PT90582B - Anticorpos anti-idiotipo destinados a antigenios associados a melanomas anti- -humanos de elevado peso molecular - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 582

REQUERENTE: S0LDAN0 FERRONE, norte-americano, residente em 16 Dobbs Terrace, Scarsdale, New York , 10583, Estados Unidos da América do Norte.

EPÍGRAFE: ANTICORPOS ANTI-IDIOTIPO DESTINADOS A AN

TIGÊNIOS ASSOCIADOS A MELANOMAS ANTI-HUMANOS DE ELEVADO PESO MOLECULAR

INVENTORES:

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte em 17 de Maio de 1988, sob o n-. 195,577.

INPI MOO. 113 RF 10732

SOLDANO FERRONE

ANTICORPOS ΑΝΤΙ-IDIOTIPO DESTINADOS A ANTIGéNiOS ASSOCIADOS A

MELANOMAS ANTI-HUMANOS DE ELEVADO PESO MOLECULAR

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento divulga e descreve dois novos anticorpos anti-idiotípicos, IMelpgl e MF11-30 e seus equivalentes, bem como fragmentos de anticorpos, péptidos ou antissoros capazes de reagir com o idiõtopo de:

<a> um anticorpo monoclonal murino 225.28 e seus derivados; ou com (b) qualquer anticorpo monoclonal segregado por hibridomas de quaisquer espécies apresentando as mesmas características imunológicas do anticorpo 225.26; ou com (c) quaisquer antissoros policlonais de quaisquer espécies apresentando as mesmas características imunológicas do anticorpo 225.28, capazes de reagir com um determinante específico (epitopo) de um antigénio associado a um melanoma de elevado peso molecular, juntamente com a sua preparação e utilização no diagnóstico, rastreio e tratamento de tumores tais como os melanomas ou outras células doentes que exprimam o epitopo HMW-MAA reconhecido anticorpo 225.28 pelo

□ presente pedido de patente é uma continuação em parte do pedido de patente n2 195 577 apresentado em 17 de Maio de 1983.

SMBITD DD INVENTO □ presente invento diz respeito à criação de anticorpos especificamente concebidos para aumentar a actividade imunológica do hóspede contra um tumor. Mais em particular, os investigadores tem tratado os pacientes que sofrem de melanomas com anticorpos que actuam sobre os antigénios contidos nas células do melanoma. □ Antigénio Associado a Melanomas de Elevada Massa Molecular (daqui em diante designado por AAM-EMN) é um alvo adequado para estas abordagens imunoterapêuticas de melanomas. 225.28 é um anticorpo monoclonal que reconhece um epítopo de estrutura indefinida na molécula do AAM-EMM. D presente invento diz respeito a anticorpos anti-idiotípicos em relação ao anticorpo anti-AAM-EMM 225.28 e os seus equivalentes imuno1ógicos. Os anticorpos anti-idiotípicos MF11-30 e IMelpgl em relação ao anticorpo 225.28 foram descobertos e analisados em sitemas-mode1 o animais. □ MF11-30 também foi analisado em pacientes com melanomas malignos. 0 presente invento também diz respeita aa diagnóstica, controlo e tratamento de tumores, tais como melanomas e outras células doentes que manifestam o epítopo AAM-EMM reconhecida pelo anticorpo 225.28, mediante a administração e a aplicação destes anticorpos anti-idiotípicos.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Introdução

Os antigénios são substâncias que podem induzir uma resposta imunológica. Uma resposta imunológica típica é a produção de anticorpos. Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos células B. Outra resposta típica é a estimulação de células T. (As células T são um outro tipo de linfócitos originários do timo). As células T podem destruir células anormais tais como as infectadas por determinados tipos de vírus ou outros agentes patogénicos. As células T também estão envolvidas no processo de produção de anticorpos por parte das células B. Em conformidade, um antigénio pode reagir quer com anticorpos quer com os receptores por ele estimulados nas células T. Ds anticorpos e os receptores das células T são específicas para o antigénio indutor.

□s anticorpos e as moléculas receptoras das células T apresentam regiSes variáveis, cada uma delas responsável pelo reconhecimento de um antigénio específico. A região do antigénio que se liga ao anticorpo ou receptor da célula T é designada determinante antigénicD ou epítopo. As regiSes variáveis dos anticorpos e receptores das células T contêm determinantes ou idiótipos que também são imunogénicos e iniciam respostas imunológicas anti-idiotípicas (anti-id).

Nais em particular, estão associados idiótopos às regiSes variáveis dos anticorpos e receptores de células T. Estas regiSes variáveis conferem aos anticorpos e receptores de células T especificidade em relação aos antigénios. Os idiótipos são marcadores do sistema imunológico dos anticorpos ou receptDres das células T. Um idiótipo é imunologicamente definido pela reactividade com mais do que um anticorpo anti-idiotópico que reconhece um determinante idiotópico ou idiótopo num dado idiótipo, isto é, um idiótipo é constituído por uma colecção de idiótopos. A melhor maneira de definir os idiótopos é através da sua ligação a anticorpos anti-idiotípicos monoclonais.

Deve salientar-se que os idiótopos são distintos dos determinantes isotípicos (específicos para a classe das imunoqlobulinas), xenotípicos (específicos para a espécie) e alotípicDS (específicos para determinados subgrupos de populaçSes).

