PT94233B - Processo para a preparacao de peptidos biologicamente activos e composicoes farmeceuticas que os contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO N.° 94 233 REQUERENTE: COOPERS ANIMAL HEALTHLIMITED, britânica, in dustrial e comercial, com sede em Berkhamsted Hill, Berkhamsted, Hertfordshire,Inglaterra.

EPÍGRAFE: " PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS BIO LOGICAMENTE ACTIVOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊU TICAS QUE OS CONTEM " INVENTORES: Stephen James.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Grã-Bretanha, em 03 de Junho de 1989,sob o ns. 8912837-5. INPí. MOQ 113 RF 18732

Descrição referente à patente de invenção de COOPERS ANIMAL HEALTH LIMITED, britânica, industrial e comercial, com sede em Berkhamsted Hill, Berkhams-ted, Hertfordshire, Inglaterra, (inventor: Stephen James, resi dente na Inglaterra), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM".

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a pép-tidos biologicamente activos.

Muitas hormonas polipeptídicas, tais como hormonas de crescimento, sao importantes do ponto de vis^ ta medico e na criaçao de animais. As hormonas do crescimento encontram-se em todos os vertebrados e sabe-se que, por exemplo, fomentam o crescimento (somatogénese) e que aumentam a produção de leite (lactogénes). 0 controlo e a libertação de hormona de crescimento (GH) depende de outras hormonas ou "factores" que podem ter como resultado ou o aumento ou a diminuição das quantidades de hormonas presentes nos organismos dos vertebra dos. A libertação da hormona do crescimento realiza-se em res posta ao efeito de um péptido de libertação de hormona de crescimento, conhecido como factor de libertação da hormona do crescimento (GRF), hormona de libertação de hormona de 1

crescimento (GHRH) ou somatocrinina.

Dois trabalhos originais, realizados no Salk Institute, descreveram um péptido de libertação de hormona de crescimento com até quarenta e quatro aminoácidos do tumor pancreático humano (hp) (Rivier e col. , 1982; Guille_ min e col., 1982). Ele especificamente liberta hormonas de crescimento em doses fisiológicas e verificou-se ser idêntico a hormona de libertação de GH normalmente segregada pelo hipo_ talamo e que exerce a sua actividade nos somatótrofos da pituitária. Supoe-se que o equilíbrio de somatostatina (factor que inibe a somatotrofina) e GRF constitui a influência principal sobre a pituitária que origina o perfil de libertação característico de GH dos mamíferos. A sequência de aminoácidos de GRF de um certo número de espécies já foi descrita (Felix e col., 1985). Esta sequência é constituída por péptidos de quarenta e quatro aminoácidos, sendo a região mais intensamente conser^ vada a dos resíduos 1 - 27, residindo a maior variação nos re síduos 31 - 44. Há uma considerável actividade de espécies de toda a sequência completa, por exemplo, hpGRF-44 provoca uma boa resposta em gado caprino (Hart e col., 1984). Além disso, a actividade da molécula parece ser mais importantemente loca. lizada na região 1 - 27 e um número de análogos desta região mostraram uma maior actividade na espécie modelo (Lance e col. 1984) .

Tal como o uso em seres humanos, a administraçao de hpGRF a gado pode aumentar a produção de lei. te (Enright e col., 1986) e aumentar a retenção de azoto (Me-seley e col., 1987) em virtude da sua actividade de libertação de GH.

As sequências específicas das espécies v.de acordo com Felix e col., 1985) sao as seguintes: sequência comum 1 - 27 : YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIM. 2

sequência 28 - 44 humana : SRQQGESNQERGARARL-NH2 porcina : GRF : SRQQGERNQEQGARVRL-NH2 bovina : GRF : NRQQGERNQEQGAKVRL-NH2 caprina : GRF : NRQQGERNQEQGAKVRL-NH2 ovina : GRF : NRQQGERNQEQGAKVRL-NH2. (As letras sao as anotaçoes de uma única letra para os aminoá^ eidos - veja-se Apêndice I). )

Foi relatado que a actividade das hormonas pode ser afectada por anticorpos produzidos contra elas. Assim, na Patente Europeia AP A-137-234, refere-se que anticorpos contra hormonas do crescimento isolados e administrados a animais tiveram como resultado o aumento de activida. de da hormona. Estes anticorpos podem também ser produzidos in situ vacinando o animal hospedeiro com fragmentos apropria^ damente apresentados da hormona em questão, como se refere nas Patentes Europeias EP A-284-406 e EP A-303-488.

No entanto, Armstrong e col. (1989) mostraram que a imunização contra toda a molécula de GRF inibe a actividade desta hormona. Além disso, Reynolds e col. demonstraram que a imunização contra certos fragmentos de faç^ tor de libertação de corticotrofina (CRF) anulou a sua activi dade, como é demonstrado pela reduzida circulação da concentração de glucocorticóide.

Em contraste, descobriu-se agora que a actividade de GRF pode ser potenciada num vertebrado administrando a esse vertebrado um fragmento particular de GRF que produz anticorpos para o GRF intacto. Admite-se que esta potenciação de GRF estimule o crescimento, altere a composição da carcaça, melhore o rendimento do leite e exerça outros efeitos biológicos de GH nesse vertebrado. Deve entender-se 3

que o termo "fragmento”, tal como é utilizado na presente memória descritiva, exclui a referência ao conjunto da molécula de GRF.

Consequentemente, de acordo com um seu primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um mêto^ do para potenciar (aumentar ou reforçar) a actividade do fac-tor de libertação da hormona de crescimento num vertebrado, administrando ao referido vertebrado um fragmento que tem ho-mologia estrutural primária com a região que se prolonga atra ves da sequência de aminoácidos desde a posição 28 até 44 de GRF ( em particular, a região que se prolonga através da sequência de aminoácidos de GRF da posição 31 à posição 44) ou suas partes ou péptidos antigénica ou imunogenicamente equiva lentes ou moléculas ou seus sais.

Tal como é utilizado na presente memória descritiva, o termo "potenciar" significa que o fragmen^ to actua directa ou indirectamente no sentido de aumentar ou reforçar a actividade da hormona. 0 péptido pode derivar de proteína natural, sintetizada quimicamente ou preparada como produto de gene recombinante de um sistema de expressão apropriado, usando métodos conhecidos pelos peritos no assunto.

