna Stretcher jedinica,

a je 0 ili 1,

svaka -W- je nezavisna jedinica aminokiseline (ili u nekim aspektima, jedinica za glukuronid, videti i objavu SAD br.2012/0107332 A1),

w je ceo broj u rasponu od 0 do 12,

-Y- je samo imolativna jedinica razdvajanja,

y je 0, 1 ili 2;

-D je jedinica za lekove koja ima, na primer, citostatičku, citotoksičnu ili drugačiju terapeutsku aktivnost prema ciljnoj ćeliji, npr., ćelija koja izražava PRLR; i p je ceo broj od 1 do 20.

[0376] U nekim aspektima, a je 0 ili 1, w je 0 ili 1, a i je 0, 1 ili 2. U nekim aspektima, a je 0 ili 1, w je 0 ili 1, a i je 0 ili 1. U nekom aspekti, p se kreću od 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 do 2. U nekim aspektima, p kreće od 2 na 8, 2 do 7, 2 do 6, 2 do 5, 2 do 4 ili 2 do 3. U drugim aspektima, p je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. U nekim aspektima, p je 2 ili 4 U nekim aspektima, kada w nije nula, i je 1 ili 2. U nekim aspektima, kada je w od 1 do 12, i je 1 ili 2. U nekim aspektima, w je 2 do 12, a i je 1 ili 2. U nekim aspektima, a je 1 i w i i su 0.

[0377] Za sastave koji sadrže mnoštvo antitela, opterećenje lekova je predstavljeno sa p, prosečnim brojem molekula lekova po antitelu. Opterećenje leka može se kretati od 1 do 20 lekova (D) po antitelu. Prosečan broj lekova po antitelu u izradi reakcija konjugacije može se karakterizirati konvencionalnim sredstvima kao što su masena spektroskopija, ELISA test i HPLC. Kvantitativna raspodela ADC-a u smislu p može se takođe odrediti. U nekim slučajevima, razdvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenih ADC-ova gde je p određena vrednost ADC-a sa drugim opterećenjem lekova može se postići pomoćima kao što je HPLC sa reverznom fazom ili elektroforeza. U primernim aspektima, p je od 2 do 8.

[0378] Generisanje ADC-a može se ostvariti bilo kojom tehnikom poznatom stručnom veštaku. ADC-ovi pronalaska sadrže anti-PRLR antitela opisana ovde, lek, i opciono veznik koji se pridružuje leku i antitelu. U jednom aspektu, antitelo je anti-PRLR antitelo koje sadrži najmanje jednu promenljivu oblast koja je navedena u SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 123. Dostupan je niz različitih reakcija za kovalentnu vezu lekova i veznika sa antitelima. Ovo se može postići reakcijom aminokiselinskih ostataka antitela, uključujući aminske grupe lizina, grupe glutamata i aspartinske kiseline slobodne karboksilne kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i različite grupe aromatičnih aminokiselina. Jedna od najčešće korišćenih nespecifičnih metoda kovalentnog vezivanja je karbodiimidna reakcija koja povezuje karboksi (ili amino) grupu jedinjenja sa amino (ili karboksi) grupama antitela. Dodatno, bifunkcionalni agensi kao što su dialdehidi ili imidoestri koriste se za povezivanje amino grupe jedinjenja sa amino grupama antitela. Takođe dostupno za vezivanje lekova na antitela je Schiff bazna reakcija. Ova metoda podrazumeva periodičnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, čime se formira aldehid koji zatim reaguje sa vezujućim agensom. Dodaci se javljaju putem formiranja Schiff baze sa amino grupama antitela.

Izotiocijanati se takođe mogu koristiti kao vezujući agensi za kovalentno povezivanje lekova sa antitelima. Ostale tehnike su poznate stručnjacima i u okviru ovog pronalaska.

[0379] U određenim aspektima, intermedijer, koji je prekursor veznika, reaguje sa lekarom pod odgovarajućim uslovima. U određenim aspektima, reaktivne grupe se koriste na leku ili na intermedijeru. Proizvod reakcije između leka i intermedijera, ili derivatizovanog leka, zatim se reaguje sa antitelom anti-PRLR u odgovarajućim uslovima. Sinteza i struktura primernih veznika, jedinica za nošenje, jedinice aminokiselina, samozapaljive distorzione jedinice su opisane u patentima SAD br.20030083263, 20050238649 i 20050009751.

Primeri veznika su navedeni u nastavku.

[0380] U poželjnom aspektu, veznik nije bitno osetljiv na vanćelijski okruženje. Kako se ovde koristi, „nije bitno osetljiv na vanćelijski okruženje”, u kontekstu veznika, znači da ne više od oko 20%, obično ne više od oko 15%, više tipično ne više od oko 10%, a još više obično ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% veznika, u uzorku konjugovanog jedinjenja antitela i leka kada se ADC predstavlja u vanćelijskom okruženju (npr. u plazmi). Da li veznik nije bitno osetljiv na vanćelijski okruženje, može se odrediti, na primer, inkubiranjem sa plazmom jedinjenja konjugata supstratnih supstanci za unapred određeni vremenski period (npr., 2, 4, 8, 16 ili 24 sata), a zatim kvantitativno određivanje količine slobodnog leka prisutnog u plazmi.

[0381] U nekim aspektima, veznik se može razdvojiti u unutarćelijskim uslovima, tako da cepanje veznika oslobađa jedinicu leka iz antitela u unutarćelijskom okruženju. U nekim aspektima, razdvojivi veznik je osetljiv na pH, tj. osetljiv na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Tipično, pH-osetljiv veznik se hidrolizira pod kiselim uslovima. Na primer, može se koristiti kiselinski labilni veznik koji se može hidrolizovati u lizozomu (npr., hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitni amid, ortoester, acetal, ketal ili slično). (Videti, npr., patent SAD br.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville i dr., 1989, Biol. Chem.264:14653-14661). Takvi veznici su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH-a, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni ispod pH 5,5 ili 5,0, približni pH lizozoma. U određenim aspektima, hidrolizabilni veznik je tioetarski veznik (kao što je, na primer, tioetar koji je povezan sa terapeutskim sredstvom preko akilhidrazonske veze (videti, npr., patent SAD br.5,622,929).

[0382] U drugim aspektima, veznik se može otkloniti u uslovima redukcije (npr., disulfidni veznik). Različiti disulfidni veznici su poznati u struci, uključujući na primer one koji se mogu formirati pomoću SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetata), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen), SPDB i SMPT. (Videti, npr., Thorpe i dr., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak i dr., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Videti takođe patent SAD br.4,880,935.).

[0383] U nekim aspektima, veznik se može razdvojiti sredstvom za cepanje, na primer, enzim koji je prisutan u unutarćelijskom okruženju (npr., u okviru lizozoma ili endosoma ili caveolea). Veznik može biti, na primer, peptidil veznik koji se cepa unutarćelijskim peptidaznim ili proteaznim enzimom, uključujući, bez ograničenja, lizozomsku ili endosomnu proteazu. U nekim aspektima, peptidil veznik je dugačak najmanje dve aminokiseline ili najmanje tri aminokiseline. Sredstva za cepanje mogu uključivati katepsine B i D i plazmin, od kojih su sve poznate da hidrolizuju derivate dipeptidnih lekova što rezultira oslobađanjem aktivnog leka unutar ciljnih ćelija (videti npr., Dubowchik i Walker, 1999, Pharm.

Therapeutics 83:67-123). Najznačajniji su peptidil veznici koji se mogu otkloniti enzimima koji su prisutni u PRLR-ekspresivnim ćelijama. Primeri takvih veznika su opisani, npr., u patentu SAD br. Br.6,214,345. U određenom aspektu, peptidil veznik koji se može ukloniti unutarćelijskom proteazom je veznik Val-Cit ili veznik Phe-Lys (videti, npr., patent SAD br.

6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa val-cit veznikom). Jedna prednost korišćenja intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog agensa je u tome što je agens tipično atenuiran kada je konjugovan i serumska stabilnost konjugata je tipično visoka.

[0384] U drugim aspektima, veznik ADC obelodanjivanja je malonatni veznik (Johnson i dr., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), maleimidobenzoil veznik (Lau i dr., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), ili 3'-N-amidni analog (Lau i dr., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).

[0385] U još nekim aspektima, veznik jedinica se ne može razdvojiti i lek se oslobađa, na primer, degradacijom antitela. Videti objavu SAD br.20050238649. ADC koji sadrži necepajući veznik može se dizajnirati tako da ADC ostaje znatno izvan ćelije i interaguje sa određenim receptorima na ciljanoj ćelijskoj površini tako da vezivanje ADC inicira (ili sprečava) posebno ćelijski signalni put.

[0386] U nekim aspektima, veznik jedinica je u suštini hidrofilni veznik (npr., PEG4Mal i sulfo-SPDB). Hidrofilni veznik se može koristiti da spreči ispuštanje leka iz rezistentnih ćelija karcinoma pomoću MDR (višestruke otpornosti na lekove) ili funkcionalno sličnih transportera.

[0387] U drugim aspektima, nakon cepanja, veznik funkcije direktno ili indirektno inhibira rast ćelija i/ili proliferaciju ćelija. Na primer, u nekim aspektima, veznik, nakon cepanja, može funkcionirati kao interkalentni agens, čime se inhibira makromolekularna biosinteza (npr. Replikacija DNK, transkripcija RNK i/ili sinteza proteina).

[0388] U drugim aspektima, veznik je osmišljen tako da olakša ubistvo slučajnog ubijanja (ubijanje susednih ćelija) putem difuzije jedinice za povezivanje jedinice i/ili leka sa susednim ćelijama. U drugim aspektima, veznik promoviše internalizaciju ćelije.

[0389] Prisustvo sterički sprečenog disulfida može povećati stabilnost određene disulfidne veze, povećavajući potencijal ADC-a. Prema tome, u jednom aspektu, veznik uključuje sterički sprečenu disulfidnu vezu. Sterično sprečeni disulfid se odnosi na disulfidnu vezu koja je prisutna u određenom molekularnom okruženju, pri čemu se okruženje karakteriše određenim prostornim rasporedom ili orijentacijom atoma, obično unutar istog molekula ili jedinjenja, koji sprečava ili bar delimično sprečava redukciju disulfidna veza. Prema tome, prisustvo gustih (ili sterilno otežavajućih) hemijskih delova i/ili gomilanih aminokiselinskih bočnih lanaca proksimalnih prema disulfidnoj vezi sprečava ili barem delimično inhibira disulfidnu vezu od potencijalnih interakcija koje bi rezultirale redukcijom disulfidne veze.

[0390] Primetno, pomenuti tipovi povezivanja se međusobno ne isključuju. Na primer, u jednom aspektu, veznik koji se koristi u ADC-u obelodanjivanja je nerazdvojivi veznik koji promoviše internalizaciju ćelije.

[0391] Kao što je opisano u prethodnoj formuli II, u nekim aspektima anti-PRLR ADC obelodanjivanja uključuje rastežuću jedinicu. Jedinica za rastezanje(A), kada je prisutna, sposobna je da povezuje antitelo sa jedinicom aminokiselina (-W-), ako je prisutno, na rastežuću jedinicu (-Y-), ukoliko je prisutna; ili na lek (-D) (vidi Formulu II). Korisne funkcionalne grupe koje mogu biti prisutne na anti-PRLR antitelima koja su ovde opisana, bilo prirodno ili putem hemijske manipulacije, uključuju, ali nisu ograničene na, sulfhidril, amino, hidroksil, anomernu hidroksilnu grupu ugljenih hidrata i karboksil. Pogodne funkcionalne grupe su sulfhidril i amino. U jednom primeru, sulfhidrilne grupe mogu se generisati redukcijom intramolekularnih disulfidnih veza antivegetativnih anti-PRLR antitela. U drugom aspektu, sulfhidrilne grupe se mogu generisati reakcijom amino grupe lizinskog dela antitela anti-PRLR sa 2-iminotiolana (Trautov reagens) ili drugim reagensima koji stvaraju sulfhidril. U određenim aspektima, anti-PRLR antitelo je rekombinantno antitelo i konstruisano je da nosi jednu ili više lizinskih grupa. U nekim drugim aspektima, rekombinantno anti-PRLR antitelo je projektovano da nosi dodatne sulfhidrilne grupe, na primer, dodatne cisteine.

[0392] U jednom aspektu, razdvajajuća jedinica formira vezu sa atomom sumpora antitela. Atom sumpora može se izvesti iz sulfhidrilne grupe antitela. Reprezentativne jedinice za razdvajanje ovog aspekta prikazane su unutar kvadratnih zagrada Formula IIIa i IIIb, kao što je prikazano u nastavku,

gde L-, -W-, -Y-, -D, w i y jesu definisani iznad, i R17 je odabran iz -C1-C10alkilee-, -C1-C10alkenilen-, -C1-C10alkinilen-, carbociclo-, -O-(C1-C8alkilen)-, O-(C1-C8alkenilen)-, -O-(C1-C8alkinilen)-, -arilen-, -C1-C10alkilen-arilen-, -C2-C10alkenilen-arilen, -C2-C10alkinilenarilen, arilen-C1-C10alkilen-, - arilen-C2-C10alkenilen-, -arilen-C2-C10alkinilen-, -C1-C10alkilen-(karbociklo)-, -C2-C10alkenilene-(karbociklo)-, C2-C10alkinilen-(karbociklo)-, -(karbociklo)-C1-C10alkilen-, - (karbociklo )-C2-C10alkenilen-, -(karbociklo)-C2-C10alkinilen, -heterociklo-, -C1-C10alkilen-(heterociklo)-, -C2-C10alkenilen-(heterociklo)-, -C2-C10alkinilen-(heterociklo)-, -(heterociklo)-C1-C10alkilen-, -(heterociklo)-C2-C10alkenilen-, -(heterociklo)-C1-C10alkinilen-, -(CH2CH2O)r-, ili -(CH2CH2O)r-CH2-, i r je ceo broj u rasponu od 1 do 10, pri čemu navedeni alkil, alkenil, alkinil, alkilen, alkenilen, alkiniklen, arit, karbocikl, karbociklo, heterociklo i ailenski radikali, bilo pojedinačno ili kao deo neke druge grupe, su opciono supstituisani. U nekim aspektima, pomenuti alkil, alkenil, alkinil, alkilen, alkenilen, alkiniklen, arit, karbocil, karbociklo, heterociklo i ailenski radikali, bez obzira da li su sami ili kao deo druge grupe, nisu nesupstituisani. U nekim aspektima, R17 je izabran iz -C1-C10alkilen-, -karbociklo-, -O-(C1-C8alkilen)-, -arilen-, -C1-C10alkilen-arilen-, -arilen-C1-C10alkilen-, -C1-C10alkilen-(karbociklo)-, -(karbociklo)-C1-C10alkilen-, -C3-C8heterociklo-, -C1-C10alkilen-(heterociklo)-, -(heterociklo)-C1-C10alkilen-, -(CH2CH2O)r-, i-(CH2CH2O)r-CH2-; i r je ceo broj u rasponu od 1 do 10, pri čemu su pomenute alkilenske grupe nesupstituisane a ostatak grupa je opciono supstituisana.

[0393] Ilustrativna jedinica nosača je formule IIIa gde je R<17>- (CH2)5-, kako je prikazano u daljem tekstu (videti takođe SAD.8,309,093).

[0394] Druga ilustrativna jedinica za razdvajanje je ona iz Formule IIIa gde je R17 -(CH2CH2O)r-CH2-; i r je 2, kako je prikazano u nastavku (videti takođe SAD.8,309,093).

[0395] Druga ilustrativna jedinica za razdvajanje je ona Formule IIIa gde je R17 arilen- ili arilen- C1-C10alkilen-. U nekim aspektima, arilna grupa je nesupstituisana fenilna grupa.

Ipak, još jedna ilustrativna jedinica za razdvajanje je ona Formule IIIb gde je R<17>-(CH2)5-, kako je prikazano dole (videti takođe patent SAD br.8,309,093).

[0396] U određenim aspektima jedinica za razdvajanje je povezana sa antitelom anti-PRLR putem disulfidne veze između atoma sumpora jedinice protiv PRLR antitela i atoma sumpora jedinice za razdvajanje. Predstavnička jedinica za razdvajanje ovog aspekta prikazana je u kvadratnim zagradama Formule IV (videti dole, i videti i SAD 8,309,093), pri čemu su R<17>, L-, W-, Y-, D, w i y kao što je gore definisano.

[0397] Treba napomenuti da S ostatak u formuli koja je prikazana dole (videti takođe SAD 8,309,093) odnosi se na atom sumpora antitela, osim ako je kontekstom drugačije naznačeno.

[0398] U još nekim aspektima, razdvajači sadrže reaktivno mesto koje može formirati vezu sa primarnom ili sekundarnom amino grupom antitela. Primeri ovih reaktivnih mesta obuhvataju ali nisu ograničeni na aktivne estre kao što su estri sukcinimida, 4 nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, tetrafluorofenil estri, anhidridi, hloridi kiselina, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocianati. Reprezentativne jedinice za razdvajanje ovog aspekta prikazane su unutar kvadratnih zagrada Formula Va i Vb (videti dole (videti takođe US 8,309,093)), pri čemu su R<17>, L-, W-, Y-, D, w i y kao što je gore definisano.

[0399] U nekim aspektima nosila sadrže reaktivno mesto koje reaguje na modifikovanu ugljovodoničnu (-CHO) grupu koja može biti prisutna na antitelu. Na primer, ugljeni hidrat može biti blago oksidisan pomoću reagensa kao što je natrijum periodat, a rezultujuća (-CHO) jedinica oksidovanog ugljenog hidrata može se kondenzovati razdvajačem koji sadrži funkcionalnost kao što je hidrazid, oksim, primarni ili sekundarni amin, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i jedan arilhidrazid kao što su opisali Kaneko i dr., 1991, Bioconjugate Chem.2:133-41. Reprezentativne razdvajajuće jedinice ovog aspekta prikazane su unutar kvadratnih zagrada Formula VIa, VIb i VIc (videti dole (videti takođe SAD 8,309,093), pri čemu -R<17>-, L-, -W-, -Y-, -D, w i y su definisani kao gore.

[0400] Jedinica aminokiselina (-W-), kada je prisutna, povezuje jedinicu za razvlačenje sa jedinicom za razdvajanje ako je prisutna razdvajajuća jedinica, povezuje jedinicu za razvlačenje sa delom leka ako je razdvajajuća jedinica odsutna, i povezuje jedinicu antitela sa jedinice za lekove ako jedinica za nosila i razdvajajuća jedinica nisu prisutna. Ww-može biti, na primer, monopeptid, dipeptid, tripeptid, tetrapeptid, pentapeptid, heksapeptid, heptapeptid, oktapeptid, nonapeptid, decapeptid, undekapeptid ili dodecapeptidna jedinica. Svaka -W-jedinica nezavisno ima formulu koja je označena ispod (pogledati takođe SAD 8,309,093) u kvadratnim zagradama, a w je celi broj u rasponu od 0 do 12,

gde je R19 vodonik, metil, izopropil, izobutil, sek-butil, benzil, p-hidroksibenzil, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, - -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, - (CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, - (CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenil, cikloheksil i druge neograničavajuće reprezentativne

grupe, kao što je prikazano u nastavku.

[0401] U nekim aspektima, aminokiselinska jedinica može biti enzimsko odsečena od jednog ili više enzima, uključujući karcinom ili protein povezan sa tumorom, radi oslobađanja leka (-D), koji se u jednom aspektu protonira in vivo nakon oslobađanja kako bi se dobio lek .

[0402] U određenim aspektima, jedinica aminokiselina može sadržati prirodne aminokiseline. U drugim aspektima, aminokiselinska jedinica može sadržati ne-prirodne aminokiseline. Ilustrativne Wwjedinice su predstavljene formulom (VII) (kao što je prikazano u nastavku (videti takođe SAD 8,309,093),

gde R20 i R21 su prikazani ispod;

formula (VIII) (kao što je prikazano ispod (videti i SAD 8,309,093),

gde R20, R21 , i R22 jesu kao što je ispod opisano;

i formula (IX) (kao što je naznačena ispod (videti i SAD 8,309,093),

gde R20, R21 , R22 , i R23 jesu kao što je ispod naznačeno:

[0403] Primeri aminokiselinskih jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinice formule VII gde: R21 je -(CH2)4NH2; R20 je izopropil i R21 je -(CH2)4NH2; ili R20 je izopropil i R21 je -(CH2)3NHCONH2. Druga primerna aminokiselinska jedinica je jedinica formule VIII gde R20 je benzil, R21 je benzil, i R22 je -(CH2)4NH2.