Cada anticorpo e receptor de célula T tem pelo menos um parátopo que é o local de ligação ao determinante antiqénico (o epítopo). Um parátopo pode desempenhar as funções de idiótopo, isto é, o parátopo pode estimular uma reacção anti-idiotípica em que, tal como o antigénio original, os anticorpos anti-idiotípicos se ligam ao parátopo. Um subconjunto de anticorpos ant.i-idiótopo antiparátopo pode mimar as propriedades imunológicas do antigénio original. Além dos anti-id's antiparatópicos que mimam o antigénio original, existem outros anticorpos anti-id's que definem os idiótopos dos anticorpos e receptores das células T que também participam na regulação das respostas imunológicas. Estes idiótipos são designados idiótipos reguladores e não são necessariamente imagens internas do antigénio original. F’ara uma análise geral destes princípios antecedentes confrontar S. Burdette e R. Schwartz, New Enq. J. of Med. 317:219 (1987).

A rede idiotípica

Numa dada espécie ou indivíduo o número de diferentes anticorpos e receptores de células T é muito elevada (superior a

10^Z). Cada anticorpo e receptor de célula T manifesta diversos idiótopos ligados, através de uma rede regulatória, a

anti-idiótopos complementares. N. Jerne, Ann. Immunol. 1256:373 (1974), sugeriu ser o sistema imunológico regulado por uma rede composta por idiótipos e anti-idiótipos. Existe uma grande quantidade de dados experimentais gue indicam ser a função da rede idiotípica a manutenção da homeostáse do sistema imunológico e a regulação das respostas imunológicas. Uma ve: que os idiótipos são manifestados pelas células B e pelas células T, a rede idiotípica abrange tanto reacçSes imunológicas humorais (anticorpos) como celulares (mediadas por células T). As respostas imunológicas específicas são reguladas por anticorpos anti-idiotípicos específicas quer na base na base individual quer na base de grupos através de idiótopos partilhados. Estes anticorpos anti-idiotípicos são designados anti-idiótipos reguladores e não representam necessariamente a imagem interna do antigénio-alvo. Cf. B. Goldberg e outros, J. Exp. Med . 153:515 (1983).

Terapia anti—idiótipo

Recentemente foi sugerida e demonstrada em diversos sistemas experimentais a utilização de anti-idiótipos imagem interna (pedido de patente europeu n° B4B105169, depositado em 15 de Outubro de 1984, n2 de publicação 0141783; A. Nisonoff e E. Lamoyi, Clin. Immunol. I mmuricpat ho 1 21:397 (1981); R. C. Kennedy e outros Biotechniques 3: 4040 91985). Estes anti-idiótipos imagem interna tem sido usados como sucedâneos de antigénios na geração de respostas imunológicas específicas contra infecçôes virais, bacterianas e parasíticas e cancros (B. Herlyn e outros, Sc i. ence 232:100 (1936); S. Raychaudhuri e outros, J, I mrounol . 137:1743 (198Ó).

Presentemente estão clonais e monoclonais imagem animais e seres humanos.

a ser usados anti-idiótipos poliinterna na imunoterapia activa em processo de geração destes anti—idiótipos imagem interna é o seguinte: 1) produz—se um anticorpo contra um antigénio tumoral ou um agente infeccioso. Este anticorpo é designado Acl; 2) produzem-se anticorpos anti-idiotípicos (Ac2's) contra os primeiros anticorpos. Estes anti—id's (Ac2's) são seleccionados em relação à manifestação de idiótipos que mimem as propriedades imunológicas do antigénio inicial (tal como o manifestado por um tumor ou agente infeccioso). Esta selecção consiste na inibição da ligação Acl-Ac2 pelo antigénio original e o teste biológico dos anti-idiótipos (Ac2's) como sucedâneo do antigénio in vivo. Este teste é efectuado em animais e foi previamente demonstrado para anti-idiótipos imagem interna representando antigénios tumorais e agentes infecciosos (R. C. Kennedy e outros, Biotechnigues 3:4040 (1985); D. Herlyn e outros, Science 232:100 (1986); S. Raychaudhuri e outros, J. Immunol. 137:1743 (198Ó).

Os esforços precedentes para gerar imunoterapias tumorais activas úteis foram, contudo, imprevisivelmente infrutíferos. Podem postular—se diversas razões para o sucesso limitado e resultados imprevisíveis observados com a técnica precedente.

Em primeiro lugar, muitos antigénios tumorais são difíceis de isolar. Os antigénios tumorais não se encontram frequentemente presentes numa concentração significativa nas massas tumorais ou em células tumorais cultivadas individualmente. Em segundo lugar, os antigénios tumorais são frequentemente fracamente imunogénicos. A fraca imunogenicidade pode ser um resultado da presença de outros constituintes das células tumorais que suprimem a reactividade imunológica ou do facto de os antigénios não serem manifestados exclusivamente pelas células tumorais. Em geral, os antigénios que o sistema imunológico reconhece como ¹¹ próprios não provocam uma resposta imunológica significativa. Uma das abordagens da técnica precedente à

na imunoterapia tumoral consistia utilização de anticorpos anti-idiótipo imagem interna que podem ser preparados em grandes quantidades e podem ser mais imunogénicos que os antig^nios naturais.

Contudo, os esforços precedentes de geração de anti-idiótipos imagem interna úteis também foram imprevisivelmente infrutíferos. Em relação à rede idiotípica muitos dos anti-idiótipos são, por razoes obscuras, simplesmente incapazes de induzir reacçSes imunológicas eficazes in vivo apesar de análises que indicam que eles mimam as propriedades do antigénio original. Mesmo os anticorpos anti-idiótipos que revelam as características adequadas in vitro. ou até, parcialmente, in vivo, são frequentemente incapazes de estimular a rede imunológica a gerar uma reacção imunológica terapeuticamente eficaz. Presumivelmente, estes Ab2's imagem interna ineficazes não induzem os circuitos reguladores apropriadas da rede imunológica de interacçues idiótipo/anti-idiótipo a produzir uma imunidade eficaz. Em contraposição a este fracasso de imprevisibi1 idade e incerteza, os anti-idiótipos de acordo com o presente invento e aqui descritos foram testados com sucesso em pacientes com melanoma avançado .

