PT91253B - Processo de sintese "in vitro" de um acido ribonucleico infeccioso - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO objecto da presente invenção é uma síntese in vitro de um ARN infeccioso de HRV2, assim como o as sim chamado clone de tamanho completo (full size) de HRV2.

Os rinovírus humanos são os principais causadores de constizaçoes (1). Não obstante existirem mais do que cem serotipos antigénicos diferentes todos eles ligam com o mesmo receptor (2), com excepção de dez serotipos. Os avanços mais recentes da investigação sobre osrinovírus, como a de terminação da sequência de nucleótidos de quatro serotipos e a determinação da estrutura cristalina de HRV14, levaram, na ver dade, à melhor compreensão da multiplicidade dos serotipos (3, 4, 5, 6, 7, 8), embora ainda não seja possível conseguir consPA' i

truir uma imunidade permanente ou pelo menos duradoira contra infecçoes provocadas por rinovírus.

Depois de realizada a infecção, mani_ festa-se na verdade a presença de anticorpos contra a estirpe que provoca a infecção, mas estes nao garantem protecção contre. outras estirpes de rinovírus. Uma vacinação profiláctica como a que é possível, por exemplo, no caso dos vírus da poliomielite ou da influenza é pelo menos parcialmente excluída.

Para desenvolver uma possibilidade de terapia activa contra infecçoes provocadas por rinovírus é indispensável, por consequência, analisar a história dos vírus que aparecem nas células.

Para esse efeito, é uma condição prévia desenvolver um sistema de ensaio com o qual se possa in vestigar, por exemplo, alterações sobre a sua acção sobre a história dos vírus.

Um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um sistema de ensaio com o qual se p£ dem investigar quaisquer mutações previstas que se produzam no plano do ADN.

De acordo com a presente invenção, este objectivo foi atingido mediante a síntese de uma cópia de cADN de HRV2 que possibilita transcrever ARN infeccioso in vitro . Com este cADN sintético é surpreendentemente possível imitar o comportamento dos vírus para HRV2 In vitro.

As acções de cada uma das mutações sobre o plano do ADN como, por exemplo, supressões, inserções e trocas de pares de bases podem investigar-se directamente e medir quantitativamente com ele.

Os conhecimentos que se podem obter com o auxilio deste sistema de ensaio, susceptíveis de generalizar mais cedo, por causa da maior homologia do HRV2 para os rinovírus até agora sequenniados do que com o clone de tamanho completo de HRV14 que se pode obter de acordo com Mizutani e col.. Nao obstante, este clone que continha mais vinte e um nucleótidos do que o ADN nativo ele podia obter-se com o seu ARN infeccioso. Racaniello e col. puderam mostrar que uma cópia de cADN completo de poliovírus pode produzir vírus in-

fecciosos.

Até agora, ainda não foi descrito um clone de cADN de nenhuns rinovírus que pertencem ao assim chamado grupo de receptor menor, a partir do qual se pudesse transcrever um ARN infeccioso.

No entanto, descreveram-se já clones de cADN de HRV2 (6) ainda que o comprimento médio de 0,5 kb não seja vantajoso para a construção de um cADN completo.

Para se atingir o objectivo de acordo com a presente invenção, procedeu-se, por conseguinte, como se descreve seguidamente:

A síntese da primeira cadeia de ARN de HRV2 (5 microgramas) realizou-se como se descreveu na literatura (10). Este cADN foi transformado em cadeia dupla com RNase H e ADN polimerase 1, em que se utilizaram reagentes de Amersham.

Utilizou-se T4 ADN polimerase para degradar as saliências. Depois de tratamento com EcoRI metilase, adicionaram-se ligadoras EcoRI e digeriu-se o cADN com EcoRI. Isolaram-se as moléculas mais compridas do que 4 kb com gel de agarose a 1% e ligou-se o sítio EcoRI do plasmídio do escrito azul (Stratagene, San Diego, Califórnia, Estados Unidos da América).