Em hpGRF, a região 31 a 44 compreende :

Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.

Pela expressão "homologia estrutural primária", pretende-se significar péptidos que duplicam preci^ samente as correspondentes regiões de moléculas de GRF de outras espécies e outros péptidos que têm "substituições conser vadas" de um ou mais aminoácidos, de tal forma que as proprie_ dades dos anticorpos assim produzidos a partir do péptido se- 4

jam substancialmente nao modificadas. (A expressão "substitui^ çao conservativa" define-se funcionalmente como na frase anterior ) .

Os exemplos de substituição que podem ser conservativas neste contexto incluem aquelas que têm substâncialmente a mesma hidrofobicidade, tamanho, carga e/ou aromaticidade que o resíduo original de aminoácido.

Todas essas substituições e modifica^ çoes sao geralmente conhecidas pelos peritos de química dos péptidos. Por exemplo, as substituições candidatas incluem: prolina em vez de glicina e vice-versa; alanina ou valina em vez de glicina e vice-versa; isoleucina em vez de leucina ou metionina e vice-versa; triptofano em vez de tirosina e vice--versa; histidina em vez de lisina e vice-versa; serina em vez de asparagina e vice-versa; treonina em vez de cisteína e vice-versa; serina ou alanina em vez de treonina e vice-versa; e glutamina em vez de asparagina e vice-versa. A expressão "antigenicamente equivalente" significa que um peptido ou o seu equivalente é especi^ ficamente reconhecido por certos anticorpos que, quando adicionados a péptidos de acordo com a presente invenção ou às suas partes, actuam para potenciar a actividade biológica de um factor de libertação da hormona de crescimento naquele ou num vertebrado semelhante. A expressão "imunogenicamente equiva_ lente" significa que o peptido pode ser usado, numa formulação apropriada, para formar anticorpos num vertebrado, actuan do os anticorpos de maneira a potenciar a acçao do factor de libertação naquele vertebrado.

De maneira particular, podem utilizar^ -se péptidos antigenica ou imunogenicamente equivalentes que sao ligeiramente mais curtos ou mais compridos do que a referji 5

da região ou que se sobrepoem substancialraente com a menciona da região. As variações em relação à sequência do GRF próprio do animal podem provocar uma maior resposta imune enquanto, ainda fornece anticorpos capazes de reconhecerem o GRF próprio do animal ou o GRF marcado (por exemplo, um introduzido exoge nicamente por meio de um implante).

Por consequência, pode ser vantajoso administrar um péptido curto de acordo com a presente invenção de uma espécie diferente da do animal à qual o péptido é administrado vantajosamente (por exemplo, administração de péptidos ovinos e porcinos) ou combinar substituintes de ami-noacidos nao naturais ou nao conservativos no péptido adminis^ trado.

Além disso, os péptidos em que um ou mais dos resíduos de aminoácido sao quimicamente modificados, antes ou depois de o péptido ser sintetizado, podem também ser utilizados desde que a função do péptido, nomeadamente a produção dos anticorpos específicos in vivo . se mantenha subs^ tancialmente nao alterada. Essas modificações incluem a forma çao de sais com ácidos ou com base, especialmente com ácidos e bases orgânicos ou inorgânicos fisiologicamente aceitáveis, a formaçao de um éster ou de uma amida de um grupo carboxilo terminal e a ligaçao de grupos de protecção de aminoácidos, tais como N-t-butoxi-carbonilo. Essas modificações podem proteger o péptido do metabolismo in vivo. Os péptidos podem estar presente como cópias únicas ou como múltiplos , por exem pio, repetições em série, tais como (31-44) + (31-44) ou (31-44) + (44-31). Essas repetições em série ou múltiplas podem ser suficientemente antigénicas em si próprias para obviar a necessidade de ligaçao de um veículo .

Pode ser vantajoso que o péptido seja formado como um círculo, com as extremidades N-terminal e C-terminal unidas uma a outra, ou adicionar um ou mais resíduos de cisteína a uma extremidade para aumentar a antigenici^ 6 dade e/ou permitir que se formem ligações de dissulfureto.

Se o peptido estiver ligado covalentemente a um veículo, preferivelmente um polipéptido, então o arranjo é preferivelmente tal que o peptido de acordo com a presente invenção forme um círculo. Apropriadamente, os péptidos sao amidados na extre midade C-terminal e um aminoácido adicional, por exemplo, cis_ teína, é adicionado à extremidade de N-terminal para facilitar a conjugação ou para melhorar a imunogenicidade potencial.

Um segundo aspecto da presente inven çao proporciona uma composição farmacêutica antigénica que compreende um ou mais dos péptidos de acordo com o primeiro aspecto da invenção como meios para proporcionar as funções de veículo e de agente auxiliar.

De acordo com as teorias imunológi-cas correntes, uma função veicular deve estar presente em qual_ quer formulação imunogénica a fim de estimular ou reforçar a estimulação do sistema imune. Pensa-se que os veículos incorporam (ou, em conjunto com o antigene, criam) um epítopo de célula T auxiliar. Os péptidos podem ser associados, por exem pio, por reticulação com um suporte separado, tal como albumi^ nas de soro, mioglobinas, toxóides bacterianos ou hemocianina de limpete género buraco de fechadura.

Os veículos mais recentemente desenvolvidos que induzem células T auxiliadoras na resposta imune incluem o antigene do núcleo da hepatite B (também chamado proteína nucleocapsídica), epitopos possíveis de células T, tais como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, betaga_ lactosidade e o péptido 163-171 da interleucina-1. Este último composto pode, como variante, ser considerado como veículo ou comoagente auxiliar ou como desempenhando ambas as funções.

Como variante, diversas cópias do mesmo péptido ou de péptidos diferentes de acordo com a pre- 7

sente invenção podem ser reticuladas umas ãs outras; nesta sjí tuaçao, nao há substância veicular separada como tal, mas pode proporcionar-se uma função de veículo por meio dessa reti-culaçao .

Os agentes reticulantes apropriados incluem os das listas habituais, tais como os indicados nos catálogos de Sigma e Pierce, por exemplo, aldeído glutárico, carbodiimida ou 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxila_ to de succinimidilo, explorando este último agente o grupo -SH do resíduo de cisteína do terminal C (se se encontrar pr£ sente).

