PT94961B - Processo para a producao de proteases mutantes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Âmbito técnico

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de proteínas mutantes utilizando técnicas recombinantes de ADN. Mais especificamente, a invenção refere-se à produção eficaz de proteases de Bacillus de proteínas modificadas por engenharia genética utilizando uma estirpe hospedeira homóloga do Bacillus, na qual se eliminou a capacidade de produzir a protease não modificada correspondente.

Antecedentes da Invenção

Os Bacillus são muito utilizados para a produção de enzimas industrialmente importantes como por exemplo as of-amilases, proteases neutras e proteases alcalinas (ou serina), ver, por exemplo, Debabov: The industrial use of Ba1 f-

cilli em; The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, Nova Iorque, 1982.

As principais vantagens da utilização j dos Bacillus são as grandes quantidades de proteínas segregadas, a sua não produção de substâncias perigosas e a sua longa histó ria de utilização industrial segura. Várias espécies de Bacillus , foram assim aprovadas para a produção de proteínas destinadas a í

i| aplicações alimentares.

il

Paiva e col., Gene 19 (1982) 81-87, demonstraram a possibilidade da utilização de Bacillus subtilis : como hospedeiro de expressão para proteínas heterólogas, efec!i ~ ; tuando a expressão do gene de oC-amilase a partir de B. amyloliíj quefaciens em B. subtilis. Outras referências descrevendo a expressão de gene heterólogo em B. subtilis são, por exemplo, Fah nestock e Fisher, J. Bacteriol. 165 (1986) 796-804, que demonsi traram a expressão do gene da proteína A de Staphylococcus aureus; Schein e col., Biotechnology _4 (1986) 719-725, referiram i a expressão do interferão-o(2 humano; e Wang e col, Gene 69 (1988) ι 39-47, mostrando a expressão e secreção de factor-oC natriurético humano. Para assegurar a secreção adequada destas proteínas heterólogas as duas primeiras referências utilizaram a sequência de sinais de <XL-amilase e a última referência a sequência de sinal do gene de subtilicina de B. subtilis (aprE) fundida ao : gene a expressar.

' Um problema importante das estirpes de j Bacillus como hospedeiros de produção para proteínas recombinan ' tes é que eles produzem e segregam várias proteases que tendem a degradar as proteínas heterólogas produzidas. Ver, por exem! pio, Old e Primrose, Principies of Gene Manipulation 3§ ed.

: (1985) 289, Blackwell, Oxford.

No Pedido de Patente Internacional (PCT)

I

WO 89/04866 é referida a importância das proteases extra-celula res; cerca de 90% da actividade proteolítica é atribuída ã meta loprotease neutral (npr) e ã protease de serina (protease alca¹ lina = apr).

ί Foram propostas várias soluções para ul ‘i trapassar este problema de degradação.

J Kawadura e Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) ϊ

442-444, referiram um mutante duplo de B. subtilis deficiente em protease extracelular neutra e alcalina. Em primeiro lugar, tornou-se o B. subtilis DB100 numa protease negativa neutra por transferência das mutações de nprR2 e de nprE18 de B. subtilis ' NT18. Posteriormente, foi apagada por conversão de gene um fraçr |: mento de 178 bp contendo uma parte da apr.

I

i. Fahnestock e Fisher, Appl. Environ. Mi|| crobiol 53 (1987) 379-384, descrevem a construção de uma estirl!

pe negativa apr de B. subtilis partindo de uma estirpe negativa ' de npr. Eles utilizaram um vector plasmídio contendo o gene apr

I] | e introduziram o gene de gato (conferindo uma resistência ao í

cloroanfenicol) quer como desactivador quer como marcador selec íj cionável. Posteriormente, o gene de apr cromossómico foi substi.

i!

^i! tuído por esta construção.

; Sloma e col., J. Bacteriol. 170 (1988)

I

5557-5563, detectaram e sequenciaram um terceiro gene de protea se extra-celular (epr) de B. subtilis. O apagamento parcial des. te gene revelou que ele contribuía apenas marginalmente para a actividade extracelular da protease.

Numa inspecção mais pormenorizada das estirpes produzidas parece que nenhuma das estirpes de B. subtilis referenciadas era completamente isenta de actividade proteolítica extracelular. Assim, existe ainda uma necessidade de il estirpes aperfeiçoadas de Bacillus deficientes em protease, que i podem ser utilizadas na produção de proteínas heterólogas. Esta ; necessidade é ainda mais forte quando o objectivo é a expressão de proteases que sofreram mutação.

Em várias publicações ê descrita a produção de proteases mutantes utilizando estirpes hospedeiras de i! „

Bacillus subtilis que sao incapazes de expressar o gene de protease de tipo natural, evitando assim misturas de protease mutantes e de tipo natural.

Na publicação EP-A-0246678 (o teor deste pedido corresponde ao documento EP-A-0130756), é referido uma estirpe de B. subtilis que é incapaz de segregar a subtilisina enzimaticamente activa ou protease neutral, mas que expres^ ’ sa os genes de protease heteróloga isolados ou derivados de B.

amyloliquefaciens. A mutagénese de saturação específica de sítio

foi efectuada no gene de B. amylofiquefaciens e foram expressos os mutantes. 0 fundo negativo das estirpes hospedeiro de B. sub tilis foram obtidos apagando parcialmente um ou ambos genes de protease originais, ou por mutagenese com N-metil-N’-nitro-N-ni j trosoguanidinina (NTG). Foi ainda realçada que o hospedeiro de ί B. subtilis descrito é normalmente esporulante e que os mutan'i tes asporogenosos não são satisfatórios para a produção de proii h teinas (recombinantes).

No documento WO 86/01825 (ver Fahnestock e Fisher, acima citados) são descritas estirpes de Bacillus, em

Ií particular B. subtilis, com teores de protease extracelular rei;

j: duzidos. O gene de protease alcalina é desactivado por uma inI serção in vitro de um gene que codifica para uma proteína que confere um tratamento fenotipico no microorganismo. O vector 1’ plasmídio contendo o gene de protease desactivado por inserção i é transformado em B. subtilis e o gene desactivado substitui o ! gene nativo dos cromosomas por recombinação homóloga.

O documento WO 88/08033 refere analogos i

i de subtilisina a partir de subtilisina de Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina BPN', uma subtilisina apr de B. subtilis e uma subtilisina de B. mesentericus. Estes mutantes são obtidos por substituição de um ou mais aminoácidos em ou próximo do sí: tio de ligação do cãlcio com aminoácidos de carga negativa (por ! exemplo Asp ou Glu). Os mutantes são expressos em B. subtilis.

O documento WO/04866 refere uma estirpe de B. subtilis com uma reduzida actividade de segregação de pro tease, que foi obtido por introdução de uma mutação spoOH num mutante duplo apr npr , obtendo-se assim a estirpe asporogenosa. O mutante triplo obtido apr npr SpoOH mostrava muito baixa ac : tividade de protease segregada.

As referências acima discutidas descrevem a expressão de genes homólogos e heterólogos de B. subtilis ι e a construção de estirpes de protease negativa de B. subtilis. Parece que as estirpes de protease negativa preparados por apagamento parcial do gene da protease ou por inserção de outro ge ne no gene da protease apresentam várias desvantagens, por exem pio:

7, - O gene original pode ser reactivado. Se um gene que é homólo

go do gene do cromossoma desactivado for introduzido na célu la (por exemplo num plasmídio), a recombinação homóloga pode dar origem â reactivação do gene.