[0404] Korisne - Ww- jedinice mogu biti dizajnirane i optimizovane u svojoj selektivnosti za enzimsko cepanje od strane određenog enzima, na primer, proteaze povezane sa tumorom. U jednom aspektu, a- Ww- jedinica je ona čija se cepanje katalizuje katepsin B, C i D ili plazmin proteaza. U jednom aspektu, - Ww- je dipeptid, tripeptid, tetrapeptid ili pentapeptid. Kada su R19, R20, R21 , R22 ili R23 različiti od vodonika, atom ugljenika za koji su vezani R<19>, R20, R21 , R22 ili R23 je hiralan. Svaki atom ugljenika za koji su vezani R19, R20, R21 , R22 ili R23 je nezavisan u konfiguraciji (S) ili (R).

[0405] U jednom aspektu aminokiselinske jedinice, jedinica aminokiseline je valin-citrulin (vc ili val-cit). U drugom aspektu, jedinica aminokiselina je fenilalanin-lizin (tj., fk). U još jednom aspektu aminokiselinske jedinice, jedinica aminokiseline je N-metilvalin-citrulin. U još jednom aspektu, jedinica aminokiseline je 5-aminovalerna kiselina, homo fenilalanin lizin, tetraizokinolinkarboksilat lizin, cikloheksilalanin lizin, lizin izonepekotične kiseline, lbeta-alanin lizin, glinin serin valin glutamin i izonepekotska kiselina.

[0406] Alternativno, u nekim aspektima, -W- je jedinica glukuronida koja povezuje jedinicu za razvlačenje sa razdvajajućom jedinicom ako su prisutne jedinice za razvlačenje i razdvajanje, povezuje jedinicu za razvlačenje sa delom za lekove ako je odsutna distancera i povezuje veznik jedinicu u leku ako nisu nosioci razvlačenje i razdvajanja. Jedinica glukuronida obuhvata lokaciju koja se može razdvojiti enzimom β-glukuronidaze (videti takođe SAD 2012/0107332 A1). U nekim aspektima, jedinica glukuronida obuhvata šećernu grupu (Su) koja je preko glikozidne veze (-O'-) povezana sa samo-imolativnom grupom (Z) formule koja je prikazana u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332).

[0407] Glikozidna veza (-O'-) je tipično mesto za cepanje β-glukuronidaze, kao što je veza koja se može razbiti od strane čoveka, lizozomska β-glukuronidaza. U kontekstu glukuronidne jedinice, termin „samo-imolativna grupa” odnosi se na di- ili tri-funkcionalnu hemijsku grupu koja je sposobna da kovalentno povezuje dva ili tri prostorna hemijska dela (tj., šećerna grupa (preko glikozidne grupe vezu), jedinicu za lekove (direktno ili indirektno putem razdvajajuće jedinice), au nekim aspektima veznik (direktno ili indirektno preko jedinice za razvlačenje) u stabilni molekul. Samo-imolativna grupa će se spontano odvojiti od prvog hemijskog deo (npr. razdvajač ili jedinica za lekove) ako se veza sa šećernim ostatkom razbije.

[0408] U nekim aspektima, šećerna grupa (Su) je ciklična heksoza, kao što je piranoza ili ciklična pentoza, kao što je furanoza. U nekim aspektima, piranoza je glukuronid ili heksoza. Šećerni deo je obično u β-D formatu. U specifičnom aspektu, piranoza je deo β-D-glukuronida (tj., β-D-glukuronska kiselina povezana sa samo-imolativnom grupom -Z- preko glikozidne veze koja se može otkloniti pomoću β-glukuronidaze). U nekim aspektima, šećerna grupa je nesupstituisana (npr., prirodno prisutna ciklična heksoza ili ciklična pentoza). U drugim aspektima, šećerna grupa može biti supstituisani β-D-glukuronid (tj., glukuronska kiselina supstituisana sa jednom ili više grupa, kao što je vodonik, hidroksil, halogen, sumpor, azot ili niži alkil.

[0409] U nekim aspektima, samo-imolativna grupa Z je jedinica p-aminobenzil alkohola (PAB), kako je dalje opisano ovde. Druge pogodne samo-imolativne grupe su poznate u tehnici.

[0410] U nekim aspektima, jedinica za glukuronid ima jednu od formulara kako je prikazano u daljem tekstu (videti takođe SAD 2012/0107332 A1),

gde Su je šećerna grupa, glikozidna veza sadrži vezu sa kisikom između Su i samoimolativne grupe Z, a svaki R je nezavisno vodonik, halo (npr., hloro, bromo, fluoro itd.), -CN, -N02ili druga grupa za povlačenje ili donaciju elektrona, pod uslovom da se jedinica glikuronida (i posebno Z) podvrgne sao-imolaciji nakon cepanja glikozidne veze. U nekim aspektima, svaki R je nezavisno vodonik, halo (npr., hloro, bromo, fluoro, itd.), -CN ili -N02.

[0411] U nekim aspektima, jedinica za glukuronid ima jednu od formulara kako je prikazano u daljem tekstu (videti takođe SAD 2012/0107332 A1),

gde Su je deo šećera, glikozidna veza (-O'-) sadrži vezu sa kisikom između Su i samozadovoljavajuće grupe Z, a svaki R je nezavisno vodonik.

[0412] U nekim aspektima, samo-imolativna grupa (Z) je kovalentno povezana sa šećernom grupom, sa lekom (direktno ili indirektno preko razmičuće jedinice), i sa veznikom (direktno ili indirektno preko jedinice za razvlačenje). U nekim aspektima, konjugat veznika lekova ima formulu koja je prikazana u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1),

gde su Su, O ', Z, Y, y, D, A i a definisani ovde. Tipično, od 1 do 20 takvih konjugata veznika leka može se povezati sa veznikom.

[0413] U nekim aspektima, ADC koji sadrži jedinicu glukuronida ima jednu od formula kako je prikazano u daljem tekstu (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), gde su Su, Y, y, D, A, a i L definisani kao što je ovde opisano.

[0414] U nekim aspektima, ADC koji sadrži jedinicu glukuronida ima formulu koja je prikazana u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), pri čemu su ovde definisani Y,

[0415] U nekim aspektima, ADC koji sadrži jedinicu glukuronid ima formulu koja je prikazana u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), pri čemu su Y, y, D i L definisani kako je ovde opisano.

[0416] U nekim aspektima, ADC koji sadrži jedinicu glukuronid ima formulu koja je prikazana u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), pri čemu su Y, y, D i L definisani kako je ovde opisano.

[0417] U nekim aspektima, ADC koji sadrži jedinicu glukuronid ima formulu koja je prikazana u daljem tekstu (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), gde je D opisan ovde, a mAb je monoklonsko antitelo.

[0418] U drugoj grupi aspekata, veznik je povezan (direktno ili indirektno) sa šećernom grupom (Su), koja je povezana sa samo-imolativnom grupom (Z) koja je povezana (direktno ili indirektno) sa lekom, u skladu sa formulom kao što je prikazano u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), gde su A, a, Su, O ', Z, w, Y, y, D i L definisani kao što je ovde opisano.

[0419] Na primer, šećerna grupa (Su) može se povezati direktno sa antitelom ili indirektno preko jedinice za razvlačenje. Samo-imolativna grupa (Z) može se direktno povezati sa lekom ili indirektno putem razmičuće jedinice.

[0420] U srodnim aspektima, jedinjenje za veznik lekove ima sledeću formulu kao što je prikazano u nastavku (videti takođe SAD 2012/0107332 A1), gde su A, a, Su, O ', Z, w,Y, y i D ovde definisane.

[0421] Tipično, od 1 do 20 takvih veznikskih lekova jedinjenja mogu biti vezana za antitelo.

[0422] Jedinica za razmicanje (-Y-), kada je prisutna, povezuje jedinicu aminokiseline (ili glukuronidnu jedinicu, videti i SAD 2012/0107332 A1 u jedinicu za lekove kada je prisutna jedna aminokiselinska jedinica). Uz to, jedinica razmicanja povezuje jedinicu za razvlačenje na jedinicu za lekove kada jedinica aminokiseline nije prisutna. Razmičuća jedinica takođe povezuje jedinicu za lekove sa jedinicom za antitela kada nisu prisutne i aminokiselina i jedinica za razvlačenje.

[0423] Razmičuće jedinice su dva opšta tipa: ne samo-imolativna ili samo-imolativna.

Jedinstvena ne samo-imolativna razmičuća jedinica je ona u kojoj deo ili celokupna razmičuća jedinica ostaje vezana za deo leka nakon cepanja, posebno enzimskog, jedinice aminokiselina (ili glukuronidne jedinice) iz konjugata antitela. Primeri ne samo-imolativne razmičuće jedinice uključuju, ali se ne ograničavaju na jedinicu (glicin-glicin) razmičuću jedinicu i jedinicu za glicinsko razmicanje (oba prikazana na šemi 1 dole (videti takođe SAD 8,309,093)).

[0424] Kada konjugat koji sadrži razmičuću jedinicu glicin-glicin ili jedinicu za glicinsko razmicanje prolazi kroz enzimski rastvor preko enzima (npr. proteina koji je povezan sa tumorskim ćelijama, proteaza povezana sa kanceroznim ćelijama ili proteaza povezana sa limfocitom), ostatak glicin-glicin leka ili ostatak glicinskog leka se odvaja od L-Aa-Ww-. U jednom aspektu, nezavisna hidrolizna reakcija se odvija unutar ciljne ćelije, rastavljajući vezu između glicinskog leka i oslobađa leka.

[0425] U nekim aspektima, ne samo-imolativna razmičuća jedinica (-Y-) je -Gly-. U nekim aspektima, ne samo-imolativna razmičuća jedinica (-Y-) je -Gly-Gly-.

[0426] U jednom aspektu, obezbeđen je konjugat lek-veznika u kome je razmičuća jedinica odsutna (y = 0) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.

[0427] Alternativno, konjugat koji sadrži samo-imolativnu razmičuću jedinicu može da oslobodi -D. Kao što je ovde korišćeno, termin „samo- imolativnu razmicač” odnosi se na bifunkcionalni hemijski deo koji je sposoban kovalentno povezati dve razmaknute hemijske grupe u stabilan trodelni molekul. Spontano će se odvojiti od drugog hemijskog ostatka ako se veza sa prvim ostacima odvaja.

[0428] U nekim aspektima, -Yy- je jedinjenje p-aminobenzil alkohola (PAB) čiji je fenilenski deo supstituisan sa Qmgde Q je C1-C8alkil, -C1-C8alkenil, -C1-C8alkinil, -O- (C1-C8alkil), -0- (C1-C8alkenil), -0- (C1-C8alkinil), -halogen, -nitro ili -cijano; i m je ceo broj u rasponu od 0-4. Alkil, alkenil i alkinil grupe, bilo sami ili kao deo druge grupe, mogu se opciono supstituisati.

[0429] U nekim aspektima, -Y- je PAB grupa koja je povezana sa - Ww- preko atoma amino azota grupe PAB, i direktno povezana sa -D preko karbonatne, karbamatne ili etarske grupe. Bez vezivanja bilo kakvom posebnom teorijom ili mehanizmom, šema 2 dole (videti takođe SAD 8,309,093) prikazuje mogućnost mehanizma izdavanja lekova grupe PAB koja je direktno vezana za -D preko karbamatne ili karbonatne grupe kao što je opisao Toki i dr., 2002, J. Org. Chem.67:1866-1872.

[0430] U šemi 2, Q je - C1-C8alkil, - C1-C8alkenil, - C1-C8alkinil, -O- (C1-C8alkil), -O- (C1-C8alkenil), -O-(C1-C8alkinil), -halogen, -nitro ili -cijano; m je ceo broj u rasponu od 0-4; i p se kreće od 1 do oko 20. Alkil, alkenil i alkinil grupe, bilo same ili kao deo neke druge grupe, mogu se opciono supstituisati.

[0431] Bez vezivanja bilo kakvom posebnom teorijom ili mehanizmom, šema 3 dole (videti takođe SAD 8,309,093) prikazuje mogući mehanizam izdavanja lekova PAB grupe koja je direktno vezana za -D preko veze etra ili amina, pri čemu D uključuje kiseonik ili grupu azota koja je deo leka.

[0432] U šemi 3, Q je - C1-C8alkil, - C1-C8alkenil, - C1-C8alkinil, -O- (C1-C8alkil), -O- (C1-C8alkenil), -0- (C1-C8alkinil), -halogen, -nitro ili -cijano; m je ceo broj u rasponu od 0-4; i p se kreće od 1 do oko 20. Alkil, alkenil i alkinil grupe, bilo same ili kao deo neke druge grupe, mogu se opciono supstituisati.

[0433] Drugi primeri samo-imolativnih razdvajača uključuju, ali se ne ograničavaju na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (Hay i dr., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett.9:2237) i orto ili paraaminobenzilacetali. Mogu se koristiti razdvajači koji se podvrgavaju ciklizaciji hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobutirne kiseline (Rodrigues i dr., 1995, Chemistry Biology 2:223), odgovarajuće supstituisane biciklo [2.2.1] i biciklo [2.2.2] prstenasti sistemi (Storm i dr., 1972, J. Amer. Chem. Soc.94:5815) i amidi 2-aminofenilpropionske kiseline (Amsberry i dr., 1990, J. Org. Chem.55:5867). Eliminacija lekova koji sadrže amin koji su supstituisani na α-položaju glicina (Kingsbury i dr., 1984, J. Med. Chem. 27:1447)) su takođe primeri samo-imolativnih razdvajača.

[0434] U jednom aspektu, razdvajačka jedinica je razgranata bis(hidroksimetil)-stirenska (BHMS) jedinica koja je prikazana na šemi 4 dole (videti takođe SAD 8,309,093), koja se može koristiti za inkorporiranje i oslobađanje više lekova.

[0435] U šemi 4 iznad, Q je - C1-C8alkil, - C1-C8alkenil, - C1-C8alkinil, -O-(C1-C8alkil), -0-(C1-C8alkenil), -O-(C1-C8alkinil), -halogen, -nitro ili -cijano; m je ceo broj u rasponu od 0-4; n je 0 ili 1; i p se kreće od 1 do oko 20. Alkil, alkenil i alkinil grupe, bilo same ili kao deo neke druge grupe, mogu se opciono supstituisati.

[0436] U jednom aspektu, razdvajačke jedinice (-Yy-) su predstavljene Formulama (X) -(XII) (videti dole (videti takođe SAD 8,309,093) gde Q je - C1-C8alkil, - C1-C8alkenil, - C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -O-(C1-C8alkenil), -O-(C1-C8alkinil), -halogen, -nitro ili -cijano, a m je ceo broj u rasponu od 0- 4.

[0437] Alkil, alkenil i alkinil grupe, bilo same ili kao deo druge grupe, mogu se opciono supstituisati.

[0438] Aspekti Formule I i II koji sadrže ADC mogu takođe uključiti jedinjenje sa strukturom kako je prikazano u nastavku (videti takođe SAD 8,309,093),

gde su w i y svaki 0, 1 ili 2, i jedinjenje sa strukturom kao što je prikazano dole (videti takođe SAD 8,309,093),

pri čemu su w i y svaki 0, a jedinjenja kao što je prikazano dole (videti takođe SAD 8,309,093).

[0439] U još nekim aspektima, jedinica za razmicanje (-Y-), kada je prisutna, povezuje jedinicu glukuronida, kada je prisutna, sa delom leka. U nekim aspektima, razmičuća jedinica (e) ovih aspekata su samo-imolativni razdvajači. U tom kontekstu, termin „samo-imolativni razdvajač” odnosi se na bifunkcionalni hemijski deo koji je sposoban kovalentno povezati dve razmaknute hemijske grupe u normalno stabilan trodelni molekul. Spontano će se odvojiti od drugog hemijskog ostatka ako se veza sa prvim ostacima odvaja.

[0440] U nekim aspektima, -Y- je povezan sa - Ww- preko atoma metilen ugljenika samoimolativne grupe, i povezana direktno sa -D preko karbonatne, karbamatne ili etarske grupe.

[0441] U nekim aspektima, - Yy- je jedinica p-aminobenzil alkohola (PAB) čiji je fenilenski deo supstituisan sa Qmgde je Q kao što je ovde definisano, a m je celi broj u rasponu od 0-4. U drugom aspektu, - Yy- može biti karbonatna grupa.

[0442] Drugi primeri samo-imolativnih razdvajača uključuju, ali se ne ograničavaju na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (videti, npr., Hay i dr., 1999, Bioorg.9: 2237) i orto ili paraaminobenzilacetali. Mogu se koristiti razdvajači koji se podvrgavaju ciklizaciji hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobutirne kiseline (videti npr. Rodrigues i dr., 1995, Chem. Biology 2:223), odgovarajuće supstituisane biciklo [2.2.1] i biciklo [2.2.2] prstenasti sistemi (videti npr. Storm i dr., 1972, J. Amer. Chem. Soc.94: 5815) i amidi 2 aminopenilpropionske kiseline (videti, npr., Amsberry i dr., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Eliminacija lekova koji sadrže amin koji su supstituisani na a-položaju glicina (videti, npr., Kingsbury i dr., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) su takođe primeri samoimolativnih razdvajača.

[0443] Druge pogodne razdvajačke jedinice su obelodanjene u objavljenoj SAD patentnoj prijavi br.2005-0238649.

[0444] Drugi pristup za generisanje ADC-a uključuje upotrebu heterobifunkcionalnih unakrsnih veznika koji povezuju anti-PRLR antitela sa lekom od interesa. Poželjno, unakrsni veznici su N-sukcinimidil 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoat ili N-sulfosukcinimidil 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoat, rastvorljiv u vodi, N-sukcinimidil -4-(2-piridilditio)butirat (SPDB), N-sukcinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirat (SNPB) i N-sulfosukcinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirat (SSNPB), N-sukcinimidil-4-metil-4-(5-nitro-2-piridilditio) pentanoat(SMNP), N-sukcinimidil-4-(5-N, N-dimetilkarboksamido-2-piridilditio)butirat (SCPB) ili N- sulfosukcinimidil4-(5-N, N-dimetilkarboksamido-2-piridilditio)butirat (SSCPB)). Antitela iz ovog pronalaska modifikovana sa N-sukcinimidil 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoatom, N-sulfosukcinimidil 4-(5-nitro-2-piridilditio)-pentanoatom, SPDB, SNPB, SSNPB, SMNP, SCPB ili SSCPB mogu zatim reagovati sa malim viškom određenog leka koji sadrži deo tiola da bi se dobio odličan prinos ADC-a. Preferirano, unakrsni veznici su jedinjenja formule kao što je prikazano u daljem tekstu (videti takođe patent SAD br. 6,913,748),

gde su R, R1, R2i R3jednaki ili različiti i jesu H, metil, etil ili linearni, razgranati ili ciklični alkil sa 3 do 6 atoma ugljenika, n je 0 ili ceo broj od 1 do 4, X i Y su isti ili različiti i jesu H, CONR4R5ili NO2, pod uslovom da X i Y nisu oba H istovremeno, R4i R5su isti ili različiti i svaki je H, metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, sek-butil, izo-butil ili terc-butil, a Z je SO -3M+ ili H, pri čemu M<+>predstavlja metalni jon ili tetraalkil amonijum jon, pod uslovom da je X i/ili Y NO2, Z nije H. Dodatni heterobifunkcionalni unakrsni prstenovi i postupci izrade ADC-a koriste iste opisane su u patentu SAD broj 6,913,748.

