RO116404B1

RO116404B1 - Anticorp recombinant, acid nucleic care il codifica, procedeu de obtinere a anticorpului recombinant si metoda de tratament cu acesta

Info

Publication number: RO116404B1
Application number: RO94-00095A
Authority: RO
Inventors: A Roland Newman; Nabil Hanna; W Ronald Raab
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corp San
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 2001-01-30
Also published as: EP1266965B1; PT100735A; BR9206313A; NO940219L; JPH06509708A; CZ289472B6; MY121185A; ES2265005T3; SK285046B6; AP307A; BG98411A; DE69233011D1; WO1993002108A1; HU9400201D0; EP1715045A3; HU211881A9; PT100735B; EP1715045A2; ES2196002T3; FI940336A0

Abstract

Prezenta inventie se refera la un anticorp recombinant, pentru terapie umana, cuprinzand o regiune variabila si o regiune constanta de imunoglobulina, care are specificitate pentru un antigen particular, cunoscut, care contine: o regiune constanta, selectata dintr-un grup constand din regiunea constanta de anticorp uman, de cimpanzeu sau de la o prima maimuta straveche, o regiune cadru omoloaga unei regiuni cadru corespunzatoare, de la om, cimpanzeu sau de la o a doua maimuta straveche, o regiune de legare a antigenului, omoloaga unei regiuni de legare a antigenului de la o a treia maimuta straveche la acidul nucleic care codifica un anticorp recombinant, la un procedeu de obtinere a anticorpului recombinant si la o metoda pentru tratarea unui om, care are un antigen tumoral, cu respectivul anticorp recombinant, care cuprinde administrarea orala, parenterala, prin inhalare sau pe cale topica a unei cantitati eficiente terapeutic, cuprinse intre 0,05 si 100 mg/kg corp/24 h dintr-un anticorp recombinant specific, pentru numitul antigen.

Description

Invenția se referă la un anticorp recombinant, la acidul nucleic care Ή codifică, la un procedeu de obținere a anticorpului recombinant și la o metodă pentru tratarea unui antigen tumoral, cu respectivul anticorp recombinant, util în terapia umană.

Este cunoscut că anticorpii monoclonali murinici se utilizează la diagnosticarea maladiilor umane și la rezolvarea problemelor de bază din cercetarea biologică. Acești reactivi sunt, de asemenea, utilizați în încercările clinice, ca agenți terapeutici atât pentru bolile umane cronice, cât și pentru cele acute, incluzând printre acestea leucemiile, limfoamele, tumorile solide (de exemplu, de colon, sân, hepatice), SIDA și bolile autoimune.

Este, de asemenea, cunoscut din brevetele US 4816567, 4978745, 4975369 și 4816397 că presupușii anticorpi șoarece/umani au fost creați și au prezentat caracteristici de legătură ale anticorpului părinte-șoarece, și funcții de execuție asociate regiunii constante, umane. în general, acești anticorpi himerici se construiesc prin prepararea băncii de gene genomice din DNA, extrase din hibridoamele murine preexistente, Nishimura și colaboratorii, 47 Cancer Research 999,198, 1987. Banca este apoi studiată și triată pentru genele din diferite regiuni atât din lanțurile grele, cât și din cele ușoare, prezentând modelele de rearanjare ale fragmentului corect de anticorp. Genele din regiunea variabilă sunt donate, apoi sunt legate în vectorul expresie, conținând casete donate de genă din regiunea constantă umană de lanț corespunzător greu sau ușor. Genele himerice sunt apoi exprimate într-o linie de elecție, de obicei o linie mielom murin [murine myeloma line).

Astfel de anticorpi himerici au fost utilizați în terapia umană. Anticorpii acestor anticorpi himerici, totuși, au fost produși într-un număr de cazuri, de gazde umane. Astfel de anticorpi anti-himerici sunt dăunători pentru terapie, continuată cu anticorpii himerici.

Erlich și colab., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988, Erlich și colab., 7 Hybridoma 385, 1988, Erlich și colab., 6 Hybridoma 151, 1987, și Erlich și colab., 1 Human Antibody Hibridomas 23, 1990, stabilesc că anticorpii monoclonali umani pot să fie o îmbunătățire a anticorpilor monoclonali ai șoarecelui, pentru terapia umană in vivo. Ei postulează, de asemenea, că anticorpii primatelor ne-umane, de exemplu, anticorpii monoclonali ai cimpanzeului, să fie tolerați la oameni, datorită faptului că sunt structural similari anticorpilor umani. Prin urmare, anticorpii umani sunt ne-imunogeni la maimuțe Rhesus (de exemplu, nu induc un răspuns anticorp), ei prevăd că anticorpii primatelor vor fi ne-imunogeni la oameni. Ei precizează că testarea anticorpilor la oameni nu este necesară, dacă anticorpul primatului are o regiune de structură identică cu cea a unei imunoglobuline umane sau, cel puțin, o structură nu prea diferită față de imunoglobulina umană, decât dacă anticorpii umani diferiți diferă de la unul de altul. Astfel, ei sugerează că anticorpii de la cimpanzeu pot fi utili în terapia umană.

Problema pe care o rezolvă invenția este a unui anticorp recombinant pentru terapie umană, acidul nucleic care îl codifică, procedeu de obținere a anticorpului recombinant și o metodă pentru tratarea unui om care are un antigen tumoral cu anticorpul recombinant.

Anticorpul recombinant conform invenției conține:

- o regiune constantă, selectată dintr-un grup constând din regiunea constantă de anticorp uman, de cimpanzeu sau de la o primă maimuță străveche;

- o regiune cadru omoloagă unei regiuni cadru corespunzătoare de la om cimpanzeu sau de la o a doua maimuță străveche;

RO 116404 Bl

- o regiune de legare a antigenului, omoloagă unei regiuni de legare a antigenului de la o a treia maimuță străveche.

Acidul nucleic care codifică anticorpul recombinant, conform invenției, are secvența de nucleotide pentru regiunea variabilă a lanțului greu și regiunea variabilă a 5 o lanțului ușor, prezentate în fig. 13 și respectiv fig. 14.

Procedeul de obținere a anticorpului recombinant conform invenției cuprinde etapele:

- creșterea anticorpului de maimuță străveche față de un antigen uman, într-un organism de maimuță străveche; 55

- imortalizarea unei celule capabile să producă anticorpul de la maimuța străveche;

- izolarea regiunii variabile a genei anticorpului din maimuța străveche prin:

- contactarea RNA-ului din maimuța străveche, cu revers transcriptaza, pentru a forma cDNA;

- contactarea cDNA-ului cu un primer complementar cu cDNA, zona de 60 codificare a secvenței 5' lider a genei anticorpului pentru a forma un complex hibrid;

- amplificarea acidului nucleic în complexul hibrid;

- izolarea acidului nucleic, care codifică porțiunea de legare a antigenului din regiunea variabilă a anticorpului de maimuță străveche;

- asigurarea acidului nucleic uman, care codifică regiunea constantă a anticorpului 65 uman;

- legarea acidului nucleic, provenit de la maimuța străveche și acidului nucleic uman pentru a forma acidul nucleic recombinant;

- exprimarea acidului nucleic recombinant, pentru a produce anticorpul recombinant. 70

Metoda pentru tratarea unui om care are un antigen tumoral, cu respectivul anticorp recombinant conform invenției, cuprinde administrarea orală, parenterală, prin inhalare sau pe cale topică a unei cantități eficiente terapeutic, cuprinse între 0,05 și 100 mg/kg corp/24h dintr-un anticorp recombinant definit în revendicarea 1, specific pentru numitul antigen. 75

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- imunitate și răspuns inductiv anti-anticorp uman (HAA) după administrări repetate necesare tratării stărilor cronice;

- perioadă de înjumătățire relativ scurtă, în comparație cu anticorpii umani;

- lipsa funcțiilor efectoare cu celule umane sau complementare. 8o în cazul bolilor cronice umane, incluzând bolile auto-imune, sau bolilor unde administrarea prelungită a anticorpului este necesară, unul din obstacolele majore în terapia anticorp repetitivă este răspunsul gazdei la terapia cu anticorp. Răspunsurile antianticorp uman (HAA) sunt adesea imprevizibile de la un pacient la altul. Astfel de răspunsuri sunt predominant, dar nu exclusiv, direcționate împotriva regiunii constante 85 a moleculei anticorpului, și odată ce apar, adesea, împiedică sau reduc eficiența oricărei alte terapii cu acel anticorp, sau cu alt anticorp al aceluiași izotip.

Prezenta metodă conține metode de amplificare și donare a porțiunilor antigenligande de maimuță străveche (înțelegând aici prin “maimuță, de exemplu babuin sau macac-maimuță siameză din genul Macacus) de gene din regiuni variabile de codificare 90 de imunoglobulină, fuzionarea acestor gene la regiuni de codificare a genelor donate uman, la cimpanzeu sau alte maimuțe (sau la alte modele de codificare a genelor de

RO 116404 Bl maimuță, dacă se cere), și exprimarea lor ca anticorpi umani recombinanți (maimuță, sau complet anticorpi recombinant maimuță). Mai mult, în continuare, invenția conține utilizarea unor astfel de anticorpi recombinanți; termen care include anticorpii produși prin fuziunea unui DNA din gene de doi anticorpi diferiți, chiar de la aceleași specii, de exemplu, două gene anticorp diferite de maimuță, de exemplu Rhesus și cynomolgus, pentru a da anticorpul recombinant maimuță-maimuță, ca agenți imunoterapeutici pentru tratamentul maladiilor umane. Invenția se bazează pe descoperirea că maimuțele depărtate,din punct de vedere evolutiv (de exemplu, incluzând cynomolgus, și maimuțele Rhessus), în afara cimpanzeului, nu sunt suficient de diferite de om, ca să permită anticorpilor anti-antigenelor umane să fie crescuți în aceste maimuțe, chiar în antigenele umane relativ conservate, de exemplu CD4 și CD54, dar sunt suficient de asemănătoare oamenilor ca să aibă anticorpi similari anticorpilor umani, astfel încât să nu existe răspuns imun gazdă anti-anticorp când astfel de anticorpi de maimuță, sau anticorpi recombinanți derivați din ei, sunt introduși la om.

Potențial, problemele anti-anticorp uman (HAA) pot fi ocolite prin utilizarea anticorpilor monoclonali umani. Această cale, totuși, suferă de limitări etice, clinice, și imunologice asupra imunizării subiecților umani cu multe antigene la alegere (de exemplu, antigene umane, care include porțiuni antigenice sau imunogenice de orice proteine, polipeptide sau echivalentele acestora prezente la om) pentru generarea anticorpului. Calea autorilor de a ocoli această problemă include generarea de anticorpi de specificitate corespunzătoare și funcție efectoare dorită, și utilizarea lor în producerea anticorpilor recombinanți. Acești anticorpi recombinanți în general includ o porțiune corespunzătoare de regiune variabilă de anticorp derivat de la o maimuță imunizată, și o regiune constantă de anticorp de la un om sau de la un cimpanzeu. în acest mod se reține specificitatea și afinitățile ridicate ale anticorpilor monoclonali, iar regiunea constantă corespunzătoare omului sau cimpanzeului prezentă funcțiile efectoare dorite poate fi aleasă cu ușurință.

Prezenta invenție se bazează, în continuare, pe un procedeu de amplificare a genelor imunoglobulinei maimuței, de exemplu, prin reacția în lanț a polimerazei (PCR), din RNA-ul extras din limfocite de maimuță, utilizând oligonucleotide ca primeri specifici pentru diferite regiuni ale lanțului variabil ușor și greu a familiei de gene. Genele amplificate sau porțiunile corespunzătoare, de exemplu, regiunea determinând complementaritatea (CDR) - regiunile de codificare, vezi Winter, GB 2188638A, încorporată aici ca referință, sunt donate în vectorul de expresie conținând o regiune constantă de genă umană sau de cimpanzeu pentru producerea anticorpului recombinant maimuță/om, sau a vectorului conținând o regiune de genă constantă de maimuță pentru producerea întregului anticorp recombinant de maimuță a izotipului dorit. Acești anticorpi reprezintă agenți imunoterapeutici capabili de localizare și/sau omorâre a celulelor țintă corespunzătoare (de exemplu celulele tumorale) după administrarea in vivo.

Astfel, într-un prin aspect al caracteristicilor invenției, se prezintă un procedeu pentru donarea unei porțiuni de antigen care recunoaște o regiune variabilă de genă de anticorp de maimuță. Acest procedeu include asigurarea acidului nucleic, de exemplu, RNA de la maimuță, în formarea cDNA la RNA (utilizând revers transcriptaza), asigurând un primer complementar la secvența de codificare cDNA a secvenței S’ lider a genei anticorpului, contactarea numitului cDNA cu primerul astfel încât să formeze un complex

RO 116404 Bl hibrid și amplificarea cDNA pentru a produce acidul nucleic codificator de regiune variabilă de genă anticorp de maimuță.

Prin “porțiune antigen-recunoscătoare” se înțelege una sau mai multe porțiuni de regiune variabilă de anticorp de maimuță care sunt responsabile pentru legarea și/sau recunoașterea antigenului țintă (sau epitomului sau idiotipului) al anticorpului. De exemplu, se includ regiunile CDR (vezi mai jos) sau întreaga regiune variabilă, sau orice combinație a acestor două regiuni inclusiv orice schimbări în regiunile de codificare ce pot fi induse să facă regiunea mai asemănătoare celei umane față de cea asemănătoare maimuței, fără să se altereze proprietățile specifice de legare ale anticorpului. Dacă se utilizează numai o porțiune din întreaga regiune variabilă atunci porțiunile rămase, de exemplu așa-numita “ramă”, sunt asigurate de la un alt anticorp, preferabil un anticorp uman sau de cimpanzeu (vezi mai jos și în bibliografia menționată mai sus și incorporată aici).

Frazele “regiune variabilă, “Secvență conducătoare”, “regiune constantă” și “ramă” sunt utilizate în cadrul prezentei descrieri a invenției în sensul lor general recunoscut în literatura de specialitate, de exemplu fiind menționate și în exemplele ce însoțesc invenția și în bibliografia menționată mai sus.