ί - 0 gene original, embora desactivado, pode conduzir à produi ção de produtos de expressão parcial, quando a região promotora estiver ainda activa. Isto constitui uma desvantagem em termos de eficiência metabólica.

! - A introdução de tratamentos fenotípicos indesejáveis, por exemplo resistência a antibióticos, dependente do gene inserido.

; - Instabilidade de plasmídio, devido a homologia entre uma sequência genómica e uma parte do plasmídio.

¹ _Λ ! E assim desejável apagar todas as sej i quências com homologia possível entre o cromossoma e o plasmíi dio.

Existem também desvantagens para a produção da protease alcalina, ou outros enzimas, em B. subtilis. Embora Wells e col., Nucl. Acids Res. 11, (1983) 7911-7925 mostrem que a expressão de subtilina BPN’ de B. amyloliquefaciens em B. subtilis seja possível com os seus próprios sinais de transcrição, Jacobs e col., Nucl. Acids Res. 13 (1985) 8913-8926 mostram que essa estratégia não é geralmente aplicável. Foi demonstrado que a região 5' de subtilisina Carslberg deriva da de B. licheniformes não continha sinais funcionais para a r transcrição em B. subtilis. Para conseguir uma produção conside , rável era necessário inserir um promotor de B. subtilis do gene ; em questão. É também sugerido que não apenas os processos de transcrição mas também os processos de translacção, segregação ou maturação possam ocorrer de forma menos eficaz em hospedeii _ ; ros heterõlogos, devido a uma sequência imperfeita de Shine Da_l garno ou mesmo incompatibilidade do produto do gene com o hospe deiro heterólogo.

i Os problemas de expressão acima descritos podem ser evitados quando o produto é sintetizado numa estirpe de Bacillus homóloga, em que existe garantia de elevada capacidade de produção, com alto rendimento resultando em eleva ¹ dos níveis de produção.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um pro cesso para a produção de proteases que diferem em pelo menos 1 ! aminoácido da protease de tipo natural, compreendendo o referi! do processo a utilização de uma estirpe de Bacillus alcalofílij ca homóloga como hospedeiro de expressão da referida estirpe j que é incapaz de produzir a protease de tipo natural.

Ij Num dos aspectos da presente invenção j o gene de protease altamente alcalina é apagado do cromossoma,

I a estirpe negativa de protease obtida pode ser utilizada como |j hospedeiro para a expressão de proteases homólogas ou heteróloí| gas.

d íj Num outro aspecto da presente invenção ! o gene de protease altamente alcalina de cromossomas é substiI j tuido por uma copia que sofreu mutaçao deste gene.

] Também são proporcionados processos paj ra construir as novas estirpes transformadas, e vectores utilii zados para esse efeito e um processo para produzir proteases mu tantes.

Numa realização preferida dos processos mutantes eles são obtidos de forma a regular uma homologia próxima das proteases originalmente produzidas pela estirpe corres pondente.

^! As estirpes preferidas são os Bacillus ! da nova espécie de PB92, seus derivados e estirpes muito parecã. I das, transformadas por um gene que codifica a protease que soi freu mutação. 0 referido gene mostra pelo menos 30%, preferível mente pelo menos 50% e mais preferivelmente pelo menos 80% de homologia com o gene de tipo natural de Bacillus PB92 que codifica a protease de serina. 0 gene é preferivelmente derivado de um gene de tipo natural e uma estirpe alcalofílica de Bacillus. As estirpes especialmente preferidas são os Bacillus alcalofíli cos asporogenosos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS • ι |

¹ ~

A Figura 1 mostra a construção do plas6

mídio ρΜ5δΔ contendo partes das regiões de flanqueamento 5’ e 3' do gene de protease alcalina do Bacillus nova espécie PB92.

A Figura 2 representa esquematicamente a introdução da origem sensível ã temperatura da replicação do , plasmídio pEl94neo-l no plasmídio ρΜ5δΔ, dando origem ao plasi mídio ρΕΜ5δΔ.

A Figura 3 mostra a introdução por recombinação homóloga, do plasmídio ρΕΜ5δΔ na região do flanquea ι mento 5' do gene de protease da estirpe Bacillus PBT110.

·! A Figura 4 mostra um mapa de restrição íS simplificado das regiões que rodeiam o gene da protease elimina : do após uma recombinação ilegítima. Foram obtidas duas estirpes l' PBT125 e PBT126.

li Figura 5 é uma sequência de nucleótij^: dos dos fragmentos HindIII de PBT125 (A) e PBT126 (B) .

l'

A Figura 6 mostra uma representação esquemática da introdução do gene da protease em M13 πιρίδ.

A Figura 7 mostra a sequência de nucleó J tidos do plasmídio pBHA-1.

A Figura δ mostra a introdução do gene j de protease da estirpe Bacillus PBT110 no plasmídio pBHAl.

A Figura 9 mostra a reorientação a ori' gem Fl contendo o fragmento BamHI do plasmídio que dá pBHAl-MXL de pBHAR-MXL.

ι A Figura 10 mostra a subclonação da sequência 3' de protease altamente alcalina do plasmídio pBHAR-MXL, dando origem ao plasmídio pBHARB-MXL.

i

A Figura 11 mostra a eliminação da sequência de E. coli do plasmídio pBHARB-MXL M216Q que dá origem ao plasmídio pBHB-MXL M216Q.

j A Figura 12 mostra a reorientação do ge j ne de resistência â neomicina do plasmídio pE194neo-l dando ori_ gem ao plasmídio pEl94neo-3.

A Figura 13 mostra esquematicamente a introdução de origem sensível à temperatura da replicação do plasmídio pE194neo-3 no plasmídio pBHB-MXL M216Q dando origem ’ ao plasmídio pEN^Q.

^A Figura 14 mostra esquematicamente a

construção da estirpe de Bacillus estirpe PEPlll.

A Figura 15 mostra esquematicamente a construção da estirpe de Bacillus estirpe PEP211.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As proteases de serina que são produzidas pelas estirpes que pertencem ao gene de Bacillus são habitualmente designados como proteases alcalinas. As proteases uti lizadas na presente invenção são derivadas de Bacillus alcalofi^ licos, e são assim designadas como proteases alcalinas.

Para a produção de proteases altamente alcalinas são utilizados de preferência estirpes de Bacillus a_l calofílicas como células hospedeiro. Para uma produção à larga escala são necessárias estirpes industriais. Elas são originadas de organismos que podem ser isolados do solo ou que estão disponíveis de depósitos ou de outras fontes e que são obtidas por modificação genética dessas estirpes de Bacillus. As estirpes industriais de Bacillus são definidas em EP-A-0134048. Elas são caracterizadas por serem resistentes à permuta genética, co mo por exemplo infecção ou transformação por fagos. As estirpes sao estáveis e podem ou não podem ser susceptíveis de formação de esporos. Elas são habitualmente prototrõficas e são modifica das para proporcionarem elevados rendimentos de produto de proteína endógenos, como por exemplo as enzimas alfa-amilases e vá rias proteases. 0 rendimento de um produto de proteína endógeno obtido num processo de produção industrial pode representar pele menos 5 g/1 (0,5% p/v). As estirpes industriais também segregam DNases, que resultam da degradação do ADN no meio, proporcionan do uma protecção contra a permuta genética.

