PT99033A - Metodo para identificacao de compostos como inibidores da accao da oncoproteina - Google Patents

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MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS COMO INIBIDORES DAACÇSO DA ONCOPRQTEfNA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta invenção á uma continuação em parte da Patente Norte-Americana S.N. 07/586,781, depositada em 24 ds Setembro de 1990, atribuída e reconhecida como própria,, Esta. invenção refere-se a métodos para identificar terapêuticas anti-cancm„ A indução ds muitos tipos de cancro pensa-se que é fundamentalmente causada pelos produtos ds oncogenes celulares activos ( Bishop, J„M„, Science 235;i305..... 310, 19S71| Barbacid , M „ , Ann „ Rev,, Biochem „ 56 s 779.....8Ξ7, 1987 g Cole, M.D., Ann» Rev.Genet. 20::361-384,, 1986;; e Weinberg, R.A. „ Science 230s770-776, 1985),, Esses oncogenes exprimem oncoproteinas que residem na célula, muitas vezes localizadas em compartimentos celulares específicos tais como o núcleo, o citoplasma ou a membrana celular» Em exemplos particulares, os oncogenes celulares e virais Fos e Myc codificam as proteínas Fos e Myc, respectivamente» A expressão ds uma grande quantidade de Fos ou Myc numa diversidade de tipos de células permite que as células se desenvolvam indefinidamente na cultura celular (examinado em Bishop, J„M,, Cell 42::23-38, 19855 e Weinberg, R.A», Science 230 8 770-776, 1985}» Uma sobre, expressão de Fos ou de Myc em fibrabiastos normais de ratazana , juntamente com a expressão ds um produto oncogene activo ras, transforma os fibrofolastos s torna-os capazes de formarem tumores nos animais vivos (Land, H„ et al», Nature 304» 596 601, 19835 Ru 1 sy, H „ E» , Nature 304 s 602-606, 1983} Fos e Myc são exemplos de oncoproteinas que são fosforiladas, localizadas nos núcleos celulares, e possuem uma capacidade para alterar a transcrição (Donner, 35 10 15

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/A η 27 Μ1992 Ρ. et a 1» ;ι Nature 296s262-266,, 1982? Watt, R.A. et al „ , Mol Ce 11 Biol» 5,,448--456:, 1935s Reuz M„et al», Nucl» Acido Res» 155277-292, 19875» Estudos recentes sugerem que as oncoproteínas tais como Fos e Myc alteram a expressão do gene e imortalizam as células regulando a actividade do promotor de genes alvo específicos e assim activando ou reprimindo a transcrição desses genes alvo (ver, por exemplo, Va rmus ,, H. E. Sc i ence 238 s 1337-1339, 1987? K ings ton , R „ E,. etal» , Ce 11 41 s3.....5, 1985§ Bishop, J„i4. , Cell 42*23.....38, 1985;í yJeinbsrg, R.A,,,, Science 230 5 770-776, 1985),, Também se pensa que outras oncoproteínas estão implicadas na regulação do gene,, Por exemplo, o produto da oncogsne localizado no núcleo de v—„ium (jum virai; liga-se a zonas específicas no ADN (Struhi, K», Cell 50:841.....846, 1987} e é homólogo ao produto c-jum (jum celular), o qual também liga locais específicos no ADN,, 0 produto de gene jum parece ser idêntico ao factor de transcrição AP-i anteriormente caracterizado (Bohmann, D» et al. Science 23851386-1392, 1987;» É desejável identificar os compostos que inibem a actividade da oncoproteína» Pela inibição da actividade da oncoproteína, pode ser conseguido a inibição s/ou o controlo do crescimento celular induzido pela oncoproteína „ Em especial,, é desejável identificar inibidores de oncoproteínas que não alteram a actividade dos equivalentes celulares normais das oncoproteínas„ A administração desses inibidores proporcionaria benefícios terapêuticos no tratamento de doenças nas quais a expressão s a actividade da oncoproteína é um factor na promoção do crescimento celular ou na manutenção da célula num estado transf ormado., Contudo, até à data, foram identificados muitos poucas inibidores de oncoproteína» A identificação desses inibidores sofre® pela ausência de um ensaio de pesquisa simples, barato e fiável que podia identificar facilmente potenciais inibidores e seus derivados activos» 35

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Esses inibidores específicas cia activiclacls de oncoproteína podem ser ainda ensaiados quanto àqueles que não inibem a transcrição celular normal ou a actividade cios homólogos da □ncoprateína celular normais,, Sumário da Invenção Reconhecendo a importância do papel que os inibidores de oncoproteínas representariam no tratamento terapêutico de muitas formas cie cancro e conhecedores da carência de um sistema de ensaio simples pela qual esses in i bid ores potíe r iam ser id sn t i f i cados, os in ven to res investigaram a utilização de construções de oncogenes quiméricas em ensaios in vivo em hospedeiros eucariotas como um sistema modelo no qual se identificam agentes que alteram a expressão do oncogene. Estes esforços culminaram no desenvolvimento de um teste simples,! barato,, que pode ser utilizado para detestar inibidores da actividade biológica das oncopro teí n as d e mamifero» A invenção proporciona um método rápido, fiável e preciso para identificar objectivamsnte os compostos,, incluindo os produtos farmacêuticos para humanos, como inibidores da actividade de oncoproteína e, ροκά onsequência,, corno tsrapêutic:as anti-caricro A invenção proporciona ainda um método para identificar e classificar o mecanismo de acção de um composto inibidor da oncoproteína,, feioactivo,, A invenção proporciona ainda um ensaio para monitorizar o isolamento s/ou a purificação de um composto inibidor da oncoproteína ou de misturas desses compostos a partir de uma preparação sm bruto,, A invenção proporciona ainda um método para identificar e classificar um composto como um inibidor da actividade da oncoproteína determinando a capacidade de um composto tal para alterar a expressão de um gene transmissor ("reportar gene"},, sm que a expressão do gene transmissor está ligada operativamente. à actividade de regulação da transcrição de uma oncoproteína de fusão» 0

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25 30 6390S HSH .....0471,,0 í00786/103001) A r,^?#1992 ! 4.-- * método envolve em geral 5 (a) proporcionar uma célula hospedeira a qual contém um gene transmissor ligado operativamente a um local de ligação de ADN s que contém um gene de fusãoáfeoncoproteína o qual expressa uma fusão de oneoproteína capaz de se ligar ao local de ligação ADN de modo que a expressão do gene transmissor ê mediada pela oneoproteína de fusão ligada a ADNii (b) pBr em contacto a célula hospedeira com o composto i; e (c) ensaiar quanto à expressão do gene transmissor,, Uma diminuição na expressão do gene transmissor é indicativa ds um composto que inibe a actividade da oneoproteína,, A invenção proporciona ainda um método para identificar a capacidade ds um composto para inibir a actividade da oneoproteína por determinação da capacidade do composto para inibir a expressão induzida pela oneoproteína ds uma molécula transmissora,, compreendendo o método (a) desenvolver um primeiro hospedeiro na presença de um composto em que o primeiro hospedeiro foi transformado com uma ou mais construções recomfoinantss codificando uma proteína de fusão s um gene transmissor e na qual a expressão de um gene transmissor está ligada operativamente à expressão da proteína de fusão,, (b) desenvolver um segundo hospedeiro na presença do mesmo composto em que o segundo hospedeiro foi transformado com uma ou mais construções recombinantes codificando uma oneoproteína de fusão s um gene transmissor e em que a expressão do gene transmissor está ligada operativamente à expressão da oneoproteína de fusão § s (c) comparar a expressão desse gene transmissor no primeiro hospedeiro com a expressão desse gene transmissor η o segun d o hos ped e i. r o „ tim concretizações preferidas,, a célula hospedeira utilizada pelos métodos da invenção foram células de animais,, cultivadas, ou ds leveduras,, Descrição das concretizações preferidas Na descrição que se segue,, utilizaram~se vários termos utilizados na tecnologia de ADN recombinante„ 35 10 15

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Para se proporcionar uma compreensão mais clara e consistente da descrição e das reivindicações,, incluindo o âmbito a ser dado a esses termos,! proporcionam-se as definições seçuintes. Ligado operativamente.Como é uti1izado aqui,, o termo "ligado operativamente" significa que dois elementos macromoleculares estão combinados da tal modo que a modulação da actividads do primeiro elemento induz um efeito no segundo elemento,, Beste modo,, a modulação da actividads de um elemento promotor pode ser utilizada para alterar e/ou regular a expressão de uma ssqu@nc.ia codificadora ligada operativaments„ Por exemplo» a transcrição de uma sequência codificadora que está ligada operativamente a um elemento promotor é induzida por factores que "activam" a actividade do promotor? a transcrição de uma ssqufncia codificadora que está ligada operativamente a um elemento promotor é inibida por factores que "reprimem" a actividads do promotor,, Assim,, uma região promotora está ligada operativamente à sequência codificadora de uma proteína se a transcrição dessa actividade da sequência codificadora ώ inf lu@nci.ada pela a c t i v i d a d e d o p r o misto r,, Construção de fusão„ 0 termo "construção de fusão" refere-ss, geralmente, a genes rscombinantes que codificam proteínas de fusão s oncoproteínas de fusão» Proteína de fusão» lima proteína de fusão à uma proteína híbrida,, Uma proteína hibrida ê uma proteína que foi construída para conter domínios de pelo menos duas proteínas diferentes,, Como é aqui utilizado,, o termo "proteína de fusão" significa uma proteína híbrida que possui (a) um domínio de regulação da transcrição da uma proteína de regulação de transcrição que não ê uma oncoproteína,, a (b) em domínio da ligação AON da uma proteína de ligação ADN,, A estrutura da proteína de fusão é tal que o domínio de regulação da transcrição é o dominio de ligação ADN estão dispostas de uma forma que faz com que 35 15