în formele preferate, secvența leader este o secvență lider umană, de cimpanzeu sau de maimuță de aproximativ 60 baze, exemple prezentate în fig. 1.

Autorul invenției a descoperit că secvențele leader din regiunea variabilă de maimuță, cimpanzeu și om sunt suficient de asemănătoare cu cele a primerilor construiți pentru ca una să fie corespunzătoare amplificării celeilalte. în metoda conform invenției, RNA este amplificat suficient pentru a produce suficient acid nucleic care să se plaseze într-un vector pentru donarea de mai târziu.

Invenția se referă de asemenea la un procedeu de obținere a unui anticorp de antigen uman, care anticorp este neimunogenic la om. Procedeul cuprinde creșterea într-o maimuță a anticorpului de maimuță față de antigenul uman, și izolarea acidului nucleic codificator al porțiunii antigen-recunoscătoare a regiunii variabile a anticorpului de maimuță. Acidul nucleic uman codificator al regiunii constante umane a anticorpului este asigurat, și legat la regiunea constantă a acidului nucleic al maimuței pentru a forma acidul nucleic recombinant. Acidul nucleic recombinant este apoi exprimat să producă anticorpul dorit. Alternativ, acidul nucleic de codificare a regiunii constante de maimuță sau cimpanzeu poate fi utilizat pentru a forma anticorpul recombinant. Există puține, dacă totuși există, diferențe în secvența aminoacidului din regiunile constante umane sau de cimpanzeu (de exemplu ele sunt omoloage), și acele diferențe prezente între om și maimuță pot fi ușor amendate (schimbate) prin tehnici standard dacă acidul nucleic de codificare a regiunii constante de maimuță se utilizează pentru a forma un anticorp recombinant. Tot ceea ce este deficitar în prezenta invenție este faptul că anticorpul produs este mai puțin imunogen decât regiunea constantă de maimuță astfel încât nu rezultă un răspuns semnificativ imun când anticorpul recombinant este introdus la om. (Asemenea regiuni anticorp sunt denumite pe parcursul descrierii ca regiuni omoloage). Astfel, anticorpul recombinant este prelucrat să fie funcțional la fel ca anticorpul uman în secvența aminoacidului său, de exemplu, are o regiune omoloagă constantă celei umane sau a cimpanzeului. în rezumat, anticorpul este atât de asemănător anticorpului uman încât este necesar să se reducă schimbarea răspunsului

140

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 116404 Bl imun nedorit față de anticorp, în anticorpul recombinant 1 conține o porțiune antigenligand de anticorp de maimuță.

Prin “neimun” se înțelege că anticorpul nu trebuie să dea naștere la un răspuns antigen-anticorp suficient de mare pentru a reduce eficiența administrării continue a anticorpului în majoritate la oameni, un timp suficient atingerii eficienței terapeutice, de exemplu comparativ cu un anticorp presupus murin-uman sau murin. Preferabil, să nu apară și să nu se înregistreze un răspuns al anticorpului.

în una din formele preferate, procedeul cuprinde imortalizarea unei celule de maimuță care este responsabilă pentru producerea anticorpului de maimuță, de exemplu fuziune hibridoma transformarea virală cu Herpes papio, donarea unui singur limfocit B (denumită de asemenea” imortalizarea tranzitivă”), și producerea unei bănci de imunoglobuline recombinant.

în altfel de forme preferate, procedeul include selectarea limfocitului B de la maimuță fie din leucocitele sângelui periferic, splină, măduvă osoasă fie din nod limfatic, selectarea unui clon care produce anticorpul corespunzător; salvarea genelor imunoglobulinei codificatoare de astfel de anticorpi de linia celulei imortalizate, și reexprimarea genelor în producerea liniei celulei (de exemplu o linie de celulă ce produce suficientă cantitate de anticorp care să fie util terapiei umane).

Invenția se referă, de asemenea, la un anticorp recombinant format fie dintr-o regiune constant umană sau de cimpanzeu și o porțiune antigen recunoscătoare (identificatoare) a unei regiuni variabile de maimuță, fie mai întâi o regiune constantă de maimuță și o a doua porțiune diferită de recunoaștere a antigenului de maimuță a unei regiuni variabile.

în aspectul relatat, invenția se referă la un anticorp monoclonal sau un Fab, (Fab)₂, un lanț dimer ușor sau greu, sau orice fragment minim recombinant al acestuia, cum ar fi un Fv sau un SCA (anticorp monolanț) sau alt fragment activ imunologic al acestuia (de exemplu, o regiune CDR-), la un antigen uman format prin imortalizarea limfocitului B de maimuță. Asemenea fragmente sunt utile ca agenți imunosupresivi. Alternativ, anticorpul conform prezentei invenții poate fi atașat de o moleculă efector sau reporter. De exemplu, un anticorp conform prezentei invenții poate avea un macrociclu, pentru chelatizarea unui atom de metal greu, sau a unei toxine, cum ar fi ricin, atașat de el prin structură de legătură covalentă. Suplimentar, fragmentul Fc sau domeniul -CH₃a moleculei anticorpului complet poate fi înlocuit cu o enzimă sau moleculă de toxină, și o parte a lanțului imunoglobulinic poate fi legat cu o polipeptidă efector sau moleculă reporter. Anticorpii bispecifici pot fi construiți, de asemenea, prin procedeu standard.

Prezenta invenție se referă la compozițiile farmaceutice în care anticorpii sunt prezență, anticorpii preparați conform prezentei invenții și furnizați în scop profilactic sau terapeutic. Astfel de anticorpi pot fi, de asemenea, prevăzuți ca imunotoxine, de exemplu, molecule care sunt caracterizate prin două componente și sunt în mod particular utile pentru uciderea celulelor selectate in vitro sau in vivo. 0 componentă este un agent citotoxic care este de obicei fatal celulei când este atașat ei sau absorbit de ea. Un al doilea component, cunoscut “ca vehicul de livrare” asigură mijloacele de eliberare a agentului toxic la un anumit tip de celulă, cum ar fi celulele carcinomatoase. Cei doi componenți sunt de obicei legați chimic prin una din diferitele bine cunoscute proceduri chimice sau genetice. De exemplu, când agentul citotoxic este o proteină și al doilea

RO 116404 Bl component este o imunoglobulină intactă, legarea poate fi făcută prin liganzi de încrucișare heterobifuncționale, de exemplu, carbodiimidă, glutaraldehidă, și altele. Obținerea de diferite imunotoxine este bine cunoscută în tehnologia de specialitate.

într-un alt aspect înrudit, prezenta invenție se referă la acidul nucleic de codificare a anticorpului recombinant uman/maimuță.

în formele preferate, acidul nucleic codifică regiunea constantă umană sau de cimpanzeu și porțiunea recunoscătoare de antigen a regiunii variabile de maimuță, iar acidul nucleic este purificat, și apare separat de componentele biologice cu care el apare în mod natural, sau mai preferabil, este asigurat ca soluție omogenă.

într-un alt aspect, prezenta invenție se referă la anticorpul CDR-grefat format din cel puțin una din regiunile determinante de complementaritate (CDRs), adică, reziduurile de aminoacid (utilizând sistemul de etichetare aminoacid standard al lui Kabat] 31-35 (CDR 1) 50-65 (CDR 2) și 95-102 (CDR 3) a lanțului greu specificat, și resturile de amino acid 24-34 (CDR 1), 50-56 (CDR 2) și 89-97 (CDR 3) a lanțului ușor specificat a regiunii variabile de maimuță străveche, și o ramă a regiunii variabile a imunoglobulinei din a doua specie. Anticorpul CDR grefat este capabil să lege același antigen ca și anticorpul original la maimuțe. Regiunea constantă a anticorpului este derivată din imunoglobulină umană sau de cimpanzeu. Metodologia de preparare este în general descrisă de Jones și colaboratorii, 321 Nature 522, 1986. Astfel grefații CDR pot fi alterați dacă se dorește încât să asigure apariția lor mult mai umani decât alții ca probabilitatea de apariție (instigare) a reacției adverse la anticorp să fie diminuată.

în formele preferate, procedeul curpinde imortalizarea sau selectarea unei celule de la macac, care este responsabilă de producerea anticorpului macacului și dezvoltarea genelor imunoglobulinei din celulă, donarea și secvențierea genelor anticorpului responsabil de producerea anticorpului, selectarea secvenței cadru a regiunii variabile umane (preferabil cu cel mai apropiat omolog de cadrul regiunii variabile a macac-ului); și substituirea secvențelor CDR macac cu secvențele CDR umane și modificări minore în regiunea cadru umană pot fi incluse pentru menținerea afinității anticorpului pentru antigenul său.

Prin “modificări minore se înțelege că mai puțin de 6 aminoacizi din regiunea cadru pot fi substituiți cu alți aminoacizi. De obicei astfel de substituții sau modificări sunt făcute numai când acei aminoacizi sunt implicați în interacțiuni informaționale ce țin regiunea cadru în formă corespunzătoare astfel încât antigenul dorit să fie recunoscut de anticorp. Astfel de modificări se vor reflecta, în generală acei aminoacizi care sunt diferiți în anticorpul maimuței față de anticorpul uman. De exemplu, secvența aminoacid din anticorpul uman chiar înainte de lanțul greu CDR 3, 92-94 este, în general, cisteinăalanină-arginină (arginina este cunoscută ca fiind înlocuită în minoritatea anticorpilor cu serină treonină); în unele cazuri anticorpii din secvența maimuță conțin cisteină-alaninăserină; astfel, în acest exemplu, poate fi preferat să se utilizeze serina la aminoacidul 94 (vezi fig.9D).

Invenția se referă, de asemenea, la o metodă de tratare a oamenilor având un antigen particular, de exemplu unul ce este asociat bolii. Metoda include administrarea unei cantități eficiente din punct de vedere terapeutic de anticorp specific recombinant pentru un antigen particular, în care anticorpul recombinant este unul având fie o regiune constantă provenind de la om sau cimpanzeu și o porțiune de recunoaștere a antigenului

230

235

240

245

250

255

260

265

270

RO 116404 Bl dintr-o regiune variabilă de maimuță, fie o primă regiune constantă de la maimuță și o porțiune antigen recunoscătoare ca a doua regiune variabilă de la o maimuță diferita.

în formele preferate ale aspectelor de mai sus, antigenul este un antigen de tumoare, un antigen curpins în deficiența imună, un antigen cuprins într-un răspuns autoimun, un receptor exprimat într-o celulă gazdă, sau un antigen selectat din antigeni umani CD58, VLA4 (alfa 4 beta 1 integrin], CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD2O receptor celulă-T uman, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFbeta Tn antigen, IL-1, IL-8, C5a, molecule de adeziune, de exemplu VCAM, CD54, CD28, CD11c, CD18 și CD11b, produs oncogen nou, MDR-1 (P-glicoproteină), TGFalfa și receptorul său și PDGF, și anticorpul recombinant este activ fie deplet (omoară sau elimină) celulele nedorite (de exemplu, anti-CD4) prin acționarea cu complement, fie omorâtor de celule, fie este activ ca agent citotoxic sau să producă legarea Fcreceptorului printr-o fagocită. Alternativ, anticorpul blochează sau stimulează funcțiile receptoare, sau neutralizează produșii solubili activi, cum ar fi una sau mai multe interleukine, TNF și C5a.

Invenția se referă, de asemenea, la compozițiile farmaceutice ale anticorpilor de mai sus sau fragmente ale lor. Compozițiile sau produșii pot fi obținuți în mod convenabil în formă de soluții corespunzătoare administrării parenterale sau nazale sau administrării orale. Preparatele corespunzătoare de anticorpi pot fi amestecate cu preparate corespunzătoare de alți agenți, obținându-se o utilitate clinică crescută.

Anticorpii recombinanți pot fi utilizați ca agenți terapeutici activi și pasivi împotriva unui număr de boli umane, inclusiv a limfomului celular B, a infecțiilor inclusiv SIDA, a bolilor autoimune și inflamatorii, și a transplanturilor. Anticorpii pot fi utilizați fie în forma lor nativă, fie ca parte a complexului anticorp/chelat, anticorp/medicament sau anticorp/toxină. Suplimentar, anticorpii în întregime sau fragmente de anticorpi (Fab₂, Fab, Fv) pot fi utilizate ca reactivi de reflecție sau ca vaccinuri potențiale sau imunogeni în imunoterapia activă pentru generarea răspunsurilor anti-idiopatice.

Cantitatea de anticorp util producerii efectului terapeutic poate fi determinată prin tehnicile standard bine cunoscute celor ce lucrează în mod obișnuit în domeniul de specialitate. Anticorpii vor fi în general obținuți prin tehnici standard în cadrul tamponului acceptabil farmaceutic, și pot fi administrați prin oricare din căile obișnuite de administrare. Datorită eficienței anticorpilor revendicați de prezenta invenție cât și datorită toleranței lor de către oameni este posibil să se administreze acești anticorpi în scopul combaterii diferitelor maladii sau stări maladive de natură umană.

Anticorpii recombinanți anti-CD4 (sau fragmente ale acestora) conform prezentei invenții sunt, de asemenea, utili pentru inducerea imunosupresiei, de exemplu, inducerea supresiei de sistem imun al omului sau al animalului. Această invenție deci se referă la o metodă de inducere terapeutică sau profilactică a imunosupresiei la om sau alt animal ce o necesită prin administrarea unei cantități efective, cantități netoxice de astfel de anticorp.

Abilitatea anticorpilor conform prezentei invenții de a induce imunosupresia poate fi demonstrată prin teste standard alcătuite în acest scop, de exemplu, încercarea reacției de limfocite amestecate sau încercarea măsurării inhibiției de proliferare de celulă -T măsurată prin preluarea de timidină.