Apropriadamente, a reticulaçao ou a conjugação usando MBS (m-maleimido-benzoil-N-hidróxi-succinimi_ da) ou aldeído glutárico é para um polipéptido, por exemplo, os péptidos propriamente ditos, o epitopo de célula T ou, mais apropriadamente, Keyhole limpet haemocyanin.

Se o péptido for preparado por expres^ sao de uma sequência de nucleótidos apropriada num hospedeiro também apropriado, pode ser vantajoso expressar o péptido como produto de fusão com uma sequência que proporciona a função auxiliadora de células T e actua como veículo. 0 sistema "Ecosec" de Kabigen é um exemplo de um desses arranjos. "Eco-sec" é uma marca comercial registada.

Conhecem-se agentes auxiliares apropriados aos do campo das vacinas, por exemplo, o agente auxiliar completo ou imcompleto de Freund, hidróxido de alumínio, saponina, DEAE-dextrano, muramil-dipeptido, óleos minerais, óleos neutros (tais como migliol), óleos vegetais (tais como óleo de amendoim), "Iscoms", liposomas, novasomas ou tecnologias semelhantes, polióis Pluronic ou o sistema auxialiar de Ribi (veja-se, por exemplo, a Patente Britânica GB-A-2189141). "Pluronic" é uma marca comercial registada. 8

.Λ \ J Ο peptido de acordo com a presente invenção pode ser ligado a outros antigenes para proporcionar o efeito duplo. Por exemplo, o péptido pode ser ligado a parte ou a toda a molécula de somatostatina para criar, em adi-çao a anticorpos anti-GRF, anticorpos anti-somatostatina que promovem o crescimento ou pode ser ligado a parte ou a toda a molécula de hormona sexual para proporcionar a imunocastra-çao simultânea ou parcial ou toda a hormona de libertação de hormona luteinizante (LHRH) ou pode ser ligada a parte ou a toda a molécula da hormona de crescimento para proporcionar a simultânea potenciação da acçao da hormona de crescimento ou de qualquer outra hormona péptidica envolvida no crescimento e na modulação da composição da carcaça.

Os péptidos e agentes auxiliares e/ou veículos podem ser formulados de qualquer maneira apropriada que possa ser prevista pelos peritos no assunto usando veículos conhecidos ou de conhecimento ainda a ser descoberto e critérios. Em particular, as formulações podem ser baseadas em polímeros biodegradáveis tais como copolímeros de lacti-da/glicolida tais como os referidos na Patente Europeia EP-A--58481 "ICI). Os péptidos de acordo com a presente invenção (quer estejam ligados quer nao estejam ligados a outros antigenes) podem ser utilizados em combinação com outros procedimentos de imunização (por exemplo, contra infecções bacteria-nas, virais ou parasíticas), para reforçar outros péptidos.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona anticorpos anti-GRF dirigidos a sequências de GRF da região que compreende os péptidos 28 - 44 (em particular, anticorpos anti-GRF dirigidos para o fragmento de GRF 31 - 44 ou 35 - 44) ou péptido antigénica ou imunologicamente equivalente ou seus sais. Apropriadamente, estes anticorpos anti-GRF podem ser complexados com GRF ou com fragmentos de GRF de acordo com a presente invenção.

Um outro aspecto da presente inven-• çao proporciona um método de tratamento de um vertebrado nor- 9

mal ou anormal com uma composição contendo um péptido de pequenas dimensões ou composição antigénica como se descreveu acima ou anticorpos anti-GRF (apropriadamente, anticorpos ant_i -GRF pré-complexados com GRF ou com fragmentos de GRF), a fim de alterar as características biológicas do vertebrado, em particular, os efeitos biológicos associados com GH.

Por exemplo, o desenvolvimento daque^ le vertebrado pode ser intensificado ou reforçado para além dos níveis normais ou a uma velocidade acelarada ou níveis de crescimento anormalmente baixos podem ser trazidos para valores proximos do semelhante, a produção de leite pode ser intensificada ou reforçada juntamente com outros efeitos biológicos associados com GH, tais como a composição da carcaça.

Por exemplo, a retenção do azoto e a proporção de carne magra para gordura pode também ser reforçada usando esses métodos. 0 termo "vertebrado" inclui seres humanos e não humanos.

Os péptidos curtos e as composiçoes antigenicas de acordo com a presente invenção sao geralmente administrados intravenosamente, subcutaneamente ou intramuscii larmente, embora também possam ser apropriadas as vias de administração intranasal, transdermal, oral ou rectal para alg_u mas formulações da presente invenção. 0 antigene pode também ser administrado por expressão como proteína de fusão por uma bactéria, fermento ou vírus geneticamente estudado que replica no ver tebrado hospedeiro. Em particular, os péptidos e os antigenes de acordo com a presente invenção podem encontrar-se presentes utilizando um suporte para bactérias, usando os métodos conhecidos da técnica, por exemplo, utilizando o mutante aro duplo de Salmonella ( ver pedido de Patente Internacional PCT/GB88/01143, publicado como a publicação Internacional Número W089/05856). A formulação é normalmente estéril 10

e, para uso patentérico, é substancialmente nao pirogénica e uma dose unitária inclui tipicamente 1 a 1.000 microgramas do péptido de pequenas dimensões de acordo com a presente invenção, tipicamente, 10 a 500 microgramas, preferivelmente, cerca de 50 microgramas ou menos.

Pode ser vantajosa uma ou mais imuni_ zaçoes repetidas, como é do conhecimento da técnica da imuno-logia. Geralmente, as formulações podem ser preparadas e/ou administradas por médicos ou veterinários de acordo com a sua experiência e qualificaçao.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, esta proporciona um processo para preparar um dos péptidos mencionados acima por métodos conhecidos da síntese dos péptidos ou por clivagem apropriada da molécula de GRF natural. A síntese pode realizar-se de acordo com o m£ todo geral de Stewart e col. (1969) ou pelos métodos descritos por Marglin e Merrifield (1970) e artigos subsequentes.