É vantajoso utilizar como estirpe hospe deiro a estirpe a partir da qual o gene de protease foi originalmente isolado, dado que apenas nesse caso se pode estar segu ro de que todos os sinais necessários para expressão estão funcionais .

Uma vantagem adicional da utilização de Bacillis alcalofílicos como estirpes de produção é o risco mini, mo de contaminação com outros microorganismos, dado o pH alcal_i

no durante a fermentação.

De acordo com a presente invenção, é re ferido um processo para a eliminação de um gene que codifica pa ra a protease de Bacillus a partir do genoma de forma a que a regressão se torne impossível. A referida eliminação pode ser uma eliminação parcial (desde que as sequências deixadas nos cromossomas sejam para diminuir a recombinação homóloga com o gene da protease que codifica o plasmídio) mas mais preferivelmente o gene é completamente eliminado. A estirpe de protease negativa obtida por este processo é utilizada para a produção de protease mutantes homólogas após introdução de um vector de expressão contendo o gene que codifica esta protease mutante. É, contudo, entendido que esta estirpe de protease negativa pode também ser utilizada com vantagem para a expressão de outras proteínas quer homólogas quer heterólogas. Neste contexto consjL déramos que a expressão das proteases mutantes utilizadas como célula hospedeiro, as células em que o gene de tipo natural foi isolado, são de expressão homóloga.

Foi verificado que utilizando uma protease industrial para produzir a estirpe de Bacillus como hospe deiro para a produção dos mutantes desta protease, a elevada eficiência da produção da protease original é transferida para a protease mutante. Isto resulta numa eficiência de produção surpreendentemente superior comparada com as estirpes laboratoriais. Uma cópia de cromossomas do gene que sofreu mutação dã após expressão e secreção numa estirpe industrial um rendimento ainda superior a 50 cópias de plasmídio contendo o gene que sofreu a mutação, numa estirpe laboratorial.

Constitui um aspecto desta invenção o facto de as proteases mutantes poderem ser produzidas com eficiência por uma estirpe de Bacillus homóloga por permuta do gene dos cromossomas ou duma sua parte com o gene que sofreu a mu tação correspondente. Deste modo a capacidade de produção para a protease do tipo natural é eliminada enquanto que ao mesmo tempo se introduz uma capacidade de produção para uma protease mutante.

Como célula hospedeiro para a expressão de genes que sofreram mutação codificando para proteínas de en9 genharia modificadas, é preferível usar células em que os genes são estruturalmente expressos a um alto nível.

Noutro aspecto da presente invenção foi verificado com surpresa que os Bacillis asporogenosos podem ser utilizados para se obter um elevado nível de expressão do gene de protease.

A presente invenção também mostra (Tabe la 1) que para se obter uma elevada produção da protease altamente alcalina derivada de Bacillus PB92 em B. subtilis, é preferível inserir um promotor que é activo em B. subtilis, em frente do gene. Se as enzimas derivadas de outros Bacillis forem produzidas, a inserção de B. subtilis de um promotor activo em B. subtilis ou outros sinais de expressão podem ser necessários, o que necessita de uma fase extra.

Os Bacillis produtores de protease alta mente alcalina são taxonomicamente não muito bem classificados são geralmente referidos como estirpes de Bacillus alcalofílicos. Para a presente invenção definem-se os Bacillis alcalofíli cos como estirpes de Bacillus que crescem em condições alcalinas de pH 9-11 (Horikoshi, K. e T. Akiba, 1982, Alkalophilic microorganisms, Springer Verlag, Nova Iorque). As proteases alcalinas produzidas por esses Bacillis são também designadas como proteases altamente alcalinas. Exemplos destas estirpes de Bacillus susceptíveis de crescerem em valores de pH alcalinos são descritas em, por exemplo, Patentes Norte Americanas NQs.

723 250, Re. 30 602 e 4 480 037. Um exemplo de uma estirpe hospedeiro de Bacillus alcalofílica é o Bacillus nova espécie PB92 referido entre outros na Patente Norte Americana NQ. Re.

602. Os derivados destas estirpes de Bacillus, que foram opti. mizados para a produção de proteases são utilizados para produzir as suas proteases â escala industrial (ver EP-A-0284126).

Os produtos são utilizados em várias aplicações industriais por exemplo como aditivos em detergentes de lavandarias. Exemplos desses produtos são o Maxacal (Gist-brocades/IBIS), Savinase R (NOVO), Esperase (NOVO). Mutantes desses produtos foram descri tos no documento WO 89/06279, onde se afirma que eles são derivados de Bacillus lentus, e no Pedido de Patente Europeia pré-publicada EP-A-0328229.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção são proporcionadas estirpes de Bacillus transformadas que produzem os mutantes descritos na patente EPI -A-0328229 e WO 89/06279, preferivelmente a uma escala industri : al.

I í De acordo com a presente invenção, é utilizada adequadamente uma estirpe de Bacillus, em particular um Bacillus alcalofílico, preferivelmente Bacillus nova espécie

I PB92. Outro grupo preferido de estirpes de Bacillus são os muJ tantes asperogenosos dos quais PBT110 e os seus derivados são I os mais preferidos. A transformação de estirpes de Bacillus al: calofílicos envolverá preferivelmente a utilização de protopla^ tos a partir das referidas estirpes. Contudo, o procedimento de transformação convencional de protoplastos descrito por Chang, S. e S.M. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115, não fun ciona para a estirpe de Bacillus alcalofílicas. Os protocolos necessários para estas estirpes foram apresentados em EP-A -0283075, que ê aqui incluída como referência.

A expressão do gene de protease mutantes em hospedeiros homólogos necessita da substituição e/ou desactivação do gene do tipo natural. Podem ser utilizados alguns processos.

(A) Um dos processos é efectuar uma clonação do gene ou de uma ' sua parte modificá-lo por mutagenese dirigida a sítios e re ! introduzir o gene (parcial) na célula num plasmídio. Por re j combinação homóloga o gene pode ser introduzido no cromosso i

ma. O resultado é uma situação em que o gene do tipo natuJ ral e o gene mutante estão localizados em pares. Após uma segunda recombinação a sequência modificada é deixada no cromossoma possuindo assim efectivamente introduzida a muta ί ção no gene do cromossoma (tal como descrito na Figura 14).

(B) Noutro processo a cópia do gene do cromossoma é desactivada por eliminação. Se a eliminação do gene é escolhida como es tratégia o fragmento do gene do cromossoma que é eliminado é preferivelmente a região completa de codificação. Após a i desactivação é levada a cópia mutante do gene desactivado *! para a célula com o vector de clonação.

• i • (C) Noutro processo a cópia do gene do cromossoma é mutageniza11 do. Em princípio é possível obter mutações (específicas) in vivo, após transformação das bactérias com oligonucleótidos que são mutagénicos. Esse processo foi utilizado com sucesso em fungos como é descrito por Moerschell e col. Proc. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988) 524-528. Se for efectuado esse processo num homólogo, preferivelmente numa estirpe de Bacillus alcalofílica homóloga, isto é considerada uma realização da invenção.