[0445] U jednom aspektu, punjeni veznici (koji se takođe nazivaju pro-punjeni veznici) koriste se za konjugovanje anti-PRLR antitela na lekove da bi se formirali ADC. Punjeni veznici uključuju veznike koji se postaju puniti nakon ćelijske obrade. Prisustvo naelektrisane grupe u vezniku određenog ADC ili na lek nakon ćelijske obrade daje nekoliko prednosti, kao što su: (i) veća rastvorljivost ADC-a, (ii) sposobnost rada na većoj koncentraciji u (iii) sposobnost povezivanja većeg broja molekula lekova po antitelima, što potencijalno rezultuje većom potencijalnošću, (iv) potencijal za napunjene konjugatne vrste da se zadrže unutar ciljne ćelije, što dovodi do veće potencije, i (v) poboljšana osetljivost ćelija otpornih na više lekova, koje ne bi mogle da izvezu napunjene vrste lekova iz ćelije. Primeri nekih pogodnih napunjenih ili propanovanih unakrsnih veznika i njihove sinteze su prikazani na slikama 1 do 10 u patentu SAD br.8,236, 319. Poželjno je da su napunjeni ili pro-napunjeni unakrsni veznici oni koji sadrže sulfonat, fosfat, karboksil ili kvaternarnih aminskih supstituenata koji značajno povećavaju rastvorljivost ADC-a, posebno za ADC-ove sa 2 do 20 konjugovanih lekova. Konjugati pripremljeni od veznika koji sadrže pro-punjeni deo bi proizveli jednu ili više zaručenih grupa nakon što se konjugat metaboliše u ćeliji.

[0446] U sledećem aspektu, ADC obelodanjivanja sadrži veznik koji ima formulu kao što je prikazano u daljem tekstu (videti takođe patent SAD br.8,236, 319),

gde Y' predstavlja funkcionalnu grupu koja omogućava reakciju sa antitelom; Q predstavlja funkcionalnu grupu koja omogućava povezivanje leka preko disulfidne, tioeterske, tioestarske, peptidne, hidrazonske, estarske, etarske, karbamatne ili amidne veze; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, i R10su isti ili različiti i jesu H, linearni alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, razgranati ili ciklični alkil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika , linearni, razgranati ili ciklični alkenil ili alkinil koji imaju od 2 do 6 atoma ugljenika, anjone, kao što su ali bez ograničenja, SO - - 2-3, X-SO3, OPO3, X-OPO 2- 2-

3, PO3, X-PO 2-

3, CO2-, katjoni, kao što su, ali bez ograničenja, heterocikli koji sadrže azot, N<+>R11R12R13, ili X-N+R11R12R13ili fenil, gde su: R11, R12i R13su isti ili različiti i jesu H, linearni alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, ili razgranati ili ciklični alkil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika i X predstavlja fenil ili linearan alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika ili razgranati ili ciklični alkil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika; 1, m i n su 0 ili ceo broj od 1 do 4; A je fenil ili supstituisani fenil, pri čemu je supstituent linearni alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, ili razgranati ili ciklični alkil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika, ili zamenjeni supstituent odabran od anjona, kao što je, ali nije ograničeno SO - 2- -3, X-SO -3, OPO 2-

3, X-OPO3, PO 2

3, X-PO 2-3, CO2-, i katjoni, kao što su, ali bez ograničenja, heterocikli koji sadrže azot, N<+>R11R12R13ili X-N+R11R12R13, gde Ks ima istu definiciju kao gore, i gde je g 0 ili 1; Z je opciono polietilenoksi jedinjenje formule (OCH2CH2) p, pri čemu p je 0 ili ceo broj od 2 do oko 1000 ili jedinica F1-E1-P-E2-F2 u kojoj su E1 i E2 iste ili različite i su C=O, O ili NR14, gde R14je H, linearni alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, razgranati ili ciklični alkil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika, linearan, razgranat ili cikličan alkenil ili alkinil koji ima od 2 do 6 atoma ugljenika; P je peptidna jedinica između 2 i 20 aminokiselina dužine, pri čemu se E1 ili E2 mogu povezati sa peptidom preko terminalnog azota, terminalnog ugljenika ili preko bočnog lanca jedne od aminokiselina peptida; i F1 i F2 su isti ili različiti i predstavljaju opcionu polietilenoksi jedinicu formule (OCH2CH2) p, pri čemu je p 0 ili cijeli broj od 2 do oko 1000, pod uslovom da kada Z nije F1-E1-P-E2-F2 , najmanje jedan od R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, i R10je zamenjen supstituent ili kada je g 1, najmanje jedan od A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, i R10su napunjeni supstituenti.

[0447] Primeri funkcionalne grupe, Y', koji omogućavaju reakciju sa antitelom, uključuju agense koji reaguju sa aminom kao što su, ali bez ograničenja, estri N-hidroksisukcinmida, pnitrofenil estri, dinitrofenil estri, pentafluorofenil estri; tiol reaktivni agensi kao što su, ali bez ograničenja, piridildisulfidi, nitropiridildisulfidi, maleimidi, haloacetati i hloridi karboksilne kiseline.

[0448] Primeri funkcionalne grupe, Q, koja omogućava povezivanje leka, uključuju grupe koje omogućavaju povezivanje putem disulfidnog, tioeterskog, tioestarskog, peptidnog, hidrazonskog, estarskog, karbamatnog ili amidnog veziva. Takve funkcionalne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, tiol, disulfid, amino, karboksi, aldehide, maleimido, haloacetil, hidrazine i hidroksi.

[0449] Primeri linearnih alkila uključuju metil, etil, propil, butil, pentil i heksil. Primeri razgranatih ili cikličnih alkil grupa sa 3 do 6 atoma ugljenika obuhvataju izopropil, sek-butil, izobutil, terc-butil, pentil, heksil, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil.

[0450] Primeri linearnih alkenila koji imaju 2 do 6 atoma ugljenika uključuju etenil, propenil, butenil, pentenil, heksenil. Primeri razgranatih ili cikličnih alkenila koji imaju 2 do 6 atoma ugljenika obuhvataju izobutenil, izopentenil, 2-metil-1-pentenil, 2-metil-2-pentenil.

[0451] Primeri linearnih alkinila sa 2 do 6 atoma ugljenika uključuju etinil, propinil, butinil, pentinil, heksinil. Primeri razgranatih ili cikličnih alkinila koji imaju do 6 atoma ugljenika uključuju 3-metil-1-butinil, 3-metil-1-peninil, 4-metil-2-heksinil.

[0452] U jednom aspektu jedan od R1, R2, R3, R4, R9, ili R10je zamenjen supstituent odabran od sulfonata, fosfata ili trialkilamonijuma, a ostatak je H, l, g i m su svaki 0, n = 1, Q i Y 'svaki nezavisno, disulfidni supstituent, maleimido, haloacetil grupa ili estar N-hidroksi sukcinimida. U još poželjnijem aspektu jedan od R1, R2, R3, R4, R9, ili R10je sulfonat, a ostatak su H, 1, g i m svaki od 0, n = 1, Q je disulfid, maleimido ili haloacetil, a Y' je maleimido grupa ili estar N-hidroksi sukcinimida. U još poželjnijem aspektu jedan od R1, R2, R3, R4, R9, ili R10je sulfonat, a ostatak su H, 1, g i m svaki od 0, n = 1, Q je piridilditio ili nitropiridilditio grupe, maleimido ili haloacetil grupe, a Y' je N-hidroksi sukcinimid estar.

[0453] Dodatni primeri veznika koji se mogu koristiti sa sadašnjim sastavima i metodama uključuju valin-citrulin; maleimidokaproil; amino benzojske kiseline; paminobenzilkarbamoil (PAB); lizozomski razdvajivi vezniki; maleimidokaproil-polietilen glikol(MC(PEG)6-OH); N-metil-valin citrulin; N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC); N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio) butanoat (SPDB); i N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP) (videti takođe SAD 2011/0076232).

Još jedan veznik za upotrebu u prikazanom opisu uključuje vezivanje avidin-biotina da bi se obezbedio ADC koji sadrži avidin-biotin (videti takođe patent SAD br.4,676,980, PCT objave br.WO1992/022332A2 WO1994/016729A1, WO1995/015770A1, WO1997/031655A2 WO1998/035704A1 WO1999/019500A1 WO2001/09785A2, WO2001/090198A WO2003/093793A2, WO2004/050016A2 WO2005/081898A2, WO2006/083562A2, WO2006/089668A1, WO2007/150020A1, WO2008/135237A1, WO2010/111198A1, WO2011/057216A1, WO2011/058321A1, WO2012/027494A1, i EP77671B1), gde su neki takvi veznici otporni na cepanje biotinidaze. Dodatni veznici za upotrebu u predmetnom obelodanjivanju mogu da sadrže par kohezin/dokdera da bi se obezbedio ADC koji sadrži kohezion-dokerin (videti PCT objave br. WO2008/097866A2, WO2008/097870A2, WO2008/103947A2 i WO2008/103953A2)

[0454] Dodatni veznici za upotrebu u ovom prikazu mogu sadržati ne-peptidne polimere (primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksietilirane poliole, polivinil alkohol, polisaharide, dekstran, polivinil etil eter, PLA (poli (mlečna kiselina )), PLGA (poli (mlečna kiselina-glikolna kiselina)) i njihove kombinacije, pri čemu je poželjni polimer polietilen glikol) (videti takođe PCT objava br. WO2011/000370). Dodatni veznici su takođe opisani u WO 2004-010957, SAD objava br.

20060074008, SAD objava br.20050238649 SAD objava br.20060024317.

[0455] Za ADC pronalaska koji sadrži maitansinoid, mnoge pozicije na maitansinoidima mogu služiti kao pozicija za hemijski povezivanje vezujućeg ostatka. U jednom aspektu, maitansinoidi sadrže vezujući deo koji sadrži reaktivnu hemijsku grupu su estri C-3 maitansinola i njegovi analogi u kojima vezujući deo sadrži disulfidnu vezu, a hemijska reaktivna grupa sadrži N-sukcinimidil ili N-sulfosukcinimidil estar. Na primer, pozicija C-3 koja ima hidroksilnu grupu, položaj C-14 modifikovan sa hidroksimetilom, pozicija C-15 modifikovana sa hidroksi i pozicija C-20 koja ima hidroksi grupu su korisna. Vezni deo najpoželjnije je povezan sa položajem C-3 maitansinola.

III. Upotreba anti-PRLR antitela

[0456] S obzirom na njihovu sposobnost vezivanja za humani PRLR, anti-human PRLR antitela ili njihovi delovi obelodanjivanja mogu se koristiti za otkrivanje humanog PRLR (npr. U biološkom uzorku, kao što je serum ili plazma), koristeći konvencionalne imunotestove, kao što su enzimski vezani imunosorbentni testovi (ELISA), radio-imuni testovi (RIA) ili imunohistohemijska tkiva. Obelodanjivanje daje metod za otkrivanje humanog PRLR u biološkom uzorku koji obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelom ili antitelskim delom obelodanjivanja i otkrivanje ili antitela (ili dela antitela) vezanih za humanu PRLR ili neograničeno antitelo (ili deo antitela ), kako bi se na taj način otkrio humani PRLR u biološkom uzorku. Antitelo je direktno ili indirektno označeno sa detektabilnom supstancom za olakšavanje detekcije vezanih ili neograničenih antitela. Pogodne detektne supstance uključuju različite enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju hrenu peroksidazu, alkalnu fosfatazu, b-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri odgovarajućih kompleksa proteinske grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluoroscentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocianat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I,<177>Lu,<166>Ho, ili 153Sm.

[0457] Alternativno za obeležavanje antitela, humani PRLR se može analizirati u biološkim tečnostima pomoću imuno-testa koristeći rhPRLR standarde označene sa detektabilnom supstancom i neoznačenim anti-humanim PRLR antitelom. U ovom testu kombinovani su biološki uzorak, označeni rhPRLR standardi i anti-human PRLR antitelo i utvrđena je količina označenog rhPRLR standarda vezanog za neoznačeno antitelo. Količina humanog PRLR u biološkom uzorku je obratno proporcionalna količini označenog rhPRLR standarda vezanog za anti-PRLR antitelo. Slično tome, humani PRLR se takođe može analizirati u biološkim tečnostima pomoću imuno-testa koristeći rhPRLR standarde označene sa detektabilnom supstancom i neoznačenim anti-humanim PRLR antitelom.

[0458] Antitela i delovi antitela prema pronalasku su poželjno sposobni da neutrališu humanu PRLR aktivnost kako in vitro tako i in vivo. Prema tome, takva antitela i dela antitela prema pronalasku mogu se koristiti za inhibiranje hPRLR aktivnosti, npr., u ćelijskoj kulturi koja sadrži hPRLR, kod ljudi ili drugih subjekata sisara koji imaju PRLR sa kojim antitelo pronalaska unakrsno protiče. U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za inhibiranje hPRLR aktivnosti koji obuhvata kontaktiranje hPRLR sa antitelom ili delom antitela prema pronalasku tako da je aktivnost hPRLR inhibirana. Na primer, u ćelijskoj kulturi koja sadrži ili sumnjiči da sadrži hPRLR, antitelo ili deo antitela prema pronalasku može se dodati u medijum za kulturu da inhibira hPRLR aktivnost u kulturi.

[0459] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metod za smanjenje aktivnosti hPRLR kod subjekta, poželjno od subjekta koji pati od bolesti ili poremećaja u kojem je aktivnost PRLR štetna. Obelodanjivanje daje metode za smanjenje PRLR aktivnosti kod subjekta koji pati od takve bolesti ili poremećaja, a postupak obuhvata davanje subjektu antitela ili dela antitela prema pronalasku tako da je aktivnost PRLR u subjektu smanjena. Poželjno, PRLR je humani PRLR, a subjekt je humani subjekt. Alternativno, subjekt m Još dalje subjekt može biti sisar u koji je uveden PRLR (npr., primenom PRLR ili izražavanjem PRLR transgena). Antitelo pronalaska može se davati humanom subjektu u terapeutske svrhe. Štaviše, antitelo pronalaska može se davati ne-humanim sisarima koji izražavaju PRLR sa kojim je antitelo sposobno da se vezuje za veterinarske svrhe ili kao životinjski model ljudskog oboljenja. U vezi sa drugim, takvi modeli na životinjama mogu biti korisni za procenu terapeutske efikasnosti antitela iz ovog pronalaska U vezi sa drugim, takvi modeli na životinjama mogu biti korisni za procenu terapeutske efikasnosti antitela iz ovog pronalaska (npr. testiranje doziranja i vremenskih tokova primene).

[0460] Kako se ovde koristi, pojam „poremećaj u kome je aktivnost PRLR štetna” ima nameru da obuhvati bolesti i druge poremećaje u kojima je pokazano da je prisustvo PRLR-a kod subjekta koji boluje od poremećaja ili se sumnja da je odgovoran za patofiziologiju poremećaja ili faktor koji doprinosi pogoršavanju poremećaja. Shodno tome, poremećaj u kome je aktivnost PRLR štetna je poremećaj u kome se očekuje smanjenje aktivnosti PRLR-a da olakšava simptome i/ili progresiju poremećaja. Takvi poremećaji mogu se dokazati, na primer, povećanjem koncentracije PRLR u biološkoj tečnosti subjekta koji pati od poremećaja (npr. Povećanje koncentracije PRLR u serumu, plazmi, sinovijalnoj tečnosti itd. predmet), koji se može detektovati, na primer, koristeći anti-PRLR antitelo kako je gore opisano. Neograničavajući primeri poremećaja koji se mogu tretirati antitelima otkrivanja, na primer, Ab1 Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, chAb5, Ab6, chAb6, Ab7, chAb7, Ab8, chAb8, Ab9, chAb9, Ab10, chAb10, Ab11, chAb11, Ab13, chAb13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52, Ab53, Ab54 ili Ab55, njihove varijante ili fragmenti koji se vezuju za antigen, uključuju one poremećaje opisane u odeljku ispod koji se odnose na farmaceutske sastave antitela iz ovog pronalaska. Na primer, pogodni poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, razne vrste kancera, uključujući melanom, limfom, karcinom jajnika, karcinom gastrointestinalnog karcinoma, rak debelog creva, kancer pluća, rak pankreasa, endometrijum raka i raka prostate. U određenim aspektima, kancer je rak dojke, bubrežni karcinom, kancer prostate, kancer jajnika, karcinom endometrijuma ili kancer pluća. U konkretnoj varijanti, kancer je kancer dojke. U konkretnom aspektu, kancer je kancer prostate.

[0461] U drugom aspektu, sadašnje obelodanjivanje odnosi se na tretman „poremećaja koji je povezan sa nedovoljnom ekspresijom ili smanjenom aktivnošću PRLR-a“. Kao što je ovde korišćeno, termin „poremećaj koji je povezan sa nedovoljnom ekspresijom ili smanjenom aktivnošću PRLR” ima za cilj uključivanje bolesti i drugih poremećaja u kojima je pokazano da je podrazumevanje ili smanjena aktivnost PRLR ili se sumnja da je odgovoran za patofiziologiju poremećaj ili faktor koji doprinosi pogoršanju poremećaja. Shodno tome, očekuje se povećanje aktivnosti PRLR aktivnosti da ublaži simptome i/ili progresiju ovih poremećaja. Takvi poremećaji mogu se dokazati, na primer, smanjenjem koncentracije PRLR u biološkoj tečnosti subjekta koji pati od poremećaja (npr., smanjenje koncentracije PRLR u serumu, plazmi, sinovijalnoj tečnosti itd. predmet), koji se može detektovati, na primer, koristeći anti-PRLR antitelo kako je gore opisano. Neograničavajući primeri poremećaja koji mogu biti tretirani antitelima iz pronalaska, na primer, njihove varijante Ab12, chAb12 ili njihovi fragmenti vezani za antigen, uključuju poboljšanje razvoja sisara ili povećanje laktacije.

IV. Farmaceutski sastavi

[0462] Pronalazak takođe sadrži farmaceutske sastave koje sadrže antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen, prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske sastave koje sadrže antitela iz ovog pronalaska su za upotrebu u, ali ne ograničavajući se na, dijagnostikovanje, otkrivanje ili nadgledanje poremećaja, u sprečavanju, tretiranju, upravljanju ili poboljšanju poremećaja ili jednog ili više simptoma, i/ili istraživanje. U specifičnoj realizaciji, sastav sadrži jedno ili više antitela iz ovog pronalaska. U drugoj realizaciji, farmaceutska kompozicija sadrži jedno ili više antitela iz ovog pronalaska i jedno ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava, osim antitela iz pronalaska za tretiranje poremećaja u kojem je aktivnost PRLR štetna. Poželjno, profilaktički ili terapeutski agensi za koje je poznato da su korisni za ili su bili korišćeni u prevenciji, tretiranju, upravljanju ili poboljšanju poremećaja ili jednog ili više simptoma. U skladu sa ovim otelotvorenjima, sastav može dalje sadržati nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0463] Antitela i dela antitela prema pronalasku mogu se inkorporirati u farmaceutske sastave pogodne za davanje subjektu. Tipično, farmaceutski sastav sadrži antitelo ili deo antitela prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač” obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, prevlake, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i apsorpcione sredstva za odlaganje i slično koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača obuhvataju jednu ili više vode, fiziološkog rastvora fiziološkog rastvora fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora fiziološkog rastvora, fosfatnog pufera, dekstroze, glicerola, etanola i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima biće poželjnije uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciji. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoćnih supstanci kao što su vlažni ili emulgatori, konzervansi ili puferi, koji povećavaju rok upotrebe ili efikasnost antitela ili dela antitela.