Os recombinantes foram sequenciados para garantir que todas as regiões da sequência de HRV2 estivessem cobertas. As zonas que não estão recobertas são prepara das ou por síntese química ou por repetição das operações acima descritas. Em seguida, estes clones são reunidos para se ob ter uma molécula completa de cADN. Na extremidade 3' do cADN completo de HRV2 adiciona-se um promotor de ARN-polimerase apropriado para a transcrição, por exemplo, o promotor T7 ARN-polimerase ou o promotor SP6 ARN-polimerase.

No caso presente, obtiveram-se cADN recombinantes com um tamanho de até seis kb (Figura 1). Como, no entanto, nenhum dos clones continha a extremidade 5’ comple ta, utilizou-se um clone que continha os nucleótidos 1 a 471 e já foi anteriormente descrito (plOO, (6)) para recobrir esta região.

Clones 4 cADN

Utilizaram-se plOO (com o fragmento PstI maior para os nucleótidos 1 - 471), pl9 (19 - 5101), pl5 (2125 - 71O2dA5O) e pl (5373 - 7lO2dA5O) para construir uma molécula de cADN completa, que pudesse ser transcrita pela T7 ARN -polimerase. Utilizou-se a estratégia representada na Figura 1, para construir dois segmentos que correspondem às partes 5’ θ 3’ da molécula. Para a parte 5’, inseriu-se o fragmento BamHl/Pstl com 0,6 kb do clone 100 no sítio Sacl/PstI do plasmídio Bluescripto. Este plasmídio contém o promotor de T7 ARN-polimerase juntamente como o poliligador.

Utilizou-se um oligonucleótido de dupla cadeia sintético que continha os nucleótidos 1 a 9 de HRV2 e as extremidades salientes correctas para possibilitar a ligação nos sítios de Saci e BamHI· 0 sítio de Bluescripto Saci foi escolhido porque ele fica mais próximo do promotor de T7 ARN polimerase. 0 plasmídeo resultante foi designado como plOOb e continha os nucleótidos 1 a 471. Foi aberto com Hpal no nucleótido 226 de HRV2. 0 fragmento de 4,9 kb Hpal/Smal isolado do clone 19 foi inserido para se transformar no clone 119 (nucleótidos 1 a 5101).

Esta construção leva, na verdade, a uma outra inserção dos nucleótidos 226 a 471 da sequência de HRV2 entre os sítios de restrição Hpa°/Sma°I e AspI, ainda que seja de novo eliminado nas operações seguintes de clomação (Figura 1).

Construiu-se um plasmídio que contém a parte 3' procedendo como se descreve em seguida:

ligaram-se os clones 1 e 15 um com o outro, para o que se substituiu o fragmento de 1,2 kb Spel/Spel do clone 1 (as sítios de Spel estão no poli-ligador e na posição 6554 em HRV2) por intermédio do fragmento de 4,1 kb Spel/Spel do clone 15; obteve-se como resultado o clone 115 (nucleótidos 2435 a 7lO2dA5O).

Não foi possível utilizar directamente o clone 15 porque o troço de polidA do sítio Saci estava próximo do poli-ligador. Ror esse motivo, o cADN estava na orientação errada e não podia ligar-se, portanto, à metade 5’ .0

do cADN.

Na síntese in vitro do ARN infeccioso é utilizável apenas um sítio de corte de restrição no plasmídio depois do troço de polidA (neste caso, com um comprimento de aproximadamente cinquenta nucleótidos). Para este efeito o melhor é o Asp 718 I na extremidade de poli-ligador. A parte do poli-ligador que estava entre a sequência de polidA e o sítio de Asp 718 I foi, portanto, eliminada, com o que o plasmídio 115 foi aberto com EcoRI e os nucleótidos salientes fo-¹ ram eliminados por digestão com nuclease de feijão mungo.

Por eliminação com Asp 718 I, foi separada a parte remanescente do poli-ligador; as extremidades salientes foram preenchidas com fragmento de Klenow da ADN polimerase I. As extremidades modificadas foram em seguida ligadas, obtendo-se o clone 115m; esta estratégia regenerou o sítio de Asp 718 I que fica agora vizinho do troço de polidA.

As duas metades do cADN de HRV2 foram em seguida reunidas através do sitio único de Sphj; o frag mento com 1,2 kb Sphi/Asp 718 I do clone 119 foi substituido pelo fragmento com 3,2 kb Sphl/Asp 718 I do clone 115m; obteve -se o clone pHRV2.