A presente invenção refere-se a estirpes de Bacillus que são conhecidas como produtores eficazes de protease. Num dos processos preferidos a região de codificação da protease altamente alcalina completa é eliminada do cromossoma. Nesta realização é utilizado um vector contendo o gene de protease alcalina incluindo as suas regiões 5¹ e 3¹. 0 gene de protease é eliminado do vector in vitro, deixando para trás as regiões de flanqueamento 5¹ e 3’. Este vector é levado para a estirpe de Bacillus alcalofílica. 0 vector é integrado no cromossoma através de uma recombina ção homóloga da região de flanqueamento. A recombinação exterior e a resolução conduz a uma estirpe de Bacillus possuindo um gene de protease eliminado. 0 vector utilizado é preferivelmente um plasmídio. Para tornar possível a selecção é introduzido um marcador que pode ser um plasmídio pre ferivelmente resistente a antibióticos, por exemplo resistente à neomicina. 0 vector pode preferivelmente ser escolhido para ser integrado no cromossoma e isto pode ser conseguido por introdução de uma origem indutora de replicação por exemplo uma origem sensível â temperatura como por exem pio a do pE194. 0 referido plasmídio é introduzido numa célula hospedeira homóloga. Numa condição de alta temperatura o plasmídio não é susceptível de se replicar e assim os integradores do cromossoma podem ser escolhidos para isso. Os integradores são escolhidos a altas temperaturas na presença do antibiótico relevante (por exemplo neomicina). A reso lução do plasmídio do cromossoma hospedeiro pode deixar as regiões de flanqueamento no cromossoma enquanto se remove a região de codificação. Finalmente, o mutante resultante escolhido perdeu o gene marcador seleccionável (é sensível â neomicina) e é protease negativa. A configuração final cromossó mica é determinada por análise de restrição e revelação de Southern. A patente WO 88/06623 descreve com pormenor os mecanismos de integração possíveis. 0 gene de protease, modificado pela mutagenese dirigida aos sítios, é agora introduzido na célula de protease negativa num vector de expressão adequado. É pre ciso cuidado para que o plasmídio contenha poucas ou possivelmente nenhumas sequências homólogas para o cromossoma para se evitar a instabilidade do plasmídio.

Em vez de expressar o gene de protease com a mutação de um vector é também possível integrar o gene de protease que sofreu mutação no cromossoma na estirpe negativa de protease. Isto pode ser conseguido deixando as regiões de flanqueamento do gene de protease que limitam o gene de protease que sofreu mutação no plasmídio. A introdução de um plasmídio desses pode dar origem a uma recombinação homóloga nas regi ões de flanqueamento introduzindo assim o gene de protease que sofreu mutação no cromossoma da estirpe negativa de protease. Isto é especialmente vantajoso se o plasmídio se tornar instável. A presente invenção também mostra que uma quantidade de mu tante recombinante ou de protease do tipo natural obtida é comparável ou mesmo mais elevada se for integrada uma cópia do gene no genoma e em seguida se existirem várias cópias do gene co difiçado por um plasmídio.

Numa realização ainda adicional o gene de protease altamente alcalina cromossõmica é substituído pelo gene mutante por recombinação homóloga, sem isolamento prévio de uma estirpe de protease negativa.

A protease é expressa e pode ser isolada quer de células quer do meio quando a proteína é segregada. Após recuperação da protease ela pode ser purificada e formulada para se obter uma composição detergente. Assim, no sistema de produção descrito o gene do tipo natural foi completamente elimi nado, a preparação da protease mutante é completamente livre da proteína de tipo natural.

O plasmídio pM58, construído como descri to na patente EP-A-0284126, contem um gene de protease completamente alcalina. Para se obter o plasmídio de desactivação a re13

gião de codificação do gene da protease é eliminado por uma dupla digestão de Ball/Hpal. A origem sensível à temperatura da replicação de pE194neo-l é posteriormente introduzida. A construção ρΕΜδδΔ é introduzida na estirpe de Bacillus PBT110.

j A integração pelo mecanismo designado pelo tipo de Campbell teve lugar na região de flanqueamento 5¹ | do gene da protease, resultando numa estirpe de protease positi j va contendo todo o vector plasmídio no seu cromossoma no sítio j da protease (tal como se mostra na Figura 3).

A selecção posterior para derivados de !, protease negativa dessa estirpe revelou duas estirpes PBT125 e j!

j PBT126, que tinham perdido o gene de protease e o marcador de , neomicina. Uma análise adicional revelou que nesta segunda fase jj tinha ocorrido uma recombinação ilegítima.

|| Dado gue as estirpes de Bacillus obtidas não apresentavam uma actividade detectável de protease elas podiam ser utilizadas para a expressão dos genes de protease al. terada. Será óbvio que ο PBT125 e ο PBT126 são apenas exemplos. Dado que a recombinação ilegítima dará origem a resultados dife rentes serã essencial determinar se o gene completo foi elimina do. Para se obterem estirpes mais específicas, podiam ter sido feitos recombinantes homólogos.

ί Os exemplos aqui apresentados descrevem j principalmente duas realizações específicas da invenção. Uma de , las e a produção de uma protease mutante codificada para plasmí dio a partir de uma estirpe de protease negativa. A outra é a produção de uma protease mutante em que o gene que sofreu a mutação foi introduzido no genoma por permuta de genes. Será obviamente óbvio para o especialista que são possíveis outras rea j lizações, por exemplo: integração cromossómica numa estirpe de protease negativa, uma cópia do gene que sofreu mutação no plass mídio e integrado no cromossoma, mais do que uma cópia do gene que sofreu a mutação localizada em pares ou em posições diferen tes no cromossoma. Os seguintes exemplos são apresentados como ilustração e não como limitação.

SECÇÃO EXPERIMENTAL

EXEMPLO 1

Construção do PLasmídio de Desactivagão ρΕΜ58Δ ί Fez-se a digestão do plasmídio ρΜ5δΔ (ver EP-A-0284126) com enzimas de restrição Bali e Hpal. Conten do o grande fragmento das sequências de flanqueamento do gene ί, de protease foi purificado (Maniatis, Molecular cloning: A Labo 'j ratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) e ligado. A mistura de ; Ligação foi transformada (Spizizen e col., J. Bacteriol. 81

I í (1961) 741-746) para Bacillus subtilis DB104 (Kawamura e Doi, ^! J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) e escolhida para transforman tes resistentes à neomicina e de protease negativa em placas mí

II nimas contendo 0,4% de caseína e 20 ug/ml de neomicina.

H plasmídio ρΜ5δΔ foi isolado e caracP - ~ l terizado por analise de enzima de restrição. Tal como se mostra ;; na Figura 1 o plasmídio pM58A contem as sequências de flanqueamento do gene de protease altamente alcalina, codificando o gene para a resistência â neomicina e uma origem de Bacillus de replicação.

Para construir um plasmídio de integração contendo uma origem sensível à temperatura de replicação, ρΜ58Δ foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e BglII. O fragmento que continha as sequências de flanqueamento de protea

I se altamente alcalina foi purificado e ligada ao fragmento (purificado) Xbal/BglII de pE194neo-l (EP-A-0284126) contendo a j origem sensível à temperatura da replicação, derivada de pEl94 ' (Jordanescu e col., Plasmid (1978) 468-479), após o referido ι

fragmento ter sido purificado da forma anteriormente descrita.

A mistura de ligação foi transformada para B. subtilis DB104 e escolhida para a resistência ã neomicina (ver acima). O plasmi! dio ρΕΜ5δΔ foi isolado e caracterizado (Figura 2). Ele contem o gene resistente à neomicina, a origem sensível â temperatura da replicação de pE194 e as sequências de flanqueamento do gene de protease alcalina.

Este plasmídio ρΕΜ5δΔ foi utilizado pa ι ra transformar a estirpe de Bacillus PBT110.

