RS51324B - Vakcine protiv nipah virusa - Google Patents

Abstract

Ekspresioni ptičiji pox vektor, naznačen time što sadrži polinukleotid koji kodira glikoprotein Nipah virusa, gde je ptičiji pox ekspresioni vektor canarypox vektor.Prijava sadrži još 9 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

[0001]Predstavljeni pronalazak se odnosi na rekombinantne vakcine protiv Nipah virusa i na primenu takvih vakcina.

OSNOVA PRONALASKA

[0002]Nipah virus je član familije Paramyxoviridae i u srodstvu je sa Hendra virusom (ranije nazivan konjski morbillivirus). Nipah virus je prvi put izolovan 1999. prilikom ispitivanja uzoraka đobijenih u epidemiji encefalitisa i respiratorne bolesti među odraslim muškarcima u Maleziji i Singapuru (videti, npr., Chua et al., Lancet 1999 Oct 9; 354 (9186): 1257-9 i Paton et al., Lancet. 1999 Oct 9; 354 (9186): 1253-6). Domaćin Nipah virusa je još uvek nepoznat, ali pretpostavlja se da su leteće lisice (slepi miševi iz rodaPteropus)njegov prirodni domaćin.

[0003]Zbog promena u ekološkim uslovima, leteće lisice sve više dolaze u kontakt sa ljudima i domaćom životinjama. Stoga je moguće da virusi iz letećih lisica mogu inficirati domaće životinje i ljude, što može kao rezultat dati viruletniju, moguće i fatalnu bolest. Nipah virus izaziva relativno blago oboljenje kod svinja u Maleziji i Singapuru i prenosi se na ljude, mačke i pse putem bliskog kontakta sa inficiranim svinjama.

[0004]Infekcija Nipah virusom kod ljudi povezana je sa encefalitisom koji karakteriše groznica i pospanost, kao i ozbiljnija bolest centralnog nervnog sistema, kao što su koma, konvulzije i nemogućnost zadržavanja daha (videti npr., Lee et al., Ann Neurol. 1999 Sep; 46 (3): 428-32). Bolest uzrokovana Nipah virusom počinje sa 3-14 dana groznice i glavobolje, nakon čega sledi pospanost i dezorijentacija koja se karakteriše mentalnom konfuzijom. Ovi znaci i simptomi mogu progredirati u komu tokom 24-48 časova. Neki od pacijenata imali su respiratornu bolest tokom rane faze infekcije. Ozbiljna oboljenja nervnog sistema izazvana encefalitisom čiji je uzrok Nipah virus bila su obeležena izvesnim posledicama, kao što su perzistentne konvulzije i promene ličnosti. Tokom epidemije bolesti uzrokovane Nipah virusom 1998-1999, oko 40% pacijenata sa ozbiljnom nervnom bolešću koji su primeljni u bolnice, umrlo je od bolesti, (videti, npr., Lam & Chua, Clin Infect Dis. 2002 May 1; 34 Suppl 2: S48-51).

[0005]Shodno tome, cilj zdravstvene zaštite životinja je poboljšanje zdravlja ljudi sprečavanjem prenošenja bolesti između životinja i/ili ljudi.

[0006]Infekcija Nipah virusom može se sprečiti izbegavanjem životinja za koje je poznato da su inficirane i upotrebom odgovarajuće lične zaštitne opreme i uređaja kada je neophodno da se dođe u kontakt sa potencijalno inficiranim životinjama. Lek ribavirin se pokazao kao efikasan protiv Nipah virusain vitro,međutim, kontrolisana ispitivanja leka nisu izvedena i klinička koristnost nije određena.

[0007]Ako bi se razvio efikasan program za prevenciju i lečenje infekcije Nipah virusom, bilo bi neophodno da se definišu virusni antigeni koji su značajni u indukciji zaštitnih odgovora i da se formulišu potencijalni imunoprofilaktički tretmani. Vezujući (G) i fuzioni (F) glikoproteini Nipah virusa uključeni su kao virusni antigeni (videti npr., Bossart et al., J Virol. 2002 Nov; 76 (22): 11186-98 i Guillaume et al., J Virol. 2004 Jan; 78 (2): 834-40). Glikoproteini (G i F) Nipah virusa kada su eksprimirani kao rekombinanti vaccinia virusa indukuju imuni odgovor kod hrčaka koji pruža zaštitu od letalnog izlaganja Nipah virusu (videti npr., Guillaume et al., J Virol. 2004 Jan; 78 (2): 834-40). Međutim, zabeleženo je daje i kod aktivne i kod pasivne imunizacije odgovor antitela na Nipah virus snažno stimulisan, što sugeriše daje efikasnost imunizacije povezana sa sposobnošću vektora da se replicira.

[0008]Prema tome, u tehnici postoji potreba za efikasnom i pouzdanom vakcinom protiv Nipah virusa u kojoj su heterologni proteini eksprimirani sa ograničenom ili bez produktivne replikacije.

[0009]Citiranje ili identifikacija bilo kog dokumenta u ovoj prijavi ne predstavlja potvrdu da je takav dokument dostupan kao stanje tehnike za predstavljeni pronalazak.

REZIME PRONALASKA

[0010]Pronalazak je delimično zasnovan na razvoju efikasne rekombinantne vakcine koja imunizuje svinje protiv Nipah virusa sa oslabljenim canarypox vektorom koji kodira glikoprotein Nipah virusa, tako da je omogućena ekspresija heterolognih proteina sa ograničenom ili bez produktivne replikacije.

[0011]Pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor canarypox virusa koji obuhvata polinukleotid koji kodira glikoprotein Nipah virusa. U jednoj varijenti glikoprotein Nipah virusa može biti vezujući (G) protein. Povoljno, polinukleotid može da sadrži osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 8943 do nukleotida 10751 iz SEQ ID NO: 1, ili polinukleotid kodira peptid SEQ ID NO: 8. U sledećoj varijanti glikoprotein Nipah virusa može biti fuzioni (F) protein. Povoljno, polinukleotid može da sadrži osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 6654 do nukleotida 8294 iz SEQ ID NO: 1, ili polinukleotid kodira peptid SEQ ID NO: 7. U sledećoj varijanti, glikoprotein Nipah virusa može biti vezujući (G) ili fuzioni (F) protein. Povoljno, polinukleotid može sadržati osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 6654 do nukleotida 8294 i osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 8943 do nukleotida 10751 iz SEQ ID NO: 1, ili polinukleotid kodira protein SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8.

[0012]Ekspresioni vektor je canarypox vektor. Povoljno, canarypox vektor može biti

ALVAC.

[0013]Pronalazak obuhvata formulaciju za primenu i ekspresiju glikoproteina Nipah virusa pri čemu formulacija može da sadrži bilo koji od vektora opisanih u prethodnom tekstu i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac. U jednoj varijanti, nosač, razblaživač i inertni punilac mogu da olakšaju infekciju i/ili poboljšaju očuvanje vektora. Opisan je postupak za primenu glikoproteina Nipah virusa na životinju, koji sadrži primenu prethodno navedene formulacije na životinju. Povoljno, životinja je svinja.

[0014]Opisan je postupak za indukciju imunog odgovora kod životinje koji može da sadrži primenu kompozicije koja može da sadrži bilo koji od vektora opisanih u prethodnom tekstu u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora. Opisan je postupak za indukciju imunog odgovora kod životinje koji može da sadrži primenu kompozije koja može da sadrži ćeliju, pri čemu ta ćelija može da sadrži bilo koji od vektora opisanih u prethodnom tesktu u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora. Povoljno, životinja je svinja.

[0015]Opisan je postupak za indukciju imunološkog ili zaštitnog odgovora kod životinje koji može da sadrži primenu kompozicije koja može da sadrži bilo koji od vektora opisanih u prethodnom tekstu u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora. Opisan je postupak za indukciju imunološkog ili zaštitnog odgovora kod životinje koji može da sadrži primenu kompozicije koja može da sadrži ćeliju, pri čemu ta ćelija može da sadrži bilo koji od vektora opisanih u prethodnom tekstu u efikasnoj količini za indukciju imunog odgovora. Povoljno, životinja je svinja.

[0016]Takođe je opisan komplet za izvođenje svakog od prethodno navedenih postupaka koji sadrži bilo koju od prethodno opisanih kompozicija i izborno, uputstva za izvođenje postupka.

