[go: up one dir, main page]

RO118887B1 - Metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale - Google Patents

Metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale Download PDF

Info

Publication number
RO118887B1
RO118887B1 RO98-01216A RO9801216A RO118887B1 RO 118887 B1 RO118887 B1 RO 118887B1 RO 9801216 A RO9801216 A RO 9801216A RO 118887 B1 RO118887 B1 RO 118887B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
resistance
gene
vector
efficacy
determining
Prior art date
Application number
RO98-01216A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel J. Capon
Christos John Petropoulos
Original Assignee
Virologic, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virologic, Inc. filed Critical Virologic, Inc.
Publication of RO118887B1 publication Critical patent/RO118887B1/ro

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la o metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale, care constă în determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei la medicamentele antivirale, prin etapele: a) se introduce un vector test de rezistenţă care conţine un segment derivat care cuprinde o secvenţă virală funcţională sau nefuncţională de la un pacient şi o genă indicator într-o celulă gazdă; b) se cultivă celule gazdă din etapa a); c) se măsoară expresia indicatorului într-o celulă gazdă, în care expresia indicatorului este dependentă de segmentul derivat de la pacient; d) se compară expresia indicatorului din etapa c) cu expresia indicatorului măsurate când etapele a)...c) sunt realizate în absenţa medicamentului antiviral. ŕ

Description

Invenția se referă la o metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței omului la medicamente.
Rezistența virală la medicamente
Utilizarea compușilor antivirali pentru chemoterapia și chemoprofilaxia bolilor virale este o dezvoltare relativ nouă în domeniul bolilor infecțioase, în special, când se compară cu cel mai mult de 50 ani de experiență cu antibiotice antibacteriene. Crearea compușilor antivirali nu este simplă deoarece, virusurile prezintă un număr de probleme unice. Virusurile trebuie să se înmulțească intracelular și adesea folosesc enzimele, macromoleculele și organele celulei gazdă pentru sinteza particulelor virale. Prin urmare, siguranța și eficiența compușilor antivirali trebuie să fie capabilă să facă discriminare cu un grad înalt de eficiență între funcțiile celulare și cele specifice virusului. Suplimentar, datorită naturii replicării virusului, evaluarea in vitro a sensibilității izolatelor virale față de compuși antivirali este realizată întrun sistem de cultură complex constând din celule vii (de exemplu, cultură de țesut). Rezultatele de la astfel de sisteme de analiză variază în mare măsură în funcție de tipul de celule din cultura de țesut care sunt folosite și de condițiile analizei. în ciuda acestor complexități, 9 medicamente sunt aprobate pentru terapia SIDA, 5 inhibitori de transcriptază inversă AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, 1 inhibitor non nucleozidic al transcriptazei inverse, nevirapină, și 3 inhibitori de protează saquinavir, ritonavir și indinovir și s-au dezvoltat recent câțiva candidați suplimentari pentru medicamente antivirale cum ar fi, nelfinavir, delaviridine, VX-478 și 1592.
Rezistența virală la medicament este o problemă substanțială dată fiind rata ridicată a replicării virale și frecvențele mutației. Mutante rezistente la medicament sunt recunoscute inițial pentru poxvirusuri cu tiosemicarbazonă (Appleyard și May (1966) Brit.J.Exptl.Pathol. 47,144-51), pentru poliovirus cu guanidină (Melnick și colab. (1961) Science 134,557), pentru virusul influenza A cu amantadină (Oxford și colab. (1970) Nature 226, 82-83; Cochran și colab. (1965) Ann. NY Acad Sci 130, 423-429) și pentru virus herpes simplex cu iododeoxiuridină (Jawetz și colab. (1970) Ann. NY Acad Sci 173, 282-291). Până în prezent s-au identificat aproximativ 75 de mutații de rezistență la medicamente ale HIV (Mellors și colab., (1995) Intnl. Antiviral News supliment și Condra, J.H. și colab. (1996) J.Virol. 70, 8270-8276).
Genomurile mici și eficiente ale virusurilor se pretează la investigarea intensivă a geneticilor moleculare, structurii și ciclurilor replicative ale celor mai importanți patogeni virali umani. Ca o consecință, sunt caracterizate, atât pentru activitatea, cât și pentru rezistența la medicamente antivirale mai precis decât au fost cele pentru oricare altă clasă de medicamente. (Richman (1994) Trends Microbiol. 2, 401-407). Probabilitatea că vor apare mutante rezistente este o funcție a cel puțin 4 factori: 1) frecvența mutației virale; 2) mutabilitatea intrinsecă a sitului țintă viral față de un antiviral specific; 3) presiunea selectivă a medicamentului antiviral; și, 4) mărimea și rata replicării virusului. Considerând primul factor, pentru virusurile ARN mono bandă, replicarea genomului care este lipsit de un sistem de corectare, frecvențele mutației sunt de aproximativ 3x10'5 pe perechea de baze pe ciclu replicativ (Holland și colab. (1992) Curr. Topics Microbiol Immunol. 176, 1-20; Mansky și colab. (1995) J.Virol. 69, 5087-94; Coffin (1995) Science 267, 483-489). Astfel, un singur genom de 10 kilobaze, asemenea celui al virusului imunodeficienței umane (HIV), este de așteptat să conțină în medie o mutație pentru fiecare 3 genomi virali urmași. La fel, cel de-al doilea factor, mutabilitatea intrinsecă a sitului viral țintă ca răspuns la un agent antiviral specific afectează semnificativ probabilitatea apariției mutantelor rezistente. De exemplu, zidovudina (AZT) selectează pentru mutații în transcriptaza inversă a HIV mai ușor in vitro și in vivo decât o face alt analog aprobat de timidină d4T (stavudină).
RO 118887 Β1
O consecință, probabil inevitabilă a acțiunii unui medicament antiviral este că el conferă suficientă presiune selectivă asupra replicării virusului pentru selectarea mutantelor rezistente la medicament (Herrmann și colab. (1977) Ann. NY Acad Sci 284, 632-7). Consi- 50 derând cel de-al treilea factor, odată cu prelungirea duratei de expunere la medicament, presiunea selectivă asupra replicării populației de virus crește pentru a iniția apariția mai rapidă a mutantelor rezistente la medicament. De exemplu, doze mai ridicate de AZT tind să selecteze viruși rezistenți la medicament mai rapid decât o fac doze mai scăzute (Richman și colab. (1990) J.AIDS. 3, 743-6). Această presiune selectivă pentru mutante rezistente 55 crește probabilitatea ca asemenea mutante să apară atâta timp, cât sunt susținute niveluri semnificative ale replicării virusului.
Cel de-al patrulea factor, mărimea și viteza înmulțirii populației virale, are consecințe majore asupra probabilității apariției mutantelor rezistente. Numeroase infecții virale sunt caracterizate prin niveluri ale înmulțirii virusului cu viteze ridicate ale fluctuației virusului. 60 Această afirmație este adevărată, în special, în cazul infecțiilor cronice cu virusul HIV precum și virusurile hepatitei B și C. Probabilitatea apariției rezistenței la AZT crește la pacienții infectați cu HIV odată cu reducerea numerelor limfocitelor CD4 care sunt asociate cu niveluri în creștere ale replicării HIV (Ibid).
Niveluri mai ridicate ale virusului cresc probabilitatea mutantelor preexistente. S-a 65 dovedit că apariția unei populații rezistente are ca urmare supraviețuirea și proliferarea selectivă a unei subpopulații existente anterior care apare întâmplător în absența unei presiuni selective. Toate virusurile au o linie de bază a ratei mutației. La calcule de aproximativ 101° virioni noi care sunt generați zilnic în timpul infecției cu HIV (Ho și colab. (1995) Nature 373, 123-126), o rată de mutație de 10-4 Ia 10‘5 pe nucleotidă garantează preexistența a 70 aproape oricărei mutații la orice moment de timp în timpul infecției cu HIV. Dovada este că acumularea mutantelor rezistente la medicament se face de fapt în subpopulațiile existente de indivizi infectați cu HIV (Najera și colab. (1994) AIDS Res Hum Retroviruses 10,1479-88; Najera și colab. (1995) J.Virol, 69, 23-31). Preexistența mutantelor picornavirus rezistente la medicamente la o rată de aproximativ 10’5 este, de asemenea, bine documentată (Ahmad 75 și colab. (1987) Antiviral Res. 8, 27-39).
Virusul imunodeficienței umane (HIV)
Sindromul deficienței imuno dobândite (SIDA) este o boală umană fatală, considerată în general, a fi una dintre cele mai serioase boli care a afectat vreodată umanitatea. Global, numărul indivizilor umani infectați cu virusul imunodeficienței umane (HIV) și cazurile de 80 SIDA cresc continuu și eforturile de a stăpâni cursul, crezut uneori pandemic, sunt de eficiență limitată. în prezent sunt recunoscute două tipuri ale HIV: HIV-1 și HIV-2. în 31 decembrie 1994, au fost raportate 1025073 cazuri SIDA la Organizația Mondială a Sănătății. Aceasta este numai o parte a cazurilor totale, și OMS estimează la sfârșitul lui 1994, lăsând diagnozele insuficiente, raportările insuficiente și întârzierile în raportare, și bazat pe numărul 85 estimat al infecțiilor HIV, că au existat peste 4,5 milioane de cazuri cumulate de SIDA în întreaga lume (Mertens și colab. (1995) AIDS 9 (Suppl A), S259-S272). Deoarece HIV a început să se răspândească în America de Nord, Europa și Africa Subsahariană, se estimează că peste 19,5 milioane de bărbați, femei și copii sunt infectați (Ibid). Una dintre trăsăturile distinctive pandemice SIDA a fost răspândirea sa globală în cel puțin 20 ani, cu 90 circa 190 țări care raportează în prezent cazuri SIDA. Estimările infecției HIV în întreaga lume făcute de OMS sunt șocante. Totalul cumulativ estimat al cazurilor adulților SIDA prin anul 2000 este în jur de un milion. în anul 2000, numărul cumulativ al deceselor legate de HIV la adulți este anticipat să crească la mai mult de 8 milioane din totalul curent, în jur de milioane. 95
RO 118887 Β1
I
HIV-1 și HIV-2 sunt retrovirusuri acoperite cu un genom diploid care are 2 molecule ARN identice. Organizarea moleculară a HIV este (5') U3-R-U5-gag-po//pept/d-env-U3-R-U5 (31) cum este arătat în fig. 1a. Secvențele U3, R, și U5 formează repetițiile terminale lungi (LTR) care sunt elemente regulatoare care inițiază expresia genelor virale și uneori, în apropierea genelor celulare la gazde infectate. Regiunile interne ale ARN-ului viral codifică pentru proteine structurale: gag (p55, p17, p24 și proteinele miezului p7), po/(protează p10, p66 și revers transcriptază p51 și integraza p32) și env (glicoproteinele învelișului gp120 și gp41). Gag codifică pentru o poliproteină precursor care este clivată printr-o protează virală în 3 sau 4 proteine structurale; po/codifică pentru transcriptază inversă (RT) și protează și integrază virală; env codifică pentru transmembrană și glicoproteina exterioară a virusului. Genele gag ș i po/sunt exprimate ca ARN genomic în timp ce gena env este exprimată ca un ARN subgenomic îmbinat. în plus, față de gena env există alte gene HIV produse prin îmbinare de ARN-uri subgenomice care contribuie la replicarea și activitățile biologice ale virusului. Aceste gene includ tat care codifică o proteină ce activează expresia genelor virale și unor gene celulare; revcare codifică o proteină ce inițiază expresia mARN-urilor neîmbinate sau îmbinate singure; nef care codifică o proteină miristilată ce pare să moduleze producția virală în anumite condiții; vif care codifică o proteină ce afectează capacitatea particulelor virale de a infecta celule țintă, dar nu pare să afecteze expresia virală sau transmiterea prin contact celulă-la-celulă; vpr care codifică o proteină asociată virionului; și vpu care codifică o proteină ce pare să inițieze eliberarea extracelulară a particulelor virale.
Nici o boală nu exemplifică mai bine problema rezistenței virale la medicamente decât SIDA. Izolate, HIV rezistente la medicamente au fost identificate pentru inhibitori nucleozidici și non-nucleozidici ai transcriptazei inverse și pentru inhibitori ai proteazei. Apariția izolatelor HIV rezistente la AZT nu este surprinzătoare deoarece AZT și alți inhibitori ai transcriptazei inverse doar reduc replicarea virusului prin circa 90%. Rate indicate ale replicării virusului în prezența presiunii selective a tratamentului medicamentos asigură condiții ideale pentru apariția mutantelor rezistente la medicament. Pacienți la ultimele stadii ale infecției care au nivele mai ridicate ale replicării virusului dezvoltă virus rezistent cu tratament AZT mai repede decât cei la stadii timpurii ale infecției (Richman și colab. (1990) J AIDS 3, 743-6). Descrierea inițială a apariției rezistenței la AZT a identificat reduceri progresive și în etape în sensibilitatea la medicament (Larder și colab. (1989) Science 243, 1731-1734). Aceasta s-a explicat prin recunoașterea a numeroase mutații în gena pentru transcriptază inversă care au contribuit la sensibilitatea redusă (Larder și colab. (1989) Science 246,1155-1158). Aceste mutații au avut o contribuție însumată sau chiar sinergică lafenotipul cu sensibilitate redusă (Kellam și colab. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89,19341938). Achiziția cumulativă, de asemenea mutații, a avut ca urmare descreșterea progresivă a sensibilității. Efecte similare s-au observat cu inhibitori non-nucleozidici ai transcriptazei inverse (Nunberg și colab. (1991) J Virol 65, 4887-4892; Sardanna și colab. 81992) J Biol Chem 267, 17526-17530). Studii ale inhibitorilor proteazei au dovedit că selecția tulpinilor HIV cu sensibilitate redusă la medicamente are loc în săptămâni (Ho et al. (1994) J Virol 68, 2016-2020; Kaplan și colab. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 5597-5601). Deși, studii recente au demonstrat inhibitorii de protează ca fiind mai puternici decât inhibitorii transcriptazei inverse, totuși, s-a dezvoltat rezistență. (Condra și colab. Id.And Report 3rd Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, March 1996). Niveluri subterapeutice de medicament, cauzate de dozare redusă, interacțiuni medicamentoase, absorbție insuficientă sau bioac-cesibilitate redusă datorată altor factori, sau întreruperile auto-impuse de medicație, toate permit replicarea virală crescută și oportunitate crescută pentru mutație și rezistență (Id).
RO 118887 Β1
Presiunea selectivă a tratamentului medicamentos permite dezvoltarea mutantelor preexistente. Cu replicarea virală continuă în absența activității medicamen-toase antivirale 145 complet supresivă, achiziția cumulativă a numeroase mutații are loc în timp, așa cum s-a descris pentru AZT și inhibitori de protează ai HIV. în schimb s-au observat mutante virale cu rezistență multiplă la diferite medicamente (Larder și colab. (1989) Science 246,11551158; Condra și colab. (1995) Nature 374, 569-71). Cu apariția inevitabilă a rezistenței în numeroase infecții virale, la fel ca HIV de exemplu, trebuie să fie dezvoltate strategii pentru 150 optimizarea tratamentului în fața populațiilor rezistente de virus. Stabilirea contribuției rezistenței la medicament la eșecul medicamentului este o problemă dificilă deoarece pacienții care sunt mai probabili să dezvolte rezistență la medicament au alți factori care produc confuzie ceea ce predispune la o prognoză slabă (Richman (1994) AIDS Res Hum Retroviruses 10, 901-905). în plus, pacienții conțin amestecuri de virusuri cu sensibilități diferite. 155
Hepatita B (HBV)
HBV este agentul cauzal pentru hepatita cronică și acută, care afectează circa 200 milioane de pacienți în întreaga lume. Zuckerman A.J. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hygiene (1982) 76,711-718. Infecția HBV dobândită în viața adultă este adesea inaparentă clinic, și majoritatea adulților infectați acut se recuperează complet de la boală și eliminarea virusului. 160 Rareori, totuși, boala acută a ficatului poate să fie, atât de severă, încât pacientul moare de hepatită violentă. O fracțiune mică, probabil 5 până la 10% dintre adulții infectați acut, devin infectați persistent prin virus și dezvoltă boală cronică a ficatului de severitate variabilă. Infecția HBV transmisă neonatal, este însă rareori eliminată, și mai mult de 90% din asemenea copii devin infectați cronic. Deoarece HBV este răspândit în mod obișnuit de la mama 165 infectată la copilul nou născut în zonele populate intens ale Africii și Asiei, câteva sute de milioane de oameni din întreaga lume sunt infectați persistent prin HBV pentru cea mai mare parte a vieții lor și suferă în grade diferite de boală cronică a ficatului, care crește mult riscul lor de a dezvolta ciroză și carcinom hepatocelular (HCC). Riscul de HCC este crescut de 100 de ori la pacienți cu hepatită cronică, și riscul de HCC în timpul vieții la bărbații infectați la 170 naștere se apropie de 40%. Beasley RP et al., Lancet (1981) 2,1129-1133. Pentru conformitate, o mare fracțiune a populației lumii suferă și moare de aceste ultime complicații ale infecției HBV. Dezvoltarea medicamentelor anti-HBV a avut mult de așteptat, fiind împiedicată de domeniul extrem de îngust al gazdelor HBV; HBV se înmulțește în principal în ficatul uman și de cimpanzeu și nu în animale de experiment sau culturi cultivate. Tiollais, P și 175 colab. Nature (London) (1985) 317, 489-495. Virusul Hepatitei B este un virus ADN cu o structură genomică compactă; în ciuda ADN-ului său mic, circular, de 3200 baze perechi, ADN HBV codifică 4 seturi de produse virale și are o structură multiparticulă complexă. HBV atinge economia sa genomică prin bazarea pe o strategie eficientă a proteinelor codificate de la 4 gene suprapuse: S, C, P și X. HBV este unul dintr-o familie de virusuri animale, 180 hepadnvirusuri, și este clasificat ca hepadnvirus de tip 1. Virusuri similare infectează anumite specii de marmotă din America de Nord, veverițe de sol și copaci și rațe de Pekin. Toate hepadnvirusurile, inclusiv HBV, au împreună următoarele caracteristici: 1) există 3 forme morfologice distincte, 2) toți membrii au proteine care sunt omologe funcțional și structural antigenilor învelișului și nucleocapsidei ai HBV, 3) ele replică în ficat, dar pot exista de 185 asemenea în situri extrahepatice, 4) ele conțin o ADN polimerază endogenă cu activități de ADN polimerază dependente, atât de ARN, cât și de ADN, 5) genomii lor sunt parțial molecule de ADN circular dublu bandă, 6) ele sunt asociate cu hepatită acută și cronică și carcinom hepatocelular și 7) replicarea genomului lor trece printr-un ARN intermediar care este transcris invers în ADN folosind activitatea ADN polimerază endogenă dependentă de 190 ARN într-un mod analog celui observat la retrovirusuri. în nucleul celulelor infectate ale ficatului, ADN-ul parțial dublu bandă este convertit la un ADN dublu bandă circular închis
RO 118887 Β1 covalent (cccADN) de ADN polimeraza dependentă de ADN. Transcripția ADN-ului viral este realizată de o ARN polimeraza a gazdei și dă naștere la câteva transcripte ARN care diferă în siturile lor de inițiere dar toate se termină la un semnal de poliadenilare comun. Cele mai lungi dintre aceste ARN-uri acționează ca pregenom pentru virus precum și mesaj pentru unele proteine virale. Proteinele virale sunt translate de la ARN-urile pregenomice, și proteinele și pregenomul ARN sunt organizate în virioni și secretate din hepatocite. Deși, HBV este dificil de cultivat in vitro, câteva celule s-au transfectat cu succes cu ADN HBV rezultând producerea in vitro a particulelor HBV.
Există 3 forme de particule ale HBV: particule de 22 nm neinfecțioase, care apar fie ca forme sferice, fie ca forme filamentoase lungi, și particule sferice de 42 nm cu cochilie dublă care reprezintă virionul intact infecțios de hepatită B. Proteina învelișului, HbsAg, este produsul genei S a HBV și se găsește pe suprafața exterioară a virionului și pe structurile mai mici sferice și tubulare. în amontele cadrului deschis de citire al genei S sunt cadrele deschise de citire ale genei pre-S, pre-S1 și pre-S2, care codifică pentru produsele genei pre-S, incluzând receptorii pe suprafața HBV pentru albumina serică umană polimerizată și siturile de atașare pentru receptori hepatocit. Virionul intact 42nm poate fi distrus prin detergenți blânzi și sunt izolate particule de 27nm ale miezului nucleocapsidei. Miezul este compus din două proteine ale nucleocapsidei codificate de gena C. Gena C are 2 codoni de inițiere care definesc o regiune miez și o regiune premiez. Antigenul principal exprimat pe suprafața miezului nucleocapsidei este codificat de regiunea miez și este denumit antigenul miez al hepatitei B (HbcAg). Antigenul e al hepatitei B (HbeAg) este produs de la aceiași genă C prin inițiere la ATG-ul premiezului.
De asemenea, organizată în miezul nucleocapsidei este o ADN polimerază, care dirijează replicarea și repară ADN HBV. ADN polimeraza este codificată de gena P, a treia și cea mai mare dintre genele HBV. Enzimă are ambele activități ADN polimerază dependentă de ADN și transcriptază inversă dependentă de ARN și este, de asemenea, necesară pentru encapsidarea ARN-ului pregenomic. A patra genă, X, codifică pentru o proteină mică neasociată particulei care s-a dovedit a fi capabilă de transactivarea transcripției ambelor gene, virală și celulară.
Cu toate că replicarea HBV este foarte bine înțeleasă, etapele timpurii din infecția HBV nu au fost bine definite. Receptorii celulari sau siturile de atașare pe virioni nu pot fi studiate în analize de cultură de țesut corespunzătoare. într-un efort pentru rezolvarea acestei probleme, s-au dezvoltat anumite linii de celule, celulele hepatoblastomice umane Huh (HB 611) (Ueda, K. Și colab., Virology (1989) 169, 213-216) și celule HepG2 (Galle, P.R. și Theilmann, L.Arzneim-Forsch. Drug Res. (1990) 40,1380-1382) pentru evaluarea medicamentelor anti-HBV.
De curând, atenția s-a concentrat asupra variantelor moleculare ale HBV. în genomul HBV se întâlnesc variații, și izolatele clinice ale HBV care nu exprimă proteine virale s-au atribuit mutației în localizări individuale sau în numeroase gene. De exemplu, au fost descrise variante care au pierdut proteinele nucleocapsidei, proteinele învelișului, sau ambele. Au atras atenția două mutante. Prima este găsită la unii pacienți cu infecție HBV cronică severă. Acești pacienți s-au dovedit a fi infectați cu o mutantă HBV care conține o modificare în regiunea premiez care face virusul incapabil să codifice HbeAg. Mutația cea mai comună la astfel de pacienți este o singură substituție de bază, de la G la A, care se întâlnește în al doilea spre ultimul codon al pre-genei C la nucleotida 1896. Această substituție rezultă în înlocuirea codonului triptofan TGG printr-un codon stop (TAG), care împiedică translarea HbeAg. Pacienții cu astfel de mutații premiez care sunt incapabile să secrete HbeAg tind să aibă o boală severă a ficatului care progresează rapid la ciroză și care nu răspunde cu ușurință la terapia antivirală.
RO 118887 Β1
A doua categorie de mutante HBV constă în mutante de fugă, în care se întâlnește o singură substituție aminoacidă, de la glicină la arginină, la poziția 145 a imunodominantului, un determinant comun la toate subtipurile HbsAg. Această schimbare în HbsAg conduce la o schimbare conformațională critică care are ca urmare o pierdere a activității de neutralizare prin anticorp anti-HBs.
Analize pentru rezistență virală accesibile în prezent
Definiția sensibilității virale la medicamente este înțeleasă, în general, ca fiind concentrația de agent antiviral la care un procent dat al replicării virale este inhibat (de exemplu, IC50 pentru un agent antiviral este concentrația la care 50% din replicarea virală este inhibată). Astfel, o descreștere în sensibilitatea virală la medicament este semnul distinctiv că un antiviral a fost selectat pentru virusul mutant care este rezistent la acel medicament antiviral. Rezistența virală la medicament este definită în general, ca o descreștere în sensibilitatea virală la medicament la un pacient dat în timp. în contextul clinic, rezistența virală la medicament este evidențiată prin eficiența mai mică a medicamentului antiviral sau eficiența clinică de durată mai scurtă la un pacient.
în prezent, instrumentele accesibile pentru cercetător și clinician pentru cercetarea sensibilității și rezistenței antivirale a medicamentului sunt inadecvate. Testul clasic pentru determinarea rezistenței și sensibilității HIV față de agent antiviral este complex, consumator de timp, costisitor, și este riscant prin aceea că necesită cultura virusului patogen de la fiecare și fiecare alt pacient (Barre-Sinoussi și colab.,(1983) Science 224, 497-500). în această procedură, celule mononucleare din sânge periferic de la pacient (PMBC) sunt inițial cultivate pentru a stabili un stoc viral al mulțimii cunoscute a infecției (moi), și stocul viral astfel produs se folosește pentru infectarea unei linii celulare indicatoare țintă. Explozia rezultată a înmulțirii virale este apoi măsurată tipic în prezența și absența unui agent antiviral prin determinarea producției antigenelor virali în cultura de celule. Asemenea teste pot fi realizate numai pe baza îndemânării investigatorilor experți, și pot să ia 2 la 3 luni pentru realizare la un cost de mii de dolari pe pacient fiecare agent testat. Mai mult, deoarece nu se pot stabili stocuri virale de moi suficient de la PBMC de la unii pacienți cu HIV, testul clasic pentru rezistență HIV nu poate fi realizat asupra tuturor indivizilor infectați cu HIV. Mai semnificativ, în cursul generării stocului viral prin pasajul virusului în cultură, caracteristicile virusurilor însuși se pot schimba și prin urmare pot să ascundă natura adevărată a virusului pacientului. Astfel, aplicarea testului clasic a fost limitată la strângerea de informații despre tendințele din experimentele clinice și nu au fost accesibile pentru o analiză prospectivă care s-ar putea folosi pentru a ajusta terapia antivirală pentru un pacient dat. în ciuda acestor limitări, testul clinic are două calități importante: el este specific pentru agentul aflat în evaluare și furnizează informație asupra fenotipului virusului propriu pacientului, ceea ce este, concentrația de medicament care inhibă 50% din replicarea virală (IC50).
Au fost făcute un număr de încercări pentru îmbunătățirea testului clasic, dar fiecare are neajunsuri serioase. Primul tip dintre aceste teste se poate descrie ca nespecific prin aceea că el nu determină caracteristicile virusului propriu pacientului la toți, ci mai degrabă dă o măsură independentă a cursului infecției. Printre aceste teste sunt cele care măsoară numărul celulelor T CD4+, semnul distinctiv al progresării bolii HIV (Goedert și colab., (1987) JAMA 257, 331-334), cele care măsoară niveluri de antigen viral (de exemplu, antigen miez p24 (Allain și colab., (1987) N. Engl. J. Med. 317,1114-1121)), și cele care măsoară niveluri de ARN și ADN viral (de exemplu, reacția polimerazică de catenă cantitativă și analize ale ADN ramificat (Piatak și colab. (1993) Science 259,1749-1754; Urdea (1993) Clin. Chem. 39, 725-726)). Dezavantajul principal al unor astfel de teste nespecifice este că ele nu dau nici o informație asupra rezistenței virale per se, ci mai degrabă încearcă să tragă o concluzie din cursul aparent al bolii pacientului. Suplimentar, numeroși factori, alții decât rezistența
245
250
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 118887 Β1 virală la medicament pot să afecteze nivelul parametrilor în considerație. Cu alte cuvinte numărul celulelor T CD4+, nivelurile de antigen p24 și nivelurile ARN-ului viral HIV pot să varieze din motive altele decât rezistența la medicament în timpul cursului bolii.
Alt test clasic modificat amplifică gena virală care este ținta agentului antiviral. în acest test gena virală de la un pacient dat este amplificată și apoi recombinată într-o clonă provirală biologic activă a HIV. Această clonă provirală este transfectată în celule umane pentru a genera un stoc viral de noi cunoscut care apoi se poate utiliza pentru infectarea unei linii celulare indicatoare țintă. în maniera testului clasic, cineva determină apoi producerea de antigene virale în prezența sau absența agentului antiviral. O asemenea analiză descrisă de Kellamm și Larder (1994) Antimicrobial Agents and Chemo. 38, 23-30, implică amplificarea PCR a secvențelor care codifică transcriptaza inversă de la un pacient, care se introduc apoi într-o clonă ADN provirală prin recombinare omologă pentru reconstituirea genomului viral complet, inclusiv gena transcriptazei inverse care a fost deletată. Virusul recombinant rezultat produs de la asemenea clone este cultivat apoi în linii de celule T, și se testează sensibilitatea la medicament în analiza reducerii plăcii HeLa CD4'. Totuși, această clasă de teste necesită încă cultivarea virusului pentru determinarea rezistenței la medicament și este astfel dificil, de lungă durată și costisitor și necesită investigator de laborator care să manevreze culturi virale periculoase. Mai mult, variația care însoțește virusul dat în timpul procesului de cultură poate avea ca urmare rezultate necorespunzătoare, imprecise.
O a doua clasă de teste încearcă să asigure informația specifică asupra genotipului HIV al pacientului, cu scopul final al corelării acestei informații genotipice cu fenotipul de rezistență la medicament al virusului. într-adevăr, substituții aminoacide specifice în gene virale cum ar fi, genele transcriptază inversă și protează s-au dovedit a fi corespondente la niveluri specifice ale rezistenței virale la inhibitori ai transcriptazei inverse și respectiv proteazei (Larder și colab. (1994) J. Gen. Virol. 75, 951-957). Un neajuns major asociat cu o astfel de analiză este acela că ea este indirectă și poate fi deranjată de mutații secundare care s-au dovedit a se adăuga la sau contra efectelor primei mutații. Este un interjoc complex al tuturor resturilor aminoacide dintr-o polipeptidă virală dată, care în final determină activitatea produsului genei în prezența sau absența unui inhibitor. Astfel, ar fi necesară o bază de date de proporții vaste și nepractice pentru a interpreta starea rezistenței sau sensibilității unui genotip dat, fiind numărul schimbărilor aminoacide potențiale din genomul HIV.
O a treia clasă de teste, o analiză dezvoltată recent pe bază bacteriană face uz la o genă virală donată molecular (specific, gena transcriptază inversă) care a fost introdusă într-un vector de expresie bacterian. La transformarea tulpinilor speciale de E.coli care sunt deficitare în AdN polimeraza I bacteriană, gena transcriptază inversă donată poate ajuta creșterii bacteriei în condiții de creștere selectate. în obținerea E.coli dependentă de transcriptaza inversă pentru creșterea ei, cineva poate stabili efectele unor anumiți inhibitori ai transcriptazei inverse asupra activității genei virale (Cerere PCT WO 95/22622). Un neajuns major cu această abordare, este că totuși, inhibitorul poate fi transportat prin membrana celulară și metabolizat diferit de bacterii față de cum este de o celulă umană, și ca urmare concentrația reală a inhibitorului metabolic al revers transcriptazei poate fi cu mult diferită în bacterie decât ar fi într-o celulă umană țintă relevantă a invenției, sau adevăratul inhibitor poate fi complet absent. într-adevăr, se cunoaște că metabolismul nucleozidei diferă mult între celulele umane și bacteriene. Alt neajuns semnificativ al acestei abordări este că analiza măsoară activitatea ADN polimerazei dependente de ADN a transcriptazei inverse și nu și a ADN polimerazei dependentă de ARN, transferul de bandă sau activitățile ARNazei H a transcriptazei inverse. Astfel, un compus antiviral care acționează, cel puțin în parte, asupra acestor alte activități nu va avea activitatea sa inhibitoare deplină în această analiză.
RO 118887 Β1 încă o altă dificultate cu această abordare este că este un test bazat pe creștere; astfel, 340 dacă un inhibitor (de exemplu, un analog nucleozidic) blochează de asemenea creșterea bacteriană pentru motive altele decât efectele sale asupra transcriptazei inverse, el nu poate fi testat adecvat în acest sistem.
Vectori virali
Vectori virali, și mai precis vectori retrovirali s-au folosit pentru modificarea celulelor 345 mamifere datorită eficienței ridicate cu care vectori retrovirali infectează celule țintă și se integrează în genomul celulei țintă. Datorită capacității lor de a se însera în genomul celulelor mamifere s-a concentrat multă atenție asupra vectorilor retrovirali pentru folosire în terapia genetică. Detalii asupra vectorilor retrovirali și utilizării lor se pot găsi în brevete și publicații de brevete incluzând cererea de brevet european EPA 0178220; brevetele US 350 4405712, 4980289 și 5439809; cererea PCT WO 92/07943 și WO 89/11539. Expunerile din aceste brevete și publicații sunt încorporate aici ca referințe.
O consecință a importanței privind tehnologia vectorului retroviral a fost dezvoltarea liniilor celulare organizate. O problemă majoră cu folosirea retrovirusurilor este posibilitatea răspândirii retrovirului competent prin replicare. Există astfel o nevoie de a produce vectori 355 ajutători care să nu poată fi prelucrați în virioni. Ca urmare, s-au dezvoltat vectori deficienți în organizare sau linii de celule organizate. Detalii asupra vectorilor deficienți ca organizare și liniilor de celule organizate pot fi găsite în brevete și publicații de brevet, incluzând brevetele US 5124263, 4650764,4861719 și 5278056 ; cererea de brevet european cu publicația nr.0386882; cererile PCT WO 91/19798, WO 88/08454 și WO 93/03143, ale 360 căror descrieri sunt încorporate aici ca referință.
Invenția se referă la metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței omului la medicamente care constă în aceea că determină sensibilitatea sau eficacitatea biologică și rezistența la medicamentele antivirale prin etapele:
a) se introduce un vector test de rezistență care conține un segment derivat 365 care cuprinde o secvență virală funcțională sau nefuncțională de la un pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă,
b) se cultivă celula gazdă din etapa a),
c) se măsoară expresia indicatorului într-o celulă gazdă, în care expresia indicatorului este dependentă de segmentul derivat de la pacient, 370
d) se compară expresia indicatorului din etapa c) cu expresia indicatorului măsurate când etapele a)-c) sunt realizate în absența medicamentului antiviral, în care o concentrație test a medicamentului antiviral este prezentă la etaple a)- c), la etapele b)- c) sau la etapa c), aceste etape se determină la un moment dat și se continuă cu determinarea rezistenței la medicament prin etapa de determinare a sensibilității la medicamentele anti- 375 virale la același pacient la un moment ulterior, se compară sensibilitățile determnate în primul și ultimul moment, în care scăderea sensibilității la medicamentul antiviral determinată la momentul ulterior față de primul moment indică dezvoltarea sau progresia rezistenței la medicamentul antiviral la pacient.
Invenția descrie vectori noi, celule gazdă și compoziții pentru realizarea acestor teste 380 noi de sensibilitate și rezistență la medicamente antivirale. De asemenea, această invenție se referă la selectarea de medicamente candidate pentru capacitatea lor de a inhiba secvențe virale selectate și/sau proteine virale. Mai precis, invenția se referă la folosirea tehnologiei ADN-ului recombinant pentru a construi mai întâi, un vector de testare a rezistenței cuprinzând un segment derivat de la pacient și o genă indicator, apoi introducerea vectorului 385 de testare a rezistenței într-o celulă gazdă, și determinarea expresiei sau inhibării produsului genei indicator într-o celulă gazdă țintă în prezența unui medicament antiviral. Această
RO 118887 Β1 invenție este, de asemenea, în legătură cu mijloace și metode de identificare a medicamentelor antivirale care au tablouri distincte ale rezistenței când se compară cu medicamente antivirale existente. Această invenție se referă, de asemenea, la metode și compoziții pentru identificarea și cercetarea eficacității biologice a compușilor terapeutici potențiali. Această invenție este în legătură mai ales cu teste de sensibilitate și rezistență utile în asigurarea unui regim terapeutic optim pentru tratamentul a diverse boli virale, incluzând de exemplu, HIV/SIDA și hepatită.
Un obiect al acestei invenții este de a asigura un test de sensibilitate și rezistență la medicament capabil să arate dacă o populație virală de la un pacient este rezistentă la un medicament prescris dat. Alt obiect al acestei invenții este de a asigura un test care face posibil, pentru clinician să înlocuiască unul sau mai multe medicamente în regimul terapeutic pentru un pacient care a devenit rezistent la un medicament sau medicamente date după o durată de terapie anterioară. încă un alt obiect al acestei invenții este de a asigura un test care va face posibilă alegerea unui regim medicamentos eficient pentru tratamentul infecțiilor virale. încă un alt obiect al acestei invenții este de a asigura o analiză sigură, standardizată, abordabilă, rapidă, precisă și pe care să te poți baza a sensibilității și rezistenței la medicament pentru aplicare în clinică și cercetare. încă un alt obiect al acestei invenții este de a asigura un test și metode pentru evaluare eficacității biologice a compușilor medicamentași candidați care acționează asupra genelor virale specifice și/sau proteinelor virale, în special, în privința rezistenței virale la medicament și rezistenței încrucișate. De asemenea, un obiect al acestei invenții este de a asigura mijloacele și compozițiile pentru evaluarea rezistenței și sensibilității virale la medicament. Acesta și alte obiecte ale acestei invenții vor fi evidente din descriere ca un întreg.
Obiectele invenției de față sunt realizate printr-un test nou pentru determinarea sensibilității pentru un medicament antiviral care cuprinde: (a) introducerea unui vector de testare a rezistenței care cuprinde un segment derivat de la pacient și a unei gene indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea expresiei genei indicator într-o celulă gazdă țintă; și (d) compararea expresiei genei indicator de la etapa (c) cu expresia genei indicator măsurată când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența medicamentului antiviral, în care o concentrație test a medicamentului antiviral este prezentă la etapele (a)-(c); la etapele (b)-(c) sau la etapa (c).