Os métodos tradicionais da síntese de péptidos por reacçao em fase sólida e técnicas semelhantes não sao geralmente apropriados para a produção em grande esca la (muito embora o possam a vir a ser no futuro) e, assim, a produção comercial dos péptidos faz-se normalmente por cultura de um organismo apropriado transformado com uma sequência de polinucleótidos que codificam o péptido pretendido. Portan_ to, outros aspectos da presente invenção incluem esses polinu_ cleotidos, vectores de transformaçao e de expressão que trans portam esses polinucleótidos, organismos transformados por eles e processos para a cultura desses organismos.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se aos vertebrados nao humanos cujas característica3 foram alteradas por métodos de acordo com a presente invenção.

Descrevem-se seguidamente alguns exemplos de processos de acordo com a presente invenção, fa li zendo-se referência aos desenhos anexos, nos quais: a Figura 1 representa a resposta de GRF atenuada em carneiros imunizados com anti-GRF 1-14 anti_ -sor o ; a Figura 2 representa a resposta de potenciação de GRF em carneiros imunizados com anti-GRF 31 -- 44 anti-soro; a Figura 3 representa a resposta de potenciação de GRF em carneiros imunizados com anti 35 - 44 anti-soro; a Figura 4 é uma curva de titulaçao que mostra o desenvolvimento de uma resposta anti-GRF num anji nal imunizado; a Figura 5 resume a acçao de anticor^ pos a GRF 1 - 14, 31 - 44 ou 35 - 44 mediante a resposta biológica de carneiros a GRF, durante um período de quatro horas; e a Figura 6 realça a acçao de anticor_ pos a GRF 1 - 14, 31 - 44 ou 35 - 44 durante os sessenta minu tos iniciais. Métodos Gerais 1. Preparaçao de péptidos A nao ser que se indique outra manei ra de proceder, todos os péptidos foram sintetizados pelo modo FMOC-poliamida de síntese de péptidos em fase sólida.

Proporciona-se protecção temporária ao grupo N-alfa-amino por meio do grupo 9-fluorenil-metilóxi- 12 -carbonilo (FMOC). A clivagem repetida deste grupo de protec-çao lábil fortemente básico efectua-se usando piperidina a 20% em N,N-dimetil-formamida.

As funcionalidades da cadeia lateral sao protegidas sob a forma dos seus éteres de butilo (no caso da serina, treonina e tirosina), ésteres de butilo (no caso do ácido glutâmico e do ácido aspártico), derivado de butiló-xi-carbonilo (no caso da lisina e da histidina), derivado de tritilo (no caso da cisteína) e o derivado de 4-metóxi-2,3,6--trimetil-benzeno-sulfonilo ( no caso da arginina). Quando a glutamina ou a asparagina sao resíduos da extremidade C, utiliza-se o grupo 4,4'-dimetóxi-benzidrilo para a protecçao das funções amido da cadeia lateral. 0 suporte da fase sólida baseia-se num polímero de poli-dimetacrilamida constituído a partir de três monómeros de dimetilacrilamida (monómero da cadeia), bis_ -acriloil-etilenodiamina (agente reticulante) e éster de meti lo de acriloil-sarcosina (agente funcionalizante). 0 agente ligado clivável de péptido-a-resina utilizado é um derivado do ácido 4-hidroximetil-fenóxi-acético que é um ácido fácilmente eliminável.

Todos os derivados de aminoácidos sao adicionados sob a sua forma de derivados de anidrido simé_ trico previamente formado, com a excepçao da asparagina e da glutamina, que são adicionadas usando um procedimento de acoplamento invertido mediado por N,N-diciclo-hexil-carbodiimi-da/l-hidróxi-benzotriazol.

Todas as reacçoes de acoplamento e de desprotecçao sao controladas usando os procedimentos de ensaio de ninidrina, ácido trinitrobenzeno-sulfónico ou isoti na.

Depois de completada a síntese, os 13

péptidos sao clivados do suporte de resina com a concomitante eliminação dos grupos de protecção da cadeia lateral por tratamento com ácido triflúor-acético a 95% contendo 5% de mistu ra eliminadora. Os eliminadores vulgarmente utilizados sao etanoditiol, fenol, anisol e água, dependendo a escolha exac-ta dos aminoácidos constituintes do péptido a ser sintetizado. 0 acido triflúor-acético I eliminado por evaporaçao in vacuo. com subsequente trituração com éter dietílico para se obter o péptido bruto. Quaisquer eliminadores presentes sao retirados por simples extracçao que, por liofilizaçao da fase aquosa, proporciona o péptido bruto isento de eliminadores. A purificação pode efectuar-se por uma qualquer técnica ou combinação de técnicas cromatográfi-cas, tais como cromatografia com exclusão de tamanho, cromato. grafia com permuta de ioes, cromatografia de afinidade (por exemplo, utilizando um anticorpo monoclonal apropriado) e cro matografia em fase líquida de elevado rendimento em fase inversa. A análise dos péptidos pode realizar-se utilizando cro matografia em camada fina, cromatografia em fase líquida de elevado rendimento em fase inversa, análise de aminoácidos de^ pois da hidrólise ácida e por análise espetrométrica de massas (FAB) por bombardeamento atómico rápido. 2. Conjugação de péptidos i) Conjugação com ovalbumina

Dissolveram-se 3,0 mg de péptido em 300 microlitros de dimetil-formamida. Adicionaram-se 150 mi-crolitros de 10 mg/ml de ovalbumina em solução salina tamponi_ zada com fosfato de Dulbecco (PBS) e raisturou-se cuidadosameji te. Adicionaram-se lentamente 250 microlitros de glutaraldeí-do 0,04 molar recentemente preparado, sob agitaçao, durante um período de tempo de dez minutos e depois deixou-se â tempe_ ratura ambiente durante mais sessenta minutos com agitaçao 14

contínua (SPIRAMIX, Denley Instruments). Adicionou-se 1,0 ml de PBS e seguiram-se mais 100 microlitros de glutaraldeído 0,04 molar, como se referiu acima. Deixou-se repousar durante sessenta minutos à temperatura ambiente, antes de se realizar a diálise durante a noite a +4°C contra PBS. ii) Conjugação com hemocianina de limpeto de fechadura (KLH) 3 }