[0017]Napominje se da su u ovom opisu i posebno u patentnim zahtevima i/ili paragrafima termini kao što su "sadrži", "sastoji se od", i slično mogu da znače "obuhvata", "obuhvaćen", i slično; i da termin kao što je "sastoji se uglavnom od" uzima u obzir za elemente koji nisu eksplicitno navedeni.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0018]Sledeći detaljan opis, koji je dat radi primera, ali nije namenjen da ograniči pronalazak samo na opisane specifične varijante, najbolje se može razumeti zajedno sa pratećim crtežima, naročito jer se takvi crteži odnose na predstavljeni pronalazak kao što je definisan u patentnim zahtevima:SI.1 ilustruje nukleotidne (SI. 1A) i aminokiselinske (FIG. 1B) sekvence Nipah virusa. Videti npr., GenBank Accession No. NC 002728, Chua et al, Science. 2000 May 26; 288 (5470): 1432-5; Harcourt et al, Virology. 2001 Aug 15; 287 (1): 192-201; Chan et al., J Gen Virol. 2001 Sep; 82 (Pt 9): 2151-5 i Chua et al, Microbes Infect. 2002 Feb; 4 (2): 145-51, koji su ovde obuhvaćeni u celini. SI. 2 ilustruje konstrukciju plazmida pSL- 6802-1-4. SI. 2A predstavlja mapu kodirajućih regiona Nipah virusa. SI. 2B ilustruje PCR oligonukleotide za amplifikaciju Nipah G gena. SI. 2C ilustruje konstrukciju pSL- 6802-1-4. SI. 2D predstavlja nukleotidnu sekvencu leve i desne ruke i ekspresionu kasetu sa translacijom G gena Nipah virusa. SI. 3 ilustruje konstrukciju plazmida pSL- 6802-2-5. SI. 3A ilustruje PCR oligonukleotide za amplifikaciju Nipah G gena. SI. 3B ilustruje konstrukciju pSL- 6802-2-5. SI. 3C predstavlja nukleotidnu sekvencu leve i desne ruke i ekspresionu kasetu sa translacijom G gena Nipah virusa. SI. 4 ilustruje konstrukciju plazmida pSL- 6839-1. SI. 4A predstavlja mapu Nipah virusa i antigena vakcine. SI. 4B ilustruje PCR oligonukleotide za amplifikaciju Nipah F gena. SI. 4C ilustruje konstrukciju pSL- 6839-1. SI. 4D predstavlja nukleotidnu sekvencu leve i desne ruke i ekspresionu kasetu sa translacijom F gena Nipah virusa. SL. 5 ilustruje konstrukciju plazmida pSL- 6851-29. SI. 5A ilustruje PCR oligonukleotide za amplifikaciju Nipah F gena. SI. 5B predstavlja dijagram plazmida pSL- 6851-29. SI. 5C predstavlja nukleotidnu sekvencu leve i desne ruke i ekspresionu kasetu sa translacijom F gena Nipah virusa. SI. 6 ilustruje Nipah G western blot. Traka 1 bio je supernatant ALVAC, traka 2 bio je supernatant vCP2199 (ALVAC NipahG), traka 3 bio je supernatant vCP2199 (ALVAC Nipah G), traka 4 bio je supernatant kokošijeg pox virusa, traka 5 bio je supernatant vFP2200 (kokošiji pox virus Nipah G), traka 6 bio je supernatant vFP2200 (kokošiji pox virus Nipah G), traka 7 bili su markeri (177.6, 113.9, 81.2,60.7, 47.4, 36.1, 25.3, 19.0, 14.7, 6.1 kDa), traka 8 bio je ALVAC talog, traka 9 bio je vCP2199 talog, traka 10 bio je vCP2199 talog, traka 11 bio je talog kokošijeg pox virusa, traka 12 bio je vFP2200 talog i traka 13 bio je vFP2200 talog. SI. 7 ilustruje Nipah F imunoblot. SI. 7A je blotovana sa antiserumom zamorca. SI. 7B je blotovana sa antiserumom svinje. Gel #1 bio je sa Nipah F rekombinantima (samo talog). Traka 1 bio je prazan prostor, traka 2 bio je kokošiji pox virus, traka 3 bio je vFP2207, traka 4 bio je vFP2207, traka 5 bio je prazan prostor, traka 6 bio je ALVAC, traka 7 bio je cvCP2208, traka 8 bio je marker 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa i trake 9 i 10 bile su prazan prostor. Gel #2 bio je sa Nipah F rekombinantima (samo supernatant). Traka 1 bila je prazan prostor, traka 2 bila je kokošiji pox virus, traka 3 bio je vFP2207, traka 4 bio je vFP2207, traka 5 bio je marker 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa, traka 6 bio je prazan prostor, traka 7 bio je ALVAC, traka 8 bio je prazan prostor, traka 9 bio je vCP2208 i traka 10 bio je prazan prostor.

DETALJAN OPIS

[0019]Pronalazak je delimično zasnovan na razvoju efikasne rekombinantne vakcine protiv Nipah virusa. Pronalazak se odnosi na vakcinu protiv Nipah virusa.

[0020]Gen Nipah virusa je kodiran u ekspresioni vektor, gen Nipah virusa kodira glikoprotein. U naročito povoljnoj varijanti, gen Nipah virusa kodira vezujući (G) glikoprotein. U sledećoj naročito povoljnoj varijanti, gen Nipah virusa kodira fuzioni (F) glikoprotein.

[0021]Ekspresioni vektor je canarypox vektor. U naročito poželjnoj varijanti, vektor je oslabljeni canarypox vektor. Povoljno, oslabljeni canarypox vektor je ALVAC.

[0022]Protein Nipah virusa koji je kodiran od strane ekspresionog vektora je glikoprotein. U naročito povoljnoj varijanti, protein Nipah virusa je vezujući (G) glikoprotein, povoljnije sa sekvencom SEQ ID NO: 8. U sledećoj naročito povoljnoj varijanti, protein Nipah virusa je fuzioni (F) glikoprotein, povoljnije sa sekvencom SEQ ID NO: 7.

[0023]U naročito povoljnoj varijanti pronalaska, rekombinantni konstrukti su ALVAC konstrukt koji eksprimira Nipah G označen kao vCP2199 i ALVAC konstrukt koji eksprimira Nipah F označen kao vCP2208.

[0024]U opštem slučaju, proteini Nipah virusa uključuju protein nukleokapsida (povoljnije SEQ ID NO.: 2), fosfoprotein (povoljnije SEQ ID NO: 3), V protein (povoljnije SEQ ID NO: 4), C protein (povoljnije SEQ ID NO: 5), protein matriksa (povoljnije SEQ ID NO: 6) ili polimerazu (povoljnije SEQ ID NO: 9).

[0025]Termini "protein", "peptid", "polipeptid" i "polipeptidni fragment" ovde su korišćeni naizmenično u odnosu na polimere aminokiselinskih ostataka bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili granat, može sadržati modifikovane aminokiseline ili analoge aminokiselina, i može biti prekinut drugim hemijskim grupama. Termini takođe obuhvataju aminokisclinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom, na primer, formiranjem disulfidne veze, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao stoje konjugacija sa obeleživačem ili bioaktivnom komponentom.

[0026]Gen Nipah virusa koji je korišćen u pronalasku kodira glikoprotein. U posebno povoljnoj varijanti, gen Nipah virusa kodira vezujući (G) glikoprotein, povoljnije nukleotide 8943 do 10751 iz SEQ ID NO: 1. U sledećcoj naročito povoljnoj varijanti, gen Nipah virusa kodira (F) glikoprotein, povoljnije nukleotide 6654 do 8294 iz SEQ ID NO: 1.

[0027]U opštem slučaju geni Nipah virusa obuhvataju proteine nukleokapsida (povoljnije nukleotide 113 do 1711 iz SEQ ID NO: 1), fosfoprotein (povoljnije nukleotide 2406 do 4535 iz SEQ ID NO: 1), V protein (povoljnije nukleotide 2406 do 3775 iz SEQ ID NO: 1), C protein (povoljnije nukleotidi 2428 do 2928 iz SEQ ID NO: 1), proteine matriksa (povoljnije nukleotide 5108 do 6166 iz SEQ ID NO: 1) ili polimerazu (povoljnije nukleotide 11259 do 18213 iz SEQ IDNO: 1).

[0028]"Polinukleotid" je polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, koji sadrži dezoksiribonukleotide, ribonukleotide i analoge u bilo kojoj kombinaciji. Polinukleotidi mogu imati trodimenzionalnu strukturu, i izvršavati bilo koju funkciju, poznatu ili nepoznatu. Termin "polinukleotid" obuhvata molekule u obliku dvostrukog, jednostrukog ili trostrukog spiralnog molekula. Ukoliko nije drugačije naznačeno ili zahtevano, bilo koja ovde opisana varijanta pronalaska koja je polinukleotid obuhvata i dvolančani oblik i svaki od dva komplementarna oblika za koji se zna ili koji se predviđa da formira dvolančani oblik DNK, RNK ili hibridnog molekula.

[0029]Slede neograničavajući primeri polinukleotida: gen ili genski fragment, egzoni, introni, iRNK, tRNK, rRNK, ribozomi, cDNK, rekombinantni polinukleotidi, granati polinukleotidi, plazmidi, vektori, izolovane DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, probe i prajmeri nukleinskih kiselina. Polinukleotid može sadržati modfiikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i nukleotidni analozi, uracil, drugi šećeri i vezujuće grupe, kao što su fluoriboza ili tiolat, i nukleotidne grane. Nukleotidna sekvenca može biti dodatno modifikovana nakon polimerizacije, na primer konjugacijom, sa obeleživačkom komponentom. Drugi tipovi modifikacija uključeni u ovu definiciju su terminalni modifikovani nukleotidi („cap" nukleotidi), supstitucija analogom jednog ili više nukleotida koji se javljaju u prirodi, i uvođenje sredstava za vezivanje polinukleotida za proteine, jone metala, obeleživače, druge polinukleotide ili čvrstu podlogu.

[0030]"Izolovani" polinukleotid ili polipeptid je onaj koji je najvećim delom oslobođen od materija sa kojima je povezan u svojoj prirodnoj sredini. Pod terminom najvećim delom oslobođen podrazumeva se da je najmanje 50%, povoljnije najmanje 70%, još povoljnije najmanje 80%, i najpovoljnije najmanje 90% oslobođen od ovih materija.

[0031]Pronalazak dalje obuhvata lanac koji je komplementaran polinukleotidu glikoproteina Nipah virusa.

[0032]Komplementarni lanac može biti polimerni i bilo koje dužine, i može sadržati dezoksiribonukleotide, ribomukleotide, i analoge u bilo kojoj kombinaciji.

[0033]Reakcije hibridizacije mogu se izvesti pod uslovima različite "oštrine". Uslovi koji povećavaju oštrinu reakcije hibridizacije su dobro poznate. Videti na primer, "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual", second edition (Sambrook et al. 1989). Primeri relevantnih uslova uključuju (u pravcu povećanja oštrine): temperature inkubacije od 25°C, 37°C, 50°C i 68°C; koncentracije pufera od 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (gde je SSC 0.15 M NaCl i 15 mM citratni pufer) i njihov ekvivalent korišćenjem drugih puferskih sistema; koncentracije formamida od 0%, 25%, 50%, i 75%; vreme inkubacije od 5 minuta do 24 časa; 1, 2 ili više koraka ispiranja; vreme inkubacija pri ispiranju od 1, 2 ili 15 minuta; i rastvori za ispiranje od 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, ili dejonizovana voda.

[0034]Pronalazak dalje obuhvata polinukleotide koji kodiraju funkcionalno ekvivalentne varijante i derivate glikoproteina Nipah virusa ili njihove funkcionalno ekvivalentne fragmente koji mogu pojačati, smanjiti ili ne uticati značajno na osobine kodirajućih polipeptida. Ove funkcionalno ekvivalentne varijante, derivati ili fragmenti pokazuju sposobnost zadržavanja aktivnosti glikoproteina Nipah virusa. Na primer, promene u sevenci DNK koje ne menjaju kodiranu aminokiselinsku sekvencu, kao i one koje rezultuju u konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka, jedna ili nekoliko delecija ili adicija aminokiselina, i supstitucija aminokiselinskih ostataka aminokiselinskim analogom, su one koje neće značajno uticati na osobine kodiranog polipeptida. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su glicin/alanin; valin/izoleucin/leucin; asparagin/glutamin; asparaginska kiselina/glutaminska kiselina; serin/treonin/metionin; lizin/arginin; i fenilalanin/tirozin/triptofan.