Faptul că anticorpii conform prezentei invenții au utilitate în inducerea mijloacelor imunosupresive înseamnă că ei sunt utili în tratamentul sau prevenirea rezistenței, sau

RO 116404 Bl respingerea organelor transplantate sau țesuturi transplantate (de exemplu, rinichi, inimă, plămân, măduvă osoasă, piele, cornee, etc.), în tratamentul sau prevenirea bolilor 320 autoimune, inflamatorii, proliferative și hiperproliferative, și manifestărilor cutanate a bolilor tratate cu medicație imunologică (de exemplu, artrita reumatoidă, lupusul eritematos, lupusul eritematos sistemic, tiroidita Hashimotos, scleroza multiplă, miastenia gravis, diabetul de tip 1, uveite, sindrom nefrotic, psoriazis, dermatită atopică, dermatită de contact și alte dermatite eczematoase, dermatita seboreică, Lechen plan, 325 Pemplugus, pemfigus bulos, Epidermoliza buloasă, urticaria, angioedeme, vasculitide, eriteme, eusinofilii cutanoase, Alopecia areata, etc.]; tratamentul bolilor tractului respirator, boli obstructive reversibile, inflamații intestinale și alergii (de exemplu boala Celiacă, proctitis, eosinofilia gastroenterică, mastocitoza, Boala Crohn și colita ulceroasă și alergii de natură alimentară (de exemplu, migrene, rinite și eczeme). 330

O persoană de specialitate, în urma experienței și rutinei, este capabilă să determine care este cantitatea efectivă, cantitatea netoxică de anticorp care ar fi necesară scopului inducerii imunosupresiei. în general, totuși, doza efectivă va fi în domeniul de la aproximativ 0,05...100 mg/kg corp/zi.

Anticorpii sau fragmente de anticorpi conform prezentei invenții ar putea fi utili, 335 de asemenea, în tratarea tumorilor mamiferelor. în mod mai specific trebuie să fie utili pentru reducerea dimensiunii tumorii, inhibarea creșterii tumorii și/sau prelungirea timpului de supraviețuire al animalelor purtătoare de tumoare. în consecință, prezenta invenție, relatează o metodă de tratare tumorilor umane sau ale altor animale prin administrarea unor asemenea anticorpi la oameni sau animale în cantitate eficientă, 340 netoxică.

O persoană de specialitate în domeniul respectiv, prin rutina experienței, poate determina care este cantitatea eficientă, netoxică de anticorp care ar fi necesară tratării tumorilor canceroase. în general, totuși, doza eficientă este așteptată să fie în domeniul de la aproximativ 0,05... 100 mg/kg corp/zi. 345

Anticorpii conform prezentei invenții pot fi administrați la om sau la animale în cantitate suficientă astfel încât să producă un efect care să fie eficient terapeutic sau profilactic în concordanță cu metodele de tratament menționate mai sus. Deci anticorpii conform prezentei invenții pot fi administrați atât omului cât și animalelor în doză convențională sub formă preparată prin combinarea anticorpului definit în prezenta 350 invenție cu un suport farmaceutic acceptat sau un diluant acceptat conform tehnicilor cunoscute. Cei avizați vor recunoaște ușor forma și caracterul suportului acceptat din punct de vedere farmaceutic sau diluantului că este dictată de cantitatea de ingredient activ cu care urmează să se combine, calea de administrare și alte variabile bine cunoscute. 355

Calea de administrarea a anticorpului (sau fragmentelor acestuia] conform prezentei invenții poate fi cea orală, parenterală, prin inhalare sau topică. Termenul “parenteral” așa cum se utilizează pe parcursul prezentei descrieri a invenției include calea intravenoasă, intramusculară, subcutanată, rectală, vaginală sau administrarea intraperitoneală. Formele subcutanate și intramusculare ale administrării parenterale 360 sunt în general cele preferate.

Regimurile de dozaj zilnic parenteral sau oral pentru compușii utilizați conform prezentei invenții pentru inducerea imunosupresiei profilactic sau terapeutic, sau pentru

RO 116404 Bl tratarea terapeutică a tumorilor canceroase vor fi în general de aproximativ O,O5 la 100, dar preferabil de aproximativ 0,5...10 mg/kg corp/24h.

Anticorpul, conform invenției prezente, poate fi administrat, de asemenea, prin inhalare. Prin “inhalare” se înțelege administrarea intranazală sau inhalarea orală. Forme de dozare corespunzătoare pentru asemenea administrare, cum ar fi formularea ca aerosoli sau doză inhalantă măsurată, pot fi preparate prin tehnicile convenționale. Cantitatea de doză preferată de compus conform invenției ce urmează să fie utilizat în general este în domeniul de aproximativ 10... 100 mg.

Anticorpul, conform prezentei invenții, poate fi, de asemenea, administrat topic. Prin administrare topică se înțelege administrarea nesistemică și include aplicarea unui anticorp (sau fragment de anticorp), compus conform prezentei invenții, extern pe epidermă, în cavitatea bucală și instilații de astfel de anticorp în ureche, ochi și nas, și locurile în care în general nu intră semnificativ în circuitul sangvin. Prin administrare sistemică se înțelege administrarea intravenoasă, intraperitoneală și administrarea intramusculară. Cantitatea de anticorp cerută pentru atingerea efectului dorit terapeutic sau profilactic va fi, desigur, variabilă cu anticorpul ales, natura și severitatea condițiilor ce urmează a fi tratate și animalul supus tratamentului, și este în ultimă instanță la aprecierea medicului pentru schimbări. 0 doză corespunzătoare topică de anticorp conform prezentei invenții va fi de obicei în domeniul de aproximativ 1 ...100 mg/kg/zi.

în continuare, se prezintă exemple de realizare a invenției în conformitate cu fi.

1...16 care reprezintă:

- fig.1, este o reprezentare tabelară a 20 de codoni în nouă secvențe de lanț leader greu de diferite Ig (imunoglobuline) și zece secvențe de lanț lider greu de Ig de maimuță;

- fig.2, reprezentare diagramatică a structurii diferitelor lanțuri de Ig prezentând poziția relativă a leaderului, și regiunilor variabile și constante cu pozițiile de locuri de restricție și primeri utilizate pentru amplificare;

- fig.3, reprezentare schematică a lanțului vector casetă greu pentru expresia anticorpilor himerici umani;

- fig.4, reprezentare schematică a lanțului din vectorul ușor desemnat pentru exprimarea anticorpilor umani sau himerici;

- fig.5 și 6, reprezentări schematice ale vectorilor desemnați pentru exprimarea imunoglobulinei din lanțul ușor cDNA kappa sau lambda. în acești vectori, genele imunoglobulinei sunt aranjate într-o configurație tandem utilizând neomicin fosfotransferaza ca marker selectiv;

- fig.7-1, 7-2 și 8, prezintă o secvență de acid nucleic de secvențe primeri leader variabile utile invenției (acești primeri în fig.8 corespund celor înșirați ca Secv. nr.1-12;

- fig.9A la 9H, reprezintă comparări ale regiunilor umane și de maimuță în secvențele VH1, VH2, VH3, VH4 și VH5, și respectiv secvențele VKI și VKII, și V lambda III;

- fig.1O, comparație a secvențelor VH3 umană și de maimuță, cu o comparație față de secvența VH2 umană;

- fig.11, reprezentare grafică a ligandului unui anticorp conform invenției la antigenul uman CD4;

- fig.12, reprezentare grafică a inhibării unui ligand de 1F3 prin anticorpul prezentat în fig. 10;

RO 116404 Bl

410

- fig. 13 și 14, porțiuni de secvențe de nucleotide de anti-CD4 VH, și VL regiuni;

- fig.15, un grafic ce prezintă activitatea anti-CD54; și

-fig. 16, o histogramă comparând caracteristicile plasmidei de expresie.

Anticorpii de maimuța

Maimuțele străvechi (primare] includ maimuțele ca babuinul și macacul (inclusiv maimuța Rhesus și maimuța cynomolgus]. Prezenta invenție asigură detalii ale utilizării invenției revendicate cu diferite gene de maimuță. Aceste exemple nu sunt limitative în invenție și pot fi ușor aplicate și la alte maimuțe străvechi.

Referindu-ne la fig.2, se observă că este prezentată forma schematică de structură generală a genelor codificatoare de lanțuri de imunoglobulină grea, kappa ușoară, și lambda ușoară. Fiecare din aceste lanțuri este format cu codonul de pornire ATG urmat de secvența lider a aproximativ 60 de baze, o regiune de codificare a unei regiuni variabile a imunoglobulinei, și o regiune constantă de acea imunoglobulină. Exemple de diferite secvențe leader, sau peptide semnal, de lanțuri grele sunt prezentate în fig. 1. Aceste secvențe, și echivalentul lor la maimuță pot fi determinate prin tehnicile de determinare standard bine cunoscute celor ce lucrează în domeniul de specialitate, și sunt descrise mai jos.

Secvențele prezentate în porțiunea mai de jos a fig. 1 sunt secvențe leader umane. Autorii au descoperit că, construcția primerilor complementari acestor regiuni leader permite amplificarea genelor Ig de la maimuță. Similar, primerii omologi secvențelor leader de maimuță (de exemplu, porțiunea de deasupra din fig. 1) pot fi utilizați la amplificarea genelor imunoglobulinei de maimuță, și de asemenea pentru amplificarea genelor imunoglobulinei umane.

Prin utilizarea unor astfel de primeri în procedeele de amplificare standard genele codificatoare de diferite gene imunoglobulinice de maimuță, pot fi ușor izolate, și secvențele și pot fi determinate secvențele de codificare a regiunilor variabile ale anticorpilor. Exemple, de asemenea, de proceduri sunt date mai jos. Rezultatele analizei prevăzute mai jos sunt prezentate în fig.9A la 9H, și în fig. 10. Srprinzător, autorul a descoperit că, în ciuda abilității producerii anticorpilor cu antigene umane relativ conservate în maimuță, secvențele cadrului regional variabil al anticorpilor astfel obșinuți au fost nedistinctibile de anticorpii umani. Cu alte cuvinte, cantitatea (gradul) de secvență imunoglobulină variabilă observată la maimuțe a fost similară cu cea observată la oameni, și a fost imposibil să se determine care anticorp a fost derivat de la om sau de la maimuță fără a analiza însăși sursa.

Astfel, de exemplu, referindu-se la fig. 10, secvența aminoacidului regiunii VH3 de la om a fost comparată cu cea de maimuță. Anticorpii umani au prezentat un domeniu de omologie de la 83...98%. în timp ce, cei de la maimuță au fost de la 90 la 93% omologi cu regiunea umană VH3. Contrar, regiunea umană VH2 a fost omoloagă cu cea VH3 umană numai în proporție de 60%. în acest desen, ca și în celelalte desene, prezența aceluiași aminoacid în orice loc este reprezentată printr-o liniuță, în timp ce prezența unui aminoacid diferit este prezentată prin litera standard de codificare. Pozițiile în care aminoacidul nedorit poate fi distribuit sunt prezentate cu X. Similar, omologicitatea pentru VH1, CVH2, VH3, VH4 și VH5 și pentru VKI și VKII și V lambda III, este prezentată în fig.9A-9H. Din nou, omologicitate semnificativă între regiunea imunoglobulinei de maimuță și cea umană a fost observată în fiecare regiune variabilă

415

420

425

430

435

440

445

450

RO 116404 Bl incluzând secvențele regiunilor imunoglobulinei J. Asemenea omologie ridicată este similară celei observate la anticorpii umani.

Metodologia prin care secvențele au fost determinate este prezentată mai jos în cadrul exemplelor. Cei ce lucrează în mod curent în domeniul de specialitate vor recunoaște ușor că aceste exemple nu sunt limitative în această invenție și rezultate echivalente și anticorpi monoclonali sau presupuși pot fi obținuți prin procedee similare bine cunoscute celor ce lucrează în domeniul de specialitate. A se vedea de exemplu brevetele US 4816567; 4978745; 4975369; 4816397. De exemplu, după donare o genă codificatoare a regiunii variabile de la maimuță, o astfel de genă este ușor ligată la una codificatoare de regiune constant umană sau de maimuță, și genele fuzionate exprimate să producă o linie celulară care să producă anticorpul dorit. Mai jos se prezintă exemple de astfel de proceduri.

în exemplele următoare, primul pas din procedeu cuprinde izolarea totală a RNAului din sângele periferic de maimuță sau din celule de splină. Limfocitele B de la maimuțe imunizate pot fi obținute din sângele periferic sau nodozitate limfatică și utilizate direct, sau pot fi preferențial multiplicate. Multiplicarea poate cuprinde transformarea Herpes virus papio, fuziunea pe celulă mielom heterolog cu selecție subsecventă, sau donarea limfocitelor individuale B cu diluție limitativă în prezența celulelor T umane stimulate.

Acidul ribonucleic total (RNA total) este transformat într-un monofilar cDNA (ss) prin revers transcriptază utilizând nespecific (oligo-dT sau hexameri întâmplători) sau specifici (imunoblobulină CHI sau CK sau regiune constantă C lambda) primeri oligonucleotide.

cDNA monofilar produs prin această reacție este amplificat utilizând reacția de polimerizare în lanț în care ss cDNA, împreună cu deoxinucleotid trifosfataze, o DNA polimerază (de exemplu, o polimerază termostabilă) și primeri specifici, sunt utilizați pentru a amplifica regiunea variabilă a lanțului ușor corespunzător (fig.7-2). Alte locuri ale primerilor pot fi utilizate în scopul de a încorpora diferite locuri de restricție unice care să permită donarea direcțională a DNA-ului PCR amplificat într-un vector de expresie posedând același loc de restricție. O fixare a primerilor legați la capătul 3' a secvenței leader a lanțului greu al anticorpului încorporând locul Mlu 1, sau o fixare a primerilor legați la primele 23 baze a cadrului una încorporând un loc Xhol care poate fi utilizat de asemenea și se descrie în fig.7-1. Genele regiunii variabile a lanțului ușor și greu al imunoglobulinei pot fi donate într-un vector de închidere direct după amplificarea PCR pentru a permite ulterioare manipulări moleculare dacă este nevoie sau, donat direct într-un vector de expresie ce conține genele regiunii constante a lanțului ușor sau greu uman. Configurația moleculară a genelor imunoglobulinei în vectorul de expresie pot fi genomice, în care promotorul/schimbătorul imunoglobulinei și alte regiuni reglatoare sunt prezente cât și secvențe de îmbinare cap la cap donor/acceptor la joncțiunile intron/exon. Alternativ genele imunoglobulinei presupuse pot fi inserate în configurația cDNA-ului utilizând secvențe diferite (heterologe) virale promotor/multiplicator.