Um alvo apropriado para desenvolver abordagens imunoterapeuticas do melanoma é o antigénio associado a melanoma de elevada massa molecular (AAM-EMM) (também designado antigénio proteog1icano de sulfato de condroitina associado a melanoma PGM). Ds nossos resultados revelam que as tentativas de indução de reacçSes celulares e humorais contra AAM-EMM podem ter como resultado a intervenção no crescimento tumoral. 0 AAM-EMM é constituído por dois g1iccpeptídeos associados não-cova1entes. Um deles tem uma massa molecular aparente de 280 K e o outro uma massa molecular aparente superior a 440 K.

AAM-EMM células cio ntelanoma humano (R. C.

sintetizado e manifestado pelas Spiro e outros, J. Biol. Chem. 2641092 (1988). Ds proteog11 canos são g1icoproteínas com cadeias polissacarídeo g1icosaminoq1icano (GAG) covalentemente ligadas ao resíduo serina no seu núcleo. A proteína no núcleo do AAtf-Effff é inicialmente traduzida sob a forma de um precursor com uma massa molecular de 240 K com oligossacarídeos asparaqina-N-liqados do tipo manose elevada. □ arranja e subsequente processamento do oligossacarídeo N—ligado para dar origem á forma complexa tem como resultado a conversão da componente de massa molecular 240 K numa forma com massa molecular 250 K. A adição de cadeias laterais GAG de sulfato de condroitina à proteína do núcleo da forma de massa molecular 250 K converte-a numa forma proteog1icano de elevada massa molecular (superior a 450 K). Tanto a forma com massa molecular 250 K como a forma com massa molecular superior a 450 K se manifestam na superfície da célula de melanoma (R. C. SpirD e outros, J Biol . Chem. 264:1779 (1989)). □ RGtf desempenha um papel fundamental na determinação da evolução dD crescimento tumoral e da metãstase (ff. Herlyn e outros, ftnn. Rev. Immunol. 6:283 (19SS); N. P. Robertson e outros. Câncer Res. 49:1816 (1989)). As moléculas de proteína da superfície celular estão envolvidas em interacçSes corn células adjacentes e formam palmilhas complexas que estabelecem contacto com o substrato (tf. Herlyn e outros, ftnn __Rev.

Immunol „ 6:283 (1988). Os anticorpos do AAM-EMIf bloqueiam a mobilidade quimioté.c tica e quimiocinética das células (tf. Herlyn e outros, Ann. Rev. Immunol. 6:283 (1988), J. E. de Vries e outros, Int. J. Câncer 38:465 (1986)). Os anticorpos anti-AAIf-EMM causam a redução da formação de colónias do melanoma em aqar mole (J. R. Harper, J . Matl. Câncer Inst. 71:259 (1933)).

SUMARIO DQ INVENTO

D presente invento revela dois novos anticorpos anti-idiótipo, MF11-30 e IMelpgl, e os seus equivalentes com capacidade para reagirem com (1) d idiótopo do anticorpo monoclonal murino 225.28 e os seus derivados ou equivalentes imunológicos ou (2) qualquer anticorpo monoclonal secretado por hibridomas de qualquer espécie que apresente as mesmas características intunológicas que o 225.28 ou (3) qualquer antissoro policlonal de qualquer espécie que apresente as mesmas características imunolóqicas que o 225.28, que seja reactivo com um determinante específico (epítopo) de um antigénio associado a melanoma de elevada massa molecular (AAM-EMM). Os anticorpos anti-idiótipo MF11-30 e IMelpgl revelaram inibir a ligação de 225.28 à linha de células de melanoma humano Colo 38, bem como a outras linhas celulares (dados não indicados). Os inventores descobriram que o MF11—30 e o IMelpgl podem induzir reacçóes antitumorais relevantes .

Outro aspecto do presente invento consiste na revelação de métodos para a utilização dos novos anticorpos anti-idiótipo na imunoterapia activa e passiva, incluindo o diagnóstico, o controlo e o tratamento do melanoma e de outras doenças associados ao epítopo reconhecido pelo anticorpo 225.28.

Por exemplo, os inventores utilizaram com sucesso anticorpos anti-idiotípicos na indução imunoterapãutica activa de uma reacção antitumoral em pacientes com tumores. ' Apresentam-se em seguida os resultados de estudos efectuados com anticorpos anti-idiotípicos (Ac2's) usados como imunoactivadores para potenciar reacções das células B e T específicas para os tumores em pacientes afectados por melanoma.

DESCRIÇSQ DOS DESENHOS

A Figura 1 é constituída por dois gráficos. A inibição por parte do anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 da ligação do anticorpo monoclonal an ti— AAM-EMM marcado com ^^1 a células de melanoma Colo 38 cultivadas- é representada no Gráfico A. 0 Gráfico B representa a. ausência de inibição significativa por parte cId MF11-3O da ligação de um anticorpo monoclonal í 'D cr anti-AAM-EMM marcado com ^1 diferente (TF’41.2) a células de melanoma Colo 38, revelando a especificidade do MF11-30 para o anticorpo 225.28. Os gráficos apresentam a inibição percentual como factor da concentração de anticorpo monoclonal anti-id.iotípico em pg/ml.