[0035]Za svrhe ovog pronalaska, identičnost ili homologija sekvenci je određena upoređivanjem poravnatih sekvenci tako da se maksimizuje preklapanje i identičnost uz istovremeno minimizovanje praznina u sekvenci. Naročito, identičnost sekvenci može biti određena korišćenjem bilo kog matematičkog algoritma. Neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, modifikovan kao u Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877.

[0036]Još jedan primer matematičkog algoritma za poređenje sekvenci je algoritam od Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Takav algoritam je uključen u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje GCG sekvence. Pri korišćenju ALIGN programa za poređenje aminokiselinskih sekvenci može se koristiti PAM120 tabela za težinu ostataka, penal za dužinu praznine od 12, i penal za prazninu od 4. Još jedan koristan algoritam za identifikaciju regiona lokalne sličnosti i poravnanja sekvence je FASTA algoritam kao što je opisano u Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988: 85: 2444-2448.

[0037]Povoljniji za korišćenje prema ovom pronalasku je program WU- BLAST (Washington University BLAST) verzija 2.0. Izvršni programi WU- BLAST verzija 2.0 za nekoliko UNIX platformi mogu se preuzeti sa ftp :/Mast.wustl.edu/blast/executables. Ovaj program je zasnovan na WU- BLAST verziji 1.4, koji je zasnovan na NCBI- BLAST verziji 1.4 koji je u javnom vlasništvu (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460.480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; svi ovde uključeni).

[0038] U opštem slučaju, poređenje aminokiselinskih sekvenci postiže se poravnavanjem aminokiselinske sekvence polipeptida poznate strukture sa aminokiselinskom sekvencom polipeptida nepoznate strukture. Zatim se porede aminokiseline u sekvencama i grupišu se aminokiseline koje su homologe. Ovaj postupak otkriva konzervativne regione polipeptida i uzima u obzir aminokiselinske insercije i delecije. Homologija između aminokiselinskih sekvenci može se odrediti korišćenjem komercijalno dostupnih algoritama (videti takođe opis homologije u prethodnom tekstu). Kao dodatak onima koji su pomenuti ovde, takođe se pominju i programi BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP, i PSI- BLAST, obezbeđeni od strane National Center for Biotechnology Information. Ovi programi su u širokoj upotrebi u tehnici u ovu svrhu i mogu poravnati homologe regione dve aminokiselinske sekvence.

[0039]U svim programima za pretraživanje unutar paketa rutine za poravnanje praznina su integralni deo samog pretraživanja baze podataka. Određivanje praznina se može uključiti ili isključiti. Podrazumevani penal (Q) za prazninu od 1 je Q=9 za protein i BLASTP, i Q=10 za BLASTN, ali mogu biti promenjeni u bilo koji ceo broj. Podrazumevani penal po ostatku za produženje praznine (R) je R=2 za proteine i BLASTP, i R=10 za BLASTN, ali mogu biti promenjeni u bilo koji ceo broj. Bilo koja kombinacija vrednosti za Q i R može se koristiti da bi se poravnale sekvence tako da se maksimizuje preklapanje i identičnost uz istovremeno minimizovanje praznina sekvence. Podrazumevani matriks za poređenje aminokiselina je BLOSUM62, ali se mogu koristiti druge matrice za poređenje aminokiselina kao stoje PAM.

[0040]Alternativno ili dodatno, termin "homologija" ili "identičnost", na primer, u odnosu na nukleotidne ili aminokiselinske sekvence, može ukazati na kvantitativnu meru homologije između dve sekvence. Procenat homologije sekvenci može se izračunati kao (Nref - Ndif)

<*>100/Nref, gde je Ndif ukupan broj ostataka koji nisu identični u dve poravnate sekvence i gde je Nref broj ostataka u jednoj od sekvenci. Stoga, DNK sekvenca AGTCAGTC imaće 75% identičnost sekvence sa sekvencom AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2).

[0041]Alternativno ili dodatno, "homologija" ili "identičnost" u odnosu na sekvence može se odnositi na broj mesta sa identičnim nukleotidima ili aminokiselinama podeljen sa brojem nukleotida ili aminokiselina u kraćoj od dve sekvence gde ravnanje dve sekvence može biti određeno u saglasnosti sa algoritmom koji su dali Wilbur i Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 726, uključen ovde), na primer, korišćenjem veličine prozora od 20 nukleotida, dužine reči od 4 nukleotida, i penala za prazninu od 4, i kompjuterski asistirane analize i interpretacije podataka za sekvencu uključujući poravnanje, mogu se pogodno izvesti korišćenjem dostupnih programa (e.g., Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Kada se kaže da su RNK sekvence slične, ili imaju određen stepen identičnosti ili homologije sekvence sa DNK sekvencama, timidin (T) u DNK sekvenci se smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvenci. Stoga, RNK sekvence su unutar obima pronalaska i mogu biti izvedene iz DNK sekvenci, sa tim da se timidin (T) u DNK sekvenci smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvencama.

[0042]I, bez nepotrebnog eksperimentisanja, stručnjak može konsultovati mnoge druge programe ili reference za određivanje procenta homologije.

[0043]Pronalazak dalje obuhvata glikoprotein Nipah virusa, sadržan u molekulu vektora ili ekspresionom vektoru pronalaska, i, ukoliko je potrebno, operativno vezan za pojačivački ili promotorni element. U povoljnijoj varijanti, promotor je promotor citomegalovirusa (CMV). U drugoj varijanti, pojačivači i/ili promotori uključuju različite promotore specifične za ćeliju ili tkivo, različite virusne promotore ili pojačivače i različite DNK sekvence Nipah virusa izogeno specifične za svaku životinjsku vrstu.

[0044]"Vektor" se odnosi na rekombinantni DNK ili RNK plazmid ili virus koji sadrži heterologni polinukleotid koji se doprema do ciljne ćelije, biloin vitroiliin vivo.Hetrologni polinukleotid može sadržati sekvencu od interesa za korišćenje u terapiji, i može izborno biti u obliku ekspresione kasete. Nije neophodno da vektor bude sposoban za replikaciju u krajnjoj ciljnoj ćeliji ili subjektu. Ovaj termin uključuje klonirajuće vektore za translaciju polinukleotidne kodirajuće sekvence. Takođe su uključeni virusni vektori.

[0045]Termin "rekombinantni" označava polinukleotid genomske cDNK, polusintetičkog ili sintetičkog porekla koji se ili ne javlja u prirodi ili je vezan za drugi polinukleotid u rasporedu koji se ne nalazi u prirodi.

[0046]"Heterologno" označava izvedeno iz entiteta genetički različitog od drugog entiteta sa kojim se poredi. Na primer, polinukleotid može biti postavljen u plazmid ili vektor izveden iz različitog izvora, i na taj način predstavlja heterologni polinukleotid. Promotor koji je uklonjen iz nativne kodirajuće sekvence i operativno vezan za kodirajuću sekvencu koja nije nativna sekvenca predstavlja heterologni promotor.

[0047]Polinukleotidi pronalaska mogu sadržati dodatne sekvence, kao što su dodatne kodirajuće sekvence unutar iste transkripcione jedinice, kontrolni elementi kao što su promotori, pojačivači, mesta vezivanja ribozoma, mesta za poliadenilaciju, terminatori transkripcije, dodatne transkripcione jedinice pod kontrolom istog ili različitog promotora, sekvence koje dozvoljavaju kloniranje, ekspresiju, homolognu rekombinaciju i transformaciju ćelije domaćina i svaki takav konstrukt koji može biti poželjan u cilju obezbeđivanja varijanti ovog pronalaska.

[0048]Elementi za ekspresiju glikoproteina Nipah virusa pogodno su prisutni u vektoru pronalaska. U minimalnom slučaju ovo obuhvata inicijalni kodon (ATG), stop kodon i promotor i izborno takođe poliadenilacionu sekvencu za određene vektore kao što su plazmid i određeni virusni vektori, npr., virusni vektori osim pox virusa i terminator transkripcije pox virusa. Kada polinukleotid kodira poliproteinski fragment, npr. protein Nipah virusa, pogodno, u vektoru je ATG smešten na 5' okvira čitanja, a stop kodon je postavljen na 3'. Mogu biti prisutni elementi kontrole ekspresije, kao što su pojačivačke sekvence, stabilizujuće sekvence i signalne sekvence koje dozvoljavaju sekreciju proteina.

[0049]Postupci za pravljenje i/ili primenu vektora, rekombinanata ili plazmida za ekspresiju genskih proizvoda gena pronalaska biloin vivoiliin vitro,mogu biti željeni postupci, npr., postupak koji je analog postupcima koji su ovde dati, ili dati u dokumentima citiranim u: SAD Patenti br. 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140; 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091;

5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639; 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439; 5,552,143; 5,580,859; 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066; 6,497,883; 6,464,984; 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376; 6,376,473; 6,368,603; 6,348,196; 6,306 400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199; 6,090,393; 6,074,649; 6,045,803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450 i 6;312,683; SAD patentna prijavaserijski broj 920,197, podneta 16. 10. 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11313-11318; Ballay et al., EMBO J. 1993; 4: 3861-65; Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550-2561; Frolov et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8: 85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3: 237-52; Ju et al., Diabetologia 1998; 41: 736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075; McClements et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11349-11353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 399-406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9: 271; i Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11307-11312. Vektor u pronalasku je vektor canarypox virusa. Proteini ili njihovi fragmenti, citokini, itd., koji ne potiču od Nipah virusa, mogu biti eksprimirani od strane jednog ili više vektora ili uključeni u kompozicije pronalaska.

[0050]Citokin ili citokini mogu biti u obliku proteina u imunogenoj ili kompoziciji vakcine, ili mogu biti koeksprimirani u domaćinu zajedno sa imunogenom ili imunogenima ili njihovim epitopom (epitopima). Prednost je data koekspresiji jednog ili više citokina, bilo istim vektorom koji eksprimira imunogen ili imunogene ili njihove epitope, ili njihovim posebnim vektorom.