Exemplul 1. Secvențe de anticorpi de maimuță

Figurile 7 și 8 prezintă primeri cu sau fără locuri de restricție, utilizați în amplificarea PCR a genelor imunoglobulinei de la maimuță și/sau cDNA-uri umane. Detalii ale procedeelor utilizate sunt prevăzute mai jos. RNA-ul este izolat din splină, sânge periferic și celule nodoase limfatice de maimuțe utilizând metoda standard

RO 116404 Bl guanidin-izotiocianat. Fracțiunea RNA total izolată prin acest procedeu este apoi utilizată ca suport (template) pentru reacțiile de amplificare ulterioare. 0 cotă parte de RNA este incubată în prezența a 200 unități de revers transcriptază a virusului Moloney murine leucemiei și primerii oligonucleotidei (50-100 picomoli) nespecifici (oligo-dT sau hexameri întâmplători) sau specifici (regiunea CH1 a imunoglobulinei IgG sau regiunea CK a lanțului 505 constant kappa) să genereze o tulpină cDNA necodificatoare monosens. Monotulpina cDNA produsă prin această reacție este apoi amplificată utilizând reacția în lanț a polimerazei (PCR). O cotă parte dintr-un monofilar cDNA este incubată împreună cu deoxinucleotid trifosfați 620 μΜ), o DNA polimerază termostabilă (2-5 unități) și primeri de oligonucleotide sintetice derivate de la om (50 picomoli), pentru a amplifica genele 510 regiunii variabile a imunoglobulinei lanțului greu sau ușor.

Utilizând perechea de primeri prezentați în fig.8, sunt amplificate câteva secvențe din regiunea variabilă a lanțului ușor și greu a imunoglobulinei de Cynomolgus a unui număr de familii de gene. Aceste secvențe amplificate sunt donate în locul EcoRV a vectorului p-Blue-script (PpBS, disponibil de la Str.tagene, CA) și utilizat pentru 515 secvențierea DNA-ului. Secvențierea DNA-ului este efectuată utilizând DNA-ul plasmidei conținând insertul donat ca dublu stratificat, DNA-ul suport și metoda standard de secvențiere a lanțului terminal.

Secvențe de imunoglobulină de maimuță Cynomolgus reprezentative sunt prezentate în fig.9A-9H. Incluse în fig.9A-9H sunt secvențele aminoacid derivate de la 520 genele regiunii variabile umane reprezentând fiecare familiile de gene a regiunii variabile majore. Procentul de omologicitate a fiecărei secvențe de maimuță cu secvența derivată de la om, excluzând regiunile domeniului constant și regiunile CDR se prezintă de asemenea. Nivelul de asemănare dintre secvențele umane și cele derivate de la maimuță pentru o familie dată este tot atât de ridicat ca cel dintre două secvențe umane în cadrul 525 acelei familii. Este deci imposibil să se distingă secvențele regiunii variabile a imunoglobulinei derivate de la maimuțe străvechi, și cele derivate de la oameni numai pe baza comparării secvențelor.

Izolarea RNA-ului

Limfocitele B antigen-specific de maimuță sunt obținute în câteva moduri: prin 530 fuziune de celule din noduli limfatici de maimuță imunizată pe linie celulară K5H6/B5 partener de fuziune heteromielom uman/șoarece, și apoi trierea liniilor hibridome, prin limfocitele B transformate viral, sau prin tehnici de donare a limfocitelor B singure in vitro. în ultimul caz creșterea unui singur limfocit B de maimuță este susținută in vitro prin cocultivarea cu celule T umane ce au fost stimulate prin anticorp. Un singur limfocit 535 B este plasat în fiecare rezervor al celor 96 țesuturi rezervor al plăcii de cultură împreună cu aproximativ 150000 celule T umane anti-CD3-stimulate mitomicin C-tratate. După o perioadă de două săptămâni de incubare limfocitul B singur s-a mărit de cel puțin cât 200 celule plasmatice diferențiate. Supernatant de cultură din aceste rezervoare este cercetat pentru prezența imunoglobulinei prin tehnica ELISA utilizând un anticorp 540 captură de imunoglobulină de capră anti-maimuță.

Celulele fie din celulele transformate viral antigen-specific fie hibridoame sunt crescute în număr suficient pentru extracția RNA. Recipienții din tehnica de donare in vitro a limfocitului B unice care sunt pozitivi pentru imunoglobulină sunt îndepărtați, spălați de două ori cu tampon salin fosfat pH 7,5 și centrifugați (1000 x g 10 min.). 545

RO 116404 Bl

Celulele spălate sunt suspendate în 100 μΙ de amestec cloroform/alcool izoamilic (49:1). După vortexare (amestecare în aparat Vortex) și incubare pe gheață timp de 15 min., probele sunt centrifugate la 10,000 x g timp de 20 min. Faza apoasă este transferată într-un tub nou, amestecată cu volum egal de izopropanol și incubată timp de 1 h la 2O°C. Precipitatul este colectat prin centrifugare la 10000 x g timp de 15 min., spălat cu etanol 70%, recentrifugată și peletul este uscat în Speedivac (Savant). RNA-ul uscat este redizolvat timp de 1 s în 100 μΐ tampon de lizare. Un volum egal de izopropanol se adaugă și se incubează la - 20°C timp de 1 h. Precipitatul se colectează prin centrifugare la 10000 x g timp de 15 min. și se spală cu etanol 70%. Peletul se usucă într-un Speedivac (Savant) și se stochează la -20°C în etanol 70% până la utilizare.

Sinteza cDNA monofilar

Extractul de RNA total din celulele rezultate de la un singur recipient (rezervor) se dizolvă în 32 μΙ de apă bidistilată la care se adaugă 1 μΙ (50 -100 pmoli) de primer (fie hexameri întâmplători, oligo dT sau primeri 3' imunoglobulin-specifici) și 10 μΙ de 5 X tampon revers transferază (0,25 Tris-HCI pH 8,3, 0,375 M Kcl, 15 mM Mg Cl₂, 50 mM ditiotriol). Amestecul se încălzește la 65°C timp de 5 min. după care se pune pe gheață timp de 2 min. După încălzire, se adaugă 1 μΙ RNAsin (Promega), 5 μΙ de 5 mM deoxinucleotid trifosfați, și 1 μΙ(200 unități) de (BRL) revers transcriptaza virusului Moloney murine leukemiei, și amestecul se incubează la 37°C timp de 1,5 h. După terminarea reacției revers transcriptazei, amestecul monofilar cDNA/RNA se extrage cu fenol/cloroform și se trece prin coloană umplută cu 1 ml G-25 SEPHADEX. Materialul trecut prin această coloană a fost utilizat ca tampon(mediu) ss cDNA pentru amplificarea PCR.

Amplificarea de ss cDNA.

3...10 μΙ din ss cDNA se amestecă cu 10 μΙ 10 X PCR tampon (500 mM HCI, 100 mM Tris-HCI pH 8,3, 15 mM MgCI₂), 1,6 μΙ de 1,25 mM deoxinucleotid trifosfați, 50 picomoli de primer 5' imunoglobulină specifică, 50 pmoli de primer 3' de imunoglobulină specifică, și 2...5 unități de polimerază DNA termostabilă (Synthetic Genetics). Volumul de reacție se aduce la 100 μΙ cu apă și se acoperă cu 100 μΙ de ulei mineral. Amestecul de reacție se incubează la următoarele temperaturi, timpii specificați mai jos:

94°C timp de 1 min. 48°C timp de 2 min. 72°C timp de 2 min.

Acest ciclu se repetă de 30...35 ori. Produșii amplificați se examinează prin electroforeză pe gel de agaroză utilizând gel de agaroză 1,2% și standarde cu greutate moleculară stabilită. Genele regiunii variabile ale imunoglobulinei aplificate se situează aproximativ între 350 și 500 pb markeri. Produsele PCR amplificate au fost apoi utilizate pentru donarea în vectorul plasmidă corespunzător.

Exemplul 2. donarea genelor anticorp de maimuță

Deoarece secvențele genei regiunii variabile a maimuței, la nivelul cDNA, sunt indistinctibile la membrii umani ai familiei de gene echivalente, răspunsurile imune la anticorpii presupuși maimuță/om, dacă există, sunt fără îndoială de dorit să fie diferite de cele apărute împotriva moleculelor anticorp uman.

Tehnologia PCR: pot fi utilizate să se introducă locuri de enzime de restricție specifice, inclusiv (dar nu limitate la) Sall, Bgl II, Κρη I și Nhel, în secvențele regiunii

RO 116404 Bl variabile a maimuțelor străvechi pe parcursul reacției de amplificare PCR utilizând primeri bazați pe cei din fig.6. Genele donate preexistente sunt amplificate din vectorul lor specific utilizând acești primeri pentru a introduce locurile de restricție specifice care subsecvent au fost utilizate să doneze gena într-un vector expresie. Alternativ, acești 595 primeri sunt utilizați să amplifice direct din RNA celular.

Vectorii expresie care sunt construiți sunt de două tipuri. Primul (vezi fig. 3 și 4) permite regiunilor variabile imunoglobulinei cDNA donate să fie inserate în vectorul casetă, utilizând locurile de restricție unice, în care elementele genei imunoglobulinei sunt aranjate în configurație genomică. Acest tip de vector încorporează un promotor 600 imunoglobulinic, cei doi exoni ce fac secvența conduce un promotor imunoglobulinic, cei doi exoni ce fac secvența leader a imunoglobulinei, două locuri de donare Spel și Nhel, secvențele donor desprinzătoare în aval (în jos), o regiune de mărire a imunoglobulinei, o genă dde regiune constant umană (lanț greu sau ușor) și semnale de poliadenilare în aval (în jos). Suplimentar, ele includ bacteria originală de replicare, o genă de beta- 605 lactamază pentru bacteriană, și o genă neomicin fosfotransferază pentru selecția G 418, sau o genă xantin-guaninfosforibosil transferază (gpt) pentru selecția acidului micofenolic în celulele mamiferelor. Vectorii de expresie a lanțurilor grele și ușoare utilizează neomicin fosfotransferaza (Neo) și genele xantin-guanidin fosforibosil transferazei ca marker selectabil. 61 o

Al doilea tip al sistemului de expresie (vezi fig. 5 și 6) utilizează genele imunoglobulinei în configurația cDNA. Adică, nu sunt locuri introni sau rupere (desprindere] prezente între secvența conducătoare 5' și secvențele regiunii constante 3'. Acest tip de vectori utilizează secvențele promotor heteroloage virale/măritor, conducând genele lanțului ușor și greu al imunoglobulinei aranjat în manieră tandem, 615 secvențele poliadenilării și un marker celulă mamifer selectabilă (Neo). Gena Neo poate fi modificată spre a-și ascuți translația, de exemplu prin schimbarea codonului amonte și adiacent locului de pornire a genei din ACC la TCT. Suplimentar, o genă dihidrofolat reductază (dhfr) este prezentă pentru gena amplificatoare ce urmează cu metotrexat. Genele regiunii variabile imunoglobulinei de maimuță pentru a fi donate în cDNA vectori 620 de expresie configurați au fost amplificați fie din secvențele donate preexistente în vector de închidere ((PBS), sau direct din RNA cu primeri conținând fie locuri de restricție Sall sau Mlul și Nhel, pentru lanțul greu, fie Bg1 II și Kpnl sau BsiWI pentru lanțurile ușoare kappa sau lambda. Totuși nu se exclud nici alte locuri de restricție unice potențiale. Genele imunoglobulinei lanțului ușor și greu presupuse au fost introduse separat sau 625 secvențial (pentru construcțiile configurate genomic), sau pe același vector (pentru construcțiile configurate cDNA), prin electroporație în linia producătorului de celulă. Electroporația a fost utilizată pentru introducerea construcțiilor DNA liniarizate fie în celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO), fie în celulele de mielom de șoarece, urmat de donarea unei celule singure de transfactanți în 96 rezervoare de plăci de 63o cultură de țesut. Condițiile electroporării utilizând un dispozitiv de electroporare BTX-1OO (BTX, San Diego) și o cuvetă de plastic disponibilă de 1 ml dă numerele optime de transfectanți dintr-o cantitate dată de vector DNA.

Celulele CHO adaptate să crească în suspensie în mediu de ser liber (CHO-S SFM II minus hipoxantină și timidină, Gibco) sunt utilizate în construcțiile conținând elemente 635 regulatoare virale.

RO 116404 Bl

Subclonarea genelor regiunilor variabile a Ig

Produșii de reacție PCR sunt extrași cu fenol/cloroform și trecuți printr-o coloană cu 1 ml SEPHADEX G-25 presat. Daca fragmentul DNA urma să fie donat deschis la un capăt într-o plasmidă se adaugă 1 μΙ 1M MgCI₂, 0,5 ml de 1,25 mM deoxinucleotid trifosfați și 1 μΙ de polimerază ADN Klenow (5 unități la amestecul de reacție PCR total (1OO μș] și se incubează la 37°C timp de 15 min. pentru a completa orice locuri de cuplare 5'. înainte de donarea deschisă la capăt în plasmidă, capetele (marginile) 5', sunt fosforilate după cum urmează: se adaugă 5 μΙ de 10 mM ATP, 1 μΙ de T4 polinucleotid kinază (10 unități) la amestecul total de reacție și se incubează la 37°C, timp de 30 min. Fragmentele amplificate ce conțineau locuri de restricție interne sunt mai întâi tăiate cu enzima corespunzătoare de restricție și utilizate direct pentru ligare fără fosforilare. în ambele cazuri fragmentul de donat se extrage cu fenol/cloroform înainte de ligarea în vectorul corespunzător.