A Figura 2 representa a indução de anticorpos antimelanoma por parte do IMelpgl na sequência de imunizações repetidas. Testou-se sôro recolhido em coelhos imunizados com IMelpgl ou IC01 7 dias após ter sido testada a segunda e quarta potenciações em relação à ligação a células Colo 38 mediante um ELISA tal como se descreve na secção Materiais e Métodos da Parte II. Os símbolos correspondentes aos diferentes soros são indicados na figura. A imunização com 1001 adequado ao isótipo não induziu qualquer resposta humoral anti—melanoma detectável.

A Figura 3 representa a reacção de noma induzida por IMelpgl conjugado com HKL coelho obtido em imunizações com IMelpgl, isolado em células Colo 38 antes (Fig. 3a) e adsorção por células 3T3 através de um ELISA na sec.ção de Materiais e Métodos da Parte II símbolos correspondentes a soros diferentes anticorpos antimelaTestou-se sôro de

IMe1pg1-HKL ou HKL depois (Fig. 3b) da tal como se descreve Tal como antes, os são indicados na figura.

no

A Figura 4 representa a ligação de Ac3 purificado que se refere è afinidade a células Colo 38. Soros de coelho obtidos por imunização com IMelpql-HKL foram purificados no que se refere à imunidade e testados em relação à ligação a células Colo 38 (Fig. 4a) ou a HKL (Fig. 4b) mediante um teste de radioimunidade tal como se descreve na secção Materiais e Métodos da Parte II. Apresentam-se os resultados representativos obtidos com dois coelhos. Vinte nanogramas de 225.28 purificado dão origem a 1200 cpm num teste de ligação directa numa placa de células Colo 38.

A Figura 5 representa a inibição da ligação do Ac 1 1251-225.28 à linha de células tumorais Colo 38 por Ac3's de coelho. Ds soros colhidos em coelhos imunizados com IMelpgl, IMelpgl-KLH ou ICD1 foram purificados no que se refere à imunidade numa coluna de IMelpgl 7 dias após a segunda e quarta potenciações terem sido testados quanto à sua capacidade de inibição da ligação do Ac 1 ^**'l-225.28 a células Colo 38 através de um tes>te de radioimunida.de tal como se descreve na secção Materiais e Métodos da Parte II. As percentagens de inibição foram calculadas indicando-se os resultados representativos obtidos com dois coeihos.

IESCRIçSO FORMEMuRI Z.ADA DAS FClRMAS St. REALIZAC4Q PRE.FERIoA'ó

As expressões adiante apresentadas têm, no âmbito do presente invento, o seguinte significado:

irnunoterapia passiva d a transferência passiva de anticorpos para o paciente ou animal; irnunoterapia activa d a indução de reacçSes associadas a anticorpos ou células T num paciente ou animal; supressão d a inibição de uma resposta imunológica ou a inibição da manifestação de uma reacção idiotípica; estimu 1 ação d a indução de uma resposta imunológica ou a .indução da manifestação de uma reacção idiotípica; regressão tumoral d a redução geral de 307. ou superior do tumor.

Todas as referências citadas no presente encontram-se em anexo a título informativo.

i nven t o

I. Obtenção e caracterização do anticorpo monoclonal anti-idiotípico (MF11-50) destinado ao anticorpo monoclonal 225.28 destinado ao AAM-EMM anticorpo monoclonal MF11-30 (ATCC, Rockville, MD, n9 cie acesso ao depósito HBÍ0133) obtido a partir de esplenócitos d secretado por um hibridoma de um rato BALB/c imunizado com anticorpo monoclonal anti-AAM-EMM 225.28 segundo procedimentos semelhantes aos descritos por M. Kusama, T. Kageshita, F. Perosa e S. Ferrone em Syngeneic Anti-idiotypic Antisera to Murine Antihumari High-Molecular Weight Mel anoma-Associated Antigene Monoclonal Antibodies, Câncer Res. 47:4312—4317 (1987) para a obtenção de antissoros anti-idiotípicos singeneicos dos anticorpos monoclonais anti-AAM-EMM murinos. (Para uma descrição do anticorpo 225.28 cf. B. S. Wilson, Internationa 1 J pf Câncer 28:293-300 (1981). 0 anticorpo 225.28 pode ser obtido de ATCC, Rockville, MD, n.2 de acesso ao depósito HB10141. Resumidamente, o anticorpo monoclonal purificada 225.28 (200 p.g) que tinha eido acoplado a hemocianína keyhole limpet (por vezes designada HKL“ no presente invento) mediante fixação de glutaraldeído foi injectada intraperitonealmente em ratos BALB/c para ser usada como imunogénio. Uti 1ízaram-se como adjuvantes adjuvante de Freund completo e incompleto para potenciar os ratos no dia 0 e no dia 7, respectivamente. No dia 14 os ratos foram potenciados com anticorpo monoclonal 225.28 em solução salina tamponada com fosfato com um pH de 7,2. Três dias depois os ratos foram sacrifiçados e os tacos individualmente removidos.