[0051]Citokin (citokini) može biti izabran od: interleukina 18 (IL- 18), interleukina 12 (IL-12), interleukina 15 (IL- 15), MlP-la (inflamatorni protein makrofaga la; Marshall E. et al, Br. J. Cancer, 1997, 75 (12), 1715-1720), GM- CSF (faktor koji stimuliše stvaranje kolonija granulocita-makrofaga). Poželjno, korist je dobijena od citokina vrsta koje se vakcinišu; odnosno, pogodno, citokin odgovara ciljnoj ili domaćinskoj vrsti i to je na primer, GM- CSF svinje (S. Inumaru et al. Immunol. Cell Biol. 1995, 73 (5), 474-476), GM- CSF psa (primer 8 WO00/77043), GMCSF mačke, (primer 9 WO00/77043).

[0052]WO00/77210 obezbeđuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence koje odgovaraju GMCSF konja, gdein vitroproivodnja GM-CSF i konstrukcija vektora (npr., plazmida i virusnih vektora) dozvoljavajuin vivoekspresiju GM- CSF konja.

[0053]Ovaj pronalazak se takođe odnosi na preparate vektora pronalaska. Priprema vektora može uključiti, u većem delu se sastojati od, ili se sastojati od jednog ili više vektora, kao što suin vivoekspresioni vektori, koji uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od (i pogodno eksprimiraju) jednog ili više polinukleotida Nipah virusa i, pogodno, vektor sadrži i eksprimira polinukleotid koji uključuje, u većem delu se sastoji od, ili se sastoji od kodirajućeg regiona koji kodira protein Nipah virusa, pogodno glikoprotein Nipah virusa, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom nosaču, inertnom puniocu ili razblaživaču. Stoga prema varijani pronalaska, drugi vektor ili vektori u preparatu uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od polinukleotida koji kodira, i pod određenim okolnostima vektor eksprimira jedan ili više drugih proteina od glikoproteina ili njegovog fragmenta Nipah virusa.

[0054]Prema drugoj varijanti, vektor ili vektori u preparatu uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od jednog ili više polinukleotida koji kodira jedan ili više proteina ili njihovih fragmenata, proteina Nipah virusa, pogodno glikoproteina Nipah virusa. Preparat pronalaska pogodno uključuje, u većem delu se sastoji od, ili se sastoji od najmanje dva vektora koji uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od, i pogodno takođe eksprimiraju, pogodnoin vivopod odgovarajućim ili pogodnim uslovima, ili u pogodnoj ćeliji domaćinu, polinukleotide iz različitih izolata Nipah virusa koji kodiraju iste proteine i/ili različite proteine, ali pogodno iste proteine. Za preparate koji sadrže jedan ili više vektora koji uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od polinukleotida koji kodiraju, i pogodno eksprimiraju, pogodnoin vivo,protein Nipah virusa, pogodno glikoprotein Nipah virusa, ili njihov epitop, da produkti ekspresije budu iz dva, tri ili više različitih izolata Nipah virusa, pogodno sojeva. Pronalazak je takođe usmeren na smeše vektora koje uključuju, u većem delu se sastoje od, ili se sastoje od onih koji kodiraju i eksprimiraju različite proteine Nipah virusa.

[0055]Vektor pronalaska je ptičiji pox vektor koji sadrži gen za glikoprotein Nipah virusa, gde je ptičiji pox vector canarv pox vektor, pogodno, oslabljeni canarypox vektor kao što je ALVAC. Oslabljeni canarypox virusi opisani su u SAD Patentu br. 5,756,103 (ALVAC) i WO01/05934.

[0056]Prema pronalasku, vektor poxvirusa je vektor canarypox virusa, pogodno oslabljeni canarypox virus. U tom pogledu, canarypox je dostupan iz ATCC pod pristupnim brojem VR-111. Oslabljeni canarypox virusi opisani su u SAD Patentu br. 5,756,103 (ALVAC) i WO01/05934.

[0057]Za informacije o postupku za stvaranje njihovih rekombinanta i kako njihove rekobinante primeniti, stručnjak može, između ostalog, konsultovati dokumente WO90/12882 i SAD Patent br. 5,756,103 pored ostalog.

[0058]U slučaju canarypox, pogodno inserciono mesto ili mesta su ORF (s) C3, C5 i/ili; takođe pogledati dokumente koji su ovde citirani.

[0059]Pogodno, polinukleotid koji treba da se eksprimira inseriran je pod kontrolom specifičnog poxvirus promotora; takvi mogu, između ostalog, uključiti vaccinia promotor 7.5 kDa (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), vaccinia promotor I3L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), vaccinia promotor HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), kravlji pox promotor ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), vaccinia promotor H6 (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).

[0060]Za vakcinaciju sisara ekspresioni vektor je canarypox. Na taj način, može se postići ekspresija heterolognih proteina sa ograničenom ili bez produktivne replikacije.

[0061]U opštijem slučaju, promotor je ili virusnog ili ćelijskog porekla. Snažan virusni promotor koji nije CMV- IE koji se može uspešno praktično koristiti u pronalasku je rani/ kasni promotor SV40 virusa ili LTR promotor virusa Rous sarkoma. Snažan ćelijski promotor koji se može uspešno praktično koristiti u pronalasku je promotor gena za citoskelet, kao što je npr., dezminski promotor (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), ili aktinski promoter (Miyazaki J. et al.. Gene, 1989, 79, 269-277).

[0062]Funkcionalni podfragmenti ovih promotora, tj., delovi ovih promotora koji zadržavaju odgovarajuću promotorsku aktivnost npr., podeljeni CMV- IE promotori prema PCT prijavi br. WO98/00166 ili SAD Patentu br. 6,156,567, mogu se praktično koristiti u pronalasku. Promotor praktično korišćen u pronalasku posledično uključuje derivate ili podfragmente promotora pune dužine koji zadržavaju odgovarajuću promotorsku aktivnost i stoga funkcionišu kao promotori, pogodno sa promotorskom aktivnošću suštinski sličnom pravim ili promotorima u punoj dužini iz kojih su izvedeni derivati ili subfragmenti, npr., bliski aktivnosti podeljenog CMV- IE promotora iz SAD Patenta br. 6,156,567 sa aktivnošću CMV-IE promotora u punoj dužini. Stoga, CMV- IE promotor praktično upotrebljen u pronalasku uključuje, u većem delu se sastoji od, ili se sastoji od promotorskog dela promotora pune dužine i/ili pojačivačkog dela promotora pune dužine, kao i derivata i podfragmenata.

[0063]Prema sledećoj varijanti pronalaska, ekspresioni vektori su ekspresioni vektori korišćeni uin vitroekspresiji proteina u odgovarajućem ćelijskom sistemu. Proizvodnja proteina može se izvršiti transfekcijom sisarskih ćelija putem replikacije ili ekspresije bez produktivne replikacije virusnih vektora u ćelijama sisara ili ptica, ili putem replikacije Baculovirus-a (videti npr., SAD Patent br. 4,745,051; Vialard J. et al, J. Virol, 1990 64 (1), 37-50; Verne A., Virologv, 1988,167,56-71), npr.,Autographa californicavirus jedarne polihedroze AcNPV, u ćelijama insekta (npr., Sf9 ćelijeSpodoptera frugiperda,ATCC CRL 1711; videti takođe, U.S. Patents Nos. 6,228,846, 6,103,526). Ćelije sisara koje se mogu koristiti pogodno su ćelije hrčka (npr., CHO ili BHK- 21) ćelije majmuna (npr., COS ili VERO). Eksprimirani proteini mogu biti prikupljeni u ili iz supernatanta kulture posle, ili ne posle sekrecije (ako nema sekrecije tipično dolazi do lize ćelije ili se ona izvodi), izborno koncentrovani postupcima za koncentrovanje kao što je ultrafiltracija i/ili prečišćeni putem sredstava za prečišćavanje, kao što je afinitetni, jono-izmenjivački ili gel filtracioni tip hromatografskog postupka.

[0064]Stručnjaku je poznato da uslovi kultivisanja ćelija domaćina variraju u odnosu na određeni gen i da je rutinsko eksperimenti sanje povremeno neophodno da bi se odredili optimalni uslovi za kultivisanje glikoproteina Nipah virusa, u zavisnosti od ćelije domaćina. "Ćelija domaćin" označava prokariotsku ili eukariotsku ćeliju koja je genetički izmenjena, ili ima mogućnost da se genetički izmeni primenom egzogenog polinukleotida, kao što je rekombinantni vektor. Kada se govori o genetički izmenjenim ćelijama, termin se odnosi i na originalno izmenjenu ćeliju i na njeno potomstvo.

[0065]Polinukleotidi koji sadrže željenu sekvencu mogu se ubaciti u pogodan klonirajući ili eksprimirajući vektor, a vektor može biti uveden u pogodnu ćeliju domaćina za replikaciju i amplifikaciju. U opštem slučaju polinukleotidi mogu biti uvedeni u ćeliju domaćina bilo kojim sredstvima poznatim u tehnici. Vektori koji sadrže polinukleotide od interesa mogu se uvesti u ćeliju domaćina bilo kojim pogodnim sredstvom, uključujući direktnu apsorpciju, endocitozu, transakciju, f- uparivanje, elektroporaciju, transfekciju korišćenjem kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAR-dekstrana, ili drugih supstanci, bombardovanje mikroprojektilima; lipofekciju; i infekciju (gde je vektor infektivan, na primer retrovirusni vektor). Izbor u vezi uvođenja vektora ili polinukleotida često će zavisiti od karakteristika ćelija domaćina.

[0066]Treba izvesti primenu terapeutski efikasne količine formulacije pronalaska za dopremanje i ekspresiju glikoproteina Nipah virusa do ciljne ćelije. Određivanje terapeutski efikasne količine predstavlja za stručnjaka rutinsko eksperimentisanje. Formulacija sadrži ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji eksprimira glikoprotein Nipah virusa, i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac. U pogodnoj varijanti, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac olakšava transfekciju i/ili poboljšava očuvanje vektora ili proteina.