De asemenea, invenția asigură o metodă pentru determinarea rezistenței la un medicament antiviral la un pacient care cuprinde: (a) dezvoltarea unei curbe standard a sensibilității pentru un medicament antiviral; (b) determinarea sensibilității la medicamentul antiviral la pacient folosind testul de sensibilitate descris mai sus; și (c) compararea sensibilității la medicamentul antiviral din etapa (b) la curba standard determinată în etapa (a), în care o descreștere în sensibilitatea antivirală indică dezvoltarea rezistenței la medicamentul antiviral la pacient.
Această invenție asigură în plus o metodă pentru determinarea rezistenței la un medicament antiviral la un pacient cuprinzând: (a) determinarea sensibilității la medicamentul antiviral la un prim moment, conform metodei de mai sus, în care segmentul derivat de la pacient este obținut la numitul moment; b) determinarea sensibilității la medicament antiviral la același pacient la un moment ulterior; (c) comparararea sensibilităților la medicamentul antiviral determinate în etapa (a) și (b), în care o descreștere în sensibilitate la medicamentul antiviral la momentul ulterior comparată la primul moment indică dezvoltarea sau progresarea rezistenței la medicamentul anviral la pacient.
Avantajul invenției este acela că face posibilă ca medicul curant să cerceteze dacă o genă virală care codifică o proteină virală sau o secvență virală funcțională, dintre care fiecare poate fi ținta agentului antiviral, are o mutație care să facă medicamentul mai puțin
RO 118887 Β1 eficient. Mai precis, noua analiză a acestei invenții face posibil ca cineva să determine dacă un virus a devenit rezistent la un medicament antiviral anume. Mai mult, această invenție face posibil ca un clinician să cerceteze sensibilitatea și rezistența la medicament pentru o terapie combinată. Suplimentar, analiza face posibil pentru cineva să modifice un regim terapeutic prospectiv prin testarea medicamentului(lor) particulare sau combinațiilor de medicamente cu determinarea dacă aceste medicamente, singure sau în combinație, inhibă una sau mai multe gene și/sau proteine virale. Această invenție asigură avantaje semnificative față de analizele accesibile în prezent prin asigurarea unei analize a sensibilității și rezistenței la medicament mai sigure, mai abordabile, de mai mare siguranță și mai eficiente pentru cercetarea eficacității terapeutice a unui medicament(e) antivirale particulare sau combinații de medicamente care fac posibil ca un medic curant să optimizeze tratamentul. Analiza acestei invenții are avantajul semnificativ de a face posibilă evaluarea rezistenței și sensibilității la toate stadiile dezvoltării medicamentului: 1) în timpul evaluării preclinice a compușilor candidat; 2) în timpul evaluării clinice a noilor medicamente; 3) în timpul terapiei pacientului făcând posibilă modelare regimului efectiv de tratament pentru depășirea problemei rezistenței la medicament; și 4) ca parte a supravegherii epidemiologice, evaluarea prevalenței rezistenței în timpul folosirii medicamentelor aprobate și experimentale.
Prezenta invenție este îndreptată spre metode și compoziții de analizare a sensibilității și rezistenței la medicament incluzând: a) metoda de analiză de determinare a sensibilității și rezistenței a unui segment derivat de la un pacient față de un medicament antiviral; b) compoziții incluzând vectori de testare a rezistenței cuprinzând un segment derivat de la pacient și o genă indicator; și c) celule gazdă care conțin vectori de testare a rezistenței. Această invenție este îndreptată în plus spre compoziții și metode de construire a vectorilor și celulelor gazdă care sunt folosiți în analiza sensibilității și rezistenței la un medicament a acestei invenții.
într-un aspect al invenției există dată o metodă pentru determinarea sensibilității pentru un medicament anti-HIV care cuprinde: (a) introducerea un vector de testare a rezistenței care cuprinde un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea expresiei genei indicator într-o celulă gazdă țintă; și (d) compararea expresiei genei indicator de la etapa (c) cu expresia genei indicator măsurată când etapele (a) - (c) sunt realizate în absența medicamentului anti-HIV, în care o concentrație de testat a medicamentului de testat este prezentă la etapele (a) - (c); la etapele (b) - (c); sau la etapa (c).
într-un aspect al invenției este dată o metodă pentru determinarea sensibilității pentru un medicament anti-HIV care cuprinde: (a) introducerea unui vector de testare a rezistenței care cuprinde un segment derivat de la pacient și a unei gene indicator într-o celulă gazdă;
(b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea unui indicator într-o celulă gazdă țintă în care numitul indicator este o structură ADN sau ARN; și (d) compararea măsurătorii indicatorului de la etapa (c) cu măsurătoare indicatorului când etapele (a) - (c) sunt realizate în absența medicamentului anti-HIV, în care o concentrație de testat a medicamentului antiHIV este prezentă la etapele (a) - (c); la etapele (b) - (c) sau la etapa (c).
într-un aspect al invenției este asigurată o metodă pentru determinarea sensibilității pentru un medicament anti-HBV care cuprinde: (a) introducerea unui vector test cuprinzând un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea expresiei genei indicator într-o celulă gazdă țintă; (d) compararea expresiei genei indicator de la etapa (c) cu expresia genei indicator măsurată când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența medicamentului anti-HBV, în care o concentrație test a medicamentului anti-HBV este prezentă la etapele (a)-(c); la etapele (b)-(c); sau la etapa (c).
440
445
450
455
460
465
470
475
480
485
RO 118887 Β1 într-un aspect al invenției este dată o metodă pentru determinarea sensibilității pentru un medicament anti-HBV care cuprinde: (a) introducerea unui vector pentru rezistență cuprinzând un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea unui indicator într-o celulă gazdă țintă în care numitul indicator este o structură ADN sau ARN; și (d) compararea măsurării indicatorului de la etapa (c) cu măsurarea indicatorului când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența medicamentului anti-HBV, în care o concentrație a medicamentului anti-HBV, este prezentă la etapele (a)-(c); la etapele (b)-(c); sau la etapa (c).
Această invenție asigură, de asemenea, o metodă pentru determinarea rezistenței la medicament anti-HIV la un pacient cuprinzând: (a) dezvoltarea unei curbe standard a sensibilității la medicament pentru un medicament anti-HIV; (b) determinarea sensibilității la medicament anti-HIV la pacient folosind testul de sensibilitate descris mai sus; și (c) compararea sensibilității la medicamentul anti-HIV din etapa (b) cu curba standard determinată în etapa (a), în care o descreștere în sensibilitatea anti-HIV indică dezoltarea rezistenței față de medicamentul anti-HIV la pacient.
De asemenea, această invenție asigură o metodă pentru determinarea rezistenței la medicament anti-HBV la un pacient care cuprinde: (a) dezvoltarea unei curbe standard pentru sensibilitate la medicamente pentru un medicament anti-HBV; (b) determinarea sensibilității la medicamentul anti-HBV la pacient folosind testul de sensibilitate descris mai sus; și (c) compararea sensibilității la medicamentul anti-HBV din etapa (b) cu curba standard determinată în etapa (a), în care o descreștere în sensibilitatea anti-HBV indică dezvoltarea rezistenței la medicamentul anti-HBV la pacient.
Această invenție asigură, de asemenea, o metodă pentru evaluarea efectivității biologice a unui compus candidat pentru medicament antiviral care cuprinde: (a) introducerea unui vector test de rezistență care cuprinde un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea expresiei genei indicator într-o celulă gazdă țintă; (d) compararea expresiei genei indicator de la etapa (c) cu expresia genei indicator măsurată când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența compusului candidat ca medicament antiviral în care o concentrație test a compusului candidat ca medicament antiviral este prezentă la etapele (a)-(c); la etapele (b)-(c); sau la etapa (c).
Această invenție asigură, de asemenea, o metodă pentru evaluarea eficacității biologice a unui compus candidat ca medicament antiviral care cuprinde: (a) introducerea unui vector de test de rezistență care cuprinde un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea unui indicator într-o celulă gazdă țintă în care numitul indicator este o structură ADN sau ARN; și (d) compararea măsurării indicatorului de la etapa (c) cu măsurarea indicatorului când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența compusului candidat ca medicament antiviral, în care o concentrație test a compusului candidat ca medicament antiviral este prezentă la etapele (a)-(c), la etapele (b)-(c); sau la etapa (c).
Vectorul test de rezistență cuprinde segmentul(le) derivate de la pacient (de exemplu, HIV, HBV, etc.) și gena indicator include suplimentar unul sau mai multe segmente care nu sunt derivate de la pacient. într-o realizare preferată vectorul test de rezistență virală este construit de la un vector genomic viral care include o deleție a uneia sau mai multor gene. De exemplu, în cazul HIV, env este deletată într-un vector test de rezistență care altfel păstrează expresia mARN și caracteristicile de prelucrare ale virusului complet. Alternativ vectorul test de rezistență este construit de la un vector viral subgenomic care include numai una sau câteva gene virale care sunt de obicei ținta medicamentului antiviral. De exemplu, în cazul HBV, una sau mai multe dintre genele HBV care codifică anumite funcțiuni structurale și enzimatice necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei virale (adică,
RO 118887 Β1 genele C, S și X) pot fi deletate dintr-un vector test de rezistență care altfel, păstrează expresia mARN-ului și caracteristicile de prelucrare ale virusului complet. Vectorul test de rezistență cuprinde în plus, fie intensificatorul/promotorul nativ al virusului particular, fie un intensificator/promotor străin pentru expresia genelor țintă antiviral.
Expresia genei indicator în vectorul test de rezistență în celula țintă este dependentă în final, de acțiunea secvențelor segmentului derivat de la pacient. Gena indicator este funcțională sau nefuncțională. în cazul unei gene indicator nefuncționale, gena indicator nu este exprimată eficient într-o celulă gazdă transfectată prin vectorul test de rezistență până când ea este convertită într-o genă indicator funcțională prin acțiunea unuia sau mai multor produse ale segmentului derivat de la pacient. într-o realizare, gena indicator este făcută nefuncționată prin utilizarea unui promotor permutat, adică un promotor care, deși în aceeași orientare transcripțională ca gena indicatoare, urmează mai degrabă decât precede secvența de codificare a genei indicator. Suplimentar, orientarea genei indicator de funcționare este opusă celei a promotorilor virali sau LTR-urilor. Astfel, secvența de codificare a genei indicator nefuncțională nu poate fi nici transcrisă de promotorul permutat și nici de promotorii virali. în cazul HIV, gena indicator este rearanjată ca o consecință a transcripției inverse astfel că promotorul permutat precede acum secvența genei indicator, care ca urmare poate fi exprimată funcțional. în cazul HBV, gena indicator este rearanjată ca o consecință a circularizării genomului în timpul replicării HBV. într-o a doua realizare, gena indicator este făcută nefuncțională prin folosirea unei regiuni de codificare permutată, adică regiunea de codificare a genei indicator în care porțiunea 5' a regiunii de codificare mai degrabă urmează decât precede porțiunea 3' a regiunii de codificare. în această configurație nu se exprimă nici un mARN care poate da naștere la un produs al genei indicator funcțional. în cazul HIV, gena indicator este rearanjată ca o consecință a transcrierii inverse astfel că regiunea de codificare 5' a genei indicator acum precede regiunea de codificare 3', și care urmare gena indicator poate fi exprimată funcțional. în cazul HBV, gena indicator este rearanjată ca o urmare a circularizării genomului în timpul replicării HBV. într-o a treia realizare, gena indicator este făcută nefuncțională prin folosirea unui intron inversat, adică un intron înserat în secvența de codificare a genei indicator cu o orientare transcripțională opusă celei a genei indicator. Suplimentar, gena indicator însăși conține un promotor funcțional cu întreaga unitate transcripțională orientată opus față de promotorii virali. Astfel, gena indicator nefuncțională este în orientare greșită pentru a fi transcrisă de LTR-urile virale în cazul HIV sau intensificatorul-promotorul HBV și ea nu poate fi transcrisă funcțional de promotorul său propriu, deoarece intronul inversat nu poate fi excizat corect prin îmbinare. Cu toate acestea, în cazul retrovirusurilor și hepatovirusurilor, și specific HIV și HBV, transcripția de către promotorii virali are ca urmare formarea mARN-ului în care îndepărtarea intronului inversat poate avea loc prin îmbinare. La retrovirusuri, ca o urmare a transcrierii inverse a transcriptului îmbinat rezultat și integrarea provirusului rezultat în cromozomul celulei gazdă, gena indicator poate fi acum transcrisă funcțional de propriul său promotor. La HBV, ca o consecință a transcrierii inverse a transcriptului îmbinat rezultat și circularizării ADN-ului genomic în celula gazdă, gena indicator poate fi acum transcrisă funcțional de propriul său promotor.
Vectorii test de rezistență care cuprind o genă indicator nefuncțională se pot folosi pentru realizarea testelor de rezistență în teste fie bazate pe particule, fie care să nu se bazeze pe particule. Testul bazat pe particule este bazat pe particule virale ale vectorului de rezistență, care sunt defective la replicare, fiind produse de celulele gazdă ale vectorului de rezistență. Factorii de acțiune trans necesari pentru producerea particulelor virale ale vectorului de testare a rezistenței sunt asigurate de vector de expresie organizați care sunt transfectați în celula gazdă organizată. în contrast, testul de rezistență care nu se bazează pe particule se realizează prin trasfectarea unei singure celule gazdă cu vectorul de testare a rezistenței în absența vectorilor de expresie organizați.
535
540
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 118887 Β1 în cazul genei indicator funcționale, gena indicator funcțională este exprimată eficient într-o primă celulă gazdă transfectată prin vectorul test de rezistență (cunoscută până aici ca celulă gazdă vector test de rezistență). Astfel, funcția genei indicator în celula gazdă vector test de rezistență nu este dependentă de segmentul derivat de la pacient. Cu toate acestea, capacitatea genei indicator de a fi exprimată într-o a doua celulă gazdă (cunoscută până aici ca o celulă gazdă țintă) este dependentă de producerea particulelor virale funcționale ale vectorului test de rezistență în celula gazdă vector test de rezistență. Astfel, activitatea genei indicator în celulele gazdă țintă este dependentă de activitatea secmentelor derivate de la pacienți.
Un alt aspect această invenție este îndreptată spre teste de rezistență și sensibilitate la medicamente antivirale pentru HIV/SIDA sau HBV. Sunt identificați vectori test de rezistență particulari ai invenției pentru utilizare în testul de rezistență și sensibilitate la medicamente antivirale HIV/SIDA, precum și celule gazdă vector test de rezistență. încă un aspect, această invenție este îndreptată spre teste de rezistență și sensibilitate la medicamente antivirale pentru hepatită. Similar în cazul HBV, sunt identificați vectori test de rezistență particulari (de asemenea, cunoscuți până aici ca sisteme vectori test de rezistență) ale invenției pentru utilizare în testul de rezistență și sensibilitate la medicamente antivirale HBV, precum și celule gazdă vector test de rezistență.
Un alt aspect această invenție asigură compuși pentru identificarea și cercetarea eficienței biologice a potențialilor compuși terapeutici antivirali pentru tratamentul bolilor virale. Un alt aspect, invenția este îndreptată spre o celulă gazdă transfectată cu unul sau mai mulți vectori pentru cercetarea sensibilității la medicament. în alt aspect, invenția este îndreptată spre un nou vector test de rezistență care cuprinde o genă(e) virale derivate de la pacient și o genă indicator.
Invenția de față dă o analiză nouă de sensibilitate și rezistență la medicamente cuprinzând etapele: (a) introducerea unui vector test de rezistență care cuprinde un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea expresiei genei indicator într-o celulă gazdă țintă; și (d) compararea expresiei genei indicator de la etapa (c) cu expresia genei indicator măsurată când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența medicamentului antiviral, în care concentrația test a medicamentului antiviral este prezentă la etapele (a)-(c); la etapele (b)-(c); sau la etapa (c).
într-un aspect al invenției este dată o metodă pentru determinarea sensibilității pentru un medicament antiviral care cuprinde: (a) introducerea unui vector test de rezistență cuprinzând un segment derivat de la pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă; (b) cultivarea celulei gazdă de la etapa (a); (c) măsurarea unui indicator într-o celulă gazdă țintă în care numitul indicator este o structură ADN sau ARN; și (d) compararea măsurării indicatorului de la etapa (c) cu măsurarea indicatorului când etapele (a)-(c) sunt realizate în absența medicamentului antiviral, în care concentrația test a medicamentului antiviral este prezentă la etapele (a)-(c), la etapele (b)-(c), sau la etapa (c).
De asemenea, această invenție descrie o metodă pentru determinarea rezistenței la medicament antiviral la un pacient cuprinzând: (a) dezvoltarea unei curbe standard a sensibilității la medicament pentru un medicament antiviral; (b) determinarea sensibilității la medicament la un pacient folosind oricare dintre testele de sensibilitate descrise mai sus; și (c) compararea sensibilității la medicament antiviral din etapa (b) cu curba standard determinată în etapa (a), în care o descreștere a sensibilității antivirale indică dezvoltarea rezistenței la medicamentul antiviral la pacient.
Această invenție asigură de asemenea, o metodă pentru determinarea rezistenței la medicament antiviral la un pacient cuprinzând: (a) determinarea sensibilității la medicamentul antiviral la un pacient la un prim moment, conform cu oricare dintre metodele de mai
RO 118887 Β1 sus, în care segmentul derivat de la pacient este obținut de la pacient la aproximativ la 635 numitul moment de timp; (b) determinarea sensibilității la medicamentul antiviral al aceluiași pacient la un moment de timp ulterior; și (c) compararea sensibilităților la medicamentul antiviral determinate la etapa (a) și (b), în care o descreștere în sensibilitatea la medicamentul antiviral la timpul ulterior comparată la primul moment indică dezvoltarea sau progresia rezistenței la medicamentul antiviral la pacient. 640
Analiza acestei invenții se poate folosi pentru orice boală virală unde sensibilitatea și rezistența la medicamentul antiviral este o preocupare incluzând, de exemplu, HIV, virus herpes simplex, virus cytomegalovirus, virus varicela zoster, alte virusuri herpes umane (HIV), virus influenza A, virus sincițial respirator, virusurile hepatitei A, B și C, rinovirus, și virusul papilloma uman. Cele de mai înainte sunt anumite virusuri reprezentative pentru care 645 există în prezent chemoterapie antivirală accesibilă, și reprezintă familiile virale retroviridae, herpesviridae, orthomyxoviridae, pneumovirus și hepadnviridae. Analiza acestei invenții se va putea folosi cu alte infecții virale care apar de la infecții datorate altor virusuri din aceste familii precum infecțiile virale care apar de la virusurile din alte familii virale. Suplimentar, sensibilitatea la medicament și testul de rezistență al acestei invenții este util pentru 650 selectarea de compuși pentru tratarea bolilor virale pentru care în prezent nu este accesibilă o terapie în mod curent.
Structura, ciclul de viață și elementele genetice ale virusurilor care ar putea fi testate în testul de sensibilitate și rezistență al acestei invenții vor fi cunoscute pentru cineva cu pregătire obișnuită în domeniu. Este folositor pentru practica acestei invenții, de exemplu, să 655 se înțeleagă ciclul de viață al unui retrovirus, precum și genele virale necesare pentru salvarea virusului și infectivitate. Celulele infectate retroviral înmagazinează în membrană un virus care conține un genom ARN diploid. Virusul, încrustat cu o glicoproteină de înveliș (care servește pentru determinarea gradului de infectare al gazdei), se atașează la un receptor celular din membrana plasmatică a celulei de infectat. După legarea receptorului, 660 virusul este internalizat și neacoperit el trece prin citoplasmă celulei gazdă. Fie, pe drumul său spre nucleu, fie în nucleu, moleculele transcriptazei inverse rezidente în miezul viral conduc sinteza provirusului ADN cu bandă dublă, o sinteză care este inițiată prin legarea unei molecule de tARN-ul genomic viral. Provirusul ADN cu banda dublă este în continuare integrat în genomul celulei gazdă, unde el poate servi ca matriță transcripțională pentru 665 ambele ARN-uri care codifică proteine virale și ARN genomic al virionului, care vor fi organizate în particule de miez viral. Pe drumul lor în afara celulei infectate, particulele de miez se deplasează prin citoplasmă, se atașează la interiorul membranei plasmatice a celulelor nou infectate, și înmuguresc, luând cu ele zone ale membranei care conțin produsul codificat de gena virală pentru glicoproteină de înveliș. Acest ciclu de infecție - transcripție inversă, 670 transcripție, translație, asamblarea vitrionului, și înmugurirea - se repetă singur, iar și iar și duce la răspândirea infecției.
ARN-ul viral și, ca rezultat, ADN-ul proviral codifică câteva elemente care sunt vitale pentru finalizarea cu succes a ciclului viral de viață. Vitrionul ARN poartă promotorul viral la capătul său 3'. Promotorul viral este plasat în replică la capătul 5' al genomului proviral, 675 deoarece genomul este transcris invers. Chiar 3' față de LTR-ul viral 5' stă situl de organizare virală. Ciclul de viață retroviral necesită prezență factorilor de acțiune trans codificați viral. ADN polimeraza dependentă de ARN-ul viral transcriptaza inversă (pol) este, de asemenea, conținută în miezul viral și este vitală pentru ciclul de viață viral prin aceea că ea este responsabilă pentru conversia ARN-ului genomic la ADN proviral intermediar inte- 680 grativ. Glicoproteină învelișului viral, env, este necesară pentru atașarea virală la celula neinfectată și pentru răspândirea virală. De asemenea, există factori de transactivare, așanumiții transactivatori, care pot servi pentru modularea nivelului transcripției a provirusul
RO 118887 Β1 parental integrat. De obicei, virusurile competente pentru replicare (non deficitare) sunt auto conținute prin aceea că ele codifică toți acești factori de transactivare. Omologii lor deficitari nu sunt auto conținuți.
în cazul unui virus ADN, cum ar fi un hepadnvirus, înțelegerea ciclului de viață și genele virale necesare pentru infecție este folositoare pentru practica acestei invenții. Procesul intrării HBV nu a fost bine definit. Replicarea HBV folosește o matriță ARN intermediară. în celula infectată prima etapă în replicare este ADN-ului circular asimetric relaxat (rc-ADN) la ADN covalent circular închis (cccADN). Acest proces, care se petrece în nucleul celulelor hepatice infectate, implică finalizarea sintezei benzii ADN pozitive și ligarea capetelor ADN-ului. în a doua etapă, cccADN este transcris de către ARN polimeraza gazdei pentru generarea unei matrițe ARN de 3,5 kB (pregenomul). Acest pregenom este complexat cu proteină în miezul viral. Cea de-a treia etapă implică sinteza primei benzi ADN sens negativ prin copierea ARN-ului folosind proteina P transcriptază inversă codificată viral. Proteina P servește, de asemenea, ca primer bandă ADN minus. în final, sinteza celei de-a doua benzi ADN sens pozitive are loc prin copierea primei benzi ADN, folosind activitatea ADN polimeraza proteină P și un oligomer al ARN-ului viral ca primer. De asemenea, pregenomul transcrie mARN pentru proteinele structurale principale ale miezului.
Schema următoare ilustrează unii dintre diverșii vectori și celule gazdă care se pot folosi în această invenție. Nu se intenționează să fie a toate cuprinzătoare.
Vectori
Casetă genă indicatoare Vector viral (genă indicatoare + (genomic sau subgenomic) funcțională/nefuncțională
Vector viral genă indicatoare (genă indicatoare funcțională/nefuncțională) + Situri acceptoare secvență pacient + Segmente derivate de la pacient
Vector test de rezistență (segmente derivate de la pacient + genă indicatoare)
Celule gazdă
Organizare celulă gazdă - transfectată cu vectori de expresie organizați
Celulă gazdă vector test de rezistență - o celulă gazdă organizată transfectată vector test de rezistență.
Celulă gazdă țintă - o celulă gazdă de infectat printr-o particulă virală a vectorului test de rezistență produs de către celula gazdă vector test de rezistență.
Vector test de rezistență “Vector test de rezistență” înseamnă unul sau mai mulți vectori care luați împreună conțin ADN sau ARN care cuprinde un segment derivat de la pacient și o genă indicator. în cazul unde vectorul test de rezistență cuprinde mai mult decât un vector, segmentul derivat de la pacient poate fi conținut într-un vector, și gena indicator într-un vector diferit. Un
RO 118887 Β1
735 asemenea vector test de rezistență care cuprinde mai mult decât un vector este numit până aici ca un sistem vector test de rezistență pentru scopul clarității dar este, cu toate acestea înțeles ca fiind un vector test de rezistență. ADN-ul sau ARN-I unui vector test de rezistență poate fi conținut astfel în una sau mai multe molecule ADN sau ARN. într-o realizare, vectorul test de rezistență este obținut prin inserția unui segment derivat de la pacient într-un vector viral genă indicator. în altă realizare, vectorul test de rezistență este obținut prin inserția unui segment derivat de la pacient într-un vector organizat în timp ce gena indicator este conținută într-un al doilea vector, de exemplu, un vector viral genă indicator. Așa cum s-a folosit aici, “segment derivat de la pacient” se referă la unul sau mai multe segmente virale obținute direct de la pacient folosind diverse mijloace, de exemplu, donare moleculară sau reacția de amplificare polimerazică de catenă (PCR) a unei populații de segmente derivate de a pacient folosind ADN viral sau ADN complementar (cADN) preparat de la ARN viral, prezent în celule (de exemplu, celule mononucleare din sânge periferic, PBMC), ser sau alte fluide corporale ale pacienților infectați. Când un segment viral “se obține direct” de la pacient el este obținut fără trecerea virusului prin cultură, sau dacă virusul este cultivat, atunci un număr minim de pasaje pentru eliminarea în esență a mutațiilor de selecție din cultură. Termenul “segment viral” se referă la orice secvență virală funcțională sau genă virală care codifică un produs al genei (de exemplu, o proteină) care este ținta unui medicament antiviral. Termenul “secvență virală funcțională” așa cum s-a folosit aici se referă la orice secvență de acid nucleic (ADN sau ARN) cu activitate funcțională cum ar fi intensificatori, promotori, situri de poliadenilare, situri de acțiune ale factorilor de transactivare, cum ar fi, tar și RRE, secvențe organizate, secvențe de integrare, sau secvențe de îmbinare. Dacă un medicament a fost ținta a mai mult de o secvență virală funcțională sau produs al genei virale atunci segmentele derivate de la pacient care corespund la fiecare numită genă virală se vor introduce într-un vector test de rezistență. în cazul terapiei combinate unde trebuie să fie evaluate două sau mai multe antivirale care tintesc două secvențe virale
J funcționale diferite, vor fi introduse în vectorul test de rezistență segmente derivate de la pacient corespunzătoare pentru fiecare secvență virală funcțională sau produs al genei virale. Segmentele derivate de la pacient sunt înserate în situri de restricție unice sau localizări specificate, numite situri acceptoare ale secvenței de la pacient, în vectorul viral genă indicator sau de exemplu, un vector organizat în funcție de secvența particulară care se folosește așa cum s-a descris aici.
Așa cum s-a folosit aici, “segment derivat de la pacient” cuprinde segmente derivate de la om și diverse specii animale. Astfel de specii includ, dar nu sunt limitate la cimpanzei, cai, bovine, pisici și câini.
De asemenea, segmentele derivate de la pacient pot fi încorporate în vectori test de rezistență folosind oricare dintre cele câteva tehnici alternative de donare. De exemplu, donare prin introducerea siturilor de restricție clasa II, atât în partea principală a plasmidului, cât și în segmentele derivate de la pacient sau prin donare primer uracil ADN glicozilază (refs).
Segmentul derivat de la pacient se poate obține prin orice metodă de donare moleculară sau amplificare a genei, sau modificări ale acestora, prin introducerea siturilor acceptoare secvență pacient, cum s-a descris mai jos, la capetele segmentului derivat de la pacient care trebuie introdus în vectorul test de rezistență. De exemplu, într-o metodă de amplificare a genei cum ar fi PCR, situri de restricție care să corespundă siturilor acceptoare secvență pacient pot fi încorporate la capetele primerilor folosiți în reacția PCR. Similar, întro metodă de donare moleculară cum ar fi, donare cADN, numitele situri de restricție pot fi încorporate la capetele primerilor folosiți pentru sinteza primei sau celei de-a doua benzi cADN, sau într-o metodă cum ar fi, primer de reparație ADN, cu ADN fie donat, fie neclonat, numitele situri de restricție pot fi încorporate în primerii folosiți pentru reacția de reparare.
740
745
750
755
760
765
770
775
780
RO 118887 Β1
Siturile și primerii acceptori pentru secvența derivată de la pacient sunt desemnați pentru îmbunătățirea reprezentării segmentelor derivate de la pacient. Seturi de vectori test de rezistență care au desemnate situri acceptoare ale secvenței de la pacient asigură reprezentarea segmentelor derivate de la pacient care vor fi reprezentate într-un grad mai mic numai într-un vector test de rezistență.
Vectorii test de rezistență sunt pregătiți prin modificarea unui vector genă virală indicator (descrisă mai jos) prin introducerea siturilor acceptoare secvență pacient, amplificarea sau donarea segmentelor derivate de la pacient și înserarea secvențelor amplificate sau donate în vectorii virali genă indicator la siturile acceptoare secvență pacient. Vectorii test de rezistență sunt construiți de la vectori virali genă indicator care în schimb sunt derivați de la vectori virali genomici sau vectori virali subgenomici și o casetă genă indicator, din care fiecare se descrie mai jos. Vectorii test de rezistență sunt apoi introduși într-o celulă gazdă. Alternativ, un vector test de rezistență (numit, de asemenea, sistem vector test de rezistență) este pregătit prin introducerea siturilor acceptoare secvență pacient într-un vector organizat, amplificarea sau donarea segmentelor derivate de la pacient și inserarea precisă a secvențelor amplificate sau donate în vectorul organizat la siturile acceptoare secvență pacient și cotransfectarea acestui vector organizat cu un vector viral genă indicator.
într-o realizare preferată, vectorul test de rezistență poate fi introdus în celule gazdă organizate împreună cu vectori de expresie organizați, așa cum s-au definit mai jos, pentru a produce particule virale vector test de rezistență care sunt folosite în teste de rezistență și sensibilitate la medicament care sunt denumite până aici ca “test bazat pe particule”. într-o realizare preferată alternativă, vectorul test de rezistență poate fi introdus într-o celulă gazdă în absența vectorilor de expresie organizați pentru realizarea unui test de rezistență și sensibilitate la medicament care este denumit până aici ca “test care nu se bazează pe particule”. Așa cum s-a folosit aici un “vector de expresie organizat’ asigură factorii, cum ar fi, proteine organizate (de exemplu, proteine structurale cum ar fi, polipeptidele miezului și învelișului), factori de acțiune trans, sau gene cerute de replicarea retrovirusului deficient sau hepadnvirusului. într-o astfel de situație, un genom viral competent pentru replicare este slăbit într-un asemenea mod, încât el nu poate să se autoreplice. Aceasta înseamnă că, deși vectorul de expresie organizat poate produce gene de acțiune trans sau gene absente necesare pentru salvarea genomului viral deficient prezent într-o celulă care conține genomul slăbit, genomul slăbit nu se poate salva el însăși.
Indicator sau genă indicator “Indicator sau genă indicator” se referă la un acid nucleic care codifică o proteină, structură ADN sau ARN care, fie direct, fie printr-o reacție dă naștere la un aspect măsurabil sau remarcabil, de exemplu, o culoare sau lumină de o lungime de undă măsurabilă sau ADN-ului sau ARN-ului folosit ca un indicator o schimbare sau generarea unei structuri ADN sau ARN specifice. Exemple preferate de gene indicator sunt gena E.coli lacZ care codifică beta-galactozidază, gena luc care codifică luciferază, fie de la, de exemplu, Photonis pyralis (licurici) fie de la Renilla reniformis (pansea de mare), gena E.coli phoA care codifică fosfatază alcalină, proteina fluorescentă verde și gena bacteriană CAT care codifică cloramfenicol acetiltransferază. Exemple suplimentare preferate de gene indicator sunt proteine secretate sau proteine ale suprafeței celulare care sunt măsurate cu ușurință prin analiză, cum ar fi, radioimunoanaliză (RIA), sortarea celulelor activate fluorescent (FACS), includerea de exemplu, a factorilor de creștere, citokine și antigeni de suprafață ai celulei (de exemplu, hormon de creștere, 11-2 sau respectiv CD4). De asemenea, “genă indicator” se înțelege că include o genă de selecție, cunoscută de asemenea, ca marker selectabil. Exemple de markeri selectabili corespunzători pentru celule de mamifere sunt dihidrofolat reductaza (DHFR), timidin kinază, higromicină, neomicină, zeocină sau E.coli gpt. în cazul exemplelor
RO 118887 Β1 anterioare de gene indicator, gena indicator și segmentul derivat de la pacient sunt distincte, adică gene separate. în unele cazuri un segment derivat de la pacient poate fi folosit de asemenea, ca o genă indicator. într-o astfel de realizare în care segmentul derivat de la pacient corespunde la mai mult decât o genă virală care este ținta unui antiviral, una dintre numitele gene poate servi de asemenea ca genă indicator. De exemplu, o genă protează virală poate servi ca o genă indicator. De exemplu, o genă protează virală poate servi ca o genă indicator în virtutea capacității sale de a cliva un substrat cromogenic sau capacității sale de a activa un zimogen inactiv care în schimb clivează un substrat cromogen dând naștere în fiecare caz la o reacție de culoare. în toate exemplele de mai sus de genă indicator, gena indicator poate să fie, o genă ‘funcțională” sau “nefuncțională” dar în fiecare caz expresia genei indicator în celula țintă este în final, dependentă de acțiunea segmentului derivat de la pacient.
Genă indicator funcțională în cazul unei “gene indicator funcțională” gena indicator poate fi capabilă să fie exprimată într-o celulă gazdă organizată/celulă gazdă vector test de rezistență” cum s-a definit mai jos, independent de segmentul derivat de la pacient, deși gena indicator funcțională nu ar putea fi exprimată în celula gazdă țintă, cum s-a definit mai jos, fără producerea particulelor virale funcționale vector test de rezistență și infectarea efectivă a celulei gazdă țintă, într-o realizare a unei gene indicator funcțională, caseta genei indicator, cuprinzând elemente de control și o genă care codifică o proteină indicator, este inserată în vectorul viral genă indicator cu orientarea transcripțională aceiași sau opusă a intensificatorului/promotorului vectorului viral străin. Un exemplu al unei gene indicator funcționale în cazul HIV sau HBV, plasează gena indicator și promotorul său (un intensificator/promotor IE CMV) în orientare transcripțională aceiași sau opusă ca HIV-LTR sau respectiv intensificator-promotor HBV, sau intensificator/promotor IE CMV asociat cu vectorul viral.
Genă indicator nefuncțională
Alternativ, gena indicator, poate fi “nefuncțională” prin aceea că gena indicator nu este exprimată eficient într-o celulă gazdă organizată transfectată cu vectorul test de rezistență, care este cunoscută apoi ca celulă gazdă vector test de rezistență, până când este convertită într-o genă indicator funcțională prin acțiunea unuia sau mai multora dintre produsele segmentului derivat de la pacient. O genă indicator este făcută nefuncțională prin manipulare genetică în conformitate cu această invenție.
1. Promotor permutat. într-o realizare, o genă indicator este făcută nefuncțională datorită localizării promotorului, prin aceea că, deși promotorul este în aceiași orientare transcripțională ca gena indicator, el mai degrabă urmează, decât precede secvența care codifică gena indicator. Acest promotor plasat greșit este cunoscut ca un “promotor permutat’. Suplimentar față de promotorul permutat al genei indicator, orientarea este opusă față de cea a vectorului viral nativ sau promotor/intensificator străin. Astfel secvența de codificare a genei indicator nefuncționale nu poate fi transcrisă nici de promotorul permutat, nici de promotorii virali. Gena indicator nefuncțională și promotorul său permutat este făcută funcțională prin acțiunea uneia sau mai multora dintre proteinele virale. Un exemplu al unei gene nefuncționale cu un promotor permutat în cazul HIV, plasează un promotor ARN polimerază fag T7 (denumit aici ca promotor T7) în 5' LTR în aceeași orientare transcripțională ca gena indicator. Gena indicator nu poate fi transcrisă de promotorul T7, deoarece caseta genei indicator este poziționată în fața promotorului T7. Gena indicator nefuncțională din vectorul test de rezistență este transformată într-o genă indicator funcțională de transcriptază inversă la infecția celulelor țintă, care rezultă de la repoziționarea promotorului T7, prin copierea de la 5' LTR la 3' LTR, relativ la regiunea de codificare genă indicator. După integrarea genei indicator reparate în cromozomul celulei țintă prin HIV integrază, o ARN polimerază T7 nucleară exprimată prin transcrierea genei indicator de celula țintă. Un
835
840
845
850
855
860
865
870
875
880
RO 118887 Β1 exemplu al unei gene indicator nefuncționale cu un promotor permutat în cazul HBV, plasează o regiune intensificator-promotor sau 3' de gena indicator ambele având aceeași orientare transcripțională. Gena indicator nu poate fi transcrisă de intensificator-promotor deoarece caseta genei indicator este poziționată în față. Gena indicator nefuncțională în vectorul test de rezistență este transformată într-o genă indicator prin transcriere inversă și circularizarea vectorului viral genă indicator HBV prin repoziționarea intensificatoruluipromotorului în amonte relativ la regiunea de codificare a genei indicator.