Conjugaram-se 5 mg do péptido com h£ mocianina de limpet de ajustamento usando a técnica da m-ma-leimido-benzoil-N-hidróxi-succinimida - MBS (R. A. Lerner e col., 1981), fornecida por Pierce and Warriner (UK) Ltd., Chester, Inglaterra ou utilizando o método do glutaraldeído aleatório. Este último realizou-se procedendo da seguinte maneira: 5 mg de péptido hpGRF foram dissolvidos em 250 microli_ tros (PBS - Dulbocco) e 500 microlitros de KLH 10 mg/ml em PBS. Adicionaram-se gota a gota 500 microlitros de glutaraldeído 0,04 molar (Sigma), com agitação. Fez-se rodar este à temperatura ambiente durante sessenta minutos. Adicionaram-se mais 1,5 ml de PBS e depois 500 microlitros de glutaraldeído 0,04 molar, como se descreveu acima e fez-se rodar a mistura durante trinta minutos. Submeteu-se a mistura reaccional a diálise, usando uma membrana de diálise Spectropor com 1 kDa de corte, durante a noite contra 100 volumes de PBS. 3. Reticulaçao

Dissolveram-se 1,4 mg de péptido em 140 microlitros de dimetil-formamida e adicionaram-se 170 microlitros de glutaraldeído 0,04 molar como se referiu acima. De resto, procede-se da mesma maneira. Se nao é necessária qualquer reticulaçao nem conjugação, dissolveu-se o péptido em dimetil-formamida, dispersou-se em PBS mas não se diali-sou. 15

Controlos Negativos

Prepararam-se controlos negativos em paralelo com os acima mencionados nao utilizando péptido com ovalbumina (ou KLH) ou utilizando poli-lisina (peso molecular= = 1.000 - 2.000 Da) e reticulou-se como se descreveu acima. 4. Agentes Auxiliares e Administração - "Freunds"

Depois da dialise, os volumes das preparações acima mencionadas foram diluídos com PBS até perfazer 4,5 ml e prepararam-se emulsões do tipo de água-em-óleo usando dois volumes de adjuvante completo de Freunds (Difco ou Sigma FCA). Isso conseguiu-se por tratamento a frio com ul^ tra-sons ou usando um homogeneizador de Potter-Elvehjen. As emulsões foram ensaiadas por dispersão (ou por ausência) sobre uma superfície de água.

As injecçoes foram administradas su_b cutaneamente em dois sítios (um de cada lado) em carneiros

Cheviot (com idades de 9 - 12 meses, machos castrados, 30 - - 35 kg). Em cada sítio, administrou-se 1 ml.

Realizou-se uma segunda imunização de maneira semelhante 28 a 42 dias depois, usando péptido recentemente preparado conjugado da mesma maneira mas emulsiona do com adjuvante incompleto de Freunds (FIA, Difco ou Sigma). Qualquer imunização subsequente foi semelhante, mas feita com intervalos de vinte e oito dias. Ratos receberam 0,1 ml das preparações intraperitonialmente a intervalos de tempo semelhantes . 5. Adjuvante e administração - Outros

Utilizaram-se, sozinhos ou em combi_ 16

naçao, DEAE-dextrano (completamente hidratodo durante a noite com água bidestilada : pharmacia), saponina (Sigma) e hidróxji do de alumínio (MAl-hidrogeln). Depois da diálise, fizeram-se adições de 3,1 ml de PBS mais 7 ml de 5% de DEAE-dextrano (dd) mais 2,8 ml de 5 mg/ml de saponina; ou 5,9 ml de PBS mais 7 ml de 5% de Dd; ou 10,1 ml de PBS mais 2,8 ml de 5 mg/ml de saponina. Utilizou-se hidróxido de alumínio ("A10H") a 1,0 mg/ml de concentração final, quando fosse apropriado. Nao foi necessária qualquer operação de emulsionaçao mas teve-se o cuidado de manter os constituintes em suspensão homogénea. Administrou-se 1 ml a carneiros, como se descreveu acima. Efe£ tuaram-se imunizações nos mesmos intervalos. 6. Amostras de sangue (Carneiros)

Retiraram-se amostras de 10 ml de sangue por punctura da veia jugular a partir de carneiros usa dos no ensaio, precisamente antes da administração e a intervalos de tempo posteriores. Depois de se deixar que se realizasse a sedimentação à temperatura ambiente (aproximadamente três a cinco horas), separou-se o soro por centrifugação para o ensaio de rádio-imunidade de detecçao de anticorpos. Colec-taram-se amostras maiores de soro da mesma maneira a partir de aproximadamente 150 - 200 ml de sangue e congelaram-se a -20°C para subsequente fraccionamento da fracção de IgG para utilização nos ensaios.

Amostras de sangue (Ratos)

Retiraram-se pequenas amostras de sangue (0,25 - 0,5 ml) da via retro-orbital ou por secção da veia da cauda e trataram-se como se descreveu para os carneiros. Nao se retiraram amostras maiores. 7. Ensaio de rádio-imunidade _ 17 _

A nao ser que se indique outra maneira de proceder, a detecçao de anticorpos aos péptidos que se poderiam também ligar ao factor de libertação da hormona de crescimento efectuou-se por ligaçao directa à fase líquida, como se descreveu anteriormente (Aston e col., 1985; Chard, 1987).

EXPERIENCIAS

Desenvolvimento de Anti-soros

1A Imunização de Ratos e Carneiros contra hpGRF 31 - 44 e Detecçao de Anticorpos hpGRF Método

Sintetizou-se a seguinte sequência por meio do instrumento de Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, Inglaterra e purificou-se por cromatografia em fase líquida de alta pressão, para se obter um péptido com mais de 80% de pureza:

Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu- -nh2

Note-se que este péptido está amida-do na posição 44 e tem um resíduo de cisteína adicionado na posição 30 para facilitar a conjugação usando MBS (veja-se abaixo) ou para melhorar a imunogenicidade potencial.

Conjugaram-se 5 mg do péptido com Keyhole Limpet Haemocyanin, usando a técnica da m-maleimido--benzoil-N-hidroxi-succinimida e o método do glutaraldeído aleatorio. Ajustou-se o volume de ambas as conjugações até perfazer 5 ml. Adicionaram-se 10 ml de adjuvante completo de Freund (FCA - Sigma). Arrefeceu-se este a 0°C e emulsionou-se por meio de ultra-sons usando uma amostra previamente arrefecida. 18

Utilizaram-se preparações completas para imunizar dois grupos de ratos e de carneiros. Este último recebeu 1 ml por via subcutânea em dois sítios dos lados para se obter uma dose total de peptido de 667 microgramas por carneiros. Utilizaram—se cinco carneiros North Cheviot com a idade de dezoito meses por preparação. Utilizaram-se seis ratos (Balb/C) por preparação e cada um recebeu 100 microgramas de péptido em FCA, administrados intraperitonialmeii te .