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ambos os domínios sejam biologicamente activos,. A proteína que é a fonte do domínio de regulação da transcrição é diferente da proteína que ê a fonte do dominio de ligação de ADN,, isto é, os dois domínios são hetsrólogos um ao outro,, 0 dominio de regulação da transcrição da proteína de fusão pode activar ou reprimir a transcrição de genes alvo,, conforme a actividade biológica nativa do dominio,. Como á utilizado aqui,, o termo "proteína de fusão” não inclui as oncoproteínas de fusão da invenção como aqui se descreve a seguir,, 0 termo "gene da proteína de fusão" é utilizado para referir uma sequtncia de ADN que codifica uma proteina de fusão.. Um gene da protsina de fusão pode ainda proporcionar elementos adicionais tis regulação da transcrição da tradução para o respectivo controlo da transcrição e da tradução,, Qncoproteína_ds fusão,, Como é aqui utilizado,, a termo "oncoprotsína de fusão" refere-se também a uma proteína híbrida a qual foi construída para conter domínios de duas proteínas diferentes,, Como se utiliza aqui,, o termo "oncoproteína de fusão" significa uma proteina híbrida a qual possui (a) domínio de regulação da transcrição ds uma oncoprot.ei.na de regulação da transcrição,, s (b) um dominio de ligação ds ADN ds uma protsina ds ligação de ADN,, A estrutura da oneoproteína ds fusão á tal que o dominio de regulação da transcrição e o dominio de ligação de ADN estão dispostas ds uma forma tal que permite que ambos os domínios sejam biologicamente activos,. A oneoproteína que é a fonte do domínio de regulação da transcrição é diferente da proteína que é a fonte do dominio de ligação de ADN,, isto é,, os dois domínios são heteráIogas um em relação ao outro,, 0 dominio da regulação da transcrição da oncoprotsína de fusão pode activar ou reprimir a transcrição 35 15

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de genes alvo conforma a actividade biológica nativa do dominio„ 0 termo ,!gens de oncoproteina de fusão" â utilizado para referir uma sequência de ADN que codifica uma oncoproteina de fusão,, Um gene de oncoproteina de fusão pode ainda proporcionar elementos de regulação da transcrição e da tradução para o correspondente controlo da transcrição e da tradução,, Variante, Como é aqui utilizado, uma "variante" de uma entidade proteica como uma proteína de fusão ou uma oncoproteina de fusão refere-se a uma entidade proteica que contém uma sequência de aminoácidos a qual é substancialmente semelhante,, mas não idêntica, à sequfncia de aminoácidos de uma proteína de fusão ou de uma oncoproteina de fusão construída a partir dos domínios de ocorrência natural, Por uma "sequfncia de aminoácidos". Substancialmente semelhante deve-se entender uma sequência de aminoácidos que é muito homóloga,, mas não idêntica à sequência de aminoácidos encontrada numa proteína de fusão ou numa oncoproteina de fusão, As sequências de aminoácidos muito homólogas incluem sequências com 80% ou mais de semelhanças, e possivelmente baixa homologia, especialmente se a homologia está concentrada em domínios de interesse e é necessária para a função da proteína,, Derivado funcional„ Como utilizado aqui, um " derivado funcional" de uma proteína de fusão de uma oncoproteina de fusão é uma proteína que possui uma actxvidads biológica que é substancialmente semelhante à actividade biológica das construções de oncoproteina de fusão da invenção. Por "substancialmsnts semelhante" deve-se entender uma actividade biológica que é qualitativamente semelhante mas quanfcitaiivamente diferente, Por exemplo,, um derivado funcional de uma oncoproteina de fusão pode reconhecer o mesmo alvo da oncoproteina de fusão, mas não com a mesma afinidade. Da mesma maneira, um derivado 35

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 63908 MSN .....0471.0 (00786/103001) / í ΪΖΜ1992 /- /' funcional de uma proteína de fusão pode reconhecer o mesmo alvo da proteína de fusão,, mas não com a mesma afinidade»

Como é a q u i u t i 3. i z a d o» p o r exemplo, um péptida é considerado um "derivado funcional" quando ele contém a estrutura de a m x η o á c i d o s d a ρ r o t e í n a híbrida da invenção mais porções químicas adicionais que não são» geralmente, uma parte da proteína hihrída,, Essas porçffes podem melhorar a solubi 1 idadea absorpçSo, a semi-·vi da biológica,, etc,, do derivado» As porçSfes podem,, alternativaments, diminuir a toxidade do derivado» ou eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário indesejável do derivado,, etc» PorçSes capazes de conseguirem esses efeitos são divulgadas em 11 Rsminqton ' s Pharmaceutica 1 Sciences (1980)". Os procedimentos para acoplar essas porçSes a uma molécula são bem conhecidos na arte» Um derivado funcional de proteína híbrida pode ou não conter alteraçSfes pás-tradução tal cjomo hidratos de carbono ligados covalentemente,, dependendo da necessidade dessas modificaçães para a execução dos métodos da invenção. 0 termo "derivado funcional" é destinado a englobar os "fragmentos", as "variantes", os "análogos", ou os "derivados químicos" funcionais de uma molécula,, Ees posta. Como é aqui utilizado, o termo "resposta" refere.....se a uma variação em qualquer parâmetro que possa ser utilizado para medir e descrever o efeito de um composto sabre a actividade de uma oncoproteína ou de uma oncoproteina de fusão da invenção» A resposta pode ser revelada como uma alteração física (tal como uma alteração no fsnótipolou,, pode ser revelada como uma alteração molecular (tal como uma alteração numa velocidade de reacção ou numa constante de afinidade)» A detecção da resposta pode ser realizada par qualquer meio apropriado» Composto» Como é aqui. utilizado,, o termo "composto” refere-se a uma entidade química,, em fase sólida» líquida ou gasosa» 0 termo deve ser entendido incluindo os o 35 15

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MSH .....0471,,0 * | (00786/103001) *' compostos sintéticos5 os produtos naturais s as entidades macromoiecularss tais como os poi ipéptidos,, os polinucleótidos ou os lipidos,, e também entidades pequenas tais como os neurotransmissores,, os ligando®, as hormonas ou os compostos e1smsn tares,, Composto Bioactivo. Como é aqui. utilizado,, o termo "composto bioactivo" refere-se a qualquer composto que induz uma resposta mensurável nos ensaios da invenção„ Promotor „ Como é utilizado aqui,, um "promotor" é uma sequência de ADN localizada perto do início da transcrição na extremidade de uma sequência transcrita ligada operativamente„ C promotor pode conter um ou mai.s elementos ou módulos reguladores que interagem na modulação da transcrição do gene ligado operativamen te,, Expressão„ Como é aqui utilizado» expressão é o processo pelo qual a informação codificada dentro de um gene é revelada» Se o gene codifica uma proteína,, a expressão envolve a transcrição do ADN em ARNm o processamento do ARNm (se necessário) um produto de ARNm maduro e a tradução do ARNm maduro em proteína» Uma molécula de ácido nuclaico,, tal como um ADN ou gene é considerada "capaz de expressar” um polipéptido se a molécula contém as sequências de codificação para o polipéptido e para as sequências de controlo da expressão as quais,, no ambiente hospedeiro apropriado,, proporcionam a capacidade de transcrever., processar,, s traduzir a informação genética contida no ADN num produto proteico e se essas sequências de controlo de expressão estão ligadas operativamente à sequência do nucleótidos que codifica o polipéptido» 0 veiculo de clonação» Como é utilizado aqui, um "veiculo ds clonação" é qualquer entidade molecular que é capaz de fornecer uma sequência de ácido nuclaico a uma célula hospedeira para fins de clonação» Exemplos de veículos de clonação incluem plasmideos ou genomas ds fago„ ’í i { 35 15 10 1 15

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Pode ser utilizado um plasmideo que se pode replicar autonomamente na célula hospedeira,, flIternativamente5 uma molécula de ácido nucleico que se pode inserir (integrar) no ADN cromossómico da célula hospedeira é util, especialmente uma molécula a qual se insere no ADN cromossómico da célula hospedeira da uma forma estável,, isto á, uma forma que permita que essa molécula seja herdada pelas células filhas,, Os veículos de clonação são muitas vezes caractarizados por um, ou por um pequeno número, de locais de reconhecimento por endonuclease nos quais essas sequências de ADN podem ser cortadas de uma forma determinada sem a perda de uma função biológica essencial do veículo,, s dentro das quais o ADN pode ser unido (“spliced") para provocar a sua rspiicação e clonação„ 0 veiculo de clonação pode ainda conter um marcador adequado para ser utilizado na identificação das cél ui as transformadas pelo veículo de c lonação. Por exemplo, um gene marcador, pode ser um gene que confere resistência ao antibiótico específico a uma célula hospedeira,. A palavra "vector" é por vezes utilizada para o "veículo de clonação",, Veículo de_expressão. Como é utilizado aqui,, um "veículo de expressão" á um veículo de expressão ou um vector semelhante so veículo de clonação mas é concebido espscialmente para proporcionar um ambiente que permita a expressão do gene danado após transformação no hospedeiro,, Uma forma de proporcionar esse ambiente é proporcionar sequências de regulação da transcrição e da tradução sobre esse veículo de expressão, sendo essas sequências de regulação da transcrição e da tradução capazes de serem ligadas operativamente ao gene danado. Outra forma de proporcionar esse ambiente é proporcionar um local, ou locais, de clonação nesse veículo, no qual um gene clonado desejado e elementos reguladores da expressão desejados ρ o d e m ser" c 1 o n a d o s „ Num veículo de expressão, o gene a ser clonado está geralmente ligado operativamente a certas 35 15 10 i 15

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J8U992 % sequências de controlo, tais como as sequências promotoras., As sequências de controlo da expressão variarão consoante quer o vector seja concebido para expressar o gene ligado operativemnte num hospedeiro procariota ou eucariota © pode conter adicionalmente elementos de transcrição, tais como elementos intensificadores, sequências de terminação, elementos de especificidade tissular s ou locais de inciação e terminação da transcrição,, Hospedeiro„ Como utilizado aqui, o termo "hospedeiro" deve ser entendido como qualquer organismo que é o receptor de um veiculo ds clonação ou ds expressão. Em concretizações preferidas, o hospedeiro da invenção á uma célula de levedura ou uma célula animal em cultura tal como uma célula ds mamífero ou de insecto. Numa concretização especialmente preferida, o hospedeiro levedura é a Saccharpiiivces carevisias. Numa outra concretização especialmente preferida, o hospedeiro mamífero é uma célula NIH3T3 ou CV-i em cultura,, Em geral, as protéinas que regulam a transcrição possuem uma capacidade para ligar sequências específicas de ADN e uma capacidade para regular promotores específicos os quais contém essas sequências,, Essas proteínas possuem, geralments, pelo menos duas funções, uma função de ligação de ADN e uma função de regulação da transcrição, ror ligação ao ADN, o dominio de regulação da transcrição de proteína altera (activa ou reprime)a transcrição do gene ligado operativamente ao local de ligação do ADN da proteína reguladora. Em muitas proteínas reguladoras ds ligação ADN, a função da ligação de ADN e a função de regulação da transcrição são realizadas em dominías separáveis,, Estes domínios são muitas vezes unidades discretas s localizadas em locais na cadeia de aminoácidos que podem estar fisicamente separadas,, Pela separação destas unidades, é possível construir derivados de proteínas reguladoras de ligação de ADN, nativas. Esses derivados 35 1 i5