[0464] Razni sistemi za davanje su poznati i mogu se koristiti za administriranje jednog ili više antitela iz pronalaska ili kombinacije jednog ili više antitela iz ovog pronalaska i profilaktičkog agensa ili terapeutskog sredstva koji je koristan za sprečavanje, upravljanje, tretiranje ili poboljšanje poremećaja ili jedan ili više simptoma, npr., enkapsulacija u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da izražavaju antitelo ili fragment antitela, endocitozu posredovanu receptorom (videti npr., Wu i Wu, J. Biol. Chem.262:4429-4432 (1987)), izgradnja nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Metode davanja profilaktičnog ili terapeutskog sredstva prema pronalasku obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, parenteralnu primenu (npr. Intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno i subkutano), epiduralnu primenu, intratumoralnu administraciju i primjenu mukozama (npr., intranazalno i oralni rute). Pored toga, može se koristiti plućna administracija, npr., pomoću inhalatora ili nebulizatora, i formulacije sa sredstvom za aerosolizaciju. Videti, npr., patente SAD br.6,019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540 i 4,880,078; i PCT objave br. VO 92/19244, VO 97/32572, VO 97/44013, VO 98/31346 i VO 99/66903. U jednom aspektu, antitelo pronalaska, kombinovana terapija ili kompozicija prema pronalasku se primenjuje pomoću tehnologije Alkermes AIR® plućne medicine (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). U određenom aspektu, profilaktički ili terapeutski agensi pronalaska se primenjuju intramuskularno, intravenozno, intratumoralno, oralno, intranazalno, plućno ili subkutano. Profilaktički ili terapeutski agensi se mogu primenjivati bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolusom, pomoću apsorpcije kroz epitelne ili mukokutane obloge (npr. oralna mukoza, rektalna i creva, i sl.) i mogu se primenjivati zajedno sa drugim biološkim aktivni agensi. Administracija može biti sistemska ili lokalna.

[0465] U određenom aspektu, može biti poželjno da se lokalno administriraju profilaktička ili terapijska sredstva iz ovog pronalaska na područje u kojem je potrebno tretman; ovo se može postići, na primer, a ne ograničenjem, lokalna infuzija, injektiranjem ili pomoću implantata, pomenuti implantat je poroznog ili neporoznog materijala, uključujući membrane i matrice, kao što su sijalične membrane, polimeri, fibrozne matrice (npr., Tissuel®) ili matrice kolagena. U jednom aspektu, efikasna količina jednog ili više antitela antagonista pronalaska se administrira lokalno na pogodno područje subjektu koji sprečava, leči, upravlja i/ili poboljšava poremećaj ili njegov simptom. U drugom aspektu, efikasna količina jednog ili više antitela pronalaska se administrira lokalno na pogođeno područje u kombinaciji sa efektivnom količinom jedne ili više terapija (npr., jedan ili više profilaktičkih ili terapijskih sredstava), osim antitela pronalazak subjekta za sprečavanje, tretiranje, upravljanje i/ili poboljšanje poremećaja ili jednog ili više simptoma.

[0466] U drugom aspektu, profilaktički ili terapeutski agens otkrivanja može se isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem ili sistemom sa produženim oslobađanjem. U jednom aspektu, pumpa se može koristiti za postizanje kontrolisanog ili kontinuiranog oslobađanja (vidi Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:20; Buchwald i dr., 1980, Surgery 88:507; Saudek i dr., 1989, N. Engl. J. Med.321:574). U drugom aspektu, polimerni materijali se mogu koristiti za postizanje kontrolisanog ili kontinuiranog oslobađanja terapija pronalaska (videti npr. Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen i Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger i Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.23:61; videti also Levy i dr., 1985, Science 228:190; During i dr., 1989, Ann. Neurol.25:351; Howard i dr., 1989, J. Neurosurg.7 1:105); patenti SAD br.5,679,377; patenti SAD br.5, 916,597; patenti SAD br.5,912,015; patenti SAD br.

5,989,463; patenti SAD br.5,128,326; PCT objava br. WO 99/15154; i PCT objava br. WO 99/20253. Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa zadržanim oslobađanjem obuhvataju, ali bez ograničenja, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli (akrilna kiselina), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakril kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli (N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilenglikol), polilaktidi (PLA), poli(laktid-ko-glikolid) (PLGA) poliortoester. U poželjnom aspektu, polimer koji se koristi u formulaciji sa produženim oslobađanjem je inertan, bez lažljivih nečistoća, stabilan pri skladištenju, sterilan i biorazgradljiv. U još jednom aspektu, kontrolisan sistem ili sistem sa produženim oslobađanjem može biti smešten u blizini profilaktičke ili terapeutske mete, tako da zahteva samo jedan deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138 (1984)).

[0467] Sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem govore u pregledu Langer (1990, Science 249:1527-1533). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku u stanju tehnike može se koristiti za proizvodnju formulacija sa trajnim oslobađanjem koja sadrži jedan ili više terapeutskih agenasa otkrivanja. Videti, npr., patent SAD br.4,526, 938, PCT objava WO 91/05548, PCT objava WO 96/20698, Ning i dr., 1996, „Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song i dr., 1995, „Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek i dr., 1997, „Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24:853-854, i Lam i dr., 1997, „Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759- 760.

[0468] U specifičnom aspektu, gde je sastav obelodanjivanja nukleinska kiselina koja kodira profilaktičko ili terapeutsko sredstvo, nukleinska kiselina se može davati in vivo radi promovisanja ekspresije njenog kodiranog profilaktičkog ili terapeutskog sredstva, konstrukcijom kao deo odgovarajućeg nukleusa kiselog ekspresionog vektora i administrira ga tako da postaje intracelularno, npr. pomoću retrovirusnog vektora (videti patent SAD br.

4,980,286) ili direktnim injekcijom ili pomoću bombardovanja mikropartikla (npr. pištolj za gen, Biolistic, Dupont), ili prevlake sa lipidima ili receptorima ćelijske površine ili sredstvima za transfekciju, ili njihovim davanjem u vezu sa peptidom poput homeoboka, za koji je poznato da ulazi u nukleus (vidi, npr., Joliot i dr., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativno, nukleinska kiselina može biti uvedena intracelularno i ugrađena u DNK ćelije domaćina za ekspresiju homolognom rekombinacijom.

[0469] Farmaceutski sastav prema pronalasku je formulisan tako da bude kompatibilan sa svojim planiranim načinom primene. Primeri načina administriranja uključuju, ali nisu ograničeni na, parenteralno, npr., intravenozno, intradermalno, subkutano, oralno, intranazalno (npr. inhalacija), transdermalno (npr., topično), transmukozna i rektalna administracija. U određenom aspektu, sastav je formulisan u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutski preparat prilagođen za intravenoznu, subkutanu, intramuskularnu, oralnu, intranazalnu ili lokalnu primenu na ljudska bića. Tipično, kompozicije za intravenoznu primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je to neophodno, kompozicija može takođe uključiti sredstvo za rastvaranje i lokalnu anestetiku kao što je lignocamne, kako bi se olakšao bol na mestu injekcije.

[0470] Ako se kompozicije prema pronalasku primenjuju topikalno, kompozicije se mogu formulisati u obliku masti, kreme, transdermalnog krzna, losiona, gela, šampona, spreja, aerosola, rastvora, emulzije ili druge forme poznate stručnjak u struci. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Za topikalne dozne oblike koji se ne mogu prskati, viskozni do polučvrsti ili čvrsti oblici koji sadrže nosač ili jedan ili više pomoćnih supstanci kompatibilnih sa topikalnom aplikacijom i koji imaju dinamički viskozitet poželjno veći od vode obično se koriste. Odgovarajuće formulacije obuhvataju, bez ograničenja, rastvore, suspenzije, emulzije, kreme, masti, praškove, laminate, salve i slično, koji su, po želji, sterilisani ili mešani sa pomoćnim sredstvima (npr., konzervansima, stabilizatorima, , ili soli) za uticaj na različita svojstva, kao što je, na primer, osmotski pritisak. Drugi pogodni lokalni dozni oblici uključuju preparate za raspršivanje aerosola gde je aktivni sastojak, poželjno u kombinaciji sa čvrstim ili tečnim inertnim nosačem, upakovana u smešu sa isparljivim pod pritiskom (npr. gasovitom propelantu, kao što je freon) ili u bočici za stiskanje. Ovlaživači ili sredstva za smanjenje gubitka vlage takođe mogu biti dodati farmaceutskim sastavima i doznim oblicima ako se želi. Primeri takvih dodatnih sastojaka su dobro poznati u struci.

[0471] Ako metoda obelodanjenja sadrži intranazalno davanje sastava, sastav se može formulisati u obliku aerosola, spreju, mistu ili u obliku kapljica. Konkretno, profilaktička ili terapeutska sredstva za upotrebu prema ovom pronalasku mogu se pogodno dostaviti u obliku prezentacije aerosolnog spreja sa pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz upotrebu odgovarajućeg pogonskog sredstva (npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljenika dioksid ili drugi pogodni gas). U slučaju aerosola pod pritiskom, dozirna jedinica se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporučivanje merene količine. Kapsule i kertridži (sastoji se od, na primer, želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru, mogu se formulisati koji sadrže praškastu mešavinu jedinjenja i pogodnu bazu praha kao što je laktoza ili skrob.

[0472] Ako metoda obelodanjivanja obuhvata oralno davanje, sastavi se mogu formulisati oralno u obliku tableta, kapsula, keseta, gelnih kapica, rastvora, suspenzija i slično. Tablete ili kapsule mogu se pripremiti konvencionalnim sredstvima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su sredstva za vezivanje (npr., preželatinizovani skrob kukuruza, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); punila (npr., laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogenfosfat); maziva (npr., magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); dezintegranti (npr., krompirni skrob ili natrijum skrobni glikolat); ili sredstva za vlaženje (npr., natrijum lauril sulfat). Tablete mogu biti obložene metodama dobro poznatim u stanju tehnike. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u obliku, ali ne ograničavajući se na njih, rastvore, sirupe ili suspenzije, ili se mogu predstaviti kao suhi proizvod za sastavljanje sa vodom ili drugim odgovarajućim vozilima pre upotrebe. Takvi tečni preparati mogu biti pripremljeni konvencionalnim sredstvima sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su sredstva za suspendovanje (npr., sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); sredstva za emulziju (npr., lecitin ili akacija); ne-vodena vozila (npr., bademovo ulje, maseni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervanse (npr., metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe sadržati puferske soli, arome, boje i sredstva za zaslađivanje. Preparati za oralnu primenu mogu se pogodno formulisati za sporo oslobađanje, kontrolisano oslobađanje ili produženo oslobađanje profilaktičkog ili terapeutskog sredstva.

[0473] Postupak otkrivanja može sadržati pulmonalno davanje, npr., pomoću inhalatora ili nebulizatora, sastava formulisanog sredstvom za aerosolizaciju. Vidi, npr., patente SAD br.

6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 i 4,880,078; i PCT objave br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903. U specifičnom aspektu, antitelo obelodanjivanja, kombinovane terapije i/ili sastava obelodanjivanja se primenjuje pomoću tehnologije Alkermes AIR® plućne medicine (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass).

[0474] Postupak obelodanjivanja može sadržati primenu kompozicije formulisanog za parenteralnu primenu injekcijom (npr., pomoću ubrizgavanja bolusa ili kontinualne infuzije). Formulacije za injekciju mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze (npr., u ampulama ili u višeodržnim kontejnerima) sa dodatim konzervansom. Sastavi mogu imati oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljnim ili vodenim vozilima i mogu sadržati formulatorna sredstva kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u prahu za sastavljanje sa odgovarajućim nosačem (npr., sterilnom vodom bez pirogena) pre upotrebe.

[0475] Metode obelodanjivanja mogu dodatno da sadrže administraciju sastava formulisanih kao depotne preparate. Takve dugotrajne formulacije mogu se davati implantacijom (npr., subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, sastavi mogu biti formulisane pomoću odgovarajućih polimernih ili hidrofobnih materijala (npr., kao emulzije u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkih smola, ili kao oskudno rastvorljivi derivati (npr., kao umereno rastvorljiva so).

[0476] Metode obelodanjivanja obuhvataju primenu sastava formulisanih kao neutralne ili solne forme. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju one formirane sa anjonima kao što su one izvedene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline itd. i one koje se formiraju sa katjonima kao što su oni koji nastaju iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, hidroksida gvožđa, izopropilamina, trietilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain itd.

[0477] Generalno, sastojci sastava se isporučuju ili pojedinačno ili pomešani zajedno u jediničnoj doznoj formi, na primer, kao suhi liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili vrećica, što ukazuje na količinu aktivnog sredstva. Kada je način primene infuzija, sastav se može izdati infuzionom bocom koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološku rastvor farmaceutske vode. Kada je način primene injekcijom, mogu se obezbediti ampule sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, tako da se sastojci mogu mešati pre primene.

[0478] Posebno, obelodanjivanje takođe predviđa da je jedno ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava ili farmaceutskih kompozicija prema pronalasku pakovano u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili kapsula koja ukazuje na količinu sredstva. U jednom izvođenju jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava ili farmaceutskih sastava prema pronalasku se isporučuje kao suhi sterilizovani liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru i može se rekonstituisati (npr., sa vodom ili fiziološkim rastvorom) do odgovarajuću koncentraciju za administraciju subjektu. Poželjno, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava ili farmaceutskih sastava prema pronalasku se isporučuju kao suhi sterilni liofilizovani prah u hermetički zatvorenom kontejneru u jediničnoj dozi od najmanje 5 mg, poželjnije najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 75 mg ili najmanje 100 mg. Liofilizirani profilaktički ili terapeutski agensi ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku treba da se čuvaju između 2 °C i 8 °C u originalnom kontejneru i profilaktički ili terapeutski agensi ili farmaceutski preparati pronalaska treba davati u roku od 1 nedelje, poželjno u roku od 5 dana, u roku od 72 sata, u roku od 48 sati, u roku od 24 časa, u roku od 12 sati, u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku od 3 sata ili u roku od 1 sata nakon rekonstitucije. U alternativnom aspektu, jedan ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava ili farmaceutskih sastava prema pronalasku se isporučuju u tečnom obliku u hermetički zatvorenom posudu koja ukazuje na količinu i koncentraciju agensa. najmanje 0,25 mg/ml, poželjnije najmanje 0,5 mg/ml, najmanje 1 mg/ml, najmanje 2,5 mg/ml, najmanje 5 mg/ml, najmanje 8 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/kg, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml ili najmanje 100 mg/ml. Tečni oblik treba čuvati na temperaturi od 2 °C do 8 °C u originalnom kontejneru.

[0479] Antitela i delovi antitela prema pronalasku mogu se inkorporirati u farmaceutski sastav pogodan za parenteralnu primenu. Poželjno, antitelo ili delovi antitela biće pripremljeni kao injekcioni rastvor koji sadrži 0.1-250 mg/ml antitela. Injekcioni rastvor može biti sastavljen od tečnog ili liofilizovanog doznog oblika u kutiji sa kremenom ili amberom, ampule ili napunjenim špricem. Pufer može biti L-histidin (1-50 mM), optimalno 5-10 mM, na pH 5.0 do 7.0 (optimalno pH 6.0). Ostali pogodni puferi uključuju, ali nisu ograničeni na, natrijum sukcinat, natrijum-citrat, natrijum-fosfat ili kalijum-fosfat. Natrijum hlorid se može koristiti za modifikaciju toksičnosti rastvora u koncentraciji od 0-300 mM (optimalno 150 mM za oblik tečnog doziranja). Krioprotektanti mogu biti uključeni u liofilizovanu dozu, prvenstveno 0-10% saharoze (optimalno 0.5-1.0%). Ostali pogodni krioprotektanti uključuju trehalozu i laktozu. Sredstva za punjenje mogu biti uključena za liofilizovanu dozu, uglavnom 1-10% manitola (optimalno 2-4%). Stabilizatori se mogu koristiti iu tečnim i liofilizovanim doznim oblicima, uglavnom od 1-50 mM L-metionina (optimalno 5-10 mM). Ostali pogodni agensi obuhvataju glicin, arginin, mogu se uključiti kao 0-0,.5% polisorbat-80 (optimalno 0.005-0.01%). Dodatni surfaktanti uključuju, ali nisu ograničeni na polisorbat 20 i površinske aktivne supstance BRIJ. Farmaceutski sastav koji sadrži antitela i delove antitela prema pronalasku pripremljenim kao injekcioni rastvor za parenteralnu primenu, mogu dalje sadržavati sredstvo korisno kao adjuvans, kao što su oni koji se koriste za povećanje apsorpcije ili disperziju terapeutskog proteina (npr., antitela). Posebno koristan adjuvans je hijaluronidaza, kao što je Hilenek® (rekombinantna humana hijaluronidaza). Dodavanje hijaluronidaze u injekcioni rastvor poboljšava biološku dostupnost ljudi nakon parenteralne primene, naročito subkutane primene. Takođe dozvoljava veće zapremine mesta za injekcije (tj. veće od 1 ml) sa manjim bolešću i neugodnošću, kao i minimalnom učestalošću reakcija na mestu infekcije. (videti WO2004078140, US200610496

[0480] Sastavi ovog pronalaska mogu biti u različitim oblicima. Ovi obuhvataju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste oblike doziranja, kao što su tečna rastvori (npr. injektirajuće i infuzibilne rastvore), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Poželjni oblik zavisi od nameravanog načina primene i terapijske primene. Tipični poželjni sastavi su u obliku injektibilnih ili infuzibilnih rastvora, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi sa drugim antitelima. Poželjni način primene je parenteralan (npr. intravenozni, subkutani, intraperitonealni, intramuskularni). U poželjnom aspektu, antitelo se daje intravenskom infuzijom ili injekcijom. U još jednom poželjnom aspektu, antitelo se daje intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.

[0481] Terapeutski sastavi obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Sastav se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporiranjem aktivnog jedinjenja (tj. antitela ili delovi antitela) u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednom ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, prema potrebi, praćenom filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilno vozilo koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnog, liofilizovanog praha za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjne metode pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje raspršivanjem, što daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz ranije sterilnog filtriranog rastvora. Odgovarajuća tečnost rastvora može se održati, na primer, korišćenjem prevlake kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanti. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se dovesti tako što u sastavu uključuje agens koji odlaže apsorpciju, na primer soli monostearata i želatin.

[0482] Antitela i dela antitela prema predmetnom pronalasku mogu se primenjivati različitim metodama poznatim u stanju tehnike, iako je za mnoge terapeutske primene preferirani put/način primene subkutana injekcija, intravenozna injekcija ili infuzija. Kao što će ceniti stručnjak, put i/ili način primene će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. U određenim aspektima, aktivno jedinjenje može biti pripremljeno sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzo otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne zakrpe i sisteme za mikrokapsulirane isporuke. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoester i polilaktička kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili općenito poznati stručnjacima. Videti, na primer, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0483] U određenim aspektima, antitelo ili deo antitela prema pronalasku može se oralno primenjivati, na primer, sa inertnim razblaživačem ili pomoćnim nosačem za ishranu.

Jedinjenje (i drugi sastojci, po želji) mogu se takođe zatvoriti u tvrdoj ili mekoj školjki želatinskoj kapsuli, komprimovane u tablete ili ugrađene direktno u ishranu subjekta. Za oralnu terapijsku primenu, jedinjenja mogu biti inkorporirana pomoćnim ekscipijentima i upotrebljavaju se u obliku tableta za prihvatljivost, bukalnih tableta, šupljina, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafira i slično. Za administriranje jedinjenja iz ovog pronalaska pomoću drugog od parenteralne primene, može biti neophodno da se premazuje jedinjenjem ili ko-administriraju sa jedinjenjem sa materijalom koji sprečava njegovu inaktivaciju.

[0484] U drugim aspektima, antitelo ili deo antitela obelodanjivanja mogu biti konjugovani sa vrstama na bazi polimera, tako da pomenute vrste na bazi polimera mogu dati dovoljnu veličinu na pomenuto antitelo ili deo antitela obelodanjivanja tako da navedeno antitelo ili deo antitela otkrivanje koristi od povećane propusnosti i retenzionog efekta (EPR efekat) (videti takođe PCT objavu br. WO2006/042146A2 i objave SAD 2004/0028687A1, 2009/0285757A1 i 2011/0217363A1 i patent SAD br.7,695,719.