[0067]Farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac dobro su poznati stručnjacima. Na primer, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac može biti 0.9% rastvor NaCl (npr., slani rastvor) rastvor ili fosfatni pufer. Drugi farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punioci koji se mogu koristiti u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, poli-(L-glutamat) ili polivinilpirolidon. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac može biti bilo koje jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja olakšava primenu vektora (ili proteina eksprimiranog preko vektora pronalaskainvitro); pogodno, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac mogu olakšati transfekciju i/ili poboljšati održanje vektora (proteina). Doze i zapremine doza ovde se razmatraju u opštem opisu i takođe mogu biti određeni od strane stručnjaka na osnovu otkrića zajedno sa postojećim saznanjima u tehnici, bez suvišnog eksperimentisanja.

[0068]Katjonski lipidi koji sadrže kvaternarnu amonijum so koja je pogodno, ali ne isključivo, pogodna za korišćenje sa plazmidima, pogodno oni koji imaju sledeću formulu:

u kojoj je Rizasićeni ili nezasićeni alifatični radikal negranatog lanca sa 12 do 18 ugljenikovih atoma, R2je sledeći alifatični radikal sa 2 ili 3 ugljenikova atoma i X je amin ili hidroksilna grupa, npr., DMRIE. U sledećoj varijanti, katjonski lipid može biti povezan sa neutralnim lipidom, npr., DOPE.

[0069]Od ovih katjonskih lipida, prednost je data DMRIE (N-(2- hidroksietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloksi)-l-propan amonijum; WO96/34109), koji je pogodno povezan sa neutralnim lipidom, pogodno DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amin; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), da bi formirao DMRIE-DOPE.

[0070]Kada je DOPE prisutan, DMRIE:DOPE molarni odnos je pogodno oko 95: oko 5, oko 5: oko 95, od pogodnije oko 1: oko 1, npr., 1:1.

[0071]Težinski odnos DMRIE ili DMRIE-DOPE adjuvanta: plazmida može biti između oko 50: oko 1 i oko 1: oko 10, kao što je oko 10: oko 1 i oko 1: oko 5, i pogodno oko 1: oko 1 i oko 1: oko 2, npr., 1: 1 i 1: 2.

[0072]Farmaceutske kompozicije mogu se primcniti direktnoin vivo,a kodirani proizvod eksprimiran preko vektora u domaćinu. Postupci zain vivodopremanje vektora koji kodira glikoprotein Nipah virusa (pogledati npr., SAD Patent br. 6,423,693; patentne objave EP 1052286, EP 1205551, U.S. patentnu objavu 20040057941, WO 9905300 i Draghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec; 6 (6): 830-6) mogu biti modifikovani da bi dopremili glikoprotein Nipah virusa ovog pronalaska.In vivodopremanje vektora koji kodira glikoprotein Nipah virusa, koji je ovde opisan, može biti ostvareno od strane prosečnog stručnjaka.

[0073]Pogodno, farmaceutske i/ili terapeutske kompozicije i/ili formulacije prema pronalasku sadrži ili se većinom sastoje ili se sastoje od efikasne količine koja dovodi do terapeutskog odgovora, jednog ili više ekspresionih vektora prema pronalasku; efikasna količina može se odrediti iz datog opisa, kao i saznanja iz tehnike, bez suvišnog eksperimentisanja.

[0074]Imunogene kompozicije i vakcine prema pronalasku mogu sadržati jedan ili više adjuvanata. Naročito pogodni adjuvanti za praktično korišćenje u ovom pronalasku su (1) polimeri akrilnih ili metakrilnih kiselina, anhidrid maleinske kiseline i polimeri alkenil derivata, (2) imunostimulišuće sekvence (ISS), kao što su oligodezoksiribonukleotidne sekvence sa jednom ili više ne-metilovanih CpG jedinica (Klinman D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; W098/16247), (3) emulzije ulje u vodi, kao što je SPT emulzija opisana na strani 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" objavljena od strane M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulzija MF59 opisana na strani 183 istog rada, (4) katjonski lipidi koji imaju kvaternarnu amonijum so, (5) citokini, (6) aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat ili (7) drugi adjuvanti razmatrani u bilo kom citiranom dokumentu koji je ovde uključen, ili (8) bilo koja njihova kombinacija ili smeša.

[0075]Emulzija ulje u vodi (3), koja je naročito pogodna za virusne vektore, može se zasnivati na:

- lakom tečnom parafinskom ulju (tip Evropske farmakopeje).

- izoprenoidnom ulju kao što je skvalan, skvalen,

- ulju koje nastaje oligomerizacijom alkena, npr., izobuten ili decen,

- estrima kiselina ili alkohola koji imaju negranatu alkil grupu, kao što su biljna ulja, etil oleat, propilen glikol, di(kaprilat/kaprat), glicerol tri(kaprilat/kaprat) i propilen glikol dioleat, ili

- estrima granatih masnih alkohola ili kiselina, naročito estrima izostearinske kiseline.

[0076]Ulje je korišćeno u kombinaciji sa emulzifikatorima da bi se stvorila emulzija. Emulzifikatori mogu biti nejonski surfaktanti, kao što su: - estri, sa jedne strane, sorbitana, manid (npr., anhidromanitol oleat), glicerol, poliglicerol, ili propilen glikol, a sa druge strane, oleinske, izostearinske, ricinoleinske ili hidroksistearinske kiseline, pomenuti estri opciono mogu biti etoksilovani, -polioksipropilen- polioksietilen kopolimerni blokovi, kao što je Pluronic, npr., L121.

[0077]Od polimera adjuvanta tipa (1), prednost je data polimerima unakrsno vezane akrilne ili metakrilne kiseline, naročito unakrsno vezane sa polialkenil etrima, šećerima ili polialkoholima. Ova jedinjenja poznata su pod nazivom karbomer (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Stručnjak takođe može konsultovati SAD Patent br. 2,909,462, koji obezbeđuje takve akrilne polimere unakrsno vezane polihidroksil jedinjenjem sa najmanje tri hidroksilne grupe, poželjno ne više od osam takvih grupa, gde su atomi vodonika u najmanje tri hidroksilne grupe zamenjeni nezasićenim alifatičnim radikalima sa najmanje dva atom ugljenika. Poželjni radikali su oni koji sadrže 2 do 4 atoma ugljenika, npr., vinili, alili i druge etilenski nezasićene grupe. Nezasićeni radikali mogu takođe sadržati druge supstituente, kao što je metil. Proizvodi koji se prodaju pod imenom Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) su naročito poželjni. Oni su unakrsno vezani sa alil saharozom ili alil pentaeritritolom. Od njih, spomenuti su Carbopol 974P, 934P i 971 P.

[0078]Što se tiče kopolimera anhidrida maleinske kiseline-alkenil derivata, prednost je data EMA (Monsanto), koji predstavlja negranat lanac ili unakrsno vezane kopolimere etilen-anhidrid maleinske kiseline i koji su, na primer, unakrsno vezani sa divinil etrom. Referenca je takođe načinjena na J. Fields et al., Nature 186: 778-780, June 4,1960.

[0079]U pogledu strukture, polimeri akrilne i metakrilne kiseline i EMA poželjno su formirani od osnovnih jedinica sa formulom:

u kojoj:

- Rii R2, koji mogu biti isti ili različiti, predstavljaju H ili CH3

- x = 0 ili 1, poželjno x = 1

- y = 1 ili 2, sa x + y = 2.

[0080]Za EMA, x = 0 i y = 2 i za karbomere x = y = 1.

[0081]Ovi polimeri su rastvorljivi u vodi ili u fiziološkom rastvoru (20 g/l NaCl) i pH se može podesiti na 7.3 do 7.4, npr., dodavanjem baze (NaOH), da bi se obezbedio rastvor adjuvanta u koji se može uključiti ekspresioni vektor (vektori). Koncentracija polimera u finalnoj kompoziciji vakcine može biti u opsegu između 0.01 i 1.5% tež./zapr., poželjno 0.05 do 1% tež./zapr. i poželjno 0.1 do 0.4% tež./zapr.

[0082]U pogodnoj varijanti, farmaceutske i/ili terapeutske kompozicije i/ili formulacije prema pronalasku su primenjene preko injekcije, kao što je, ali nije ograničeno na, intramuskularnu (IM), intradermalnu (ID) ili subkutanu (SC) injekciju.

[0083]Takođe u vezi sa takvim terapeutskim kompozicijama, iz ovde datog opisa i iz saznanja u tehnici, stručnjak može odrediti broj primena, put primene, i doze koje će se koristiti za svaki protokol za injekciju, bez suvišnog eksperimentisanja.

[0084]U pogodnoj varijanti, rekombinantna vakcina se može primeniti na svinju ili infekcijom ili transfekcijom uneti u ćelije u količini od oko najmanje IO<3>pfu (jedinica formiranja plaka); poželjnije oko IO<4>pfu do oko 10<10>pfu, npr., oko 10<5>pfu do oko IO9 pfu, na primer, oko IO<6>pfu do oko 10<8>pfu, po dozi, na primer, po dozi od 2 ml. U naročito pogodnoj varijanti, doza je oko 10<8>pfu po dozi.

[0085]Postupak uključuje najmanje jednu primenu efikasne količine terapeutske kompozicije prema pronalasku na životinju. Životinja može biti mužjak, ženka, trudna ženka ili novorođenče. Ova primena može biti pažljivo izvedena preko intramuskularne (IM), intradermalne (ID) ili subkutane (SC) injekcije ili preko intranazalne ili oralne primene. U pogodnoj varijanti, terapeutska kompozicija prema pronalasku može se primeniti špricom ili aparatom bez igle (kao, na primer, Pigjet, Biojector or Vitajet (Bioject, Oregon, USA)). Drugi pristup za primenu plazmida je korišćenje elektroporacije videti, npr., S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; PCT prijavu br. WO99/01158.

[0086]Pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije za vakcinisanje životinja protiv infekcija Nipah virusom. U određenoj varijanti, farmaceutske kompozicije koja sadrže Nipah F i Nipah G prema ovom pronalasku koriste se za vakcinaciju životinja protiv infekcija izazvanih Nipah virusima. U pogodnoj varijanti, životinja je svinja. U sledećim pogodnim varijantama, životinja je mačka, pas, konj ili čovek.

[0087]Takođe je dat postupak za sprečavanje prenošenja Nipah virusa između prve i druge životinje koji se sastoji od imunizacije ili izazivanja imunog odgovora kod prve životinje korišćenjem bilo kog od postupaka opisanih ovde da bi se sprečilo prenošenje bolesti na drugu životinju. U određenoj varijanti, farmaceutske kompozicije koje sadrže Nipah F i Nipah G prema pronalasku koriste se za vakcinisanje pomenutih prvih životinja protiv infekcija izazvanih Nipah virusima. U pogodnoj varijanti, prva životinja je svinja. Druga životinja je mačka, pas, konj ili čovek.