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podems por exemplo,, possuir a capacidade de ligar o ADN mas não a capacidade de regular a transcrição de ADN» Além disso5 esses derivados podem ser o domínio de ligação de ADN de uma proteína reguladora e o domínio da regula ção da transcrição de outra proteína reguladora. De acordo com a invenção, combinando as domínios de duas proteínas diferentes numa única proteína de "fusão", pode ser criada uma proteína que possui as ρ r ο p r i e d a d e s c o m bina d a s d o s d o mini. o s originais^ e s s a proteína pode ser utilizada para identificar e caracterizar compostos ou outros factores que modulam,, ou alteram de outro modo, a actividads de um dos domínios fundidos,, Para se utilizar nos métodos da invenção,, um hospedeiro deve possuir pelo menos duas construç-íes genéticas? uma primeira construção proporcionando sequências genéticas capazes de expressarem uma proteína de fusão ou uma oncoproteína. ds fusão? s, uma segunda,, construção proporcionando sequências genéticas contendo um gene transmissor» Numa destas células hospedeiras é necessário que o promotor do gene transmissor contenha o elemento de ligação ds ADN que é reconhecido pelo dominio de ligação de ADN da proteína de fusão ou da oncoproteína de fusão» Assim, a expressão (ou repressão) da síntese do gene transmissor á dependente da expressão e ligação da proteína ds fusão ou da oncoproteína de fusão ao promotor tío gene transmissor,, De preferência, são utilizados dois hospedeiros nos métodos da invenção» Um hospedeiro possui uma construção proteína ds fusão,, o outro hospedeiro contém uma construção oncoproteína de fusão e ambos os hospedeiros contêm a mesma construção gene transmissor„ Além disso,, o domínio de ligação ds ADN na construção proteína de fusão no primeiro hospedeiro é,, de preferência, a mesma que no dominio ds ligação de ADN na construção oncoproteína de fusão,, Expondo ambos os hospedeiros a um composto e comparando a expressão do transmissor nos dois hospedeiros, 35 15

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pode ser determinada a capacidade de um composto para alterar especificaments a transcrição induzida do oncogene (e não alteram a transcrição em geral),, 0 domínio de regulação da transcrição da construção proteína de fusão no primeiro hospedeiro pode ser qualquer domínio suficiente para permitir a regulação e, ds preferência, a activação da transcrição» Por e nem pio,, pode ser usada a cópia celular normal do domínio de regulação da transcrição da oncoprotsína que é utilizada na construção o ri c ο ρ r o t e í n a d e f u s ã ο η o s e g u n d o h o s p s d e i r o „ Alternativamente, e especialmente quando a cópia celular normal da oncoproteina é não identificada ou idêntica à oncoproteína, pode ser usado o domínio de regulação da trasncrição de uma proteína de regulação da transcrição diferente,, A utilização do domínio de regulação da transcrição de uma proteína de regulação diferente pode ser vantajosa, se desejado, piara garantir que quaisquer inibidores potenciais que sejam identifiçados não inibam a transcrição em geral. Os métodos da invenção podem ser utilizados para a identificação de compostos que inibem a transcrição per se. Os métodos da invenção podem também ser utilizados para a identificação de compostos que inibem ou de outro modo interferem com a oligomsricação da proteína, especialmente se essa oligomerisação é necessária para a regulação de transcrição de um gene indicador. Sem se pretender ficar limitado a um mecanismo específico de acção dos compostos foioactivos identificados pelos métodos da invenção, sabe-se que o domínio de regulação de transcrição de muitas proteínas de ligação ds ADN pode interagir com Coligomerizar com) uma segunda proteína que não liga ADN e, na forma aligomerica, estimular a transcrição de genes ligado operativamente» Por consequência, nas construçães de fusão da invenção que requerem essa oligomeri.zação para a actividade de transcrição, os compostos que inibem essa oligomerisação também inibem a actividade da oncoprotsína„ ,14 35 1 /5

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Qualquer proteína de ligação de ADN ou proteína de regulação de transcrição, e especialmente as proteínas eucarlotas pode ser utilizada como uma fonte de um domínio desejado nas construções proteína de fusão e oncoproteína de fusão da invenção,, Conhecem-ss muitas proteínas de regulação da transcrição„ As proteínas de regulação da transcrição e os métodos utilizados para caractsriiísr os domínios dessas proteínas, foram revistas por Johnson e Mcknight, Annu„ ftev. Btoch. 58; pág„ 798.....839, de 1989,, aqui. incorporado para referência. Nas construções da invenção, as sequências que proporcionam (1) o domínio de ligação de ADN © (2) o elemento de ligação ds ADN reconhecido por esse dominío podem ser, cada uma, homólogas a uma célula hospedeira ou heterólogas à célula hospedeira,, De preferência, são utilizados num dominio de ligação, de ADN, hetsrólogo e o elemento,, Numa concretização espscialments preferida, rios hospedeiros eucariotas, a fonte do elemento de ligação de ADN e a fonte do domínio de ligação de ADN da proteína que liga aquele elemento, ê procariota,, A utilização de elementos de regulação procariotas com um hospedeiro eucariota nos métodos da invenção é vantajoso uma vez que diminui grandemente a possibilidade do hospedeiro conter um elemento endógeno o qual pode titular, diluir ou ds outro modo interferir com a interpretação dos resultados fornecidos pelos métodos da invenção. Embora não seja necessário para a prática dos métodos da invenção, quando a domínio ds regulação de transcrição seleccionado não é aquele da cópia celular normal da oncoproteína por exemplo, o domínio c-Mvc de v.....i'iyc correspondente, pode ser desejável utilizar um domínio de regulação da transcrição de ADN de uma proteína de regulação de ADN que está na mesma ciasse de ligação de ADN que a oncoproteína. Muitas proteínas reguladoras que partilham homologias nos seus locais de ligação ds ADN

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63908 M6H .....0471,,0 (00786/103001) podem também partilhar semelhanças na forma como regulam a transcrição.

Dois motivos que caracterizam as proteínas de ligação de ADN são o motivo em "hélice.....curva- -hélice" ( ” hei ÍK--turn-hel ík " 5 e o motivo em "dedo de zinco" ( "zinc finger motif"). As proteínas seguintes contém um motivo em "dedo de zinco"s as proteínas da levedura SAL4, MAPI, ADR1, SNI 5, AR8R11 e L.AC9, a proteína cvs-3 de Neurospora? a liga de proteínas Drosopila, o "caracol",, a " corcunda",, o examinador,, e o supressor da "ala cabeluda", e as proteínas de vertebrados Spl, a proteína semelhante a H2TF-l/NF”fflB, a PRDX, a TDF, a GLX , a Evi--1,, o receptor glucocoiticoide, o receptor de estrogénio, o receptor de progesterona, o receptor da hormona tiróide (C-srbA) e o 1ZIF/268. As proteínas seguintes contém um motivo em "hélice-curva-hélice"s os factores de tipo de empareihamento de levedura HATal, ivIATa2 e HATai, as proteínas Drosofila de antenapedia, de ultrabitórax, aos pares, "fushi tarazu”, separado,, e denteado, e as proteínas de vertebrado OTF--l(OCTl), OTF.....2 (0CT2) e PIT-1.

Os domínios de regulação de transcrição preferidos nos métodos da invenção são os de GCN4 e 6AL4„

Os exemplos das proteínas de ligação de ADN, pracariotss com domínios de ligação de ADN e elementos de ligaçã de ADN úteis nos métodos da invenção incluem LsxA, CAP proteína activadara de catabolito de E,. cal i) „ as proteínas de bacteriófago e CR0 s Cl, as proteínas repressor lac, repressor trp, repressor gal e fago 434 e repressor ΡΞ2 s Cro„ Além disso, qualquer um dos domínios de ligação de ADN das proteínas de regulação de ADN previamente indicadas podem ser utilizados ss estão presentes nas células moléculas suficientes da proteína para titularem qualquer local de ligação de ADN homólogo, que esteja presente na célula hospedeira. A identificação de um domínio de liagação ADN numa proteína pode ser realizada por uma x& 35 15 10 1 15

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diversidade de técnicas conhecidas na arte e previamente utilizado para identificar esses domínios,. As proteínas de ligação de ADN, e os domínios de ligação de ADN nessas proteínas, são identificados e purificados pela afinidade para o ADN» Por exemplo* a ligação de ADN pode ser revelada em experiências de hibridação em filtro, nas quais a proteína (geralmente marcada para facilitar a detenção) é permitida ligar-se a ADN imobilizado sobre um filtro ou, vice.....versa, na qual o local de ligação de ADN (gsralmente marcado) é ligado a um filtro sob o qual a proteína foi imobilizada. A especificidade e afinidade de sequência dessa ligação é revelada com ensaios da protecção de ADN e ensaios de atraso em gel» A purificação dessas proteínas pode ser executada utilizando técnicas de cromatografia da afinidade específica para sequência de ADN, isto é, cromatografia em coluna com uma resina derivada com o ADN ao qual o domínio se liga. A degradação prateaiítica das proteínas de ligação de ADN pode ser utilizada para revelar o domínio que retém a capacidade de ligação de ADN» 0 domínio tíe ligação de ADN é construído na oncoproteína de fusão duma forma que não destrói a capacidade do domínio para reconhecer o elemento de ADN ao qual ele se liga naturalmente5 isto é, o domínio de ligação de ADN é proporcionado de um modo que não destrói a sspscificidade de ligação do ADN do domínio de ligação de ADN»

Qs domínios de regulação da transcrição em proteínas podem também ser identificados por técnicas conhecidas na arte e, de preferência, utilizando uma proteína danada na qual as sequências genéticas podem ser facilmente manipuladas» Numa forma danada, a síntese de derivados da proteína nativa é de preferência dirigida pelos vectores de expressão para que o domínio de regulação da transcrição possa ser identificado, monitorizando a capacidade dos derivados expressos para activarem a transcrição de genes que se sabe serem activados pela 35 15