Recolheram-se amostras de sangue de todos os animais quatro semanas depois e receberam imediatamente uma dose semelhante ("reforço") àquela que se descreveu previamente, com excepçao de as cargas totais de péptido serem iguais a metade e a emulsão ter sido preparada utilizando adjuvante incompleto de Freunds (FIA - Sigma).

Retiraram-se amostras de sangue de todos os animais quinze dias depois e (apenas os carneiros) semanalmente em seguida. Todos os animais receberam uma dose de reforço posterior em FIA vinte e oito dias depois do primeiro reforço.

Os soros destas amostras de sangue foram ensaiados relativamente a presença de anticorpos anti--GRF por método de ensaio de rádio-imunidade competitiva, utilizando factor de libertação de hormona de crescimento 3-125 10 -( I)-iodotirosil 1-44 amida (Amarsham, Bucks., Reino Unido) e anti-rato ou anti-carneiro Sac-Cel (Immununodiagnos-tics, Ltd.). Utilizou-se um anticorpo anti-GRF de coelho (Me-tachem Diagnostics, LTD., Northampton, Reino Unido) com Sac--Cel anti-coelho como controlo positivo preliminar deste sistema. Retiraram-se então amostras a granel de carneiro para a preparaçao de IgG e realizou—se a análise subsequente das propriedades. 19

RESULTADOS

Os resultados estão reunidos na Tabe^ la que indica a percentagem de animais sobreviventes que apre^ sentaram uma resposta de anticorpos positiva a partir de pelo menos duas sangrias de ensaio.

Método de Ratos Balb/G Carneiros Cheviot Conjugação (sobreviventes) (sobreviventes) MBS 33% 40% (6/6) (5/5) Glutaraldeído 40% 60% (5/6) (5/5) 18 Imunização de Carneiros contra uma Gama de Sequências de Aminoácidos Derivados de GRF Método

Sintetizaram-se as seguintes sequências utilizando o instrumento de Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, Inglaterra e purificaram-se por cromatografia em fase líquida sob alta pressão, para se obterem peptidos com mais de 80% de pureza.

Cys^+1-14: (I) Cys-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val--Leu 15-27+Cys28: (II) Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Cys 20

Cys21+22-35: (III) Cys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-

Ser-Asn

Cys3°+31-44NH2: (IV) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala- -Arg-Leu-NH2 30

Cys u+31-39: (V) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly ) 31-39: (VI) Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly Cys34+35-44NH2: (VII) Cys-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 29 44

CysZy + 30-43+Lys^NH2: (VIII) Cys-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Lys-NH2.

Dissolveram-se todos estes péptidos em solução salina tamponizada com fosfato 50 mM (pH = 7,2, PBS) e conjugaram-se numa base de igual peso com Keyhole Lim-pet Haemocyanin (KLM; Sigma, Poole, Inglaterra), usando o método de glutaraldeído aleatório acima descrito. Emulsionou-se esta preparação com adjuvante completo de Freunds e administrou-se subcutaneamente a carneiros (South Down x Kent), divi_ dindo 1 ml entre dois sítios dos lados de cada carneiro. A do^ se total inicial foi aproximadamente igual a 500 microgramas de péptido por carneiro. Utilizaram-se cinco carneiros por tratamento incluindo um grupo de controlo negativo de apenas KLH. Efectuaram-se imunizações semelhantes ao fim de vinte e oito e de setenta dias depois da dosagem inicial. Estas doses continham cerca de 50 a 5 microgramas de péptido por carneiro, respectivamente. 21

De todos os animais, retiraram-se amostras de sangue para tubos de soro Monovette, por punctura da veia jugular nos dias -5, +14, +27, +35, +42, +56, +63, +70, +84, +98 e +112 (relativos à primeira imunização). Além disso, tomaram-se amostras maiores de até 200 ml em ocasioes apropriadas, para a separação subsequente de anticorpos. Sepa_ raram-se os soros de todas as amostras e armazenaram-se a -20°C, antes de serem ensaiados relativamente à presença de anticorpos anti-GRF humana por ensaio de rádio-imunidade competitiva como se descreveu acima.

Resultados

Todos os carneiros sobreviveram às imunizações. A Tabela indica o número de animais que produziram uma resposta de anticorpos positiva em pelo me nos duas das sangrias de ensaios.

Peptido Percentagem de Animais com Resposta Positiva I 40 II 20 III 40 IV 60 V 40 VI 20 VII 60 VIII 0 controlo negativo 0 e um ponto de partida e parece-se mais ade-

0 péptido VIII considerável da sequência humana de GRF 22

quadamente com as sequências de GRF ovina/bovina/porcina. A análise da mancha pontual (Harlow e Lane, 1988) mostrou que os anticorpos para este antigene tinham aumentado em 60% dos animais e que haveria probabilidade de reconhecer GRF ovina e outras .

Conclusões

Os anticorpos podem aumentar em rela çao a uma gama de péptidos da sequência de GRF e estes reconhecem a molécula intacta de que se derivaram e/ou o imunogé-nio original. 2. Actividade de Potenciação de GRF de Anti-Soros in vitro Método

Utilizando um sistema in vitro basea do e descrito Machlin e col., (1984), mas utilizando pituitárias de carneiro, investigou-se a acção de GRF com ou sem diferentes tipos de anti-soros ovinos. Ensaiou-se a GH no meio de ensaio pelo método de Hart e col., (1975), com a diferença de os padrões terem sido dissolvidos no meio apropriado in vitro e se ter utilizado "Sac-cel" anti-cobaia (Wellcome Diag^ nostics) em vez do sistema de suporte/anticorpo duplo descrito .

Adicionaram-se anti-soros (5 microli tros) contendo hpGRF a 1.000 microgramas/mililitro e adicionou-se menos do que a quantidade apropriada (ou não) a depres^ soes em quadruplicado contendo células de pituitária conflueii tes e 1 ml de meio fresco em que se tinha omitido o soro de feto de vitela. Retirou-se o meio depois de quatro horas a 37 C e congelou-se a -20°C para o subsequente ensaio de GH. 23

Resultados 0 quadro seguinte mostra as quantida^ des de GH detectadas no meio in vitro pelo ensaio de rádio--imunidade. Sao expressos como microgramas em GH/ml/cinco horas com os desvios padrão.