[0088]Takođe je obezbeđen komplet za izvođenje bilo kog od prethodno opisanih postupaka koji sadrži bilo koju od kompozicija pronalaska, i izborno, uputstva za izvođenje postupka.

[0089]Pronalazak će sada biti dalje opisan putem primera. Zadržavajući se na canarypox virusnim vektorima koji kodiraju glikoprotein Nipah virusa, takvi mogu biti uzeti kao ilustrativni za ovaj pronalazak. Drugi predmeti primera dati su samo kao informacija.

PRIMERI

Primer1: Konstrukti

[0090]Konstrukcija plazmida pSL- 6802- 1- 4. pSL- 6802-1-4 obuhvata okružujuće sekvence C5 lokusa, H6 vaccinia promotor i G gen Nipah virusa da bi se generisao VCP2199. Nipah virus je izolovan iz humanog CSF. Nipah G gen je amplifikovan putem PCR-a i ubačen u plazmid pTMl, čime se generiše pTMl Nipah G. Svrha je bila konstrukcija pC5 H6p Nipah G donor plazmida za stvaranje ALVAC canarypox virus rekombinanta koji eksprimira Nipah G. Naziv plazmida je bio pC5 H6p Nipah G, pSL- 6802-1-4. Osnova plazmida bio je pCXL-148-2, pC5 H6p koji obuhvata H6 vaccinia promotor, leve i desne ruke koje odgovaraju C5 lokusu insercije. Plazmid pCXL- 148-2 je izveden iz plazmida pNVQH6C5LSP- 18 preko mutacije jedne baze iz T u C u desnoj ruci C5. Plazmid pNVQH6C5LSP-18 je opisan u S. Loosmore et al US2005/0031641.

[0091]G gen Nipah je amplifikovan PCR postupkom korišćenjem pTMl Nipah G kao šablonske i prajmera 11470.SL i 11471.SL (SI. 2B). PCR fragment od -1.8 kb kloniran je u pCR2.1, stvarajući klon pSL- 6771-1-1 (pCR2.1 H6p Nipah G), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 2C). Nru I- Xho I H6p Nipah G fragment od -1.8 kb iz pSL- 6771-1-1 kloniran je u pCXL- 148-2 (pC5 H6p), stvarajući pSL- 6802-1-4 (pC5 H6p Nipah G), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 2C i 2D).

[0092]Konstrukcija<p>lazmida<p>SL- 6802- 2- 5. pSL- 6802-2-5 obuhvata okružujuće sekvence F8 lokusa, H6 vaccinia promotor i G gen Nipah virusa da bi se generisao VFP2200. Nipah virus je izolovan iz humanog CSF. G gen Nipah je amplifikovan PCR-om i ubačen u plazmid pTMl, generišući pTMl Nipah G. Svrha je bila da se konstruiše pF8 H6p Nipah G donor plazmid za generisanje kokošijeg pox rekombinanta koji eksprimira Nipah G. Naziv plazmida bio je pF8 H6p Nipah G, pSL- 6802-2-5. Osnova plazmida bio je pSL- 6427-2-1, pF8 H6p koji obuhvata H6 promotor, leve i desne ruke F8 lokusa insercije. Plazmid pSL- 6427-2-1 je izveden iz plazmida pSL- 5440-5-1 putem mutacije jedne baze iz C u T u levoj ruci F8. Plazmid pSL- 5440-5-1 je opisan u S. Loosmore et al US2005/0031641.

[0093]Nipah G gen je amplifikovan putem PCR-a korišćenjem pTMl Nipah G kao šablona i prajmera 11470.SL i 11471.SL (SI. 3A). PCR fragment od -1.8 kb kloniran je u pCR2.1, stvarajući klon pSL- 6771-1-1 (pCR2.1 H6p Nipah G), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 3 B). Nru I-Xho I H6p Nipah G fragment od -1.8 kb iz pSL- 6771-1-1 kloniranje u pSL-6427-2-1 (pF8 H6p), stvarajući pSL- 6802-2-5 (pF8 H6p Nipah G), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 3B i 3C).

[0094]Konstrukcija plazmida pSL- 6839- 1. pSL- 6839-1 obuhvata okružujuće sekvence F8 lokusa, H6 vaccinia promotor i F Nipah virus gen da bi se stvorio VFP2207. Nipah virus je izolovan iz CSF. Nipah F gen je amplifikovan putem PCR-a i ubačen u plazmid pTMl, stvarajući pTMl Nipah F. Svrha je bila da se konstruiše pF8 H6p Nipah F donor plazmid za stvaranje kokošijeg pox rekombinanta koji eksprimira Nipah F. Naziv plazmida: pF8 H6p Nipah F, pSL- 6839-1. Osnova plazmida bio je pSL- 6427-2-1, pF8 H6p koji obuhvata H6 vaccinia promotor, leve i desne ruke F8 lokusa insercije.

[0095]Postojala je interna T5NT sekvenca u Nipah F koja je uklonjena mutagenezom usmcrcnom na specifično mesto. Fragment koji kodira 3'- kraj H6 promotora i 5'- kraj Nipah F gena amplifikovan je putem PCR-a korišćenjem prajmera 11457.SL i 11458.SL. U amplifikovanom segmentu T5NT sekvenca je uklonjena i uvedeno je Apa I mesto za potrebe kloniranja (SI. 4B). Fragment je kloniran u pCR2.1, stvarajući pSL- 6797-3-1 (pCR2.1 H6p 5'- Nipah F, bez T5NT), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 4C). 3'- Nipah F fragment amplifikovan je putem PCR-a korišćenjem prajmera 11456.SL i 11459.SL. U amplifikovanom segmentu T5NT sekvenca je uklonjena i uvedeno je Apa I mesto za potrebe kloniranja (SI. 4B). Fragment je kloniran u pCR2.1, stvarajući pSL- 6797-4-1 (pCR2.1 3'-Nipah F, bez T5NT), što je potvrđeno analizom sekvence (SI. 4C). Nru I- BamH I H6p 5'-Nipah F fragment od - 0.7kb iz pSL- 6797-3-1 ubačen je u pSL- 6427-2-1 (pF8 H6p), stvarajući pSL- 6830-1 (pF8 FI6p 5'- Nipah F). Apa I- BamH I 3'- Nipah F fragment od - l.Okb iz pSL- 6797-4-1 ubačen je između Apa I i Bam H I u pSL- 6830-1, stvarajući pSL-6839-1 (pF8 H6p Nipah F), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 4C i 4D).

[0096]Konstrukcija plazmida pSL- 6851- 29. pSL- 6851-29 obuhvata okružujuće sekvence C5 lokusa, H6 vaccinia promotor i F gen Nipah virusa da bi se stvorio VCP2208. Nipah virus je izolovan iz humanog CSF. Nipah F gene je amplifikovan putem PCR-a i ubačen u plazmid pTMl, stvarajući pTMl Nipah F. Svrha je bila da se konstruiše pC5 H6p Nipah F donor plazmid da bi se generisao ALVAC canarypoxvirus rekombinant koji eksprimira Nipah F. Naziv plazmida bio je pSL- 6851-29, pC5 H6p Nipah F. Osnova plazmida bio je pCXL- 148-2, pC5 H6p koji obuhvata H6 vaccinia promotor, levu i desnu ruku C5 lokusa insercije.

[0097]Postojala je interna T5NT sekvenca u Nipah F koja je uklonjena mutagenezom usmerenom na specifično mesto. Fragment koji kodira 3'- kraj H6 promotora i 5'- kraj Nipah F gena amplifikovan je putem PCR-a korišćenjem prajmera 11457.SL i 11458.SL. U amplifikovanom segmentu T5NT sekvenca je uklonjena i uvedeno je Apa I mesto za potrebe kloniranja (SI. 5A). Fragment je kloniran u pCR2.1, stvarajući pSL- 6797-3-1 (pCR2.1 H6p 5'- Nipah F, bez T5NT), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 5B). 3'- Nipah F fragment amplifikovan je putem PCR-a korišćenjem prajmera 11456.SL i 11459.SL. U amplifikovanom segmentu, T5NT sekvenca je uklonjena i uvedeno je Apa I mesto za potrebe kloniranja (SI. 5A). Fragment je kloniran u pCR2.1, stvarajući pSL- 6797-4-1 (pCR2.1 3'-Nipah F, bez T5NT), što je potvrđeno analizom sekvence (SI. 5B). Nru I- BamH I H6p 5'-Nipah F fragment od~0.7kb iz pSL- 6797-3-1 ubačen je u pSL- 6427-2-1 (pF8 H6p), stvarajući pSL- 6830-1 (pF8 H6p 5'- Nipah F). Apa I- BamH I 3'- Nipah F fragment od - l.Okb iz pSL- 6797-4-1 ubačen je između Apa I i Bam H I u pSL- 6830-1, stvarajući pSL-6839-1 (pF8 H6p Nipah F), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 4C i 4D). Nru I- Xma I H6p Nipah F fragment 1.7kb iz pSL- 6839-1 ubačen je u pCXL- 148-2 (pC5 H6p) da bi se stvorio pSL- 6851-29 (pC5 H6p Nipah F), koji je potvrđen analizom sekvence (SI. 5B i 5C).

[0098]Konstrukcija kokošijeg pox- rekombinanta koji eksprimira Nipah F. vFP2207. Gen je bio Nipah F. Donor plazmid bio je pSL- 6839-1. Mesto insercije bio je F8 lokus kokošijeg pox virusa. Promotor je bio vaccinia virus H6 promotor. Ćelije zain vitrorekombinaciju bile su ćelije fibroblasta primarnog kokošijeg embriona (1°CEF) koje su uzgajane u 10% FBS,

DMEM.

[0099]In vitrorekombinacija izvedena je transfekcijom 1°CEF ćelija saNot I- linearizovanim donor plazmidom pSL- 6839-1 (20 ug). Transficirane ćelije su naknadno inficirane sa kokošijim pox virusom kao virusom za spašavanje na MOI od 10. Nakon 48 časova, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, obrađene ultrazvukom i korišćene za skrining rekombinantnih virusa. Skrining rekombinantnih plakova zasnivao se na postupku hibridizacije sa korišćenjem Nipah F specifične probe, koja je obeležena sa peroksidazom rena. Nakon četiri uzastopne runde prečišćavanja plaka, stvoren je rekombinant označen kao vFP2207 koji je potvrđen hibridizacijom kao 100% pozitivan na insert i 100% negativan na F8 ORF.