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;7 JAN. 1992 proteína de comprimento total» Além disso,; podem ser utilizados ensaios de transcrição isentos de células, capazes de uma transcrição exacta a partir dos promotores desejados, utilizando os moldes de ADN clonado. A proteína de fusão e a oncoproteína de fusão da invenção podem conter mais do que um domínio de activação de transcrição» De uma forma semelhante, a região promotora do gene transmissor pode conter mais do que um elemento de ligação de ADN, cada um dos quais capaz de alterar (induzir e/ou inibir) a expressão do gene transmissor 1igado operativaments» As construçSes genéticas da invenção (a proteína de fusão e gene transmissor ou a oncoproteína de fusão e o gene transmissor) podem ser colocadas em dois plasmideos ou fragmentos de ADN recombinante diferentes, ou combinados num plasmidso ou fragmento de ADN recombinante» As construçSes podem também ser inseridos no genoma de uma célula hospedeira» De preferencia, a oncoproteína da fusão é construída ds tal modo que o domínio de ligação de ADN nativo da oncoproteína (se existir algum) foi removido (ou inactivado) e substituído por um domínio heierólogo de ligação de ADN,. Em consequência,, a oncoproteína de fusão já não se liga a quaisquer elementos de ADN específicos que podem ser alvos naturais para a oncoproteína,, Antes, a oncoproteína ds fusão liga agora especifieamente à sequência ds ADN identificada pelo domínio h©terólogo de ligação ADN na oncoproteína de fusão,, Uma vez ligado ao ADN, ocorre a transcrição de genes ligados operativamente» Numa outra concretização, a oncoproteína de fusão retém o seu domínio de ligação de ADN, nativo, mas também contém um segundo domínio de ligação ADN heterólogo» Nesta concretização, a oncoproteína de fusão pode ainda ligar quaisquer elementos de ADN específicos que são normalmente alvos para a oncoproteína desde que a ligação da 35 1 5

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i z \ proteína aos locais nativos não obste a ligação ao elemento de ligação ADN heteróloyo» As construçliss da fusão podem também carecer de um domínio nativo de dimerização. Em certos casos,, a presença do domínio nativo de dimerização compromete a activação através dos operadores LexA,, quer evitando a dimerização dos domínios de ligação de ADN LexACe assim evitando que a proteína de fusão se ligue a um operador LexA) quer facilitando uma interacção heterodimériea com alguma outra proteína celular (0,9.,,, outro fantor de trasncrição ou a matriz nuclear) e assim reduzir o número de moléculas da proteína de fusão disponível para homodimerização s para ligação do promotor» Os dominios de dimsrização das proteínas e das oncoproteínas da invenção podem ser removidos da sequ@nc.ia de ADN que codificou uma oncoproteína ou outra proteína por digestão enzimática (e„gn,, disgestão de restrição) ou,, se o domínio de dimerização está no terminal carhoxilo,, por inserção de codão de paragem a montante do domínio ou dentro dela,, 0 gene transmissor pode ser qualquer gene cuja expressão possa ser monitorizada e cuja expressão possa actuar como um indicador da actividade da proteína de fusão ou da oncoproteína de fusão» Numa concretização preferida,, o gene transmissor ê um gene que não é geralniente expresso pelo hospedeiro ou é um gene que substitui um gene endógeno do hospedeiro» 0 produto do gene transmissor pode ser ensaiado directamente por um imunoensaio. Esses imunoensaios incluem aqueles em que o anticorpo está em fase liquida ou está ligado a um portador em fase sólida» Além disso, o gene transmissor pode ser marcado detectavelmente de várias maneiras serem utilizadas nos imunoensaios. Os imunoensaios preferidos para deteetar a utilização de uma proteína transmissora incluem os doseamentos radio.....imunológicos5 os ensaios de imunossorção de enzima ligado (ELISA)5 ou outros ensaios à imunidade conhecidos na arte,, tais como ensaios de 35 15

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mm iiiiunof kiorescfncia, ensaios de quimioluminescfncia ou ensaios de bioluminesc:?ncia,, Qualquer alteração detestável do fenotipo pode servir como a base para os métodos da invenção,, São especialmente úteis os genes transmissores que conferem um novo fenotipo ao hospedeiro quando expressos, Os genes que conferem ao hospedeiro uma capacidade para se desenvolver num meio sslectivo são especialmente úteis,, Por exemplo,, na levedura, a utilização do gene LEV2 de levedura como um gene transmissor em estirpes mutantes,. que carecem de LEV2, permite que essa levedura se desenvolva com leucina como uma fonte única de carbono (ver e„g„;! The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,, ed,. Stratheru et» al. ,, Coid Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.J. 1981;; e os mê t od os d esc: r i tos em Ro t hstei n et.al., Mo 1 Ce 11 Biol« 71:1198,1987), A expressão do gene transmissor é monitorizada através de mera descrição se a hospedeira mantém a capacidade de se desenvolver em leucina,, 0 gene lacZ de E„coli é também muito utilizado como um transmissor. Nos hospedeiros que utilizam o gene lacZ como um gene transmissor, a expressão e a ar.tividade da oncoproteína de fusão pode ser facilmente traçado monitorizando a produção de β-galactosidase, A produção de j3.....galactosidase pode ser monitorizada visualmente na presença do colante cromofórico, x-gal, que se torna azul após a hidrólise pelo enzima,, Outros genes transmissores incluem his3, ura3, trpl a,, um gene transmissor sspscialmsnte preferido em células de mamíferos, o gene da cloranfsnicol·--cstiltransferase (CAT)„ Um especialista na arte pode imaginar muitos outros sistemas transmissores apropriados que podiam revelar a presença ou a inibição da actividade biológica da oncoproteína de fusão,, Pode ser estabelecido que efeito de um composto desejado ê devido a um efeito na transcrição e não 35 15

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63903 Π3Η .....0471,,0 (00786/103001) a um efeito sobre a actividade do produto transmissora per ss.tr comparando o efeito de um tal composto em hospedeiros contendo o produto da oncoproteína de fusão,, com os efeitos de um tal composto nos hospedeiros contendo um produto diferente do da oncoproteína de fusão, se ambos os hospedeiros contêm a mesma construção gene transmissor,, Numa concretização preferida dos métodos da invenção, o gene da oncoproteína de fusão contém uma sequência codificando a proteína LexA repressora,, bacteriana e uma sequência codificando o dominio de activação da transcrição da oncoproteína virai, vFos,, A expressão de um tal gene resulta na oncoproteína de fusão "LshA-vFos". A LsxA-~vFos mantém a capacidade de se ligar ao elemnto de ligação cie ADN LexA» A LexA-vFos mantém também o potencial para activar a transcrição devido à presença do domínio cie activsção da transcrição vFos. A ligação da oncoproteína de fusão LexA.....vFos resulta na activaçlo da transcrição devido à presença de um dominio, ou domínios,, de activaçlo contidas na porção vFos. As construçffes transmissoras, nas quais a sequência " repressor-operador,! LexA ( o elemento de ligação de ADN reconhecido pelo domínio de ligação ds ADN LexA) ê um módulo ou elemento com um promotor que está ele próprio ligado operativamente a um gene transmissor lacZ„ expressarão o produto do gene .1.acZ em resposta á ligação de uma oncoprotéina de fusão Lexft-vFos.. Um composto que altera a actividade da oncoproteína de fusão é facilmente identificado av a 1 i a n cl o a c a p a c i d a d e d o s h o s p e d eir o s p ara expressaram o gene transmissor 1acZ e assim hidrolisarem o X--ga! no cromáforo azul,, Quando a actividade da oncoproteína é alterada peia presença de um composto que inibe essa actividade,, a célula hospedeira altera a expressão do gene transmissor lacZ s altera, assim,, a sua capacidade para hidrolisar o X-gal no cromáforo azul» Quando as células de levedura foram utilizadas como hospedeiros nos métodos da invenção, -:::1 35 15

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estirpes da levedura pedem ser plaqueadas inrfivitíualmsnte e desnvolvidas como gramas,, Um composto a ser testado pode ser aplicado a uma das placas num disco de papel de filtro que está inpregnado com esse composto,, ou alternativaments pode ser incorporado nos meios am que as leveduras se estão a desenvolver. A capacidade de um composto para alterar a actividade de activação da transcrição induzida pela oncoproteina pode ser dstsctado pelo aparecimento de uma "zona" à volta do disco impregnado com o composto» Por exemplo,, se o composto é tóxico para a sobrevivência da levedura,, a levedura não se desenvolverá na zona contendo o composto,, Quando são utilizadas células animais em cultura como células hospedeiras,, um composto a ser testado pode ser adicionado ao meio da cultura» A permeabilidade de células a vários compostos pode ser intensificada, se necessário, utilizando uma estirpe mutante da célula que possui uma permeabi1 idade intensificada, ou utilizando compostos que são conhecidos por aumentarem a permeabi1 idade» Por exemplo, em levedura, os compostos tais como o nonapéptido polimicina B podem ser utilizados para aumentar a permeabi1 idade da levedura aos compostos orgânicos pequenos» Em células da eucarxotes superiores, o DMSO pode ser utilizado para aumentar a permeabilidade,, Os análogos desses compostos que são ma is permeáveis através das membranas de levedura podem também ser utilizados» Por exemplo, um derivado de dibutirilo de um composto proporciona muitas vezes uma permeabi1 idade acrescida do composto nas membranas biológicas» Os métodos da invenção podem ser utilizados para a identificação de compostos biaactivos que interferem com a actividade da oncoproteina associada à mem brana e / ou a 1 ocalia ada c i top 1 asmi.camen te,, Por exemp 1 o, as oncoproteínas Ras e Src estimulam a expressão do gene dependente de Fos nas células eucariotas „ Ensaiando um composto bioactivo que altera um marcador dessa expressão. 35 1 1 5

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I 63908 MGH .....0471.,,0 (00786/103001) podem ser identificados compostos bioactivos que inibem a estimulação por Ras ou Src da transcrição dependendo ds Fos„

De igual modo, os métodos da invenção podem ser utilizados para identicar inibidores de proteina--quiriases, por exemplo quando,, de acordo com os métodos da invenção, a actividade de tais quinasss acaba por alterar a transcrição ds um gene marcador» A sequência ds ADN da proteína de fusão e/ou gene alvo,, pode ser construída quimicamente se não for desejável utilizar como fonte da informação genética um dons do genoma ou ARNm» Métodos de sintetizar quimicamente ADN são bem conhecidos na arte e podem ser postos em prática por um vendedor camercia1.