[0485] Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporirati u kompozicije. U određenim aspektima, antitelo ili deo antitela prema pronalasku se formuliše sa ili se zajedno sa jednom ili više dodatnih terapeutskih sredstava koji su korisni za tretiranje poremećaja u kojima je PRLR aktivnost štetna. Na primer, anti-hPRLR antitelo ili deo antitela prema pronalasku može se formulisati i/ili zajedno sa jednom ili više dodatnih antitela koja vezuju druge mete (npr., antitela koja vezuju citokine ili koja se vezuju molekule ćelijske površine). Štaviše, jedno ili više antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa dva ili više prethodno navedenih terapijskih sredstava. Ovakva kombinovana terapija može povoljno koristiti manje doze primenjenih terapijskih sredstava, čime izbegava moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama.

[0486] U određenim aspektima, antitelo sa PRLR ili njegovim fragmentom je vezano za vozilo za produženje poluvreme koje je poznato u struci. Takva vozila uključuju, ali nisu ograničena na, domen Fc, polietilen glikol i dekstran. Takva vozila su opisana, npr., u patentu SAD 6,660,843 i objavljena PCT objava br. WO 99/25044.

[0487] U specifičnom aspektu sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju antitelo pronalaska ili drugo profilaktičko ili terapeutsko sredstvo otkrivanja daju se za tretiranje, sprečavanje, upravljanje ili poboljšanje poremećaja ili jednog ili više simptoma istih putem genske terapije. Genska terapija se odnosi na terapiju koju vrši administracija na subjekt izražene ili izražene nukleinske kiseline. U ovom aspektu obelodanjivanja, nukleinske kiseline proizvode svoje kodirano antitelo ili profilaktičko ili terapeutsko sredstvo otkrivanja koje posreduje profilaktičkim ili terapijskim efektima.

[0488] Bilo koji od načina za genu terapiju dostupan u stanju tehnike može se koristiti prema predmetnom pronalasku. Za opšte preglede metoda genske terapije pogledajte Goldspiel i dr., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu i Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); i Morgan i Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Metode poznate u tehnici rekombinantne DNK tehnologije koje se mogu koristiti su opisane u Ausubel i dr. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); i Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detaljan opis različitih metoda genetske terapije nalazi se u US20050042664 A1.

[0489] U drugom aspektu, ova aplikacija sadrži postupak tretiranja (npr., tretiranje, suzbijanje, poboljšanje, odlaganje ili sprečavanje pojave ili sprečavanje ponavljanja ili relapsa) ili sprečavanje poremećaja povezanog sa PRLR-om, u subjektu. Ova metoda obuhvata: davanje subjektu PRLR vezivnog sredstva (posebno antagonista), npr., anti-PRLR antitela ili njegovog fragmenta kao što je ovde opisano, u količini koja je dovoljna da leči ili spreči poremećaj povezan sa PRLR-om. PRLR antagonist, npr. Anti-PRLR antitelo ili njegov fragment, može se davati subjektu, samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim modalitetima kako je ovde opisano.

[0490] U drugom aspektu, ova primena obezbeđuje metod za detekciju prisustva PRLR u uzorku in vitro (npr., biološki uzorak, kao što je serum, plazma, tkivo, biopsija). Metoda predmeta se može koristiti za dijagnozu poremećaja, npr., kancera. Metoda obuhvata: (i) kontaktiranje uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-PRLR antitelom ili njegovim fragmentom kao što je ovde opisano; i (ii) detektovanje formiranja kompleksa između anti-PRLR antitela ili njegovog fragmenta i uzorka ili kontrolnog uzorka, pri čemu je statistički značajna promena u formiranju kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak indikativna za prisustvo PRLR u uzorku.

[0491] U još jednom aspektu, ova aplikacija obezbeđuje metod za detekciju prisustva PRLR in vivo (npr., in vivo slikanje u subjektu). Postupak metoda se može koristiti za dijagnostifikovanje poremećaja, npr. Poremećaja povezanog sa PRLR-om. Postupak uključuje: (i) administriranje anti-PRLR antitela ili njegovog fragmenta kao što je ovde opisano subjektu ili subjektu kontrole pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela ili fragmenta na PRLR; i (ii) detektovanje formiranja kompleksa između antitela ili fragmenta i PRLR, pri čemu statistički značajna promena u formiranju kompleksa u subjektu u odnosu na kontrolni subjekt ukazuje na prisutnost PRLR-a.

[0492] Antitela pronalaska, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen mogu se koristiti sami ili u kombinaciji za tretiranje takvih bolesti. Treba se razumeti da antitela iz ovog pronalaska ili njegov deo koji se vezuju za antigen mogu biti korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim sredstvom, npr., terapeutskim agensom, koje dodatno sredstvo odabire veštački za njegovu namenu. Na primer, dodatni agens može biti terapeutsko sredstvo koje je poznato kao korisno za tretiranje bolesti ili stanja koje tretiraju antitelo iz ovog pronalaska. Dodatni agens takođe može biti sredstvo koje daje korisni atribut terapeutskom sastavu, npr., agens koji utiče na viskoznost sastava.

[0493] Treba dalje shvatiti da su kombinacije koje treba uključiti u ovo otkrivanje one kombinacije korisne za njihovu nameru. Agensi navedeni u nastavku ilustruju svrhe i nisu namenjeni da budu ograničeni. Kombinacije, koje su deo ovog obelodanjivanja, mogu biti antitela sadašnjeg obelodanjivanja i najmanje jedno dodatno sredstvo odabrano iz spiska ispod. Kombinacija može uključivati i više od jednog dodatnog sredstva, npr., dva ili tri dodatna sredstva ako je kombinacija takva da formirani sastav može obaviti svoju nameravanu funkciju.

[0494] Kombinovana terapija može uključivati jedan ili više PRLR antagonista, na pr. Anti-PRLR antitela ili njihove fragmente, formulisane sa ili zajedno sa jednom ili više dodatnih terapeutskih sredstava, npr. jedan ili više inhibitora faktora citokina i faktora rasta, imunosupresivi, antiinflamatorni agensi (npr. sistemski anti-inflamatorni agensi), antifibrotički agensi, inhibitori metabolizma, inhibitori enzima i/ili citotoksični ili citostatički agensi, mitotski inhibitori, antitumorski antibiotici, imunomodulatori, vektori za gensku terapiju, alkilovanje agensi, antiangiogeni agensi, antimetaboliti, agensi koji sadrže bor, sredstva za zaštitu od hemograma, hormoni, antihormonska sredstva, kortikosteroidi, fotoaktivni terapeutski agensi, oligonukleotidi, agensi radionuklida, inhibitori topoizomeraze, inhibitori tirozin kinaze ili radiosenzibilizatori, kao što je više opisano ovde.

[0495] U određenom aspektu, anti-PRLR vezujući proteini koji su ovde opisani, na primer, anti-PRLR antitela, koriste se u kombinaciji sa sredstvom protiv kancera ili antineoplastičnim agensom. Termini „anti-kancerogeni agens” i „anti-neoplastični agens” odnose se na lekove koji se koriste za tretiranje maligniteta, kao što je kancerozni rast. Terapija lekovima se može koristiti samo, ili u kombinaciji sa drugim tretmanima kao što je operacija ili terapija zračenjem. Nekoliko klasa lekova se može koristiti u tretiranju karcinoma, zavisno od prirode uključenog organa. Na primer, rak dojke uobičajeno stimulišu estrogeni i mogu se lečiti lekovima koji neaktiviraju polne hormone. Slično, kancer prostate se može lečiti lekovima koji inaktiviraju androgene, muški seksualni hormon. Sredstva protiv kancera koja se mogu upotrebiti zajedno sa anti-PRLR antitelima iz ovog pronalaska uključuju, između ostalog, sledeća sredstva:

[0496] Pored gore navedenih sredstava protiv raka, anti-PRLR antitela opisana ovde mogu biti primenjena u kombinaciji sa agensima opisanim u odeljku II. Nadalje, pomenuta antikancerogena sredstva takođe mogu biti korišćeni u ADC-ovi pronalaska.

[0497] U posebnim aspektima, anti-PRLR antitela mogu se primenjivati sami ili sa drugim anti-kancer agensom koji deluje zajedno ili sinergistički sa antitelom za tretiranje bolesti povezanih sa PRLR aktivnošću. Takvi anti-kancerogeni agensi uključuju, na primer, agense dobro poznate u struci (npr., citotoksini, hemoterapeutski agensi, mali molekuli i zračenje). Primeri antikancerogenih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, Panorex (Glaxo-Welcome), Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), Mylotarg (Wyeth), Campath (Millennium), Zevalin (IDEC i Schering AG), Bexxar (Corixa/GSK), Erbitux (Imclone/BMS), Avastin (Genentech) i Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche). Ostali anti-kancerogeni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji su objavljeni u patentu SAD 7,598,028 i međunarodnoj publikaciji br. WO2008/100624 jedan ili više sredstava protiv kancera mogu se davati ili istovremeno ili pre ili nakon davanja antitela ili deo koji se vezuje za antigen iz ovog pronalaska.

[0498] Dodatni primeri poželjnih dodatnih terapeutskih sredstava koji se mogu davati istovremeno i/ili formulisani sa jednim ili više PRLR antagonista, npr., anti-PRLR antitela ili njihovi fragmenti, uključuju, ali nisu ograničeni na, jedan ili više: inhalirani steroidi; beta agonisti, npr., beta-agonisti sa kratkim dejstvom ili dugotrajnim dejstvom; antagonisti leukotriena ili leukotrien receptora; kombinovane lekove kao što su ADVAIR; IgE inhibitori, npr., anti-IgE antitela (npr., XOLAIR); inhibitori fosfodiesteraze (npr., PDE4 inhibitori); ksantini; antiholinergični lekovi; sredstva za stabilizaciju mast ćelija kao što je kromolin; IL4 inhibitori; inhibitori IL-5; inhibitori eotaksina/CCR3; antagonisti histamina ili njegovih receptora uključujući H1, H2, H3 i H4 i antagoniste prostaglandina D ili njegovih receptora (DP1 i CRTH2). Takve kombinacije mogu se koristiti za tretiranje astme i drugih respiratornih poremećaja. Dodatni primeri terapeutskih sredstava koji se mogu dati zajedno i/ili formulisati sa jednim ili više anti-PRLR antitela ili njegovih fragmenta uključuju jedan ili više: antagonista TNF-a (npr. rastvorljivi fragment TNF receptora, npr. P55 ili p75 humanog TNF receptora ili njegovih derivata, npr.75 kD TNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein, ENBREL)); TNF-enzimski antagonisti, npr. Inhibitori TNF pretvarajućeg enzima (TACE); antagonisti muskarinskih receptora; TGF-beta antagonisti; interferon gama; perfenidon; hemoterapeutski agensi, npr., metotreksat, leflunomid ili sirolimus (raparnjin) ili njegov analog, npr. CCI-779; COX2 i cPLA2 inhibitori; NSAIDs; imunomodulatori; p38 inhibitora, TPL-2, MK-2 i NFkB inhibitora, između ostalog.

[0499] Druge poželjne kombinacije su supresivni suplementarni anti-inflamatorni lekovi (CSAID); antitela ili antagonista drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15 , IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, interferoni, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF i edothelin-1, kao i receptori ovih citokina i faktora rasta.

Antitela iz ovog pronalaska ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen mogu se kombinovati sa antitelima na molekule na površini ćelija kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA ili njihovi ligandi uključujući CD154 (gp39 ili CD40L).

[0500] Poželjne kombinacije terapijskih agenasa mogu ometati različite tačke u zapaljenoj kaskadi; Poželjni primeri uključuju antagoniste TNF-a kao što su himerna, humanizirana ili humana TNF antitela, adalimumab, (HUMIRA; D2E7; PCT objava br. WO 97/29131), CA2 (RemicadeTM), CDP 571 i rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori, njihovi derivati , (p75TNFR1gG (EnbrelTM) ili p55TNFR1gG (Lenercept), kao i inhibitori TNF konvertujućeg enzima (TACE), slični inhibitori IL-1 (inhibitori interleukin-1-konvertujućeg enzima, IL-1RA itd.) mogu biti efikasni iz istog razloga. Druge poželjne kombinacije uključuju Interleukin 4.

[0501] Farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu uključivati „terapeutski efikasnu količinu” ili „profilaktički efikasnu količinu” antitela ili delova antitela prema pronalasku.

„Terapeutski efikasna količina” odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog terapeutskog rezultata. Terapeutski efikasnu količinu antitela ili dela antitela može da odredi stručnjak u tehnici i može se razlikovati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnost antitela ili antitela deo da bi izazvao željeni odgovor u pojedincu. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj su neki toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadmašeni terapeutski korisnim efektima. „Profilaktički efikasna količina” odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, pošto se profilaksa doza koristi kod osoba pre ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.

[0502] Dozni režimi se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalni željeni odgovor (npr., terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, jedan bolus može biti primenjen, nekoliko podeljenih doza može da se primeni tokom vremena ili doza može biti srazmerno smanjena ili povećana, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulirati parenteralni sastav u obliku jedinjenja doze za lakšu primenu i uniformnost doziranja. Jedinica formulacije doza koja se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za jedinične doze za subjekte sisara koje treba tretirati; svaka jedinica koja sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunato da bi proizvela željeni terapeutski efekat u saradnji sa zahtevanim farmaceutskim nosačem.

Specifikacije za jedinice oblika doziranja prema pronalasku diktiraju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja koja su inherentna u umetnosti mešanja takvo aktivno jedinjenje za tretman osetljivosti kod pojedinaca.

[0503] Primeran, neograničavajući opseg za terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu antitela ili dela antitela prema pronalasku je 0.1-20 mg/kg, još poželjnije 1-10 mg/kg. Treba napomenuti da se vrednosti doziranja mogu razlikovati u zavisnosti od vrste i jačine stanja koje treba ublažiti. Dalje treba shvatiti da za bilo koji određeni predmet, specifični režimi doziranja treba vremenom prilagoditi prema individualnoj potrebi i profesionalnom proceni osobe koja administrira ili nadgleda administraciju sastava, a da su opseg doziranja koji su ovde navedeni primeri samo i nisu namenjene da ograniče obim ili praksu zahtevanog sastava.

PRIMERI

Primer 1: Stvaranje i izolovanje anti humanih PRLR monoklonalnih antitela

1 Humanizacija PRLR antitela

1.1 Odabir humanih germinalnih sekvenci za pravljenje CDR-kalemljenih humanizovanih PRLR antitela

[0504] Primenom metodologije humanizacije, CDR sekvence VH i VL lanaca monoklonalnih antitela Ab5, Ab6, Ab7 i Ab8 su kalemljene na različite humane sekvence primaoca teškog i lakog lanca kao što sledi:

1.1.1 Ab6

[0505] Ab1 se odnosi na humanizovana antitela izvedena iz mišijeg Ab6. Na osnovu usaglašenosti sa VH i VL sekvencama monoklonalnog antitela Ab6 prema predmetnom pronalasku, sledeće poznate humane sekvence su izabrane:

1. 1. IGHV1-69*02 i IGHJ6*01 za pravljenje sekvence primaoca teškog lanca

2. 2. IGKV1-12*01 ili IGKV3-15*01 i IGKJ4*01 za pravljenje sekvence primaoca lakog lanca

[0506] Kalemljenjem odgovarajućih VH i VL CDR za Ab6 u navedene sekvence primaoca, CDR-kalemljene, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence su pripremljene.

1.1.2 Ab5

[0507] Ab2 se odnosi na humanizovana antitela izvedena iz mišijeg Ab5. Na osnovu usaglašavanja sa VH i VL sekvencama monoklonalnog antitela Ab5 prema predmetnom pronalasku, sledeće poznate humane sekvence su izabrane:

1. 1. IGHV1-69*01 i IGHJ4*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca

2. 2. IGKV2-29*02 i IGKJ4*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca [0508] Kalemljenjem odgovarajućih VH i VL CDR za Ab5 u navedene sekvence primaoca, CDR-kalemljene, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence su pripremljene.

1.1.3 Ab8

[0509] Ab3 se odnosi na humanizovana antitela izvedena iz mišijeg Ab8. Na osnovu usaglašavanja sa VH i VL sekvencama monoklonalnog antitela Ab8 prema predmetnom pronalasku sledeće poznate humane sekvence su izabrane:

1. 1. IGHV1-18*01 i IGHJ6*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca

2. 2. IGKV1D-39*01 i IGKJ2*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca

[0510] Kalemljenjem odgovarajućih VH i VL CDR za Ab8 u navedene sekvence primaoca, CDR-kalemljene, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence su pripremljene.

1.1.4 Ab7

[0511] Ab4 se odnosi na humanizovana antitela izvedena iz mišijeg Ab7. Na osnovu usaglašavanja sa VH i VL sekvencama monoklonalnog antitela Ab7 prema predmetnom pronalasku sledeće poznate humane sekvence su izabrane:

1. 1. IGHV1-69*06 i IGHJ4*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca

2. 2. IGKV2-29*02 i IGKJ4*01 za pravljenje sekvenci primaoca teškog lanca [0512] Kalemljenjem odgovarajućih VH i VL CDR za Ab7 u navedene sekvence primaoca, CDR-kalemljene, humanizovane i modifikovane VH i VL sekvence su pripremljene.

1.2 Uvođenje potencijalnih reverznih mutacija okvira u CDR-kalemljenim antitelima [0513] Za stvaranje humanizovanih antitela sa potencijalnim reverznim mutacijama okvira, mutacije su identifikovane i uvedene u sekvence CDR-kalemljenog antitela sa de novo sintezom varijabilnog domena, ili oligonukleotidnim primerima i lančanim reakcijama polimeraze, ili sa oba putem metoda poznatih u struci. Različite kombinacije reverznih mutacija i drugih mutacija napravljene su za svaki od CDR-kalema kao što sledi. Preostali broj ovih mutacija zasnovan je na Kabat sistemu numerisanja.

1.2.1 Ab1

[0514] Za Ab1VH.1z teškog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: M48→I, V67→A, I69→L, i A71→V. Dodatne mutacije obuhvatale su sledeće: Q1→E, Y27→G, N60→A, K64→Q, i D65→G.

[0515] Za Ab1VL.1 lakog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: A43→S, G64→D, i Y87→F.

1.2.2 Ab2

[0516] Za Ab2VH.1z teškog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: M48→I, V67→A, I69→L, A71→V, i T75→S. Dodatne mutacije obuhvatale su sledeće: Q1→E, Y27→G, N60→A, i K64→Q.

[0517] Za Ab2VL.1 lakog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: I2→V i Y87→F.

1.2.3 Ab3

[0518] Za Ab3VH.1z teškog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: M48→I, V67→A, M69→L, T71→V, i T73→N. Dodatne mutacije obuhvatale su sledeće: Q1→E, N60→A, F63→L, K64→Q, i S65→G.

[0519] Za Ab3VL.1 lakog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: A43→P i I48→V.

1.2.4 Ab4

[0520] Za Ab4 VH.1z teškog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: M48→I, V67→A, I69→L, A71→V, K73→R, T75→S, i A93→G. Dodatne mutacije obuhvatale su sledeće: Q1→E.

[0521] Za Ab4 VL.1 lakog lanca, jedan ili više sledećih ostataka je reverzno mutirano kao što sledi: I2→V i Y87→F.

1.3 Stvaranje humanizovanih antitela za PRLR koji sadrže reverzne mutacije okvira u CDR-kalemljenim antitelima

[0522] Sledeći humanizovani varijabilni regioni mišijih monoklonalnih PRLR antitela klonirani su u IgG ekspresione vektore za funkcionalnu karakterizaciju.

1.3.1 Ab1

Ab1 VH.1z je CDR-kalemljeno, humanizovano Ab6 VH koje sadrži IGHV1-69*02 i IGHJ6*01 sekvence okvira.

Ab1 VH.1 je zasnovano na .1z sa Q1E promenom.

Ab1 VH.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 i sadrži četiri predložene reverzne mutacije okvira M48I, V67A, I69L, i A71V.

Ab1 VH.1b je dizajn između .1 i .1a i ima samo dve reverzne mutacije M48I i A71V. Takođe ima četiri CDR humane germinalne promene Y27G, N60A, K64Q, i D65G.

Ab1 VL.1 je CDR-kalemljeno humanizovano Ab6 VL koje sadrži IGKV1-12*01 i IGKJ4*01 sekvence okvira.