Un promotor permutat poate fi orice promotor eucariotic sau procariotic care poate fi transcris în celula gazdă țintă. De preferință, promotorul va fi de mărime mică pentru a face posibilă inserția în genomul viral fără perturbarea replicării virale. Mai preferat, va fi folosit un promotor de mărime mică care este capabil de transcripție de o singură subunitate ARN polimerază introdus în celula gazdă țintă, cum ar fi, un promotor bacteriofag. Exemple de asemenea promotori bacteriofag și ARN polimerazele lor înrudite le includ pe cele ale fagilor T7, T3 și Sp.6. O secvență de localizare nucleară (NLS) poate fi atașată la ARN polimerază pentru localizarea expresiei ARN polimerazei la nucleu unde ea poate fi necesară pentru a fi transcrisă de gena indicator reparată. O asemenea NLS se poate obține de la orice proteină nucleară transportată cum ar fi, antigenul SV40T. Dacă se folosește o ARN polimerază de la fag, poate fi adăugat un sit intern de intrare ribozom (IRES) în fața genei indicator cum ar fi, regiunea 5' netranslată a virusului EMC (UTR), pentru translatarea transcriptelor care în general sunt fără capac. în cazul HIV, însăși promotorul permutat poate fi introdus la orice poziție în 5' LTR care este copiat la 3' LTR în timpul transcripției inverse, atâta timp cât funcția LTR nu este distrusă, de preferință, în porțiunile US și R ale LTR, și cel mai preferat în afara regiunilor funcționale și puternic conservate ale US și R. în cazul HBV, promotorul permutat poate fi plasat la orice poziție ce nu distruge elementele cis de acțiune care sunt necesare pentru înmulțirea ADN HBV. Secvențe de blocare se pot adăuga la capetele vectorului test de rezistență pentru a face necorespunzătoare expresia genei indicator nefuncționale datorită artefactelor transcripției (concatenarea ADN). în exemplul HIV de promotor T7 dat mai sus, o asemenea secvență de blocare poate consta dintr-un terminator transcripțional T7, poziționat pentru blocarea citirii transcripției care rezultă de la concatenarea ADN, dar nu și transcripția care rezultă din repoziționarea promotorului T7 permutat de la 5' LTR la 3' LTR în timpul transcripției inverse.
2. Regiune de codificare permutată. într-o a doua realizare, o genă indicator este făcută nefuncțională datorită localizării relative a regiunilor de codificare 5' și 3' ale genei indicator, prin aceea că, regiunea de codificare 3' mai degrabă precede, decât urmează regiunea de codificare 5'. Această regiune de codificare plasată greșit este cunoscută ca o “regiune de codificare permutată”. Orientarea genei indicator nefuncționale poate fi aceiași sau opusă celei a promotorului/intensificatorului nativ sau străin a vectorului viral, deoarece codificarea mARN pentru o genă indicator funcțională se va produce în eventualitatea oricărei orientări. Gena indicator nefuncțională și regiunea sa de codificare permutată este făcută funcțională prin acțiunea unuia sau mai multor produse ale segmentului derivat de la pacient. Un al doilea exemplu al unei gene indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată în cazul HIV, plasează o regiune de codificare 5' a genei indicator cu un promotor asociat în regiunea 3' LTR U3 și o regiune de codificare 3‘ a genei indicator într-o localizare în față a genomului HIV, cu fiecare regiune de codificare având aceiași orientare transcripțională cu LTR-urile virale. în ambele exemple, regiunile de codificare 5' și 3' pot avea îmbinate, de asemenea, secvențe asociate donor și respectiv acceptor, care pot fi semnale de îmbinare heteroloage sau artificiale. Gena indicator nu poate fi transcrisă funcțional de promotorul asociat sau promotori virali, deoarece regiunea de codificare permutată împiedică formarea transcriptazelor îmbinate funcțional. Gena indicator nefuncțională din vectorul test de
RO 118887 Β1
930 rezistență este convertită la o genă indicator funcțională prin transcriptază inversă la infecția celulelor țintă, rezultate de la repoziționarea regiunilor de codificare 5' și 3' ale genei indicator una față de cealaltă, prin copierea 3' LTR la 5' LTR. După transcripția de către promotorul asociat cu regiunea de codificare 5', ARN-ul îmbinat poate lega regiunile de codificare 5' și 3' pentru a produce un produs genă indicator funcțională. Un exemplu al unei gene indicator nefuncționale cu o regiune de codificare permutată în fața HBV, plasează regiunea de codificare 3' a genei indicator în față sau 5' de intensificator promotor și 5' regiunii de codificare a genei indicator. Orientările transcripționale ale regiunilor de codificare 5' și 3' ale genei indicator sunt identice una față de alta, și aceeași precum a vectorului viral genă indicator. Cu toate acestea, deoarece regiunile de codificare 5' și 3' ale genei indicator sunt permutate în vectorii test de rezistență (adică, regiunea de codificare 5' este după regiunea de codificare 3'), nu este transcris nici un mARN care se poate îmbina pentru generarea unei regiuni de codificare a genei indicator funcționale. După transcripția inversă și circularizarea vectorului viral genă indicator, regiunea de codificare 3' a genei indicator este poziționată după sau 3' față de promotor-intensificator și regiunea de codificare 5', permițând astfel transcripția mARN-ului care poate fi îmbinat pentru generarea unei regiuni de codificare a genei indicator funcțională.
>
3. Intron inversat. într-o a treia realizare, gena indicator este făcută nefuncțională prin folosirea unui “intron inversat”, adică un intron înserat în secvența de codificare a genei indicator cu o orientare transcripțională opusă celei a genei indicator. Orientarea transcripțională globală a casetei genei indicator incluzând propriul său promotor legat, este opusă celei a elementelor de control virale, în timp ce orientarea intronului artificial este aceiași ca a elementelor virale de control. Transcripția genei indicator de propriul său promotor legat nu conduce la producerea transcriptelor funcționale, deoarece intronul inversat nu poate fi îmbinat în această orientare. Transcripția genei indicator de către elementele virale de control, totuși, conduce la îndepărtarea intronului inversat prin îmbinarea ARN, deși gena indicator nu este încă exprimată funcțional deoarece transcriptul care rezultă are o orientare antisens. După transcripția inversă a acestui transcript și integrarea ADN-ului retroviral rezultant, sau circularizarea ADN-ului hepadnvirusului, gena indicator poate fi transcrisă funcțional folosind promotorul propriu legat deoarece intronul inversat a fost îndepărtat anterior. în acest caz, gena indicator însăși poate să conțină propriul său promotor funcțional cu întreaga unitate transcripțională orientată opus față de elementele virale de control. Astfel gena indicator nefuncțională este în orientare greșită pentru a fi transcrisă de către elementele virale de control și nu poate fi transcrisă funcțional de promotorul propriu, deoarece intronul inversat nu poate fi excizat corespunzător prin îmbinare. Cu toate acestea, în cazul unui retrovirus și specific HIV și hepadnvirusurilor, și specific HBV, transcripția prin promotorii virali (HIV LTR sau intensificator promotor HBV) are ca urmare îndepărtarea intronului inversat prin îmbinare. Ca o consecință a transcripției inverse transcriptul îmbinat rezultat și integrarea provirusului rezultat în cromozomul celulei gazdă sau circularizarea vectorului HBV, gena indicator poate fi acum transcrisă funcțional de propriul său promotor. Intronul inversat, constând dintr-un sit donor și acceptor îmbinat pentru îndepărtarea intronului, este localizat de preferință, în regiunea de codificare a genei indicator, în scopul distrugerii translației genei indicator. Donorul și acceptorul îmbinați pot fi orice donor și acceptat îmbinat. Un donor-receptor îmbinat este donorul îmbinat IE CMV și acceptorul îmbinat al celui de-al doilea exon al genei globinei alfa umane (“intron A”).
Vector viral genă indicator - Construcție
Așa cum s-a folosit aici, “vector viral genă indicator” se referă la un vector (i) cuprinzând o genă indicator și elementele sale de control și una sau mai multe gene virale. Vectorul viral genă indicator este asamblat de la o casetă genă indicator și un “vector viral”, definit
935
940
945
950
955
960
965
970
975
RO 118887 Β1 mai jos. Vectorul viral genă indicator poate să includă suplimentar un intensificator, semnale de îmbinare, secvențe de poliadenilare, terminatori transcripționali, sau alte secvențe regulatoare. Suplimentar, vectorul viral genă indicator poate fi funcțional sau nefuncțional. în eventualitatea că segmentele virale care sunt ținta medicamentului antiviral nu sunt incluse în vectorul viral genă indicator ele pot fi furnizate într-un al doilea vector. O “casetă genă indicator” cuprinde o genă indicator și elemente de control. “Vector viral” se referă la un vector care cuprinde câteva sau toate dintre următoarele: gene virale care codifică un produs al genei, secvențe de control, secvențe virale organizate, și în cazul unui retrovirus, secvențe de integrare. Vectorul viral poate să includă suplimentar unul sau mai multe segmente virale din care unul sau mai multe pot fi ținta unui medicament antiviral. Două exemple ale unui vector viral care conține gene virale sunt denumite până aici ca un “vector viral genomic” și un “vector viral subgenomic”. Un “vector viral genomic” este un vector care poate cuprinde o deleție a uneia sau mai multe gene virale pentru a face virusul incompetent pentru replicare, dar care altfel păstrează caracteristicile expresiei mARN-ului și prelucrării virusului complet. într-o realizare pentru un test de rezistență și sensibilitate a HIV, vectorul viral genomic cuprinde genele HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, și nef o parte, cea mai mare parte sau în întregime env poate fi deletată. Un “vector viral subgenomic” se referă la un vector care cuprinde regiunea de codificare a uneia sau mai multor gene virale care pot codifica proteinele care sunt ținta(le) medicamentului antiviral. în cazul HIV, o realizare preferată este un vector viral subgenomic care cuprinde gena HIV gag-pol. în cazul HBV o realizare preferată este un vector viral subgenomic care cuprinde gena P HBV. în cazul HIV, două exemple de clone provirale folosite pentru construcția vectorului viral sunt: HXB2 (Fisher și colab., (1986) Nature, 320, 367-371) și NL4-3. (Adachi și colab., (1986) J.Virol., 59, 284291). în cazul HBV, s-au caracterizat un număr mare de secvențe genomice de lungime întreagă și s-ar putea folosi pentru construcția vectorilor virali HBV: GenBank numerele M54923, M38636, J02203 și X59795. Genele de codificare virală pot fi sub controlul unui intensificator/promotor nativ sau un intensificator/promotor viral sau celular străin. O realizare preferată pentru un test rezistență și sensibilitate a HIV la medicament, este de a plasa regiunile de codificare genomice sau subgenomice virale sub controlul intensificatorului/promotorului nativ al regiunii HIV-LTR U3 sau intensificatorului/promotorului timpuriu imediat (IE) al CMV. O realizare preferată pentru un test rezistență și sensibilitate a HBV la medicament, este de a plasa regiunile de codificare genomice sau subgenomice virale sub controlul intensificatorului/promotorului timpuriu imediat (IE) al CMV. în cazul unui vector viral genă indicator care conține una sau mai multe gene virale care sunt ținte sau codifică proteine care sunt ținte ale unui medicament(e) antivirale atunci vectorul conține situri acceptoare ale secvenței de la pacient. Segmentele derivate de la pacient sunt introduse în situl receptor al secvenței pacientului în vectorul viral genă indicator care este denumit apoi vector test de rezistență, așa cum s-a descris mai sus.
“Situri acceptoare ale secvenței pacientului” sunt situri într-un vector pentru inserția segmentelor derivate de la pacient și numitele situri pot să fie: 1) situri de restricție unice introduse într-un vector prin mutageneză dirijată în sit; 2) situri de restricție unice întâlnite în mod natural în vector; sau 3) situri selectate în care se poate introduce segmentul derivat de la pacient folosind metode de donare alternativă (de exemplu, donare UDG). într-o realizare, situl acceptor al secvenței pacientului se introduce în vectorul viral genă indicator. Siturile acceptoare ale secvenței pacientului sunt localizate, de preferință, în sau lângă regiunea de codificare a proteinei virale care este ținta medicamentului antiviral. Secvențele virale folosite pentru introducerea siturilor acceptoare ale pacientului sunt alese, de preferință, astfel, încât să nu fie făcută nici o schimbare, sau o schimbare conservativă în secvența de codificare de aminoacid găsită la acea poziție. De preferință, siturile acceptoare ale
RO 118887 Β1
1030 secvenței pacientului sunt localizate într-o regiune relativ conservată a genomului viral pentru facilitarea introducerii segmentelor derivate de la pacient. Alternativ, siturile acceptoare ale secvenței pacientului sunt localizate între gene importante din punct de vedere funcțional sau secvențe regulatoare. Siturile acceptoare ale secvenței pacientului pot fi localizate la sau lângă regiuni din genomul viral care sunt relativ conservate pentru a permite inițierea prin primerul folosit pentru introducerea sitului de restricție corespondent în segmentul derivat de la pacient. Pentru îmbunătățirea suplimentară a reprezentării segmentelor derivate de la pacient, astfel de primeri pot fi desemnați ca depozite degenerate pentru acomodarea heterogenității secvenței virale, sau pot încorpora reziduuri cum ar fi, deoxiinozină (I) care are capacități multiple de împerechere a bazelor. Seturi de vectori test de rezistență care au situri acceptoare ale secvenței pacientului care definesc aceleași intervale sau sit de restricție suprapus se pot folosi împreună în teste de rezistență și sensibilitate la medicament pentru asigurarea segmentelor derivate de la pacient care, situri de restricție internă identice pentru un sit acceptor dat al secvenței pacientului, și ar putea fi astfel subreprezentate în orice vector test de rezistență singur.
Celule gazdă
Vectorul test de rezistență se introduce într-o celulă gazdă. Celule gazdă corespunzătoare sunt celule de la mamifere. Celule gazdă preferate sunt derivate de la țesuturi umane și celule care sunt ținte de principiu ale infecției virale. în cazul HIV acestea includ celule umane cum ar fi, celule T umane, monocite, macrofage, celule dendritice, celule Langerhans, celule stemice hematopoietice sau celule precursoare, și alte celule. în cazul HBV, celulele gazdă adecvate includ linii de celule de hepatom (HepG2, Huh 7), hepatocite umane primare, celule de la mamifere care se pot infecta prin HBV pseudotipic, și alte celule. Celule gazdă derivate de la om vor asigura ca medicamentul antiviral să pătrundă eficient în celulă și să fie convertit de mecanismul enzimatic celular în forma metabolică relevantă a inhibitorului antiviral. Celule gazdă sunt denumite până aici ca “celule gazdă organizate”, “celule gazdă vector test de rezistență”, sau “celule gazdă țintă”. O “celulă gazdă organizată” se referă la o celulă gazdă care asigură factori de trans-activare și proteine virale organizate necesare prin vectorii virali cu replicare defectivă folosiți aici, cum ar fi vectori test de rezistență, pentru a produce particulele virale ale vectorului test de rezistență. Organizarea proteinelor poate fi asigurată prin expresia genelor virale conținute în însăși vectorul test de rezistență, o expresie organizată a unui vector(i), sau ambelor. O celulă gazdă organizată este o celulă gazdă care este transfectată cu unul sau mai mulți vectori de expresie organizați și când s-a transfectat cu un vector test de rezistență, atunci s-a denumit până aici, “celulă gazdă vector test de rezistență” și este uneori denumită celulă gazdă organizată/celulă gazdă vector test de rezistență. Celule gazdă preferate pentru utilizare ca celule gazdă organizate pentru HIV includ celule renale embrionare umane 293 (293, Graham, F.L. și colab., J.Gen.Virol. 36:59,1977), BOSC23 (Pear și colab., Proc.Natl. Acad. Sci. 90, 8392, 1993), liniile de celule tsa54 și tsa201 (Heinzel și colab., J.Virol. 62, 3738, 1988), pentru HBV HepG2 (Galle și Theilmann, L.Arzheim.-Forschy Drug Res. (1990) 40, 1380-1382). (Huh, Ueda, K și colab. Virology 169, 213-216 *1989). O “celulă gazdă țintă” se referă la o celulă care trebuie să fie infectată prin particulele virale ale vectorului test de rezistență produse de către celula gazdă vector test de rezistență în care are loc expresia sau incubarea genei indicator. Celulele gazdă preferate pentru utilizare drept celule gazdă țintă includ celula T umană linii de celule leucemice incluzând Jurkat (ATCC T1B-152), H9 (ATCC HTB-176), CEM (ATCC CCL-119), HUT78 (ATCC T1B-161) și derivate de la acestea.
1035
1040
1045
1050
1055
1060
1065
1070
RO 118887 Β1
Teste de rezistență și sensibilitate la medicament
Testele de rezistență și sensibilitate la medicament ale acestei invenții se pot realiza în una sau mai multe celule gazdă. Sensibilitatea virală la medicament se determină sub forma concentrației de agent antiviral la care un procent dat al expresiei genei indicator este inhibat (de exemplu, IC50 pentru un agent antiviral este concentrația la care este inhibată 50% din expresie genei indicator). O curbă standard pentru sensibilitate la medicament antiviral se poate dezvolta pentru un segment viral care este, fie un segment viral standard de laborator, fie de la un pacient neinițiat (cu alte cuvinte, care nu a primit nici un medicament antiviral) folosind metoda acestei invenții. Corespunzător, rezistența la medicament viral este o scădere a sensibilității virale la medicament pentru un pacient dat, fie prin compararea sensibilității la medicament la un astfel de standard dat, fie prin obținerea măsurării secvențiale în timp la același pacient, cum s-a determinat prin inhibarea crescută a expresiei genei indicator (adică, expresie scăzută a genei indicator).
în primul tip de test de rezistență și sensibilitate la medicament, particule virale ale vectorului test de rezistență sunt produse de o primă celulă gazdă (celulă gazdă vector test de rezistență) care se pregătește prin transfectarea unei celule gazdă organizate cu vectorul test de rezistență și vector(i) organizați de expresie. Particulele virale ale vectorului test de rezistență sunt folosite apoi pentru infectarea unei a doua celule gazdă (celula gazdă țintă) în care este măsurată expresia genei indicator. Astfel, un sistem de două celule cuprinzând o celulă gazdă organizată care este transfectată cu un vector test de rezistență, care este apoi cunoscut ca o celulă gazdă vector test de rezistență, și o celulă țintă este folosită în cazul, fie al unei gene funcționale, fie al unei gene nefuncționale. Genele indicator funcționale sunt exprimate eficient la transfecția celulei gazdă organizate și vor necesita infecția unei celule gazdă țintă cu supernatantul celulei gazdă vector test de rezistență pentru realizarea testului acestei invenții. Gene indicator nefuncționale cu un promotor permutat, o regiune de codificare permutată, sau un intron inversat nu sunt exprimate eficient la transfecția celulei gazdă organizate și astfel, infecția celulei gazdă țintă poate fi atinsă, fie prin cocultivarea celulei gazdă vector test de rezistență și celulei gazdă țintă, fie prin infecția celulei gazdă țintă folosind supernatantul celulei gazdă vector test de rezistență. în al doilea tip de test de rezistență și sensibilitate la medicament, o singură celulă gazdă (celula gazdă vector test de rezistență) servește, de asemenea, ca o celulă gazdă țintă. Celulele gazdă organizate sunt transfectate și produc particule virale vector test de rezistență și unele celule gazdă organizate devin, de asemenea, ținta infecției prin particulele vectorului test de rezistență. Testele de rezistență și de sensibilitate la medicament care folosesc un singur tip de celulă gazdă sunt posibile cu vectori test de rezistență virală care cuprind o genă indicator nefuncțională, un promotor permutat, o regiune de codificare permutată, sau un intron inversat. Asemenea gene indicator nu sunt exprimate eficient de transfecția unei prime celule, dar sunt exprimate eficient la infecția unei a doua celule, și asigură astfel o ocazie pentru măsurarea efectului agentului antiviral aflat sub evaluare. în cazul unui test de rezistență și sensibilitate care folosește un vector test de rezistență cuprinzând o genă indicator nefuncțională, nici procedură de cocultivare, nici testul de sensibilitate și rezistență care folosește un singur tip de celulă, nu se poate folosi pentru infecția celulelor țintă. Un vector test de rezistență care cuprinde o genă indicator funcțională necesită un sistem de două celule care folosește supernatante filtrate de la celule gazdă vector test de rezistență pentru infectarea celulei gazdă țintă.
într-o realizare a invenției în cazul HIV, teste de rezistență bazate pe particule sunt realizate cu vectori test de rezistență derivați de la vectori virali genomici, adică, pLG-lucPPHS, pCG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-PB, pLG-lucPC-HS, pCG-lucPC-HS, pLGlucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-PB, pLG-lucll-HS, pCG-lucll-HS, pLG-lucll-PB, pCGlucll-Pb și pCG-CXCN(F-lucP)2-AA care sunt contransfectate cu vectorul de expresie
RO 118887 Β1
1125 organizat pVL-env4070A (denumit, de asemenea, pCXAS-4070Aenu). Alternativ, un test de rezistență bazat pe particule poate fi realizat cu vectori test de rezistență de rezistență derivați de la vectori virali subgenomici (adică pLG-lucPP-HS, pCS-lucPP-HS, pLS-lucPPPP, pCS-lucPP-PB, pLS-lucPP-HS, pCS-lucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-lucPC-PB, pLSlucll-HS, pCS-lucll-HS, pLS-lucll-PB și pCS-luc-ll-PB) care sunt contransfectați cu vectorul de expresie organizat pVL-env4070A și, fie pLTR-HIV3' sau pCMV-HIV3'. în altă realizare a invenției în cazul HIV, teste de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate folosind fiecare dintre vectorii test de rezistență prin transfecția celulelor gazdă selectate în absența vectorilor de expresie organizați.
în cazul testului de rezistență și sensibilitate bazat pe particule, particulele virale ale vectorului test de rezistență sunt produse de o primă celulă gazdă celulă gazdă vector test de rezistență care se prepară prin transfectarea unei celule gazdă organizate cu vectorul test de rezistență și vectorul(i) organizați. Apoi, particulele virale vector test de rezistență sunt folosite pentru infectarea unei a doua celule gazdă (celula gazdă țintă) în care se măsoară expresia genei indicator. într-un al doilea tip de test de rezistență și sensibilitate bazat pe particule, un singur tip de celulă gazdă (celula gazdă vector test de rezistență) servește ambelor scopuri: unele celule gazdă organizate dintr-o cultură dată sunt transfectate și produc particule virale vector test de rezistență și unele celule gazdă din aceiași cultură sunt ținta infecției de către particulele vector test de rezistență astfel produs. Teste de rezistență care folosesc un singur tip de celulă gazdă sunt posibile cu vectori test de rezistență care cuprind o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat, deoarece, astfel de gene indicator sunt exprimate eficient la infecția unei celule gazdă permisive, ele nu sunt exprimate eficient la transfecția aceluiași tip de celulă gazdă și astfel, asigură o ocazie de a măsura efectul agentului antiviral aflat sub evaluare. Pentru motive similare, teste de rezistență care folosesc două tipuri de celule se realizează prin cocultivarea celor două tipuri de celule ca o alternativă la infectarea celui de-al doilea tip de celulă cu particule virale obținute de la supernatantele primului tip de celulă.
în cazul testului de rezistență și sensibilitate care nu se bazează pe particule, testele de rezistență sunt realizate prin transfecția unei singure celule gazdă cu vectorul test de rezistență în absența vectorilor de expresie organizați. Teste de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate folosind vectori test de rezistență care cuprind gene indicator nefuncționare, fie cu promotori permutați, fie regiuni de codificare permutate, fie cu introni inversați. Aceste teste de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate prin transfecția unui singur tip de celulă gazdă cu fiecare vector test de rezistență în absența vectorilor de expresie organizați. Deși, genele indicator nefuncționale conținute în acești vectori test de rezistență nu sunt exprimate eficient la transfecția celulelor gazdă, există expresia detectabilă a genei indicator care rezultă de la transcripția inversă nevirală bazată pe particule. Transcripția inversă și transferul de bandă au ca urmare conversia genei indicator nefuncțională permutată la o genă indicator funcțională nepermutată. Deoarece, transcripția inversă este dependentă complet de expresia genei pol conținută în fiecare vector test de rezistență, agenții antivirali pot fi testați pentru capacitatea lor de a inhiba produsele genei pol codificate prin segmentele derivate de la pacient conținute în vectorii test de rezistență. în cazul HIV, transcripția inversă și transferul de bandă rezultă în conversia genei indicator nefuncțională la o genă indicator funcțională. Deoarece, transcripția inversă este complet dependentă de expresia segmentului derivat de la pacient conținut în fiecare vector test de rezistență, agenții antivirali pot fi testați pentru capacitatea lor de a inhiba produsele genei codificate de segmentele derivate de la pacient conținute în vectorii test de rezistență.
1130
1135
1140
1145
1150
1155
1160
1165
1170
RO 118887 Β1
Celulele gazdă organizate sunt transfectate cu vectorul test de rezistență și vector(i) de expresie organizați corespunzători pentru a produce celule gazdă vector test de rezistență. Agenți antivirali individuali, incluzând inhibitori ai transcriptazei inverse AZT, ddl, ddC, d4T și 3TC și inhibitorii proteazei saquinavir, ritonavir și indinavir, precum și combinații ale lor sunt adăugate la plăci individuale ale celulelor gazdă organizate la momentul transfecției lor, la un domeniu corespunzător de concentrații. De la 24 până la 48 h după transfecție, celule gazdă țintă sunt infectate prin cocultivare cu celule gazdă vector test de rezistență sau particule virale ale vectorului test de rezistență obținute din supernatante filtrate ale celulelor gazdă vector test de rezistență. Fiecare agent antiviral, sau combinația lor, se adaugă la celulele gazdă țintă înainte sau la momentul infecției pentru a atinge aceiași concentrație finală a agentului dat, sau agenților, prezenți în timpul transfecției.
Determinarea expresiei sau inhibării genei indicator în celulele gazdă țintă infectate prin cucultivare sau cu supernatante virale filtrate se face prin analiza expresiei genei indicator, de exemplu, în cazul unde gena indicator este gena lucde la licurici, prin măsurarea activității luciferazei. Reducerea activității luciferazei observată pentru celule gazdă țintă infectate cu un preparat dat de particule virale ale vectorului test de rezistență în prezența unui agent antiviral dat, sau agenți, așa cum s-a comparat la un control desfășurat în absența agentului antiviral, se referă în general, la logaritmul concentrației agentului antiviral ca o curbă sigmoidă. Această curbă de inhibiție se folosește pentru calcularea concentrației inhibitorii aparente (IC) a acelui agent, sau combinație de agenți, pentru produsul viral țintă codificat de segmentele derivate de la pacient prezente în vectorul test de rezistență.
în cazul unui test de rezistență și sensibilitate cu o celulă, celulele gazdă sunt transfectate cu vectorul test de rezistență și vectorul(ii) de expresie organizați corespunzători produc celule gazdă vector test de rezistență. Agenții antivirali individuali sau combinații ale lor, sunt adăugați la plăci individuale de celule transfectate la momentul transfecției lor, la un domeniu de concentrații corespunzător. De la 24 până la 72 h după transfecție celulele sunt colectate și analizate pentru activitatea luciferazei de la licurici. Deoarece, celulele transfectate în cultură nu exprimă eficient gena indicator, celulele transfectate din cultură la fel de bine ca celulele suprainfectate din cultură, servesc ca celule gazdă țintă pentru expresia genei indicator. Reducerea în activitatea luciferazei observată pentru celule transfectate în prezența unui agent antiviral dat, sau agenți, cum s-au comparat la un control desfășurat în absența agentului(lor) antivirali se referă în general, la logaritmul concentrației agentului antiviral ca o curbă sigmoidă. Această curbă de inhibare se folosește pentru calcularea concentrației inhibitorii aparente (IC) a unui agent, sau combinație de agenți pentru produsul viral țintă codificat de segmentele derivate de la pacient prezente în vectorul test de rezistență.
Medicamente antivirale/medicamente candidat
Medicamentele antivirale care trebuie să fie adăugate la sistemul de testare sunt adăugate la momente selectate depinzând de medicamentul antiviral țintă. De exemplu, în cazul inhibitorilor proteazei HIV, incluzând saquinavir, ritonavir, indinavir și nelfinavir, ele sunt adăugate la plăci individuale de celule gazdă organizate la momentul transfecției lor cu un vector test de rezistență, la un domeniu corespunzător de concentrație. Inhibitorii proteazei HIV sunt, de asemenea, adăugați la celule gazdă țintă ia momentul infecției pentru atingerea aceleiași concentrații finale adăugate în timpul transfecțiilor. Inhibitorii transcriptazei inverse HIV, incluzând AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC și nevaripină, sunt adăugați la plăcile individuale de celule gazdă țintă la momentul infectării prin particulele virale ale vectorului test de rezistență, la o concentrație de testat. Alternativ, medicamentele antivirale sunt prezente pe durata analizei. Concentrația test este aleasă dintr-un domeniu de concentrații care este de obicei, aproximativ 0,1 nM și aproximativ 100 M și mai specific, pentru fiecare dintre
RO 118887 Β1 următoarele medicamente: AZT, de la aproximativ 1 nM la aproximativ 5 (M; ddl, de la aproximativ 1 nM la aproximativ 25 (M; 3TC de la aproximativ 1 nM la aproximativ 50 (M; d4T de la aproximativ 1 nM la aproximativ 25 (M; și, nevrapină de la aproximativ 1 nM la aproximativ 100 M).
în altă realizare a acestei invenții, un compus antiviral candidat se testează în testul de rezistență și sensibilitate al acestei invenții. Compusul antiviral candidat se adaugă la sistemul de testat la o concentrație corespunzătoare și la momente selectate depinzând de proteina țintă a candidatului antiviral. Alternativ, mai mult decât un compus candidat antiviral se testează în combinație cu un medicament antiviral aprobat cum este AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, saquinavir, sau un compus care este supus experimentelor clinice, cum este ritonavir sau indinavir. Eficacitatea candidatului antiviral este evaluată prin măsurarea expresiei sau inhibării genei indicator. într-un alt aspect al acestei realizări, testul de sensibilitate și rezistență este folosit la cercetarea pentru mutantele virale. După identificarea mutantelor existente, fie la antivirale cunoscute, fie la antivirale candidat, mutantele rezistente sunt izolate și se analizează ADN-ul. Astfel, este asamblată o bandă de mutante virale rezistentă ce face posibilă căutarea de antivirale candidat, singure sau în combinație. Aceasta face posibil pentru o persoană cu pregătire obișnuită să identifice antivirale eficiente și să desemneze regimuri terapeutice eficiente.
Metode generale și materiale
Majoritatea tehnicilor folosite pentru construcția vectorilor și transfectarea și infectarea celulelor, sunt practicate pe larg în domeniu, și majoritatea practicienilor sunt familiarizați cu resursele de materiale standard care descriu condiții și proceduri specifice. Cu toate acestea, pentru comoditate, paragrafele care urmează servesc ca un ghid. “Plasmizii” și “vectorii” sunt desemnați printr-ο literă p urmată de litere și/sau numere. Plasmizii de start de aici sunt, fie accesibili comercial, accesibili publicului pe o bază nerestrictivă, sunt construiți de la plasmizi accesibili, în conformitate cu proceduri publicate. în plus, plasmizii echivalenți celor descriși care sunt cunoscuți în domeniu sunt evidenți pentru persoana cu pregătire obișnuită în domeniu.
Construcția vectorului invenției folosește tehnici de ligare și restricție standard, care sunt bine înțelese în domeniu (vezi, Ausubel și colab. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-lnterscience sau Maniatis și colab., în Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.), plasmizi izolați, secvențe ADN, sau oligonucleotide sintetizate sunt clivate, ajustate și relegate în forma dorită. Secvențele tuturor constructelor ADN care încorporează ADN sintetic s-au conformat prin analiza secvenței ADN (Sânger și colab., (1977) Proc. Natl.Acad.Sci. 74, 5463-5467).
“Digestia” ADN-ului se referă la clivajul catalitic al ADN-ului cu o enzimă de restricție care acționează numai la anumite secvențe, situri de restricție, din ADN. Diversele enzime de restricție folosite aici sunt accesibile comercial și condițiile lor de reacție, cofactorii și alte cerințe sunt cunoscute lucrătorului în domeniu cu pregătire obișnuită. Pentru scopuri analitice, se folosește de obicei 1 (g de plasmid sau fragment ADN cu aproximativ două unități de enzimă în aproximativ 20 (1 sau soluție tampon. Alternativ, un exces al enzimei de restricție se folosește pentru asigurarea digestiei complete a substratului ADN. Timpi de incubare de aproximativ 1 la 2 h la aproximativ 37°C se pot folosi pentru lucru, deși pot fi tolerate și variații. După fiecare incubare, proteina se îndepărtează prin extracție cu fenol/cloroform și poate fi urmată de extracție cu eter și acidul nucleic recuperat din fracțiunile apoase prin precipitare cu etanol dacă se dorește, se poate realiza separarea după mărime a fragmentelor clivate prin electroforeză în gel poliacrilamidic sau gel de agaroză folosind tehnici standard. O descriere generală a separărilor după mărime se găsește în Methods of Enzymology 65: 499-560 (1980).
1225
1230
1235
1240
1245
1250
1255
1260
1265
1270
RO 118887 Β1
Fragmentele de restricție clivate se pot teși la capete prin tratare cu fragmentul mare al ADN polimerazei I. E.coli (Klenow) în prezența a patru deoxinucleotide trifosfat (dNTP-uri) folosind timpi de incubare de aproximativ 15 la 25 min la 20°C în 50 mM Tris (pH=7,6) 50 mM NaCI, 6 mM MgCI2, 6 mM DTT și 5-10 mM dNTP-uri. Fragmentul Klenow umple capetele 5’ adezive, dar amestecă benzile unice 3' ieșite în afară chiar dacă sunt prezente cele 4 dNTP-uri. Dacă se dorește, se poate realiza reparația selectivă prin furnizarea numai a unei dNTP, sau cu dNTP-uri selectate, în limitările dictate de natura capetelor adezive. După tratament cu Klenow, amestecul se extrage cu fenol/cloroform și se precipită cu etanol. Tratamentul în condiții corespunzătoare cu nuclează S1 sau Ba1-31 are ca urmare hidroliza oricărei porțiuni cu o singură bandă.
Ligările sunt realizate în volume de 15-50 (1 în următoarele condiții și temperaturi standard: 20 mM ris-CI, pH=7,5, 10 mM MgCI2,10 mM DTT, 33 mg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCI, și fie 40 mM ATP, 0,01-0,02 unități (Weiss) ADN ligază T4 la 0°C (pentru ligare “capăt adeziv”), fie 1 mM ATP. 0,3-0,6 unități (Weiss) ADN ligază T4 la 14°C (pentru ligare “capăt teșit’). Ligările intermoleculare “capăt adeziv” sunt realizate de obicei la 33-100 (g/ml concentrații ADN total (5-100 mM concentrație finală totală. Ligări și teșiri intermoleculare la capăt (care, de obicei, folosesc un exces molar de 10-30 ori al linkerilor) sunt realizate la 1 mM concentrație finală totală.
“Expresie tranzitorie” se referă la o expresie neamplificată în aproximativ 1 zi la 2 săptămâni de transfecție. Momentul optim pentru expresie tranzitorie a unei proteine heteroloage particulare dorite poate să varieze depinzând de câțiva factori incluzând, de exemplu, orice factori transactivatori care pot fi folosiți, mecanisme de control translațional și celula gazdă. Expresia tranzitorie se întâlnește când plasmidul particular care s-a transfectat funcționează, adică, este transcris și translat. în acest timp, plasmidul ADN care a pătruns în celulă este în stare neintegrată, liber în nucleu. în această perioadă are loc transcripția plasmidului absorbit de către celulă. După transfecție, ADN-ul plasmidului poate să devină degradat sau diluat prin diviziunea celulei. Are loc o integrare oarecare în cromatina celulară.
în general, vectori care conțin promotori și secvențe de control care sunt derivate de la specii compatibile cu celula gazdă sunt folosite cu celula gazdă particulară. Promotori adecvați pentru utilizare cu gaze procariotice includ ilustrativ sisteme promotor beta-lactamază și lactoză, fosfatază alcalină, sistemul promotor triptofan (trp) și promotori hibrizi cum ar fi promotorul tac. Totuși, sunt corespunzători și alți promotori bacterieni funcționali. Suplimentar la procariote, microbi eucariotici cum ar fi, culturi de drojdie, pot fi, de asemenea, folosite. Saccharomyces cerevisiae, sau drojdia comună de panificație, este cel mai obișnuit microorganism eucariotic folosit, cu toate că numeroase alte tulpini sunt accesibile în mod obișnuit. Promotorii care controlează transcripția de la vectori în celule gazdă de la mamifere se pot obține din diverse surse, de exemplu, genomi ai virusurilor cum ar fi: polyoma, virusul simian 40 (SV40), adenovirus, retrovirusuri, virusul hepatitei B și, de preferință, citomegalovirus, sau de la promotori mamifere heterologe, de exemplu, promotorul b-actinei. Promotorul timpuriu și promotorul târziu ai virusului SV40 sunt obținuți în mod convenabil ca un fragment de restricție SV40, care conține, de asemenea, originea replicării virale SV40. Promotorul timpuriu imediat al citomegalovirusului uman este obținut în mod convenabil ca un gragment de restricție Hindlll E. Desigur, sunt, de asemenea, utili aici promotori de la celula gazdă sau specii înrudite.