Na transcrição deste plasmídio, depois de linearização com Asp 718 I, obtém-se um ARN que compreende o genoma completo de HRV2. Além disso, na extremidade 5' encontram-se dezasseis nucleótidos adicionais (que correspondem à sequência do sítio de iniciação da T7 ARN polimerase até à primeira base do cADN) e, na extremidade 3’, existem cinco nucleótidos adicionais do sítio Asp 718 I.

A transcrição com T7 ARN polimerase foi efectuada de acordo com métodos usuais (11). A mistura da transcrição foi utilizada directamente como solução de ARN sem qualquer tratamento posterior. A qualidade do ARN foi ensaiada num gel com 1,0% de agarose que contém 0,1% de SDS; normalmente, mais de 90% das moléculas de ARN eram moléculas de compri mento completo”.

A concentração de ARN foi determinada por manchamento de acordo com o método de Pleck and Begg (12). Os fosfatos de nucleósido foram eliminados por precipi

- 5 a tação dupla em presença de acetato de amónio 800 mM, os ácidos nucleicos foram dissolvidos em água e o ARN foi hidrolisado com bases alcalinas. 0 AON e as proteínas foram precipitados com ácido perclórico. Por meio da medição subsequente espectro fotométrica da concentração dos nucleótidos, determinou-se a concentração inicial de ARN com base na hipótese de que 90% do ARN era constituido por moléculas de comprimento completo.

Transfixaram-se células Hela (estirpe Ohio) com utilização do método de DEAE-dextrano (9), em que 300 microlitros da mistura de transfecção com ARN, transcritas por pHRV2 cortado com Asp 718 I, foram utilizadas por placa.

Depois de três dias, tingiram-se as células com vermelho-neutro ou violeta-de-cristal e verificou-se a presença de placas.

Surpreendentemente, não se observou nenhuma infecção. A razão possível para este efeito podia ser os nucleótidos adicionais, não obstante mizutani e Colonno (9) terem obtido um ARN infeccioso de cADN com o comprimento de vinte e um nucleótidos de HRV14. Para garantir as actividades que são provocadas pela presença dos nucleótidos adicionais na extremidade 5', desenvolveu-se uma estratégia alternativa que reduziu a sequência adicional a apenas dois radicais G. É impossível a eliminação completa porque a T7 ARN polimerase necessita de dois radicais G nas posição +1 e +2.

Van der Werf e col. puderam mostrar que um sítio de StuI exactamente no sítio de iniciação da transcrição da T7 polimerase pode ser introduzida por uma mutagénese dirigida para o sítio, na qual a sequência AGGGCG (a transcrição começa com o primeiro &) é alterada em AGGCCT, em que os dois grupos G essecnciais para a transcrição com a T7 ARN polimerase permanecem não removidos. A enzima de restrição StuI corta depois no segundo G e origina extremidades lisas; portanto, o transcrito de ARN de um fragmento que foi clonado por este sítio contém apenas dois grupos G adicionais.

Com utilização de um estojo de mutagénese dirigida para oligonucleótidos da Amersham, foi inserido, portanto, um sítio de StuI no plasmidio plOOb, em que se utilizou a possibilidade de produzir ADN de uma cadeia a par_ 6 -

tir de plasmídios de Bluescript. 0 plasmídio 100b StuI resultante foi digerido com StuI β Asp 718 I; o fragmento de 7,0 kb BamHl/Asp718I de pHRV2 foi então construído com o auxílio de um oligonucleótido sintético de cadeia dupla que continha os primeiros nove nucleótidos da sequência de HRV2 e as correspon dentes extremidades para poder ser adicionado correctamente nos sitios de restrição.

sequenciamento de alguns dos candi datos obtidos mostra que todos continham mais do que cópia do oligonucleótido. Estes foram separados por digestão de restrição com BamHI, eluição do fragmento de 10 kb por um gel de aga rose e religação. Rara um clone, verificou-se que continha ape nas uma cópia do oligonucleótido. Foi designado pHRV2/l.