Pentru reacția de ligare se amestecă 10% din fosforilat sau fragmentul amplificat PCR tăiat cu enzima de restricție cu aproximativ 2 ng de vector corespunzător (volum total de 8 μΙ), digerat anterior cu enzime de restricție. Pentru capătul deschis se utilizează pBleuscript digerat cu EcoRV. Pentru capătul bastonaș donarea vectorului TCAE 5.2 sau 6.0 sau pGenex-H sau pGenex L, tăiat cu enzime de restricție corespunzătoare se utilizează 1 μΙ de 10 X tampon de ligare (500 mM Tri-HCI pH 7,6, 100 mM MgCI₂, 10 mM ATP, 10 ml ditiotreitol), 1 μΙ T4 ADN ligază (1 unitate) se adaugă și reacția se lasă să se desfășoare la 14°C peste noapte. Materialul ligat se utilizează pentru transformarea competentă a celulelor de E.coli HB101 utilizând metoda standard cu clorură de calciu pentru transformare. Bacteria transformată este selectată prin creștere pe plăci de agar conținând ampicilină LB. Coloniile individuale au fost selectate și crescute peste noapte în mediu LB conținând ampicilină și plasmida DNA este extrasă utilizând metoda standard de Ikiză alcalină. După analiza de restricție pentru determinarea clonelor ce conțin inserții de imunoglobulină este preparat DNA pentru secvențiere.

Gene donate pentru secvențiere

Genele regiunii variabile de imunoglobulină donate sunt secvențiate utilizând metoda standard de terminare a lanțului. Plasmida DNA dublu filamentară conținând insertul donat este utilizat ca suport de secvențiere.

înainte de secvențiere, DNA dublu răsucit (toronat) este chimic denaturat. DNA este secvențiat utilizând t7 DNA polimeraza SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH) radioactiv marcată alfa deoxiATP, și următorii primeri de secvențiere: (5'G (5'GAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') și (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') pentru regiunea variabilă a lanțului greu al imunoglobulinei G în direcțiile 5' la 3' și 3' la 5'. (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') și (5' GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') pentru regiunea variabilă a lanțului ușor al imunoglobulinei lambda în direcțiile 5' la 3' și 3' la 5'. Produșii de reacție au fost separați pe geluri poliacrilamidice 6% și citite.

Rezultatele secvențierii unui număr de gene ale regiunii variabile ușoare și grele a imunoglobulinei maimuțelor străvechi sunt prezentate în fig.9A-9H. Clonarea și secvențierea genelor imunoglobulinei de Cynomolgus nu este descrisă anterior în literatura de specialitate. Și nici, numai pentru acest motiv, gradul de omologicitate dintre om și Cynomolgus privind genele regiunii V a fost posibil să se definească. Omologicitatea dintre o singură genă lambda variabilă a cimpanzeului și contrapartea sa

RO 116404 Bl genomică umană a fost descrisă prezentând numai o diferență de 2% în regiunile cadrului (modelului).

Transfectia si selecția

I f *

După secvențierea genelor regiunii variabile a lanțului greu și ușor donat, genele sunt subclonate în vectori corespunzători de expresie. Aceștia pot fi vectori construiți cu elemente reglatoare de imunoglobulină în configurație genomică (așa cum se arată în fig.3 și 4), sau cu elemente reglatoare virale utilizând configurația DNA (fig.5 și 6). Locurile de restricție corespunzătoare (Spel și Nhel) pot fi desemnate (proiectate) în primeri de amplificare PCR pe parcursul etapei de amplificare inițiale, sau primeri de amplificare în sens contrar conținând locuri de restricție pot fi utilizați pentru amplificarea genelor imunoglobulinei din vectorii de închidere în care ele au fost donate. Alternativ, genele regiunii variabile a imunoglobulinei pot fi donate direct în vectorii de expresie după amplificarea PCR din RNA, încât această subclonare este inutilă.

Electroporarea

Electroporarea este utilizată fie pentru cotransformarea construcțiilor genomice cu lanț ușor sau greu fie pentru transformarea secvențială a construcțiilor genomice cu lanț ușor și greu în celule Sp2/o. în transformările secvențiale electroporarea construcției lanțului ușor presupus este urmată de selecția în acid micofenolic. Separarea supernatanților de clone, crescuți în 96 rezervoare plăci, pentru producerea lanțului ușor cu antiser împotriva regiunii constante a lanțului ușor uman utilizând tehnica EUSA, a permis selectarea clonelor exprimând cel mai înalt grad pentru lanțul ușor.

Electroporarea ulterioară a transformatorilor lanțului ușor cu un vector conținând construcția de imunoglobulină cu lanț greu maimuță/om a permis selectarea transformatorilor exprimând anticorpul presupus al specificității dorite și izotopul.

Construcția de lanț ușor pGENEX-L (figurile 3 și 4) este transformată în linia celulară a murin mielomului Sp2/o prin electroporare după cum urmează. Celulele SP2/o la o concentrație de 1 x 1O⁷ ml în tampon de transformare (272 mM sucroză, 7 mM fosfat de sodiu pH 7,4, 1 mM MgCI₂) se amestecă cu 50 pg de pGENEX-L conținând gena lanțului ușor donat corespunzător, care este anterior linearizat prin digestie cu enzima de restricție Pvull. Celulele sunt introduse într-o cuvetă spectrofotometrică de plastic de 1 ml și sunt inserați electrozi placă de 3,5 mm în cuvetă. Utilizând un aparat de transfecție BTX-100 (BTX, Inc) celulelor li s-a dat un puls de curent de 500 microsecunde astfel că aproximativ 50% din celule să moară. Această valoare este determinată anterior/prin pulsarea celulelor. în absență de DNA, cu tensiuni crescătoare și măsurarea numărului de celule supraviețuiesc după 24 h. Tensiunea față de viabilitate este reprezentată grafic și tensiunea corespunzătoare la 50% celule moarte utilizată pentru toate experiențele ulterioare de electroporare. Utilizând aparatul BTX-100, valoarea optimă este găsită ca fiind un puls la o amplitudine de 200 pentru 500 microsecunde. După pulsarea celulelor, acestea sunt lăsate să se recupereze pe gheață timp de 15 min. înainte de a fi transferate pe cele 96 rezervoare de plăci de țesut de cultură în mediu Dulbecco modificat Eagle (DMEM) conținând 5% ser de fetus de vită și 10% Sp2/o mediu condiționat. Celulele sunt placate la o concentrație la care creșterea celulei este observată în aproximativ 1 la 3 rezervoare după selectarea medicament corespunzător. Acest parametru este determinat pentru fiecare experiență de electroporare prin placarea unor numere diferite de celule electroporate per rezervor

685

690

695

700

705

710

715

720

725

RO 116404 Bl (1000 - 10000) și selecționând celulele ce sunt încorporate cu plasmidă. Numărul de rezervoare pe fiecare placă care prezintă creștere de celulă este numărat după 2-3 săptămâni de selecție. Astfel, numărul aproximativ de celule ce au dat aproximativ 1 la 3 rezervoare (wells) cu o concentrație de plasmidă particulară este determinat pentru a fi utilizat în experiențe ulterioare. Direct după electroporare celulele sunt introduse în mediu fără medicament. Se adaugă mediu proaspăt la două zile după electroporare conținând fie G418 fie acid micofenolic pentru celulele ce prezintă activitate neomicin fosfotransferază sau guanasil fosfotransferază.

Celulele sunt alimentate tot la două zile în prima săptămână și apoi de două ori pe săptămână. Concentrația medicamentului utilizat este determinată prin incubarea celulelor în prezența concentrațiilor crescătoare de medicament și monitorizarea viabilității celulei. Concentrația de medicament utilizat este de două ori fată de cea care • · I a dat 100% moarte. Pentru Sp2/o aproximativ 1 pg acid micofenolic/ml este cerut și pentru G418 aproximativ 800 Atg/ml.

Celulele sunt electroporate în câteva moduri, fie că vectorii genomici cu lanț ușor și greu (pGenex-H) și (pGenex-L) sunt co-electroporați, fie că lanțul ușor este electroporat singur. în ultimul caz clonele sunt selectate pentru nivelul ridicat de expresie al lanțului ușor de imunoglobulină presupusă utilizând tehnica ELISA. Ionii sunt apoi crescuți și electroporați cu vector conținând un lanț greu. Dacă sunt utilizați construcții cu genă tandem, vectorul de expresie (TCAE 5.2 sau TCAE 6) este mai întâi liniarizat prin digestie cu o enzimă Not I. O singură electroporare este suficientă pentru a se atinge integrarea atât a genelor lanțului ușor cât și a celor a lanțului greu. După două sau trei săptămâni supernatanții din rezervoarele ce continuau să crească în prezența medicamentului corespunzător sunt studiate pentru secreția de lanț ușor de imunoglobulină presupusă sau pentru întreaga imunoglobulină utilizând tehnica ELISA. Genele imunoglobulinei în configurația cDNA sunt electroporate în, fie celule Sp2/o, așa cum se descrie mai sus, fie în celule ovariene de hamster chinez (CHO) adaptate să crească în suspensie în mediu lipsit de ser. Celulele CHO sunt electroporate utilizând un aparat de electroporare BTX 600, fixat la condițiile pentru a atinge numărul maxim de colonii rezistente G418. Aceste condiții sunt 210 volți, 400 μ? și 13 ohmi. După electroporare celulele sunt numărate, spălate în tampon de transformare, resuspendate în același tampon și plasate pe gheață timp de 15 min. Celulele sunt ajustate la 1 x 10⁷ celule vii/ml și 400 p\ de suspensie de celule introduse în cuvetă sterilă de 0,4 ml (BTX Inc.). 25 grame de vector DNA Not 1 liniarizat TCAE 5.2 sau TCAE 6, conținând gene donate de regiune variabilă de imunoglobulină de macac sunt resuspendate în tampon TE (10 mM Tris, 1MM EDTA, pH 8,0) la 1 /zg/ml și adăugate la suspensia de celule. Electroporarea este efectuată prin descărcarea aparatului utilizând butonul automat de sarcină și puls. Cuveta este plasată pe gheață timp de 15 min., celulele la 120 ml cu mediu lipsit de ser și plasate pe plăci, șase 99-plăci rezervor (200 pl per rezervor conținând aproximativ 6,667 celule electroporate sau 3,333 celule vii per rezervor). Parametrii independenți de electroporare sunt stabiliți pentru această linie celulară și selectați prin G418 la 400 Aig/ml.

Selectarea pentru producerea de anticorp

Prezența de anticorpi umani recombinanți, de maimuță sau himerici, de către transformanți a fost stabilită prin tehnica ELISA după cum urmează: 96 plăci de rezervor

RO 116404 Bl plate întinse (Dynatech) sunt acoperite cu IgG anti-umană de capră sau kappa la 2OO ng/rezervor în tampon de acoperire (carbonat de sodiu 0,8 mg/ml, bicarbonat de sodiu

I, 55 mg/ml, pH 9,6) și incubate timp de cel puțin 16 h la 4°C. Tamponul de acoperire este îndepărtat și rezervoarele blocate cu 120 μΙ de tampon de blocare (1% ser albuminic de bovină în tampon salin fosfat conținând 0,2% azidă de sodiu) și incubat la 37°C, timp de 1 h. După aceea se completează până la 125 μ\ cu supernatant de cultură și rezervoarele se incubează 2 h la 37°C. Plăcile au fost apoi spălate de cinci ori cu PBS. 100 μΙ de perosidază de hrean- IgG anti-umană de capră etichetată (marcată) (sau kappa) diluată 1:1000 - 1:5000 în tampon de diluare (1% ser de albumină de bovină, 0,05% Tween 20, 0,02% azidă de sodiu în PBS) se adaugă. Plăcile se incubează la 37°C timp de 1 h apoi se spală de cinci ori cu PBS. Anticorpul himeric a fost detectat cu 100 μΙ peroxid de hidrogen și substrat, 3,3', 5, 5' - tetrametilbenzidină (1:1 v/v) per rezervor. Reacția de culoare este terminată după 2... 5 min. cu 100 μΙ de acid sulfuric 2M per rezervor.

Cei care lucrează în domeniul de specialitate pot obține ușor performanțe echivalente metodologiilor descrise mai sus. Exemple de astfel de tehnologii includ imortalizarea limfocitelor B selectate prin fuziune hibridoma, cum se descrie mai sus, cu linia de celulă K5H6/B5 descrisă de Carroll și colaboratorii, 164 J.Experimental Medicine 1566, 1986, sau linie de celulă echivalentă, cum ar fi SPAZ4 (disponibilă de la Sandoz, a se vedea Ehrlich și colaboratorii, 34, Clin.Chem. 1681, 1988). Linii similare de celule pot fi ușor construite prin tehnicile standard utilizând metodologiile publicate. Alternativ, genele imunoglobulinei pot fi donate din (a) celule imortalizate prin transformare virală cu Herpes papio, așa cum descrie Marhova și colaboratorii 30 Vopr Virusol 549, 1985, sau cu virus echivalent, (b) prin donarea unui singur limfocit B pentru a asigura o imortalizare trecătoare, așa cum descrie Amoroso și Lipske 145,

J. lmmunology 3155, 1990, sau (c) prin utilizarea unui recombinant din biblioteca de bacteriofage de imunoglobulină, așa cum descrie Huse și colaboratorii, 246 Science 1275, 1989 și Mc Cafferty și colaboratorii, 348 Nature 552, 1990. Alegerea clonelor conținând anticorpul corespunzător poate fi făcută prin tehnicile prezentate mai sus, sau tehnici echivalente bine cunoscute specialiștilor în domeniu și gena imunoglobulinei dorite rezultată din linia de celulă imortalizată. Suplimentar, anticorpul produs prin izolarea limfocitelor B de maimuță pot fi utilizate în terapia umană, fără să se formeze anticorpul presupus.

Regiunea constantă umană poate fi obținută prin tehnicile standard cu orice izotop dorit, bine cunoscut celor ce lucrează în domeniul de specialitate, și regiunea variabilă de anticorp de maimuță ligat cu regiunea constantă umană. Anticorpi presupuși, utili în mod particulat față de receptorii celulelor de suprafață specifice, care pot fi utilizați în imunoterapia umană includ CD4, ICAMs, CD19, CD20, CD8, CD11a, CD11b, CD28, CD18, CD45, CD71 și TGR.