A hibridização dos esplenócitos com células de mieioma murino (F'3-X63-Ag.653> e a subc1onização foram efectuadas de acordo com procedimentos padrão conhecidos dos especialistas da técnica (G. Kohler, C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256:485-487 (1875)) (em anexo, a título informativo). Esta fusão gerou 283 hibridomas diferentes. A análise dos sobrenadantes com anticorpo monoclonal 225.28 em testes serológicos revelou que 1<S colónias reagiam num teste de ligação F(ac')^,, quatro colónias reagiam num teste sanduíche e quatro inibiam a ligação do anticorpo monoclonal 225.28 ás células do melanoma com o antigénio original (AAM-EMM), indicando que estas últimas colónias produtoras de anticorpos produziam um anticorpo dirigido ao parátopo do anticorpo original. 0 anticorpo monoclonal MF11-30 revelou uma forte reactividade em todos os trás testes, tal como se representa na Figura 1 dos desenhos e na Tabela 1. A Fig. 1 representaa inibição pelo anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 da ligação do anticorpo monoclonal anti-AAN-EMM marcado com

12S

2tí a células de melanoma Colo 38 cultivadas,

A especificidade do anticorpo anti-id MF11-30 demonstrada na Fig. 1 foi obtida do seguinte modo adiante descrito.

Incubaram—se anticorpo monoclonal anti-AAM-EMM marcado com

125

225..28 ÍFig. 1, Grãf. h) e, como controlo, anticorpo monoclonal anti-AAM-EMM marcado com ¹²⁵I TF'41.2 (Fig. 1, Grãí. B) (1 x 10° cpm) durante 2 horas a 4°C com anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 (o-o) e com um anticorpo monoclonal anti-idiotípico TKó-74 de controla (.-.) específico em relação ao anticorpo monoclonal anti-AAH-EMM TP41.2. (0 anticorpo monoclonal anti-idiotípico TKó-74 é secretado por um hibridoma obtido de esplenócitos de um raito BALB/c imunizado com d anticorpo monoclonal anti-AAM-EMM TF'41.2). As misturas foram então adicionadas a células de melanoma Colo 38 cultivadas (2 x 10^ / concavidade). Após uma hora de incubação a 4‘-C, as células-alvo foram lavadas por cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato e a radioactividade ligada foi medida com um contador gama.

Ds resultados dos testes serológicos relativos á actividade biológica e reactividade do anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 são indicados na Tabela 1 adiante apresentada. D anticorpo monoclonal anti—idiDtípicD TKó-74 foi seleccionado com o anticorpo monoclonal anti-AAM-EMM TF’41.2. Os procedimentos dD teste de ligação usado nestes testes encontram—se descritos em Câncer Res. 47:4312-4317 (1987) anexado a título informativo. Ds procedimentos do teste sanduíche usados nestes testes encontra-se descrito por M. Tsujisaki, M. Kusama, K. Sakaguchi, F. Perosa e S„ Ferrone em A sandwich assay to detect and characterize syngeneic anti-idiotypic a.ntibodies to murine anti-HLA and tumor associated antigen monoclonal antibodies, J . Immunol. Methods 85:47-515 (198ó).

TABELA ί

Reactividade do anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 em testes serológicos com anticorpos monoclonais anti-AAM-EMM

Γ j Ac. mo. | anti-idiotípicos I		225.23	1
r I I I I I I I	Teste de ligação F(ac1 ) 2 (em cpm)	Teste sanduíche	Inibição da 1 ligação às 1 células de 1 melanoma 1 (percen tua1) 1
! j MF11-30 1	13 000	13 900	92,6 |
i j TKG-74 1 1	323	200	< 5 |
| Ac. mo. | anti-idiotípicos 1		TP41.2
r 1 1 i ! 1 I	Teste de ligação F(ac1>2 em c pm)	T este sanduíche	Inibição da 1 ligação ès 1 células de 1 melanoma 1 ( percen tu.al ) J

MF11-30

600

128

ΤΚΘ-74

000

053

91,0 teste do anticorpo monoclonal MFll-30 com uma série de anticorpos monoclonais de determinantes antiqénicos distintos de AAM-EMM não revelaram qualquer reactividade significativa excepto em relação a 225.28 revelando assim que d local de ligação do anticorpo MFll-30 estava orientado para um idiótopo do anticorpo 225.28 não partilhado por outros anticorpos orientados para o mesmo antigénio. 0 teste da acção do anticorpo MFll-30 contra antigénios associados a melanoma distintos e determinantes monomórficos e polimórficos de t-ILA Classe I e Classe II também permitiram detectar reactividade exclusivamente com o anticorpo monoclonal 225.28.

monoc1ona1 pH 9,5). Após três lavaEstas análises foram realizadas do seguinte modo. Revestiram-se placas microtituladas de po1ivini1c1oreto (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) com o anticorpo monoclonal a testar através de uma incubação, realizada de um dia para o outro de 50 μΙ/concavidade de uma solução de anticorpo (100 pg/ml, tampão bicarbonato 0,1 M, gens com uma solução salina tamponada cdoi fosfato contendo Tween a 0,05’/. (STF-T20), o revestimento de placas microtituladas com anticorpos monoclonais foi controlado mediante xenoanticorpos 125 anti-Ig de rato marcadas com I. As placas revestidas com anticorpo monoclonal foram incubadas com anticorpo monoclonal 1 ^5 5

MFll-30 marcado com I (2 x 10^u cpm / concavidade) durante 16 horas a 4'-'C. Após 5 lavagens com STF—T20 mediu—se a radioactiv dade ligada com um contador gama. A ligação específica é calc lada como o valor que se obtém após a subtracção dos cpm n concavidades de controlo dos cpm nas concavidades experimentai Qs resultados são apresentados na Tabela II.