Ab1 VL.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 sa 3 predložene reverzne mutacije okvira (A43S, G64D, i Y87F).

Ab1 VL.2 je CDR-kalemljeno humanizovano Ab6 VL koje sadrži IGKV3-15*01 i IGKJ4*01 sekvence okvira.

Ab1 VL.2a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 sa 4 predložene reverzne mutacije okvira (A43S, I58V, G64D, i Y87F).

1.3.2 Ab2

Ab2 VH.1z je CDR-kalemljeno, humanizovano Ab5 VH koje sadrži IGHV1-69*01 i IGHJ4*01 sekvence okvira.

Ab2 VH.1 je zasnovano na .1z sa Q1E promenom.

Ab2 VH.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 i sadrži pet predloženih reverznih mutacija okvira M48I, V67A, I69L, A71V, i T75S.

Ab2 VH.1b je dizajn između .1 i .1a i ima samo dve reverzne mutacije M48I i A71V. Takođe ima tri CDR humane germinalne promene Y27G, N60A, i K64Q.

Ab2VL.1 je CDR-kalemljeno humanizovano Ab5 VL koje sadrži IGKV2-29*02 i IGKJ4*01 sekvence okvira.

Ab2 VL.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 sa 2 predložene reverzne mutacije okvira (I2V i Y87F).

Ab2 VL.1b je dizajn između .1 i .1a sa 1 predloženom reverznom mutacijom okvira I2V.

Ab3

Ab3 VH.1z je CDR-kalemljeno, humanizovano Ab8 VH koje sadrži IGHV1-18*01 i IGHJ6*01 sekvence okvira.

Ab3 VH.1 je zasnovano na .1z sa Q1E promenom.

Ab3 VH.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 i sadrži pet predloženih reverznih mutacija okvira M48I, V67A, M69L, T71V, i T73N.

Ab3 VH.1b je dizajn između .1 i .1a i ima samo dve reverzne mutacije M48I i T71V. Takođe ima četiri HCDR2 humane germinalne promene N60A, F63L, K64Q, i S65G.

Ab3 VL.1 je CDR-kalemljeno humanizovano Ab8 VL koje sadrži IGKV1D-39*01 i IGKJ2*01 sekvence okvira.

Ab3 VL.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 sa 2 predložene reverzne mutacije okvira (A43P i I48V).

Ab3 VL.1b je dizajn između .1 i .1a 1 predloženom reverznom mutacijom okvira I48V.

1.3.3 Ab4

Ab4 VH.1z je CDR-kalemljeno, humanizovano Ab7 VH koje sadrži IGHV1-69*6 i JH4 sekvence okvira.

Ab4 VH.1 je zasnovano na .1z sa Q1E promenom.

Ab4 VH.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 i sadrži sedam predloženih reverznih mutacija okvira M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, T75S, i A93G.

Ab4 VH.1b je dizajn između .1 i .1a i ima samo dve reverzne mutacije M48I i A71V.

Ab4 VL.1 je CDR-kalemljeno humanizovano Ab7 VL koje sadrži IGKV2-29 i Jk4 sekvence okvira.

Ab4 VL.1a je humanizovani dizajn zasnovan na .1 sa 2 predložene reverzne mutacije okvira (I2V i Y87F).

Ab4 VL.1b je dizajn između .1 i .1a sa 1 predloženom reverznom mutacijom okvira I2V.

Primer 2: Testiranje vezivanja i aktivnosti PRLR antitela

[0527] Vezivanje i aktivnost PRLR antitela prema pronalasku testirano je kao što sledi.

2.1 T47D pPRLR ELISA

[0528] T47D ćelije postavljene su pri 60,000/otvoru u ploče sa 96 otvora u RPMI1640 medijumu koji sadrži 10% FBS, i inkubirane su preko noći. Sledeći dan, medijum ćelijske kulture je promenjen u RPMI1640 medijum bez FBS. Ćelije su zatim tretirane testiranjem PRLR antitela razblaženih u PBS puferu koji sadrži 0.1%BSA pri koncentracijama koje su u opsegu od 0.001 do 10 ug/mL 60 min pri 37C. Na kraju tretiranja, ćelije su stimulisane sa 100 ng/mL hPRL (R&D Systems) 15 min pri 37C. Ćelije su zatim lizirane sa puferom za ćelijsku lizu (signalizacija ćelija) 20min pri 4C. Ćelijski lizati analizirani su za fosfor-PRLR nivoe upotrebom humanog fosfor-PRLR ELISA DuoSet IC kompleta od R&D System (#DYC4058). Rezultati su prikazani u Tabeli 13.

[0529] Ovaj test korišćen je kao početna provera zato što je fosforilacija PRLR direktan odgovor na stimulaciju receptora, i blokiranje ove aktivnosti povezano je sa inhibiranjem PRLR signalizacije. Sva antitela izrazila su inhibiciju fosforilacije PRLR.

2.2 Testovi proliferacije ćelije

2.2.1 Test proliferacije Baf3-xPRLR ćelije

[0530] Projektovane Baf3-xPRLR ćelijske linije održavane su u RPMI1640 medijumu sa 10%FBS i 10ng/mL hPRL (R&D Systems). Ćelije su posejane u ploču sa 96 otvora pri 10,000/otvoru u regularnom medijumu kulture koji sadrži 10ng/mL hPRL. Ćelije su tretirane testiranjem PRLR antitela razblaženih u PBS puferu sa 0.1%BSA pri koncentracijama 0.001-10ug/mL 3 dana pri 37C. Nakon inkubacije, proliferacija ćelija merena je upotrebom standardnom CellTiter- Glo Luminescent Viability Assay kompleta (Promega). Rezultati su prikazani na Tabeli 13.

2.2.2 Test proliferacije Nb2-11 ćelija

[0531] Nb2-11 ćelije (Sigma) održavane su u kompletnom medijumu (RPMI1640, 10% FBS, 10% serum konja, 0.05mM 2-merkaptoetanol, 0.075% natrijum bikarbonat). Ćelije su prebačene u stacionarni medijum (RPMI1640, 10% serum konja, 0.05mM 2-merkaptoetanol, 0.075% natrijum bikarbonat) plus 1% FBS na dan pre testa. Za PRL-zavisan test proliferacije, Nb2-11 ćelije su isprane i resuspendovane u stacionarnom medijumu plus 1ng/mL hPRL (R&D Systems) pri 250k ćelija / mL. Ćelije su postavljene u ploču sa 96 otvora pri 90uL/otvoru i tretirane su sa 10uL PRLR antitela za testiranje ispranih u PBS puferu sa 0,1%BSA pri krajnjim koncentracijama 0.001-10ug/mL 3 dana pri 37C. Nakon inkubacije, ćelijska proliferacije je merena upotrebom standardnog CellTiter- Glo Luminescent Viability Assay kompleta (Promega). Rezultati su prikazani na Tabeli 13.

2.2.3 Zaključci

[0532] Nb-211 i Ba/F3 ćelije pacova koje izražavaju PRLR miša, cino i čoveka su zavisne od PRLR signaliziranja za proliferaciju, tako da ovaj osetljiv test korišćen za pristup blokiranja PRLR signaliziranja kod ćelija za ove različite vrste in vitro. Ljudski rezultati postavljeni su paralelno sa onima viđenim u pPRLR testu. Aktivnost je generalno održavana u humanizovanim verzijama, npr., Ab1, Ab2, Ab3 i Ab4. Ab1 Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab11 i Ab13 su pokazala PRLR inhibiranje PRLR cino i PRLR čoveka, dok su Ab1 Ab2, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab9 i Ab13 bila naročito efikasna. Ab2, Ab4 i Ab7 su se pokazala naročito efikasna pri PRLR inhibiranju aktivnosti za PRLR miša i pacova.

2.3 ELISA test vezivanja za vanćelijske domene (ECD)

[0533] Ploče su obložene preko noći sa kozjim anti-humanim Fc region antitelom (1 ug/ml) za PRLR ECD-Fc fuzione proteine čoveka, miša i pacova, i miš anti-his za PRLR ECD-his6 protein cino u 1x PBS (pH 7.4). Za PRLR ECD cino vezujuće eksperimente za mišija antitela, cino PRLR ECD-his6 protein je direktno vezan za ELISA ploču. Ploče su blokirane 1 sat sa Superblock (Pierce) i isprane (3x) sa puferom za ispiranje (1x PBS (pH 7.4), 0.05% Tween 20). ECD proteini su povezivani za odgovarajuće antitelo (1 sat) u puferu za vezivanje (pufer za ispiranje plus 10% Superblock), isprani (3x, pufer za ispiranje) i zatim inkubirani sa serijum ispiranja antitela (1 sat) u puferu za vezivanje. Nakon ispiranja (3x, pufer za ispiranje), sekundarna antitela konjugovana za HRP su vezivana (1 sat) u puferu za vezivanje, isprana (3x, pufer za ispiranje) i inkubirana sa TMB supstratom (Pierce) kako bi se razvio signal za 3-5 minuta, zaustavljena sa 2N H2SO4i skenirana pri 450 nM. Krive su poravnate sa GraphPad 5 (Prizm) i EC50 su određene sa funkcijom poravnanja krive u GraphPad 5.

Rezultati su prikazani na Tabeli 13.

[0534] Podaci ELISA za vezivanje u korelaciji su sa podacima o inhibiranju proliferacije.

2.4 FACS test vezivanja:

[0535] Nb2-11 i Baf3-xPRLR ćelije su resuspendovane u FACS puferu (PBS 1%FBS) pri 2 milione ćelija / mL. Ćelije su dodate u ploču sa 96 otvora i okruglim dnom (100uL/otvoru) i tretirane sa testiranim PRLR antitelima 1 sat pri 4C. Ćelije su zatim isprane sa FACS puferom dva puta i inkubirane sa drugim antitelom konjugovanim sa ALEXA488 (Invitrogen) 1 sat pri 4C. Nakon dva ispiranja u FACS puferu, ćelije su resuspendovane u 1% formaldehidu u PBS. Ćelije su analizirane upotrebom LSRII protočnog citometra. Rezultati su prikazani na Tabeli 13.

[0536] FACS podaci takođe su u korelaciji sa podacima proliferacije. Humanizovana antitela nisu izložena FACS testu vezivanja.

2.5 Biacore vezivanje

[0537] Korišćeni pufer je HBS-EP+ (10mM Hepes, pH7.5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0,05% Tween 20). [PRLR] pri 600nM, 66,67nM i 7,41nM (3 tačke, 9-puta serije ispiranja), poklopljen do 1:1 modela vezivanja (lokalni Rmax, MT uključen) upotrebom Biacore T200 softvera za evaluaciju. Rezultati su prikazani na Tabeli 14.

[0538] Biacore podaci dali su detaljnije informacije o biohemijskom vezivanju. Niži afinitet humanizovanih antitela za mišiji PRLR je preciznije kvantifikovan sa ovim testom.

[0539] Analiza rezultata na Slici 11 pokazuje da chAb7 ima visok afinitet za humani PRLR. Dalje, nakon humanizacije himernih antitela kako bi se napravila humanizovana antitela Ab36 i Ab39, afinitet se smanjio ∼45-puta i ∼22-puta, respektivno. Smanjenje afiniteta je primarno usled promena u brzini koff. Dok reverzne mutacije izvršene na Ab36 (tj., Ab53) nisu poboljšale afinitet antitela, reverzne mutacije izvršene Ab39 (tj., Ab54 i Ab55) povećale su afinitet do nivoa koji je približno 4-puta i 5-puta slabiji nego što je uočeno sa chAb7. Analiza rezultata na Slici 10 ukazuje da svi mAbs pokazuju značajno i proporcionalno slabiju kinetiku vezivanja za mišiji PRLR.

TABELA 14: REZIME SAZNANJA IZ PRIMERA 2.5 (BIACORE TEST

VEZIVANJA)

Primer 3: Test inhibiranja rasta ksenograft tumora

[0540] Efekat PRLR antitela na rast Nb2-11 limfoma ksenograft tumora kod pacova je procenjen. Jedan milion ćelija kancera suspendovano u S-MEM medijumu (bez kalcijuma, bez glutamina, Life Technologies Corporation) koji sadrži Matrigel (bez fenol crveno, Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware) je inokulirano subkutano u desni bok noge ženskog SCID-bež (Charles Rivers Labs, 10 po grupi) na dan ispitivanja 0. Davanje (IP) antitela ili prenosioca (normalni slani rastvor) izvršeno je u vreme poklapanja veličine na dan 7. Tumori su mereni parom kalipera dva puta nedeljno počevši od vremena poklapanja veličine i zapremine tumora izračunate su prema formuli V = L×W<2>/2 (V: zapremina, mm<3>; L: dužina, mm. W: širina, mm). Zapremina tumora merena je za vreme trajanja eksperimenta dok srednja zapremina tumora u svakoj grupi nije dostigla krajnju tačku od >1000 mm<3>. Rezultati su prikazani na Slici 5 i Tabeli 15.

Table 15. Rezime efekata PRLR antitela u Nb2-11 ksenograft modelu

Primer 4: Anti-PRLR grupisanje epitopa

[0541] Grupisanje epitopa PRLR antitela prema određeno je upotrebom testa vezivanja u parovima kao što sledi.

Mišija antitela: Ab5-Ab12

[0542] Korišćeni pufer je HBS-EP+ (10mM Hepes, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfaktant). Test je izvršen upotrebom Biacore T100 i CM5 senzor čipova sa antimišijim IgG (Pierce) ili anti-humanim IgG (Pierce) u svakom protoku ćelija. PRLR antitela obuhvaćena su u protočnoj ćeliji. Protočna ćelija zatim je blokirana ubrizgavanjem kontrolnog antitela (50µg/ml) pre ubrizgavanja antigena. Drugo PRLR antitelo (10µg/ml) je ubrizgano. Odgovor na vezivanje kao funkcija vremena je analiziran za svaki test vezivanja u vidu parova. Testovi recipročnog vezivanja su takođe izvršeni. Rezultati testova izvršenih na mišijim antitelima Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11 i Ab12 prikazani su na Slici 6.

Himerna i humanizovana antitela

[0543] Korišćeni pufer je HBS-EP+ (10mM Hepes, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfaktant). Test je izvršen pri 12°C upotrebom Biacore T200 i CM5 senzor čipova sa anti-humanim IgG (Pierce) amin-povezanih u 4 protočne ćelije do ∼2000 RU.

[0544] Odvojena testirana mAbs obuhvaćena su u protočnim ćelijama 2, 3 & 4 (protočna ćelija 1 je referentna, bez testiranog mAb). Sve 4 protočne ćelije zatim su blokirane ubrizgavanjem sa izotip kontrolnim mAb pri 50ug/ml. Sve 4 protočne ćelije su zatim ubrizgane samo sa antigenom ili sa puferom (pufer je samo za dvostruko referenciranje, izvršeno za svaki par pojedinačno). Sve 4 protočne ćelije zatim su ubrizgane sa drugom testiranim mAb pri 10ug/ml. Sve 4 protočne ćelije zatim su regenerisane sa glicinom, pH1.5.

[0545] Odgovor na vezivanje kao funkcija vremena je analiziran za svaki test vezivanja u vidu parova. Testovi recipročnog vezivanja su takođe izvršeni. Rezultati testova simultanih testova izvršenih chAb7, Ab39, Ab40, chAb5, Ab30, chAb6, Ab19, Ab21, chAb8, Ab48, Ab49 i LFA102 prikazani su na Slici 7 i Slici 8.

[0546] Ovi testovi, izvršeni upotrebom himernih i humanizovanih antitela, pokazali su da su oba, himerna i humanizovana antitela, prepoznala isti region PRLR.

[0547] Slika 7 prikazuje rezultate testa vezivanja antitela izvršenog kako bi se odredilo da li su himerne i humanizovane forme svakog korenog antitela u konkurenciji jedna sa drugom za vezivanje za PRLR. Ovi rezultati ukazuju da su himerne i humanizovane forme svakog korenog antitela u konkurenciji jedna sa drugom, što sugeriše da humanizovanje himernih ćelija nije značajno izmenilo izvorni epitop za bilo koje dato koreno antitelo. Drugim rečima, himerno projektovanje ili humanizacija nije izmenilo relativno grupisanje epitopa za većinu antitela kada se poredi sa grupisanjem antitela roditeljskih mišijih antitela. Međutim, postojalo je malo pomeranje u grupisanju epitopa za mAbs izvedeno iz Ab5 u odnosu na mAbs izvedeno iz Ab8 kada se poredi sa prethodnim grupisanjem epitopa za mišije mAbs. Ova razlika je najverovatnije usled steričke razlike između mišijeg i ljudskog okvira u suprotnosti za promenom u stvarnom epitopu. Za slične rezultate videti Zettlitz, K.A., i dr., Mol Biotechnol (2010) 46: 265-278.

Primer 5: Kristalizacija chAb6 (Fab)-PRLR kompleksa

[0548] Kristalizacija strukture chAb6 Fab fragment-PRLR kompleksa izvršena je i analizirana kao što sledi.

Pripremanje i prečišćavanje chAb6 Fab fragmenta:

[0549] Fab fragment chAb6 izvršen je papain cepanjem roditeljskog mAb kao što je detaljno dato ispod. Papain je aktiviran sa 50 mM cisteinom u PBS, pH 7.4 pufer. mAb chAb6 u PBS, pH 7.4 pufer je pomešan sa papainom pri 1:77 masenom odnosu papaina i mAb i inkubiran 1 h pri 37° C. Reakcija je ugašena sa 6.25mM jodoacetamida. Smeša je prečišćena na 8 ml Mab SelectSure smoli (GE Healthcare) gde je Fab fragment sakupljen dok je proticao. Proticaj je koncentrovan upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekulske mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep koloni (GE Healthcare), prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferu. Frakcije koje su sadržale Fab fragment (praćeno sa UV adsorbancijom pri 280 nm) sakupljene su i zamrznute pri - 80° C. Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC, SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Pripremanje chAb6 Fab-PRLR kompleksa:

[0550] Rekombinantni humani PRLR je izražen u ekspresionom sistemu sisara i zatim prečišćen upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Rekombinantni humani PRLR i chAb6 Fab protein prečišćeni su upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Rekombinantni humani PRLR i chAb6 Fab protein pomešani su pri 1.15:1 molarnom odnosu i inkubirani 2 h pri 22°C. Uzorak kompleksa stavljen je u 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep kolonu (GE Healthcare) prethodno uravnotežen u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferi pri 1 ml/min. Frakcije koje su sadržale kompleks (praćeno sa UV adsorbancijom pri 280 nm) objedinjene su i koncentrovane do 44 mg/ml upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekulske mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC i SDS-PAGE. Višak Fab-kompleks proteina skladišten je zamrznut pri -80° C.

Kristalizacija chAb6 Fab - PRLR kompleksa:

[0551] Protein kompleks isporučen je pri 43.9 mg/ml u 50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl i korišćen je razblažen do 30 mg/ml za ispitivanja kristalizacije. Kristali su razvijani upotrebom tehnike difuzije pare pri 17°C. Rastvor rezervoara je bio 25%(w/v) PEG 3350, 0.1M Bis-Tris pH 5.5, 0.1M amonijum sulfat. Kristalizacione kapi napravljene su upotrebom 1:1 odnosa proteina i rastvora u rezervoaru. Kristali su krio-zaštićeni upotrebom 10%(v/v) propilen glikola. Podaci difrakcije sakupljeni su pod gasom azota pri 100K u Canadian Light Source (Saskatoon, Canada).

Rendgenska struktura chAb6 Fab - PRLR kompleksa:

[0552] Podaci rendgenske difrakcije prošireni do 1.93 Å rezolucije, i potpuni komplet podataka je procesiran sa HKL2000 (HKL Research, Inc). Pristalografska prostorna grupa je ortorombna sa jediničnim ćelijskim parametrima a=62 Å, b=83 Å, i c=135 Å. Statistika za sakupljeni komplet podataka data je na Tabeli 16.