EXEMPLO 2

Construção de uma Estirpe de Bacillus Alcalofílica de Protease

Negativa

A. Transformação protoplástica de Bacillus PBT110 por plasmídio ρΕΜ58Δ

A estirpe de Bacillus PBT110 é um mutan te asporagenoso de Bacillus nova espécie PB92 (Patente Norte Americana NQ. Re. 30 602) e foi obtida por procedimentos clássicos de mutação (UV). Esta estirpe foi transformada com o plasmídio ρΕΜ5δΔ semelhante ao processo descrito na Patente EP-A-0284126. Antes das experiências de integração, foi verificado por análises de enzima de restrição se os transformantes continham o plasmídio relevante.

B. Integração de ρΕΜ5δΔ no cromossoma de Bacillus PBT110

A integração de ρΕΜ5δΔ nbo cromossoma da estirpe de Bacillus PBT110 foi efectuada da forma descri ta na Patente EP-A-0284126. A escolha dos integrantes ocorreu numa concentração de neomicina de 1 pg/ml. A organização genética do integrante foi determinada por análise da enzima de restrição seguida por revelação de Southern e anã lise de hihridização e é apresentada na Figura 3. Parecia que a integração de ρΕΜ5δΔ tinha lugar através de um mecanismo designado por tipo de Campbell por recombinação homóIoga na região de flanqueamento 5' do gene de protease alca lina, resultando numa estirpe de Bacillus PBT110-INT5.

C. Selecção de estirpes de protease negativa

A estirpe de Bacillus PBT110-INT5 foi inoculada em 100 ml de caldo de soja tríptico (TSB) contendo 1 (ug/ml de neomicina e incubou-se durante 24 horas a uma temperatura de 50QC.

Após 24 horas foram inoculados 0,1 ml da cultura obtida num frasco de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio mínimo de PBT : K₂HPO₄, 17.42 g/1; glutamato, 13.36 g/1; sódio citrato.H₂O 2 g/1; FeSO₄.7H₂O, 0.05 g/1;

ZnSO₄.7H₂O, 1 mg/1; MnSO₄.H₂O, 1 mg/1; CaCl₂,2H₂O, 10 mg/1; MgSO₄.7H₂O, 0.2 g/l; CuSO₄.5H₂O, 0.5 mg/1; H₃BO₃, 0.5 mg/1; Na₂Mo0₄.2H₂0, 0.5 mg/1; CoC1₂.6H₂0, 0.5 mg/1; Biotina, 0.5 mg/1; sacarose, 20 g/l; (pH 8,0, esterilizado durante 20 min a 120QC). Após a esterilização foi adicionado 1 mg/1 de tiamina.

Esta cultura foi incubada a 37QC durante 4 dias. Passados 4 dias, diluiu-se 1 ml da cultura em 100 ml do mesmo meio e incubou-se durante 4 dias. Passados 4 dias. Passados 4 dias a cultura foi colocada em placas de meio mínimo PBT contendo adicionalmente 0,4% de caseína e 15 g/l de ágar. As colónias a que faltava uma protease halo detectãvel foram consideradas protease negativa e foram ensaiadas para a determinação da ausência de gene codificando a protease alcalina PBT110.

D. Caracterização das estirpes da protease negativa

As estirpes que não apresentavam um halo detectãvel nas placas de caseína descritas na secção anterior foram em primeiro lugar ensaiadas para a determinação da presença de um fenotipo sensível ã neomicina e asporogenoso. Duas estirpes, Bacillus PBT125 e PBT126, que continham a protease negativa e o fenotipo asporogenoso foram ensaiadas para a determinação da produção de protease em frascos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio de pro dução de protease, da forma descrita na Patente Norte Americana NQ. Re. 30 602. Nenhuma das estirpes produziu quantidades detectáveis de protease.

A organização genética das duas estirpes foi determinada pela anãlise de enzimas de restrição e revelação cromossómica que é representada na Fifura 4. Não ocorreu recombinação homóloga, mas sim ilegítima, resultando em duas estirpes que eliminavam completamente os genes resisten tes ã protease e â neomicina. Contudo, parecia ter sido deixado um pequeno fragmento de plasmidio no cromossoma após eliminação do gene da protease. A sequência deste fragmento foi determinada da forma seguinte. Os fragmentos de cromosso ma HindIII das estirpes PBT125 e PBT126 contendo as junções de plasmidio/cromossoma foram ligadas num vector fago M13 mpl8 (Messing e col., Nucl. Acids Res. (1981) 303-321) e transfectadas para E. Coli JM101 de acordo com o procedimen to descrito por Cohen e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 2110-2114. Após a propagação do fago em E. coli JM101, foi isolado ssADN (Heidecker e col., Gene 10 (1980) 69-73) .

As inserções foram sequenciadas utilizando o processo descrito por Sanger e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463. Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 5A e 5B, respectivamente.

EXEMPLO 3

Construção de Vectores de Produção e Mutação de Protease

A. Subclonação do gene da protease PB92 no fago M13 mp!8

Foi feita a digestão do plasmídio pM58 com Hpal e Bali. Apõs purificação do fragmento de ADN contendo o gene de protease (Maniatis, 1982) este fragmento foi ligado ao fago M13 mpl8 foi digerido com Smal. A mistura de ligação foi transfectada e E. coli JM101 (Cohen e col. supra). Após a propagação do fago em E. coli JM101, foi iso lado o dsADN de acordo com o processo descrito por Birnboim e Doly (Nucl. Acids Res. Ί_ (1979) 1513-1523) . A inserção e a sua orientação foram verificadas por análise de enzima de restrição. O vector mpl8 MXL foi utilizado para experiências de subclonação adicionais e é representada na Figura 6.

B. Subclonação do gene de protease PN92 no plasmídio pBHAl

A Figura 7 mostra a sequência de nucleó tidos do plasmídio pBHAl. Este plasmídio é derivado do sistema de vector geminai pMa/c5-8 descrito por Stanssens e col., (Nucl. Acids Res. 17 (1989) 4441-4454), em que foi in serido um promotor adicional. O plasmídio BHA1 consiste nos seguintes fragmentos:

.rf?'''' pos 11-105: bacteriófago FD, terminador;

pos 121-215: bactiriôfago FD, terminador;

pos 221-307: uma parte de plasmídio pBR322 (isto é posições

2069-2153);

i pos 313-768: bacteriófago Fl, origem de replicação isto é pos 5482-5943);

pos 772-2571: parte do plasmídio pBR322, isto ê a origem de replicação e o gene de -lactamase;

! pos 2572-2685: transposição Tn903, genoma completo; pos 2719-2772: terminador de triptofano (duplo);

ί pos 2773-3729: transposão Tn9, o gene de cloranfenicol-acetilI transferase (=cat) . Os nucleótidos na pos

3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) e 3409 (A) diferem de sequência de codificação cat” natural. As mutações foram introduzidas para eliminar os sítios d

Ncol, Bali, EcoRT e PvuII; pos 3730-3804: sítio de clonação múltiplo;

pos 3807-7264: parte do plasmídio pUBUO (isto é a replicação e gene de resistência â canamicina, fragmento EcoRI PvuII) (McKenzie e col., Plasmid 15 (1986) 93-103 e Plasmid Γ7 (1987) 83-85);

pos 7267-7331: sítio de cloração múltipla.