Vectorii folosiți aici pot să conțină o genă de selecție, denumită, de asemenea, un marker selectabil. O genă de selecție codifică o proteină, necesară pentru supraviețuirea sau creșterea unei celule gazdă transformată cu vectorul. Exemple de markeri selectabili corespunzători pentru celule de la mamifere includ gena dihidrofolat reductază (DHFR), gena ornitin decarboxilază, gena de rezistență multiplă la medicamente (mdr), gena
RO 118887 Β1
1320 adenozin deaminază, și gena glutamin sintază. Când astfel de markeri selectabili sunt transferați cu succes într-o celulă gazdă de la mamifer, celula gazdă de la mamifer transformată poate să supraviețuiască dacă se plasează sub presiune selectivă. Există două categorii distincte larg folosite de regimuri selective. Prima categorie se bazează pe un metabolism al unei celule și folosește o linie de celule mutante cărora le lipsește capacitatea de a crește independent de un mediu suplimentar. A doua categorie este denumită selecție dominantă și se referă la o schemă de selecție folosită în orice tip de celulă și nu necesită folosirea unei linii de celule mutante. Aceste scheme folosesc un medicament pentru a opri creșterea unei celule gazde. Acele celule care au o genă nouă vor exprima o proteină care poartă rezistență la medicament și vor supraviețui selecției. Exemple de asemenea selecție dominantă folosesc medicamentele neomicină (Southem și Berg (1982), J. Molec. Appl. Genet. 1, 327), acid micofenolic (Mulligan și Berg (1980) Science 209, 1422), sau higromicină (Sugden și colab., (1985) Mol. Cell. Biol. 5,410-413). Cele trei exemple date mai sus folosesc gene bacteriene sub control eucariotic pentru a duce rezistența la medicamentul corespunzător neomicină (G418 sau genticină), xgpt (acid microfenolic) sau respectiv, higromicină.
“Transfecție” înseamnă introducerea ADN-ului într-o celulă gazdă astfel că ADN-ul se exprimă, atât funcțional, cât și în alt fel; de asemenea, ADN-ul poate să replice, fie ca un element extracromozomal, fie prin integrare cromozomală. Cu excepția unde este altfel dat, metoda folosită aici pentru transformarea celulelor gazdă este metoda coprecipitării fosfat de calciu a lui Graham și van der Eb (1973) Virology, 52,456-457. Metode alternative pentru transfecție sunt electroporarea, metoda DEAE-dextran, lipofecția și biolistică (Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press).
Celule gazdă pot fi transfectate cu vectorii de expresie ai prezentei invenții și cultivate în mediu nutritiv convențional modificat așa cum este corespunzător pentru inducerea promotorilor, selectarea transformanților sau amplificarea genelor. Celule gazdă sunt cultivate în F12:DMEM (Gibco) 50:50 cu glutamină adăugată și fără antibiotice. Condiții de cultură, cum ar fi temperatura, pH-ul și altele, sunt cele folosite anterior cu celula gazdă selectată pentru expresie, și vor fi evidente pentru lucrătorul cu pregătire obișnuită în domeniu.
Exemplele care urmează doar ilustrează cel mai bun mod cunoscut acum pentru practicarea invenției, dar nu vor fi interpretate ca limitând invenția.
Avantajul metodei este acela că aplicând etapele și luând în considerare ordinea de desfășurare a acestora se obține o evaluare exactă a sensibilității sau eficacității și rezistenței omului la medicamente.
în continuare, se prezintă mai multe figuri, în legătură cu exemplele de realizare ale invenției.
- fig.1 - A -, reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic al HIV-1. Proteinele virale sunt codificate în fiecare dintre cele trei cadre de citire prin genele gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env și net ARN-ul este transcris de la ADN viral și este prelucrat de enzime virale și celulare, dând naștere, atât la ARN genomic viral, cât și la mARN. Sunt indicate elementele U3, R și U5 ale repetiției virale terminale lungi (LTR).
- B -, reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral genomic HIV care conține următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': 1) o regiune HIV-LTR U3, 2) o regiune HIV-LTR R, 3) o regiune HIV-LTR U5, 4) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, și 5) un HIV-LTR 3'.
- C -, reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral genomic HIV care conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': 1) un intensificator promotor IE CMV, 2) o regiune HIV-LTR R, 3) o regiune HIV-LTR U5, 4) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, și 5) un HIV-LTR 3'.
1325
1330
1335
1340
1345
1350
1355
1360
1365
RO 118887 Β1
- D reprezentare diagramatică generalizată a vectorului subgenomic viral HIV care conține următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': 1) o regiune HIV-LTR U3,
2) o regiune HIV-LTR R, 3) o regiune HIV-LTR U5, 4) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, și 5) un HIV-LTR 3'.
- E -, reprezentare diagramatică generalizată a vectorului subgenomic viral HIV care conține următoarele elemente într-o orientare 5‘ spre 3': 1) un intensificator/promotor IR CMV, 2) o regiune HIV-LTR R, 3) o regiune HIV-LTR U5, 4) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, și 5) un HIV-LTR 3'.
- fig.2, - A reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic al HIV-1.
- B -, reprezentare diagramatică a vectorului test de rezistență cuprinzând o genă indicator nefuncțională care cuprinde un promotor permutat având următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': 1) o regiune HIV-LTR U3 (1LG-lucPP-HS și pLG-lucPP-PB) sau un intensificator-promotor (pCG-lucPP-HS și pCG-lucPP-PB), 2) o regiune HIV-LTR R,
3) o regiune HIV-LTR U5 care conține iserat un promotor ARN polimerază fag T7 (aici cunoscut ca promotor T7) cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor, 4) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env deletată, și nef, 5) segmente) derivate de la pacient introduse în situri acceptoare ale secvenței pacientului, 6) o casetă a genei indicator intradusă în gena env deletată, și 7) un HIV-LTR 3'.
- C -, reprezentare diagramatică care arată conversia genei indicator nefuncționale (promotor permutat) vectorul test de rezistență, descris în 2(a), la o genă indicator funcțională prin transcriptaza inversă. Conversia la o genă indicator funcțională rezultă din repoziționarea promotorului T7 față de regiunea de codificare a genei indicator.
- fig.3, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic al HIV-1.
- B reprezentare diagramatică a vectorului de expresie organizat pLTRHIV3' care asigură genele vif, vpr, tat, rev, vpu și nef, dintre care fiecare este exprimată ca un mArN subgenomic îmbinat transcris de la regiunea HIV LTR U3.
- C -, reprezentare diagramatică a vectorului de expresie organizat pCMVHIV3' care asigură genele vif, vpr, tat, rev, vpu, și nef dintre care fiecare este exprimată ca un mARN subgenomic îmbinat transcris de la intensificatorul promotorul IE CMV.
- D -, reprezentare diagramatică a vectorului de expresie organizat pVLenv4070A [pCXAS(4070A env)] care asigură produsul genei amfotropice MLV env)] care asigură produsul genei amfotropice MLV env, prin transcripție de la intensificatorulpromotorul IE CMV.
- fig.4, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic al HIV.
- B -, reprezentare diagramatică generalizată a vectorilor test de rezistență cuprinzând o genă indicator nefuncțională care cuprinde o regiune de codificare permutată conținând următoarele elemente într-o orientare 5‘ spre 3': 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLGlucPC-HS și pLG-lucPC-PB) sau un prim intensificator-promotor CMV le (pCG-lucPC-HS și pCG-lucPC-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunile de codificare ale genelor gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env deletată, și nef, 4) un segment(e) derivate de la pacient introdusă în siturile acceptoare ale secvenței pacientului, 5) o primă casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 5' a genei luciferază, introdusă în gena env deletată, 6) o a doua casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 3' a genei luciferază, introdusă într-o regiune HIV-LTR U3 deletată 3', și 7) un HIV-LTR R 3' și regiunea U5.
- C -, reprezentare diagramatică care prezintă conversia genei indicator nefuncțională (regiune de codificare permutată) în vectorul test de rezistență, descris 4(a), la o genă indicator funcțională prin transcriptază inversă. După transcriere inversă și transfer de bandă, regiunea de codificare 3' luciferază este copiată de la LTR 3' la LTR 5', permițând transcripția mARN-ului care se poate îmbina pentru generarea regiunii de codificare luciferază funcțională.
RO 118887 Β1
1420
- fig.5, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic al HIV-1.
- B -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorilor test de rezistență care cuprind o genă indicator nefuncțională cuprinzând un intron inversat conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLG-lucll-HS și pLG-lucll-PB) sau un prim intensificator-promotor (pCG-luclI-HS și pCG-lucll-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-po/, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, 4) segment(e)derivate de la pacient introduse în situl acceptor al secvenței pacientului, 5)o casetă a genei indicator introdusă în gena env deletată, și 6) un HIV-LTR 3‘.
- C -, reprezentare diagramatică care arată conversia genei indicator nefuncționale (intron inversat) în vectorul test de rezistență, descris în 5(a), la o genă indicator funcțională prin transcriptază inversă. Orientarea transcripțională globală a casetei genei indicator este opusă celei a primului intensificator-promotor CMV și LTR-urilor virale, în timp ce orientarea intronului artificial este aceiași cu a elementelor din urmă. Transcripția genei indicator de către al doilea intensificator-promotor CMV nu conduce la producerea de transcripție, deoarece intronul inversat nu poate fi îmbinat în această orientare. Transcripția genei indicator de către LTR-ul viral 5' sau primul intensificator-promotor IE CMV, totuși, conduce la îndepărtarea intronului inversat prin îmbinarea ARN, deși gena indicator nu este exprimată funcțional, deoarece transcriptul rezultat are o orientare antisens. După transcripția inversă a acestui transcript și integrarea ADN-ului proviral rezultat gena poate fi transcrisă funcțional de către al doilea intensificator-promotor deoarece intronul inversat a fost anterior îndepărtat.
- fig.6, - A -, Reprezentare diagramatică a structurii ADN-ului genomic HIV este prezentată mai sus (a) și (b).
- B -, o reprezentare diagramatică a vectorilor test de rezistență care cuprind o genă indicator funcțională având următoarele elemente într-o orientare 5‘ spre 3': 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLG-luc-HS-1 și pLG-luc-PB-1) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCG-luc-HS-1 și pCG-luc-PB-1), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunea de codificare a genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, 4) o casetă a genei indicator funcțională introdusă în gena envdeletată, cu o orientare transcripțională opusă față de LTR-urile virale și 5) un HIV-LTR 3‘.
- C -, o reprezentare diagramatică a vectorilor test de rezistență care cuprind o casetă a genei indicator funcțională (pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-HS-2 și pCGluc-PB-2) în care orientarea transcripțională a casetei genei indicator este aceiași ca a LTRurile virale.
- fig.7, - A -, demonstrarea sensibilității la medicament folosind vectori test de rezistență, pCG-CXCN (F-lucP)2-AA și pCG-CXAT(F-lucP)2-AA. Datele sunt prezentate ca activitate a genei luciferază în celule gazdă țintă ca Unități Relative Lumină (RLU) în absență de AZT sau în prezența a 5 mM AZT.
- B -, sensibilitate la medicament și test de rezistență realizat cu vectorul test de rezistență, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA conținând segmente “test” derivate de la pacient pretratament și post tratament AZT. Vectorii test de rezistență sunt derivați vectorul genomic viral genă indicator, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA. Datele sunt prezentate ca procent inhibare a activității genei luciferază în celule gazdă țintă contra concentrație AZT (log10). pCGCXCN(F-lucP)2-AA este marcat sub formă de căsuțe pline. PCG-CXCN(F-lucP)2-AA care conține segmente derivate de la pacient, înaintea tratamentului AZT este marcat ca cercuri pline și tratamentul post AZT ca triunghiuri pline.
1425
1430
1435
1440
1445
1450
1455
1460
1465
RO 118887 Β1
- C sensibilitate la medicament și test de rezistență realizat cu vectorul test de rezistență, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA care conține segmentul transcriptază inversă derivat de la clona provirală activă biologic, pNL4-3. Datele sunt prezentate ca procent inhibare a activității gene luciferază în celule gazdă țintă contra concentrație nevirapină (log10) și este marcată sub formă de căsuțe pline.
- D sensibilitate la medicament și test de rezistență realizat cu vectorul test rezistență, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA care conține segmentul protează derivat de la clona provirală activă biologic, pNL4-3. Datele sunt prezentate ca procent inhibare a activității genei luciferază în celule gazdă țintă contra concentrație indinavir (log10) și este marcată cu căsuțe pline.
- fig.8, - A reprezentare diagramatică a structurii ARN-ului pregenomic al HIV. ARN-ul pregenomic este arătat ca o linie groasă. Secvențele de repetiție directă (DR) sunt ca dreptunghiuri închise. Sunt prezentate pozițiile secvenței semnal de encapsidare ((). Genele C, P, S, și X sunt arătate ca dreptunghiuri deschise. Sunt indicate regiunile proteinei terminale (TP), distanțierului, ADN polimerază/transcriptază inversă (pol/RT), Rnază ale genei P. Siturile de inițiere a translației C, P, S, și X sunt indicate prin triunghiuri umbrite.
- B -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral sub-genomic, genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS-), o componentă a sistemului vectorului test de rezistență, care cuprinde o casetă genă indicator și un intron inversat care conține următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și 5' ((codonul de inițiere a translării pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator nefuncțională în care ORF genă indicator conține un intron inversat, (4) regiunea genomului HBV care conține DR2, DR1*, 3's, și regiunea semnal de poliadenilare (pA) 3'HBV.
- C -, reprezentare a formei ADN covalent circular închis (cccADN) al vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(F-IG)(ll8PSAS-), care conține o casetă a genei indicator asamblată ca urmare a replicării virale HBV.
- D -, reprezentare diagramatică a unui exemplu de vector organizat, pPKCPX, un component al sistemului vector test de rezistență cuprinzând un segment derivat de la pacient care conține următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': (1) regiunea intensificator-promotor CMV IE, (2) regiunea care înconjoară genomul HBV de la codonul de inițiere al translației C ORF până la semnalul 3' pA și care include genele C, P, S și X. Gena C a vectorului organizat, pPK-CPX, este modificată astfel încât nu conține secvențele pre-C ORF și nu exprimă proteinele S (așa cum s-a arătat prin X la siturile de inițiere a translației).
- E -, reprezentare diagramatică a unui vector organizat, suplimentar, pPK-S, care asigură proteinele genei S, ce este cotransfectată cu sistemul vector test de rezistență cuprinzând vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS-), și plasmidul organizat, pPK-CPX.
- F -, reprezentare diagramatică a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(NFIG)II-(PSAS+), care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu un intron inversat conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': (1) regiunea intensificator-promotor CMV IE, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și 5' ((regiunea codonului de inițiere a translației pre-C ORF esdte elimiantă), (3) casetă genă indicator (care conține un intron inversat) în regiunea genomului HBV) din regiunea genomului HBV care conține un segment al genei P derivat de la pacient, (4) regiunea genomului HBV care conține DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA.
- G -, reprezentare diagramatică a formei ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(F-IG9ll-(PSAS+), conținând o casetă genă indicator funcțională și un segment al genei P derivat de la pacient asamblate ca urmare a replicării virale.
RO 118887 Β1
- Η -, reprezentare diagramatică a unui vector organizat, pPK-CSX, ce asigură proteinele genelor C, S și X, care este cotrasfectat cu vectorul test de rezistență, pCSHBV(NF-IG) (ll-(PSAS+).
- fig.9, - A -, reprezentare a structurii pregenomice a ARN-ului pregenomic al HBV.
- B -, reprezentare diagramatică a vectorului viral genă indicator HBV conținând o casetă a genei indicator nefuncționale. Sunt arătate siturile pentru legarea primerului pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare ale primerului înainte (Pf) și primerului invers (Pr) nu constituie o unitate de amplificare funcțională în forma lineară a vectorului ce se folosește pentru transfectarea celulelor gazdă organizate. Situl de legare Pr este desemnat să înconjoare joncțiunea secvenței care se generează prin îmbinarea ARN-ului pregenomic.
- C -, reprezentare diagramatică a formei rc-ADN a vectorului viral genă indicator descris în 10b. Sunt arătate siturile de legare ale primerului pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare a primerului Pf și Pr constituie o unitate de amplificare funcțională în componentul ADN bandă plus a formei rc-ADN și componente ADN bandă plus și minus ale vectorului care se generează prin replicare ADN HBV din particulele virusului produs în organizarea celulelor gazdă. Situl de legare Pr este asamblat prin îmbinarea ARN-ului pregenomic.
- D -, reprezentare diagramatică a unui vector viral genă indicator care conține o casetă genă indicator nefuncțională. Sunt arătate situri de legare primer pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare Pf și Pr constituie o unitate de amplificare funcțională care se folosește pentru transfectarea organizării celulelor gazdă, dar situl de legare Pf nu este adiacent la situl de legare al sondei de detecție exonucleară (sondă) în forma neîmbinată a vectorului. Acest aranjament al Pf, Pr și siturile de legare exonuclează nu constituie o unitate de detecție exonuclează eficientă.
- E -, reprezentarea diagramatică a formei rc-ADN a vectorului viral genă indicator descris în fig.9D. Sunt arătate siturile de legare a primerului pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare a primerului Pf și Pr constituie o unitate de amplificare funcțională în formele rc-ADN și cccADN care sunt generate prin replicarea ADN HBV în organizarea celulelor gazdă. Localizarea sitului de legare Pf este adusă imediat adiacent la situl de legare al sondei de detecție exonuclează (sondă) în formele rc-ADN și cccADN ale vectorului. Acest aranjament al siturilor de legare Pf, Pr și sondei constituie o unitate eficientă de detecție a exonucleazei.
- F -, reprezentare diagramatică a unui vector viral genă indicator HBV. Sunt prezentate siturile de legare a primerului pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare ale primerului înainte (Pf) și primerului invers (Pr) nu constituie o unitate de amplificare funcțională în forma lineară a vectorului ce se folosește pentru transfectarea celulelor gazdă organizate.
- G -, reprezentare diagramatică a formei rc-ADN a vectorului viral genă indicator descris în fig.9F. Sunt prezentate situri de legare ale primerului pentru amplificarea unei secvențe ADN țintă. Localizarea și orientarea siturilor de legare ale primerului Pf și Pr constituie o unitate de amplificare funcțională în banda ADN plus componentă a formei rcADN și banda plus și minus, componente ale formei cccADN a vectorului care este generat prin replicare ADN HBV din particulele virale produse în celulele gazdă organizate.
- fig. 10, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ARN-ului pregenomic al HBV.
- B -, reprezentare diagramatică a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-), un component al sistemului vector test de rezistență care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat conținând următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea
1520
1525
1530
1535
1540
1545
1550
1555
1560
1565
RO 118887 Β1
5' a genomului HBV și DR1 și 5' (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) caseta genei indicator nefuncțională asamblată, astfel, încât, regiunea promotorului este poziționată 3', adică în aval de ORF-ul genei indicator, (4) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere a translației preC ORF este eliminat). Vectorul organizat, pPK-CPX, un component al sistemului vector test de rezistență cuprinzând un segment al genei P derivat de la pacient este prezentat în fig.8D și organizarea vectorului S pPK-S, este prezentată în fig.8E.
- C reprezentare diagramatică a formei ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului viral subgenomic genă indicator pCS-HBV (F-IC)PP(PSAP-), conținând o casetă a genei indicator funcțională asamblată ca o urmare a replicării virale HBV.
- D -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS+), care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat conținând elementele următoare într-o orientare 5' spre 3‘: (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și copia 5' a ((codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat) (3) o regiune intensificator-promotor (promotor permutat), (4) gena P conținând segmentul derivat de la pacient (5) ORF-ul genei indicator (6) un sit de intrare ribozom intern (IRES), și (7) regiunea 3' a genomului HBV care ckonține DR2, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat). Vectorul organizat pPK-CSX, care asigură genele C, S și X este cotransfectat cu vectorul test de rezistență pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS+) și este arătat în fig.8H.
- E -, reprezentare diagramatică a formei de ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului test de rezistență pCS-HBV(F-IG)PP)PSAS+) conținând o casetă a genei indicator funcțională și un segment a genei P derivat de la pacient, asamblat ca un rezultat al replicării virale HBV.
- fig.11,- A -, reprezentare diagramatică a structurii ARN-ului pregenomic al HBV.
- B -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS-(PSAS-), un component al sistemului vector test de rezistență care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și un sit de inițiere a translației care conține elementele următoare într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor CMV IE, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5' ((codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) un ORF al genei indicator căruia îi lipsește un sit de inițiere a translației, (4) o regiune intensificator-promotor (promotor permutat), (5) regiunea 3' a genomului HBV care conține DR2, codonul de inițiere a translației pre-C ORF, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA. Vectorul organizat, pPK-CPX, un component al sistemului vectorului test de rezistență care cuprinde un segment derivat de la pacient este prezentat în fig. 8D și organizarea vectorului S, pPK-S, este prezentată în fig.8E.
- C -, reprezentare diagramatică a formei de ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(F-IG)PPTIS-(PSAS-), care conține o casetă a genei indicator funcțională asamblată ca rezultat al replicării virale.
- D o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+), care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5' ((codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) un ORF al genei indicator căruia îi lipsește un sit de inițiere a translației, (4) gena P care conține segmentul derivat de la pacient, (5) o regiune intensificator-promotor (promotor permutat), (6) regiunead 3' a genomului HBV conținând DR2, codonul de inițiere a translației, pre-C ORF, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3’HBV pA. Vectorul organizat, pPK-CSX, care furnizează genele C, S și X este cotransfectat cu vectorul test de rezistență, pCS-HBV (NF-IG)PPTIS(PSAS+), și este arătată în fig.8H.
RO 118887 Β1
- E reprezentarea a formei ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului test de rezistență pCS-HBV(F-IG)PPTIS(PSAS+), care conține o casetă a genei indicator funcțională și un segment al genei P derivat de la pacient asamblat ca urmare a replicării virale HBV.
- fig. 12, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ARN-ului pregenomic al HBV.
- B -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PCR-(PSAS-), un component al sistemului vector de rezistență care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu regiune de codificare conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3': (1) regiunea intensificator promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5' ((codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă a genei indicator nefuncțională asamblată, astfel, încât regiunea promotor și o porțiune 5' a regiunii de codificare sunt poziționate 3', adică în avalul restului porțiunii 3' a regiunii de codificare, (4) regiunea 3' a genomului HBV care conține DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat). Vectorul organizat, pPK-CPX, un component al sistemului vector de testare a rezistenței este prezentat în fig.8D și vectorului organizat S, pPK-S, este arătată în fig.8E.
- C -, reprezentare diagramatică a formei ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS-), care conține o casetă a genei indicator funcțională asamblată ca un rezultat al replicării virale HBV.
- D -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+), care cuprinde o genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3‘: (1) regiunea intensificator-promotor CMV IE (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5' ((codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) porțiunea 3' a ORF-ului genei indicator începând cu o secvență acceptor îmbinată în orientare inversă, (4) gena P care conține segmentul derivat de la pacient, (5) o regiune intensificator promotor, (6) porțiunea 5' a ORF-ului genei indicator care se termină într-o secvență donoare îmbinată în ordine inversă, (7) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat). Vectorul organizat, pPK-CSX, care asigură genele C, S, și X este cotransfectat cu vectorul test de rezistență, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+), și este prezentat în fig.8H.
- E -, reprezentare a formei ADN-ului covalent circular închis (cccADN) al vectorului test de rezistență, pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS+), conținând o casetă a genei indicator funcțională și un segment al genei P derivat de la pacient asamblat ca urmare a replicării virale HBV.
- fig.13, - A -, reprezentare diagramatică a structurii ARN-ului pregenomic al HBV.
- B -, o reprezentare diagramatică generalizată a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), un component al sistemului vector test de rezistență care cuprinde o casetă a genei indicator funcțională conținând următoarele elemente într-o orientare 5' spre 3‘: (1) regiunea intensificator-promotor, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5' ((codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă a genei indicator funcțională, (4) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), vectorul organizat, pPK-CPX, un component al sistemului vector test de rezistență care cuprinde un segment al genei P derivat de la pacient este prezentat în fig.8D și vectorul organizat S, pPK-S, este arătat în fig.8E.
- C -, reprezentare diagramatică a formei de ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului viral subgenomic genă indicator, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), care conține o genă indicator funcțională.
1620
1625
1630
1635
1640
1645
1650
1655
1660
1665
RO 118887 Β1
- D o reprezentare diagramatică a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(FIG)(PSAS+), care cuprinde o genă indicator funcțională conținând elementele următoare într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV care include DR1 și 5' ((codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă a genei indicator funcțională, (4) gena P conținând segmentul derivat de la pacient, (5) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat). Vectorul organizat, pPKCSX, care asigură genele C, S, și X, care este cotransfectat cu vectorul test de rezistență, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+), este arătat în fig. 8H.
- E -, reprezentare diagramatică a formei de ADN covalent circular închis (cccADN) a vectorului test de rezistență, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+), care conține o genă indicator funcțională.
Se dau, mai jos, mai multe exemplele de realizare ale invenției:
Exemplul 1. Test de rezistență și sensibilitate a HIV la medicamente folosind vectori test de rezistență care cuprind segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat
Vector viral genă indicator-Construcție
Vectori virali genă indicator conținând o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat sunt desemnate folosind vectori virali HIV, atât genomici, cât și subgenomici care cuprind gene virale care sunt ținta(le) medicamentelor antivirale. Vectori virali genă indicator pLG-lucPP și pCG-lucPP sunt bazați pe vectorii virali genomici pLG și pCG; fiecare poartă o deleție în gena env HIV. Vectorul test de rezistență derivați de la vectori virali genă indicator genomică, pLG-lucPP și pCG-lucPP, conțin un sit acceptor pentru secvență pacient pentru introducerea segmentului derivat de la pacient și sunt folosiți în legătură cu un vector de expresie organizat care codifică produsul genei amfotropice MLV 4070A env. Vectori virali genă indicator pLS-lucPP și pCS-lucPP sunt bazați pe vectorii subvirali pLS și pCS; fiecare codifică numai gena gag-polHIV. Vectori test de rezistență derivați de la vectorii virali genă indicator subgenomică, pLS-lucPP și pCS-lucPP, conțin un sit acceptor secvență pentru inserția segmentului derivat de la pacient și sunt folosiți în legătură cu un prim vector de expresie organizat care codifică genele vif, vpr, tat, rev, vpu și nef HIV, și un alt vector organizat care codifică produsul genei amfotropice MLV 4070 env.
Vectori virali HIV - genomici și subgenomici
Vectorii virali HIV sunt desemnați folosind secvențele biologic active ale clonei provirale HXB2 (Fisher și colab. (1986) Nature 320, 367-371). Sunt desemnate două tipuri de vectori virali: vectori virali genomici cu deleții într-o singură genă cum ar fi, env, dar care altfel păstrează caracteristicile de expresie și prelucrare ale mARN-ului ale virusului complet, și vectori virali subgenomici care includ numai una sau câteva gene care sunt de obicei țintele specifice ale testării sensibilității, cum ar fi, gag-polsau cărora le pot lipsi cu totul genele virale. Ambele tipuri de vectori au un sit de restricție unic în genomul viral pentru inserția unei casete a genei indicator, precum și situri acceptoare pentru secvența de la pacient, adică situri de restricție unică lângă sau în gena țintă a antiviralului (de exemplu, pol) pentru a permite inserția secvențelor HIV derivate de la pacient. Suplimentar ambele tipuri de vector sunt desemnate pentru încorporarea, fie a intensificatorului-promotorului nativ al regiunii HIV-LTR U3, fie a unui intensificator promotor străin de la regiunea timpurie imediată a CMV (IE). Pentru construcția ADN-urilor plasmidului sunt folosite metode standard (Ausubel și colab. (1987) Current Protocols in Molecular Bology, Wiley-lnterscience). Secvențele tuturor constructelor ADN care încorporează ADN sintetic sunt confirmate prin analiza secvenței ADN (Sânger și colab. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467).
RO 118887 Β1
1715
Secvențe HIV sunt obținute de la plasmidul PBS-HIV (PAGE și colab. (1990) J. Virol. 64,5270-5276) care conține secvența ADN provirală HXB2 pe un fragment de restricție Hpal la Xbal inserat în polilinkerul vectorului de donare plasmid pBluescript KS (+) (Stratagene, San Diego, CA). Deoarece, această clonă provirală conține ADN necaracterizat care mărginește ADN-ul din situl de integrare provirală, sunt folosite două etape de mutageneză dirijată în sit pentru îndepărtarea de astfel de secvențe folosind plasmid PBS-HIV ca matriță, în etapa unu, secvențe umane adiacente la 5' LTR sunt îndepărtate folosind oligonucleotida 1, care conține secvențele care urmează într-o direcție 5‘ la 3': 1) o secvență complementară la primele 18 nucleotide ale provirusului integrat, în stânga regiunii U3, 2) un sit Smal de 6 nucleotide, și un 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la regiunea din pBluescript KS (+) exact dincolo de polilinkerul și promotorul fagic T3. în a doua etapă, secvențele umane adiacente la 5' LTR sunt îndepărtate folosind oligonucleotida 2, care conține următoarele secvențe /5' la 3'):1) o secvență de 18 nucleotide complementară la regiunea din pBluescript Ks (+) exact dincolo de situl Pvul, în gena LacZ, 2) un sit Xbal de 6 nucleotide, și 3) o secvență complementară la ultimele 18 nucleotide ale provirusului integrat, în dreapta regiunii U5. Plasmidul rezultat este numit PBS-HXB2.
Vectori virali genomici și subgenomici care folosesc regiunea HIV-LTR U3 ca intensificator-promotor pentru expresia genelor antivirale țintă (fig.1) sunt derivate fiecare de la plasmidul PBS-HXB2 printr-o singură etapă de mutageneză dirijată în sit. Vectorul viral genomic pLG, care este deletat pentru gena env, se prepară folosind oligonucleotida 3 care conține următoarele secvențe (5‘ la 3‘): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 7626 la 7643 ale HXB2 în gena env (toate coordonatele pentru HXB2 sunt prin referire la GenBank, numărul de acces K03455), 2) un sit Notl de 8 nucleotide, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 6384 la 6401 ale HXB2 în gena env. Vectorul viral subgenomic pLS, care este deletat pentru genele env, tat, rev, vif, vprșî vpu, se pregătește folosind oligonucleotida 4 care conține următoarele secvențe (5' la 3‘):1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 7626 la 7643 ale HXB2 din gena env, 2) un sit Notl de 8 nucleotide, și 3) o secvență nucleotidică de 18 nucleotide complementară la pozițiile 5109 la 5126 ale HXB2 în gena vif.
Vectorii virali genomici și subgenomici care folosesc regiunea IE a CMV ca intensificator-promotor pentru expresia genelor țintă antivirale sunt derivate de la plasmizii pLG și pLS, și sunt numiți pCG și, respectiv pCS (fig.1). Vectorul viral genomic pCG se prepară în două etape. în prima etapă, se prepară un plasmid intermediar din 2 fragmente ADN: 1 (un fragment vector de 11,2 kB preparat de la digestia plasmidului pLG cu Smal și tratarea vectorului cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 0,9 kB conținând intensificatorul-promotorul IE CMV preparat prin digestia plasmidului pVL-1 (descris mai jos) cu Smal. Plasmizii care conțin regiunea IE CMV în aceiași orientare transcripțională ca LTRurile virale identificați prin alcătuirea hărții de restricție. în a doua etapă, plasmidul pCG se prepară de la acest plasmid intermediar prin mutageneză dirijată în sit pentru legarea intensificatorului-promotorului la regiunea 5-LTR R la o poziție care permite transcripția inițierii pentru a se întâlni la începutul regiunii R, folosind oligonucleotida 5 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 455 la 472 ale HXB2 la începutul regiunii r, și 2) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile -18 la -1 ale intensificatorului-promotorului CMV IE (coordonate de referință la Boshart și colab. (1985) Cell 41, 521-530). Vectorul viral subgenomic pCS este derivat de la plasmidul pCG și este preparat de la 2 fragmente ADN: 1) un vector ADN de 9,1 kB preparat prin digestia plasmidului pLS cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCG cu Smal și Clal.
1720
1725
1730
1735
1740
1745
1750
1755
1760
RO 118887 Β1
Vector viral genomic genă indicator-Promotor permutat
Vectorii virali genă indicator pLG-lucPP și pCG-lucPP, și vectorii test de rezistență derivați de la aceștia, conțin următoarele elemente într-o orientare 5' la 3' (fig.2B): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLG-lucPP)sau un intensificator-promotor le CMV (pCG-lucPP), 2) o regiune HIV-LTR r, 3) o regiune HIV-LTR U5 care conține introdus un promotor T7 cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor, 4) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, 5) o casetă genă indicator introdusă în gena envdeletată, și 6) un HIV-LTR 3‘. Aceiași casetă genă indicator este introdusă în pLG-lucPP și pCG-lucPP și conține următoarele elemente: 1) o regiune EMC 5-UTR care permite pătrunderea ribozomului intern, 2) regiunea de codificare completă a genei luciferează (luc), și 3) un terminator transcripțional T7. Gena indicator are o orientare transcripțională opusă la HIV-LTR sau intensificator-promotor IE CMV și prin urmare nu poate fi transcrisă funcțional de aceste elemente. De asemenea, gena indicator nu poate fi transcrisă de promotorul T7 deoarece caseta genă indicator este poziționată în amonte de promotorul T7. După transcripția inversă și transfer de bandă, promotorul T7 este copiat de la 5‘ LTR la 3' LTR, permițând transcripția funcțională a genei indicator de la promotorul T7 creat din nou de ARN polimeraza T7 (fig.2C).
Plasmidul plucPP, care conține caseta genă indicator, se prepară în 3 etape. în prima etapă, plasmidul pVL-EMC/T7 care conține o casetă flancată prin situri unice Notl cuprinzând elementul EMC 5'-UTR și terminatorul transcripțional T7, se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 3,0 kB preparat prin digestia plasmidului pVL descris mai jos) cu Notl și tratarea vectorului cu fosfatază alcalină, și 2) un fragmentADN de 0,8 kB conținând terminator EMC 5' UTR preparat prin PCR folosind plasmid pTM1 (Moss și colab. (1990) Nature 348, 91-92) ca matriță și oligonucleotidele 6 și 7 ca primeri, urmat de digestie cu Notl. Oligonucleotidele 6 și 7 încorporează fiecare un sit de restricție Notl. în a doua etapă, plasmidul pVL-luc, care conține regiunea de codificare a genei luciferează de la licurici introdusă în vectorul mamifer de expresie pVL-1 (descris mai jos), se prepară de la două fragmente ADN: un vector ADN de 4,1 kB preparat prin digestia plasmidului pVL-1 cu Nrul și Bg1 II, și 2) un fragment ADN de 1,7 kB conținând regiunea de codificare luciferază completă, preparată prin PCR folosind plasmid pGEM-luc (Promega, Madison, Wl) ca matriță și oligonucleotidele 8 și 9 ca primeri urmat de digestie cu Nrul și Bg1 II. Oligonucleotidele 8 și 9 încorporează situri de restricție Nrul și Ncol, și respectiv Bg1 II și Xhol. în a treia etapă, plasmidul plucPP, care conține regiunea de codificare a genei luciferază introdusă între elementul EMC 5'-UTR și terminatorul transcripțional T7, este preparat de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 3,8 kB preparat prin digestia plasmidului pVL-EMC/T7 cu Ncol și Sa1l, și 2) un fragment ADN de1,7 kB conținând regiunea de codificare luciferază completă, preparată prin digestia plasmidului pVL-luc cu Ncol și Xhol.
Plasmidul pLG-lucPP se prepară în două etape. în prima etapă, se prepară plasmid pLG-T7 prin introducerea unui promotor fag T7 în fața regiunii HIV-LTR U5 în plasmidul pLG prin mutageneză dirijată în sit folosind oligonucleotida 10 care conține secvențele următoare (5' la 3‘): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 552 la 569 ale HXB2 în regiunea U5, 2) o secvență de 20 nucleotide complementară la promotorul T7, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 534 la 551 ale HXB2 din regiunea U5. în etapa a doua, se prepară plasmid pLG-lucPP de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,2 kB preparat prin digestia plasmidului pLG-T7 cu Notl și tratarea vectorului care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN sw 2,5 kB conținând caseta genă indicator luciferază preparată prin digestia plasmidului plucPP cu Notl. Clone corespondente la pLGlucPP, care conțin caseta genă indicator introdusă în vectorul viral cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor virale, sunt identificate prin alcătuire de hărți de restricție.
RO 118887 Β1
Plasmidul pCG-lucPP se prepară în două etape. în prima etapă, se prepară plasmid pCG-T7 prin introducerea unui promotor fag. T7 în amontele regiunii HIV-LTR U5 în plasmidul pCG prin mutageneză dirijată în sit folosind oligonucleotida 10. în etapa a doua, se prepară plasmid pCG-lucPP de la 2 fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,7 kB preparat prin digestia plasmidului pCG-T7 cu Notl și tratarea vectorului care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 2,5 kB conținând caseta genă indicator luciferază preparată prin digestia plasmidului plucPP cu Notl. Clone corespondente la pCGlucPP, care conțin caseta genă indicator introdusă în vectorul viral cu o orientare transcripțională opusă celei a intensificator-promotor IE CMV și LTR-urilor virale, sunt identificate prin alcătuire de hărți de restricție.
Vector viral subgenomic genă indicator - Promotor permutat
Vectorii genă indicator pLS-lucPP și pCS-lucPP, și vectorii test de rezistență derivați de la aceștia, conțin elementele următoare într-o orientare 5' la 3' (fig.2B): 1) o regiune HIVLTR U3 (pLS-lucPP) sau un intensificator-promotor IE CMV (pCS-lucPP), 2) o regiune HIVLTR r, 3) o regiune HIV-LTR U5 conținând insertat un promotor T7 cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor, 4) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, 5) caseta genă indicator, 6) un element RRE de la gena HIV env conținând o secvență virală organizată, și 7) un 3' HIV-LTR. Caseta genă indicator a pLS-lucPP și pCS-lucPP este aceiași ca în pLG-lucPP și pCG-lucPP. Ca și pentru vectorii de mai înainte, genele indicator ale pLSlucPP și pCS-lucPP nu pot fi transcrise funcțional deoarece transcripția inversă și transferul de bandă au ca urmare copierea promotorului T7 de la 5' LTR la 3' LTR (Fig. 2C). Plasmidul pLS-lucPP se prepară în două etape. în prima etapă, plasmidul pLS-T7, care conține un promotor fih.T7 în amontele regiunii HIV-LTR U5 a plasmidului pLS, se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 9,1 kB preparat prin digestia plasmidului pLS cu Smal și Clal, și 2) un fragment de 0,8 kB conținând HIV-LTR cu o regiune R5 cae conține inserat un promotor T7, preparat prin digestia plasmidului pLG-T7 cu Smal și Clal. în a doua etapă, plasmidul pLS-lucPP se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 9,9 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-T7 cu Notl și tratarea vectorului care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 2,5 kB conținând caseta gena indicator luciferază preparată prin digestia plasmidului plucPP cu Notl. Clone care corespund la pLSlucPP, care conțin caseta genă indicator introdusă în vectorul viral cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor virale, sunt identificate prin alcătuirea hărții de restricție.