TABELA 16. STATISTIKA RENDGENSKE DIFRAKCIJE chAb6 FAB-PRLR

KOMPLEKS

Određivanje strukture:

[0553] Kristalna struktura je određena molekularnom ramenom- Delimični model pretraživanja za VhV1, ChCl, i PRLR delove stvoren je i zatim postavljen upotrebom programa MOLREP (Vagin et al, 1997) u CCP4 okruženju programa (Winn i dr.2011). Asimetrična jedinica sadrži jedan molekularni kompleks, i simetrični parovi završavaju kristalne rešetke sa međumolekulskim kontaktima. Koordinate su prečišćene u poređenju sa podacima upotrebom programa autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) i iterativnih ciklusa grafičke analize i obnavljanja u gustinu elektrona sa programom COOT (Emsley et al, 2010). Statistika za dobijenu strukturu data je u Tabeli 17:

TABELA 17. STATISTIKA PREČIŠĆAVANJA ZA chAb6 FAB-PRLR KOMPLEKS

[0554] Međumolekulski kontakti praćeni su između PRLR vanćelijskog domena i više chAb6 Fab CDR. Ovi kontakti se sastoje od kritičnih hidrofobnih i hidrofilnih interakcija i obuhvataju premošćavanje molekula vode. Ovi kontakti direktno obuhvataju CDR H1, H2, H3, i L2 od SEQ ID Nos: 104 i 113. Kontaktna površina na antigen površinama na površini epitopa pri preseku PRLR domena, koja sadrži topografski region definisan sa PRLR ostacima: E8, F10, C12, R25, E43, G44, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, Y99, I100, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. Prethodni ostaci amino kiselina PRLR su unutar 4Å za chAb6 Fab nakon vezivanja za njega.

[0555] Prikaz površina epitopa mapiranih na strukturi PRL-PRLR trostrukog kompleksa za Ab6 i LFA102 dat je na Slici 9.

Primer 6: Kristalizacija chAb7 (Fab)-PRLR kompleksa

[0556] Kristalizacija strukture chAb7 Fab fragment-PRLR kompleksa je izvršena i analizirana kao što sledi.

Pripremanje i prečišćavanje chAb7 Fab fragmenta:

[0557] Fab fragment chAb7 pripremljen je papain cepanjem roditeljskog mAb kao što je detaljno dato ispod. Papain je aktiviran sa 50mM cisteina u PBS, pH 7.4 puferu. mAb chAb7 u PBS, pH 7.4 pufer je pomešan sa papainom pri 1:100 masenom odnosu papaina i mAb i inkubiran 1 h pri 37° C. Reakcija je ugašena sa 6mM jodoacetamida. Smeša je prečišćena na 5 ml Mab SelectSure smoli (GE Healthcare) gde je Fab fragment sakupljen kao proticaj. Proticaj je koncentrovan upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep koloni (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferu. Frakcije koje sadrže Fab fragment (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i zamrznute pri - 80° C. Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC, SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Pripremanje chAb7 Fab-PRLR kompleksa:

[0558] Rekombinantni humani PRLR je izražen u ekspresionom sistemu sisara i zatim prečišćen upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Rekombinantni humani PRLR i chAb7 Fab protein su pomešani pri 2:1 molarnom odnosu i inkubirani 2 h pri 4° C. Uzorak kompleksa stavljen je u 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep kolonu (GE Healthcare) prethodno uravnotežen u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferu pri 1 ml/min. Frakcije koje su sadržale kompleks (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 18 mg/ml upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC i SDS-PAGE. Višak Fab-kompleks proteina skladišten je zamrznut pri -80° C.

Kristalizacija chAb7 Fab-PRLR kompleksa:

[0559] Protein isporučen pri 17.6 mg/ml u 50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl, 1mM natrijum azidu i korišćen je pri isporučenoj koncentraciji. Kristali su razvijeni upotrebom tehnike difuzione pare pri 4°C. Rastvor rezervoara je bio 22%(w/v) PEG 4000, 0.1M natrijum acetat, 0.2M amonijum sulfat. Kristalizacione kapi su napravljene upotrebom 1:1 odnosa proteina i rastvora rezervoara. Kristali su krio zaštićeni upotrebom 15%(v/v) propilen glikola. Podaci difrakcije su sakupljeni pod gasom azota pri 100K 17ID liniji (IMCA-cat) u Advanced Photon Source (Argonne, IL).

Rendgenska struktura chAb7 Fab-PRLR kompleksa:

[0560] Podaci rendgenske difrakcije prošireni do 2.0 Å rezolucije, i kompletni podaci su procesirani sa autoPROC (Global Phasing, Ltd). Kristalna prostorna grupa je monoklinični P21 sa jediničnim parametrima ćelije a=99 Å, b=85 Å, c=101 A, i beta=93°. Statistika za sakupljeni komplet podataka data je u Tabeli 18.

TABELA 18. STATISTIKA RENDGENSKE DIFRAKCIJE ZA chAb7 FAB-PRLR

KOMPLEKSA

Određivanje strukture:

[0561] Kristalna struktura određena je molekularnom zamenom. Delimični model pretrage za VhV1, ChCl, i PRLR delove je stvoren i zatim postavljen upotrebom programa MOLREP (Vagin et al, 1997) u CCP4 okruženju programa (Winn i dr.2011). Asimetrična jedinica sadrži 2 molekularna kompleksa koji su slično postavljeni i upakovani sa parovima simetrije za kompletnu kristalnu rešetku sa međumolekulskim kontaktima. Koordinate su prečišćene u poređenju sa podacima upotrebom programa autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) i iterativnim ciklusima grafičke analize i obnavljanjem u gustinu elektrona sa programom COOT (Emsley et al, 2010). Statistika za dobijenu strukturu data je u Tabeli 19:

TABLE 19. STATISTIKA PREČIŠĆAVANJA ZA chAb7 FAB-PRLR KOMPLEKS

Struktura PRLR / chAb7 Fab kompleksa:

[0562] Međumolekulski kontakti su primećeni između PRLR vanćelijskog domena i više chAb7 Fab CDR. Zakopana površina receptora nakon vezivanja antitela je 1198 Å<2>. Kontakti sadrže kritične hidrofobne i hidrofilne interakcije i obuhvataju premošćavanje molekula vode.

Ovi kontakti direktno obuhvataju CDR H1, H2, H3, L1, i L2 od SEQ ID Nos: 105 i 114. Kontaktna površina na antigenu pokriva površinu epitopa pri preseku PRLR domena, koja sadrži topografski region definisan PRLR ostacima: E8, I9, F10, K11, C12, R25, E43, G44, W72, T74, I76, D91, E92, L93, Y94, V95, D96, T98, Y99, I100, W139, L143, E145, F160, K185, D187, H188, Y190 i W191 od SEQ ID NO:2. Prethodni ostaci amino kiselina PRLR su unutar 4Å chAb7 Fab nakon vezivanja za njega.

[0563] Pozicija vezanog chAb7 za PRLR sugeriše da chAb7 bi sprečio vezivanje prolaktina za PRLR.

[0564] Saznanja iz Primera 5 i 6 su konzistentna pri demonstriranju da chAb6 i chAb7 pokazuju komplementarne interakcije za približno isti epitop. Konzervirana svojstva teškog lanca između dva antitela sugerišu važnost interakcija teškog lanca u PRLR vezivanju.

Primer 7: Kristalizacija chAb8 (Fab)-PRLR kompleksa

[0565] Kristalizacija strukture chAb8 Fab fragment-PRLR kompleksa je izvršena i analizirana kao što sledi.

Pripremanje i prečišćavanje chAb8 Fab fragmenta:

[0566] Fab fragment chAb8 pripremljen je papain cepanjem roditeljskog mAb kao što je detaljno dato ispod. Papain je aktiviran sa 50mM cisteina u PBS, pH 7.4 pufer. mAb chAb8 u PBS, pH 7.4 pufer je pomešan sa papainom pri 1:93 masenom odnosu papaina i mAb i inkubiran 1 h at 37° C. Reakcija je ugašena sa 5mM jodoacetamida. Smeša je prečišćena na 8 ml Mab SelectSure smolom (GE Healthcare) gde je Fab fragment sakupljen kao proticaj. Proticaj je koncentrovan upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep koloni (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferu. Frakcije koje sadrže Fab fragment (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i zamrznute pri - 80° C. Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC, SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Pripremanje chAb8 Fab-PRLR kompleksa:

[0567] Rekombinantni humani PRLR je izražen u ekspresionom sistemu sisara i zatim je prečišćen tehnikama dobro poznatim u struci. Rekombinantni humani PRLR i chAb8 Fab protein su pomešani pri 1.16:1 molarnom odnosu i inkubirani 2 h at 22° C. Uzorak kompleksa stavljen je u 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep kolonu (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferu pri 1 ml/min. Frakcije koje su sadržale kompleks (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 38 mg/ml upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC i SDS-PAGE. Višak Fab-kompleks proteina skladišten je zamrznut pri -80° C.

Kristalizacija chAb8-PRLR kompleksa:

[0568] Kompleks proteina je isporučen pri 38 mg/ml u 50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl i razblažen je do 30 mg/ml za ispitivanja kristalizacije. Kristali su razvijeni upotrebom tehnike difuzione pare pri 17°C. Rastvor rezervoara je bio 20%(w/v) PEG 8000, 0.1M natrijum kakodilat pH 5.5, 0.2 amonijum sulfat. Kristalizacione kapi su napravljene upotrebom 1:1 odnosa proteina i rastvora rezervoara. Kristali su krio-zaštićeni upotrebom 10%(v/v) propilen glikola. Podaci difrakcije su sakupljeni pod gasom azota pri 100K u Canadian Light Source (Saskatoon, Canada).

Rendgenska struktura chAb8 Fab-PLR kompleksa:

[0569] Podaci rendgenske difrakcije prošireni do 2.55 Å rezolucije, i kompletni podaci su procesirani sa HKL2000 (HKL Research, Inc). Kristalografska prostorna grupa je ortorombična P212121 sa jediničnim parametrima ćelije a=55 Å, b=89 Å, i c=186 Å.

Statistika za sakupljeni komplet podataka data je u Tabeli 20.

TABELA 20. STATISTIKA RENDGENSKE DIFRAKCIJE ZA chAb8 FAB-PRLR

KOMPLEKS

Određivanje strukture:

[0570] Kristalna struktura određena je molekularnom zamenom. Delimični model pretrage za VhV1, ChCl, i PRLR delove je stvoren i zatim postavljen upotrebom programa MOLREP (Vagin et al, 1997) u CCP4 okruženju programa (Winn i dr.2011). Asimetrična jedinica sadrži jedan molekulski kompleks, i parove simetrije završavaju kristalnu rešetku sa međumolekulskim kontaktima. Koordinate su prečišćene u poređenju sa podacima upotrebom programa autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) i iterativnim ciklusima grafičke analize i obnavljanjem u gustinu elektrona sa programom COOT (Emsley et al, 2010). Statistika za dobijenu strukturu data je u Tabeli 21:

TABELA 21. STATISTIKA PREČIŠĆAVANJA ZA chAb8 FAB-PRLR KOMPLEKS

Struktura PRLR / chAb8 Fab kompleksa:

[0571] Međumolekulski kontakti su primećeni između PRLR vanćelijskog domena i više chAb8 Fab CDR. Kontakti sadrže kritične hidrofobne i hidrofilne interakcije i obuhvataju premošćavanje molekula vode. Ovi kontakti direktno obuhvataju CDR H1, H2, H3, L1 i L3 od SEQ ID Nos: 106 i 115. Kontaktna površina na antigenu pokriva površinu epitopa pri preseku PRLR domena, koja sadrži topografski region definisan PRLR ostacima: R25, T141, L143, E145, R147, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q163, Q164, F167, S171, R183, K185, D187, H188, W191, i W194 od SEQ ID NO:2. Prethodni ostaci amino kiselina PRLR su unutar 4Å chAb8 Fab nakon vezivanja za njega.

Primer 8: Kristalizacija chAb5 (Fab)

[0572] Kristalizacija strukture chAb5 Fab fragment je izvršena i analizirana kao što sledi. Pripremanje i prečišćavanje chAb5 Fab fragmenta:

[0573] Fab fragment chAb5 pripremljen je papain cepanjem roditeljskog mAb kao što je detaljno dato ispod. Papain je aktiviran sa 50mM cisteina u PBS, pH 7.4 puferom. mAb chAb5 u PBS, pH 7.4 puferom je pomešan sa papainom pri 1:100 masenom odnosu papaina i mAb i inkubiran 1 h at 37° C. Reakcija je ugašena sa 5.5mM jodoacetamida. Smeša je prečišćena na 5 ml Mab SelectSure smoli (GE Healthcare) gde je Fab fragment sakupljen kao proticaj. Proticaj je koncentrovan upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 200 HiPrep column (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferom. Frakcije koje sadrže Fab fragment (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 31.3 mg/ml upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC, SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Kristalizacija chAb5:

[0574] Protein je isporučen pri 31.3 mg/mL u 50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl, 1mM natrijum azidu i razblažen do 20mg/ml za ispitivanja kristalizacije upotrebom protein pufera. Kristali su razvijeni upotrebom tehnike difuzione pare pri 4°C. Rastvor rezervoara je bio 20%(w/v) PEG 3350, 0.2M natrijum format. Kristalizacione kapi su napravljene upotrebom 1:1 odnosa proteina i rastvora rezervoara. Kristali su krio-zaštićeni upotrebom 15%(v/v) propilen glikola. Podaci difrakcije su sakupljeni pod gasom azota pri 100K 17ID liniji (IMCA-CAT) u Advanced Photon Source (Argonne, IL).

Rendgenska struktura chAb5

[0575] Podaci rendgenske difrakcije prošireni do 2.1 Å rezolucije, i kompletni podaci su procesirani sa autoPROC (Global Phasing, Ltd). Kristalna prostorna grupa je monoklinični P21 sa jediničnim parametrima ćelije a=72 Å, b=66 Å, c=92 Å, i beta=96°. Statistika za sakupljeni komplet podataka data je u Tabeli 22.

TABELA 22. STATISTIKA RENDGENSKE DIFRAKCIJE ZA chAb5 FAB

Određivanje strukture:

[0576] Kristalna struktura određena je molekularnom zamenom. Delimični modeli pretrage za VhV1 i ChCl delove su stvoreni i zatim postavljeni upotrebom programa MOLREP (Vagin et al, 1997) u CCP4 okruženju programa (Winn i dr.2011). Asimetrična jedinica sadrži dva (2) Fab molekula slične konformacije i upakovana sa parovima simetrije za kompletnu kristalnu rešetku sa međumolekulskim kontaktima. Koordinate su prečišćene u poređenju sa podacima upotrebom programa autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) i iterativnim ciklusima grafičke analize i obnavljanjem u gustinu elektrona sa programom COOT (Emsley et al, 2010). Statistika za dobijenu strukturu data je u Tabeli 23:

TABELA 23. STATISTIKA PREČIŠĆAVANJA ZA chAb5 FAB

Struktura chAb5 Fab:

[0577] Preklapanje chAb5 sa chAb7 Fab iz kompleksa sa PRLR otkriva blisko strukturno usaglašavanje, dajući 0.67 Å RMSD za usaglašene C-alfa koordinate VhVl domena.

Upoređivanje je istaklo očekivani aspekt veoma slične strukturne konformacije za ove blisko povezane Fab, i dalo dokaz sa slične konformacije na lokacijama različitih amino kiselina. Ispitivanje okruženja sa PRLR za usaglašene strukture ne otkriva značajne sudare sa konformacijom chAb5.

[0578] Preklapanje modela chAb5 sa chAb7, na osnovu njihovih respektivnih kristalnih struktura, sugeriše da antitela imaju nekoliko razlika i da dele slične konformacije. Na osnovu prethodnog, chAb5 se očekuje da ima sličan epitop kao chAb7 sa sličnim PRLR interakcijama.

Primer 9: Kristalizacija LFA-102-PRLR kompleksa

[0579] Kristalizacija strukture LFA102-PRLR kompleksa je izvršena i analizirana kao što sledi.

Pripremanje i prečišćavanje LFA-102 Fab fragmenta:

[0580] Fab fragment LFA-102 pripremljen je papain cepanjem roditeljskog mAb kao što je detaljno dato ispod. Papain je aktiviran sa 50mM cisteina u PBS, pH 7.4 puferu. mAb LFA-102 u PBS, pH 7.4 pufer je pomešan sa papainom pri 1:100 masenom odnosu papaina i mAb i inkubiran 1 h at 37° C. Reakcija je ugašena sa 5mM jodoacetamida. Smeša je prečišćena na 20 ml Mab SelectSure smoli (GE Healthcare) gde je Fab fragment sakupljen kao proticaj. Proticaj je koncentrovan upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 300 HR koloni (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferom. Frakcije koje sadrže Fab fragment (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i zamrznute pri - 80° C. Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC, SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Pripremanje LFA-102 Fab-PRLR kompleksa:

[0581] Rekombinantni humani PRLR je izražen u ekspresionom sistemu sisara i zatim prečišćen upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Rekombinanti humani PRLR i LFA-102 Fab protein su pomešani pri 1.1:1 molarnom odnosu i inkubirani 3 h at 4° C. Uzorak kompleksa stavljen je u 2.6 cm x 60 cm Sephacryl 300 HR kolonu (GE Healthcare) prethodno uravnotežena u 50mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.5 puferom at 1 ml/min.

Frakcije koje su sadržale kompleks (praćeno sa UV apsorbancijom pri 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 18 mg/ml upotrebom Ultrafree-15 Biomax 30 kDa odsečene molekularne mase (MWCO) centrifugalnog uređaja (Millipore). Prečišćenost uzorka procenjena je analitičkim SEC i SDS-PAGE. Višak Fab-kompleks proteina skladišten je zamrznut pri -80° C.

Kristalizacija LFA-102 Fab-PRLR kompleksa:

[0582] Protein je isporučen pri 20.7 mg/ml i 50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl, 1mM natrijum azidu i korišćen je pri isporučenoj koncentraciji. Kristali su razvijeni upotrebom tehnike difuzione pare pri 4°C sa rezervoarom 45% (w/v) 2-metil-2, 4-pentanediol (MPD), 0.1M Tris-HCl pH 8.5, 0.1M amonijum dihidrogen fosfatom. Sa ovim uslovima rastvora nije potrebna dodatna krio-zaštita tako da su kristali dobijeni direktno iz kapi i krio-ohlađeni u tečnom azotu. Podaci difrakcije su sakupljeni pod gasom azota pri 100K 17ID liniji (IMCA-cat) u Advanced Photon Source (Argonne, IL).

Rendgenska struktura LFA-102 Fab-PRLR kompleksa:

[0583] Podaci rendgenske difrakcije prošireni do 2.25 Å rezoluciji, i kompletni podaci su procesirani sa autoPROC (Global Phasing, Ltd). Kristalografska prostorna grupa monoklinični C2 sa jediničnim parametrima ćelije a=98 Å, b=119 Å, c=81 Å, i beta=107°. Statistika za sakupljeni komplet podataka data je u Tabeli 24.

TABELA 24. STATISTIKA RENDGENSKE DIFRAKCIJE ZA LFA-102 FAB-PRLR

KOMPLEKS

Određivanje strukture:

[0584] Kristalna struktura određena je molekularnom zamenom. Delimični model pretrage za VhV1, ChCl, i PRLR delove je stvoren i zatim postavljen upotrebom programa MOLREP (Vagin et al, 1997) u CCP4 okruženju programa (Winn i dr.2011). Asimetrična jedinica sadrži jedan molekulski kompleks, i parove simetrije završavaju kristalnu rešetku sa međumolekulskim kontaktima. Koordinate su prečišćene u poređenju sa podacima upotrebom programa autoBUSTER (Global Phasing, Ltd) i iterativnim ciklusima grafičke analize i obnavljanjem u gustinu elektrona sa programom COOT (Emsley et al, 2010). Statistika za dobijenu strukturu data je u Tabeli 25:

TABELA 25. STATISTIKA PREČIŠĆAVANJE ZA LFA-102 FAB-PRLR

KOMPLEKS

Struktura PRLR / chAb7 Fab kompleksa:

[0585] Međumolekulski kontakti su između PRLR i LFA102 uključuje CDR L1, L3, H2 i H3 od LFA 102 (Seq ID Nos 156 i 157). Kontaktna površina na antigenu pokriva epitop definisan sa PRLR ostacima: E145, E155, W156, E157, I158, H159, F160, A161, G162, Q164, L170 i S171 od SEQ ID NO:2. Prethodni ostaci amino kiselina PRLR su unutar 4Å LFA102 nakon vezivanja za njega.