[0100]Konstrukcija canarypox rekombinanta koji eksprimira Nipah G, vCP2199. Gen je bio Nipah G. Donor plazmid bio je pSL- 6802-1-4. Mesto insercije je bilo C5. Promotor je bio H6 promotor. Ćelije zain vitrorekombinaciju bile su ćelije fibroblasta primarnog kokošijeg embriona (1°CEF) koje su uzgajane u 10% FBS, DM EM.

[0101]In vitrorekombinacija izvedena je transfekcijom 1°CEF ćelija sa Not I- linearizovanim donor plazmidom pSL- 6802-1-4 (15 ug). Transficirane ćelije su naknadno inficirane sa ALVAC kao virusom za spašavanje na MOI od 10. Nakon 24 časa, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, obrađene ultrazvukom i korišćene za skrining rekombinantnih virusa. Skrining rekombinantnih plakova zasnivao se na postupku hibridizacije sa korišćenjem Nipah G specifične probe, koja je obeležena sa peroksidazom rena. Nakon pet uzastopnih rundi prečišćavanja plaka, stvoren je rekombinant označen kao vCP2199 koji je potvrđen hibridizacijom kao 100% pozitivan na Nipah G insert i 100%) negativan na C5 ORF.

[0102]Konstrukcija kokošijeg pox rekombinanta koji eksprimira, Nipah G, vFP2200. Gene je bio Nipah G. Donor plazmid bio je pSL6802-2-5. Mesto insercije je bilo F8. Promotor je bio H6 promotor. Ćelije zain vitrorekombinaciju bile su ćelije fibroblasta primarnog kokošijeg embriona (1°CEF) koje su uzgajane u 10% FBS, DMEM.

[0103]In vitrorekombinacija izvedena je transfekcijom 1°CEF ćelija sa Not I- linearizovanim donor plazmidom pSL6802-2-5 (15 ug). Transficirane ćelije su naknadno inficirane sa kokošijim pox kao virusom za spašavanje na MOI od 10. Nakon 24 časa, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, obrađene ultrazvukom i korišćene za skrining rekombinantnih virusa. Skrining rekombinantnih plakova zasnivao se na postupku hibridizacije sa korišćenjem Nipah G specifične probe, koja je obeležena sa peroksidazom rena. Nakon četiri uzastopne runde prečišćavanja plaka, stvoren je rekombinant označen kao vFP2200. Hibridizacijom je potvrđeno da su 100% pozitivni na Nipah G insert i 100% negativni na F8

ORF.

[0104]Konstrukcija canarypox rekombinanta koji eksprimira, Nipah F. vCP2208. Gen je bio Nipah F. Donor plazmid bio je pSL6851.29 (pC5 H6p Nipah F). Mesto insercije je bilo C5. Promotor je bio H6 promotor. Ćelije zain vitrorekombinaciju bile su ćelije fibroblasta primarnog kokošijeg embriona (1°CEF) koje su uzgajane u 10% FBS, DMEM.

[0105]In vitrorekombinacija izvedena je transfekcijom 1°CEF ćelija sa Not I- linearizovanim donor plazmidom pSL6851.29 (10 ug). Transficirane ćelije su naknadno inficirane sa ALVAC kao virusom za spašavanje na MOI od 10. Nakon 24 časa, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, obrađene ultrazvukom i korišćene za skrining rekombinantnih virusa. Skrining rekombinantnih plakova zasnivao se na postupku hibridizacije sa korišćenjem Nipah F specifične probe, koja je obeležena sa peroksidazom rena. Nakon četiri uzastopne runde prečišćavanja plaka, stvoren je rekombinant označen kao vCP2208 koji je hibridizacijom potvrđen kao 100% pozitivan za Nipah F insert i 100%) negativan za C5 ORF.

Primer 2:Ekspresija

[0106]Western blot kokošijeg pox Nipah G, vFP2200 ( SI. 6). Primarne CEF ćelije inficirane su sa vCP2199 (ALVAC C5 H6p Nipah G) i vFP2200 (kokošiji pox F8 H6p Nipah G) na MOI od 10 i inkubirani na 37°C u toku 24 časa. Ćelije i supernatant kulture su zatim sakupljeni. Proteini iz uzorka razdvojeni su na 10% SDS- PAGE gelu, preneti na Immobilon najlon membranu. Korišćeni su antiserum zamorčeta i hemiluminescentni sistem. Nipah G eksprimiran je u ćelijskom talogu sa vCP2199 i vFP2200. Nije se pojavio u supernatantu.

[0107]Western blot za ALVAC Nipah F, vCP2208 ( SI. 7A i 7B). Primarne CEF ćelije su inficirane sa CP2208. (ALVAC C5 H6p Nipah F) na MOI od 10 i inkubirani 24 časa. Supernatant je sakupljen i prečišćen. Ćelije su sakupljene i suspendovane u vodi da bi se lizirale. Lizat i supernatant odvojeni su preko 10% SDS- PAGE. Protein je prenet na najlon membranu i blokiran sa Western blokirajućim puferom. Ekspresija F proteina iz vCP2208 (ALVAC C5 H6p Nipah F) pokazana je preko antiseruma zamorčeta i sistema za detekciju hcmiluminiscencije. Korišćenjem sistema svinjskog antiseruma i peroksidaze rena takođe je pokazana ekspresija F proteina iz vCP2208, ali nižeg intenziteta.

[0108]Western blot ALVAC Nipah G, vCP2199 (SI. 6). Primarne CEF ćelije su inficirane sa vCP2199 (ALVACC5 H6p Nipah G) i vFP2200 (kokošiji pox F8 H6p Nipah G) na MOI od 10 i inkubirano na 37°C u toku 24 časa. Ćelije i supernatant kulture su zatim sakupljeni. Proteini iz uzorka su razdvojeni na 10% SDS- PAGE gelu, preneseni na Immobilon najlon membranu. Korišćeni su sistem antiseruma zamorčeta i hemilumonescencije. Nipah G bio je eksprimiran u ćelijskom talogu za vCP2199 i vFP2200. Nije se pojavio u supernatantu.

[0109]Western blot kokošijeg pox Fowlpox Nipah F. vFP2207 (SI. 7A i 7B). Primarne CEF ćelije bile su inficirane sa vFP2207 (kokošiji pox F8 H6p Nipah F) na MOI od 10 i inkubirane 24 časa. Supernatnant je sakupljen i prečišćen. Ćelije su sakupljene i suspendovane u vodi da bi se lizirale. Lizat i supernatant su razdvojeni preko 10% SDS- PAGE. Protein je prenesen na najlonsku membranu i blokiran sa Western blokirajućim puferom. Ekspresija F proteina iz vFP2207 (kokošiji pox F8 H6p Nipah F) pokazana je preko antiseruma zamorčeta i sistema za detekciju hemiluminiscencije. Korišćenjem sistema svinjskog antiseruma i peroksidaze rena takođe je pokazana ekspresija F proteina iz vFP2207, ali nižeg intenziteta.

Primer3: Serologija i zaštita

[0110]Šesnaest svinja je po principu slučajnosti raspoređeno u četiri grupe. Životinje grupe F imunizovane su sa IO<8>pfu/dozi VCP2208 koji eksprimira F protein Nipah virusa. Životinje grupe G imunizovane su sa 10<8>pfu/dozi VCP2199 koji eksprimira G protein Nipah virusa. Žv ivotinje grupa G+F imunizovane su sa smešom koja sadrži 10 8 pfu/dozi VCP2199 i 10<8>pfu/dozi VCP 2208 koji eksprimira redom G i F proteine Nipah virusa. Grupa životinja za imunizaciju bile su nevakcinisane kontrolne životinje.

[0111]Na svinje je primenjena injekcija intramuskularnim putem na Dan 0 i Dan 14. Svinje su imunizovane intranazalnom inokulacijom od 2.5xl0<5>pfu Nipah virusa na Dan 28. Sedam dana nakon imunizacije prisustvo virusa je identifikovano preko RT-PCR-a ili izolacijom virusa u različitim organima i u nazalnom brišu. Uzorci krvi sakupljeni su za dan DO, D7, D14, D21, D28, D29, D30, D31, D32, D34, i D35 nakon prve injekcije i titri antitela izmereni su preko IgG indirektnog ELISA ili seroneutralizacionog testa. Neutrališuća antitela su određena u testu redukcione neutralizacije mikrotitra plaka (mPRNT) kao što je prethodno opisano (H. V/eingartl et al. Can. J. Vet. Rrs. 2003, 67, 128-132), korišćenjem Vero V- 76 ćelija i 1 % pokrovnog sloja od karboksimetilceluloze. Komore sa 90 % redukcije plaka smatrane su pozitivnim na prisustvo neutralizujućih antitela protiv Nipah virusa. Podaci dobijeni iz ELISA testa i podaci za neutrališuće titre (NT) predstavljeni su u Tabeli 1. Kombinovani Nipah F/G indukovao je najviši neutrališući titar pre imunizacije, neposredno iza njega bila je G vakcina. F vakcina je imala niže vrednosti za neutrališuća antitela.

[0112]Test virusnih plaka: test virusnih plaka izveden je u 12-komornim pločama (Costar, Corning, NY) sa Vero 76 ili PT-K75 konfluentnim monoslojevima. Inokulum virusa (400 |il/komora) inkubiran je sa ćelijama 1 čas na 33°C, 5% CCb, i zatim zamenjen sa 2 ml 2% karboksimetilceluloze, natrijumove soli, srednje viskoznosti /DMEM (Sigma Chemical, St.Louis, MO)/2% FBS pokrovnim slojem, i inkubiran na 33°C, 5% CO?. Ćelije su fiksirane nakon 5 dana sa 4% formaldehida i obojene sa 0.5% kristal violeta/80 % metanol/PBS. RT-PCR je izveden na serumu/plazmi i samim PMBC uzorcima, prema V. Guillaume et al ,1. Virol. Method. 2004, 120, 229-237, primenom SmartCvcler (Cepheid), Quantitech kompleta (Qiagen), i prajmera i proba (Applied Biosvstems International) smeštenim unutar N gena. „Forvvard" prajmer GCA CTT GAT GTG ATT AGA (SEQ ID NO: 29) i „reverse" primer GGC AGT GTC GGG AGC TGT AA (SEQ ID NO: 30), smešteni su unutar N gena, dajući amplikon od 395 bp. RT-PCR standardizovana je sa N genom Nipah virusa kloniranim u pSHAME2a plazmid sa senzitivnošću od 300 kopija/reakciji u 100 ul uzorka. Uzorci koji su postali pozitivni na 35 ciklusa smatrani su negativnim.