Para expressar as construções recombinantes de fusão da invenção são necessários sinais de transcrição e de tradução que sejam reconhecidos pelo hospedeiro» Uma proteina ds fusão donada ou uma de codificação de oncoproteína donada, obtida mediante os métodos acima mencionados,, pode ser ligada operativamente a sequências que controlam a expressão por transcrição num vector de expressão,, e introduzida, por exemplo por transformação, numa célula hospedeira a fim de produzir as proteínas de fusão recombinantes ou oneoproteinas de fusão, ou seus derivados funcionais, para uso nos métodos da invenção»

Os sinais reguladores da iniciação da transcrição podem ser seleccionados para permitirem a repressão ou a activação da expressão da construção de fusão ds forma que seja possível, se desejável, modular a expressão da construção de fusão» São de interesse os sinais reguladores sensíveis á temperatura, de forma a que por variação da temperatura, a expressão pode ser ou reprimida 'ou activada, ou os que são regulados quimicamente, por exemplo, pela adição de um metabolito ou análogo de metanollio, ao meio de crescimento» 35 15

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Como alternativa a construção de fusão pode ser expressa constitutívamsnte na célula hospedeira. Quando as sequ@nci.as nativas de controlo não actuam satisfatóriamente na célula hospedeira é, então, possível substituir as sequ@nci.as funcionais na célula hospedeira. A expressão das construções de fusão em hospedeiros diferentes pode resultar em diferentes modificações pós.....tradução,, as quais podem alterar as propriedades das proteínas por estas construções„ é necessário exprimir as proteínas num hospedeiro em que a capacidade da proteína para manter a sua função biológica não é impedida» A expressão das proteínas em hospedeiros levedura é conseguida usando,, prsferencialmente;, sinais reguladores de levedura» 0s vectores da invenção podem conter elementos reguladores ligados operativamente, tais como as sequ@nci.as intensificadoras (sequtncias activadoras a montante, em levedura) ou elementos de ADN que conferem a um gene ligado operativamente expressão específica da espécie, do tecido ou do tipo de célula» Em geral, os vectores de expressão contendo sequências reguladoras de transcrição, tais como sequ@ncias promotoras e sequências c:!e terminação de transcrição, são utilizados em relação com um hospedeiro» Estas sequências facilitam a transcrição eficaz de um fragmento do gene que a elas está ligado opsrativamente,, Para além disso, os vectores de expressão contêm normalments elementos discretos de ADN tais como, por exemplo, (a) uma origem de replicação que permite uma replicação autónoma do vector, ou, elementos que promovem, de forma estável, a inserção do vector no cromossoma do hospedeiro, e, (b) genes específicos que são capazes de proporcionar uma selecção fsnótipica em células transformadas» 0s vectores eucariotas de expressão também podem conter elementos que lhes permitam a sua manutenção em hospedeiros procariotass tais vectores são conhecidos por vectores vaivém,, 35 24 15

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A nature2a exacta das zonas de regulação necessárias para a expressão do gene variam entre as espécies ou tipos de células e Há muitos sistemas vectores de expressão apropriadc^s disponíveis comercialmente» Numa concretização altamente preferida, as leveduras são utilizadas como células hospedeiras» Os elementos necessários para a expressão por transcrição de um gene em levedura foram revistos recentemente (STR.UHL, L. „ An »Rev,, Biochem „ 58 51051.....1077 (.1989) , aqui incorporado para referencia)» Na levedura a maior parte dos promotores contém 3 elementos de ADN básicos2 (1) uma sequência activadora a montante (VAS) ;í (2) uma elemento TATAi/ e, (3) um elemento (15 de iniciação,, Alguns promotores também confim elementos operadores» Numa outra concretização as células de mamíferos são utilizadas como células hospedeiras,, Uma grande variedade de sinais reguladores de transcrição e de tradução podem ser derivados para a expressão de proteínas nas células de mamíferos,, muito em especial das ssquincias genómicas de vírus que infectam as células sucariotas» Logo que o vector ou a sequlncia da ADN que contim a(s) construções é preparado para expressão, a(s) construçãos de ADN é introduzida na célula hospedeira apropriada por qualquer um dos meios adequados, por exemplo por transfarmação« Depois da introdução do vector, as células receptoras são desenvolvidas num meio selectivo, o qual executa a selecção em termos do crescimento das células que contém o vector» A expressão da(s) sequincia(s) genética(s) clortada(s) resulta na produção da proteína de fusão ou na produção de um fragmento deste péptido» Esta expressão pode ocorrer de forma contínua nas células transformadas, ou induzida por agentes exógenos (supra)„ Se a sequincia de ADN de codificação da proteína de fusão e de um promotor ligado operativamente são introduzidos numa célula hospedeira recsptora como uma molécula não replicante de ADN (ou de ARN), que pode ser uma 35 15

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molécula linear ou, preferencialmente, uma molécula circular fechada., cova lente, incapaz ds replicação autónoma, a expressão da proteína de fusão pode ocorrer mediante a expressão transitória da sequência introduzida., D e ρ referência, p o dem se r c οπ st ruidos transformantes genéticamente estáveis mediante a integração do ADN para a proteína de fusão no cromossoma do hospedeiro,, Tal integração pode ocorrer sem auxílio ou pode depender de um vector que se insere funcionalemente no cromossoma do hospedeiro,, por exemplo com vectores retrovirais, transposões ou outros elementos ds ADN que promovem a integração de sequências de ADN em cromossomas. Células que tenham sido transioraadas com os vectores de ADN para a proteína de fusão da invenção são também seleccionacias pela introdução de um ou ma.is marcadores que permitam a selecção das células hospedeiras que contenham o vector (por exemplo, o marcador pode fornecer um enzima sintético de aminoácidos ou resistência a biocidos, e.g», resistência a antibióticos tais como o 6418,, ou a metais pesados tais como o cobre, ou semelhantes,, Nas concretizações preferidas, a Saccharomyces cersvisiae é o hospedeiro levedura preferido e as células CV-1 ou NIH3T3 são as células hospedeiras de mamíferos preferidas„ Os métodos da invenção proporcionam uma forma rápida, fiável e económica de pesquisar e classificar os compostos como inibidores da actividade das oncoproteínas. Os métodos da invenção são aplicáveis para a pesquisa industrial, em grande escala, de muitos compostos ou preparações quanto à actividade inihidora das oncoproteínas. Para além disso, os métodos da invenção permitem a pesquisa de quaisquer compostos puros, misturas de compostos ou misturas de preparações, de forma a identificar os efeitos aditivos, sinergéticos ou pre.judici.as de tais composições,, Os métodos da invenção são também úteis para a identificação da presença de compostos bioactivos em 35 10 15

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63908 MSH .....0471,,0 (00786/103001} extractos sm bruta,, e cama ensaios compostas bioactivos daí resultantes,, Os métodos da invenção também sSo utels para a avaliação da estabilidade dos « compostos bioactivos acima identificadas e, especial mente,, para a avaliaçSo da eficiência das várias preparaçSes,,

Os exemplos seguintes descrevem adicionalmente os materiais s métodos utilizados na realização da invenção» Os exemplos não pretendem de qualquer forma limitar o objecto da invenção,,

EXEMPLOS

Seguem-se exemplos de ensaios oncoproteínas de fusão utilizáveis na invenção» Estes exemplos são fornecidos para ilustrar e não limitar a invenção» EXEMPLO 1

Construção de genes de fusão s ds ancoqenes de fusão a ··' Seneral idade A construção de genes de fusão LexA está descrita em Lech,, !<„,, et al,, Cell 52::179-184,, 1988;! Brsnt e Ptashne, Cell 43 5 729,19555:1 s na patente U«S» 4 833 0550 de

Brent, aqui incorporados para referência» Também são descritos na patente U.S, 4 833 080* de Brent,, os vectores plasmídicos que podem ser utilizados para construir, na generalidade, genes de fusão LexA (e„ g,, pEBSOO) vectores de expressão da levedura Ce„ g,, pAAHS) ,, s plssmideos alvo (ou transmissores) da levedura que incluem genes alvo de levedura transportando operadores LexA a montante» b ····· L©xA-Sal4 A construção de genes de fusão LexA~Sa.t4 está descrita na patente L!»S„ 4 833 080 de Brent» c ™ LexA.....vriyc 0 plasmideo MC38,, contendo a totalidade de HC29 de ave do vírus ds mielocistomatose ds ave,, (Reddy, E„ P. et al», Froc.Natl.Acad.Sci. USA 80::2500-2504,, 1983:; disponível na American Type Cuiture Callection , Rockville, MD, Número de Acesso da ATCC 41007) foi cortado num local 35 1 1 5

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Sspl a jusante do gene virai aaa-mvc. A mistura foi tratada com ADN-Xigase de 74 na presença de ligadorss Hind III e a mistura de ligação foi tratada com PstI s HindIII» 0 pedaço de PstI-"Hindi 11 que continha a maior parte do gene myc foi isolado e inserido em pIJClS sm cortado com PstI.....Hindi II para gerar o pI<A58« Numa série de construçSes separadas,, o pedaço BamHl-Xmnl de pRB480 (Brsnt,, R» st ai»,, Nature 312 51612-61.5,, 1984p patente LI8„ 4 S33 080,, de Brsnt) que codificava a porção do terminal amino de LezA,, foi ligado a um adaptador de cadeia dupla da saquincia

C6GGGAGCTGCA

GCCCCTCG e o fragmento dal resultante foi inserido sm pUC.1.9 cortado

com BamHI.....PstI para produzir o plasmideo ρΚΑ144„ A BamHI corta no gene da tetraciclina de prB430 s pBR322« 0 pedaço

Ba mH I.....PstI de LezA de ρΚΑ14, o pedaço PstI.....Hind 111 de v-rayc de pS<A58 ε o pedaço HindIII.....BamH 1 ds pBR322 foram ligados para gerar PKA210» 0 plasmideo ADM foi seleccionado em colónias bacterianas em placas LB contendo tetraciclina. Um destes plasmideos, pKA210,, contem os primeiros 87 codíles de LeXA, três codSes do fragmento adaptador e os eodíles 31 a 425 de v-mcy. 0 gene de fusão codifica uma proteína de 465 amxnoácidos cuja sequência através da junção de fusão é pro gly glu leu gin pro, em que pro é o aminoácido 87 de LezA e gin â aminoácido 51 da proteína nativa vMyc:,, Ests gene codifica uma proteína de fusão com uma massa molecular previsível de 51,000 Dal tons,.