! Os fragmentos foram combinados utilizan do técnicas conhecidas de clonação, por exemplo, enchimento nas extremidades com Klenow, clonação de adaptação, etc.. Todos estes dados foram derivados de Genbank National Nucleic Acid Sequence Data Bank' NIH, U.S.A.. O plasmídio pMc5-8 foi depositado com o número DSM 4566.

Antes dos procedimentos de mutação o sistema de vector geminai pBHA/C-1 foi modificado para se obter o sistema de vector geminai pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL, da forma seguinte :

1. O vector mpl8-MXL foi digerido com Kpnl e HincII. O fragmen to de ADN contendo o gene de protease foi purificado e liga do em pBHAl que foi digerido com EcoRV e Kpnl. A mistura de ligação foi transformada em E. coli JM101 (Maniatis, 1982) . j e colocado em placas LC contendo 10 g/1 de tripton, 5 g/1

N de extracto de fungo (Difco), 8 g/1 de NaCl, 25 mg/1 de tiI ]

mina, 1 g/1 de MgSO^.7H₂O, 100 pg/ml de ampicilina e 20 pg/ml de neomicina pH 7.0. O plasmidio de ADN dos transformantes foi isolado (Birnboim, supra) e caracterizado por análise de enzima de restrição. Desta forma foi isolado pBHAl-MXL (ver Figura 8).

2. De modo a sequenciar as mutações introduzidas no gene da protease com um conjunto disponível de oligonucleótidos, foi necessário inverter a orientação da origem Fl comparada com o gene da protease. Isto foi efectuado da seguinte maneira : o plasmidio pBHAl-MXL foi digerido com BamHI e reli gado. A mistura de ligação foi transformada em E. coli WK6 (Maniatis, supra) e escolhida para resistência â neomicina ou ampicilina em placas LC⁺ contendo 10 g/1 trypton, 5 g/1 Yeast Extract (Difco), 8 g/1 NaCl, 25 mg/l thymine, 1 g/1 MgSO^.7H₂O, 100 jug/ml ampicillin and 20 pg/ml neomycin pH 7.0. O ADN de plasmidio dos transformantes foi isolado (Birn boim, supra) e caracterizado por análise de enzima de restrição. Desta maneira foi isolado o pBHAR-MXL, que diferia do pBHA-MXL por a orientação da sequência de E. coli ser in vertida, (ver Figura 9).

3. Para a introdução de sequências adicionais de flanqueamento no plasmidio pBHAR-MXL, foram feitas as seguintes digestões. 0 plasmidio pM58 foi digerido com Sphl e HindIII. O plasmidio pBHAR-MXL (Figura 10) foi digerido com Sphl e HindIII.

fragmento maior foi purificado. Ambas as digestões foram ligadas e transformadas em B. subtilis DB104 e escolhidas para a resistência à neomicina e actividade de protease em placas mínimas contendo 10 pg/ml de neomicina e 0,4% de caseína. Os transformantes foram caracterizados por análise de enzima de restrição. Um destes, pBHARB-MXL (Figura 10), foi utilizado para outras experiências.

C. Mutagenese do gene PB92 no plasmidio pBHARB-MXL

A mutagénese foi efectuada com o sistema de vector geminai pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL (Stanssens, supra) .

Foi utilizado um processo baseado na

I técnica de duplex com separação (Kramer e col., Nucl. Acids. Res. 12 (1984) 9441) e um plasmídio (fago/plasmídio híbrido) . 0 processo baseia-se essencialmente num intermediário de ADN duplex separado consistindo de uma banda separada (banda-) contendo um marcador resistente a antibióticos de tipo natural e uma banda modelo (bandat) contendo uma mutação âmbar no gene conferindo a resistência ao antibiótico. Após estabilização, o oligonucleótido mutagénico torna-se incorporado na banda separada durante a reacção de enchimen to e selagem in vitro da separação. As moléculas resultantes são utilizadas para transformar uma deficiência de repa ração de incoenrência (Mut S) hospedeira em que a ligação entre a mutação pretendida e o marcador da resistência ao antibiótico é conservada. A população de plasmídios mistos, isolados desta estirpe, é em seguida deixada segregar na e_s tirpe hospedeira negativa do supressor. Os transformantes são placados num meio contendo antibiótico, impondo assim uma selecção para a progenia derivada da banda separada.

No vector do tipo pMa o nucleõtido 3409 é alterado de G para A, enquanto que no vector tipo pMc o nucleótido 2238 é alterado de G para C, criando cõdãos de pa ragem âmbares no gene de cloranfenicol-acetil-transferase e no gene de (3-lactamase, respectivamente, tornando os refer_i dos genes inactivos.

Para efectuar a mutagénese o fragmento de ADN alvo é clonado no sítio de clonagem múltipla de pMa5-8 ou num seu derivado. É em seguida construído um duplex separado entre pMa5-8 contendo o ADN alvo e pMc5-8.

A separação de banda simples, consistindo do ADN alvo, pode ser submetida a mutagénese com um oligonucleótido mutagénico, com oligonucleótidos sintéticos longos possuindo um pequeno teor de nucleótidos incorporados, utilizando uma desincorporação química ou enzimática de nucleótidos. Para uma descrição detalhada, ver Ausubel e col., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. Nova Iorque; ou B. Perbal, 1988, A practical Guide to Molecular Cloning, 2â ed. John Wiley & Sons Inc; Nova Iorque.

D. Construção de Vectores para a Produção Industrial de Protease

Após a introdução das mutações pretendi das no plasmídio pBHARB-MXL, as sequências indesejadas de

E. coli do plasmídio foram eliminadas da forma seguinte: o plasmídio pBHARB-MXL contendo a mutação importante foi dige rido com BamHI e religado em condições diluídas. A mistura de ligação foi transformada em B. subtilis DB104 e escolhida para a resistência ã neomicina e actividade da protease em placas mínimas contendo 20 pg/ml de neomicina e 0,4% de caseína. O ADN dos transformantes foi isolado e caracteriza do por análise de enzima de restrição. Desta forma foram isolados vectores a que faltava o ADN de E. coli, que são ^! adequados para a produção comercial de proteínas.

procedimento anterior é ilustrado na Figura 11, em que a mutação de M216Q é tomada como exemplo, resultando no plasmídio pBHB-MXL M216Q. M216Q, assim como M216S, S160D e N212D referidos em seguida, são proteases mu tantes de Bacillus PB92, descritas na Patente EP-A-0328229.

!

!

EXEMPLO 4 ' Transformação de Protoplastos de Bacillus PBT125 por Derivados do Plasmídio pBHB-MXL ί A estirpe Bacillus PBT125 foi transfori ί mada pelo plasmídio pBHB-MXL ou os seus plasmídios derivados contendo genes de protease mutante, segundo o procedimento de transformação de EP-A-0284126. Antes dos estudos de produção, os transformantes foram ensaiados por análise de enzima de restrição para verificar se contêm o plasmídio relevante.

EXEMPLO 5

Construção dos Vectores de Integração da Protease

A. Vector de Integração pEN^Q

O plasmídio pEl94neo-l (EP-A-0284126)

foi digerido com Sall e religado. A mistura de ligação foi transformada em B. subtilis DB104 e escolhida para resistên : cia à neomicina em placas mínimas contendo 20 ug/ml de neoi ' micina. 0 plasmídio pE194neo-3 foi isolado e ensaiado na ' presença do gene de resistência à neomicina numa orientação inversa (ver Figura 12). O plasmídio pE194neo-3 foi digerido com Hpal e BglII. O fragmento contendo a origem de repli cação sensível ã temperatura foi purificado (Maniatis, supra) .