[0113]Nipah virus je izolovan u veoma niskom titru u trigeminalnoj gangliji svinje #33 Gedan plak), #35 (jedan plak) i #36. U kontrolnim životinjama Nipah virus se mogao ponovo izolovati iz više tkiva sa do 10e3 pfu/ml: svinja #39 pozitivna za nosne školjke, dušnik, olfaktorne bulbuse, trigenimalnu gangliju, bronhijalni limfni čvor i podvilični limfni čvor (LN); svinja #40 pozitivna za nosne školjke, dušnik, olfaktorne bulbuse meninge, trigenimalnu gangliju, bronhijalni limfni čvor i podvilični limfni čvor i mozak. RT- PCR rezultati dati su u Tabelama 2 i 3. Slike predstavljaju prag broja ciklusa. RNK nije detektovana u plazmi, serumu ili PBMC svinja imunizovanih sa F/G vakcinom.

[0114]Ovi rezultati pokazuju jasnu zaštitu sa rekombinantom koji eksprimira F ili G proteine Nipah virusa i potpunu zaštitu sa kombinacijom F+G proteina Nipah virusa.

Primer 4:Unakrsna neutralizacija

[0115]Osamnaest svinja su rapoređene u četiri grupe po principu slučajnosti. Grupa F od 4 životinje imunizovana je sa 10 pfu/dozi vCP2208 koji eksprimira F protein Nipah virusa. Grupa G od 4 životinje imunizovana je sa 10<8>pfu/dozi vCP2199 koji eksprimira G protein Nipah virusa. Grupa G+F od 4 životinje imunizovana je sa smešom koja sadrži 10<8>pfu/dozi vCP2199 i 10 pfu/dozi vCP 2208 koji eksprimiraju redom G i F proteine Nipah virusa. Kao nevakcinisana kontrolna grupa, 6 životinja su prirodno inficirane sa Nipah virusima i praćena do 28 dana nakon infekcije (dpi). Ova grupa je nazvana "dugoročna infekcija".

[0116]Svinje iz grupa F, G i G+F primile su intramuskularnu injekciju na Dan 0 i Dan 14. Uzorci krvi uzeti su na D27 nakon vakcinacije (dpv ili dani posle vakcinacije) i titar antitela je meren testom seroneutralizacije. Neutrališuća antitela su određena u testu redukcione neutralizacije mikrotitra plaka (mPRNT) kao što je prethodno opisano (H. Weingartl et al. Can. J. Vet. Rrs. 2003, 67, 128-132), korišćenjem Vero V- 76 ćelija zasejanih u 96 komornu ploču sa 1.2xl0<5>ćelija/cm<2>(40,000 ćelija po komori) inkubiranih u 5% C0237°C, uz DMEM medijum obogaćenim sa 10% FBS.

[0117]100 uL serijskih dvostrukih razblaženja seruma (1/10-1/1280) imkubirano je 1 čas na 5% CO237°C sa 100 uL Hendra ili Nipah virusa podešenog da sadrži 1000 pfu na 100 uL. Sva razblaženja napravljena su u DMEM.

[0118]Nakon inkubacije 100 uL gorenavedene smeše prebačeno je na V76 ćelijski monosloj. Ploča sa inokulumom inkubirana je 1 čas na 5% CO237°C.

[0119]Nakon 1 časa inokulum je uklonjen i zamenjen sa 100 uL 2% rastvorom karboksimetilceluloze u DMEM kojoj je dodat 2%FBS. Ploče su inkubirane na 5% CO237°C u trajanju od 72 časa.

[0120]Povratna titracija za Nipah virus kao rezulatat je dala to da je radno razblaženje bilo 500 PFU/komori, i za Hendra virus: 625 PFU/komori.

[0121]Napomena: Serumi dobijeni od svinja vakcinisanih sa F proteinom dvostruko su razblaženi od 1/50 do 1/2400.

[0122]Komore sa 90 % redukcije plaka smatrane su pozitivnim na prisustvo neutrališućih antitela protiv Nipah virusa ili na prisustvo neutrališućih antitela protiv Hendra virusa. Podaci za neutrališuće titre predstavljeni su u Tabeli 4. Kombinovani Nipah F/G indukovao je sinergistički efekat u odnosu na proizvodnju antitela protiv Hendra virusa, koja nisu proizvedena tokom prirodne infekcije sa Nipah virusima (videti rezultate za grupu sa dugoročnom infekcijom). Pojedinačna G vakcina ili F vakcina nije indukovala ili je indukovala niži nivo neutrališućih antitela na Hendra viruse nego F+G vakcina. Ne postoji korelacija između nivoa titra protiv Nipah virusa i onih protiv Hendra virusa.

[0123]Pronalazak je dodatno opisan sledećim numerisanim paragrafima: 1. Ekspresioni ptičiji pox vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira glikoprotein Nipah virusa, gde je ptičiji pox ekspresioni vektor canarypox vektor. 2. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 1, gde je glikoprotein Nipah virusa vezujući (G) protein. 3. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 1, gde je glikoprotein Nipah virusa fuzioni (F) protein. 4. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 1, gde je glikoprotein Nipah virusa vezujući (G) protein i fuzioni (F) protein. 5. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 2, gde polinukleotid obuhvata osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 8943 do nukleotida 10751 iz SEQ ID NO: 1. 6. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 3, gde polinukleotid obuhvata osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 6654 do nukleotida 8294 iz SEQ ID NO: 1. 7. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 4, gde polinukleotid kodira peptid prema SEQ ID NO: 8. 8. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 2, gde polinukleotid kodira peptid prema SEQ ID NO: 7. 9. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 3, gde polinukleotid kodira peptid prema SEQ ID NO: 7 i peptid prema SEQ ID NO: 8. 10. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 5, gde polinukleotid obuhvata osnovnu nukleotidnu sekvencu od nukleotida 6654 do nukleotida 10751 iz SEQ ID NO: 1. 11. Ekspresioni ptičiji pox vektor iz pasusa 1 do 10, gde je ptičiji pox ekspresioni vektor oslabljeni ptičiji pox ekspresioni vektor.

12. Canarypox vektor iz pasusa 1 gde je canarypox vektor ALVAC.

13. Ekspresioni vektor, gde je ekspresioni vektor vCP2199.

14. Ekspresioni vektor, gde je ekspresioni vektor vCP2208.

15. Formulacija za dopremanje i ekspresiju glikoproteina Nipah virusa, gde formulacija sadrži vektor iz bilo kog od pasusa 1 do 16 i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac. 16. Formulacija iz pasusa 15, gde nosač, razblaživač ili inertni punilac olakšava transfekciju i/ili poboljšava očuvanje vektora. ] 7. Kompozicija za korišćenje za izazivanje imunog odgovora kod životinje, gde kompozicija sadrži vektor iz bilo kog od pasusa 1 do 14 u količini efikasnoj za izazivanje imunog odgovora. 18. Kompozicija za korišćenje za izazivanje imunog odgovora kod životinje, gde kompozicija sadrži ćeliju, gde ćelija sadrži vektor iz bilo kog od pasusa 1 do 14 u količini efikasnoj za izazivanje imunog odgovora. 19. Kompozicija za korišćenje za indukovanje imunološkog ili zaštitnog odgovora kod životinje, gde kompozicija sadrži vektor iz bilo kog od pasusa 1 do 14 u količini efikasnoj za izazivanje imunog odgovora. 20. Kompozicija za korišćenje za izazivanje imunog ili zaštitnog odgovora kod životinje, gde kompozicija sadrži ćeliju, gde ćelija sadrži vektor iz bilo kog od pasusa 1 do 14 u količini efikasnoj za izazivanje imunog odgovora.

21. Kompozicija iz bilo kog od pasusa 17 do 20, gde je životinja svinja.

22. Kompozicija za korišćenje u prevenciji prenošenja Nipah virusa između prve i druge životinje, koja sadrži kompoziciju iz bilo kog od pasusa 17 do 20 gde je životinja iz bilo kog od pasusa 17 do 20 prva životinja.

23. Kompozicija iz pasusa 22, gde je prva životinja svinja.

24. Kompozicija iz pasusa 22 ili 23, gde je druga životinja čovek.

25. Kompozicija iz pasusa 22 ili 23, gde je druga životinja mačka ili pas.

33. Komplet koji sadrži vektore iz bilo kog od pasusa 1 do 14 ili formulacije iz bilo kog od pasusa 15 ili 16 i uputstva za korišćenje kompleta na način koji je definisan u bilo kom od pasusa 17-25.

Claims (10)

1. Ekspresioni ptičiji pox vektor, naznačen time što sadrži polinukleotid koji kodira glikoprotein Nipah virusa, gde je ptičiji pox ekspresioni vektor canarypox vektor.

2. Ekspresioni ptičiji pox vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je glikoprotein Nipah virusa vezujući (G) protein.

3. Ekspresioni ptičiji pox vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je glikoprotein Nipah virusa fuzioni (F) protein.

4. Ekspresioni ptičiji pox vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je glikoprotein Nipah virusa vezujući (G) protein i fuzioni (F) protein.

5. Ekspresioni ptičiji pox vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 4, naznačen time što je ptičiji pox ekspresioni vektor oslabljeni ptičji pox ekspresioni vektor.

6. Canarypox vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što je canarypox vektor ALVAC.

7. Ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je ekspresioni vektor vCP2199.

8. Ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 1 naznačen time što je ekspresioni vektor vCP2208.

9. Formulacija za primenu i ekspresiju glikoproteina Nipah virusa, naznačen time što formulacija sadrži vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, razblaživač ili inertni punilac.

10. Formulacija prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što nosač, razblaživač ili inertni punilac olakšava transfekciju i/ili poboljšava očuvanje vektora.