Plasmidul pCS-lucPP este preparat de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,6 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-lucPP cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kb conținând promotorul IE CMV fuzionat la regiunea R5 cu promotor T7 inserat, preparat prin digestia plasmidului pCG-T7 cu Smal și Clal.
Vectori test de rezistență - Construcție
Vectorii test de rezistență sunt preparați prin 1) modificarea vectorilor virali genă indicator pLG-lucPP, pLS-lucPP și pCS-lucPP prin introducerea siturilor unice de restricție, numite situri receptor secvență pacient, în sau lângă gena pol, 2) amplificarea segmentelor derivate de la pacient care corespund la regiunile de codificare protează și transcriptază inversă HIV prin PCR folosind ADN complementar (cADN) preparată de la ARN sau ADN prezent în Ser sau celule ale pacienților infectați, și 3) înserarea secvențelor amplificate exact în vectorii virali genă indicator la situri de acceptare secvență pacient (fig.2B). Sunt introduse două seturi de situri acceptoare pentru secvența pacientului prin mutageneză dirijată în sit în fiecare din cei 4 vectori virali genă indicator. Primul set de situri acceptoare secvență pacient constau dintr-un sit Hpal și Sall care definesc un interval cuprinzând regiunea întreagă de codificare protează și cea mai mare parte a regiunii de codificare a transcriptazei inverse, rezultând plasmizii pLG-lucPP-HS, pCG-lucPP-HS, pLS-lucPP-HS și
1815
1820
1825
1830
1835
1840
1845
1850
1855
1860
RO 118887 Β1 pCS-lucPP-HS. Al doilea set de situri acceptoare secvență pacient constă dintr-un sit Pvul și BamHI care definesc același interval, rezultând plasmizii pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-PB, pLS-lucPP-PB și respectiv pCS-lucPP-PB. Perechi înrudite de vectori test de rezistență care definesc același interval sit de restricție (de exemplu, cele derivate de la pLG-lucPP-HS și pLG-lucPP-PB) sunt folosite împreună în unele teste de rezistență pentru îmbunătățirea reprezentării acelor segmente derivate de la pacient care conțin situri de restricție interne identice la un sit acceptor dat pentru secvență pacient, și astfel, ar fi subreprezentate în oricare test de rezistență singur.
Plasmidul pLG-lucPP-HS este preparat prin trei etape consecutive de mutageneză dirijată în sit folosind plasmid pLG-luc-PP ca matriță. Primele două etape sunt pentru scopul introducerii a două situri de restricție noi, din care unul (Hpal) este unic, și din care unul (Sall) este deja prezent o dată în fiecare vector viral. A treia etapă este pentru scopul deletării sitului Sall preexistent în fiecare vector pentru a obține situl Sall introdus, unic. în etapa
I, un sit Hpal se introduce imediat în fața regiunii de codificare matură a proteazei HIV la poziția 2243 folosind oligonucleotida 11 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2249 la 2266 ale HXB2, 2) un sit Hpal de 6 nucleotide, care părăsește secvența proteinei gag la această poziție nemodificată și introduce o schimbare aminoacidă conservativă (Phe pentru Val) în secvența precursoare pol și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2225 la 2242 ale HXB2. în etapa 2, se introduce un sit Sall la regiunea de codificare carboxi terminală a transcriptazei inverse HIV la poziția 4190 folosind oligonucleotida 12 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 4196 la 4213 ale HXB2, 2) un sit Sall de 6 nucleotide care părăsește secvența proteinei transcriptază inversă la această poziție nemodificată, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 4172 la 4189 ale HXB2. în etapa 3, situl Sall preexistent în regiunea de codificare vpr la poziția 5785 a HXB2 este deletat folosind oligonucleotida 13 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 5791 la 5809 ale HXB2,2) secvența de 6 nucleotide GCCGAC care îndepărtează situl Sall dar părăsește secvența proteinei vpr la această poziție nealterată, 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 5767 la 5784 ale HXB2.
Plasmizii pCG-lucPP-HS, pLs-lucPP-HS și pCS-lucPP-HS sunt derivați de la pLGlucPP-HS după cum urmează. Plasmidul pCG-lucPP-HS se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 12,9 kB se prepară prin digestia plasmidului pLG-lucPP-HS cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCG-lucPP cu Smal și Clal. Plasmidul pLS-lucPP-HS se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,1 kB preparat prin digestia plasmidului pLG-lucPP-HS cu Ndel și Xhol, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-lucPP cu Ndel și Xhol. Plasmidul pCS-lucPP-HS se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de
II, 6 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-lucPP-HS cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCS-lucPP cu Smal și Clal.
Plasmidul pLG-lucPP-PB se prepară prin 4 etape consecutive de mutageneză dirijată în sit folosind plasmid pLG-lucPP ca matriță. Primele două etape sunt pentru scopul introducerii de situri noi de restricție (Pvul și BamHI), fiecare este deja prezent o dată în fiecare vector viral genă indicator. Etapele a 3-a și a 4-a sunt pentru scopul îndepărtării siturilor Pvul și BamHI preexistente în fiecare vector pentru a obține situri unice nou introduse. în etapa 1, se introduce un sit Pvul în fața regiunii de codificare matură a proteazei HIV la poziția 2221 folosind oligonucleotida 14 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2227 la 2244 ale HXB2, 2) un sit Pvul de 6 nucleotide, care părăsește secvențele proteinei precursoare gag și pol
RO 118887 Β1
1910 la această poziție nealterată, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2203 la 2220 a HXB2. în etapa 2, se introduce un sit BamHI la regiunea de codificare carboxi terminală a transcriptazei inverse HIV la poziția 4212 folosind oligonucleotida 15 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 4218 la 4235 ale HXB2, 2) un sit BamHI de 6 nucleotide care părăsește secvența proteinei transcriptazei inverse la această poziție nemodificată, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 4194 la 4211 ale HXB2. în etapa 3, situl preexistent Pvul din regiunea de codificare b-lactamază la poziția 2413 (coordonate după GenBank, număr de acces X52331) este deletată folosind oligonucleotida 16 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2395 la 2412 ale pBluescript KS (+), 2) secvența CAATCG de 6 nucleotide care îndepărtează situl Pvul dar părăsește secvența proteinei b-lactamază la această poziție nemodificată, și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 2419 la 2436 ale pBluescript KS (+). în etapa 4, situl preexistent BamHI în regiunea de codificare HIV revla poziția 8474 a HXB2 este deletată folosind oligonucleotida 17 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 8480 la 8497 ale HXB2, 2) secvența de 6 nucleotide GGATTC care îndepărtează situl BamHI dar părăsește secvența proteinei revHIV la această poziție nemodificată și 3) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 8456 la 8473 ale HXB2.
Plasmizii pCG-lucPP-PB, pLS-lucPP-PB și pCS-lucPP-PB sunt derivați de la pLGlucPP-PB după cum urmează. Plasmidul pCG-lucPP-PB se prepară de la două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 12,9 kB preparat prin digestia plasmidului pLG-lucPP-PB cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCG-lucPP cu Smal și Clal. Plasmidul pLS-lucPP-PB se prepară din trei fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,1 kB preparat prin digestia plasmidului pLG-lucPP-PB cu Ndel și Xhol, 2) un fragment ADN de 0,5 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-lucPP cu Ndel și Hindlll și 3) un fragment ADN de 0,8 kB preparat prin digestia plasmidului pLG-lucPP-PB cu Hindlll și Xhol. Plasmidul pCS-lucPP-PB este preparat din două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 11,6 kB preparat prin digestia plasmidului pLS-lucPP-PB cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCS-lucPP cu Smal și Clal.
Segmentul(le) derivate de la pacient corespondente regiunilor de codificare pretează și transcriptază inversă HIV sunt amplificate prin metoda reacției polimerazice de catenătranscripție inversă (RT-PCR) folosind ARN viral izolat din serul pacienților infectați cu HIV. Sunt folosite două protocoale RT-PCR așa cum s-a descris. în prima metodă (Piatak și colab., (1993) Science 259,1749-1754) sunt folosite enzime separate transcriptază inversă a virusului leucemiei murine Moloney (BRL, Bethesda, MD) și ADN polimerază Taq (Roche Molecular Diagnostics, Ontario, Canada), pentru prepararea cADN-ului și respectiv, pentru reacția PCR. în a doua metodă (Mulder și colab. (1994) J.CIin.Microbiol. 32, 292-300), se folosește o singură enzimă, ADN polimerază Thermus thermophilus (Tth), pentru a realiza, atât sinteza cADN, cât și reacția PCR. Sunt folosite două perechi de primeri, constând din oligonucleotidele 18 și 19, și oligonucleotidele 20 și 21 pentru amplificarea segmentelor derivate de la pacienți care pot fi înserate cu precizie în vectorii virali genă indicator care conțin siturile acceptoare secvență pacient Hpal/Sall și respectiv, Pvul/BamHI.
Se construiește un prim set de 4 vectori test de rezistență care încorporează prima pereche de primeri din următoarele două preparate ADN: 1) un vector ADN preparat de la plasmidul pLG-lucPP-HS, pCG-lucPP-HS, pLS-lucPP-HS sau pCS-lucPP-HS, digerate cu
Hpal și Sall, și 2) un produs ADN amplificat de 2,0 kB preparat prin RT-PCR folosind ARN viral izolat din serul unui individ infectat HIV ca matriță și oligonucleotidele 18 și 19 ca primeri, urmat de digestie cu Hpal și Sall. Un al doilea set de 4 vectori test de rezistență
1915
1920
1925
1930
1935
1940
1945
1950
1955
RO 118887 Β1 încorporând a doua pereche de primeri sunt construiți de la următoarele două preparate ADN: 1) un vector ADN preparat de la plasmidul pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-PB, pLS-lucPPPB sau pCS-lucPP-PB, digerate cu Pvul și BamHI, și 2) un produs ADN amplificat de 2,0 kB preparat prin RT-PCR folosind ARN viral izolat din serul unui individ infectat cu HIV ca matriță și oligonucleotidele 18 și 19 ca primeri, urmat de digestie cu Pvul și BamHI. Oligonucleotidele 18, 19, 20 și 21 încorporează situl de restricție Hpal, Sall, Pvul și respectiv, BamHI. Pentru a se asigura că plasmidul ADN care corespunde la fiecare dintre cei 8 vectori test de rezistență rezultați cuprind o probă reprezentativă a speciilor virale HIV cvasi prezente în serul unui pacient dat, sunt folosiți cel puțin 100 transformanți independenți E.coli obținuți în construcția unui vector test de rezistență dat pentru prepararea plasmidului ADN.
Pentru îmbunătățirea reprezentării segmentelor derivate de la pacient, sunt preparați un al 3-lea și al 4-lea set de vectori test de rezistență folosind depozitele de primeri PCR parțial degenerate, numite oligonucleotide 22, 23, 24 și 25, care sunt bazate pe secvențele oligonucleotidelor 18,19,20 și respectiv, 21. Fiecare depozit de primeri este sintetizat într-un mod care încorporează mai mult decât o bază nucleotidică (G, A, T sau C) la fiecare din cele 18 poziții ale nucleotidei localizată la capătul 3' al primerului parental care prezintă variații de secvență printre diferitele izolate de la pacient catalogate în baza de date de secvențe HIV de la Los Alamos (Myers și colab., (1993) Human Retroviruses and AIDS 1993, Los Alamos Natikonal Laboratory, Los Alamos, NM). Al treilea set de 4 vectori set de rezistență se construiește folosind vectori preparați de la plasmid pLG-lucPP-HS, pCG-lucPP-HS, pLSlucPPHS sau pCS-lucPP-HS cu secvențe de la pacient amplificate, preparate cu oligonucleotidele 22 și 23; al 4-lea set de vectori test de rezistență este construit folosind vectori preparați de la plasmid pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-PB, pLS-lucPP-PB sau pCSlucPP-PB cu secvențe de la pacient amplificate, preparate cu oligonucleotidele 24 și 25. Oligonucleotidele 22, 23, 24 și 25 încorporează situri de restricție Hpal, Sall, Pvul și respectiv, BamHI.
Celule gazdă - Preparare
Celule gazdă organizate și celule gazdă vector test de rezistență
Vectorii test de rezistență sunt folosiți pentru prepararea celulelor gazdă vector test de rezistență de la celule organizate care exprimă proteine virale organizate. Proteinele organizate pot fi asigurate prin expresia genelor virale conținute în însăși vectorul test de rezistență, un vector(i) de expresie organizați, sau ambele. Transfecția, fie tranzitorie, fie stabilă a celulei gazde organizate se poate folosi pentru producerea proteinelor organizate.
Vectorii test de rezistență sunt folosiți pentru prepararea celulelor gazdă vector test de rezistență de la celule organizate care exprimă proteine virale organizate. Proteinele organizate pot fi asigurate prin expresia genelor virale conținute în însăși vectorul test de rezistență, un vector(i) de expresie organizați, sau ambele. Transfecția fie tranzitorie, fie stabilă a celulei gazde organizate se poate folosi pentru producerea proteinelor organizate. Un vector de expresie organizat care codifică un produs al genei amfotrofice MLV envface posibilă producerea într-o celulă gazdă vector test de rezistență a particulelor virale ale vectorului test de rezistență care pot infecta eficient celule țintă umane. Vectori test de rezistență derivați de la plasmizi pLG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-HS și pCGlucPP-PB codifică toate genele HIV cu excepția envșî sunt folosiți pentru a produce celula gazdă vector test de rezistență. Vectorul de expresie organizat pVL-env4070A care codifică produsul genei amfotrofice MLV 4070A env se folosește cu vectorii test de rezistență anteriori bazați pe genom pentru a face posibilă producerea în celula gazdă a vectorului test de rezistență a particulelor virale ale vectorului test de rezistență. Vectorii test de rezistență derivați de la plasmizi pLS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB, pCS-lucPP-HS și pCS-lucPP-PB codifică numai produsele genei HIV gag-pol, și sunt folosiți pentru prepararea celulelor
RO 118887 Β1 gazdă vector test de rezistență. pVL-env4070A care asigură env, și fie vectorii de expresie pLTR-HIV3' fie pCMV-HIV3', din care fiecare asigură genele HIV vif, vpr, tat, rev, vpu și nef sunt folosiți cu vectorii test de rezistență anteriori subgenomici pentru a face posibilă producerea în celulele gazdă vector test de rezistență a particulelor virale ale vectorului test de rezistență.
Plasmizii pLTR-HIV3' și pCMV-HIV3‘ sunt fiecare derivați prin îndepărtarea celei mai mari părți a regiunii de codificare gag-poldm vectorii virali genomici pLG și respectiv, pCG. Plasmidul pLTR-HIV3' (fig.3B) se prepară prin mutageneză dirijată în sit folosind plasmid pLG ca matriță cu oligonucleotida 26 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 4712 la 4729 ale HXB2 în gena pol, și 2) o secvență de 18 nucleotide complementară la pozițiile 925 la 942 ale HXB2 în gena gag. Plasmidul pCMV-HIV3‘ (fig.3C) se prepară de la două fragmente ADN: 1) un fragment vector de 6,8 kB preparat prin digestia plasmidului pLTR-HIV3‘ cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCG cu Smal și Clal.
Plasmidul pVL-env4070A (Fig.3D) este construit de la două fragmente ADN: 1) un fragment vector de 4,3 kB preparat prin digestia unui vector de expresie mamifer pVL-2 cu Nrul și Bglll, și 2) un fragment ADN de 2,0 kB conținând regiunea de codificare completă a produsului genei MLV4070A env (nucleotide 37 la 2001, coordonate date în GenBank, număr de acces M33469, Ott și colab. (1990) J.Virol. 64, 757-766) preparat prin PCR folosind plasmid pCRIPamgag-2 (Danos și Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6460) ca matriță cu oligonucleotidele 27 și 28 ca primeri, urmată de digestie cu Nrul și Bglll. Oligonucleotida 27 încorporează un sit unic Nrul urmat de o secvență consens pentru inițierea translației la mamifere (de exemplu, Kozak (1991) J.Biol.Chem., 266,19867-19870), în timp ce oligonucleotida 28 încorporează un sit unic Bglll.
Vectorul de expresie mamifer pVL-2 conține următoarele elemente într-o direcție 5' la 3‘: intensificatorul/promotorul IE CMV, primul exon donor îmbinat IE CMV, al doilea exon acceptor îmbinat globină (1 umană, un sit de donare polilinker, situl de poliadenilare al genei antigen T SV40, și originea replicării SV40. Plasmidul pVL-2 este construit în 4 etape după cum urmează. în prima etapă, se prepară plasmid pVL prin înlocuirea sitului de donare polilinker și promotorii fag T7 și T3 ai plasmidului pBluescript II KS (+) cu un sit de donare polilinker care conține siturile de restricție BssHII, Notl, Smal, Hindlll, Sphl, Smal, EcoRI, Nrul, Apal, Bglll, Nhel, Notl, Xhol și BssHII. Se construiește pVL de la două fragmente ADN: 1) un fragment de 3,0 kB preparat prin tăierea plasmidului pBluescript II KS (+) cu BssHII, și tratarea vectorului care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN preparat prin decălirea oligonucleotidelor suprapuse 29 și 30, extindere cu ADN polimerază Klenow și digestie cu BssHII. Plasmizii conținând siturile Hindlll la Xhol în ordine 5' la 3' relativă la harta plasmidului pBluescript II KS (+) (GenBank, număr de acces X52327) sunt identificate prin analiza hărții de restricție. în a doua etapă, un plasmid intermediar se prepară de la plasmidul pVL prin inserția intensificatorului-promotorului IE CVM și primului exon donor îmbinat, și al doilea exon acceptor îmbinat globină (1 umană. Acest plasmid intermediar se prepară din 3 fragmente ADN: 1) un fragment vector de 3,0 kB preparat prin digestia plasmidului pVL cu Hindlll și EcoRI, 2) un fragment ADN de 0,9 kB conținând un intensificator-promotor IE CMV și primul exon donor îmbinat (nucleotide -674 la -19, coordonate date în Boshart și colab., (1985) Ce//41, 521-530, preparat prin PCR folosind plasmid pCM5027 care conține fragmentul-m Pstl de la HCMV tulpina AD169 (Boshart și colab., Ibid) ca matriță cu oligonucleotidele 31 și 32 ca primeri, urmat de digestie cu Hindlll și Sphl, și 3) un fragment ADN de 0,1 kB conținând al dolea exon acceptor îmbinat globină (1 umană (nucleotide 6808 la 6916, coordonate din GenBank, număr de acces J00153) preparat prin PCR folosind plasmid ppSVaHP (Treisman și colab., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 74287423) ca matriță cu oligonucleotidele 33 și 34 ca primeri, urmat de digestie cu Sphl și EcoRI.
2010
2015
2020
2025
2030
2035
2040
2045
2050
2055
RO 118887 Β1
Oligonucleotidele 31,32,33 și 34 încorporează situl de restricție Hindlll, Sphl, Sphl, și EcoRI la capetele lor respective. în a treia etapă, plasmid pVL-1 se prepară prin inserția sitului de poliadenilare antigen T SV40 în acest plasmid intermediar. Plasmidul pVL-1 se prepară din două fragmente ADN: 1) un fragment vector de 4,0 kB preparat prin tăierea plasmidului intermediar cu Bglll și Nhel, și 2) un fragment ADN de 0,2 kB conținând situl de poliadenilare antigen T SV40 (nucleotide 2770 la 2533 ale SV40, coordonate din referința Reddy și colab., (1978) Science 200, 494-502) preparat prin PCR folosind plasmid pSV2 (Southern și Berg (1982) J.Mol.AppI.Gen. 1, 327-341) ca matriță cu oligonucleotide 35 și 36 ca primeri, urmat de digestie cu Bglll și Nhel. Oligonucleotidele 35 și 36 încorporează situri de restricție unice Bglll și Nhel la capetele lor respective. în a patra etapă, plasmidul pVL-2 se prepară prin inserarea originii replicării SV40 în plasmidul pVL-1. Plasmidul pVL-2 este preparat de la două fragmente ADN: 1) un fragment vector de 4,2 kB preparat prin digestia plasmidului pVL-1 cu Nhel și Xhol, și 2) un fragment ADN de 0,2 kB conținând originea replicării SV40 (nucleotide 5725 la 5578 ale SV40, Ibid) preparat prin PCR folosind plasmid pSV2 ca matriță cu oligonucleotidele 37 și 28 ca primeri urmată de digestie cu Nhel și Sall. Oligonucleotidele 37 și 38 încorporează situri de restricție unice Nhel și Sall la capetele lor respective.
Celule gazdă țintă
Celule gazdă țintă folosite pentru testele de rezistență realizate cu vectori test de rezistență derivați de la plasmizi pLG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-HS, pCGlucPP-PB, pLS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB, pCS-lucPP-HS sau pCS-lucPP-PB sunt preparați de la linia de celule renale embrionare umane 293 și linia de celule T leucemice Jurkat (ATCC, Rockville, MD). Fiecare linie de celule este transfectată stabil cu un vector de expresie care codifică o ARN polimerază fag T7 variant. Acest variant conține un semnal de localizare nucleară antigen T SV40 (NLS) fuzionat în cadru la N-terminusul ARN polimerazei T7, permițând transportul său în, și funcțiunea în nucleul celulei (Lieber și colab. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8485-8493). Gena indicator nefuncțională din vectorul test de rezistență este convertită într-o genă indicator funcțională prin transcriptază inversă la infecția celulelor țintă, care rezultă de la repoziționarea promotorului T7 relativ la regiunea de codificare a genei indicator. După integrarea genei indicator reparate în cromozomul celulei țintă prin integrază HIV, ARN polimerază nucleară T7 exprimată de celula țintă este capabilă de transcrierea funcțională a genei indicator.
Plasmidul pVL-T7RNAP-NLS se folosește pentru dirijarea expresiei unei ARN polimeraze variante T7 legate la un NLS, în celule umane sau alte celule și linii celulare de la mamifere. PVL-T7RNAP-NLS este preparat din 3 fragmente ADN: 1) un vector fragment de 4,3 kB preparat prin digestia plasmidului pVL-2 cu EcoRI și Bglll, 2) un fragment ADN de 2,6 kB care codifică ARN polimerază T7 resturile aminoacide 34 la 883 (nucleotide 267 la 2817, coordonate prin referire la GenBank, număr de acces M38308, Grachev și Pletnev (1984) Bioorg. Khim. 10, 824-843) preparat prin PCR folosind plasmid pT7-G1 (Deng și colab. (1994) Gene 143, 245-249) ca matriță cu oligonucleotidele 39 și 40 ca primeri, urmat de digestie cu Nrul și Bglll, și 3) un fragment de ADN sintetic care codifică primii 3 aminoacizi ai antigenului T SV40 urmat de aminoacizii 118 la 133 ai antigenului T mare SV40 care conține NLS-ul (Lieber și colab., Ibid), preparat prin decălirea oligonucleotidelor 41 și 42, extindere cu ADN polimerază Klenow și digestie cu EcoRI și Nrul. Oligonucleotidele 39, 40, 41,42 încorporează situri de restricție Nrul, Bglll, EcoRI și respectiv Nrul.
Plasmidul pVL-Neo se folosește ca un marker selectabil pentru stabilirea de transfectanți stabili ai celulelor și liniilor umane și de la alte mamifere prin contrasfecție. PVLNeo dirijează expresia neomicin fosfotransferazei și conferă rezistență la antibioticul G418.
Plasmidul pVL-Neo se prepară din 2 fragmente ADN: 1) un fragment vector de 4,3 kB preparat prin digestia plasmidului pVL-2 cu EcoRI și Bglll, și 2) un fragment ADN de 0,8 kB
RO 118887 Β1 conținând regiunea de codificare Neo completă (nucleotide 1551 la 2345 ale secvenței transpozonului Tn5, coordonate date în GenBank, număr de acces U00004, Beci și colab. (1982) Gene 19, 327-336) preparat prin PCR folosind plasmid pSV2Neo (Southern și Berg (1982) J. Mol. App!. Gen. 1, 327-341) ca matriță cu oligonucleotidele 43 și 44 ca primeri, urmată de digestie cu EcoRI și Bglll. Oligonucleotida 43 încorporează un sit EcoRI unic urmat de o secvență consens pentru inițierea translației la mamifere, în timp ce oligonucleotida 44 încorporează un sit Bglll unic.
Se introduce pVL-T7RNAP prin transfecția stabilă în celule 293 prin metoda coprecipitării fosfat de calciu (Wigler și colab. (1979) Cell 16, 777) și în celule Jurkat prin electroporare (Irving și colab. (1991) Cell 64, 891-901). Celulele 293 sunt menținute în mediu DMEM (JHR Biosciences) suplimentat cu 1 g/l glucoză, 10% Ser donor de vițel (Tissue Culture Biologics). Celulele Jurkat sunt menținute în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% Ser bovin fetal (Irvin Scientific), glutamină, penicilină și streptomicină. Amestecurile de transfecție pentru celule 293 și celule Jurkat conțin fiecare un amestec de 10 pg de pVLT7RNAP și marker selectabil pVL-Neo într-un raport de masă de 10:1 la 20:1. De la 24 la 48 h de la transfecție, celulele sunt etalate în același mediu care conține antibioticul G418 (GIBCO, Grand Island, N.Y.). Clone independente de celule 293 rezistente la G418 sunt culese direct din plăcile de selecție după 2 săptămâni și sunt extinse pentru analiză. Clone de celule Jurkat rezistente la G418 sunt obținute prin diluție de limitare după 2 sau 3 săptămâni de selecție medicament și sunt extinse pentru analiză.
Clone de celule 293 și Jurkat rezistente la G418 sunt cercetate pentru nivelul expresiei lor de ARN polimeraza T7 prin determinarea nivelului de stare stabilă a mARN-ului sintetizat specific ARN polimerazei T7 de către celule folosind metoda de hibridizare Northern blot (Ausubel și colab. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-lnterscience). Clone de celule 293 și Jurkat care exprimă nivele optime ale ARN polimerazei T7 sunt identificate apoi prin determinarea capacității lor de a susține transcripția specifică ARN polimerazei T7 în transfecții tranzitorii cu plasmid pEMCLucbgAn (Deng și colab. (1991) Gene 109, 193201) în care transcripția genei luciferază este dirijată de un promotor T7. Clonele 293 și Jurkat care susțin cele mai ridicate nivele ale expresiei genei luciferază sunt alese pentru utilizare în continuare; acestea sunt denumite celule 293/T7RNAP-NLS și, respectiv Jurkat/T7RNAP-NLS.
Teste de sensibilitate și rezistență la medicamente
Teste de rezistență sunt realizate cu vectori test de rezistență bazați pe vectori virali genă indicator pLG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-HS, pCG-lucPP-PB, pLS-lucPPHS, pLS-lucPP-HS, pCS-lucPP-HS sau pCS-lucPP-PB, folosind, fie două tipuri de celulă gazdă, fie un tip de celulă gazdă. în primul tip de test de rezistență, particulele virale ale vectorului test de rezistență sunt produse de o primă celulă gazdă (celula gazdă vector test de rezistență) care se prepară prin transfectarea unei celule gazdă organizate cu vectorul test de rezistență și vector(i) de expresie organizați. Particulele virale ale vectorului test de rezistență sunt folosite apoi pentru infectarea unei a doua celule gazdă (celulă gazdă țintă) în care se măsoară expresia genei indicator. în al doilea tip de test de rezistență, un singur tip de celulă gazdă (celula gazdă vector test de rezistență) servește ambelor scopuri: unele dintre celulele gazdă organizate dintr-o cultură dată sunt transfectate și produc particule virale test de rezistență și unele celule gazdă din aceiași cultură sunt ținta infecției prin particulele virale produse astfel. Teste de rezistență care folosesc un singur tip de celulă gazdă sunt posibile cu vectori test de rezistență care cuprind o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat: în timp ce astfel de gene indicator sunt exprimate eficient la infecția unei celule gazdă permisive, ele nu sunt exprimate eficient la transfecția aceluiași tip de celulă, și astfel asigură o ocazie de a măsura efectul agentului antiviral aflat sub evaluare. Pentru
2110
2115
2120
2125
2130
2135
2140
2145
2150
2155 motive similare, teste de rezistență care folosesc două tipuri de celule se pot realiza prin cocultivarea celor două tipuri de celule ca o alternativă la infectarea celui de-al doilea tip de celulă cu particule virale obținute din supernatantele primului tip de celulă.
Test de rezistență și sensibilitate - două celule
Celulele gazdă vector sunt preparate prin cotransfecția unui vector test de rezistență și vectorului(lor) de expresie organizați corespunzători folosind, fie linia de celule 293, tsa54, sau tsa201 (Heinzel și colab. (1988) J.Virol. 62, 3738), fie linia de celule BOSC 23 (Pear și colab., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 8392) ca celule gazdă organizate. Vectori test de rezistență construiți prin înserarea segmentului derivat de la pacient în pLG-lucPP-HS, pCGlucPP-PB și pCG-luc-PB sunt contransfectați cu vectorul de expresie organizat pVLenv4070A, în timp ce vectori test de rezistență preparați prin înserarea segmentelor derivate de la pacient în pLS-lucPP-HS, pCS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB și pCS-lucPP-PB sunt cotransfectați cu vectorii de expresie organizați pVL-env4070A și, fie pLTR-HIV3', fie pCMVHIV3'. Drept celule gazdă sunt folosite celule Jurkat/T7RNAP-NLS.
Celule gazdă organizate sunt crescute în mediu DMEM, 1 g/1 glucoză, 10% ser donor de vițel și trecute la pasaj la o diluție 1:10 la fiecare 3 zile. Celulele sunt întinse cu 48 h înaintea transfecției la 1x106 celule per placă de 10 cm. Celulele sunt transfectate prin metoda coprecipitării fosfat de calciu folosind 5 la 10 mg din fiecare vector test de rezistență și vector(i) de expresie organizați corespunzători pentru producerea celulelor gazdă vector test de rezistență. Agenți antivirali individuali, incluzând inhibitori de transcriptază inversă AZT, ddl, ddC, d4T și 3TC, și inhibitori de protează saquinavir, ritonavir și indinavir, precum și combinații ale acestora, sunt adăugate la plăci individuale de celule transfectate la momentul transfecției lor, la un domeniu corespunzător de concentrații. De la 24 la 48 h după transfecție, celulele gazdă țintă sunt infectate prin cocultivare cu celule gazdă vector test de rezistență sau particule virale obținute de la supernatante filtrate ale celulelor gazdă vector test de rezistență. Fiecare agent antiviral, sau combinație a acestora, se adaugă la celule gazdă țintă la momentul infecției pentru a obține aceiași concentrație finală a agentului dat, sau agenților prezenți în timpul transfecției.
Pentru infecție prin cocultivare, se îndepărtează mediul de la o placă de 10 cm a celulelor gazdă vector test de rezistență preparată prin transfecție 24 la 48 h mai devreme, și 0,5 la 1,0x106 celule țintă Jurkat/T7RNAP-NLS sunt adăugate la placă în mediu Jurkat care conține agentul antiviral la concentrația corespunzătoare. Celulele țintă sunt cocultivate cu celule gazdă vector test de rezistență 24 h, apoi îndepărtate și adăugate la celule gazdă vector test de rezistență proaspăt preparat pentru o a doua cocultivare în mediu celule Jurkat care conține agent(i) antivirali la concentrație corespunzătoare. La 24 h mai târziu, celulele gazdă țintă sunt recoltate de la a doua cocultivare, colectate prin centrifugare, spălate de 3 ori cu soluție salină tamponată fosfat rece gheață (PBS), și analizate pentru activitate luciferază. Pentru infecție cu supernatante filtrate, mediul se îndepărtează de la o placă de 10 cm de celule gazdă vector test de rezistență preparat prin transfecție de la 24 la 48 h mai devreme. Mediul se filtrează printr-un filtru de 0,45 mM la momentul recoltării, se îngheață la - 70°C, și se dezgheață înainte de transducție. Celule Jurkat/T7RNAP-NLS (0,5 la 1,0x106) sunt adăugate la 5 ml dintr-un amestec egal de mediu celule Jurkat și supernatantul filtrat, adus la 8 mg/ml de polibren (Sigma, St.Louis, Ml) și concentrația corespunzătoare de agent(i) antivirali. De la 24 la 48 h postinfecție, celulele gazdă țintă sunt colectate prin centrifugare, spălate de 3 ori cu soluție salină tamponată de fosfat rece gheață, și analizate pentru expresia genei indicator. Celule gazdă țintă infectate prin cocultivare sau cu supernatante filtrate sunt analizate pentru activitate luciferază de la licurici așa cum s-a descris (Ausubel și colab. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-lnterscience). Reducerea în activitatea luciferază observată pentru celule gazdă țintă infectate cu un i'
RO 118887 Β1
2205 preparat dat de particule virale vector test de rezistență în prezența unui agent antiviral dat, sau agenți, așa cum s-a comparat la un control desfășurat în absența agentului antiviral, se referă, în general, la logaritmul concentrației agentului antiviral ca o curbă sigmoidă. Această curbă de inhibare se folosește pentru calcularea concentrației inhibitoare aparente (IC) a acelui agent, sau combinație de agenți, pentru produsul țintă viral codificat de segmentele derivate de la pacient prezente în vectorul test de rezistență.
Test de sensibilitate și rezistență - o celulă
Celule gazdă vector test de rezistență sunt preparate prin cotransfecția unui vector test de rezistență și a vectorului(lor) de expresie organizați corespunzători folosind, fie celule 293/T7RNAP-NLS, fie celule Jurkat/T7RNAP-NLS drept celule gazdă organizate. Vectorii test de rezistență construiți prin inserția segmentelor derivate de la pacient în pLG-lucPPHS, pCG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB și pCG-lucPP-PB sunt cotransfectați cu vectorul de expresie organizat pVL-env4070A, în timp ce vectorii preparați prin înserarea segmentelor derivate de la pacient în pLS-lucPP-HS, pCS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB și pCS-lucPP-PB sunt cotransfectați cu vectorii de expresie organizați pl_-env4070A și fie pLTR-HIV3', fie PCMV-HIV3'.
Celulele sunt transfectate folosind 5 la 10 mg din fiecare vector test de rezistență și vector(i) de expresie organizați corespunzători pentru a produce celule gazdă vector test de rezistență. Celule 293/T7RNAP-NLS sunt transfectate prin metoda coprecipitării fosfat de calciu și celulele Jurkat/T7RNAP-NLS sunt transfectate prinelectroporare. Agenți antivirali individuali, sau combinații ale acestora, sunt adăugate la plăci individuale ale celulelor transfectate la momentul transfecției lor, la un domeniu corespunzător de concentrații. De la 24 la 72 h după transfecție, celulele sunt colectate prin centrifugare, spălate de 3 ori cu soluție salină tamponată de fosfat rece gheață, și s-au analizat pentru activitate luciferază de la licurici așa cum s-a descris. Deoarece, celulele transfectate în cultură nu exprimă suficeint gena indicator, celule transfectate în cultură, ca și celule suprainfectate din cultură, pot servi drept celule gazdă țintă pentru expresia genei indicator. Reducerea activității luciferază în prezența unui agent antiviral dat, sau agenți a-a cum s-a comparat la un control desfășurat în absența agentului(lor) antivirali, se referă, în general, la logaritmul concentrației agentului antiviral ca o curbă sigmoidă. Această curbă este folosită pentru calcularea concentrației inhibitoare (IC) a acelui agent, sau combinație de agenți pentru produsul viral țintă codificat de segmentele derivate de la pacient prezente în vectorul test de rezistență.
Exemplul 2. Teste de rezistență și sensibilitate a HIV la medicament folosind vectori test de rezistență care conțin segmente derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată
Vector viral genă indicator - Construcție
Vectori virali genomici genă indicator cu situri acceptoare ale secvenței pacientului, pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-HS și pLG-lucPC-PB, și vector test de rezistență derivat de la aceștia, conțin fiecare elementele care urmează într-o orientare 5' la 3' (Fig.4B): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLG-lucPC-HS și pLG-lucPC-PB) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCG-lucPC-HS și pCG-lucPC-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiune de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată și nef, 4) o primă casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 5' a genei luciferază, înserat în gena envdeletată, 5) o a doua casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 3' a genei luciferează, înserată într-o regiune 3' HIV-LTR U3, și 6) o regiune 3' HIV-LTR R și U5. pLGlucPC-HS și pCG-lucPC-HS conțin situri unice acceptoare ale secvenței de la pacient, Hpal și Sall la nucleotidele 2243 și 4190 ale HXB2; pLG-lucPC-PB și pCG-lucPC-PB conțin situri unice Pvul și BamHI acceptoare pentru secvența de la pacient la nucleotidele 2221 și respectiv, 4212 ale HXB2 (vezi, exemplul 1 pentru detalii). Prima casetă genă indicator
2210
2215
2220
2225
2230
2235
2240
2245
2250
RO 118887 Β1 conține: 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2) regiunea de codificare 5' a genei luciferază (aminoacizii 1 la 446) și 3) un donor îmbinat IE CMV. A doua casetă genă indicator conține: 1) un al doilea exon îmbinat acceptor genă - globină, 2) regiunea de codificare 3' a genei luciferazță (aminoacizii 447 la 550) și 3) un sit de poliadenilare SV40. Orientarea transcripțională a regiunilor de codificare luciferază 5' și 3' sunt identice una cu cealaltă și opuse celei al primului intensificator-promotor CVM și LTR-urilor virale. Cu toate acestea, deoarece regiunile de codificare luciferează 5' și 3' sunt permutate în vectorii test de rezistență (adică, regiunea de codificare 5' este în avalul regiunii de codificare 3', nu este transcris nici un mARN care poate fi îmbinat pentru generarea unei regiuni de codificare luciferază funcționale. După transcripție inversă și transfer de bandă, regiunea de codificare luciferază 3' este copiată de la 3' LTR la 5' LTR permițând transcripția mARN-ului care poate fi îmbinat pentru generarea unei regiuni de codificare luciferază funcționale (fig.4C).