TABELA II

Reactividade com anticorpos monoc1onais anti-AAM e anti-HLA anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30 elicitado com anticorpo monoc1ona1 anti-AAM-EMM 225.28 do o

^1 - Ac. mo. MF11-30 em

Ac. mo.	Iq	Ee.pecif ic idade	c pm >:	10
148.53	Gl	AAM-EMM	0
225.28	G2a	AAM-EMM	19	,9
763.74	Gl	AAM-EMM	0	,7
653.25	Gl	AAM-EMM	0	,7
657.5	Gl	AAM-EMM	0	,8
902.51	Gl	AAM-EMM	o	,7
TF'41.2	Gl	AAM-EMM	o
TP61.5	Gl	AAM-EMM	0	,8
CL203	Gl	96Kd-AAM	0	n &
376.94	G2a	100Kd-AAM	o	, 6
345.134	G2a	115Kd-AAM	o	,4
CRI 1-351	Gl	HLA-A2,A28	0	,7
H-8-617-1	G2b	HLA-A2,A28	0
H-8-3S5-2	Gl	HLA-A2,A28	o	,8
K+H-l-411	G2t<	HLA-A2,A2B	ô	,7
K+H-1-239-3	Gl	HLA-A2,A28	0	»1
KS1	Gl	HLA-A2,A28	0	,B
KS2	Gl	HLA-A2,A28	0	? t)
KS3	G2b	HLA-B7,B27,Bw42,Bw54, Bw55,Bw67,Bw73	0	,8
KS4	G2b	HLA-B7,B27,B«42,BW54, Bw55,Bw67,Bw73	0	cr

Q6/64	G2a	HLA-B	Q>, 5
CR10-131	G2b	HLA-Cla=se I	0,6
CR10-214	61	HLA-Classe I	0,7
CRI 1-115	G2b	HLA-Classe I	0,7
CRI	61	HLA-Classe I	0,8
Ql/28	62 a	HLA-Classe I	0,7
6/31	G2a	HLA-Classe I	0,8
W6/32	62a	HLA-Classe I	0,3
NAMB-1	G1	R^-microglobulina	0,7
B7/21	G2a	HLA-DPwl	0,6
KS5	M	HLA-DQwl	0,5
KS11	M	HLA-DQwl	0,3
KS15	61	HLA-DQwl	0,6
H-l-940-1	G2a	HLA-DQw3	0,4
H-6-237-1	61	HLA-DQw3	0,4
H-7-34-1	62a	HLA-DQw3	0,4
H-7-354-1	G2a	HLA-DQw3	0,7
H-9-61-1	G2a	HLA-DQw3	D,6
KB13	62 b	HLA-DQw3	0,B
KSó	62b	HLA-DQwl,DQw3	0,5
KS10	G2b	HLA-DQwl,DQw3	0,5
KS14	62 b	HLA-DQwl,DQw3	0,6
AC. 59	M	HLA—DR1,4,w6,w8,w9	0,3
CL413	G2a	HLA-DR	0,4
KS8	62 b	HLA-DR	0,4
i<S9	61	HLA-DR	0,4
KB12	G2b	HLA-DR	0,8
02/70	G1	HLA-DR	0,6
CRI 1-462	61	HLA-DR,DR	0,6
02/80	G2a	HLA-DP,DR	0,7
127	G2a	HLA-DR,DR	0,7
417	61	HLA-DP,DR	0,7
420	61	HLA-DR,DR	0,7

441

G1

0,7

D5/13

HLA-DP,DR

HLA-DP,DQ,DR

Resultados preliminares obtidos por Dr. R. A. Mille?r (IDEC Pharmaceuticals Corporation, Mountain View, Califórnia) indicaram que o soro de um rato imunizado com anticorpo monoclortal MF11-30 demonstrou uma elevada reactividade com células de melanoma humano de cultura em testes serológicos em relação a soro anterior à imunização. Resultados preliminares obtidos pelo Dr. S. Raychaudhuri (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, Califórnia) também indicaram que o MF11-30 pode induzir numa estirpe sinegeica de murganhos anticorpos portadores de idiótipo 225.28 que se ligam a uma linha celular de melanoma humano de cultura. Assim, os presentes resultados indicam que o anticorpo monoclonal MF11-30 pode induzir a formação de anticorpos que reagem com células de melanoma humano. Os resultados preliminares indicaram que a administração do anticorpo MF11-30 induzia a redução da carga tumoral em determinados pacientes com melanoma ma1igno.

O presente invento não se restringe ao MF11-30. De facto, podem criar-se muitos anticorpos anti-idiotípicos orientados para o idiótopo do anticorpo monoclonal murino 225.28. Pode ser usado qualquer anticorpo monoclonal secretado por hibridomas de qualquer espécie, bem como qualquer anticorpo policlonal (isto é, antissoro convencional) de qualquer espécie com as mesmas características imunológicas. Os especialistas da técnica devem ter em mente que também podem ser usados derivados do anticorpo monoclonal murino 225,28. No âmbito do presente invento o termo derivado inclui (não se limitando a) linhas celulares relacionadas bem como quaisquer anticorpos ou fragmentos de anticorpos que incluam peptídeos sintéticos que possam competir, completa ou parcialmente com o anticorpo monoclonal 225.28 no que dic respeito ô. liqação a AAM-EMM.