Exemplul 3. donarea și exprimarea anticorpului himeric maimuță/om cu specificitate pentru CD4

Generarea liniilor de limfocite B imortalizate de la maimuță

Maimuță adultă cynomolgus (White Sands New Mexico Primate Center) este imunizată intramuscular, în locuri multiple, cu 130 - 300 μg solubil CD4 (sCD4) sau membrane celulare (1 x 10⁸ celule) de la linia de celule pozitive CD4 supT1 utilizând adjuvant standard. Imunizarea se repetă la fiecare 2-3 săptămâni până la un total de

775

780

785

790

795

800

805

810

815

RO 116404 Bl șase ori. Maimuța este susținută cu injecții de 100 /zg de sCD4 în regiunea inghinală la o coapsă și după o săptămână este îndepărtat chirurgical nodului limfatic de la același picior. Limfocitele sunt îndepărtate din nodului limfatic prin tăierea în felii a țesutului și clătirea cu mediu steril DMEM. Suspensia de celule este trecută prin țesătură (tifon) de nailon și este colectat prin centrifugare la 1000 x g timp de 10 min.

Aproximativ 1 x 10⁸ limfocite sunt suspendate în tampon tris-amoniu clorură (16 mM, pH 7,5 și amestecul încălzit la 37°C timp de 5 min. pentru lizarea eritrocitelor. Limfocitele sunt colectate prin centrifugare și resuspendate în ester L4eucin-metilic (LME) și incubate la 37°C timp de 45 min. Esterul L-leucin metilic cu care este tratată celula este filtrat prin țesătură de nailon și centrifugat, 1 ml de ser fetal de vită (vițel) se adaugă, celulele suspendate spălate de două ori cu RPMI lipsit de ser. Celulele sunt numărate și amestecate într-un singur tub conic de centrifugare de 50 ml împreună cu un număr egal de celule K6H6/B5 heteromielomice, prespălate de două ori cu mediu lipsit de ser. Celulele sunt ușor suspendate în 1 ml de 50% (PEG) (polietilen glicol) adăugat ușor cu agitare pe o perioadă de 1 min. Celulele sunt apoi resuspendate prin adăugarea a 20 ml de mediu lipsit de ser pe o perioadă de 5 min., cu amestecare ușoară pentru a se dilua cu polietilen glicol. După spălarea de două ori cu mediu lipsit de ser, celulele sunt resuspendate la o concentrație de 5 x ICf/O.I ml în mediu RPMI, conținând 20% ser fetal bovin și gentamicină și introdus în 96 rezervor-plăci de cultură de țesut micro la 0,1 ml per rezervor. Un volum egal de mediu HAT (0,1 ml) este adăugat la fiecare rezervor și hibrizii au fost lăsați să crească timp de 14-17 zile înainte de selectare.

Selectarea hibrizilor celulari contopiți pentru producerea de anti-CD4

Studiul de determinare a specificității anti-CD4 este după cum urmează: Plăci ELISA acoperite cu recombinant sCD4 la o concentrație de 100 ng per rezervor și blocate cu 1% ser albuminic bovin în PBS. Cote părți de 50 μΙ de supernatant hibridom sunt îndepărtate din fiecare rezervor și lăsate să incubeze cu plăci acoperite cu sCD4 timp de 60 min. Legarea este detectată prin incubare cu ¹²⁵l marcat pe Ig anti-umană de capră sau Ig anti-maimuță de capră timp de 60 min. După spălare de patru ori cu apă distilată, rezervoarele sunt numărate cu contor gama. Rezervoarele pozitive sunt restudiate în duplicat și celulele hidrodoma din acestea sunt subclonate de trei ori, mai întâi la 5 celule per rezervor apoi de două ori la 1 celulă per rezervor. în acest stadiu anti-sCD4 pozitive sunt separate pentru abilitatea de a lega de suprafața celulei CD4. Acest lucru este făcut prin inhibarea legării unui anti-CD4 murin monoclonal, denumit 1F3, la linia celulară CD pozitivă supT1. Pe scurt acest lucru este realizat prin coincubarea diferitelor cantități de anti-CD4 de maimuță și 10 ng de 1F3 marcat cu ^12bl cu 3 x 10⁵ supT1 celule/rezervor în placă 96 rezervor. După incubarea timp de 1 h la temperatura camerei (aproximativ 2O-25°C) celulele sunt îndepărtate prin vacuum pe fibre de sticlă ca filtre. După spălare extensivă cu PBS filtrele sunt numărate cu contor gama pentru a determina inhibarea de ligand 1F3 la celulele supT1 prin supernatanții hibridom de maimuță.

O clonă candidat este aleasă și a produs un anticorp ce prezintă o inhibiție puternică față de 1F3. Clona aleasă este izotipizată prin utilizarea de reactivi de izotipizare umani și găsit ca fiind o Ig G2 posedând un lanț ușor lambda. Această linie celulară este crescută la un număr mai mare pentru donarea genelor imuno globulinei sale.

RO 116404 Bl

Clonarea genelor regiunii variabile a lanțului ușor și greu de la celule B imortalizate, de maimuță

RNA total este izolat din limfocite B imortalizate de maimuța, 1 x 1O⁷ celule, utilizând metoda guanidin izotiocianat descrisă mai sus. O zecime din RNA total este utilizată pentru prepararea cDNA monofilar utilizând un oligo-dT oligonucleotidă primer și revers transcriptază, de asemenea descris mai sus. O zecime din cantitatea de cDNA este utilizată să se efectueze reacțiile PCR, cele șase reacții PCR fiecare au inclus șase 5' V_H primeri ai familiei specifice de oligonucleotidă conținând un loc de restricție Sa1 I împreună cu o regiune oligonucleotidică constantă IgG 3' cu un loc Nhe I, ambele figurate în fig.7-1. Similar, sunt efectuate cinci reacții PCR, utilizând unu din cinci primeri ai secvenței oligonucleotidei conducătoare lambda 5' conținând locul Bg1 II și prima regiune constantă lambda 3' cu un loc Avrll. Condițiile de reacție sunt descrise mai sus. Fiecare reacție PCR este efectuată în triplu. Produsele de fiecare reacție de amplificare a lanțului ușor sau greu sunt depuse pe geluri cu 1,2% agaroză. Primerul lanțului greu VH4 (Secv.nr.:13: 5'ACTAAGRCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') și primerul lamba (Secv.nr.:14: (5'ATCACAGATCTCTCAC CATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') au dat benzi tari pe gel de agaroză la electroforeză. Produsele acestor reacții sunt utilizate pentru clonarea în vectorul TCAE 6, care conține secvențele regiunii constante lambda umane și lgG1 umană.

Clonarea a două gene a regiunii veriabile în vectorul de expresie TCAE 6 este făcută secvențial. Mai întâi, produsul PCR al lanțului greu și vectorul TCAE 6 este digerat cu enzimele de restricție Sal I și Nhe I, produsele sunt extrase cu fenol/cloroform, și trecut prin cloană tasată cu SEPHADEX G-25. Produsul PCR este ligat la vectorul tăiat peste noapte la 14°C sub prezența ligazei T4 DNA. Aproximativ 500 ng DNA total este ligat într-un volum de 10 μΙ cu un raport molar insert/vector de 10:1. Materialul ligat este utilizat să transforme celulele competent XL-1 albastre (Stratagene) și celulele transformate sunt depuse pe plăci LB de agar conținând 50 ^g/ml ampicilină. Coloniile de bacterii rezistente la ampicilină sunt scoase și crescute în 5 ml miniculturi. Plasmida DNA este extrasă din fiecare din aceste culturi prin metoda de lizare standard alcalină tăiat cu enzime de restricție Sal I și Nhe I și produșii depuși pe gel de agaroză 1,2%. Plasmidele cu inserți de aproximativ 450 bp sunt utilizate ca suport - mediu (templates) pentru subclonarea următoare a regiunilor variabile a lanțului ușor. Produsele reacției PCR a lanțului ușor cât și plasmida conținând insert de lanț greu se taie cu enzime de restricție Bgl II și Avr II și sunt ligate împreună.

Miniculturile de plasmidă sunt selectate prin tăiere cu Bgl II și Avr II. Digeratele dând un insert de aproximativ 400 - 450 bp sunt considerate pozitive. Plasmidele conținând atât Sal Ι/Nhe I cât și Bg1 2/Avr II sunt crescute în cantități mai mari pentru secvențierea DNA-ului.

Vectorii de expresie anticorp presupus tandem TCAE 5.2 și TCAE 6 sunt derivați din vectorul CLDN, care el însuși este un derivat al vectorului RLDN 10b (253 Science 77-79, 1991). RLDN la rându-i este un derivat al vectorului de expresie TND (7 DNA 651-661, 1988).

RLDNIOb diferă de vectorul TND în următoarele moduri. Caseta transcripțională a dihidroforat reductazei (DHFR) (promotor, cDNA, și regiunea poliadenilatoare) este plasată între caseta țesutului activator plasminogen (t-PA caseta de expresie) și caseta neomicin fosfotransferazei (NRO) astfel încât toate trei casetele sunt în tandem și în

865

870

875

880

885

890

895

900

905

910

RO 116404 Bl aceeași orientare transcripțională. Suplimentar, promotorul genei DHFR în CLDN este înlocuit de promotorul major al globulinei beta de șoarece (3 Mol.Cell Biol. 1246-54, 1983] și t-PA cDNA înlocuit cu un poliliaker (poliligand). Toate trei casetele transcripționale eukariote (Expresie, DHFR, NEO] pot fi separate din plasmida bacteriană DNA (derivat p(JC9] prin digestie cu endonuclează de restricție Not I.

CLDN diferă de RLDN lob deoarece Rous LTR în fața polilinkerului este înlocuit de gena promotorului amplificator imediat anterioară citomegalovirusului uman (41 Cell, 521, 1985).

Vectorii de expresie TCAE 5.2 și TCAE 6 diferă de CLDN prin aceea că:

1) Ei conțin patru casete transcripționale (în loc de trei), în ordine tandem;

a] o regiune constantă de lanț ușor de imunoglobulină umană derivată via amplificarea de cDNA prin reacția în lanț a polimerazei. în TCAE 5.2 aceasta este regiunea constantă kappa a lanțului ușor al imunoglobulinei umane (Kabat numerotând amino acizii 108-214, alotip Km3], și în TCAE 6 regiunea constantă lambda a lanțului ușor al imunoglobulinei umane (Kabat numerotând amino acizii 108-215, genotipul Oz minus, Mcg minus, Ke minus alotip).

b) o regiune constantă a lanțului greu a imunoglobulinei umane; în ambele construcții lanțul greu de imunoglobulină grea umană a fost regiunea constantă gamma 1 (Kabat numerotând amino acizii 114-478 alotipul Gm1a, Gm1z), care a fost derivată via amplificarea cDNA prin reacția în lanț a polimerazei.

c] DHFR conținând propriul său eurocariotip promotor și regiunea de poliadenilare.

d) NEO de asemenea conținând propriu său promotor eurocariot și regiunea de poliadenilare.

3) Casetele lanțului greu și ușor al imunoglobulinei umane conțin secvențele semnal sintetic pentru secreția de lanțuri imunoglobulinice.

4) Casetele lanțului ușor și greu de imunoglobulină umană conțin linkeri DNA specifici care permit inserarea de regiuni variabile de imunoglobulină ușoară și grea care mențin cadrul de citire translațional și nu alterează aminoacizii normal găsiți în lanțurile imunoglobulinei. încorporarea schimbărilor descrise, conduc la construcția vectorilor TCAE 5.2 și TCAE 6. Clonarea regiunii variabile ușoare și grele a imunoglobuline, din celula anti-CD4 heterohibrid linia E9.1, în TCAE conduce la construcția care este depozitată în ATCC. Construcția care a fost depozitată, conține regiunea variabilă a lanțului greu de imunoglobulină și regiunea variabilă a lanțului ușor al imunoglobulinei de maimuță cynomolgus, ale căror secvențe sunt prezentate în fig. 13 și 14, donate din linia de celule E9.1 anti-CD4 hibridom. Regiunea constantă grea a lanțului este de origine umană a izotopului gamma 1 și alotipul Gm1a, Gm1z. Regiunea constantă a lanțului ușor lambda este, de asemenea, de origine umană, de Oz minus, genotip mcg minus și alotip Ke minus. Genele imunoglobulinei sunt donate în vectorul de expresie mamifer TCAE 6, prezentat în fig.6, care, când este electroporat în linia celulară mamiferă CHO a dat un anticorp presupus maimuță/uman anti-CD4.

Construcția DNA-ului prezentat aici, este utilizat să se transforme tulpina bacteriană XL-1 albastră, selectată în antibiotic ca ampicilina și depozitată ca suspensie celulară bacteriană în mediu steril conținând 15% glicerol.

Un alt sistem de expresie util este cel în care gena codificatoare a markerului selectiv este modificată să amplifice randamentul de sisteme recombinant codificatoare

RO 116404 Bl

960 de secvență dorită. De exemplu, deteriorarea inițierii translației de marker selectabil dominant are drept urmare obținerea de colonii mai puțin rezistente la medicament comparativ cu vectorul nealterat, dar fiecare colonie individuală exprimă nivele semnificativ mai ridicate de produs genă co-linkată decât vectorul nedeteriorat. De exemplu, inițierea translației este prima treaptă în sinteza proteinei. Locul de inițiere a translației a genei neomicin fosfotransferază (G 418 genă rezistentă) a fost schimbat ca un consens Kozak (secvența - ccAccTGG) la un Kozak mai sărac (secvența - ccTccATGC). Deteriorarea inițierii translației genei rezistente G418 a rezultat în: a) o semnificativă reducere (de 5 ori) a coloniilor rezistente obținute din o aceeași cantitate de DNA din plasmidă transfectată (Transfected) pe celulă, și 2) o semnificativă creștere în cantitatea de produs genă colinkată exprimată în fiecare clonă. în clonele conținând consensul Kozak, 73% din coloniile rezistente, au produs mai puțin de 25 ng/ml, cu numai 3% din ele producând mai mult de 100 ng/ml. Pentru clonele cu inițierea translației alterate, Kozak mai redus, 8% din coloniile selectate au produs mai puțin de 25 ng/ml, comparativ cu 63% din coloniile producătoare de mai mult de 100 ng/ml. Caracteristic, referindu-ne la fig. 16 (în care TCAE 5.2 are un consens Kozak, și TCAE 12 are un Kozak mai scăzut sau mai sărac), 258 colonii au fost derivate din 2 electroporări de 25 μ$ de DNA care conține genă neomicin transferază cu o concordanță de loc de translatare neschimbată. 201 din aceste colonii (78%) nu au exprimat nici un produs genă detectabilă (de exemplu mai puțin de 25 ng/ml de imunoglobulină presupusă), și numai 8 colonii (3%) au exprimat mai mult de 100 ng/ml. 98 de colonii au fost derivate din 6 electroporări de 25 μ§ de DNA care conține gena neomicin trasferază cu un loc de pornire al translației alterat. 63% din aceste colonii sunt cu exprimare mai mare de 100 ng/ml, și numai 8% din aceste colonii au exprimat mai puțin de 25 ng/ml.