J O plasmídio pBHB-MXL M216Q (ver Exemplo e Figura 11) foi digerido com BglII e Bali. O fragmento contendo o gene de protease foi purificado. Ambos os fragmentos foram ligados. A mistura de ligação foi transformada para B. substilis DB104 e escolhida para a actividade de í protease e resistência â neomicina como anteriormente descrito. Os transformantes foram caracterizados por digestões de enzima de restrição. Um destes, contendo o plasmídio pEN^Q, foi o escolhido (Figura 13) . Este plasmídio continha o gene de resistência à neomicina, a origem sensível à temperatura de replicação do plasmídio pE194neo-3 e a mutação M216Q no gene da protease de PB92.

B. Vector de Integração pEN_oS.

Da forma descrita para o vector de inte gração pEN^Q, o pEN^S foi construído utilizando pBHARB-MXL M216S como vector de partida.

I í

í EXEMPLO 6 i Construção de Estirpes de Bacillus PEP111 e PEP112 !

A. Transformação de Protoplastos de Bacillus PBT110 pelo Plasmídio pENpQ

A estirpe de Bacillus PBT110 foi transformada com o plasmídio pEN^Q como descrito em EP-A-0284126. Antes das experiências de integração, foi ensaiado por análise de enzima de restrição se os transformantes continham '1 o plasmídio importante.

•J B. Integração de pEN-^Q em cromossomas de Bacillus PBT110

As experiências de integração com o plasmídio pENgQ em cromossoma da estirpe Bacillus PBT110 fo ram efectuadas da forma descrita em EP-A-0284126. A escolha dos integrantes ocorreu para uma concentração de neomicina de 1 ug/ml a temperaturas não permitidas (50QC) para a replicação de plasmídio. Para verificar a integração de pEN^Q no cromossoma, foi isolado o ADN cromossómico de integrantes potenciais foi digerido com HindIII ou Ciai, tratado com um gel de agarose com 0,8% de ADN e revelado em nitroce lulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) e hibri32 dizado com P marcado com translacçao de corte de pEN^Q de ADN (Maniatis, 1982).

Demonstrou-se que a integração de pEN^Q ocorria por recombinação homóloga resultando numa estirpe (PBT11OM/Q) com dois genes de protease (um do tipo natural e um mutante M216Q) localizados em seguimento no cromossoma. Assim, a integração de pEN^Q ocorria por um mecanismo chama do de tipo Campbell como representado na Figura 14 (ver tam bém EP-A-0284126).

C. Seiecção dos recombinantes sensíveis ã neomicina [ Foram escolhidos recombinantes sensíveis à neomicina, que continham ou o gene do tipo natural ou o gene da protease mutante no cromossoma (de agora em diante i referido com outrecombinantes). O procedimento de seiecção { é semelhante ao procedimento atrás descrito no Exemplo 2C.

i

A estirpe PBT110 M/Q foi utilizada com estirpe de partida. Após se ter incubado a estirpe PBT110 M/Q em meio mínimo PBT, foi placada a cultura em placas de ! meio mínimo PBT contendo 0,4% de caseína e 15 g/l de ágar. Estas placas foram incubadas durante 48 h a 37QC e as rêplj. cas placadas em placas de infusão de Heart (HI) contendo 1 ug/ml de neomicina e sem neomicina, respectivamente. As colónias sensíveis à neomicina foram consideradas outrecombi nantes.

; D.- Caracterização de recombinantes sensíveis ã neomicina

I

Foi isolado o ADN cromossómico de outre combinantes potenciais, digeridos com Ciai ou HindIII, processadas no gel a 0,5% de agarose, reveladas com nitrocelulose (Southern, 1975) e hibridizadas com pEN~Q de translac~ 32 ^J çao de corte com P (Maniatis, 1982). Dado que a mutação de M216Q resulta na remoção de um sítio de Ciai, as estirpes contendo uma protease de tipo natural ou um gene de pro tease mutante, e a estirpe intermédia PBT110 M/Q podem ser facilmente distinguidas, ver Fig. 14.

Foi isolado um outrecombinante contendo o gene de protease mutante M216Q de PB92. Após se ter mostrado que tinha ocorrido uma substituição do gene de protea se do tipo natural PB92 para a protease motante PB92, o pro duto da estirpe foi caracterizado pelos seus parâmetros bio químicos (k_cat, ^Km)/ resistência à oxidação, actividade específica e capacidade de lavagem, como descrito em EP-A-0328229. Todos os resultados eram idênticos a uma protease de controlo M216Q, indicando que o produto da estirpe tranjs formada era de facto a protease PB92 contendo a mutação M216Q. Esta estirpe transformada é designada por Bacillus PEP111.

Foram efectuadas experiências semelhantes utilizando o vector pEN^S para construir a estirpe de Bacillus PEP112, que contem a protease PB92 com a mutação M216S.

EXEMPLO 7

Construção das Estirpes de Bacillus PEP211 e PEP212

A estirpe de Bacillus PEP 111 foi trans formada com o plasmídio pEN^Q, seguindo o procedimento descrito em EP-A-0284126. Antes do procedimento de integração, ele foi analisado por análise de enzima de restrição para saber se os transformantes continham o plasmídio relevante. O procedimento de integração e a selecção de integrantes (para uma concentração de neomicina de 20 ug/ml a temperaturas não permitidas (50° • ί C) para a replicação de plasmídios foi efectuada da forma des.! crita em EP-A-0284126.

Para verificar a integração do plasmídio pEN^Q no cromossoma, o ADN cromossómico de integrantes potenciais foi isolado e digerido com HindIII, processado em géis de agarose a 0,8%, revelado em nitrocelulose (Southern e col.

^I ~ 32

1979) e hibridizado com pEN₃Q de translacçao marcado com P. Verificou-se que se tinha isolado uma estirpe contendo dois gej nes de protease mutantes, localizados separadamente no cromosso j mas. Esta estirpe é designada como PEP211. A sua organização cromossómica é representada na Figura 15.

! Para se obter uma estirpe análoga conII

Ií tendo dois genes de protease com a mutação M216S, transformouíí j -se a estirpe PEP112 contendo um gene mutante (M216S) apos sub_s ι tituição do gene, do gene do tipo natural, com o plasmídio : pEN_qS e foram seguidos os procedimentos acima descritos. Estas I ^J _ j expenencias resultaram numa estirpe PEP212 contendo os dois ge

I nes de protease mutante PB92 M216S localizados separadamente no i

cromossoma.

EXEMPLO 8 j Produção de Protease Mutantes

A produção de proteases mutantes foi efectuada com estirpes de Bacillus modificadas em que o gene co difica a protease que sofreu a mutação foi localizado ou num plasmídio ou no cromossoma.

Para a produção de plasmídio codificado ' foram utilizados dois tipos de estirpes, a estirpe alcalofílica de Bacillus PBT125, tal como aqui descrita, e estirpe B. subtilis DS12367, uma estirpe asporogenosa derivada de B. subtilis DB104 (Kawamura e col., J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444). Estas estirpes foram transformadas com pBHB-MXL de plasmídios derivados. Os Bacillus PBT125 e B. subtilis DS12367, que não possuíam plasmídios codificadores de protease, foram utilizados co mo estirpes de controlo.