A transcrição e a transfecção realizaram-se como se descreveu para pHRV2. No ensaio das células depois de três dias obtiveram-se surpreendentemente placas com uma eficiência de 20 - 50 placas/ g. 0 ARN de partículas de ví rus produziu 100 - 200 placas/ ug. A eficiência do ARN transcrito in vitro correspondia portanto aproximadamente a metade do que se obteve com o ARN do vírus. Ror meio de uma transfecção de controlo com pHRV2/l ADN, pôde demonstrar-se nitidamente que a infecção é dependente de ARN; o correspondente ADN não originou nomeadamente quaisquer placas.

Surpreendentemente, ao contrário dos resultados obtidos por Mazutani e Colonno para HRV14 (9), a in fecciosidade do ARN transcrito a partir destes clones era, no entanto, dependente do número de nucleótidos adicionais. SÓ o clone com tamanho completo, que não apresentava mais do que as duas guaninas adicionais na extremidade 5’ necessárias para a transcrição com a T7 polimerase originou um transcrito infec? cioso.

clone pHRV2/l de tamanho completo que fornece in vitro o ARN infeccioso preparado pela primeira vez de acordo com a presente invenção apresenta a possibilidade valiosa de, mediante mutagénese específica, investigar as exigências estruturais para a ligação ao receptor do grupo menor .

Neste sistema, podem-se investigar

todas as mutações que se podem produzir no plano do ADN. Para a investigação dos sítios de ligação do receptor, trocaram-se aminoácidos nas proteínas da membrana do vírus de HRV2 que obedecem aos seguintes critérios:

a) Na superfície do virião ou no canyon, devem existir rs dicais AS com uma inserção de cerca de um eixo de simetria quíntuplo; isto pode determinar-se por comparação com a estrutura cristalina de HRV14 (5, 13).

b) Os radicais AS apropriados devem ser conservados dentro de um grupo receptor, o que pode ser garantido por comparação das sequências com outros serotipos (8).

c) Os radicais AS encontrados de acordo com (b) podem ser especificos então apenas para um grupo receptor, se no respectivo outro grupo receptor se encontrarem radicais AS nos correspondentes sítios da sequência (comparação da sequência com componentes do grupo receptor mais importante 4, 3, 7).

objectivo da presente invenção é proporcionar a preparação de um mutante, no qual um grupo de ARG (AS n^ 180) em VP3 de HRV2 é trocado por um radical Thr. Pa ra isso, procede-se como se descreve em seguida:

Para se obter um plasmídio apropriado para mutagénese in vitro, subclonou-se um fragmento com o tamanho de 0,4 kb do cADN de tamanho completo (Figura 4). 0 fragmento abrange a região do sítio de corte com HindIII (nucleótido n9 1982) até ao sítio de PstI (n2 2422) e foi inserido nos sítios de Psti/HindIII do plasmídio Bluescript (Stratagene, San Diego, Califórnia, Estados Unidos da América).

Correspondentemente às indicações dos estratagénios, produziu-se ADN de cadeia única do plasmídio por meio de um fago auxiliar necessário à mutagénese e purificou-se A mutagénese realizou-se por meio de um oligonucleótido (vinte e seis nucleótidos) sintéticos de uma única cadeia, com uma sequência diferente da do tipo nativo no sítio desejado. A sequên cia do oligonucleótido é a seguinte:

5’ - CCCAGATGTAGATGTACCTGGTGATG -3'

Com o auxílio do estojo de mutagénese in vitro da firma Amersham, preparou-se o mutante preten- 8 -

dido procedendo de acordo com as indicações do fabricante e en saiou-se por sequenciamento do ADN de acordo com os métodos usuais (14, 15). Como a existência de outros sítios de PstI e HindIII no plasmídio pHRV2/l tornava impossível que se reclonasse o fragmento de PstI-Hind III que mantém a mutação directamente no clone de tamanho completo, ele foi primeiramente ligado num outro subclone de pHRV2/l, que contém a sequência do sítio de EcoRI (número 743) até ao sítio de Apal (número 3458) no vector de bluescript, por intermédio dos sítios de corte Psti/HindIII (Figura 4).

plasmídio resultante foi digerido com EcoRI e Apal; o fragmento com 2,7 kb de comprimento foi utilizado para substituir a correspondente sequência em PHRV2/1, pelo que se obteve pHRV2/mRT. A transcrição e a trans fecção realizaram-se como ss descreveu para pHRV2.