Vectorii virali subgenomici genă indicator cu situri acceptoare secvență pacient, pLSlucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-lucPC-HS și pCS-lucPC-PB, și vectori test de rezistență derivați de la aceștia, conțin fiecare următoarele elemente într-o orientare 5' la 3' (fig.4B): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLS-lucPC-HS și pLS-lucPC-PB) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCS-lucPC-HS și pCS-lucPC-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și U5,3) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, 4) o primă casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 5' a genei luciferază, 5) un element RRE de la gena HIV envconținând o secvență virală organizată, 6) o a doua casetă genă indicator conținând regiunea de codificare 3' a genei luciferează, înserată într-o regiune deletată 3‘ HIV-LTR U3, și 7) o regiune 3* HIV-LTR R și U5. PLS-lucPC-HS și pCS-lucPC-HS conțin situri unice Hpal și Sall acceptoare a secvenței de la pacient la nucleotidele 2243 și respectiv, 4190 ale HXB2; pLS-lucPC-PB și pCSlucPC-PB conțin situri unice Pvul și BamHI acceptoare ale secvenței pacientului la nucleotidele 2221 și respectiv, 4212 ale HXB2. Prima casetă genă indicator conține: 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2) regiunea de codificare 5' a genei luciferază (aminoacizii 1 la 446), și 3) un donor îmbinat IE CMV. A doua casetă genă indicator conține: 1) un al doilea exon acceptor îmbinat genă (-globină, 2) regiunea de codificare 3' a genei luciferază (aminoacizi 447 la 550), și 3) un sit de poliadenilare SV40. Deoarece, regiunile de codificare 5'și 3' luciferază sunt permutate în vectorii test de rezistență, transcripția inversă și transferul de bandă trebuie să aibă loc pentru generarea regiunilor de codificare 5' și 3' ale luciferazei, permițând transcripția mARN-ului care poate fi îmbinat pentru generarea unei regiuni de codificare luciferază (fig.4C).
Plasmidul pVL-luc5', care conține prima casetă, genă indicator se prepară în trei etape. în primele două etape, intronul artificial conținut în pVL-1 constând din donorul îmbinat IE CMV și acceptorul îmbinat genă (-globină se supune la mutageneză dirijată în sit pentru a crea situri de restricție care la digestie dau un fragment ADN ale cărui terminusuri 5' și 3' corespund cu precizie la startul și sfârșitul intronului artificial. în etapa 1, mutageneza dirijată în sit se realizează cu pVL-1 folosind oligonucleotida 45 care conține următoarele secvențe (5' la 3'): 1) secvența de 18 nucleotide care precede donorul îmniat IER CMV, 2) o secvență trinucleotidă TAC care corespunde primei jumătăți a sitului de restricție SnaBI, și 3) secvența de 18 nucleotide la începutul intronului artificial. Deoarece, secvența primelor trei nucleotide ale intronului este GTA, plasmidul rezultat pVL-SnaBI conține un sit de restricție SnaBI care la digestie eliberează secvența 5' a intronului ca un capăt ADN teșit, în etapa 2, mutageneza dirijată în sit se realizează cu pVL-SnaBI folosind oligonucleotida 46 care conține următoarele secvențe (5* la 3‘): 1) secvența de 18 nucleotide la capătul intronului artificial, 2) o secvență trinucleotidă CTG care corespunde ultimei jumătăți a sitului de restricție Pvull, și 3) secvența de 18 nucleotide care urmează acceptorului îmbinatglobină. Deoarece, secvența ultimelor 3 nucleotide ale intronului este CAG, plasmidul
RO 118887 Β1
2305 rezultat pVL-SnaBI/Pvull conține un sit de restricție Pvull care la digestie eliberează secvența 3' a intronului ca un capăt ADN teșit. în a treia etapă, plasmidul pVL-luc5' se prepară din două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 5,3 kB preparat prin digestia plasmidului pVLluc cu EcoRV și Nhel și tratarea vectorului rezultat cu ADN polimerază Klenow și fosfatază alcalină și 2) un fragment ADN de 0,1 kB care conține donorul îmbinat IE CMV, preparat prin digestia plasmidului pVL-SnaBI/Pvull cu SnaBI și Smal. Clonele care corespund la pVLIuc5', care conțin donorul îmbinat IE CMV înserat în orientare corectă în regiunea de codificare luciferază sunt identificate prin alcătuirea hărții de restricție.
Plasmidul pVL-luc3‘, care conține a doua casetă genă indicator, se prepară în 3 etape. în etapa 1, plasmidul pBS-LTR, în care 3'LTR al pBS-HXB2 este subclonat, se prepară din două fragmente ADN: 1) un vector ADN de 3,0 kB preparat prin digestia plasmidului pBluescript II KS (+) cu Xhol și Xbal, și 2) un fragment ADN de 0,8 kB conținând 3‘LTR, preparat prin digestia pBS-HXB2 cu Xhol și Xbal. în etapa 2, plasmidul pBS-LTRIuc3‘, care conține regiunea de codificare 3' a luciferazei urmată de un sit de poliadenilare SV40, inserat în 3'LTR deletat, este preparat din două fragmente: 1) un vector ADN de 3,5 kB preparat prin digestia pBS-LTR cu EcoRV, și tratarea vectorului rezultat cu fosfatază alcalină și 2) un fragment ADN de 0,5 kB conținând regiunea de codificare luciferază 3' și situl polyA SV40, preparat prin digestia plasmidului pVL-luc cu EcoRV și Nhel, urmată de tratamentul fragmentului rezultat cu ADN polimerază Klenow. Clonele care au regiunea de codificare luciferază 3' înserată în orientare corectă (adică, opusă direcției transcripției din 3'LTR) sunt identificate prin alcătuirea hărții de restricție. în etapa 3, se prepară plasmidul pVL-luc3' din 2 fragmente ADN: 1) un vector ADN de 4,0 kB preparat prin digestia plasmidului pBS-LTR-luc3' cu EcoRV, urmată de tratamentul vectorului care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 0,1 kB conținând al doilea exon acceptor îmbinat genă (-globină, preparat prin digestia plasmidului pVL-SnaBI/Pvull cu Pvull și Smal. Clonele care sunt corespunzătoare la pVL-luc3', care conțin al doilea exon acceptor îmbinat (-globină introdus în orientarea corectă în regiunea de codificare luciferază, sunt identificate prin harta de restricție.
Plasmizii pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pLS-lucPC-HS și pLS-lucPC-PB sunt preparați prin aceiași procedură în 3 etape. în etapa 1, plasmizii pLG-lucDP-HS, pLG-lucDPPB, pLS-lucDP-HS și pLS-lucDP-PB sunt preparați din două fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmidului pLG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pLS-lucPP-HS și respectiv, pLS-lucPP-PB cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 0,8 kB preparat prin digestia plasmidului pLG cu Smal și Clal. în a doua etapă, plasmizii pLG-luc5'-HS, pLGIuc5'-PB, pLS-luc5'-HS și pLS-luc5'-PB sunt preparați din două fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmizilor pLG-lucDP-HS, pLG-lucDP-PB, pLS-lucDP-HS și respectiv pLS-lucDP-PB, și tratarea vectorilor care rezultă cu fosfatază alcalină și 2) un fragment ADN de 2,5 kB conținând prima casetă genă indicator preparat prin digestia pVLIuc5' cu Notl. Clonele care conțin prima casetă genă indicator introdusă în vectorul viral cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor virale sunt identificate prin harta de restricție. în etapa 3, plasmizii pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pLS-lucPC-HS și pLS-lucPCPB sunt preparați din două fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmizilor pLG-luc5'-HS, pLG-luc5'-PB, pLS-luc5'-HS și respectiv pLS-luc5'-PB, cu Xhol și Xbal, și 2) un fragment ADN de 1,1 kB conținând a doua casetă genă indicator preparat prin digestia plasmidului pVL-luc3' cu Xhol și Xbal.
Plasmizii pCG-lucPC-HS, pCG-lucPC-PB, pCS-lucPC-HS și pCS-lucPC-PB sunt preparați fiecare din 2 fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmizilor pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pLS-lucPC-HS și respectiv pLS-lucPC-PB, cu Smal și Clal și 2) un fragment ADN de 1,3 kB preparat prin digestia plasmidului pCG cu Smal și Clal.
2310
2315
2320
2325
2330
2335
2340
2345
2350
RO 118887 Β1
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată au fost desemnați folosind vectori virali HIV genomici și subgenomici cuprinzând gene antivirale țintă descrise în exemplul 1.
Vectori test de rezistență sunt preparați de la plasmizii pLG-lucPC-HS, pLG-lucPCPB, pCG-lucPC-HS, pCG-lucPC-PB, pLS-lucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-lucPC-HS și pCSlucPC-PB (Fig.4B), prin procedura descrisă în exemplul 1. Vectorii test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizii pLG-lucPC-HS, pCG-lucPC-HS, pLS-lucPC-HS sau pCS-lucPC-HS folosind secvențele de la pacienți amplificate, preparate cu oligonucleotide 18 și 19, și cu oligonucleotide 22 și 23. Vectorii test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizii pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-PB, pLS-lucPC-PB și pCS-lucPC-PB folosind secvențele amplificate de la pacient preparate cu oligonucleotidele 20 și 21, și cu oligonucleotidele 24 și 25.
Test de sensibilitate și rezistență
Testele de rezistență sunt realizate prin procedurile descrise în exemplul 1, după cum urmează. Vectorii test de rezistență preparați de la plasmizii pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-HS și pCG-lucPC-PB pierd o genă HIV envfuncțională și sunt folosiți în legătură cu vectorul organizat de expresie pVL-env4070A. Vectorii test de rezistență preparați de la plasmizii pLS-lucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-lucPC-HS și pCS-lucPC-PB codifică numai produsele genei HIV gag-pol, și sunt folosiți în legătură cu vectorii de expresie organizați pVL-env4070a și, fie cu pLTR-HIV3‘, fie cu pCMV-HIV3'. în testele de rezistență realizate folosind două tipuri de celulă gazdă, linia de celule 293, linia de celule tsa54, linia de celule tsa 201, sau linia de celule BOSC 23, sunt folosite ca celule gazdă organizate, și celule Jurkat nemodificate sunt folosite drept celule țintă. Deoarece, genele indicator nefuncționale cu regiuni de codificare permutate conținute în acești vectori test de rezistență nu sunt exprimate eficient la transfecția celulelor gazdă organizate, se realizează infecția celulelor gazdă țintă, fie prin cocultivare cu celule gazdă organizate, fie folosind virus din supernatantul celulelor gazdă organizate. Pentru motive similare, testele de rezistență realizate cu acești vectori test de rezistență pot folosi un singur tip de celulă gazdă. Testele de rezistență folosind un singur tip de celulă gazdă sunt realizate folosind, fie celule 293, tsa54, tsa201, BOSC 23, fie celule Jurkat.
Exemplul 3. Test de sensibilitate și rezistență al HIV la medicamente folosind vectori test de rezistență cuprinzând segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională cu un intron inversat
Vectori test de rezistență care conțin o genă indicator nefuncțională cu un intron inversat s-au desemnat folosind vectori virali HIV genomici și subgenomici care conțin gene antivirale țintă descrise în exemplul 1.
Vectori virali genă indicator - Intron inversat
Vectori virali genomici genă indicator cu situri acceptoare secvență pacient, pLGlucll-HS, pLG-lucll-PB, pCG-lucll-HS și pCG-lucll-PB și vectori test de rezistență derivați de la aceștia, conțin fiecare următoarele elemente într-o orientare 5‘ la 3' (fig.5B): 1) o regiune HIV-LTR 113 (pLG-lucll-HS și pLG-lucll-PB) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCG-lucll-HS și pCG-lucll-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, 4) o casetă genă indicator inserată în gena envdeletată și 5) un 3' HIV-LTR. PLG-lucll-HS și pLG-lucll-PB conțin situri acceptoare unice Hpal și Sall pentru secvența de la pacient la nucleotidele 2243 și respectiv 4190 ale HXB2; pCG-lucll-HS și pCG-lucll-PB conțin acceptoare unice Pvul și BamHI pentru secvența de la pacient la nucleotidele 2221 și respectiv 4212 ale HXB2 (vezi exemplul 1 pentru detalii). Caseta genă indicator conține 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2)
RO 118887 Β1 regiunea de codificare a genei luciferază întreruptă printr-un intron artificial inversat, și 3) o secvență de poliadenilare SV40. Orientarea transcripțională globală a casetei genă indicator este opusă celei a primului intensificator-promotor CMV și LTR-urilor virale, în timp ce orientarea intronului artificial este aceiași ca a primelor elemente. Transcripția genei indicator de al doilea intensifica-tor-promotor CMV nu conduce la producerea de transcripte funcționale deoarece, intronul inversat nu poate fi îmbinat în această orientare. Transcripția genei indicator de LTR-ul viral 5' sau primul intensificator-promotor IE CMV, conduce totuși, la îndepărtarea intronului inversat prin îmbinarea ARN-ului, deși gena indicator încă nu este exprimată funcțional deoarece transcriptul rezultat are o orientare antisens. După transcripția inversă a acestui transcript și integrarea ADN-ului proviral rezultat, gena indicator poate fi transcrisă funcțional de al doilea intensificator-promotor CMV deoarece intronul inversat a fost îndepărtat anterior (fig.5C).
Vectorii virali subgenomici genă indicator cu situri acceptoare pentru secvență pacient, pLS-lucll-ll-HS, pLS-lucll-PB, pCS-lucll-HS și pCS-lucll-PB, și vectori test de rezistență derivați de la aceștia, conțin fiecare următoarele elemente într-o orientare 5' la 3' (fig.5B): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLS-lucl-HS și pLS-lucll-PB) sau un prim intensificatorpromotor-promotor IE CMV (pCS-lucll-HS și pCS-lucll-PB), 2) regiunile HIV-LTR R și LJ5, 3) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, 4) caseta genă indicator, 5) un element RRE de la gena HIV envconținând o secvență virală organizată, și 6) un 3' HIV-LTR. PLS-lucllHS și pCS-lucll-HS conțin situri acceptoare unice Hpal și Sall pentru secvența de la pacient la nucleotidele 2243 și 4190 de la HXB2; pLS-lucll-PB și pCS-lucll-PB conțin situri acceptoare unice Pvul și BamHI pentru secvență pacient la nucleotidele 2221 și respectiv 4212 ale HXB2. Caseta genă indicator conține 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2) regiunea de codificare a genei luciferază întreruptă de un intron artificial inversat, și 3) o secvență de poliadenilare SV40. Deoarece este cazul pentru vectorii virali genomici pLGlucll și pCG-lucll, genele indicator ale pLS-lucll și pCS-lucll nu pot fi transcrise funcțional, până când intronul inversat nu este îndepărtat și are loc transcripția inversă și integrarea provirală (fig.5C).
Plasmidul pVL-lucll, care conține caseta genei indicator, în care este înserat intronul artificial de la pVL-SnaBI/Pvull în regiunea de codificare luciferază într-o orientare inversă, se prepară din 2 fragmente ADN: 1) un fragment vector de 5,8 kB preparat prin digestia pVL-luc cu EcoRV și tratarea vectorului rezultat cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 0,2 kB care corespunde cu precizie la secvența intronului artificial preparată prin digestia pVL-SnaBI/Pvull cu SnaBI și Pvull. Clonele care corespund la pVL-lucll care conțin intronul artificial în regiunea de codificare luciferază într-o orientare inversă sunt identificate în harta de restricție.
Plasmizii pLG-lucll-HS, pLG-lucll-PB, pLS-lucll-HS și pLS-lucll-PB sunt preparați din 2 fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmizilor pLG-lucDP-HS, pLGlucDP-PB, pLS-lucDP-HS și respectiv pLS-lucDP-PB, și tratarea vectorilor care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 3,2 kB conținând caseta genă indicator luciferază preparată prin digestia pVL-lucll cu Notl. Clonele care conțin caseta genă indicator plucll corectă inserată în vectorul viral cu o orientare transcripțională opusă celei a LTR-urilor virale sunt identificate prin harta de restricție și sunt folosite pentru prepararea vectorilor test de rezistență.
Plasmizii pCG-lucll-HS, pCG-lucll-PB, pCS-lucll-HS și pCS-lucll-PB sunt preparați fiecare din două fragmente ADN: 1) un vector ADN preparat prin digestia plasmizilor pLGlucll-HS, pLG-lucll-PB, pLS-lucll-HS și respectiv pLS-lucll-PB, cu Smal și Clal, și 2) un fragment ADN de 1,3 kB prepasrat prin digestia plasmidului pCG cu Smal și Clal.
2405
2410
2415
2420
2425
2430
2435
2440
2445
RO 118887 Β1
Vector test de rezistență - Construcție
Vectorii test de rezistență sunt preparați de la plasmizi pLG-lucll-HS, pLG-lucll-PB, pCG-lucll-HS, pCG-lucll-PB, pLS-lucll-HS, pLS-lucll-PB, pCS-lucll-HS și pCS-lucll-PB (fig.5B), prin procedura descrisă în exemplul 1. Vectorii test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizi pLG-lucll-HS, pCG-lucll-HS, pLS-lucll-HS sau pCS-lucll-HS folosind secvențe de la pacient amplificate, preparate cu oligonucleotide 18 și 19, și cu oligonucleotide 22 și 23. Vectorii test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizi pLG-lucll-PB, pCG-lucll-PB, pLS-lucll-PB sau pCS-lucll-PB folosind secvențe amplificate de la pacient cu oligonucleotidele 20 și 21, și cu oligonucleotidele 24 și 25.
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Teste de rezistență sunt realizate prin procedurile descrise în exemplul 1 după cum urmează. Vectori test de rezistență preparați de la plasmizi pLG-lucll-HS, pLG-lucll-PB, pCG-lucll-HS și pCG-lucll-PB pierd o genă HIV envfuncțională, și sunt folosiți în legătură cu vectorul de expresie organizat pVL-env4070A. Vectorii test de rezistență preparați de la plasmizi pLS-lucll-HS, pLS-lucll-PB, pCS-lucll-HS și pCS-lucll-PB codifică numai produsele genei HIV gag-pol, și sunt folosiți în legătură cu vectorii organizați de expresie pVLenv4070A, și, fie pLTR-HIV3‘, fie pCMV-HIV3'. în testele de rezistență realizate folosind 2 tipuri de celulă gazdă, linia de celule 293, linia de celule tsa54, linia de celule tsa201, sau linia de celule BOSC 23, sunt folosite ca celule gazdă organizate, și celulele Jurkat nemodificate sunt folosite drept celule țintă. Deoarece, genele indicator cu introni inversați conținute în acești vectori test de rezistență nu sunt exprimate eficient la transfecția celulelor gazdă organizate, se realizate infecția celulelor gazdă țintă, fie prin cocultivare cu celule gazdă organizate, fie folosind virus de la supernatantul celulelor gazdă organizate. Pentru motive similare, teste de rezistență realizate cu acești vectori test de rezistență pot folosi un singur tip de celule gazdă. Teste de rezistență folosind un singur tip de celule gazdă sunt realizate folosind, fie celule 293, tsa54, tsa201, BOSC 23, fie celule Jurkat.
Exemplul 4. Test de rezistență și sensibilitate a HIV la medicament care nu se bazează pe particule folosind vectori test de rezistență cuprinzând segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională
Test de rezistență și sensibilitate la medicament
Testele de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate folosind vectori test de rezistență cuprinzând gene indicator nefuncționale, fie cu promotori permutați, regiuni de codificare permutate, fie cu introni inversați, descrise în exemplele 1,2 și 3. Aceste teste de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate prin transfecția unui singur tip de celulă gazdă cu fiecare vector test de rezistență în absența vectorilor de expresie organizați. Deși, genele indicator nefuncționale conținute în acești vectori test de rezistență nu sunt exprimate eficient la transfecția celulelor gazdă, există expresie detectabilă a genei indicator care rezultă de la transcripția inversă care nu se bazează pe particule virale. Transcripția inversă și transferul de bandă rezultă în conversia genei indicator permutată, nefuncțională, la o genă indicator funcțională nepermutată. Deoarece, transcripția inversă este dependentă complet de expresia genei pol conținută în fiecare vector test de rezistență, agenții antivirali se pot testa pentru capacitatea lor de a inhiba produsele genei pol codificate de segmentele derivate de la pacient conținute în vectorii test de rezistență. Teste de rezistență care nu se bazează pe particule sunt realizate prin procedurile generale descrise în exemplul 1 cu următoarele modificări: 1) vectorii test de rezistență sunt transfectați în celule gazdă corespunzătoare, 2) agenți antivirali, sau combinații ale lor sunt adăugate la concentrații corespunzătoare la culturi individuale de celule gazdă transfectate imediat după transfecție, 3) celulele gazdă sunt recoltate de la 24 la 72 h după transfecție și sunt analizate pentru activitate luciferază. Reducerea activității luciferazei observată la celule gazdă
RO 118887 Β1 transfectate cu un vector test de rezistență dat în prezența unui agent antiviral dat, sau agenți, așa cum s-a comparat la un control desfășurat în absența agentului(lor) antivirali se folosește pentru calcularea conținutului inhibitor aparent (Ki) al acelui agent, sau combinație de agenți, pentru produsul genei virale țintă codificată de segmentele derivate de la pacient prezente în vectorul test de rezistență.
Vector test de rezistență - Construcție
Pentru teste de rezistență care nu se bazează pe particule cu vectori test cuprinzând o genă indicator cu un promotor permutat, vectorii test de rezistență se prepară cum s-a descris în exemplul 1 folosind plasmizi pLG-lucPP-HS, pLG-lucPP-PB, pCB-lucPP-HS, pCGlucPP-PB, pLS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB, pCS-lucPP-HS sau pCS-lucPP-PB. Fiecare vector test de rezistență este transfectat în celule gazdă care exprimă o ARN polimerază T7 citoplasmică (de exemplu, celule 293/T7RNAP sau celule Jurkat/T7RNAP). Astfel de celule gazdă sunt preparate prin transfecția stabilă a celulelor 293 și celulelor Jurkat cum s-a descris în exemplul 1, folosind plasmid pVL-T7RNAP, care dirijează expresia citoplasmatică unei ARN plimeraze fag T7 în celule umane sau alte celule de la mamifere și linii de celule. Se construiește pVL-T/RNAP de la următoarele două fragmente ADN: 1) un fragment vector de 4,3 kB preparat prin digestia vectorului de expresie mamiferă pVL-2 cu EcoRI și Bglll, și 2) un fragment ADN de 2,6 kB conținând regiunea de codificare a ARN polimerazei T7 (nucleotide 166 la 2815, coordonate din GenBank, număr de acces M38308, Grachev și Pletnev (1984) Bioorg. Khim. 10, 824-843) preparat prin PCR folosind plasmid pT7-G1 ca matriță cu oligonucleotidele 47 și 40 ca primeri, urmată de digestie cu EcoRI și Bglll. Oligonucleotida 47 încorporează un sit unic EcoRI urmat de o secvență consens pentru ințierea translației eucariotice (de exemplu, Kozak (1991) J. Biol. Chem., 266,19867-19870), în timp ce oligonucleotida 40 încorporează un sit unic Bglll.
Teste de rezistență care nu se bazează pe particule, cu vectori test de rezistență cuprinzând o genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată sau intron inversat, sunt preparați cum s-a descris în exemplul 1, folosind plasmizi pLG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-HS, pCG-lucPC-PB, pLS-lucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-lucPCHS, pCS-lucPC-PB, pLG-lucll-HS, pLG-lucll-HS, PCG-lucll-HS, PCG-lucll-PB, pLS-lucll-HS, pLS-lucll-PB, pCS-lucll-HS sau pCS-lucll-PB. Fiecare vector este transfectat în, fie celule 293, tsa54, tsa201, BOSC 23, fie Jurkat.
Exemplul 5. Test de sensibilitate și rezistență a HIV la medicament folosind vectori test de rezistență cuprinzând segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator funcțională
Vector viral genă indicator - Genă indicator funcțională
Vectorii virali genomici genă indicator cu situri acceptor pentru secvență pacient, plasmizii pLG-luc-HS-1, pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-1, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-HS-1, pCGluc-HS-2, pCG-luc-PB-1 și pCG-luc-PB-2, și vectori test derivați de la aceștia, conțin fiecare următoarele elemente într-o orientare 5' la 3' (fig.6): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pLG-luc-HS1, pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-1 și pLG-luc-PB-2) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCG-luc-HS-1, pCG-luc-HS-2, pCG-luc-PB-1 și pCG-luc-PB-2), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunile de codificare ale genelor HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, envdeletată, și nef, 4) o casetă genă indicator inserată în gena envdeletată, și 5) un 3' HIV-LTR. PLG-luHS-1, pLG-luc-HS-2, pCG-luc-HS-1 și pCG-luc-HS-2 conțin situri unice Hpal și Sall acceptoare pentru secvența pacient la nucleotidele 2243 și, respectiv 4190 ale HXB2; pLGluc-PB-1, pLG-luic-PB-2, pCG-luc-PB-1 și pCG-luc-PB-2 conțin situri unice pvul și BamHI acceptoare pentru secvența pacient la nucleotidele 2221 și, respectiv 4212 ale HXB2 (vezi exemplul 1 pentru detalii). Casetele genă indicator ale fiecărui plasmid conțin 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2) regiunea de codificare a genei luciferază, și 3) o secvență
2500
2505
2510
2515
2520
2525
2530
2535
2540
2545
RO 118887 Β1 de poliadenilare SV40. Casetele genă indicator ale pLG-luc-HS-1, pLG-luc-PB-1, pCG-lucHS-1 și pLG-luc-PB-1 sunt inserate în vectorul cu o orientare transcripțională opusă LTRurilor virale sau primului intensificator-promotor CMV (Fig. 6B), în timp ce casetele genă indicator ale pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-HS-2 și pCG-luc-PB-2 sunt înserate în vetorul cu aceiași orientare (fig.6C).
Vectori virali subgenomici genă indicator cu situri acceptoare pentru secvența de la pacient, plasmizii pLS-luc-HS-1, pLS-luc-HS-2, pLS-luc-PB-1, pLS-luc-PB-1, pLS.Iuc-PB-2, pCS-luc-HS.1, pCS-luc-HS-2, pCS-luc-PB-1 și pCS-luc-PB-2, și vectori test de rezistență derivați de la aceștia, conțin fiecare următoarele elemente într-o orientare 5' la 3‘ (fig.6): 1) o regiune HIV-LTR U3 (pls-luc-HS-1, pLS-luc-HS-2, pLS-luc-PB-1 și pLS-luc-PB-2) sau un prim intensificator-promotor IE CMV (pCS-luc-HS-1, pCS-luc-HS-2, pCS-luc-PB-1 și pCSluc-PB-2), 2) regiunile HIV-LTR R și U5, 3) regiunea de codificare a genei HIV gag-pol, 4) caseta genă indicator, 5) un element RRE de la gena HIV env conținând o secvență virală organizată, și 6) un 3' HIV-LTR. PLS-luc-HS-1, pLS-luc-HS-2, pCS-luc-HS-1 și pCS-luc-HS-2 conțin situri unice Hpal și Sall acceptoare pentru secvența de la pacient la nucleotidele 2243 și, respectiv 4190 ale HXB2; pLS-luc-PB-1, pLS-luc-PB-1, pLS-luc-PB-2, pCS-luc-PB-1 și pCS-luc-PB-2 conțin situri unice Pvul și BamHI acceptoare pentru secvența pacient la nucleotidele 2221 și, respectiv 4212 ale HXB2. Casetele genă indicator ale fiecărui plasmid conțin 1) un al doilea intensificator-promotor CMV, 2) regiunea de codificare completă a genei luciferază, și 3) o secvență de poliadenilare SV40. Casetele genă indicator ale pLSluc-HS-1, pLS-luc-PB-1, pCS-luc-HS-1 și pCS-luc-PB-1 sunt înserate în vectorul cu o orientare transcripțională opusă față de LTR-urile virale sau primul intensificator-promotor CMV (fig.6B), în timp ce casetele genă indicator ale pLS-luc-HS-2, pLS-luc-PB-2, pCS-luc-HS-2 și pCS-luc-PB-2 sunt înserate în vectorul cu aceiași orientare (fig.6C).
Plasmizii pLG-luc-HS-1 și pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-1 și pLG-luc-PB-2, pCG-lucHS-1 și pCG-luc-HS-2, pCG-luc-PB-1 și pcg-luc-PB-2, pLS-luc-HS-1 și pLS-luc-HS-2, pLSluc-PB-1 și pLS-luc-PB-2, pCS-luc-HS-1 și pCS-luc-HS-2, pCS-luc-PB-1 și pCS-luc-PB-2 sunt fiecare preparați din 2 fragmente AdN: 1) un vector ADN preparat prin pLG-lucll-HS, pLG-lucll-PB, pCG-lucll-HS, pCG-lucll-pb, pLS-lucll-HS, pLS-lucll-PB, pCS-lucll-HS și respectiv pCS-lucll-PB cu Notl și tratarea vectorilor care rezultă cu fosfatază alcalină, și 2) un fragment ADN de 0,3 kB conținând caseta genă indicator luciferază preparată prin digestia pVL-luc cu Notl. Clonele conținând caseta genă indicator inserată într-un vector viral dat în ambele orientări transcripționale relative la LTR-urile virale sunt identificate prin harta de restricție (de exemplu, pLG-luc-HS-1 și pLG-luc-HS-2).
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator funcțională s-au desemnat folosind vectori virali HIV genomici și subgenomici cuprinzând gene virale țintă descrise în exemplul 1. Vectori test de rezistență sunt preparați de la plasmizii de mai sus (fig.6) prin procedura descrisă în exemplul 1. Vectori test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizi pLG-luc-HS-1, pLG-luc-HS-2, pCG-luc-HS-1, pCG-luc-HS-2, pLS-luc-HS1, pLS-luc-HS-2, pCS-luc-HS-1 sau pCS-luc-HS-1 folosind secvențe de la pacient amplificate preparate cu oligonucleotidele 18 și 19, și cu oligonucleotidele 22 și 23. Vectori test de rezistență sunt construiți cu vectori preparați de la plasmizi pLG-luc-PB-1, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-PB-1, pCG-luc-PB-2, pLS-luc-PB-1, pLS-luc-PB-2, pCS-luc-PB-1 sau pCS-luc-PB-2 folosind secvențe de la pacient amplificate, preparate cu oligonucleotidele 20 și 21, și cu oligonucleotidele 24 și 25.
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de rezistență sunt realizate prin procedurile descrise în exemplul 1 după cum urmează. Vectori test de rezistență preparați de la plasmizi pLG-luc-HS-1, pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-1, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-HS-1, pCG-luc-HS-2, pCG-luc-PB-1 și pCG-luc-PB-2 pierd o genă HIV envfuncțională și sunt folosiți în legătură cu vectorul de expresie organizat
RO 118887 Β1
2600 pVL-env4070A. Vectori test de rezistență preparați de la plasmizi pLS-luc-HS-1, pLS-luc-HS2, pLS-luc-PB-1, pl_S-luc-PB-2, pCS-luc-HS-1, pCS-luc-HS-2, pCS-luc-PB-1 și pCS-luc-PB-2 codifică numai produsele genei HIV gag-pol, și sunt folosiți în legătură cu pVL-env4070A, și cu vectorii organizați de expresie pLTR-HIV3‘ sau pCMV-HIV3‘. Teste de rezistență sunt realizate cu două tipuri de celule gazdă, care folosesc liniile de celule 293, tsa54, tsa201 sau BOSC 23 drept celule gazdă și care folosesc celule Jurkat nemodificate drept celule țintă. Infecția celulelor țintă cu aceștia sau alți vectori test de rezistență conținând gene indicator funcționale este realizată folosind procedura pentru infecție cu particule virale din supernatantele filtrate obținute de la celule gazdă indicator vector test de rezistență, cum s-a descris în exemplul 1. Spre deosebire de vectorii test de rezistență cuprinzând vectori virali genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat sau un intron inversat, cele care cuprind o genă indicator funcțională sunt de obicei capabile să exprime genele lor indicator în celulele gazdă organizate transfectate. Nici procedura de cocultivare, nici testul de rezistență care folosește un singur tip de celulă nu pot fi prin urmare, adaptate cu ușurință pentru infectarea celulelor țintă folosind vectori test de rezistență cu gene indicator funcționale, deoarece ar fi dificil să se distingă între expresia genei indicator în celule gazdă țintă și celule gazdă organizate transfectate.
Toate publicațiile și cererile de brevet citate în această descriere sunt încorporate aici în întregimea lor chiar dacă fiecare publicație individuală sau cerere de brevet a fost specific Și individual indicată ca fiind încorporată prin referire.
Va fi evident pentru persoanele pregătite în domeniu căruia îi aparține invenția, că prezenta invenție poate fi realizată și în alte forme decât cele descrise în mod specific mai sus, de exemplu, se poate realiza testul de sensibilitate și rezistență la medicament asupra altor virusuri, fără depărtare de spiritul sau caracteristicile esențiale ale invenției. Realizările particulare ale invenției descrise mai sus, trebuie să fie, prin urmare considerate ca ilustrative și nu restrictive. întinderea prezentei invenții este mai degrabă așa cum s-a expus în revendicările anexate decât limitată de exemplele conținute în descrierea anterioară.
Exemplul 6. Test de sensibilitate și rezistență a HIV la medicament folosind vectori test de rezistență care cuprind segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator funcțională
Teste de sensibilitate și rezistență
Testele de rezistență s-au realizat cu vectori test de rezistență bazați pe vectorii virali genă indicator pCG-CXCN(F-lucP)2, și pCG-CXAT(F-lucP)2, ambii fiind similari cu pCG-luc2 descris în exemplul 5, folosind două tipuri de celule gazdă. în cazul pCG-CXCN(F-lucP)2 vectorul viral genă indicator s-a modificat în sensul pierderii de către caseta genă indicator a intronului A (intron CMV/a-globină descris mai sus), nu conține un semnal de poliadenilare și secvența 3' US din spate s-a omis din construcție. US din spate s-a înlocuit cu semnalul poly A SV40 și regiunile replicării originii. Vectorul viral genă indicator pCG-CXAT(F-lucP)2 a diferit de pCG-CXCN(F-lucP)2 printr-un intron artificial conținut în caseta genă indicator în aval de intensificatorul-promotorul CMV și o regiune semnal de poliadenilare TK. Particulele virale vector test de rezistență s-au produs de o primă celulă gazdă (celulă gazdă vector test de rezistență), care s-a preparat prin transfectarea unei celule gazdă organizate cu vectorul test de rezistență și vectorul de expresie organizat. Particulele virale vector test de rezistență au fost folosite apoi pentru a infecta o a doua celulă gazdă (celula gazdă țintă) în care se măsoară expresia genei indicator.
Teste de sensibilitate/rezistență la medicament AZT
S-a construit vectorul test de rezistență pCG-luc-2 care conține o casetă genă luciferază funcțională și celulele gazdă s-au transfectat cu ADN-ul vectorului test de rezistență.
Vectorii test de rezistență au conținut secvențele “test” transcriptază inversă derivate de la
2605
2610
2615
2620
2625
2630
2635
2640
2645
RO 118887 Β1 pacient care au fost, fie sensibile, fie rezistente la inhibitorul nucleozidic al transcriptazei inverse, AZT (Sigma). Particulele virale vector test de rezistență s-au produs prin transfectarea ADN-ului vectorului test de rezistență în celule gazdă folosite pentru infectarea celulelor gazdă țintă crescute, fie în absența AZT, fie în prezența concentrațiilor de medicament în creștere (variind de la aproximativ 0,0001 μΜ la 1000 μΜ). Cantitatea activității luciferază produsă în celule gazdă țintă infectate în prezența medicamentului s-a comparat la cantitatea de luciferază produsă în celule gazdă țintă infectate în absența medicamentului. Rezistența la medicament s-a măsurat sub forma cantității de medicament necesară pentru a inhiba prin 50% activitatea luciferază detectată în absența medicamentului (concentrație inhibitoare 50%), IC50 s-au determinat prin marcarea procentului inhibării medicamentului față de log10 al concentrației medicamentului.