Para a produção com estirpes contendo . genes mutantes de protease cromossomicamente integrados, as es,ι tirpes de Bacillus PEP, tal como aqui descritas, foram as utili

zados. As estirpes de Bacillus PBT 108 e 110, contendo os genes de protease de tipo natural foram utilizadas como estirpes de controlo. A PBT108 é uma estirpe contendo dois genes de tipo na tural localizados separadamente no cromossoma, ver EP-A-0284126 ; Para PBT110, ver Exemplo 2A.

Para verificar a actividade do promotor original do gene de protease PB92 em B. subtilis, foi feita uma i construção, pBHB-MXLR, em que a orientação do gene de protease L para o promotor Hpall (Zyprian e col., DNA _5 (1986) 219-225) foi invertida, de forma a que a expressão do gene de protease é apenas dirigida pelo seu promotor original.

ί As produções foram efectuadas em frasji cos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio de produção L de protease.

Quando se utilizaram estirpes de Bacil! lus alcalofílicas, as culturas foram incubadas, após inoculaI ção, durante 40 horas a 37QC num meio de produção da forma desii j crita na Patente Norte Americana N°. Re. 30 602. No caso de βει tirpes contendo plasmídios, foi adicionada neomicina (20 pg/ml).

i

Quando se utilizaram estirpes B. subti| lis DS12367, foi adicionado um meio comparável contendo 12.5 g/1 de Extracto de Levedura (Difco), 0.97 g/1 de CaCl₂.6H₂O,

2.25 g/1 de MgCl₂.6H₂O, 20 mg/1 de MnSO^.4H₂O, 1 mg/1 de CoCl₂· l 6H₉O, 0.5 g/1 de citrato, 0.5 ml de antiespumante 5693, 6% p/p I; de maltose, e foi aplicado um tampão de fosfato 0,2 M a pH 6,8.

No caso de estirpes contendo plasmídios, foi adicionada a neomi cina (20 pg/ml).

; As culturas contendo as estirpes de B.

!

i subtilis foram incubadas durante 65 horas a 37QC. Em todos os casos os frascos de agitação foram inoculados com 0,1 ml de uma j

cultura de Caldo de Soja Tríptico contendo 20 jag/ml de neomicina de tipo relevante que tinha sido incubada durante 24 horas a 375C.

A actividade da protease foi avaliada utilizando dimetilcaseína como substrato da forma descrita por ι Lin e col., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. As actividades * específicas mutantes da protease (EP-A-0328229) foram utiliza•I das para determinar a produção numa base de mg.

Os resultados das experiências de fermentação são resumidos na Tabela 1 seguinte.

TABELA 1

Estirpe Produção relativa Mutação de protease

PBT110	100%	WT
PBT125	0%	-
PBT108	120%	WT
PEPlll	100%	M216Q
PEP112	100%	M216S
PBT125 pBHB-MXL	95-100%	WT
PBT125 pBHB-MXL M216Q	95-100%	M216Q
PBT125 pBHB-MXL M216S	95-100%	M216S
PBT125 pBHB-MXL S160D	95-100%	S160D
PBT125 pBHB-MXL N212D	95-100%	N212D
PEP211	120%	M216Q
PEP212	120%	M216S
DS12367	0-1%	-
DS12367 pBHB-MXLR	4%	WT
DS12367 pBHB-MXL	40%	WT
DS12367 pBHB-MXL M216Q	40%	M216Q
DS12367 pBHB-MXL M216S	40%	M216S
DS12367 pBHB-MXL S160D	40%	S160D
DS12367 pBHB-MXL N212D	40%	N212D

Todas as publicações incluindo pedidos de patente) mencionadas nesta especificação são indicadores para os especialistas a que a invenção se refere. Todas as publij ! cações são aqui incorporadas como referência na extensão em que cada publicação individual foi especificamente e individualmente mencionada como incorporada como referência.

Embora a invenção anterior tenha descri, ta com algum pormenor como ilustração e exemplo com o objectivo de clareza e de compreensão, será óbvio para os especialistas • i que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem se • ΐ . j afastar do espírito e âmbito das reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lã Processo para a produção de proteases l mutantes que diferem das proteases do tipo natural em pelo me! nos um aminoácido, caracterizado por compreender a utilização ' de uma estirpe de Bacillus alcalofílica homóloga como hospedeiij ro de expressão, sendo a referida estirpe incapaz de produzir a {í protease do tipo natural.

   is íi

   - 2â Processo de acordo com a reivindicação

   I ~

   1, caracterizado por se empregar como hospedeiro de expressão uma estirpe de Bacillus alcalofílica negativa a protease.

   - 3ã Si Processo de acordo com a reivindicação j 2, caracterizado por se empregar como hospedeiro de expressão l uma estirpe de Bacillus alcalofílica negativa a protease e em que o gene de protease do tipo natural é suprimido do genoma.

   Processo de acordo com qualquer das rei. ί vindicações 1 a 3, caracterizado por se empregar um derivado ne ί gativo de protease de Bacillus novo especies PB92.

   - Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a 4, caracterizado por se empregar uma estirpe de ! Bacillus alcalofílica asporogénica.

   jj Processo de acordo com qualquer das rei.

   μ vindicações 1 a 5, caracterizado por se empregar um Bacillus as porogénico de que se suprimiu o gene da protease natural por re : combinação homóloga ou ilegítima.

   i

   I

   - 7ã Processo de acordo com qualquer das re_i vindicações 1 a 6, caracterizado por a protease mutante muito í! alcalina ser codificada por plasmídio.

   Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a protease muito alcalina do tipo natural ter essencialmente a sequência de aminoácidos de protease de Bacillus novo especies PB92.

   - 9ã Processo de acordo com as reivindicações _sí1 a 6, caracterizado por se suprimir o gene de protease muito alcalina do tipo natural do cromossoma e se inserir no genoma pelo menos uma cópia de um gene de protease muito alcalina mui tante.

   I

   - lOã I ί Processo de acordo com as reivindica' ções 1 a 6, caracterizado por se substituir o gene de protease j muito alcalina do tipo natural por pelo menos uma cópia do gene |i mutante de protease muito alcalina.

   I ' l· (

   í í - llã Processo de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado por se inserir pelo menos uma cópia de um gene mutante de protease muito alcalina no genoma e se co dificar com o plasmídio outra cópia.

   I

   I

   I i - 123 H

   Processo para a obtenção de uma estirpe de Bacillus alcalofílica tendo um nivel reduzido extracelular de protease muito alcalina, caracterizado por compreender i - isolar-se um gene, incluindo as suas regiões 5' e/ou 3' não

   I codificantes que codifica uma protease muito alcalina, inserir-se o gene num vector de clonação, suprimir-se a região codificante do gene do vector de clona Ção, j - transformar-se uma estirpe de Bacillus com o vector de clo’, nação,

   - desenvolver-se os transformantes em condições em que a fun31 ção de replicação do vector estã inactiva, e seleccionar-se transformantes que perderam a sequência de ADN que codifica a protease alcalina.

   - 13ã !

   j. Processo de acordo com a reivindicação

   12, caracterizado por a mencionada estirpe de Bacillus alcalofí_ lica ser Bacillus novo especies PB92 ou um seu derivado.

   li li l[ ii

   1' i! A requerente reivindica a prioridade do ; pedido de patente europeia apresentado em 11 de Agosto de 1989, i sob o NQ. 89202117.1.