A partir de algumas placas, foram re tirados vírus e com eles infectadas monocamadas de células Hela, em que se formaram em três dias 2 x 10 - 2 x 10 pfu/ml de meio. Os vírus assim obtidos foram ainda multiplicados várias vezes em monocamada de células Hela e purificadas por três operações de centrifugação (dez minutos a 500 x g; trinta minutos a 20.000 rpm, SW40; sessenta minutos a 45 000 rpm, rotor SW-50) e peletizados.

Os vírus ressuspensos em tampão de fosfato fisiológico (PBS : 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KOI, 8,1 mM de KHgFO^, 1,5 mM de Na₂HP0^; pH 7,3) foram utilizados para a preparação de partículas de vírus marcadas com (16). A análise em gel de poliacrilamida desnaturado (Figura 5) não apresentou diferenças nas larguras das deslocações das proteínas individuais das membranas dos vírus em comparação com o tipo nativo.

Para poder garantir possíveis altera ções do comportamento de ligação dos mutantes de vírus nas células hospedeiras, realizaram-se ensaios de ligação como foi descrito por G. Abraham e R. J. Colonno (16); a duração da incubação foi de dezasseis horas para a pré-incubação com vírus frio ou de quatro horas para a incubação com vírus marcado com ⁵⁵ S. Como vírus frio, utilizou-se HRV89 θ HRV2; compararam-se

- 9 --· 'AC*·,' ι· 'umu·

, 35 vírus HRV2 marcados com S nativos e mutantes (figura 6). Não se conseguiu detectar comportamento de ligação significativamente diferente dos mutantes do vírus em relação ao tipo nativo (Figura 6).

Q

A partir de cerca de 1 x 10 de partículas de vírus purificados dos mutantes, isolou-se o ARN por extracção com fenol (17) θ transcreveu-se a região que se mantém na mutação em cADN. Rara isso, utilizou-se para a síntese da primeira cadeia um oligonucleótido sintético com a sequência

5’ -CTTCTAATTTGAGCCATTTCTTG -3' e para a síntese da segunda cadeia o oligonucleótido com a sequência

5' - TCTATTCCAGGTGAGGTT -3'

Digeriu-se o cADN de cadeia dupla com RstI e HindIII e ligou-se no vector de bluescript. Sequenciaram-se os plasmídios assim obtidos. Desta maneira, foi possível garantir que os mutantes do vírus mantinham, de facto, a alteração da sequência pretendida.

Desta forma, podem determinar-se os aminoácidos e as regiões do virião que são essenciais para a ligação do receptor.

Com base na grande homologia existen te do HRV2 em relação aos outros rinovírus até agora sequencia dos como HRV14 é de se esperar que estes resultados possam ter utilização com elevada segurança também em rinovírus que pertencem ao assim chamado grupo do maior receptor.

A presente invenção proporciona assim plamídiús que contêm os cADN completos para HRV2 ou por mutagénese específica os análogos que se obtêm sob o controlo do promotor de ARN polimerase.

São também objecto da presente inven ção os sistemas que contêm um cADN completo para HRV2 sob o controlo de um promotor de ARN polimerase em que os codões codificam os aminoácidos que ficam na superfície do virião ou no canyon, são trocados por codões para outros aminoácidos, especialmente por codões para aminoácidos que influenciam o com ,*n portamento da ligação em relação ao receptor.

Os plasmídios preferidos contêm, antes do primeiro par de bases do cADN, apenas os nucleótidos que são necessários para a iniciação da transcrição. No caso da utilização de T7 ARN polimerase, são, por exemplo, as duas guaninas essenciais.

É vantajoso prever nestes plasmídios um sítio de restrição que aparece apenas uma vez em ligação na extremidade 3' do cADN.

É também, evidentemente, objecto da presente invenção o ARN que se obtém a partir destes plasmídios por transcrição.