Em alternativa, pode ser construída uma proteína da fusão LexA-vMyc, à qual falta o domínio de dimsrização (i. e„, faltam o seu domínio "hélice.....curva- hélice" e domínio de "fecho" de Isucina), Tal cosntrução foi produzida da seguinte forma,, 0 pKA513 (supra) foi digerido com BamHI e PstI (enzimas que clivam o pi<A58 dentro no seu "poli......ligador”) e uma série de 4 oligonuclaótidos sintéticos foi inserida nesta local para recriar a sequência completa (nativa) N.....terminal de vriyc,, 0 plasmideo daí resultante foi 35

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4 denominada BHvMyc. Um fragmenta de EcoRi-HlndII1„ contenda o poli.....ligador de pUClS e o gene LsxA-vMyc, foi sxcisado da BHvMyc s inserido numa estrutura Lex202PL digerida com EcoRI/HindIII (Ma e Ftashne, Cell 51 s 113, 1987? Ruden et al„ , Nature 350;: 250, 1991) p □ Lex202Pl á um plasmideo que contém os aminoácidos 1.....202 de LexA, incluindo a domínio de dimsrizaçlío de LexA,, 0 plasmideo resultante, denominado H202/cMyc, continha os aminoácidos 1.....202 de LexA enquadradas os aminoácidos 1-425 de vMyc Para executar a delecçêío do domínio de dimerização de Myc, o H202/vMcy foi digerido com Bali num único local correspondente ao aminoácido 362 da proteína Myc» Um poli--ligador contendo um codííío de paragens no "quadro" 3 (New England Biolabs ligador # 1.062, Beverly, MA) foi. inserido neste local para produzir um gene que codificava uma proteína truncada LexA.....vMycp a esta proteína faltavam os domínios de 11 hél ice-curva-hél ice" de Myc e de "fecho" de leucina de Myc» 0 plasmideo daqui resultante foi denominado H202/vMyc:&CNa levedura verificou-se que a proteína LexA..... vMyc codificada por H202/vMycAC activava as construções contendo o operador LexA mais fortemente do que as proteínas de fusão Myc que incluíam um dominio de dimerização» Em células de mamíferos a proteína truncada proporcionava um nível mensurável de actividads de Mycp nas construções de fusão de Myc que incluíam um dominio de dimerizaçSo nativo de Myc tal nSa se verificou» d ..... LexA-cHyc 0 plasmideo pCDEMS.3 (uma oferta de Adrian Hayday), contendo ADM de c—myc,, humano, foi digerido com SmaI e Bami-iI e um fragmento de 2300 pares de bases, incluindo os exões 2 e 3 do gene c-myc» foram ligados com o fragmento Sma 1 Bami-iI de pUC19, para gerar pc20» Este plasmideo foi então digerido parcialmente com PstI g um fragmento contendo todos os cadSes do gene c-mycexcepto os primeiros 38, foi isolada e ligado com pKA1035 cortado com 35 1 5

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FstI„ um plasmideo idêntico ao pKA144 com sxcepção de o local Stnal na estrutura pUC19 ter sido destruído por corte um local ΚρηI de sobreposição e cortando de novo para a parte sobreposta com ADN.....polimerase de T4. 0 plasmideo daí resultante,, ρVR103,, continha os primeiros 87 codftes de leXA„ três codSes fornecidos pelo fragmento adaptador e os codSes 39 a 440 de c-myc„ 0 gene de fusão codifica uma protsina de 492 aminoácidos cuja sequência através da junção de fusão ê pro giy glu leu gin pro, em que pro é o aminoácido 87 de LexA e gin é o aminoácido 39 da proteína nativa crlyc „ Este gene codifica uma proteína ds fusão com uma massa molecular-prevista de aproximadamente 54,,000 Dal tons,, 0 gene humano c.....myc está também disponível na American Type Culture Collection (NQ de Acesso na ATCC 39286)» s - LexA-vFos 0 plasmideo pFBJ-2 contém um pró-virus FBJ-ijusv num fragmento de 5800 bp de Hindi II inserido no local de Hind111 de pBR322 (Van Beverens,, C. st al,, ,, Ce 11 32 s 1241.....1255, 1983 § Curran ,, T» et al „ vi rol» 116 ã 221-236 ,, 1982:! Curran, T„ et al., J„ Vi rol. 42::114--122,, 1982),, Este plasmideo foi cortado com Eaq1 e enchido na 5' parte protuherante com Klenow» 0 plasmideo foi então cortado com HindI11 e foi isolado um fragmento 3600 bp que continha a porção do terminal carhoxido da proteína de v-fos Este pedaço de v-fos ds HindIII EaqI (cheio) foi ligada a um pedaço de lexfi de BamHI-XmnI de pRB4S0 (abaixo) e ao fragmento de Hindi I I-Baml-il.....Xmnl da estrutura de pBR322» As E» Coli contendo esta construção foram identificados pela sua resistência è tetraciclina» Um plasmideo típico resultante, pi<fti95,, continha os primeiros 87 codSes de lexfi fundidos directamente com os codoes 23-381 de v-fos„ Este gene de fusão codifica uma proteína de 446 aminoácidos,, cuja sequência através da junção de fusão é pro ala q ly, em que pro é o aminoácido 87 de LexA a o primeiro ala é o aminoácido 23 do produto de v.....fos,, 0 gene v-fos também pode ;o 35 1 5

10 I 15

Mod. 71 -20.000 βκ.- 90/08 20

25 30 63908 MGH -0471»0 (00736/103001)

ser obtido na American Type Culture Collection (NS de Acesso nas ATCC 41040) f ..... LexA-cFos 0 plasmideo FMC5A contém o ADc de cFos ds ratinho em p8EMi., Este plasmideo foi primeiro cortado com Eag1 e a parte protuberante em 5' foi cheia com Klsnow. Em seguidafoi cortado com 1-1 ind111 s um fragmento de 1900 bp da Hindi I I-Eaql (cheio) contendo o fragmento do terminal carboxido do gene c-fos, foi ligado ao fragmento Bami-il—XmnI de pRB481FliP e ao fragmento de HindIII-BamHI de pEB481„0 pRB481 contém um gene LexA terminado por HindIII. incluindo o seu promotor de E„ Co1i no plasmideo pi4-8 (Brent e Ptashne CelI 43»729, 1985 p patente U.S.. 4 833 080 de Brent). Nesta construção o pRB480 (U»S„ 4 833 080 de Brent) poderia ter sido utilizado em vez do pEB481» 0 pRB481FLIP foi construído cortando o pEB48í com HindIII e isolando um plasmideo cujo fragmento de LexA terminado por HindiiI estava na orientação oposta» As E» Coli que continham um gene de fusão LexA cFos foram identificados pela sua resistência à tetracic 1 ina« 0 plasmideo daí resultante., pVRè, continha os primeiros 87 aminoâcidos ds LexA fundidos directamente com os codões 23 a 380 de c-fos. 0 gene de fusão codifica uma proteína de 445 aminoâcidos,. cuja sequência através da junção de fusão é pro ala gly, em que pro é o aminoácida 87 de LexA e ala é o aminoâcido 23 do produto de c-fos. Este gene codifica uma proteína de fusão com uma massa molecular estimada ds aproximadamente 49,000 Dal tons» 0 gene c-fos de ratinho também pode ser obtido na American Type Culture Collsction (MS de Acesso na ATCC 41041)„ g - LexA-vJun 0 plasmideo pLexA-vJun está descrito em Struhl, Nature 332s 649.. 1988.. 0 gene v-jun pode ser obtido na American Type Culture Collection (NS de Acesso na ATCC 63026)» 35 .# 4 15

15

Mod. 71 - 20.000 ex. 20

25 30 63908 ΗΒΗ .....0471,,0 (00786/1030015

,·?7»092 : f? EXEMPLO 2 Plasmideos de Levedura Na genaraI idade,. oe plasmideos alvo (ou transmissores) transportavam o gene URA3 + ,, um replicador de 2 um e elementos promotores tal como está descrito na patente U»S. 4 833 0S0 de Brent, aqui incorporada para referência„ rara expressar na levedura as construções de fusão LsxA-Hyc e LexA-Fos,, inseriram-se genes ds fusão terminados por Hind.UI no local Hindi 11 de pAAH5„ G pAAHS continha o gene LEUS^ ,, uma porção do plasmideo de 2 ,um a fim de permitir a replicaçâo na levedura,, e um fragmento AON contendo o promotor e o terminador da transcrição que flanquia o local de Hindi 11 de ADN1 (Ammerer, G„ ,, Meth,, Emyzmol. 1015 192-210,, 1983§ Brent, U»S. 4 833 080},, Outros plasmideos de expressão da levedura podem ser utilizados em vez do pAAHS; muitos estão descritos em Cloning Vectors,, ed „ Powels et al. Elsevier,, 1987» Em al ternativa,, a Lexfí.....vFos pode ser expressa a partir dos plasmideos pkLÍ19DMS ou pAF3. 0 pkL1190NS foi construindo inserindo o fragmento de BamHI ,, contendo o promotor de ADH1, o gene de LexA-vFos © o terminador de ADH1 do plasmideo pAAH5-L.exA.....vFos (acima),, no p3E3S8N3„ 0 p5E358NS foi obtido cortando pUNIO (Elledga et al», Bene 70 5 303,,1988) com sAlL·, dig erindo o ADN protuberants com Nucleass de Feijão tíe Hungo e r©ligando e destruindo assim o local,, 0 pAF3 foi elaborado em 2 passos,, Primeiroj, um fragmento terminado por BamHI/EcoRI de pADES (White, J» H,, ,, et al „ ,, Nature 315s350-352 (1985)) que continha o gene ADESs foi inserido na estrutura de pSE358NB terminada por BamHI/EcorI a fim de gerar pA8 7,, Em seguida, o fragmento terminado por BamHI,, contendo a LexA-vFos e o promotor e terminador de ADHi (acima),, foram inseridos em pA3--7, produzindo o AF3„ 35 15

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90108 20

25 30 63908 MGH --0471,,0 (00736/103001)