[0586] Pozicija vezanog LFA102 za PRLR sugeriše da bi LFA102 inhibirao PRLR dimerizaciju, ali deluje da bi skoro dozvolio simultano vezivanje prolaktina za PRLR.

Primer 10: Vezivanje Anti-PRLR antitela za cyPRLR i muPRLR

[0587] Testovi su izvršeni kako bi se procenilo vezivanje određeni anti-PRLR antitela za cyPRLR i muPRLR kao što sledi.

[0588] Radni pufer je bio HBS-EP+ (10mM Hepes, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20). Test je izvršen upotrebom Biacore T200 i CM5 senzor čipova sa anti-mišijim Fc (Pierce 31170) ili anti-humanim Fc (Pierce 31125), aminom spojenim u sve četiri protočne ćelije do ∼8000.

[0589] mAb je zahvaćeno u protočnim ćelijama 2, 3 ili 4. Antigen je ubrizgan (2 min pri 80µl/ min). Koncentracije su 3 tačke, 9 puta rastvorene serije od 500 nM - 7.4 nM, i pufer samo. Disocijacija je praćena 15 minuta. Regeneracija je izvršena sa dve uzastopne injekcije (60 i 10 sek pri 60 µ/min) 10 mM glicina, pH 1.5.

[0590] Rezultati su prikazani na Slici 10. PRLR kinetike vezivanja za cino i čoveka su praktično identične za testirana antitela. Međutim, svako testirano antitelo pokazuje značajno i proporcionalno slabiju kinetiku vezivanja muPRLR.

Spisak sekvenci

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji je u stanju da veže prolaktin receptor (PRLR), sadrži antigen vezujući domen sa bar dva CDR kompleta varijabilnog domena izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(4) ili od CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID Nos:85, 86 i 87 ili SEQ ID Nos: 149, 150 i 87, i CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID Nos: 92, 93 i 94.

2. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, dalje sadrži okvir ljudskog primaoca.

3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, sadrži bar jedan varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 123; ili gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži dva varijabilna domena, koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od:

4. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži bar jedan varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 95; i SEQ ID NO: 96.

5. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126;

(b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125;

(c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126;

(d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127;

(e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128;

(f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125;

(g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127;

(h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128;

(i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125;

(j) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126;

(k) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127; i

(l) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128.

6. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 4, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132;

(b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133;

(c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134;

(d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132;

(e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133;

(f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134;

(g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132;

(h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133; i

(i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134.

7. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 4, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144;

(b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145;

(c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146;

(d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144;

(e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145;

(f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146;

(g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144;

(h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145; i

(i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146.

8. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 4, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži sekvencu teškog lanca i sekvencu lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od:

(a) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138;

(b) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139;

(c) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140;

(d) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138;

(e) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139;

(f) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140;

(g) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138;

(h) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139;

(i) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140;

(j) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139;

(k) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 154; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; i

(l) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155; i lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139.

9. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment ima karakteristike izabrane iz grupe koja se sastoji od:

a) vezuje se za ligand koji vezuje D1 domen PRLR;

b) inhibira vezivanje prolaktina za PRLR;

c) u stanju je da modulira biološku funkciju PRLR;

d) u stanju je da neutrališe PRLR;

e) ima konstantu brzine vezivanja (Kon) do PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: bar oko 102M-1s-1; bar oko 103M-1s-1; bar oko 104M-1s-1; bar oko 105M-1s-1; i bar oko 106M-1s<-1>; kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom;

f) ima konstantu brzine disocijacije (Koff) do PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: najviše oko 10<-3>s<-1>; najviše oko 10<-4>s<-1>; najviše oko 10<-5>s<-1>; i najviše oko 10<-6>s<-1>, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom; i

g) i ima konstantu disocijacije (KD) do PRLR izabranu iz grupe koja se sastoji od: najviše oko 10<-7>M; najviše oko 10<-8>M; najviše oko 10<-9>M; najviše oko 10<-10>M; najviše oko 10<-11>M; najviše oko 10<-12>M; i najviše 10<-13>M.

10. Konstrukt antitela koji sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, navedeni konstrukt antitela dalje sadrži polipeptidni veznik ili konstantni domen imunoglobulina.

11. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od:

molekula imunoglobulina, monoklonalnog antitela, himernog antitela, CDR-kalemljenog antitela, humanizovanog antitela, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, disulfidno vezanog Fv, scFv, diatela, multispecifičnog antitela, dvostruko specifičnog antitela i bispecifičnog antitela.

12. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 10 ili 11, gde navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment sadrži konstantni domen imunoglobulina teškog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji od:

humanog IgM konstantnog domena, humanog IgG1 konstantnog domena, humanog IgG2 konstantnog domena, humanog IgG3 konstantnog domena,. humanog IgG4 konstantnog domena, humanog IgE konstantnog domena, i humanog IgA konstantnog domena.

13. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 12, sadrži konstantni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos:10-13.

14. Konjugat antitela koji sadrži konstrukt antitela prema patentnim zahtevima 10 do 13, navedeni konjugat antitela dalje sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoadhezionog molekula, agensa za prikazivanje, terapeutskog agensa, i citotoksičnog agensa, opciono gde je agens za prikazivanje izabran iz grupe koja se sastoji od a radio oznake, enzima, fluorescentne oznake, luminiscentne oznake, magnetne oznake i biotina.

15. Konjugat antitela prema patentnom zahtevu 14, gde je navedeni agens terapeutski ili citotoksični agens i izabran je iz grupe koja se sastoji od: anti-metabolita, agensa za alkilaciju, antibiotika, faktora rasta, citokina, anti-angiogenog agensa, anti-mitotičkog agensa, antraciklina, toksina i apoptotičkog agensa, opciono gde je anti-mitotički agens izabran iz grupe koja se sastoji od dolastatina, auristatina, maitansinoida, alkaloida biljke, taksana i vinka alkaloida.

16. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu antitela ili antigen vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.

17. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu konstrukta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 10-15.

18. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 17.

19. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 18. gde je navedeni vektor izabran iz grupe koja se sastoji od pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, i pBJ.

20. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 18 ili 19.

21. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 20 gde je ćelija domaćina prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija.

22. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 21, gde je navedena ćelija domaćina izabrana iz grupe koja se sastoji od CHO ćelije, COS ćelije, ćelije kvasca i Sf9 ćelije insekta.

23. Metoda za proizvodnju proteina koji je u stanju da veže PRLR, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 20 ili 21 u medijumu kulture pod uslovima dovoljnim da se proizvede vezujući protein koji je u stanju da veže PRLR.

24. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

25. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u metodi za redukovanje aktivnosti humanog PRLR.

26. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u redukovanju aktivnosti humanog PRLR kod ljudskog pacijenta koji boluje od poremećaja u kojem je PRLR aktivnost štetna, ili tretiranju pacijenta koji ima poremećaj u kome je PRLR aktivnost štetna.

27. Antitelo ili antigen vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 26, gde je poremećaj kancer koji je dalje opciono melanom, kancer endometrijuma, limfom, kancer dojke, kancer jajnika, kancer bubrega, gastrointestinalni kancer, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer pankreasa i kancer prostate.

28. Anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) koji sadrži anti-PRLR antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema bilo kom od patentnih zahteva 4-9 konjugovan bar za jedan lek.

29. Anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) prema patentnom zahtevu 28 gde antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, sadrži bar 3 CDR izabrane iz CDR kompleta varijabilnog domena teškog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) koji se sastoji od SEQ ID NOs: 40, 41, i 42; SEQ ID NOs: 46, 47, i 42; SEQ ID NOs: 56, 57, i 58; SEQ ID NOs: 62, 63, i 58; SEQ ID NOs: 71, 72, i 73; SEQ ID NOs: 71, 77, i 73; SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 149, 150, i 87.

30. Anti-PRLR konjugat antitela i leka (ADC) prema patentnim zahtevima 28 ili 29 gde antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, sadrži bar 3 CDR izabrane iz CDR kompleta varijabilnog domena lakog lanca (CDR1, CDR2, i CDR3) koji se sastoji od SEQ ID NOs: 49, 50, i 51; SEQ ID NOs: 65, 66, i 67; SEQ ID NOs: 79, 80, i 81; i SEQ ID NOs: 92, 93, i 94.

31. ADC prema bilo kom od patentnih zahteva 28-30, gde je lek izabran iz grupe koju čine mitotički inhibitor, antitumorski antibiotik, imunomodulirajući agens, vektor za terapiju gena, agens za alkilaciju, antiangiogeni agens, antimetabolit, agens koji sadrži bor, hemoprotektivni agens, hormon, antihormonski agens, kortikosteroid, fotoaktivni agens, oligonukleotid, radionukleotidni agens, inhibitor topoizomeraze, inhibitor tirozinske kinaze i radiosensitizer.

32. ADC prema bilo kom od patentnih zahteva 28-31, gde je lek izabran iz grupe koju čine Ixempra, dolastatin 10, dolatstin 15, auristatin E, auristatin PE, monometil auristatin D (MMAD ili auristatin D derivat), monometil auristatin E (MMAE ili auristatin E derivat), monometil auristatin F (MMAF ili auristatin F derivat), auristatin F fenilendiamin (AFP), auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), 5-benzoilpentanska kiselina-AE ester (AEVB), metotreksat, daunorubicin, vinkristin, maitansin, maitansinol, C-3 estri maitansinola, ansamitocin P1, ansamitocin P2, ansamitocin P3, ansamitocin P4, docetaksel, paklitaksel, paklitaksel nanočestica, vindesin sulfat, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, aktinomicini, pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini, pirolobenzodiazepin (PBD) dimeri, aktinomicin D, antramicin, hicamicin A, DC-18, DC-81, mazetramicin, neotramicin A, neotramicin B, porotramicin, protrakarcin B, SG2285, sibanomicin, sibiromicin, tomaimicin, antraciklini, daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, kaliheamicini, γ I

1; αI

2, α3, N-acetyl-γ I1, PSAG, θ

1, duokarmicini, adozelesin, bizelesin, i carzelesin, bleomicin, mitomicin, plikamicin, bacillus calmette-guerin (BCG), levamizol, vakcine za kancer, vakcine za rekombinantni bivalentni humani papilomavirus (HPV) tipovi 16 i 18 vakcine, vakcine za rekombinantni kvadrivalentni humani papilomavirus (HPV) tipa 6, 11, 16 i 18, sipuleucel-T, citokini, paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinski hormoni kao što je hormon za stimulisanje folikula (FSH), hormon za stimulisanje štitne žlezde (TSH), i hormon za luteniziranje (LH), hepatski faktor rasta; firoblastni faktor rasta, prolaktin, placentni laktogen, faktor nekroze tumora, milerijanskeinhibirajuće supstance, peptid povezan sa gonadotropinom miša, inhibin, ativin, vaskularni endotelijalni faktor rasta, integrin, trombopoietin (TPO), nervni faktori rasta kao što je NGF, plateletni faktor rasta, transformirajući faktori rasta (TGF), nalik insulinu faktori rasta-I i -II, eritropoitein (EPO), osteoinduktivni faktori, interferoni kao što je interferon α, β, i γ, faktori stimulisanja kolonija (CSF), granulocit-makrofag-C-SF (GM-CSF), i granulocit-CSF (G-CSF), interleukini (IL) kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, faktori nekroze tumora i drugi polipeptidni faktori koji obuhvataju LIF i komplet ligand (KL), faktori stimulisanja kolonija, eritropoitein (epoetin), filgrastim, sargramostim, promegapoietin, oprelvekin, terapeutici imunomodulirajućih gena, nukleinska kiselina koja kodira funkcionalni, terapeutski gen koji se koristi za zamenjivanje mutiranog ili na drugi način nefunkcionalnog (npr. skraćenog) gena povezanog sa kancerom, nukleinska kiselina koja kodira ili na drugi način daje proizvodnju terapeutskog proteina za tretiranje kancera, alkil sulfonati, busulfan, azotni iperiti, hlorambucil, ciklofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, i melfalan, nitrosouree, karmustin, fotemustin, lomustin, nimustin, streptozocin, triazini i hidrazini, dakarbazin, prokarbazin, temozolomid, etilenimimi, tiopeta, diazikvon, mitomicin C, metilamin derivati, epoksidi, altretamin, dianhidrogalaktitol, dibromodulcitol, angiostatin, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, EGF vakcina, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, Erlotinib, angiostatin, arestin, endostatin, BAY 12-9566 i w/fluorouracil ili doksorubicin, kanstatin, karboksiamidotriozol i sa paklitakselom, EMD121974, S-24, vitaksin, dimetilksantenon sirćetna kiselina, IM862, Interleukin-12, Interleukin-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, angiozim, IMC-1C11, Neovastat, marimstat, prinomastat, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, sa paklitakselom, sa gemcitabinom i cisplatinom, i sa irinotecanom i cisplatinom i sa radijacijom, tekogalan, temozolomid i PEG interferon α2b, tetratiomolibdat, TNP-470, talidomid, CC-5013 i sa taksoterom, tumstatin, 2-metoksiestradiol, VEGF trap, mTOR inhibitori (deforolimus, everolimus, i temsirolimus), inhibitore tirozinske kinaze (npr., imatinib, gefitinib, dasatinib, sunitinib, nilotinib, lapatinib, sorafenib, fosfoinositid 3-kinaze (PI3K), antagonisti folne kiseline, metotreksat, 4-aminofolna kiselina, lometreksol, pemetreksed, trimetreksat, pirimidin antagonisti, azacitidin, kapecitabin, citarabin, dekitabin, 5-fluorouracil, 5-fluoro-2'-dezoksiuridin 5'-fosfat, 5-fluorouridin trifosfat, gemcitabin, foksuridin, purin antagonist azatioprin, kladribin, merkaptopurin, fludarabin, pentostatin, 6-tioguanin, inhibitori adenozin deaminaze, kladribin, fludarabin, nelarabin, pentostatin, boroficin, bortezomib, hemoprotektivni agensi, amifostin, deksrazoksan, mesna, androgeni, estrogeni, medroksiprogesteron acetat, progestini, aminoglutetimid, anastrozol, bicalutamid, hlorotrianize, ciproteron acetat, degareliks, eksemestan, flutamid, fulvestrant, goserelin, letrozol, leuprolid, lupron, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, tamoksifen, triptorelin, asparaginaza, dakarbazin, hidroksiurea, levamizol, mitotan, prokarbazan, tretinoin, glukokortikoidi, prednizon, hromageni, boje, antismisao oligonukleotidi koji se ili prirodno javljaju ili su sintetisani upotrebom standardnih i/ili nestandardnih nukleotida (uključujući RNK interferencu (RNKi)), dvo-lančana RNK (dsRNK), mala interferirajuća RNK (siRNK), mikroRNK (miRNK), aptameri, CpG oligonukleotidi, ribozimi, angiozim, 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y I25I, I31I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se , 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, I09Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 211'Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-1111, Sb-119,1-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211 , Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, 11C, 13N, 150, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, I03Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, !66Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201T1225Ac, 76Br, I69Yb, taksan, cisplatin, metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicin C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nikotinamid, 5-bromodezoksiuridin (BUdR), 5-jododezoksiuridin (IUdR), bromodezoksicitidin, fluorodezoksiuridin (FUdR), hidroksiurea, hematoporfirin derivati, fotofrin(r), benzoporfirin derivati, NPe6, tin etioporfirin (SnET2), feoborbid a, bakteriohlorofil a, naftalocianini, ftalocianini, cink ftalocianin, kamptotecini, irinotekan, topotekan, amsakrin, daunorubicin, doksotrubicin, epipodofilotoksini, elipticini, epirubicin, etoposid, razoksan, teniposid, aksitinib, bosutinib, cediranib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lestaurtinib, nilotinib, semaksanib, sunitinib, vandetanib, abrin, abrin A lanac, alfa toksin, Aleurites fordii proteini, amatoksin, krotin, curcin, diantin proteini, dipteria toksin, difteria A lanac, nevezujući aktivni fragmenti difteria toksina, dezoksiribonucleaza (Dnaza), gelonin, mitogelin, modekcin A lanac, momordica charantia inhibitor, neomicin, onkonaza, fenomicin, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), antivirusni protein vinobojke, pseudomonas endotoksin, pseudomonas egzotoksin, egzotoksin A lanac iu pseudomonas aeruginosa, restriktocin, ricin, ricin A lanac, ribonukleaza (Rnaza), sapaonaria officinalis inhibitor, saporin, alfa-sarcin, enterotoksin-A stafilokoka, tetanus toksin, cisplatin, karboplatin, i oksaliplatin (Eloksatin, Sanofi Aventis), inhibitori proteazoma, PS-341, HDAC inhibitori, vorinostat, belinostat, entinostat, mocetinostat, panobinostat, COX-2 inhibitori, supstituisane uree, inhibitori proteina toplotnog šoka, geldanamicin, adrenokortikal supresanti, trihoteceni, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, alfaIR3, ScFV/FC, EM/164, matuzumab, erbituks,vektibiks, mAb 806, nimotuksumab, AVEO, AMG102, 5D5 (OA-5d5), H244G11, Ab #14 (MM 121-14), herceptin, 1B4C3; 2D1D12, NVP-AEW541-A, BMS-536,924 (1H-benzoimidazol-2-il)-1H-piridin-2-on), BMS-554,417, cikloligan, TAE226, PQ401 , Iressa, CI-1033 (PD 183805), lapatinib (GW-572016), tikerb, Tarceva, PKI-166, PD-158780, EKB-569, tirfostin AG 1478 (4-(3-hloroanilino)-6,7-dimetoksikvinazolin), PHA665752, ARQ 197, kapecitabin, 5-trifluorometil-2'-dezoksiuridin, metotreksat natrijum, raltitreksed, pemetreksed, tegafur, citozin arabinozid (citarabin), 5-azacitidin, 6-merkaptopurin (merkaptopurin, 6-MP), azatioprin, 6-tioguanin, pentostatin, fludarabin fosfat, kladribin (2-CdA, 2-hlorodezoksiadenozin), inhibitor ribonukleotid reduktaze, ciklofosfamid, neosar, ifosfamid, tiotepa, BCNU→ 1,3-bis(2-hloroetil)-1-nitosourea, CCNU→ 1, -(2-hloroetil)-3-cikloheksil-1-nitrosourea (metil CCNU), heksametilmelamin, busulfan, prokarbazin HCL, dakarbazin (DTIC), hlorambucil, melfalan, karboplatin, oksaliplatin, doksorubicin HCL, daunorubicin citrat, mitoksantron HCL, aktinomicin D, etopozid, topotekan HCl, tenipozid, irinotekan HCL(CPT-ll), vinkristin, vinblastin sulfat, vinorelbin tartrat, vindesin sulfat, paklitaksel, docetaksel, abraksan, iksabepilon, imatinib mezilat, sunitinib malat, sorafenib toslat, nilotinib hidrohlorid monohidrat, L-asparaginaza, alfa interferon, avastin, IL-2, aldesleukin, proleukin, IL-12, toremifen citrat, fulvestrant, raloksifen HCL, anastrazol, letrozol, fadrozol (CGS 16949A), eksemestan, leuprolid acetat, lupron, goserelin acetat, triptorelin pamoat, buserelin, nafarelin, cetroreliks, bikalutamid, nilutamid, megestrol acetat, somatostatin analogi, prendinzolon, deksametason, ketokonazol, sirolimus, temsirolimus (CCI-779), deforolimus (AP23573), i everolimus (RAD00I).

33. Farmaceutski sastav koji sadrži ADC prema bilo kom od patentnih zahteva 28-32.

34. ADC prema bilo kom od patentnih zahteva 28-33 za upotrebu pri tretiranju kancera kod pacijenta koji ima potrebu za time, opciono gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera endometrijuma, limfoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bubrega, gastrointestinalnog kancera, kancera debelog creva, kancera pluća, kancera pankreasa i kancera prostate.