Anti-soros de carneiros GRF 1-44 contra 0 1,0 hpGRF 1-29 glutaraldeido ^1,0 conjugação com ovalbumina <1,0 Suporte apenas glutaraldeido <1,0 ovalbumina reticulada hpGRF Cys+30-44-NH2 MBS 30,2+7,9 conjugação com <1,0 ovalbumina 63,1+9,1 adicionado (ug/ml) anti-soro10,0 100,0 1000,0 <1,0 14,9+11,0 25,6+9,4 61,7+8,6 82,9+16. 103,4+11,1 79,2 + 10,9 101,3+10,199,7+14,3

Conclusões

Estes resultados mostram que os anti^ corpos da região 30 - 44 da molécula de GRF podem aumentar a sua actividade in vitro. enquanto os obtidos relativamente à região 1-29 diminuem a actividade de GRF adicionada. 0 reforço indicado a partir destes dados é aproximadamente de sete a dez vezes. 3 · Purificação de Anticorpos de Anti-Soros _ 24_

0 soro proveniente das sessões de sangria de grande volume usando carneiros seleccionados é purificado para se obter uma fracção de anticorpos primariamente que podia ser utilizada na subsequente experiência in vitro. Isto baseava-se no ensaio descrito por Harlow e Lane (1988): um fraccionamento com sulfato de amónio de dois andares origjl nou uma fracçao semipura que foi dializada contra fosfato de sódio 5 mM (pH = 6,5) antes da purificação descontínua usando uma matriz de DEAE. A preparaçao final foi ensaiada de novo relativamente à actividade e guardada, congelada a -20°C, em PBS sem agentes preserverantes.

4. Actividade de Potenciação de GRF in vivo de Anti-corpos Anti-GRF Método

Prepararam-se quinze carneiros (ovelhas virgens de meia criação Scottish) com um peso vivo médio de 48 quilogramas adaptando catéteres na carótida e na veia jugular unilateralmente, vinte e quatro horas antes do primei ro período experimental. Elas tinham sido ajustadas duas se_ manas a uma dieta constituída por 16% de proteína bruta, completa, granulada, com uma taxa de 3,5% de peso vivo. Retirou- -se a alimentaçao dezoito horas antes das fases e durante as fases de amostragem da experiência. A concepção básica foi um quadrado latino para tratamento de cada ovelha, com três tratamentos básicos. Estes tratamentos foram os seguintes: 1) - GRF (humano, 1-44 amida, Cambridge Research Biochemi- cals) sozinha, a 1 micrograma/kg; 2) - Apenas anticorpos (equivalentes a aproximadamente um ex cesso de dez vezes em relaçao à dose de GRF); 25

3) - GRF a 1 micrograma/kg, previamente coraplexada com anti--corpos (com um excesso de dez vezes, como se mencionou acima), misturando suavemente durante uma hora à tempera tura ambiente.

Existiam anticorpos de três anti-so-ros diferentes dirigidos para sequências de GRF 1 - 14, 31 -- 44 ou 35 - 44, que foram atribuídos aleatoriamente aos carneiros no ensaio a cinco animais por grupo.

Retiraram-se amostras de sangue por meio do catéter venoso a intervalos de dez minutos antes da administração (e lavagem) das preparações de GRF e/ou dos ant.i -corpos por intermédio do catéter da carótida no "momento" zero. Retiraram-se outras seis amostras venosas a intervalos de cinco minutos (a t + 30 minutos); a intervalos de dez mi nu. tos até t + 60 minutos e, finalmente, oito amostras a intervalos de trinta minutos (a t + 240 minutos). Antes de reter 5 ml de sangue venoso em tubos heparinizados, rejeitaram-se os 2 ml iniciais. Centrifugaram-se as amostras e separou-se o plasma e armazenou-se a -20°C até ser ensaiado relativamente aos níveis da hormona de crescimento por ensaio de rádio-imunidade (Hart e col., 1975). Os tratamentos subsequentes do en saio foram completados sete a catorze dias depois.

Estatística

Calcularam-se os níveis médios de GH individuais para cada ponto no tempo e analisou-se por análise de variância e por um ensaio t protegido com F. Calculou-se a area por baixo da curva (ou suas partes) utilizando a regra de Simpson para a integração e compararam-se estes semelhante, mente (SAS, 1985).

Resultados 26

As respostas médias para cada grupo de tratamento para a administraçao de cada uma das preparações de anticorpos relativos a GRF 1 - 14, 31 - 44 e 35 - 44, estão representados nas Figuras 1 a 3, respectivamente. Os pa_ râmetros estatísticos foram omitidos por uma questão de clare za.

Pode ver-se que o GRF origina uma curva de resposta a GH dentro de alguns minutos depois de administração o que faz voltar para níveis de controlo aproximadas dentro do período de ensaio. Os anticorpos GRF 1-14 aboli ram esta resposta na preparaçao de agente complexante e nao parecerem estar associados a um episódio mais importante de GH quando administrados sozinhos. Em contraste assinalavel, o complexo de GRF e de anticorpos às sequências 31 - 44 ou 35 - 44 origina um nível de GH no plasma consistentemente ele vado em relaçao ao do GRF sozinho. Adicionalmente, a duração destes níveis de GH elevados pode também ser sustentada, como se mostra na Figura 3, durante cerca de 90 - 210 minutos. 0 desenvolvimento de uma resposta aii ti—GRF e demonstrado pelas curvas de titulaçao para um animal imunizado na Figura 4. A Figura 5 resume estes modelos de actividade como medias das areas por debaixo das curvas nas Figuras 1-3 derivadas para cada animal no ensaio. Esta Figij ra também ilustra a capacidade dos anticorpos a GRF 35 - 44 para iniciar inerentemente um impulso de GH. A Figura 6 chama a atenção para a ac tividade durante os primeiros sessenta minutos a seguir ao tratamento, mostrando uma diferença significativa (p 0,01) de níveis de GH do plasma médios entre os anti-soros 1 - 14 e 31 - 44, assim como os efeitos de melhoria semelhantes do GRF complexado com anticorpos a 31 - 44 e 35 - 44, que sao também ligeiramente mais significativos do ponto de vista estatísti- 27 co (p 0,01).