A LexA-vJun foi swprsssa e actividade foi ensaiada como descrito em Struhl 332 s 649,, 1938),, EXEMPLO 3 Plasmideos dg mamíferos a sua (Nafcure 0s plasmideos de mamíferos,, alvo,, (ou plasmideos transmissores5 aqui utilizados estão descritos em SodoiASski,, P„- J „ , et al „ Science 24is312.....816,, 1988 f aqui incorporados para rafertncia. Estes vectores contfm o promotor' ds p-globina fundida com o gene da cloranfenlcol- .....acetiItransferase,. Um alvo,, 0BC0,, não tinha um operador LsxA a montantes o outro,, XBC0 continha uns único operador LexA 125 bp a montante do ponto ds inicio da transcrição» Outros plasmideos alvo podam ser construídos colocando um ou mais operadores LsxA (ver a Patente U.S. 4 833 080 de Brent) 1 ig-siramenta o montante ds um promotor ds mamífero,, cuja actividade pode ser ensaiada,, Os plasmideos de expressão que codificam as oncoproteínas de fusão foram construídos inserindo,, respectivamente,, LskA-vFos terminado por HindIII ou o gene LexA-vMyc de pKA195 (Lech, li „ st al., Cel 1 52 s 179-184 ¢192)8)) ou Η202/νΜνοΔ C no vsctor de expressão de mamífero, p6R (Godowski, P„ J ,, et al ,, ,, Science 241 s 812816( 1988) } ., A síri tese das proteínas por meio destes plasmideos foi dirigida pelo promotor ds RSv,. Um número ds vectores ds expressão,, de mamíferos al ternativos,, está descrito em Cloning Vectors (supra),,

Para a expressão de LexA.....vJun nas cálulas de mamíferos,, o pLsxA.....vJun (supra) foi cortado num 1 oc a I d e EcoR ϊ ,, ún i c o,, a j usan te d a sequ®n c i a Le x A—v J un ,, ligado a um adaptador EcoRl.....Hind 111 e clivado com Hind.UI. 0 fragmento de LexA.....vJun terminado por HindIII foi primeiro inserido no local de HindiII contrária ds pi4-8 (acima) para gerar pKL18146 e,, depois, foi inserido no local de Hind 111 da p6R„ 35 15

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

25 30 63908 MGH --0471,,0 (00786/103001)

ÍXIMPLQ-4. PrPCedimen tos Expsrimentalsa« Desenvolvimento e transformação de cé 1 u3.as bacterianas. As bactérias foram desenvolvidas e f ran s f o r rnad as u t i 1 i z an d o t éc: n i c as c omun s ( Ausu be 3.F „ M „ et al., Current Protocols in Molecular Biology,, New York = Green Pub 1 ishing Assoe iates (1937) e Mi 11 er,, J „ Eper imen ts in Molecular G,enetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,, 19723» As estirpes contendo o plasmideo foram propagadas em meio LB contendo 100 μα/μϊ de carbancilina. Uti1isaram-se RB926 (hsdR thiA endA) e JM101 4-4* O ( sunE thiA Δ( 1 ac-proAB 3 /F' traDSò proA proB lac 7- lac Z L Ml5)3 como bactérias hospedeiras para a construção de plasmideo de ADN„ b „ T r a ha 1 ho M i c r o b i o 1 óg á. c o em 1 e ved u ra As leveduras foram desenvolvidas num meio YEP suplementado com 2% de glucose,, Foram executadas as transformaçSes conforme descrito em Lech, K„ st al,, ,, Ce 11 52 5 179--184 (1988) « os plasmideos foram mantidos em levedura desenvolvendo as células em meio mínimo que continha 2% de glucose mas ao qual faltava o suplemento nutritivo codificado para o marcador seleccionável do plasmideo (Shermsn., F,, ,, et al „ ,, Msthods in Yeast Genstics,, Cold Spring Harbor,, New York,, (1983)),, os genes,, sob o controlo do promotor BALiO, foram induzidos pelo desenvolvimento de células hospedeiras durante 36 horas num meio que continha 2% de ga lac tose,, Utilizam-se DBU745 \a ura5 3.eu5) foi, na maioria das experiências em levedura, como hospedeiro (patente U.3. 4 833 080 de Brent) ,, Os meios sólido e liquido utilizados para este efeito foram o meio SD (ao qual faltava uracilo) transformado a pH 7,,0,, pela adição de NanHPO^ e KH^ PO^para uma .concentração final de 70mM„ fts fontes de carbono foram adicionadas até uma concentração final de 2% para cada uma „

35

63908 MGH --0471,.0 (00786/103001) / ç

1 5 10 i 15 c. Ensaios da actividade de β- galactosidase

Os ensaios de β-galactosidsss foram efsctuados tal como está descrito em Yocum, R„ R,, st al . ,, Moí. Cell» Biol » 4 s 198 5-.1998 (1984 5;; ou., em al terna ti va, foram efestuados em células desenvolvidas em meio sólido {Lech, K» "Gene Activatiop by ADN Bound Fos and Myc Proteins", Tese para Ph» D« , Harvard University,, 1990),, excepto que as células a serem ensaiadas foram desenvolvidas em meio sólido seiestivo, em vez de em meio líquido selectivo,, As unidades de β.....qalactosidads foram calculadas através da fórmula Unidades=1000 x /volume da célula (ml) x tempo de reacção (min) x D06tS£JJ dDesenvolvimento e " transi1ecção das c á 1 u 1 as ds mam í fsro,,

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

25 30 Células cv.....1 de rim de macaco (MS de Acesso na ATCC CCL.70) foram desenvolvidas num meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro de vitelo fetal e separado 24 horas antes da transf seção,. As transfecçSes transitórias foram real içadas de acordo com um método de precipitação de fosfato de cálcio (Godowski,, P,, J,, at al„,, Science,, 241 s 812.....816 (1988) ) . Todas as transfecçfíes foram repetidas pelo menos tris vezes em duplicado a fim de assegurar a reproductibi 1 idade dos resultados» Tipicamente,, 10 a.íq do plasmidso de expressão da proteína de fusão e 2 /..to do pla.smi.dao alvo foram introduzidos nas células juntamsnte com Ξ,ι 5 jug de um plasmideo de expressão ds uma hormona de crescimento humano (pXBHS, Selden, R„ F, st al „ , Slol „ Csll Biol» 6£3173-3179 (1986)); Ausubsl, F„ H„ st al „ Current Protocols in Molecular Biology, New YorknGreen Publishinq Associates (1987)),, como um controlo interno da eficiincia da transfecçSo.Nestas experiincias,, onde a oncoproteina nuclear (e.g«, Fos, Myc,, ou Jun) é modulada pela actividade de uma proteína citoplasmática ou oncoproteina associada ã membrana (s.g„ ras ou src:) , também se incluíram, na mistura de transfecção, 10 Dg de plasmideo modulador» A quantidade 35 > 27. 1992 63908 HSH .....0471.0 (00786/103001) 1 5

/.> 4 ~ total de ADN foi levada a 25 jug com o plasmideo de controlo., pUC18» 0 ADN a ser transfectado foi. preparado mediante duas centrifugações sucessivas em gradiente de cloreto de césio (lianiatisj Tet ah, Molecular Cloning ; h Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York ¢1982)). A quantidade e a pureza dos ADM foram determinadas, por eleotroforese em gel de agarose, antes e depois de digestão com enzimas ds restrição. A expressão da hormona de crescimento humano variou menos do que 15% em relação à média., durante uma experiência e entre experiências,, indicando que a eficácia da transfecção se manteve constante e que as; células; que expressaram as oncoproteínas eram saudáveis. 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

25 30 A linha de fibroblastosderatiino NIH3T3 (N2 de Acesso na ATOO CRL 6442) foi desenvolvida num meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), com 10% de soro de vitelo fetal utilizando procedimentos comuns. 4s transi seções foram efectuadas utilizando métodos; comuns de precipitação de cálcio (ver., e. g„ Current Protocols in Molecular Biology, supra) .. Genéricamente, as transfecções sfectuarám.....se utilizando 10 jug do plasmideo contendo LexA····· gene de fusão, 2 pg do plasmideo alvo., 2.,5 ;ug de XÍ3HS e 10 jug de ADM de esperma de salmão submetido a longeneização (como ADN portador ) por cada placa de células, de 10 ^ Os transfectantes estáveis foram produzidos mediante técnicas comuns (ver e. g„ Current Protocols in Molecular Biology,, ed. Ausubel et al„, New York,, 19E37) , utilizando os plasmideos acima referidos e Ξ .ug do plasmideo que confere resistência á neomicina (Southern e Berg,, J. Mol„ Appl Benst. is 327,, 1932),, por exemplo, o plasmideo pMAMnso (d i s ρ o n i v e 1 e in C1 o n t e c h, Paio Alto, C A) . e. Ensaias de CAI Foram preparados extractos e realizadas ensaios de CAT como está descrito em Ausubel,, F. M« et al „ Current Protocols in Molecular Biology, New Yorks Breen Publishing Associates(1937))„ Os extractos das proteínas 35

63908 MGH .....0471,,0 (00786/1030015

1 5

•foram diluídos de forma a que a actividade de CAT continuasse na zona linear da actividade do enzima em relação à quantidade de sxtracto da proteína,, Os valores de CAI foram determinados excisando os pontos de C cloranfenicol de uma placa de TLC e contando os» fí percentagem de conversão foi. calculada dividindo o número de contagens nas partes acetiladas pelo total das contagens nas pontas acetiladas s não acetiladas e deduzindo a partir este número a percentagem de fundo de conversão obtida numa reacção paralela simulada,, sem o extracto da proteína,, EXEMPLO 5 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

25 30

Identificação de um inibidor de vFos s/ou vriyc em células de levsdura Aís células hospedeiras de levedura são transformadas com os plasmideos que expressam uma oncoprotsina de fusão LsxA-vFos (hospedeiro “a"),, uma oncoproteina de fusão LexA-vMyc (hospedeiro ”b,!5,, ou uma proteína de fusão LexA-Gal4 (hospedeiro !!e!i),, como acima foi descrito,, Para além disto todos as tr@s estirpes de levedura são co-transformadas com um plasmideo alvo (e„ g „ 1S40 ou 10Ξ7ji patente U»S. 4 S33 0130 de Brent},, que contém a sequência de codificação de is-~galactosidase ligada operai.ivamente a um operador LsxA, como acima está descrito» Uma camada de cada uma das estirpes das levedura á espalhada em placas de água contendo x.....Sal no meio,, Um pequeno disco de filtro contendo os compostos U,, X,, Y ou Z é colocado nas camadas,, Deixam-se desenvolver as leveduras e as placas são monitorizadas quanto ao crescimento de colónias e cor do colónias,, por observação visual,, Os resultados típicos de tal sxperifncia são m os t rad os n a Tabela 1„ 35 63908 ΗΒΗ -0471.. 0 ί00780/103001)

1 TABELA 1

Identificação de inibidores das Dneoproteinas 5

15 Μ o d. 71 · 20.000 ex. - 90/08 20

Compostos Levedura Proteína Desenvolvimento Cor do

Reguladora da Colónia ensaio í-l-gal com X-gal

25 a LeKA-vFos ··!·· Azul b LexA····· vMyc Azul c LexA.....Gal4 -i- Azul a LexA.....vFos -1- Azul ta LsxA-vMyc Branco ο- LexA-í3al4 ··!·· Branco ά LexA.....vFos ul· Azul b LexA.....vMyc JL. Branco c LexA.....Gal4 + Azul a LexA-vFos ·!- Branco b LexA-vMyc -1- Azul c LexA.....Í3al4 Azul