Secvențierea DNA

Plasmida DNA este preparată din 100 ml culturi. Este în continuare purificată prin precipitarea (1 volum) cu un amestec de 2,5 M clorură de sodiu și 20% polietilen glicol (6 volume) pe gheață timp de 15 min. După centrifugarea la 10000 x g, timp de 20 min., peletul este spălat cu 70% etanol, recentrifugat și uscat în Speedivac (Savant). Peletul de DNA este resuspendatîn apă deionizată la o concentrație de 150-250 /zg/ml. Secvențierea este făcută pe 5 ^g DNA dublu catenar utilizând tehnica lui Sânger. Este utilizată secvențierea primerilor care sunt omologi secvențelor din cadrul vectorului de expresie amonte și aval a oricăruia din inserții a lanțului greu sau ușor. Inserțiile sunt secvențiate în ambele direcții 5' la 3' și 3' la 5'. Două clone de lanț ușor anti-CD4 și două clone de lanț greu anti -CD4 fiecare generat din reacții PCR separate sunt secvențiate în paralel în scopul de a determina dacă s-au introdus niște schimbări de nucleotidă pe parcursul reacției PCR. Ambele clone din cei aleși ai lanțului ușor și lanțului greu sunt găsiți identici pe întreaga lor lungime, confirmând că nu s-au introdus erori pe parcursul amplificării, respectiv procesului de amplificare. Secvența de lanțuri ușor și greu anti-CD4 se prezintă în fig. 13 și 14 și listingul secvenței nr.15 și 16.

Expresia de anti-CD4 presupus maimuța/om

Vectorul de expreie TCAE 5.2 și TCAE 6 nu numai că nu sunt potriviți să fie utilizați pentru expresia integrată stabilă în liniile celulare Sp2/o și CHA ci, datorită faptului că includ SV40 originar, este, de asemenea, capabil să fie exprimat tranzitiv în linia de celule COS. COS este obținut în felul următor: Celulele COS sunt însămânțate cu

965

970

975

980

985

990

995

1000

RO 116404 Bl o zi înainte de transfecție încât ele urmau să fie 50 - 70% confluente următoarea zi. Mediul de cultură este îndepărtat și celulele sunt spălate de două ori cu tampon de transfecție (TB-140 mM NaCI, 25 mM Tris, 5 mM Kcl, 0,5 mM Na₂HP0₄ 1 mM MgCI₂, 1mM CaCI₂). Se amestecă 30 /zg de clorură de cesiu, purificată TCAE 6 plasmidă conținând lanțurile imunoglobulinei ușoare și grele presupus maimuță/om antiOD₄ cu 3 ml de DEAE dextran per farfurie (1 mg/ml în TB). DNA este lăsat să se incubeze cu celulele timp de 1 h la 37°C. Soluția de DNA este îndepărtată și înlocuită cu 3 ml de glicerol 20% timp de 1,5-2,5 min., după care celulele sunt spălate de două ori cu TB. Celulele sunt incubate în 5 ml de mediu proaspăt conținând 1OO μΜ clorochină timp de 3-5 h la 37°C, după care sunt spălate de două ori cu mediu și incubate cu DMEM normal timp de 72 h. Supernatantul (1OO μΙ) din celulele COS transfectate sunt studiate la diferite diluții în ceea ce privește prezența anticorpului prin tehnica bazată pe ELISA. Anticorpul anti-uman lambda de capră este utilizat pentru a acoperi plăcile de studiurezervor 96 și IgG anti-umană de capră marcată peroxidază pentru detectarea anticorpului, în condiții standard ELISA. Celulele COS sunt găsite că produc între 10 și 40 ng/ml anticorp presupus maimuță/om. Volume mai mari de supernatant sunt concentrate de 10 ori și utilizate în legarea directă RIA la celulele CD4 pozitiv supT 1. întregul anticorp parental de maimuță și o imunoglobulină umană irelevantă sunt utilizați ca și controale pozitiv și negativ (figura 11). Mai mult, anti-CD4 de maimuță și anti-CD4 presupus maimuță/om sunt utilizați pentru inhibarea legării de anticorp anti-CD4(1F3) de șoarece de afinitate mare (figura 12.) Se poate vedea că anticorpul recombinant maimuță/om nu numai că leagă celulele CD4 pozitive ci este capabil și să inhibe legarea lui 1F3 la celulele CD4 pozitive în aproximativ aceleași concentrații de întreg anticorp de maimuță sau 1F3 însuși.

Exemplul 4. Generarea de anticorpi de maimuță Împotriva antigenelor limfocite umane

Un adult de maimuță Cynomolgus (White Sands New Mexico Primate Center) este imunizat întramuscular, în locuri multiple, cu 5 x 1O⁸ limfocite umane în întregime CD54 pozitive. Celulele utilizate sunt alternativ, Celule SB (linia limfocitară B umană) și limfocite umane periferic activate, activate prin pre-incubarea cu amestec de mitogen pokeweed (2,5 mg/ml), forbol monoacetat (40 nM) și fitohemaglutinin (4 mg/rezervor) cu includerea unui adjuvant standard. Imunizarea este repetată la fiecare 2-3- săptămâni până la 8 luni. Serul din animalele imunizate este protejat la diferite stadii prin inhibarea ligandului de anticorp murine, 84H10, cunoscut că se leagă la ICAM-1. 0 cantitate de saturație de 84H10 este legată la celulele ovariene de hamster chinez (CHO), anterior transformate cu un vector de expresie conținând CD54 cDNA uman și selectat pentru expresia ridicată de suprafață de celulă CD54, împreună cu diluții crescătoare de ser de maimuță. Inhibarea ligandului 84H10 este prezentată în fig.15.

Alți anticorpi murin monoclonali care recunosc alți antigeni limfocitari umani sunt testați prin inhibare utilizând ser de maimuță obținut prin aceleași metode de imunizare.

Utilizarea

Anticorpii produși în maniera descrisă mai sus, sau prin tehnici echivalente, pot fi purificați printr-o combinare a afinității și cromatografia de excludere a locului pentru caracterizarea studiilor biologice funcționale. Aceste studii includ determinarea specificității și afinității de legare cât și funcția efector asociată cu izotipul de expresie, de exemplu, ADCC, sau complementul de fixație.

RO 116404 Bl

1050

Exemplul 5. Formulări. Compoziție

Deși este posibil pentru anticorp sau fragmentul de anticorp să fie administrat singur, este preferabil să fie prezentat și administrat sub formă de preparat farmaceutic. Ingredientul activ poate fi conținut, pentru administrarea topică, de la 0,001% la 10% m/m, de exemplu de la 1% la 2% greutate din formulare, alături de ceilalți componenți, deși el poate cuprinde până la 10% m/m dar preferabil nu mai mult de 5% m/m și mai preferabil de la 0,1% la 1% m/m din formulare.

Formulările topice cuprind un ingredient activ împreună cu unul sau mai mulți purtători-suporți ai lui și deci, facultativ oricare alt ingredient admis din punct de vedere terapeutic. Suportul trebuie să fie acceptabil în sensul ca să fie compatibil cu ceilalți ingredienți ai formulării și nu dăunătorilor și ansamblului.

Formulările corespunzătoare pentru administrarea topică includ preparatele lichide sau semi-lichide corespunzătoare penetrării prin piele la locul la care se cere tratamentul, cum ar fi fricțiuni (liniment) loțiuni, creme, unguente sau paste, și picături corespunzătoare pentru administrarea în ochi, ureche sau nas.

Picăturile pot cuprinde soluții apoase sau uleioase sterile și pot fi preparate prin dizolvarea ingredientului activ în soluția apoasă corespunzătoare a agentului bactericid și/sau fungicid și agentului de conservare și/sau altor agenți, și preferabil incluzând și un agent activ de suprafață. Soluția rezultată poate fi clarificată prin filtrare, transferată în containerul corespunzător care este apoi sigilat [închis] și sterilizat prin autoclavare sau menținere la 90°C - 100°C jumătate de oră. Alternativ, soluția poate fi sterilizată prin filtrare și transferată într-un container prin tehnică aseptică. Exemple de agenți bactericizi și fungicizi corespunzători ce pot fi incluși în picături sunt azotatul fenilmercuric sau acetatul (0,002%), clorura de benzalconiu (0,01%) și clorhexidin acetatul (0,01%).

Solvenți corespunzători pentru prepararea soluției uleioase includ glicerina, alcoolul diluat și propilen glicolul.

Loțiunile pentru aplicarea pe piele sau ochi a unei loțiuni care poate cuprinde o soluție apoasă sterilă facultativ conținând un bactericid și poate fi preparată prin metodele similare celor pentru prepararea picăturilor. Loțiunile sau fracțiile pentru aplicare pe piele pot include de asemenea un agent care ajută la uscarea în scopul răcirii pielii, cum ar fi alcoolul sau acetona, și/sau umectanți cum ar fi glicerina sau un ulei cum ar fi uleiul de castor sau uleiul de arahide.

Cremele sau pastele sunt formulări semi-preparate cu ingredientul activ pentru aplicații externe. Pot fi făcute prin amestecarea ingredientului activ în formă de pulbere sau formă finală fin divizată, singur sau în soluție sau suspensie în fluid apos sau neapos, cu ajutorul unui aparat corespunzător, cu bază grasă sau negrasă. Baza poate cuprinde hidrocarburi cum ar fi parafina tare, moale sau parafina lichidă, glicerina, ceara de albine, săpunurile metalice; un mucilagiu; un ulei de origine naturală cum ar fi almond, porump, arahide, măsline; grăsimi vegetale lanolina și derivații săi, sau acid gras cum ar fi acidul stearic sau acidul oleic cu un alcool de tipul propilen glicolului sau macroalcoolilor (macrogoli). Formulările pot încorpora orice agent activ de suprafață corespunzător cum ar fi agenți de suprafață anionici, cationici sau neionici de tipul esterilor sorbitanului sau derivații polioxietilenici ai acestuia. Agenții de suspendare cum ar fi gumele naturale, derivații celulozei sau materiale anorganice cum ar fi silicații silicoși și alți ingredienți ca lanolina pot fi de asemenea incluși.

1055

1060

1065

1070

1075

1080

1085

1090

RO 116404 Bl

Pentru persoanele avizate va fi ușor de stabilit cantitatea optimă și distribuirea pentru fiecare doză individuală a anticorpului sau fragmentului de anticorp conform invenției pe baza naturii și extinției condiției ce urmează a fi tratată, formei, căii și locului de administrare, și animalul particular care urmează să fie tratat, și optimul tuturor acestor încercări poate fi determinat prin tehnici convenționale. Va fi apreciat de asemenea de persoana avizată cursul optim de tratament, de exemplu, numărul de doze de anticorp sau fragment de anticorp conform invenției dat pe zi pentru un număr definit de zile, urmărind cursul obișnuit al încercărilor de stabilire a tratamentului.

Fără alte elaborări, se crede că o persoană avizată poate, utilizând descrierea precedentă, să utilizeze prezenta invenție până la cele mai mici detalii ale sale. în continuare se prezintă totuși câteva exemple ilustrative care nu sunt limitative și sunt pentru mai buna ilustrare a scopului prezentei invenții și a căilor sale de aplicare.

Compoziție capsulară

O compoziție farmaceutică în forma de capsule se prepară prin umplerea a două capsule gelatinoase tari cu 50 mg de anticorp sau fragment de anticorp conform invenției, în formă de pulbere, 1OO mg lactoză, 32 mg talc, și 8 mg stearat de magneziu.

Compoziție injectabilă parenterală compoziție pentru injectare se prepară prin amestecarea a 1,5% greutate de anticorp sau fragment de anticorpul recombinant în 10% volum propilenglicol și apă. Soluția este sterilizată prin filtrare.

Compoziție sub formă de unguent

Anticorpul sau fragmentul de anticorp conform invenției	1.0g
parafină moale albă	până la	100,0 g

Anticorpul sau fragmentul acestuia este dispersat în volum mic de vehicul pentru a produce un produs moale omogen. Se încarcă apoi în tuburi metalice cu capac.

Compoziție sub formă de cremă pentru aplicare topică

Anticorp sau fragment de anticorp conform invenției	1.0g
Polawax GP 200	20,0 g
Lanolină anhidră	2,0 g
Ceară de albine albă	2,5 g
Metil hidroxibenzoat	0.1 g
Apă distilată la	100,0 g

Polawax, ceara de albine și lanolina se încălzesc împreună la 6O°C. Se adaugă o soluție de metil hidroxibenzoat și se omogenizează complet utilizând un agitator cu viteză mare de rotire. Se lasă apoi ca temperatura să scadă la 5O°C. Anticorpul sau fragmentul de anticorp conform invenției este apoi adăugat și dispersat în întreaga masă, și compoziția este lăsată să se răcească cu agitare la viteză mică.

RO 116404 Bl

1135

Compoziție - loțiune pentru aplicare topică

Anticorp sau fragment de anticorp conform invenției	1.0
Sorbitan monolaurat	0.6 g
Polisorbat 20	0.6 g
Alcool cetostearic	1,2g
Glicerină	6,0 g
Metil hidroxibenzoat	0.2 g
Apă purificată B.P. (Farmacopeea Britanică)	100,0 ml

1140

Metil hidroxibenzoatul și glicerina se dizolvă în 70 ml de apă la 75°C Sorbitan monolauratul, polisorbatul 20 și alcoolul cetilstearic se amestecă și se topesc împreună la 75°C și se adaugă la soluția apoasă. Emulsia rezultată este omogenizată, se lasă să se răcească cu agitare continuă și se adaugă anticorpul sau fragmentul de anticorp ca suspensie rămasă în apă.