Conclusões Globais

Os anticorpos para a região 1-14 da sequência de GRF, mas, em surpreendente contraste, os cultivados em regiões da molécula de GRF entre os resíduos 31 e 44 nao só inibem, mas sao capazes de aumentar a actividade biológica de GRF. Estes anticorpos podem ser utilizados para aumentar as capacidades de libertação de hormona de crescimen to de GRF por administração a partir de fontes endógenas ou exógenas, incluindo a utilização dos dispositivos da libertação retardada, etc ou em animais transgénicos que expressam genes de GRF ou GH adicionais.

APENDICE I Símbolos dos Aminoácidos

Aminoácido Símbolo de Três Letras Símbolo de Uma Letra

Alamina Ala A Ar ginina Arg R Asparagina Asn N Acido Aspártico Asp D Cisteína Cy s C Glutamina Gin Q Acido Glutâmico Glu E Glycine Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Ly s K Metionina Met M 28

Fenilamina Phe F Prolina Pr o P Serina Ser S Treonina Thr T Tr iptofano Tr p W Tirosina Tyr Y Valina Vai V REFERENCIAS bibliográficas

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Claims (1)

1. 7 h

   - Ia - Processo para a preparaçao dum pép-tido biologicamente activo que compreende um fragmento ou uma sequência de resíduos que potência a actividade do factor de libertação da hormona do crescimento (GRF) em vertebrados, tendo essa sequência ou uma sequência com uma homologia estr^u tural primária em relaçao a ela nomeadamente na região das po^ siçoes dos aminoácidos 28 - 44 a partir da extremidade N do GRF, ou de um peptido antigénica ou imunologicamente equivalente ou um dos seus sais, caracterizado por se sintetizar, preferivelmente por um método de sintese de péptido em fase sólida, um péptido tendo a desejada sequência de aminoácidos, ou se transformar uma espéí cie hospedeira eucariótica ou de um mamífero com uma sequência de DNA correspondendo à desejada sequência de aminoácido e realizar-se a cultura das espécies transformadas e recuperar--se o desejado péptido biologicamente activo da biomassa resultante da cultura, após ter sido devidamente ensaiada. - 2a - Processo de acordo com a reivindicfi çao 1, carac ter izado pelo facto de o péptido ter homologia es_ trutural primária com uma sequência de resíduos de aminoácidos de factor de libertação de hormona de crescimento na região das posiçoes compreendidas entre as posiçoes 28 - 44 ou péptidos antigénica ou imonologicamente equivalentes ou seus sais. - 3a - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se obter um péptido que corresponde a um dos fragmentos do GRF a) GRF 31 - 44 ou 31

   b) GRF 35 - 44 em que o GRF e de origem humana, bovina, ovina, porcina, caprina, equina, canina, felina,de aves ou de salmao ou a pép-tidos antigenica ou imonologicamente equivalentes ou os seus sais . - 4a - Processo de acordo com a reivindica^ çao 3, caracterizado por se obter um péptido com homologia es_ trutural primaria a um péptido de acordo com a reivindicação 3 ou um seu sal. - 5a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter um péptido com as características referidas numaqualquer das reiviin dicaçoes anteriores e adicionalmente compreende um resíduo que reforça/facilita a conjugação e/ou melhora a imunogenici-dade potencial. - 6a -

   Processo de acordo com a reivindica^ çao 5, caracterizado pelo facto de o resíduo adicional ser um resíduo de cisteína terminal. - 7a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter um péptido conjugado com um antigene. - 8a - Processo de acordo com qualquer das 32 4*' —2£ϊ--- reivindicações anteriores, caracterizado por se obter ura pép-tido conjugado com a) o próprio péptido, ou b) um outro peptido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, ou c) um epítopo de célula T, ou d) parte, ou todas as células de hormona de crescimento ou de somatostatina. - 9a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter uma se quência de polinucleótidos que codifica um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6. - 10a - Processo de acordo com a reivindica^ çao 9, caracterizado por se obterem anticorpos anti-GRF dirigidos a sequências de GRF da região que compreende as posições 28 -44 ou péptido antigénica ou imunologicamente equivalente ou os seus sais. - 11a - Processo de acordo com a reivindica, çao 10, caracterizado por se obterem anticorpos anti-GRF diri. gidos ao fragmento de GRF 31 - 44 ou 35 - 44 ou péptido anti-genica ou imunologicamente equivalente ou seus sais. - 12a - Processo de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizado por se obterem anticorpos anti^ -GRF complexados com GRF ou fragmentos de GRF de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4. 33 13a Processo para a preparaçao de compo_ siçoes farmacêuticas antigénicas apropriadas para alterar as características biológicas de um vertebrado, nomeadamente reforçar a somatogénese, lactogénese ou composição da carcaça, caracterizado por se incorporar um péptido quando preparado de acordo cora qualquer das reivindicações 1 a 9 em meios que desempenham as funções de agente auxiliar e de veiculo. - 14a - Processo de acordo com a reivindica çao 10, caracterizado pelo facto de o péptido estar ligado a um veículo. - 15a - Processo de acordo com as reivindica çoes 10 ou 11, caracterizado por se misturar o péptido, quer esteja ou não ligado a um agente veicular, com um adjuvante. - 16a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo facto de o péptido ser fundido com uma proteína codificada por um microorganis-mo . A requerente reivindica a priorida_ de do pedido britânico apresentado em 3 de Junho de 1989, sob o NQ 8912837-5. Lisboa, 1 de Junho de 1990 0 AGENTE OFICIAL 1)A PROFKIEDADE INDUSTRIAI

   34 Λ D RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTI-VOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM" A presente invenção refere-se ao processo para a preparaçao de um peptido que tem homologia ejs trutural primária com uma sequência de resíduos de aminoácidos de factor de libertação de hormona de crescimento (GRF) na re giao compreendida entre as posiçoes 28 - 44 ou péptidos anti-genica ou imunologicamente equivalentes ou seus sais que podem ser usados na preparação de uma formulação antigénica para potenciar os efeitos da hormona do crescimento num vertebrado . J