Os resultados da tabela anterior indicam que nenhum dos compostos testados inibe o desenvolvimento das estirpes de levedura» Só o composto Z inibe a actividade de vFos sem inibir a de í3ai.4 s só o composto Y inibe a actividade de vMyc sem inibir a de 8aL4„ 0 composto X inibe tanto a actividade de vMyc como a de Gat4., sugerindo que não é especifico para a oncoproteina» 0 composto W não inibe a transcrição induzida pela oncoproteina e a transcrição 38 15 10 15

Mod. 71 - 20.000 sx. - 90/08 20

25 30 63908 HGH --0471,.0 (00786/103001)

ii

induzida por 8 a 14, sugerindo não ser um inibidor de transcrição destas proteínas. A partir destes resultados,, os compostos Z e Y seriam seleccionadas para investigação posteriores, tal como efeitos dose/concentração e estudos in_ vivo em animais portadores de tumores,, Para além disso, não é necessário que um composto elimine a actividade de B-galactosidass para ser ú t. i 1 p a r a a i n v e n ção,, Um composto que reduz o nivel de actividade da proteína de tipo selvagem (i„ e„, nivel de activação do gene) à também seleccionado para posterior investigação,, Tais compostos são identificados por produzirem um resultado azul claro (i„ e„ mais claro que a cor azul do tipo selvagem) aquando do contacto com as células hospedeiras ds levedura,, EXEMPLO 6 Identificação ds um inibidor de vFos ou vMvc £10.......célMlas de . ma,mi fero Para identificar inifcidores que interfiram com a activação da transcrição mediada por Fos ou mediada por Myc em células de mamíferos, as células CV-1 são transfectadas com 2 plasmideos» Um dos plasmideos é um vector de expressão que dirige a síntese de uma proteína da a partir da LTR do RSM« Os plasmideos ds expressão da LsxA..... vFos e cie LexA-vMyc foram descritos acima 5 devido à activação por LexA-vMyc das células de mamífero,, Cv--1 s N1H3T3, só poder ser medida utilizando a proteína de fusão,, truncada,, 2Q2vMycL C (ver acima) 5 este vector é preferido para utilização no ensaio descrito neste exemplo,, 0 segundo plasmideo é um "alvo" que é portador de um operador LsxA a montante de um promotor de (3-globina fundido com o gene ds cloranfenicol.....aceti 1 transfsrase (CAT) (ver acima),, A acfciva- ção do gene é ensaiada medindo a actividade ds CAT normalizada para quantidade total da proteína celular,, A activação do gene pode ser ensaiada utilizando transfectantes transitórios ou estáveis (como descrito 35 i 15

15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/06 20

25 30 63903 MBH .....0471.0 (00786/1030015

acima} Compostos que inibem a activaçlo por Lshh~-vFos ou LexA.....vMyc, mas que nSo inibem a activaçSo por LexA.....Bal4, sSo sslsccionadas como inibidores específicos da aetividade de Fos ou de Myc« Num exemplo particular, slo construídas 3 linhas de hospedeiros de NIH3T3s o hospedeiro "a" expressando uma oncoproteina de fusSo LexA-vFos ij o hospedeiro "b" expressando uma oncoproteina de fusSío LexA-vMyc (sem domínio de dimerizaçíiío de Myc·) § e o hospedeiro "c" expressando uma proteína de fusSo LsxA—Gal4j todas as linhas de células contêm uma construção que possui, o operador LexA a montante a um promotor de (3.....glofeina fundido com o gene de c 1 o ran f en i co 1 "--ace ti 11rans f e rase (CAT) »

TABELA I den t i f icaçlçLJÍs_Jjiit3idorei^._das_Jjj^çMri^tMD.#S-

Compostos Hospedeiro Proteína Desenvolvimento Aetividade NIH3T3 Reguladora Celular de CAT a LexA-vFas + Sim b LexA-~vMyc£C Sim LaxA-Gai# ..1.. Sim a LexA.....vF;'os + Sim b LexA-vMycÃC *· NSo c LexA-'“Gal4 ··!·· NSo fcont.5

4V 35 15

15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

25 30 63908 MGH -0471.0 (00786/103001)

LexA-vFas LexA.....vMycáC L.exA--8al4

Sim Não Sim

LexA-vFos + Mão LexA.....vrlyc/jC ·*· Sim LexA.....8a14 + Sim

Os resultados da tabela anterior indicam que nenhum dos compostos testados inibe o crescimento de quaisquer das células hospedeiras. Só o composto Z inibe a actividade de vFos sem inibir a de Sal4,, e só o composto Y inibe a actividade de vHyc sem inibir a de Gal4„ 0 composto X inibe tanto a de actividade de vHyc como a de 8al4, sugerindo não ser específico para a oncoproteína. 0 composto U! não inibe a transcrição induzida por onc o proteínas ou a transcrição induzida por 8a14, sujerindo que o composto W não é um infhidar destas proteínas. A partir destes resultados. os componentes Z e Y seriam se 3. ecc .tonados para posterior investigação , tais como efeitos dose/concentração s estudos l.n vivo em animais portadores de tumores. Como exposto atrás, um composto não necessita de eliminar a actividade de CAT piara ser considerado útil à invenção. Um composto que reduza o nivel de activaçSo da CAT pela oncoproteína (ie. para baixo do tipo selvagem) também é seleccionado para posterior 1 n ves t i gaç ão c omo uma tera pí?utic a an t i -c anc ro . Todas as referencias aqui citadas estão incorporadas para refarfncis.. Tendo descrito na totalidade a invenção será entendido pelos peritos na arte que o âmbito da invenção poderá abranger um vasto equivalente leque de

35 5

6390S ΗΒΗ --0471,,0 (007SÓ/103001) condições,, parâmetros s congéneres,, sem afsctar o espirito ou âmbito da'invenção ou qualquer concretização dai resultante»

Lis!: ?7 JftfiL 1992 10

J

THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION 15 1

Mod. 71 20.000 ex. 20

D

<0NIZ PEREfítA Vascçj téiie ' 1Í0Õ t(Sis04 Ãdjunto c?o AOPí £, Arco da Conceição, 3-1

I 25 30 35

Claims (3)

1. 5 S <! 63908 ΗΒΗ .....0471,,0 í00786/103001} = R E I V I N D I C A ç O E S =

   15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

   25 30 2i Método para testar a capacidade de compostas inibidores de oncaproteina caracterizado pors a) proporcionar uma primeira célula hospedeira que contém um gene transmissor ligado de modo operável a um local da ligação de DMA e que contém um gane de fusão de oncoproteina que expressa uma fusão de oncoproteina capaz ds ligar o referido local da ligação de DMA em que a expressão do gene de informação é medida pela fusão da oncaproteina ligada ao DMA]; (o) ρrορorcionar uma segunda célu1a hospedeira que contém um gene de informação ligado de modo operável a um local de ligação de DMA e que contém um gene de fusão de proteína que expressa uma fusão de proteína capaz de ligar o local de ligação de DMA em que a expressão do gene transmissor é conseguida pela fusão da proteína ligada ao DMA;; (c) contactar a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira com os referidos compostosp e (d) testar a expressão do gene transmissor na primeira célula hospedeira sendo uma alteração maior, na expressão do gene transmissor na primeira célula do que na segunda célula·! indicativo ds compostas inibidores da actividade da oncoproteina. 3â~„ Processo de acordo com as reivindicaçSes 1 ou 2 caracterizado por a célula hospedeira ser seleccionada de entre o grupo que consiste em levedura ou c é 1 u las a n i ma i s,, 4ã“ Processo ds acordo com a reivindicação 3,, caracterizado por a célula hospedeira ser levedura,, 5â~ Processo de acordo com a reivindicação 4,, caracterizado por a levedura ser Saccharomyces ce revi s i ae„ 44 35 10 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 63908 ΗΘΗ .....0471.,0 (00730/1030Q1)

   6§~ Processo de acordo com a reivindicação 3., caracterizado por a célula animal cultivada ser uma célula de mamífera cultivada,, 7§..... Processo de acordo com a reivindicação 6» caracterizado por a célula animal cultivada ser uma célula CV-i de rim de macaco ou uma célula N1H 313, Si..... Processo de acordo com as reivindicações i ou 2,, caracterizado por a expressão do gene transmissor induzir uma alteração no fsnotipo da célula hospedeira ,. 9!····· Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a expressão do gene transmissor ser testado como actividade de cloranfenicol aceti1transferase„ 101..... Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2;, caracterizado por a expressão do gene transmissor ser testado como actividade de LEU2„ iii..... Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a expressão do gene transmissor ser testado como actividade de N-galactosidade» 121-··· Processo de acordo com a reivindicação 11,, caracterizado por a alteração no feno tipo ser detectada por inspecção visual de uma cultura das células hospítálfèi ras ,,
2. 131- Processo da acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o local de ligação de ser um operador LexA,, 141“ Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a fusão da oncoproteina compreender um dominio de ligação de £DN' LexA.
3. 151- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou Ξ5 caracterizado por a fusão da oncoproteina compreender um domínio de activação t r a n s c r i c i o n a 1 de uma o n c o pi'·· o t s í n a n u c 1 e a r „ 45- 35 1 63908 HG!··! .....0471,,0 (00786/103001) 16â-~ Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteriçado por a oncoprotsína nuclear ser a proteína Fos, 5 17â- Processo de acordo com a reivindicação 15,, caracterizado por a oncoproteína nuclear ser a proteína Myc · 18â..... Processo de acordo com a reivindicação 17P caracterisado por a proteína Myc carecer de um domínio de dimerizaçlo» 10 19§-·· Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caractericado por a expressão do gene transmissor ser também dependente da actividade de uma 15 oncoproteína citopiásmioasendo uma diminuição na expressão do gene de informação indicativo de uma substância que inibe a anco pro te1n a ci to pIãsmica. 20i"-proces5o de acordo com as reivindicações 1 ou 2,, caracterizado por a expressão do gene transmissor ser também dependente da actividade de uma 20 oncoproteína associada à membrana., sendo uma diminuição na presença do gene transmissor indicativo de uma substância que inibe a oncoproteína associada à membrana» • UUdi n m 1 25 Por THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION

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