întreaga suspensie este agitată până la omogenizare.

1145

1150

Compoziție pentru picături În ochi

Anticorp sau fragment de anticorp conform invenției	0,5 g
Metil hidroxibenzoat	0,01 g
Propil hidroxibenzoat	0,04 g
Apă purificată B.P. până la	100 ml

1155

Metil și propil hidroxibenzoații se dizolvă în 70 mm de apă purificată la temperatura de 75°C și soluția rezultată se lasă să se răcească. Anticorpul sau fragmentul de anticorp conform prezentei invenții se adaugă apoi, și soluția se sterilizează prin filtrare prin membrană filtrantă (0,002 μίτι dimensiunea porilor) și se împachetează steril în containere sterile corespunzătoare.

Compoziție pentru administare prin inhalare

Pentru un rezervor de aerosol cu o capacitate de 13-20 ml: se amestecă 10 mg de anticorp sau fragment de anticorp conform prezentei invenții cu 0,2...0,5% de agent lubrifiant, cum ar fi polisorbatul 85 sau acidul oleic, și se dispersează astfel amestecul obținut în popelent, cum ar fi freon, preferabil o combinație a (1,2 diclorotetrafluoroetanului) și difluoroclorometan și se închide într-un container de aerosol corespunzător fie pentru inhalarea intranazală fie pentru inhalarea orală.

Compoziție pentru administrarea prin inhalare

Pentru un container cu o capacitate de 15-20 ml;

Se dizolvă 10 mg de anticorp sau fragment de anticorp în etanol (6...8 ml), se adaugă 0,1...0,2% agent lubrifiant, cum ar fi polisorbatul 85 sau acidul oleic; și se dispersează în propelent, cum ar fi freonul, preferabil o compoziție de (1,2 diclorotetrafluoroetan) și difluoroclorometan, și se introduc într-un container adecvat, adaptat fie administrării prin inhalație orală fie celei intranazale.

1160

1165

1170

1175

RO 116404 Bl

Anticorpii și compozițiile farmaceutice sunt deosebit de utile pentru administrarea, de exemplu, subcutanată, intramusculară sau intravenoasă. Compozițiile pentru administrarea parenterală vor cuprinde în mod obișnuit o soluție de anticorp sau fragment de anticorp conform prezentei invenții sau un amestec de aceștia dizolvați în solvent suport acceptabil, preferabil un purtător apos. O varietate de suporturi apoase pot fi utilizate, de ex., apa, apa tamponată, 0,4% sare, 0,3% glicină, și altele. Aceste soluții sunt sterile și lipsite de impurități. Aceste soluții pot fi sterilizate prin tehnicile convenționale bine cunoscute de sterilizare. Compozițiile pot conține substanțe auxiliare acceptate din punct de vedere farmaceutic așa cum cer condițiile fiziologice apreciate cum ar fi agenți de reglare a pH-ului și agenți de tamponare, etc. Concentrația de anticorp sau de fragment de anticorp conform prezentei invenții în asemenea formulări farmaceutice poate varia larg, de exemplu, de la mai puțin de aproximativ 0,5%, de obicei la sau cel puțin aproximativ 1% până la de 15 ori 20% greutate, și vor fi selectate în primul rând pe baza volumelor de fluid, viscozității, etc., conform modului particular de administrare selectat.

Astfel, o compoziție farmaceutică conform prezentei invenții, pentru administrare prin injectare intramusculară poate fi preparată conținând 1 ml de apă tamponată sterilă, și 50 mg de anticorp sau fragment de anticorp conform prezentei invenții. Similar, o compoziție farmaceutică conform invenției pentru infuzie intravenoasă poate fi obținută din 250 ml de soluție Ringer sterilă, și 150 mg de anticorp sau fragment de anticorp conform invenției. Metodele actuale pentru prepararea compozițiilor administrabile parenteral sunt bine cunoscute sau vor fi ușor de aplicat de cei avizați. ș^;sunt descrise mai etaliat, de exemplu în “Remington’s Pharmaceutical Science” ediția 15, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, prin referirea făcută, această lucrare încorporându-se prezentei invenții.

Anticorpii (sau fragmentele acestora) conform prezentei invenții pot fi liofilizați în vederea stocării și reconstituiți în suport corespunzător înainte de utilizare. Această tehnică dovedindu-se potrivită pentru tehnicile obișnuite de reconstituire și liofilizare a imunoglobulinelor în vederea utilizării.

Funcție de rezultatul dorit, compoziția farmaceutică conform prezentei invenții poate fi administrată pentru tratamente profilactice și/sau terapeutice. La aplicarea terapeutică, compozițiile sunt administrate pacientului care deja suferă de o boală, în cantitate suficientă să vindece sau cel puțin să oprească parțial boala și complicațiile sale. în aplicațiile profilactice, compozițiile conținând prezenții anticorpi sau amestecuri de acești anticorpi sunt administrate la pacienți care nu sunt încă în stare de boală pentru a mări rezistența pacientului.

Administrări unice sau multiple de compoziții farmaceutice pot fi efectuate cu nivele de doze și modele ce sunt selectate de către medicul curant. în oricare caz, compoziția farmaceutică conform prezentei invenții trebuie să asigure o cantitate de anticorpi alterați (sau fragmente ale acestora) conform prezentei invenții pentru a fi suficienți tratării eficiente a pacientului.

Trebuie notat, de asemenea, că anticorpii pot fi utilizați pentru proiectarea și sinteza oricăror compuși peptidici sau nepeptidici (mimetici) ce ar fi utili în aceeași terapie ca cea cu anticorp. A se vedea, de exemplu, Saragovi și colaboratorii, Science, 253, 792-795 (1991).

RO 116404 Bl

1225 (1) INFORMAȚII GENERALE (i) SOLICITANT: Roland A Newman, Nabil Hanna, Ronald W Raab (ii) TITLUL INVENȚIEI: ANTICORPI CHINERICI PENTRU TERAPIE UMANĂ (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 16 (iv) ADRESELE PENTRU CORESPONDENȚĂ (A) Adresa: Lyon and Lyon (B) Strada: 611 West Sixth Street (C) Oraș: Los Angeles (D) Statul California (E) Tara SUA (F) Cod 02111-2658 (v) FORMA SUB CARE SE CITEȘTE LA COMPUTER:

(A) TIPUL MEDIULUI: 3.5Dischetă, 1,44 Mn stocare (B) COMPUTER IBM Compatibil (C) SISTEM DE OPERARE IBM DOS (versiunea 5.0) (D) SOFTWARE: Word perfect (versiunea 5.0) (vi) DATE PENTRU APLICARE CURENTĂ (A) NUMĂRUL CERERII (B) DATA COMPLETĂRII (C) CLASIFICARE (vii) ÎNAINTEA DATEI DE CERERE înaintea cererilor totale, incluzând cererea descrisă mai jos: 2 (A) NUMĂRUL CERERII 07/856.281 (B) DATA COMPLETĂRII 23 MARTIE -1992 (A) NUMĂRUL CERERII 07/735.064 (B) DATA COMPLETĂRII 26 Iulie -1991 (viii) AVOCAT/AGENT (A) NUME: Warburg, Richard J.

(B) Număr de înregistrare: 32327 (C) DOCUMENT DE REFERINȚĂ 198/158 (ix) INFORMAȚII DE TELECOMUNICAȚII (A) TELEFON (213) 489-1600 (B) TFX (213)955-0440 (C) TX 67-3510 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. Nr.:1:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 17 (B) TIPUL: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: Liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. Nr.: 1 CCATGGACTG GACCTGG 20 (3) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.:2 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 20 (B) TIP: acid nucleic

1230

1235

1240

1245

1250

1255

1260

1265

RO 116404 Bl (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV Nr.: 3: ATGGACATAC TTTGTTCCAC (4) INFORMAȚII PENTRU SECVENȚA Nr.:3:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 20 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. Nr.: 3: CCATGGAGTT TGGGCTGAGC (5) INFORMAȚII PENTRU SECV. Nr.: 4:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 20 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. Nr.: 4: ATGAAACACC TGTGGTTCTT (6) INFORMAȚII PENTRU SECVENȚA Nr.:5:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 20 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV Nr.: 5:

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT (7) INFORMAȚII PENTRU SECVENȚA Nr.:6:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 20 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.Nr.: 6: ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT (8) INFORMAȚII PENTRU SECV. Nr.:7:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 16 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SEQ: ID NO.: 7: TTGGGGCGGA TGCACT

RO 116404 Bl

1315 (9) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr. :8:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 17 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.: NrO.: 8: GATGGGCCC TTGGTGGA (10) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.:9:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 21 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.Nr.: 9: GATGACCCAG TCTCCAGCCTC

K (11) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.: 10:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 21 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV. Nr.: 10:

CTCACTTGCT GCACAGGGTCC y VR M (12) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.:11:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 19 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.: Nr.: 11: AAGACAGATG GTGCAGCCA (13) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.: 12:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 20 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.: Nr.: 12: GGAACAGAGT GACCGAGGGG (14) INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.: 13:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 31 (B) TIPUL: ACID NUCLEIC

1320

1325

1330

1335

1340

1345

1350

1355

RO 116404 Bl (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV:Nr.: 13:

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (15) INFORMAȚII PENTRU SECV.: Nr.:14:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 39 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV. :Nr.: 14:

ATCACAGATC TCTCAGCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC 39 (16 INFORMAȚII PENTRU SECV.Nr.:15:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 423 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.: Nr.: 15

GAC ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTC GCA GCC CCC AGA 48 TGG GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG GCG GGC CCA GGA CTG GTG 96

AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTG ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC 144 ATC AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TAC CCA GGG AAG 192 GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT 240 TAC AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC CC ATT TCA ATA GAC ACG TCC 288 AAG AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG 336 GCC GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA 384 TTA TAA TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 423 (17) INFORMAȚII PENTRU SECV.:Nr.:16:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 387 (B) TIP: ACID NUCLEIC (C) ÎNTINDERE: singur (D) TOPOLOGIE: liniar (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SECV.:Nr.: 16:

ACC ATG GCC TGG GCT CTG CTG CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA 48

GAC TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTC TCC GTG 96

TCC CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA 144 AGG AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG 192 CTG GTC ATC TAT GTC GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA 240 TTC TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAG AAC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG 288 GTC GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT 336 ACT GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GRC CTA 384 GGT 387

RO 116404 Bl

Claims

1 . Anticorp recombinant pentru terapie umană, cuprinzând o regiune variabilă și o regiune consantă de imunoglobulină care are specificitate pentru un antigen particular cunoscut, caracterizat prin aceea că, conține:

- o regiune constantă selectată dintr-un grup constând din regiunea constantă de anticorp uman, de cimpanzeu sau de la o primă maimuță străveche;

2. Anticorp recombinant conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prima, a doua sau a treia maimuță străveche poate fi aceeași sau diferită.

3. Anticorp recombinant, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că maimuța străveche este maimuța Rhesus, maimuța Cynomolgus sau un babuin.

4. Anticorp recombinant conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se leagă specific la un antigen uman.

5. Anticorp recombinant conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că antigenul uman este selectat dintre: CD58, VACAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD2O, CD23, CD41, CD44, CD54, TFN a, TFN β, Τη antkigen, IL-1, IL-8, receptor celulă-T umană, CD3, CD28, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD5a, CD11c, CD45, produs oncogen nou, MDR11, TGFalfa, receptor TGFalfa, PDGF și CD71.

6. Anticorp recombinant, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se administrează sub forma unei compoziții farmaceutice ce conține o cantitate eficientă terapeutic sau profilactic de anticorp recombinant și un purtător acceptabil farmaceutic, în tratarea cancerului, artritei reumatoide, eczeme sau la un pacient care suferă de o deficiență a sistemului auto-imun.

7. Acid nucleic care codifică un anticorp recombinant definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, pentru anticorpul anti-CD4 de maimuță are secvența de nucleotide pentru regiunea variabilă a lanțului greu și regiunea variabilă a lanțului ușor prezentate în fig. 13 și respectiv fig. 14.

8. Procedeu de obținere a anticorpului recombinant definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că cuprinde etapele:

- creșterea anticorpului de maimuță străveche față de un antigen uman într-un organism de maimuță străveche;

- contactarea ARN-ului din maimuța străveche cu revers transcriptaza, pentru a forma cADN;

- contactarea cADN-ului cu un primer complementar cu cADN, zona de codificare a secvenței 5' leader a genei anticorpului pentru a forma un complex hibrid;

- amplificarea acidului nucleic în complexul hibrid;

1410

1415

1420

1425

1430

1435

1440

RO 116404 Bl

- izolarea acidului nucleic care codifică porțiunea de legare a antigenului din regiunea variabilă a anticorpului de maimuță străveche;

- asigurarea acidului nucleic uman care codifică regiunea constantă a anticorpului uman;

- legarea acidului nucleic provenit de la maimuța străveche și acidului nucleic uman pentru a forma acidul nucleic recombinant;

- exprimarea acidului nucleic recombinant pentru a produce anticorpul recombinant.

9. Procedeu de obținere a anticorpului recombinant conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că imortalizarea unei celule care este capabilă să exprime anticorpul de maimuță străveche se face prin fuziune hibridoma, transformare virală, donarea unui singur limfocit B sau prin construirea unei bănci.

10. Procedeu de obținere a anticorpului recombinant conform revendicării 8, caracterizat prin aceea ca conține selectarea unui limfocit-B da la maimuță străveche care este obținut din limfocitele sângelui periferic, nodul limfatic, măduvă osoasă sau splină.

11. Metoda pentru tratarea unui pacient care are un antigen tumoral cu anticorpul recombinant definit în revendicarea 1, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde administrarea orală, parenterală, prin inhalare sau pe cale topică a unei cantități eficiente terapeutic cuprinse între 0,05...100 mg/kg corp/24h dintr-un anticorp recombinant definit în revendicarea 1, specific pentru numitul antigen.

12. Metodă conform revendicării 11, caracterizată prin aceea că, pacientul suferă de o reacție autoimună și antigenul este un antigen cuprins în răspunsul autoimun al omului.