S-au însămânțat celule gazdă (293) în plăci de 10 cm diametru și s-au transfectat la câteva zile după întindere cu ADN plasmid vector test de rezistență și vectorul de expresie al învelișului pCXAS(4070A-env). Transfecțiile s-au realizat folosind o procedură precipitare calciu-fosfat. Mediul de cultură celulară conținând ADN-ul precipitat s-a înlocuit cu mediu proaspăt, de la 1 la 24 h, de la transfecție. Mediul de cultură conținând particule virale vector de rezistență a fost recoltat 1 la 4 zile după transfecție și a fost trecut printr-un filtru de 0,45 mM care înainte s-a păstrat la - 80°C. Nivelurile proteinei capsidei HIV (p24) în mediul de cultură celulară recoltat s-au determinat printr-o metodă EIA cum s-a descris de către producător (SIAC; Frederick, MD). înainte de infecție cu 6 la 48 h, celule țintă (293 și 293/T9 s-au etalat în mediu de cultură care, fie nu conține AZT, fie conține dilutii seriale de AZT de două ori începând la 100 μΜ și terminându-se la 0,00005 μΜ. Concentrațiile de AZT s-au menținut în cursul infecției. Celulele gazdă țintă s-au inoculat cu 90 μΙ supernatant celulă gazdă vector test de rezistență. Infecții de control s-au realizat folosind mediu de cultură celulară de la transformările simulate (fără ADN) sau transfecții conținând ADN plasmid vector test de rezistență fără ADN plasmid de expresie înveliș (pCXAS(4070A-env)). De la 1 până la 24 h după inoculare, s-a adăugat mediu proaspăt la fiecare godeu. De la 12 până la 36 h mai târziu mediul s-a înlocuit complet cu mediu proaspăt. De la 1 la 3 sau mai multe zile după infecție mediu a fost îndepărtat și s-a adăugat la fiecare godeu tampon de liză celulară (Promega). Lizatele celulare s-au diluat de 100 de ori în tampon de liză și fiecare lizat celular diluat s-a analizat pentru activitate luciferază (fig.7A). Efectul inhibitor al AZT a fost determinat folosind următoarea ecuație:
inhibare luciferază % = 1 - (RLUIuc(AZT) + RLUIuc) unde: RLUIuc(AZp este Unitatea Relativă de Lumină a activității luciferazei în celule infectate în prezență de AZT și RLUIuc este Unitatea Relativă de Lumină a activității luciferazei în celule infectate în absență de AZT. Valorile IC50 s-au obținut de la curbele sigmoide care sau generat de la datele prin marcarea procentului inhibării activității luciferazei față de log10 al concentrației medicamentului. Curbele de inhibare ale AZT sunt prezentate în fig.7B).
Test de sensibilitate/rezistență la medicament nevirapină
Vectorul test de rezistență, bazat pe vectorul viral genă indicator pCG-CXCN/FlucP)2, a conținut secvența transcriptază inversă derivată de la clona provirală activă biologic, pNL4-3, care este sensibilă la inhibitorul nonnucleozidic al transcriptazei inverse, nevirapină (BI-RG-587, Boehringer Ingleheim). Transfecția celulelor gazdă organizate și infecția celulelor gazdă țintă s-au realizat cum s-a descris pentru testele de sensibilitate/rezistență pentru medicamentul AZT, descrise mai sus. Sensibilitatea/ rezistența nevirapină s-a evaluat folosind concentrații de nevirapină în intervalul de la 0,0001 μΜ. Curba de inhibare nevirapină s-a determinat cum s-a descris mai sus pentru AZT și este arătată în fig.7C.
RO 118887 Β1
Test de sensibilitate/rezistență la medicament nevirapină
Vectorul test de rezistență, bazat pe vectorul viral genă indicator pCG-CXCN/FlucP)2, a conținut secvența pretează derivată de la clona provirală activă biologic, pNL4-3, care este sensibilă la inhibitorul proteazei, indinavir (MK-639, Merck). Transfecția celulelor gazdă organizate și infecția celulelor gazdă țintă s-au realizat cum s-a descris pentru testele de sensibilitate/rezistență pentru medicamentul AZT cu excepția că inhibitorul proteazei indinavir, a fost prezent în culturile de celule gazdă organizate transfectate, cum s-a descris mai sus. Sensibilitatea/rezistenta indinavir s-a evaluat folosind concentrații de indinavir în intervalul de la 1,5 pM la 3 μΜ. Curba de inhibare indinavir s-a determinat cum s-a descris mai sus pentru AZT și este arătată în fig.7D.
Exemplul 7. Test de sensibilitate și rezistență a hepatitelor folosind vectori test de rezistență a hepatitelor folosind vectori test de rezistență cuprinzând segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională conținând un intron inversat
Vector viral genă indicator - Construcție
Vectori virali genă indicator care conțin genă indicator nefuncțională cu un intron inversat au fost desemnați folosind vectori virali subgenomici HBV cuprinzând gene virale care sunt ținta medicamentelor antivirale. Vectori virali genă indicator pCS-HBV(NF-IG)ll(PSAS-), sunt bazați pe vectorul viral subgenomic pCS-HBV. Vectorul viral genă indicator conține o casetă genă indicator nefuncțională care conține un intron inversat și toate elementele regulatoare de c/s-acțiune care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV (adică (DR1, 5' ε DR2, DR1*, 3' pA), dar le lipsesc secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile de trans-acțiune structurale și enzimatice care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei virale (fig.8B). Genele C, P, S și X și siturile acceptoare pacient sunt conținute într-un vector organizat pPK-CPX (descris mai jos, fig.8D) și pPH-S (descris mai jos, fig.8E). în această realizare vectorul viral genă indicator pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS-) și vectorul organizat pPK-CPX constituie un sistem vector test de rezistență. Vectorul viral genă indicator nefuncțională pCS-HBV (NF-IG)Il-(PSAS-) conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și regiunea (ε) DR1 și copia 5' a semnalului de încapsulare (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator nefuncțională în care ORF-ul genei indicator conține un intron inversat, (4) regiunea genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3‘ε, și regiunea 3' a semnalului de poliadenilare HBV (pA). Caseta de expresie genă indicator nefuncțională este cuprinsă la câteva sau în totalitate dintre următoarele elemente aranjate într-o orientare 5' la 3': (1) o regiune intensificator-promotor transcripțională, (2) un intron, (3) o genă indicator care conține un intron inversat, (4) o secvență semnal de poliadenilare transcripțională (de exemplu, gena HSV-1 timidin kinază). Caseta de expresie genă indicator are o orientare transcripțională opusă față de elementele secvenței HBV (fig.8B). Cu toate acestea, intronul din ORF-ul genei indicator are aceeași orientare transcripțională ca elementele secvenței HBV.
într-o a doua realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NFIG)II(PSAS+), conține o casetă genă indicator nefuncțională care conține un intron inversat, toate elementele regulatoare de c/s-acțiune care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV, și unele sau toate secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile de transacțiune structurale și enzimatice care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei virale (fig.8F). Vectorii test de rezistență derivați de la vectorul viral genă indicator pCS-HBV(NF-IG)ll(PSAS+) conțin situri acceptoare pentru secvența de la pacient (PSAS) și sunt folosite în legătură cu vectorul organizat, pPK-CSX (fig.8H). în această realizare vectorul viral genă indicator poate să asigure, de asemenea, unele sau toate dintre funcțiile de organizare, cum ar fi, P. Activitățile structurale și enzimatice care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și
2695
2700
2705
2710
2715
2720
2725
2730
2735
2740
RO 118887 Β1 formarea particulei virusului, sunt asigurate folosind vector(i) suplimentasri organizați pPKCSX (descris mai jos, fig.8H). în această realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)ll(PSAS+) conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3‘: (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și 5’ε (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator, conținând un intron inversat, poziționată în regiunea genomului HBV care poate să conțină o parte sau toate genele C, P, S și X precum și segmentul genei P derivat de la pacient, (4) regiunea genomului HBV care conține DR2, DR1*, 3'*, și regiune semnal 3'ε HBV pA. în vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS+) caseta de expresie genă indicator are o orientare transcripțională opusă elementelor secvenței HBV (fig.8F). Totuși, intronul din ORF genă indicator are aceiași orientare transcripțională ca elementele secvenței HBV.
în celulele transfectate vectorii organizați (fig.8D, 8E și 8H) asigură în trans, funcțiunile structurale și enzimatice care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, dar care nu sunt asigurate de vectorul test de rezistență sau vectorul viral genă indicator. în realizarea în care un vector viral genă indicator ca pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS-) este contrasfectat cu un vector organizat cum ar fi, pPK-CPX, combinația acestor vectori constituie un sistem vector test de rezistență, este vectorul organizat care conține situri acceptor pentru secvența pacientului pentru inserția segmentului genei P derivat de la pacient (descris mai sus). Vectorul organizat pPK-CPX conține elementele următoare întro orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea genomului HBV care se întinde de la codonul de inițiere a translației C ORF la semnalul 3' pA și incluzând genele C, P, S și Y. Gena C ale vectorilor organizați este modificată, astfel, încât ea nu conține și/sau exprimă secvențele pre-C ORF și nu exprimă proteinele S (descrise mai jos).
în HBV, ARN care codifică proteine C și/sau P este organizat preferențial, în c/s, și în consecință s-ar putea să interfere cu organizarea eficientă a vectorului test de rezistență care conține o genă indicator nefuncțională sau un ARN vector viral genă indicator nefuncțională care nu codifică proteine C și P. Pentru prevenirea encapsidării ARN-ului produs de vectorii organizați sunt luate două etape și pentru îmbunătățirea eficienței encapsidării vectorului test de rezistență sau ARN-ului vectorului viral genă indicator. în primul rând, ARN-ul produs de vectorii de organizare nu conține regiunea semnal 5' de încapsulare (ε) (fig.8D, 8E și 8H). în al doilea rând, în cazurile unde funcțiunile de organizare sunt asigurate de gena C și/sau gena P, prins de vectorul test de rezistență, fie de vector viral genă indicator genă nefuncțională, sunt folosiți vectori de organizare, cum ar fi pPK-S sau pPK-CSK, care nu exprimă produsele genei C și/sau P (fig.8E și 8H).
Vectori test de rezistență - Construcție
Vectorii test de rezistență sunt preparați prin 1) modificarea vectorului viral genă indicator pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS.) Prin introducere de situri unice, numite situri acceptoare secvență de la pacient (PSAS) în regiunea genei P, 2) amplificarea segmentelor derivate de la pacient care corespund la ținta HBV a medicamentului, de exemplu transcriptază inversă sau ADN polimerază, prin amplificarea ADN-ului viral prezent în serul sau celulele pacienților infectați, și 3) înserarea cu precizie a segmentelor amplificate în vectorii virali genă indicator la siturile de acceptare a secvenței pacientului (fig.8F). Alternativ, sisteme vector test de rezistență sunt preparate prin 1) modificarea vectorilor organizați, pPK-CPX, prin introducerea siturilor acceptor pentru secvență pacient în gena P, 2) amplificarea segmentelor derivate de la pacient corespunzând la ținta medicamentului HBV, de exemplu, transcriptază inversă sau ADN polimerază, prin amplificare folosind ADN viral prezent în ser sau celule ale pacienților infectați, și 3) înserarea cu precizie a secvențelor amplificate în vectori organizați la situri de acceptare a secvenței de la pacient (fig.8D). într-o realizare, 5' PSAS este situat lângă marginea distanțierului și domeniile RT ale proteinei P (imediat în
RO 118887 Β1
2795 avalul sitului de inițiere a translației proteinei S) și 3' PSAS este situat lângă capătul Cterminal al domeniului H Rnază al proteinei P. Introducerea unui segment al genei P derivat de la pacient în siturile de acceptare a secvenței pacientului rezultă în formarea secvenței himerice genă P în care domeniile TP și distanțiere sunt codificate de vectorul secvență genă P, în timp ce domeniile transcriptază inversă/polimerază și H Rnază sunt codificate de segmentele derivate de la pacient (fig.8D și 8F).
în HBV ORF genă S întreg suprapune ORF genă P dar este exprimat folosind un cadru de citire diferit (Nassal, M. Și Schaller, H. (1993) Trends in Microbiology 1, 221-228). Astfel, secvențele genei P HBV (domeniile transcriptază inversă și H Rnază) obținute de la pacienți conțin, de asemenea, secvențele corespunzătoare genei S de la pacient. Expresia regiunii genei S derivată de la pacient de la ORF genei S suprapusă este împiedicată prin eliminarea celor 3 situri de translație ORF ale genei S (pre-Sl, pre-S2, și S) și/sau introducerea codonilor de terminare în cadru în vectorii pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS+) sau pPK-CPK (fig.8F și 8D). Expresia genei S este asigurată, în trans, folosind vector organizat separat care asigură produsele genei S bine caracterizate (fig. 8E și 8H). Modificările care elimină gena S sunt realizate fără introducerea de schimbări la secvențele aminoacide suprapuse ce sunt codificate de proteina terminală (TP) sau domeniile distanțier ale genei P.
Teste de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate cu un vector test de rezistență bazat pe vectori virali genă indicator pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS+) sau cu sistem vector test de rezistență bazat pe un vector viral genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)ll(PSAS-) și un vector organizat, pPK-CPX, folosind, fie un tip de celulă gazdă, fie două tipuri de celulă gazdă. Cotransfecția celulelor gazdă organizate, fie cu un vector test de rezistență, cum ar fi, pCS-HBV(NF-IG)ll-(PSAS+) și un vector organizat, pPK-CSX, fie cu un vector viral genă indicator, cum ar fi, pCS-HBV(NF-IG)ll. (PSAS-) și vector organizat conținând segment derivat de la pacient cum ar fi, pPK-CPX, (adică, sistem vector test de rezistență) produce particule virale HBV conținând ARN “Pregenom” genă indicator encapsidată, care ca urmare a îmbinării intronului inversat, conține o genă indicator funcțională (fig.8B și 8C).
Transformări replicate sunt realizate pe o serie de culturi de celule gazdă organizate menținute, fie în absența medicamentului antiviral, fie în concentrații crescătoare de medicament anti-HBV (de exemplu, un inhibitor transcriptază inversă sau polimerază proteină P HBV). După menținerea celulelor gazdă organizate până la câteva zile în prezența sau absența medicamentului anti-HBV nivelul de sensibilitate sau rezistență poate fi analizat, fie direct în lizate ale celulei gazdă organizate, fie în particule HBV obținute prin recoltarea mediului de cultură al celulelor gazdă organizate. Se pot folosi abordări alternative pentru evaluarea sensibilității și rezistenței în lizate de celule și particule HBV izolate.
într-o realizare, cunoscută ca analiza unei celule, sensibilitatea sau rezistența la medicament se cercetează prin măsurarea expresiei genei indicator, de exemplu, activitatea luciferază, în celule gazdă organizate transfectate în prezența sau absența medicamentului antiviral. O reducere în activitatea luciferazei observată pentru celule transfectate în prezența unui agent antiviral dat, sau o combinație de agenți cum s-a comparat la un control desfășurat în absența agentului(lor) antivirali, se referă, în general, la logaritmul concentrației agentului antiviral ca o curbă sigmoidă.
într-o a doua realizare, cunoscută ca analiza a două celule, sensibilitatea sau rezistența la medicament se cercetează prin măsurarea expresiei genei indicator, de exemplu, activitatea luciferazei, în celule gazdă țintă după infecție sau transfecție cu particule HBV sau, respectiv, particule ADN HBV. Particule virale HBV obținute de la celule gazdă organizate sunt folosite pentru infectarea celulelor gazdă sau ADN din acele particule este folosit pentru transfectarea celulelor gazdă țintă. La momentul infecției sau transfecției se adaugă
2800
2805
2810
2815
2820
2825
2830
2835
2840
RO 118887 Β1 concentrația corespunzătoare de medicament antiviral la cultura de celule. La câteva zile după infecție sau transfecție, celulele gazdă țintă sunt lizate și se măsoară expresia genei indicagor. O reducere în expresia genei indicator va fi observată pentru celule transfectate sau infectate în prezența medicamentelor care inhibă replicarea HBV, de exemplu, prin inhibarea activității, fie a transcriptazei inverse (banda - a ADN-ului), fie a ADN polimerazei (banda + a ADN-ului) a proteinei P așa cum s-a comparat la un control desfășurat în absența medicamentului.
în a treia realizare, cunoscută ca analiză indicator structură ADN, sensibilitatea sau rezistența la medicament este cercetată prin măsurarea nivelului replicării ADN HBV care a avut loc în celule gazdă organizate sau în particulele de virus produse de celule gazdă organizate. în celule gazdă transfectate vectorul viral subgenomic HBV este transcris și transcriptul ARN este organizat ca ARN “pregenomic”. în timpul maturării virusului, ARN-ul pregenomic este convertit la forma circulară relaxată a ADN-ului genomic (rc-ADN) care constă copie completă a benzii minus a ADN-ului și parțial a benzii plus a ADN-ului. într-o etapă subsecventă, rc-ADN este convertit la o formă de ADN circular covalent închis (cccADN). Pentru a măsura replicarea ADN HIV, sunt desemnați primeri de amplificare pentru amplificarea unei structuri ADN HBV care se formează prin îmbinarea ARN-ului pregenomic și conversia acestui ADN îmbinat la formele rc-ADN și cccADN.
Formarea structurii de amplificare corectă în particular HBV necesită finalizarea reușită a replicării care are ca urmare formarea rec-ADN-ului și cccADN-ului. Medicamente antivirale care inhibă replicarea ADN HBV (activitățile transcriptazei inverse și ADN polimerazei) vor limita formarea secvenței ADN țintă, care în schimb, pot fi măsurate ca o scădere a produsului ADN amplificat folosind numeroase analize de amplificare cantitativă. întrun exemplu (fig.10B), situl legării primerului invers (Pr) este separat în două componente printr-o secvență intron care este înserat într-o genă indicator ORF în aceiași orientare transcripțională ca secvențele HBV. Situl de legare primer al primerului înapoi (Pf) este localizat în regiunea vectorului viral care este flancat de secvențe DR2 și DRr. în vectorul linear HBV primerii Pf și Pr dirijează sinteza ADN în direcții opuse și sunt orientați exterior unul față de altul. în acest caz, primerul Pr dirijează sinteza ADN în direcție în amonte (spre copia 5' a (ε) și primerul Pf dirijează sinteza ADN în direcție în aval (spre 3' (ε). Acest aranjament de primeri și matriță nu constituie o unitate de amplificare funcțională în vectorul viral genă indicator. în plus, situl de legare Pr nu este intact în vectorul linear neîmbinat și astfel, Pr nu se va decăli la ADN-ul țintă. în contrast, primerii Pf și Pr asumă o orientare interioară, unul față de altul, în formă circulară relaxată a ADN HBV găsită în virioni maturi și îmbinarea ARN-ului pregenomului a asamblat un sit de legare primer Pr intact. Ambii primeri dirijează acum sinteza ADN spre o singură copie a DR1 din copia benzii plus a rc-ADN-ului și, fie în banda plus, fie în banda minus a cccADN-ului. Acest aranjament de primeri constituie o unitate de amplificare funcțională (fig.10C).
într-o realizare alternativă a analizei secvenței ADN indicator (fig.9D) se măsoară activitate exonucleazică 5' a enzimei de amplificare (de exemplu, polimerază Taq) mai degrabă decât producerea de ADN amplificat (C.Heid și colab., 1996, Genom Research 6:986994) activitatea exonucleazei 5' se măsoară prin monitorizarea clivajului nucleolitic a unei sonde oligonucleotidice cu coadă fluorescentă care este capabilă să se lege la matrița ADN amplificată flancată de siturile de legare Pf și Pr. Performanța acestei analize este dependentă de proximitatea apropiată a capătului 3' al primerului din amonte (Pf) față de capătul 5' al sondei oligonucleotidice. Când primerul Pf se extinde el dislocuiește capătul 5' al sondei oligonucleotidice, astfel, încât activitatea exonucleazică 5' a polimerazei clivează sonda oligonucleotidică. Scopul intronului este de a distanța situl de legare Pf suficient de departe
RO 118887 Β1 de capătul 5' al secvenței sondă exonuclează pentru eliminarea, în principal, a digestiei exonucleazice detectabile a sondei oligonucleotidice în matrița țintă neîmbinată. îndepărtarea intronului prin îmbinare servește la poziționarea capătului 3' al sitului de legare Pf imediat în amontele sitului 5' de legare a sondei. Aranjamentul anterior face posibilă detectarea cantitativă a activității exonucleazice a matriței țintă amplificate (fig.1 E).
Selectarea medicamentului
Selectarea medicamentului se realizează folosind un vector viral genă indicator care conține o casetă genă indicator genă nefuncțională cu un intron inversat și vector(i) organizați. în celule gazdă organizate transfectate, vectorul viral genă indicator produce un transcript ARN competent pentru încapsidare (ε+) conținând gena indicator. Vectorul(ii) viral(i) organizat(ți) asigură, în trans, funcțiunile structurale și/sau enzimatice virale care nu sunt asigurate de vectorul test de rezistență, dar care sunt necesare pentru replicarea ARNului viral și formarea particulei. La cotransfecția celulelor gazdă organizate, vectorul viral gena indicator și vectorii organizați dau naștere la particule virale HBV conținând un ARN “pregenom” vector viral genă indicator encapsidat, care ca urmare a îmbinării intronului inversat, conține o genă indicator funcțională.
Selectarea medicamentului se realizează după cum urmează: vectorul viral genă indicator și ADN-ul vectorului organizat se folosește pentru transfectarea celulelor gazdă organizate. Transfecții replicat sunt realizate pe o serie de culturi de celule gazdă organizate menținute, fie în absența, fie în prezența compușilor antivirali potențiali (de exemplu, inhibitori candidat ai transcriptazei inverse sau polimerazei proteinei P HBV). După menținerea celulelor gazdă organizate până la câteva zile în prezența sau absența medicamentelor antivirale candidat, se cercetează, fie direct nivelul inhibării replicării ADN, fie în particule virale HBV izolate obținute prin recoltarea mediilor de cultură a celulei gazdă organizată. Atât detectarea ADN, cât și metodele activității genei indicator, descrise mai sus, se pot folosi pentru evaluarea candidaților potențiali de medicamente anti-HBV.
Exemplul 8. Test de sensibilitate și de rezistență la medicament a hepatitei folosind vectori test de rezistență care cuprind segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională care conține un promotor permutat
Vector viral genă indicator - Construcție
Vectorii virali genă indicator care conțin o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat s-au desemnat folosind vector viral subgenomic HBV care sunt ținta(le) medicamentelor antivirale. Vectorii virali genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-), sunt bazați pe vectorul viral subgenomic pCS-HBV. Vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(NFIG)PP-(PSAS-), conține o casetă genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și toate elementele regulatoare care acționează cis, care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV (adică, DR1,5's DR2, DR1*, 3'pA), dar îi lipsesc secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează trans care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus (fig.1 OB). C, P și X și siturile de acceptare a secvenței de la pacient sunt conținute într-un vector organizat pPKCPX (descris în exemplul 7, vezi fig.8D). Gena S este conținută într-un vector organizat pPK-S (descris în exemplul 7, vezi fig.8E). în această realizare, vectorul viral genă indicator, pCS-HBV (NF-IG)PP-(PSAS-) și vectorul organizat pPK-CPX constituie un sistem vector test de rezistență. Vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-), conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și 5'ε (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator nefuncțională asamblată în așa fel, încât regiunea promotorului este poziționată 3', adică după gena indicator ORF, (4) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere
2895
2900
2905
2910
2915
2920
2925
2930
2935
RO 118887 Β1 al translației pre-C ORF este eliminat). Caseta de expresie genă indicator nefuncțională cuprinde câteva sau toate dintre următoarele elemente aranjate în orientarea 5' la 3': (1) un sit de intrare a ribozomului intern (IRES), (2) o genă indicator, care poate să conțină un intron inversat, și (3) o secvență semnal de poliadenilare transcripțională (de exemplu, gena timidin kinază HSV-1, SV40), (4) o regiune intensificator-promotor. în vectorul viral genă indicator nefuncțională, caseta de expresie a genei indicator are o orientare transcripțională opusă la, sau aceiași ca elementele secvenței HBV. în cazurile unde ORF genă indicator conține un intron, intronul are aceiași orientare transcripțională ca elementele secvenței HBV.
într-o a doua realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională conține o casetă genă indicator nefuncțională conținând o regiune promotor permutat, toate elementele regulatoare care acționează cis care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV, și unele sau toate secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează trans care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+) (Fig. 10D). Vectori test de rezistență derivați de la vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+), conțin situri de acceptare a secvenței de la pacient și sunt folosite în legătură cu vectorul organizat pPKCSK (fig.8H). în această realizare, vectorul viral genă indicator poate asigura, de asemenea, câteva sau toate dintre funcțiunile de organizare. Mai mult, în această realizare activitățile structurale și enzimatice care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, sunt asigurate folosind vectori organizați suplimentari. în această realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+), conține următoarele elemetne într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV și DR1 și 5'ε (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) o regiune intensificatorpromotor (promotor permutat), (4) gena P conținând segmentul derivat de la pacient, (5) ORF genă indicator, (6) un sit de intrare ribozom intern (IRES), și (7) regiunea 3' a genomului HBV care conține DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere al translației pre-C este elimiant). în vectorul viral genă indicator nefuncțională, caseta de expresie genă indicator are o orientare trascripțională, fie în direcție inversă, fie înainte, față de elementele secvenței HBV. în cazurile unde gena indicator conține un intron inversat, intronul are o aceiași orientare transcripțională ca elementele secvenței BV.
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat au fost desemnați folosind vector viral subgenomic HBV care cuprinde genele țintă antiviral cum s-a descris în exemplul 8. Vectorul viral genă indicator sau vectorul organizat se modifică pentru a include situri de acceptare a secvenței pacientului (PSAS) pentru inserarea genei P care conține segmente derivate de la pacient (PDS) (descrise în exemplul 7, vezi fig.8D și 8F). Expresia genei S derivată de la pacient este eliminată cum s-a descris în exemplul 7 (vezi, fig.8D). Expresia uniformă a genei S este asigurată, în trans, folosind un vector organizat separat care asigură produsele bine caracterizate ale genei S (fig.8E).
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate cu un vector test de rezistență bazat pe vectori virali genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS+), sau cu un sistem vector test de rezistență care cuprinde un vector viral genă indicator, pCSHBV(NF-IG)PP-(PSAS-) și un vector organizat, pPK-CPX, folosind, fie un tip de celulă gazdă, fie două tipuri de celulă gazdă. La contrasfectarea celulelor gazdă organizate, fie un vector test de rezistență și un vector organizat, fie cu un vector viral genă indicator și vectori organizați (adică, sistem vector test de rezistență) particulele virale HBV sunt produse conținând o genă indicator encapsidată și ARN “pregenom” care conține gena indicator nefuncțională. în celulele gazdă transfectate, gena indicator nefuncțională cu promotorul permutat este convertită la o genă indicator funcțională în timpul procesului de replicare al ADN-ului HBV (fig.10B și 10C).
RO 118887 Β1
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate cum s-a descris în exemplul 7 (mai sus). Rezistența sau sensibilitatea activităților transcriptazei inverse și/sau ADN polimerazei derivate de la pacient la diverse medicamente antivirale se pot măsura prin măsurarea nivelurilor expresiei genei indicator în celule gazdă transfectate sau infectate. Alternativ, rezistența sau susceptibilitatea pot fi măsurate prin cuantificarea cantității replicării ADN-ului HBV care a avut loc. Ultima se poate realiza folosind teste de amplificare cantitativă a ADN. într-un exemplu de acest tip de analiză (fig.9F și 9G) situl de legare primer al primerului invers (Pr) este localizat în regiunea avalului 5'ε. Situl de legare primer al primerului înainte (Pf) este localizat în regiunea flancată de secvențele DR2 și DR1*. în vectorul HBV linear primerii Pf și Pr dirijează sinteza ADN în direcții opuse. în acest caz, primerul Pr dirijează sinteza ADN în direcție în față (spre 5'ε) și primerul Pf dirijează sinteza ADN în direcție în spate (spre 3'ε). Această configurație a primerului nu constituie o unitate de amplificare funcțională în copia lineară a vectorului viral care se folosește pentru transfecție. în contrast, primerii Pf și Pr asumă o orientare unul spre altul în forma rc-ADN care se găsește în virionii maturi. Acum, ambii primeri dirijează sinteza ADN spre singura copie a DR1 în copia benzii plus a rc-ADN. Acest aranjament al primerilor și matriței constituie o unitate de amplificare funcțională.
Selectarea medicamentului
Selectarea medicamentului folosind un vector viral genă indicator care conține o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat se realizează în esență cum s-a descris în exemplul 7 de mai sus.
Exemplul 9. Test de sensibilitate și rezistență la medicament a hepatitei folosind vectori test de rezistență care cuprind segmente derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională conținând un promotor permutat și situri de inițiere a translației
Vector viral genă indicator
Vectori viral genă indicator conținând o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și sit de inițiere a translației, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS s-au desemnat folosind vector viral subgenomic HBV, care cuprinde gene virale care sunt ținta(le) medicamentelor antivirale. Vectorii virali genă indicator pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-), sunt bazați pe vectorul viral subgenomic pCS-HBV. Vectorul viral genă indicator conține o casetă genă indicator nefuncțională cu promotor permutat și regiuni de inițiere a translației, și toate elementele regulatoare care acționează cis ce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV (adică, DR1, 5'ε, DR2, DR1*, 3' pA), dar îi lipsesc secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice, care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus (fig.11B). Genele C, P, și X și siturile de acceptare ale secvenței pacientului sunt conținute într-un vector organizat pPK-CPX (exemplul 7, fig.8D). Gena S este conținută în vectorul organizat pPK-S, (exemplul 7, fig.8E). în această realizare vectorul viral genă indicator pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-) și vectorul organizat pPK-CPX constituie un sistem vector test de rezistență. Vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-1), conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5'ε (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) un ORF genă indicator căruia îi lipsește un sit de inițiere al translației, (4) o regiune intensificator-promotor (promotor permutat), (5) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, un codon de inițiere al translației pre-C ORF, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA. Caseta genă indicator nefuncțională cuprinde câteva sau toate dintre elementele următoare aranjate într-o orientare 5' la 3': (1) un ORF genă indicator care nu conține în cadru un sit de inițiere a translației, (2) o secvență semnal de poliadenilare transcripțională (de exemplu, gena timidin kinază HSV-1, SV40), (3) o regiune intensificator-promotor. în vectorul viral genă indicator
2995
3000
3005
3010
3015
3020
3025
3030
3035
3040
RO 118887 Β1 nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS-), orientarea transcripțională a casetei de expresie a genei indicator este aceeași ca a elementelor secvenței HBV. în cazurile unde ORF genă indicator conține un intron, intronul are o orientare transcripțională aceiași ca a elementelor secvenței HBV. într-o a doua realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională conține o casetă genă indicator genă nefuncțională conținând un promotor permutat și regiuni de inițiere a translației, toate elementele regulatoare care acționează cis ce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV, și unele sau toate secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice acționând trans, ce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, pCS-HBV(NFIG)PPTIS(PSAS+) (fig.11D). Activitățile structurale și enzimatice care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus sunt asigurate folosind vectori organizați suplimentari pPK-CSX (descriși în exemplul 7, vezi fig.8E). C, S și X sunt conținute în vectorul organizat pPK.CSX (descris în exemplul 7, vezi fig.8H). în această realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+), conține elementele următoare într-o orientare 5' la 3' (fig. 11D): (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5‘ε (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat), (3) un ORF genă indicator căruia îi lipsește un sit de inițiere al translației, (4) gena P conținând segmentul derivat de la pacient, (5) o regiune intensificator-promotor (promotor permutat), (6) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, codonul de inițiere a translației pre-C ORF, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA. în vectorul viral genă indicator nefuncțională, caseta de expresie a genei indicator are o orientare transcripțională aceiași ca a elementelor secvenței HBV. în cazurile unde gena indicator conține un intron inversat, intronul are o orientare transcripțională aceiași cu cea a elementelor secvenței HBV.
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat au fost desemnați folosind vector viral subgenomic HBV, care cuprinde genele țintă antiviral cum s-a descris în exemplul 7. Vectorul viral genă indicator sau vectorul organizat se modifică pentru a include situri de acceptare a secvenței pacientului (PSAS) pentru înserarea genei P care conține segmente derivate de la pacient (PDS) (descrise în exemplul 7, vezi fig.8D și 8F). Expresia genei S derivată de la pacient este eliminată cum s-a descris în exemplul 7 (vezi, fig.8D). Expresia uniformă a genei S este asigurată, în trans, folosind un vector organizat separat care asigură produsele bine caracterizate ale genei S (fig.8E).
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate prin procedurile descrise în exemplele 7 și 8. Gena indicator nefuncțională este convertită la o genă indicator funcțională în timpul replicării HBV (fig.11B și 11C).
Selectarea medicamentului
Selectarea medicamentului folosind un vector viral genă indicator care conține o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și regiuni de inițiere a translației se realizează în esență cum s-a descris în exemplul 7 și 8 (de mai sus).
Exemplul 10. Test de sensibilitate și de rezistență la medicament a hepatitei folosind vectori test de rezistență care cuprind segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator nefuncțională cu regiuni de codificare permutate
Vector viral genă indicator
Vectorii virali genă indicator care conțin o genă indicator nefuncțională cu regiune de codificare permutată s-au desemnat folosind vectori virali subgenomici HBV care sunt ținta(le) medicamentelor antivirale. Vectorii virali genă indicator, pCS-HBV(NF-IG)PCR (PSAS-), sunt bazați pe vectorul viral subgenomic pCS-HBV. Vectorul viral genă indicator
RO 118887 Β1
3090 conține o casetă genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată și toate elementele regulatoare care acționează cis care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV (adică, DR1, 5'ε, DR2, DR1* 3'pA) dar lipsesc secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează trans ce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus (fig. 12B). Genele C, P și X și siturile de acceptare a secvenței de la pacient sunt conținute într-un vector organizat pPK-CPX și gena S este asigurată de vectorul organizat pPK-S (descris în exemplul 7, vezi fig. 8D și 8E). în această realizare, vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(NF-IG) PCR (PSAS-) și vectorul organizat pPK-CPX constituie un sistem vector test de rezistență. Vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS-), conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5’ε (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator nefuncțională asamblată în așa fel, încât regiunea promotorului și o porțiune 5' a regiunii de codificare sunt poziționate 3‘, adică, avalul restului porțiunii 3' a regiunii de codificare, (4) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1 *, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat). Caseta de expresie genă indicator nefuncțională cuprinde câteva sau toate dintre următoarele elemente aranjate în orientarea 5' la 3‘: (1) regiunea 3' a unui intron care se termină într-o secvență acceptor îmbinată, (2) regiunea 3' a unui ORF indicator sau marker ORF selectabil, și (3) o secvență semnal de poliadenilare transcripțională (de exemplu, gena timidin kinază HSV-1, SV40), (4) o regiune intensificator-promotor, (5) regiunea 5' a unui ORF genă indicator, (6) regiunea 5' a unui intron care începe într-o secvență donor îmbinat. în vectorul viral genă indicator nefuncțională, caseta de expresie a genei indicator are o orientare transcripțională opusă la, sau aceiași ca elementele secvenței HBV. în cazurile unde ORF genă indicator conține un intron, intronul are aceiași orientare ca elementele secvenței HBV.
într-o a doua realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională conține o casetă genă indicator nefuncțională conținând o regiune de codificare permutată, toate elementele regulatoare care acționează cis care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV, și unele sau toate secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează trans ce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+) (fig. 12D). Vectori test de rezistență derivați de la vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(NF-lG)PCR(PSAS+), conțin situri de acceptare a secvenței de la pacient (PSAS) și sunt folosite în legătură cu vectorul organizat pPK-CSK (descris în exemplul 7, vezi, fig.8H). în această realizare, vectorul viral genă indicator poate asigura, de asemenea, câteva sau toate dintre funcțiunile de organizare. în această realizare, activitățile structurale și enzimatice care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, sunt asigurate folosind vectori organizați suplimentari. în această realizare, vectorul viral genă indicator nefuncțională, conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea genomului HBV imediat în avalul codonului de inițiere al translației pre-C ORF și DR1 și 5’ε, (3) caseta genei indicator conținând o regiune a genomului HBV care poate să conțină unele sau toate genele C, P, S și X, (4) regiunea genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere al translației pre-C este eliminat). în vectorul viral genă indicator nefuncțională, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+) caseta de expresie genă indicator are o orientare transcripțională, fie aceeași, fie opusă față de elementele secvenței HBV. în cazurile unde gena indicator conține un intron inversat, intronul este orientat în aceeași orientare ca elementele secvenței HBV.
3095
3100
3105
3110
3115
3120
3125
3130
3135
RO 118887 Β1
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator nefuncțională cu o regiune de codificare permutată au fost desemnați folosind vector viral subgenomic HBV, care cuprinde genele țintă antiviral cum s-a descris în exemplul 7. Vectorul viral genă indicator sau vectorul organizat se modifică pentru a include situri de acceptare a secvenței pacientului (PSAS) pentru înserarea genei P care conține segmente derivate de la pacient (PDS) (descrise în exemplul 7, vezi fig.8D și 8F). Expresia genei S derivată de la pacient este eliminată cum s-a descris în exemplul 7 (vezi, fig.8D). Expresia uniformă a genei S este asigurată, în trans, folosind un vector organizat separat care asigură produsele bine caracterizate ale genei S (fig.8E).
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate prin procedurile descrise în exemplele 7 și 8. Gena indicator nefuncțională este convertită la o genă indicator funcțională în timpul replicării HBV (fig.12B și 12C).
Selectarea medicamentului
Selectarea medicamentului folosind un vector viral genă indicator care conține o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și regiuni de inițiere a translației se realizează în esență cum s-a descris în exemplele 7 și 8 de mai sus.