de salvamento) anterior (cf . o

Para levar à prática o presente invento com anticorpos anti-idiotípicos equivalentes ao MF11-30 o primeiro passo consiste na identificação das componentes idiotípicas reactivas com o determinante específico (epítopo) do antigénio associado ao melanoma de elevada massa molecular, d que pode ser alcançado através de qualquer uma das várias abordagens conhecidas dos especialistas da técnica. F'or exemplo, anticorpos semelhantes (Acl's) com especificidade para o epítopo do antigénio associado ao melanoma de elevada massa molecular reconhecido pelo 225.28 podem ser obtidos a partir de pacientes com melanoma, animais de laboratório imunizados com células de melanoma humano, de fontes comerciais ou por métodos rotineiramente praticados pelos especialistas da técnica. Servem os Dbjectivos do presente invento tanto anticorpos monoclonais como anticorpos policlonais. Ds anticorpos policlonais podem ser isolados de soro de pacientes du de animais mediante purificação de afinidade usando antiqénios associados à doença imobilizada tal como descritos por F. X. Real e outros, J. Exp. Med. 160:1219 (1984) e no Handbook of Experimental Immunoloqy (Manual de imunologia experimental), editado por D. M. Weir e outros, 19S6, daqui em diante designada o Manual. Ds anticorpos monoclonais podem ser gerados por fusão de salvamento da hibridização de células somáticas padrão (fusão usando técnicas padrão práticadas na técnica Manual, supra e W. L. Carrol e outros, J.

Imrnu.no 1 . Meth. 69:61 (1986)) e utilizando células B periféricas de pacientes ou quaisquer outras células B sensibilizadas para o antigénio associado a melanoma de elevada massa molecular.

descritas a partir de

Os anticorpos monoclonais e policlonais também podem ser qerados através das técnicas atrás sujeitos humanos ou animais de laboratório inoculadas com o tumor, com extractos do tumor, AAM—EMM purificado ou peptídeos derivados de AAM-EMM.

Estes anticorpos Ac 1 equivalentes a 225.28 (isto é, aqueles que competem com o MF11-30 na ligação ao AAM-EMM) puderam ser utilizados para gerar e identificar Ac2's anti-id's com características iguais ou semelhantes ao MF11-30.

II. Produção e caracterização do anticorpo monoclonal anti-idiotipico (IMelpgl) orientado para o anticorpo monoclonal 225.28 orientado contra AAM-EMM □s presentes inventores descobriram e purificaram em elevado qrau um segundo anticorpo monoclonal anti-idiótipo, IMelpgl (depositado em ATCC, Rockville, MD, sob o n2 de acesso HB10134) que na. sua opinião, baseada nos dados obtidos até à data, tem um elevado grau de pureza e é superior ao MF11-30 no que diz respeito à indução de uma reacção antiturooral. □ anticorpo anti-idiotípicD IMelpgl é produzido por um hibridoma obtido esplenócitos de rato BALB/c imunizados com 225.28 e células de mieloma murino

F'3-X63~Aq8. Ó53 (T. Kageshita e outros, Piqment Ce 11 Res. 1:185 (1988)).

a partir da fusão de anticorpo monoclonal

Preparou-se o IMelpgl tratando a linha celular MF11-3Õ com BM Ciclina (Boehringer-Mannheim) de acorda com as instruções fornecidas pelo fabricante. No final do tratamento realizou-se um teste ao micoplasma usando um dispositivo de sonda de genes (Gen-Probe, San Dieqo, CA) e verificou-se estar a linha. celular isenta de qualquer contaminação detectável do micoplasma. A fim de purificar a. linha celular progenitora de qualquer micoplasma residual ela foi subsequentemente injectada intraperitonealmente em ratos. Após terem sido cultivadas em ascites as células foram novamsnte injectadas em ratos para assegurar gue a linha celular

MF11-30 estava totalmente isenta de micoplasma.

Um hibridoma MF11-30 cultivado em ascites do segundo grupo de ratos foi extraído e cultivado in vitro em meio de cultura de tecidos sem antibióticos. Após quatro semanas de cultura o material sobrenadante foi enviado para Cariei para testes ao micoplasma. O resultado do teste de micoplasma Coriel foi negativo.

D MF11-30 isento de micoplasma foi subclonado sob uma diluição limitadora a 0,3 células/concavidade (30 células / placa com 9ó concavidades) usando RF'MI contendo um total de 157. de soro de vitela, glutamina e gentamicina. Passadas duas semanas fizeram-se colheitas das concavidades que revelavam crescimento de culturas e testaram-se os seus sobrenadantes quanto A sua capacidade de se ligarem a 225.28. Ds sobrenadantes também foram testados quanto à sua capacidade de inibir a ligação de ^'^JI-225.28 è linha celular de melanoma Colo 38. Um total de 50 a ó0 concavidades com um crescimento positivo foi testado e 15 a 20 concavidades deram origem a resultados positivos nos testes atrás referidos. Um dos subclones positivos era o IMelpgl que foi expandido e utilizado em análises futuras.

A especificidade e o papel biológico da reacção Ac3 induzida pelo IMelpgl foi testada. Especificamente, (i) determinámos em diferentes espécies se o IMelpgl induzia uma reacção imunológica humoral específica em relação ao melanoma (Ac3); (ii) determinámos se os Ac3's induzidos pelo IMelpgl eram bioquim.icamente semelhantes ao 225.28 tal como foi determinado pelo método de radioimunoprecipitação e (iii) examinámos diferentes formulações de IMelpgl a fim de determinar as condições óptimas para a indução de Ac3.