Os plasmídios de acordo com a presente invenção podem utilizar-se, por exemplo, para a preparação de polipéptidos virais, em que se transformam sistemas apropria dos de hospedeiro com estes plasmídios. Estes polipéptidos virais podem então ser utilizados para tratamento terapêutico, por exemplo, para estimulação do sistema imune ou para a ligação e/ou bloqueio dos receptores celulares para os rinovírus.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1

Representação esquemática da construção da cópia de cADN completa de HRV2, que se encontra sob o controlo de um promotor de T7 ARN polimerase. Os fragmentos que foram ligados em cada secção são representados por linhas grossas. Os números por cima dos sítios de restrição referem-se à sua posição na carta de HRV2, com excepção daqueles por cima dos sítios de Saci e Asp7181, que representam as extremidades de cada clone de cADN. Indicam-se os seguintes sítios de restrição ; A, ASP7181; B, BamHI; H, Hpal, P, PstI; R, EcoRI,

S, Saci ; Se, Spel; Sh, Sphl; Sm, Smal. Todos os sítios de Asp7181 e Saci e os respectivos sítios de restrição que são marcados com um ponto, derivam de poli-ligadores do vector. 0 promotor de T7 ARN polimerase é marcado por uma seta.

Figura 2

Mapa de restrição do genoma de HRV2.

Figura 5

Sequência do genoma de HRV2 cionado e sequência de aminoácidos dele derivada.

Figura 4

Representação esquemática da subclona ção de um fragmento apropriado para a mutagénese, assim como a sua reclonação no clone de tamanho completo de HRV2 depois de mutagénese. 0 sítio mutado é designado com x.

Figura 5

Auto-radiograma de uma electroforese em gel. Separação das proteínas da membrana de vírus de diferentes fracções de gradientes numa preparação de partículas de , 35 vírus marcadas com ^J S dos mutantes em comparação com o tipo nativo.

Figura 6

Ensaio de ligação dos mutantes de HRV2. Monocamadas de células HeLa foram pré-incubadas com concentrações crescentes de HRV2 frio (a) ou de HRV89 (b). Em seguida, determinou-se a quantidade das partículas de vírus mar35 cadas com S do tipo nativo e dos mutantes que ainda não podem ser ligados.

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18. V.R. RacanielloJiBaltimore, Science 214, 916-919 (1981).

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ Processo para obtenção de um plasmídio, caracterizado pelo facto de ele conter cADN completo para HRV 2 ou os seus análogos que se podem obter por mutagenese especifica sob o controlo de um promotor de ARN polimerase.

   - 2ê Processo para obtenção de um plasmídio, caracterizado pelo facto de conter cADN completo para HV2 sob o controlo de um promotor de ARN polimerase, em que os codões que codificam para aminoácidos que ficam na superfície do virião ou no canyon são permutados por codões para outros aminoácidos, em especial por codões para aminoácidos que influenciam o comportamento de ligação em relação ao receptor.

   _ ₅a _

   Processo para a obtenção de plasmídio de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a ARN polimerase ser a T7 ARN polimerase.

   - 4§ Processo para a obtenção de um plasmidio de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de antes do primeiro par de bases do cADN só estar presente um número de nucleótidos que é necessário para a iniciação da transcrição.

   - 14 Processo para a preparação de um plasmídio, de acordo com a reivindicação 4-, caracterizado pel facto de antes do primeiro par de base de cADN só estarem pre sentes as duas guaninas essenciais para a T7 ARH-polimerase.

   - _

   Processo para a obtenção de um pias mídio, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de possuir adicionalmente um sí tio de restrição que aparece apenas uma vez na união na extre midade 3' do cADN.

   - 7§ Processo para a obtenção de um pias mídio, caracterizado pelo facto de ser pHRV2/l.

   - 8s Processo para a preparação de ANR, caracterizado pelo facto de se realizar a transcrição por um dos plasmídios de acordo com as reivindicações 1 a 6.

   A Requerente reivindica as priorida des dos pedidos alemães apresentados em 25 de Julho de 1988 e em 24 de Junho de 1989, sob os nSs. P 38 25 109.2 e P. 39 2o 753.6, respectivamente.