Exemplul 11. Test de sensibilitate și de rezistență la medicament a hepatitei folosind vectori test de rezistență care cuprind segment(e) derivate de la pacient și o genă indicator funcțională
Vector viral genă indicator - Construcție
Vectorii virali genă indicator care conțin o genă indicator funcțională s-au desemnat folosind vectori virali subgenomici HBV cuprinzând gene virale care sunt ținta(le) medicamentelor antivirale. Vectorii virali genă indicator, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), sunt bazați pe vectorul viral subgenomic pCS-HBV. Vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(F-lG)(PSAS-), conține o casetă genă indicator funcțională și toate elementele regulatoare care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV (adică, DR1,5'ε DR2, DR1 *, 3'pA), dar îi lipsesc secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează tranșee sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus (fig.14B). Genele C, P și X și siturile de acceptare a secvenței de la pacient sunt conținute într-un vector organizat pPK-CPX și gena S este conținută într-un vector organizat pPK-S (descris mai jos, vezi fig.8D și 8E). în această realizare, vectorul viral genă indicator, pCSHBV(F-IG)(PSAS-) și vectorul organizat pPK-CPX constituie un sistem vector test de rezistență. Vectorul viral genă indicator funcțională, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), conține următoarele elemente într-o orientare 5' la 3': (1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea 5' a genomului HBV incluzând DR1 și 5'ε (codonul de inițiere a translației pre-C ORF este eliminat), (3) o casetă genă indicator funcțională, (4) regiunea 3' a genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε, și regiunea semnal 3' HBV pA (codonul de inițiere al translației pre-C ORF este eliminat). Caseta de expresie genă indicator cuprinde câteva sau toate dintre următoarele elemente aranjate în orientarea 5' la 3': (1) o regiune intensificator-promotor transcripțională, (2) un intron, (3) un ORF genă indicator sau un ORF genă marker selectabil, (4) o secvență semnal de poliadenilare transcripțională (de exemplu, SV40) sau unidirecțională (gena timidin kinază HSV-1). Caseta de expresie a genei indicator are o orientare transcripțională aceiași ca, sau opusă elementelor secvenței HBV.
într-o a doua realizare, vectorul viral genă indicator conține o casetă genă indicator funcțională, toate elementele regulatoare care acționează cisce sunt necesare pentru replicarea ADN HBV, și unele sau toate secvențele genei HBV (adică, genele C, P, S, X) care asigură funcțiunile structurale și enzimatice care acționează trans, care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+) (fig.13D).
RO 118887 Β1
3190
Vectori test de rezistență derivați de la vectorul viral genă indicator, pCS-HBV(F-IG) (PSAS+), conțin situri de acceptare a secvenței de la pacient (PSAS) și sunt folosite în legătură cu vectorul organizat pPK-CSK. în această realizare, vectorul viral genă indicator asigură, de asemenea, câteva sau toate dintre funcțiunile de organizare. Activitățile structurale și enzimatice care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN HBV și formarea particulei de virus, sunt asigurate folosind vectori organizați suplimentari pPK-CSX (descriși în exemplul 7, vezi (fig.8H). în această realizare, vectorul viral genă indicator funcțională, conține următoarele elemente într-o orientasre 5' la 3':(1) regiunea intensificator-promotor IE CMV, (2) regiunea genomului HBV imediat în spatele codonului de inițiere al translației pre-C ORF și DR1 și 5'ε, (3) o casetă genă indicator funcțională în regiunea genomului HBV care conține câteva sau toate genele C, P, S și X, (4) regiunea genomului HBV conținând DR2, DR1*, 3'ε și regiunea semnal 3' HBV pA. în vectorul viral genă indicator, caseta de expresie genă indicator are o orientare transcripțională, fie opusă la, fie aceiași față de elementele secvenței HBV.
Vector test de rezistență - Construcție
Vectori test de rezistență conținând o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat s-au desemnat folosind vector viral subgenomic HBV care cuprinde genele țintă antiviral cum s-a descris în exemplul 7. Vectorul viral genă indicator sau vectorul organizat se modifică pentru a include situri de acceptare a secvenței pacientului (PSAS) pentru înserarea genei P care conține segmente derivate de la pacient (PDS) (descrise în exemplul 7, vezi fig.8D și 8F). Expresia genei S derivată de la pacient este elimiantă cum s-a descris în exemplul 7 (vezi, fig.8D). Expresia uniformă a genei S este asigurată, în trans, folosind un vector organizat separat care asigură produsele bine caracterizate ale genei S (fig.8E).
Test de sensibilitate și rezistență la medicament
Testele de sensibilitate și rezistență la medicament sunt realizate pe un vector test de rezistență bazat pe un vector viral genă indicator funcțională, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+), sau cu un sistem vector test de rezistență bazat pe un vector viral genă indicator,pCSHBV(F-IG)(PSAS-) și un vector(i) organizat. în celule gazdă organizate transfectate, vectorul viral genă indicator produce un transcript ARN competent pentru encapsidare (ε+) conținând o casetă genă indicator funcțională. Vectorul(i) organizați asigură, în trans, funcțiunile structurale și/sau enzimatice virale care nu sunt asigurate de vectorul viral genă indicator funcțională, dar care sunt necesare pentru replicarea ADN-ului viral și formarea particulei. La cotransfecția celulelor gazdă organizate, vectorul viral genă indicator și vectorii organizați sunt capabili să formeze particule HBV conținând un ARN “pregenom” vector viral genă indicator encapsidat conținând o casetă genă indicator funcțională.
în acest exemplu, vectorul viral genă indicator conține o casetă genă indicator funcțională și, prin urmare, poate să producă activitatea genei indicator în celule transfectate în absența replicării ADN HBV (fig.13). în cazul unei gene indicator funcționale, inhibarea replicării ADN-ului HBV prin medicamente poate fi evaluată prin recoltarea particulelor de virus produse în celula gazdă organizată și folosind particulele (sau particula ADN) pentru infectarea (sau transfectarea) unei celule gazdă țintă. Alternativ, replicarea ADN poate fi măsurată direct în particule de virus izolate din celule gazdă organizate folosind ADN-ul ca un indicator. Un medicament care inhibă replicarea ADN HBV va reduce formarea particulelor de virus care conțin forma rc-ADN “matură” a vectorului viral genă indicator funcțională, în consecință, gena indicator funcțională nu va fi transferată eficient la celulele gazdă țintă în timpul infecției/transfecției și cantitatea vectorului viral genă indicator cccADN și activitatea genei indicator din aceste celule va fi redusă. Detectarea expresiei genei indicator în celule gazdă țintă într-o analiză cu două celule, este realizată cum s-a descris în exemplul 7. Detectarea rc-ADN în particule de virus se realizează folosind ADN ca indicator cum s-a descris în exemplul 8 și s-a ilustrat în fig.9F și 9G.
3195
3200
3205
3210
3215
3220
3225
3230
3235
RO 118887 Β1
Selectarea medicamentului
Selectarea medicamentului folosind un vector viral genă indicator care conține o genă indicator nefuncțională cu un promotor permutat și regiuni de inițiere a translației se realizează în esență cum s-a descris în exemplele 7 și 8 (mai sus).
Oligonucleotide
1) 5'-AGTGAATTAGCCCTTCCACCCGGGTCGAGCTTGGCGTAATCA-3' (42-mer) (SEQ ID NR:1)
2) 5'-CTGTTGGGAAGGGCGATCTCTAGATGCTAGAGATTTTCCACA-3' (42-mer) (SEQ ID NR:2)
3) 5'-CTCCTCCTCCAAGTCTGAGCGGCCGCCTTTAGCATCTGATGCAC-3' (44-mer) (SEQ ID NR:3)
4) 5'-CTCCTCCTCCAAGTCTGAGCGGCCGCCATATGGTGTTTTACTAA-3‘ (44-mer) (SEQ ID NR:4)
5) S'-GGTCTAACCAGAGAGACCCGGTTCACTAAACGAGCT-S' (36-mer) (SEQ ID NR:5)
6) 5'-GAATTCGCGGCCGCAATTCCGCCCCTCTCCCT-3' (32-mer) (SEQ ID NR:6)
7) 5'-GTTAACGCGGCCGCGATATAGTTCCTCCTTTC-3‘ (32-mer) (SEQ ID NR:7)
8) 5'-GAATTCTCGCGACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3' (32-mer) (SEQ ID NR:8)
9) 5'-GTTAACAGATCTCTCGAGTTACAATTTGGACTTTCC-3' (36-mer) (SEQ ID NR:9)
10) 5'-AGACGGGCACACACTACTTAATACGACTCACTATAGGGTGAAGCACTCAAGGCAAG-3' (56-mer) (SEQ ID NR:10)
11) S'-AAGAGTGACCTGAGGGAAGTTAACGGATACAGTTCCTTGTCT-S1 (42-mer) (SEQ ID NR.11)
12) 5'-TCCAGCACTGACTAATTTGTCGACTTGTTCATTTCCTCCAAT-3' (43-mer) (SEQ ID NR:12)
13) 5'-TAACGCCTATTCTGCTATGCCGACACCCAATTCTGAAAATGG-3’ (42-mer) (SEQ ID NR:13)
14) S'-AAGGATACAGTTCCTTGTCGATCGGCTCCTGCTTCTGAGGGG-S' (42-mer) (SEQ ID NR:14)
15) 5'-CTAAAAATAGTACTTTCCGGATCCCAGCACTGACTAATTTAT-3' (42-mer) (SEQ ID NR:15)
16) 5'-TTAGCTCCTTCGGTCCTCCAATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGG-3' (42-mer) (SEQ IDNR:16)
17) 5'-GTCCCAG ATAAGTGCCAAGG ATTCGTTCACTAATCGAATGG A-3' (43-mer) (SEQ ID NR:17)
18) 5'-GAATTCGTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGG-3' (33-mer) (SEQ ID NR:18)
19) 5'-GTTAACGTCGACTTGTTCATTTCCTCCAAT-3' (30-mer) (SEQ ID NR.19)
20) 5'-GAATTCCGATCGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTGG-3' (52-mer) (SEQ ID NR:20)
21) 5'-GTTAACGGATCCCAGCACTGACTAATTTATCTACTTGTTCATTTCTCCAAT-3' (52-mer) (SEQ ID NR:21)
22) 5'-GAATTCGTTAACTTCCCTCA(G/A)ATC(A/C)CTCTTTGG-3' (depozit 33 mer) (SEQ ID NR:22)
RO 118887 Β1
3290
23) 5'-GTTAACGTCGACTT(G/T)(T/C(TCATTTCCTCC(A/T)AT-3' (depozit 30-mer) (SEQ ID NR:23)
24) 5'-GAATTCCGATCGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCA(G/A)ATC(A/C) CTCTTTGG-3· (depozit 55-mer) (SEQ ID NR:24)
25) S'-GTTAACGGATCCCAGCACTGACTAATTTATCTACTTiG/T) (T/C)TCATTTCCTCC(A/T)AT-3' (depozit 52-mer) (SEQ ID NR:25)
26) 5'-ATCTCTTACCTGTCCTATCTAACAGGCCAGGATTAA-3' (36-mer) (SEQ ID NR:26)
27) S'-GAATTCTCGCGACCACCATGGCGCGTTCAACGCTC-S' (35-mer) (SEQ ID NR:27)
28) S'-GTTAACAGATCTTCATGGCTCGTAACTCTAT-S1 (30-mer) (SEQ ID NR:28)
29) 5'-GAATTCGCGCGCAACGGCCGCAACCCGGGAAAAGCTT AAGCATGCAACCCGGGAAGAATTCAATCGCGAAA-3' (72-mer) (SEQ ID NR:29)
30) 5'-GTTAACGCGCGCTTCTCGAGTTGCGGCCGCTTGCTAGCTT AGATCTTTGGGCCCTTTCGCGATTGAATTCTT-3' (72-mer) (SEQ ID NR:30)
31) S'-GAATTCAAGCTTGGCCATTGCATACGTTGT-S· (30-mer) (SEQ ID NR:31)
32) S'-GTTAACGCATGCATAAGAAGCCAA-S' (24-mer) (SEQ ID NR:32)
33) S'-GAATTCGCATGCTCCCCTGCTCCGACCCGG-S' (30-mer) (SEQ ID NR:33)
34) 5'-GTTAACGAATTCTCCTGCGGGGAGAAGCAG-3· (30-mer) (SEQ ID NR:34)
35) 5'-GAATTCAGATCTGCCATACCACATTTGTAG-3' (30-mer) (SEQ ID NR:35)
36) 5'-GTTAACGCTAGCTCCAGACATGATAAGATA-3' (30-mer) (SEQ ID NR:36)
37) 5'-GAATTCGCTAGCATCCCGCCCTAACTCCG-3' (30-mer) (SEQ ID NR:37)
38) 5,-6ΤΤΑΑ0βΤ0βΑ060ΑΑΑΑ000Τ0β000Τ00-3' (30-mer) (SEQ ID NR:38)
39) 5'-GAATTCTCGCGAACAGTTGGCCCT-3' (24-mer) (SEQ ID NR:39)
40) 5'-GTTAACAGATCTTTACGCGAACGCGAAGTC-3' (30-mer) (SEQ ID NR:40)
41) 5‘-GTTAACGAATTCTTGCAAAAAGCTTTGCAAGATGGATAAAGTTTTTAGAAC TCCAGTAGGACTCC-3' (66-mer) (SEQ ID NR:41)
42) 5'-GAATTCTCGCGATCTAGACGTTCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGA GTCCTACTGGAGTTT-3· (66-mer) (SEQ ID NR:42)
43) 5'-GTTAACGAATTCCCACCATGATTGAACAAGATGGA-5' (35-mer) (SEQ ID NR:43)
44) 5'-GAATTCAGATCTTCAGAAGAACTCGTCAAG-3‘ (30-mer) (SEQ ID NR:44)
45) 5'-CCCCGTGCCAAGAGTGACTACGTAAGTACCGCCTATAGA-3' (39-mer) (SEQ ID NR:45)
3295
3300
3305
3310
3315
3320
3325
3330
3335
RO 118887 Β1
46) 5'-CTCTGCTTCTCCCCGCAGCTGGAGAATTCAATCGCGAAA-3' (39-mer) (SEQ ID NR:46)
47) 5'-GTTAACGAATTCCCACCATGAACACGATTAACATC-5' (35-mer) (SEQ ID NR:47)
LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚIE GENERALĂ:
(i) SOLICITANT: Capon, Daniel J. Și Christos J. Petropoulous (ii) TITLUL INVENȚIEI: Compoziții și metode pentru determinarea sensibilității și rezistenței antivirale la medicament (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 47 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDEȚĂ:
(A) ADRESA: Cooper & Dunham LLP (B) STRADA: 1185 Avenue of the Americas (C) ORAȘ: New York (D) STAT: New York (E) ȚARA: Statele Unite (F) ZIP: 10036 (v) FORMA CITIBILĂ DE COMPUTER:
(A) TIP MEDIU: Floppy disk (B) COMPUTER: PC compatibil IBM (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Versiune #1.30 (vi) DATE ALE CERERII CURENTE:
(A) NUMĂR CERERE:
(B) DATA DEPUNERII:
(C) CLASIFICARE:
(viii) INFORMAȚIE MANDATAR/AGENT:
(A) NUME: White, John P.
(B) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE: 28.678 (C) NUMĂR REFERINȚĂ/DOSAR: 50130-A-PCT/JPW/AKC (xi) INFORMAȚIE TELECOMUNICAȚIE:
(A) TELEFON: 212-278-0400 (B) TELEFAX: 212-391-0526 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 1:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 1:
AGTGAATTAG CCCTTCCACC CGGGTCGAGC TTGGCGTAAT CA
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 2:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 2:
CTGTTGGGAA GGGCGATCTC TAGATGCTAG AGATTTTCCA CA
3385
3390 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 3:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 3:
CTCCTCCTCC AAGTCTGAGC GGCCGCCTTT AGCATCTGAT GCAC
3395
3400 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 4:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 4:
CTCCTCCTCC AAGTCTGAGC GGCCGCCATA TGGTGTTTTA CTAA
3405
3410 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 5:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 36 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 5: GGTCTAACCA GAGAGACCCG GTTCACTAAA CGAGCT
3415
3420 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 6:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 32 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 6: GAATTCGCGG CCGCAATTCC GCCCCTCTCC CT
3425
3430
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 7:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 32 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 7:
GTTAACGCGGC CCGCGATATA GTTCCTCCTT TC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 8:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 32 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 8:
GAATTCTCGC GACCATGGAA GACGCCAAAA AC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 9:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 36 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 9:
GTTAACAGAT CTCTCGAGTT ACAATTTGGA CTTTCC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 10:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 56 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 10:
AGACGGGCAC ACACTACTTA ATACGACTCA CTATAGGGTG AAGCACTCAA GGCAAG (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 11:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 11:
AAGAGTGACC TGAGGAAGT TAACGGATAC AGTTCCTTGT CT
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 12:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă .
(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 12:
TCCAGCACTG ACTAATTTGT CGACTTGTTC ATTTCCTCCA AT
3485
3490 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 13:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 13:
TAACGCCTAT TCTGCTATGC CGACACCCAA TTCTGAAAAT GG
3495
3500 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 14:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 14:
AAGGATACAG TTCCTTGTCG ATCGGCTCCT GCTTCTGAGG GG
3505
3510 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 15:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 15:
CTAAAAATAG TACTTTCCGG ATCCCAGCAC TGACTAATTT AT
3515
3520 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 16:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 16:
TTAGCTCCTT CGGTCCTCCA ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GG
3525
3530
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 17 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 42 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 17:
GTCCCAGATA AGTGCCAAGG ATTCGTTCAC TAATCGAATG GA (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 18:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 18:
GAATTCGTTA ACTTCCCTCA GATCACTCTT TGG (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 19:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 19:
GTTAACGTCG ACTTGTTCAT TTCCTCCAAT (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 20:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 55 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 20:
GAATTCCGAT CGACAAGGAA CTGTATCCTT TAACTTCCCT CAGATCACTC TTTGG (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 21:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 52 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 21:
GTTAACGGAT CCCAGCACTG ACTAATTTAT CTACTTGTTC ATTTCCTCCA AT
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 22:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă
3585 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 22: GAATTCGTTA CATTCCCTCA TATCMCTCTT TGG
3590 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 23:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă
3595 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 23: GTTAACGTCG ACTTZYTCAT TTCCTCCWAT
3600 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 24:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 55 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 24:
GAATTCCGAT CGACAAGGAA CTGTATCCTT TAACTTCCCT CARATCMCTC TTTGG
3605
3610 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 25:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 52 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 25:
GTTAACGGAT CCCAGCACTG ACTAATTTAT CTACTTGTTC ATTTCCTCCA AT
3615
3620 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 26:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 36 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 26: ATCTCTTACC TGTCCTATCT AACAGGCCAG GATTAA
3625
3630
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 27:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 27: GAATTCTCGC GACCACCATG GCGCGTTCAA CGCTC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 28:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 28: GTTAACAGAT CTTCATGGCT CGTACTCTAT (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 29:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 72 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 29: GAATTCGCGC GCAAGCGGCC GCAACCCGGG
AAAAGCTTAA
GCATGCACCACGGGAAGAAT
TCAATCGCGA AA (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 30:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 72 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 30:
GTTAACGCGC GCTTCTCGAG TTGCGGCCGC TTGCTAGCTT AGATCTTTGGCGCCCTTTCGC
GATTGAATTC TT (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 31:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic
RO 118887 Β1 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 31:
GAATTCAAGC TTGGCCATTG CATACGTTGT
3685 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 32:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă
3690 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 32: GTTAACGCAT GCATAAGAAG CCAA
3695 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 33:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 33: GAATTCGCAT GCTCCCCTGC TCCGACCCGG
3700
3705 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 34:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic)
3710 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 34:
GTTAACGAAT TCTCCTGCGG GGAGAAGCAG
3715 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 35:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic)
3720 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 35: GAATTCAGAT CTGCCATACC ACATTTGTAG
3725 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 36:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic
3730
RO 118887 Β1 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI; SEQ ID NR: 36: GTTAACGCTA GCTCCAGACA TGATAAGATA (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 37:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 37: GAATTCGCTA GCATCCCGCC CCTAACTCCG (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 38:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 38:
GTTAACGTCG ACGCAAAAGC CTAGGCCTCC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 39:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 39: GAATTCTCGC GAACAGTTGG CCCT (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 40:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 40: GTTAACAGAT CTTTACGCGA ACGCGAAGTC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 41:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 66 baze perechi (B) TIP: acid nucleic
RO 118887 Β1 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 41:
GTTAACGAAT TCTTGCAAAA AGCTTTGCAA GATGGATAAA GTTTTTAGAA ACTCCAGTAG 60
GACTCC (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 42:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 63 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 42:
GAATTCTCGC GATCTAGACG TTCTACCTTT CTCTTCTTTT TTGGAGGAGT CCTACTGGAG TTT (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 43:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 43:
GTTAACGAAT TCCCACCATG ATTGAACAAG ATGGA (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 44:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 44:
GAATTCAGAT CTTCAGAAGA ACTCGTCAAG (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 45:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 39 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 45:
CCCCGTGCCA AGAGTGACTA CGTAAGTACC GCCTATAGA
3785
3790
3795
3800
3805
3810
3815
3820
3825
RO 118887 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 46:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 39 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 46:
CTCTGCTTCT CCCCGCAGCT GGAGAATTCA ATCGCGAAA (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 47:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 47: GTTAACGAAT TCCCACCATG AACACGATTA ACATC

Claims (69)

1. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței omului la medicamentele antivirale, caracterizată prin aceea că determină sensibilitatea sau eficacitatea biologică și rezistența la medicamentele antivirale prin etapele
a) se introduce un vector test de rezistență care conține un segment derivat care cuprinde o secvență virală funcțională sau nefuncțională de la un pacient și o genă indicator într-o celulă gazdă,
b) se cultivă celule gazdă din etapa a),
c) se măsoară expresia indicatorului într-o celulă gazdă, în care expresia indicatorului este dependentă de segmentul derivat de la pacient,
d) se compară expresia indicatorului din etapa c) cu expresia indicatorului măsurate când etapele a)-c) sunt realizate în absența medicamentului antiviral, în care o concentrație test a medicamentului antiviral este prezentă la etaple a)- c), la etapele b)- c) sau la etapa c), aceste etape se determină la un moment dat și se continuă cu determinarea rezistenței la medicament prin etapa de determinare a sensibilității la medicamentele antivirale la același pacient la un moment ulterior, se compară sensibilitățile determinate în primul și ultimul moment, în care scăderea sensibilității la medicamentul antiviral determinată la momentul ulterior față de primul moment indică dezvoltarea sau progresia rezistenței la medicamentul antiviral la pacient.
2. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței omului la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde un segment derivat de la pacient și gena indicator.
3. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde un segment derivat de la pacient care este o genă.
RO 118887 Β1
4. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde un segment derivat de la pacient și acest segment este două sau mai multe gene.
5. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde un segment derivat de la pacient care conține o genă retrovirală.
6. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței, la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cuprinde un segment derivat de la pacient care conține o genă HIV.
7. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorului test de rezistență cuprinde un segment derivat de la pacient care conține o genă HIV gagpol.
8. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul conține o genă indicator funcțională.
9. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență conține o genă indicator nefuncțională.
10. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență conține o genă indicator luciferază.
11. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde un vector viral genă indicator și un vector organizat, vectorul viral genă indicator cuprinde o genă indicator, iar vectorul organizat cuprinde un segment derivat de la pacient.
12. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă hepadnavirală.
13. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă HBV.
14. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă P HBV.
15. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă RT/ADN.
16. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, indicatorul este o genă indicator.
17. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN al unui vector viral genomic.
18. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN al unui vector viral subgenomic.
3880
3885
3890
3895
3900
3905
3910
3915
3920
3925
RO 118887 Β1
19. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că vectorul test de rezistență cuprinde ADN al unui retrovirus.
20. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN al HIV.
21. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN care codifică vif, vpr, tat, rev, vpu și nef.
22. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul deriat de la pacient cuprinde o secvență virală funcțională.
23. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient codifică o proteină care este ținta unui medicament antiviral.
24. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient codifică două sau mai multe proteine care sunt ținta unui medicament antiviral.
25. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă retrovirală.
26. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, la om, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă HIV.
27. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul deriat de la pacient cuprinde o genă HIV gag-pol.
28. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, gena indicator este o genă indicator funcțională și celula gazdă este o celulă gazdă vector test de rezistență incluzând etapa suplimentară de infectare a celulei gazdă țintă cu particule virale vector test de rezistență folosind supernatante filtrate de la celulele gazdă vector test de rezistență.
29. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, gena indicator este o genă indicator nefuncțională.
30. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este o celulă gazdă organizată /celulă gazdă vector test de rezistență .
31. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, cultura se realizează prin co-cultivare.
32. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este infectată cu particule virale vector test de rezistență folosind supernatante filtrate de la celula gazdă organizată/celule gazdă vector test de rezistență.
RO 118887 Β1
3975
33. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, gena indicator este o genă luciferază.
34. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, gena indicator este o genă lacZ E. coli.
35. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că, celula gazdă organizată/celula gazdă vector este o celulă umană.
36. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, la om, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că, celula gazdă organizată/celula gazdă vector este o celulă renală embrionară umană.
37. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că, celula gazdă organizată/celula gazdă vector este o celulă 293.
38. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este o celulă umană T.
39. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este o celulă umană T a liniei de celule leucemice.
40. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este o celulă a liniei de celule Jurkat.
41. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este o celulă a liniei de celule H9.
42. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este o linie de celule CEM.
43. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este transfectată cu cel puțin o celulă gazdă organizată.
44. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este o celulă gazdă de la mamifer.
45. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este 293.
46. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este o linie de celule de hepatom uman.
47. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este HepG2.
48. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că, celula gazdă este Huh7.
3980
3985
3990
3995
4000
4005
4010
4015
4020
RO 118887 Β1
49. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient codifică o proteină.
50. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient codifică două sau mai multe proteine.
51. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, gena indicator nefuncțională cuprinde un promotor permutant.
52. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, gena indicator nefuncțională cuprinde o regiune de codificare permutată.
53. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, gena indicator nefuncțională cuprinde un intron inversat.
54. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că, celula gazdă și celula țintă sunt aceeași celulă.
55. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 54, caracterizată prin aceea că, celula tintă este o celulă umană.
J
56. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 54, caracterizată prin aceea că, celula țintă este o celulă T umană.
57. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 54, caracterizată prin aceea că, celula gazdă țintă este infectată cu particule virale vector test de rezistență prin folosirea de supernatante de la celula gazdă organizată/celula gazdă vector de rezistență.
58. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 54, caracterizată prin aceea că, cultura se obține prin cocultivare.
59. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, sensibilitatea sau eficacitatea biologică și rezistența omului la medicamentele antivirale se determină prin etapa de elaborare a unei curbe standard a sensibilității la medicament pentru un medicament antiviral, se determină sensibilitatea la medicamentul antiviral la un pacient, conform metodei din revendicarea 1, și se compară sensibilitatea la medicamentul antiviral cu curba standard.
60. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, indicatorul conține o structură ADN.
61. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, indicatorul conține o structură ARN.
62. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN al unui hepadnavirus.
RO 118887 Β1
63. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN al HBV.
64. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, vectorul test de rezistență cuprinde ADN care codifică C,P și X.
65. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă P.
66. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale,conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă HBV.
67. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă RT HBV.
68. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient cuprinde o genă ADN polimerază HBV.
69. Metodă pentru determinarea sensibilității sau eficacității biologice și rezistenței la medicamentele antivirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, segmentul derivat de la pacient conține o genă HBV.
RO98-01216A 1996-01-29 1997-01-29 Metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale RO118887B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59300996A 1996-01-29 1996-01-29
PCT/US1997/001609 WO1997027319A1 (en) 1996-01-29 1997-01-29 Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO118887B1 true RO118887B1 (ro) 2003-12-30

Family

ID=24372979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO98-01216A RO118887B1 (ro) 1996-01-29 1997-01-29 Metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0852626B1 (ro)
JP (1) JP4183749B2 (ro)
KR (1) KR100537153B1 (ro)
CN (1) CN1263867C (ro)
AP (1) AP9801360A0 (ro)
AT (1) ATE447621T1 (ro)
AU (1) AU732255B2 (ro)
CA (1) CA2216126C (ro)
DE (2) DE69739645D1 (ro)
EA (1) EA005426B1 (ro)
ES (1) ES2175355T3 (ro)
HU (1) HUP9900388A3 (ro)
IL (1) IL125464A (ro)
NO (1) NO983421L (ro)
NZ (1) NZ331376A (ro)
PL (1) PL328068A1 (ro)
RO (1) RO118887B1 (ro)
WO (1) WO1997027319A1 (ro)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69321845T2 (de) 1992-08-25 1999-04-29 Monsanto Co Hydroxyethylaminosulfonamide verwendbar als inhibitoren retroviraler proteasen
BR9707204A (pt) 1996-01-26 1999-12-28 Virco Nv Método de administração de quimioterapia de pacientes que são hiv positivos baseados na sensibilidade à droga fenotìpica de cepas de hiv humanas
US6242187B1 (en) 1996-01-29 2001-06-05 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
AU8897698A (en) * 1997-07-30 1999-02-22 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
AU3474499A (en) * 1998-04-07 1999-10-25 Southern Research Institute High-throughput method for screening for antiviral activity
BR9911600A (pt) * 1998-05-26 2001-02-13 Virologic Inc Recursos e métodos para monitoração de terapia antiretroviral inibidora de transcriptase reversa de não nucleosìdeo
US7037644B1 (en) 1998-05-26 2006-05-02 Virologic, Inc. Means and methods for monitoring non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS
EP1100959B1 (en) * 1998-06-19 2005-03-09 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
US6787126B1 (en) 1998-06-19 2004-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
US20030148307A1 (en) 1998-06-19 2003-08-07 Department Of Health & Human Services, C/O Centers Of Disease Control And Prevention Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
JP2003503004A (ja) * 1998-06-24 2003-01-28 バイロロジック・インコーポレイテッド ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤抗レトロウイルス療法をモニターし、ｈｉｖ／ａｉｄｓの治療における治療決定をガイドする手段および方法
EP1185712B8 (en) 1999-05-28 2005-10-19 Virco Bvba New mutational profiles in hiv-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance
CA2422489A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Virologic, Inc. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor as antiretroviral therapy
US7292944B2 (en) 2000-10-20 2007-11-06 Virco Bvba Establishment of biological cut-off values for predicting resistance to therapy
RU2318213C2 (ru) 2000-10-20 2008-02-27 Вирко Бвба Новые мутационные профили обратной транскриптазы вич-1, коррелирующие с фенотипической резистентностью к лекарственным средствам
US7247439B1 (en) 2001-06-04 2007-07-24 Monogram Biosciences, Inc. Method of evaluating a patient antibody response to envelope proteins of a virus
US7097970B2 (en) 2001-06-04 2006-08-29 Monogram Biosciences, Inc. Methods of evaluating viral entry inhibitors using patient derived envelope protein constructs
EP1446498B1 (en) 2001-11-08 2008-03-12 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Protease assay for therapeutic drug monitoring
AU2003254500B2 (en) 2002-07-01 2009-11-19 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Mutational profiles in HIV-1 protease correlated with phenotypic drug resistance
US7473524B2 (en) 2002-07-01 2009-01-06 Hilde Azijn Mutational profiles in HIV-1 protease correlated with phenotypic drug resistance
DE20218008U1 (de) 2002-11-21 2003-03-06 FESTO AG & Co., 73734 Esslingen Anordnung von mehreren Handhabungsvorrichtungen
US8603736B2 (en) 2004-06-07 2013-12-10 Monogram Biosciences, Inc. Compositions and methods for determining resistance to inhibitors of virus entry using recombinant virus assays
US8178291B2 (en) 2005-02-18 2012-05-15 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining hypersusceptibility of HIV-1 to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2006089046A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining anti-hiv drug susceptibility and replication capacity of hiv
US20090087841A1 (en) 2005-05-27 2009-04-02 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining resistance of hiv-1 to protease inhibitors
WO2006133267A2 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining altered susceptibility of hiv-1 to anti-hiv drugs
WO2006133266A2 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Monogram Biosciences, Inc. Methods for determining resistance or susceptibility to hiv entry inhibitors
WO2007146336A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Monogram Biosciences, Inc. Molecular determinants associated with enhanced ability to enter cells expressing cxcr4
US8338101B2 (en) * 2007-01-23 2012-12-25 Virco Bvba Method for designing a drug regime for HIV-infected patients
WO2008106115A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Monogram Biosciences, Inc. Compositions and methods for determining whether a subject would benefit from co-receptor inhibitor therapy
WO2018030534A1 (ja) * 2016-08-10 2018-02-15 国立研究開発法人理化学研究所 Ｂ型肝炎治療用組成物、及びｂ型肝炎ウイルスの複製活性の評価方法
RU2646472C1 (ru) * 2016-10-07 2018-03-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки эффективности терапии инфекции вызванной вирусом герпеса человека 6 типа у детей
WO2018126042A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 Virongy L.L.C. Retro- and lenti-hbv hybrid vectors and constructs
CN109722465B (zh) * 2019-01-07 2022-02-01 福建省疾病预防控制中心(福建省健康教育促进中心、福建省卫生检验检测中心) 一种hiv耐药检测载体和构建方法
CN113832169A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 厦门大学 靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0291893A1 (en) * 1987-05-19 1988-11-23 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Stable human cell lines expressing an indicator gene product under virus-specific genetic controls
EP0361749B1 (en) * 1988-09-27 1995-02-08 Dana Farber Cancer Institute A vector comprising a replication competent HIV-I provirus and a heterologous gene
HU209835B (en) * 1988-12-07 1994-11-28 Univ Osaka Res Found Method for producing of retrovirus protease, reverse transcriptase and integrase
EP0414475B1 (en) * 1989-08-25 1997-12-10 Chiron Corporation Methods for culturing HCV in B- or T-lymphocyte cell lines
GB8923123D0 (en) * 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
FR2700169B1 (fr) * 1993-01-04 1995-03-24 Transgene Sa Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine.
US5645982A (en) * 1993-08-19 1997-07-08 Systemix, Inc. Method for screening potential therapeutically effective antiviral agents
WO1995022622A1 (en) * 1994-02-18 1995-08-24 University Of Washington Methods and compositions for screening for anti-aids drugs
US5733543A (en) * 1994-04-29 1998-03-31 Nabel; Gary J. Introduction of HIV-protective genes into cells by particle-mediated gene transfer
CA2158977A1 (en) * 1994-05-09 1995-11-10 James G. Respess Retroviral vectors having a reduced recombination rate
US5837464A (en) * 1996-01-29 1998-11-17 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
AU8897698A (en) * 1997-07-30 1999-02-22 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening

Also Published As

Publication number Publication date
CN1213407A (zh) 1999-04-07
NO983421D0 (no) 1998-07-24
ES2175355T3 (es) 2002-11-16
AU1952897A (en) 1997-08-20
EP1170380A2 (en) 2002-01-09
JP2000503849A (ja) 2000-04-04
HUP9900388A2 (hu) 1999-05-28
IL125464A0 (en) 1999-03-12
EP0852626A4 (en) 1999-08-25
EA005426B1 (ru) 2005-02-24
AU732255B2 (en) 2001-04-12
CA2216126A1 (en) 1997-07-31
HUP9900388A3 (en) 2005-03-29
NZ331376A (en) 2000-03-27
CA2216126C (en) 2009-03-31
AP9801360A0 (en) 1998-12-31
DE69711584D1 (de) 2002-05-08
PL328068A1 (en) 1999-01-04
EP0852626B1 (en) 2002-04-03
DE69711584T2 (de) 2002-11-07
ATE447621T1 (de) 2009-11-15
CN1263867C (zh) 2006-07-12
EP1170380B1 (en) 2009-11-04
DE69739645D1 (de) 2009-12-17
EP1170380A3 (en) 2003-05-02
EP0852626A1 (en) 1998-07-15
KR19990082129A (ko) 1999-11-15
KR100537153B1 (ko) 2006-12-15
JP4183749B2 (ja) 2008-11-19
IL125464A (en) 2007-12-03
WO1997027319A1 (en) 1997-07-31
EA199800669A1 (ru) 1999-02-25
NO983421L (no) 1998-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO118887B1 (ro) Metodă pentru determinarea sensibilităţii sau eficacităţii biologice şi rezistenţei omului la medicamentele antivirale
US5837464A (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
US6942969B2 (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
Geraghty et al. Cell type‐dependence for Vpu function
Zhuang et al. Hypoxic microenvironment shapes HIV-1 replication and latency
Corbeil et al. HIV-induced apoptosis requires the CD4 receptor cytoplasmic tail and is accelerated by interaction of CD4 with p56lck.
DeHart et al. The ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related protein is dispensable for retroviral integration
US6653081B2 (en) Methods for monitoring antiretroviral therapy and guiding therapeutic decision in the treatment of HIV/AIDS
TW200303922A (en) Compositions and methods for evaluating viral receptor/co-receptor usage and inhibitors of virus entry using recombinant virus assays
Lentz et al. Development of cell cultures that express hepatitis B virus to high levels and accumulate cccDNA
AU776535B2 (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
MXPA98006104A (en) Compositions and methods to determine the susceptibility and resistance to antiviral drug and the antivi drug examination
EP1292712A1 (en) Means and methods for monitoring antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of hiv/aids
Wang et al. The CARD8 inflammasome drives CD4+ T-cell depletion in HIV-1 infection
Wang et al. Residual proviral reservoirs: a high risk for HIV persistence and driving forces for viral rebound after analytical treatment interruption. Viruses 2021; 13 (2): 335
Copeland et al. Cytochemical analysis of human T cell leukaemia virus 1 LTR-regulated β-galactosidase gene expression using a novel integrated cell system
White ACCURATE CHARACTERIZATION AND MEASUREMENT OF HIV-1 DECAY AND THE STABLE LATENT RESERVOIR
Chaudhuri et al. CPSF6 Promotes HIV-1 Preintegration Complex Function
Maikoo et al. Development of a latency model based on HIV-1 subtype C to study how long terminal repeat genetic variation impacts viral persistence and latency reversal
Sperber et al. 10–13 December 2019, Miami, Florida, USA
Geretti et al. Pathogenesis of HIV infection
Corbeil HIV-induced Apoptosis Requires the CD4 Receptor Cytoplasmic Tail and Is Accelerated by Interaction of CD4 with p56 t'k By Jacques Corbeil,* Michel Tremblay, llg and Douglas D. Richman