'“ϋΣΓ

Os dados aqui apresentados indicam que num sistema alogeneico em ratos era requerida a conjugação de Ac2 a um suporte para a indução de anticorpos que reconhecessem antigénios em células de melanoma humano. Contudo, num sistema xenogeneico (coelhos), tanto o Ac2 não conjugado como o conjugado induziam anticorpos antitumorais. 0 Ac2 conjugado era mais eficaz uma vez que apenas foram necessárias duas imunizações ao contrário dc> Ac2 isolado que exigia quatro vacinações. Uma dissecação mais aprofundada, da reacção Ac3 indica que parte da reacção idiotípica é específica em relação ao tumor tal como é revelado pela capacidade dos Ac3's de inibir a ligação de um anticorpo antimelanoma monocional a células transportando o antigénio do melanoma. 0 facto de os Ac2's e Ac3's imunoprecipitarem idênticas espécies moleculares das células de melanoma reforça a especificidade antitumoral da reacção humoral induzida por Ac2. Além disso, os anticorpos antitumorais induzidos por Ac2 não reagem cruzadamente com hemocianina (suporte). Colectivamente, os dados apresentados nesta comunicação indicam os pre-requisitos de uma iumunoterapia idiotípica eficaz e demonstram a utilização potencial do IMelpgl como agente imunoterapêutico activa em relação a melanomas humanos.

A. Materiais e métodos

Linhas celulares. A linha celular de melanoma Colo 38 foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitela, 17. de glutamina e 10 pg/'ml de sulfato de humano 107. de gen ta— micina.

- 26 Anticorpos monoclonais. 0 anticorpo monoclonal

225.23 (Γ2β.,Κ) foi purificado numa coluna de proteína A-Sepharose 4B. 0 anticorpo monoclonal IMelpgl foi purificado por afinidade numa coluna a 225—Sepharose. 0 anticorpo imunoc1ínico IC01 (ΓΙ,Κ) foi utilizada coma controla ajustada aa isótipo para α IMelpgl.

Conjugação de IMelpgl anti-id a HKL- 0 acoplamento foi efectuado de acordo com o método descrito por S. Raychaudhuri e outros, <3. Immunol. 137:1743 (1787). De um modo resumido, misturaram-se 4 ml de solução de caldo de anticorpo (1 mg/ml) com HKL (1 mg/ml) em STF. Adicionou-se solução de glutaraldeído recentemente diluída (17.) á mistura de anticorpo e HKL de modo a obter-se uma concentração final de 0,057. A mistura foi incubada durante 1 hora ã temperatura ambiente e dialisada de um dia para o outro contra STF.

Imunização dos ratos. Imunizaram-se ratos A/J com oito semanas (três em cada grupo) com 50 G g de IMelpgl não conjugado ou conjugado com hemocianina (HKL) emulsionada com adjuvante SAF—M contendo 50 pg de MDF de treonilo por rato (A. C. Allison e □utros, J. Immunol. Methods 95:157 (1986)). Repetiram—se por duas vezes as imunizações com a mesma concentração de antigénio todas as duas semanas subcutaneamente. Como controlo, imunizou— -se o mesmo nu.mero de ratos com 50 pg de IC01 conjugado ou não conjugado, um anticorpo ajustado ao isótipo não relacionado, ou com 50 pg de HKL isolado. Sangraram-se os ratos sete e quatorze dias; apos cada imunização.

Imunização dos coelhos. Imunizaram-se coelhos N'ZW adultos (dois em cada grupo) intradermicamente em locais diferentes com 500 pg de IMelpgl não conjugado ou conjugado com HKL em adjuvante SAF-M contendo 250 pg de MDF' de treonilo por coelho. Os coelhos foram injectados com a mesma concentração de antigénios todas as duas semanas e sangrados sete e quatorze dias após cada imunização. Cada coelho foi imunizado um máximo de quatro vezes. Ds coelhos de controlo foram imunizados com 500 p.g de HKL isolado.

Análise da reacção idiotípica (Ac3). A reacção idiotipica induzida pelo IMelpgl foi analisada num teste de radioimunidade (TRI) tal como é descrito por S. Raychaudhuri e outros, J. Immunol. 137:1743 (1087). De um modo resumida, revestiram-se

IMelpgl-F(ac)^ placas foram placas microtituladas com 100 ng de fragmento durante duas horas à temperatura ambiente. As lavadas com STF e incubados com BSA a 17. em STF durante 1 hora.

Soro serialmente diluído de grupos de controlo e experimentais diferentes foram incubados nas concavidades na presença de 20 000 1 ^5 cpm de 1-225.28 durante 18 horas. As placas foram cuidadosamente lavadas e a radioactividade em cada concavidade foi medida com um contador gama. Ds resultados foram expressos como percentagens de inibição da ligação de IMelpgl-F(ac)².

12(

1-225.28 ao fragmento

Anáiise da reacção Ac 1's em soro,

Para determinar reacção anticorpo específico em relação ao melanoma adsorveram-se soros de coelho primeiro sobre células 3T3 não relacionadas (10^) durante 3 horas a 4°C a fim de remover reactividades não específicas. Soros não absorvidos e absorvidos por 3T3 foram então serialmente diluídos em BSA a 17. e testados por um EIA quanto a sua capacidade de se ligarem a linhas celulares de melanoma (Colo 38 e M21) que manifestam o antigénio do melanoma. As células foram cultivadas sobre placas microtituladas e glu.taraldeído a 0,057. em STF durante 15 minutos, placas foram bloqueadas com BSA a 17, contendo glicina 0,1 M durante 40 minutos. As placas foram incubadas com diferentes diluições de soro durante duas horas, lavadas com STF e depois fixados com Em sequida, as incubadas com IgG anti-rata de cabra conjugada com peroxidase durante 1 hora. As placas foram extensivamente lavadas-, o substrato de peroxidase ABTS foi adicionado e a densidade óptica foi medida a 405 nanometros.

Purificação por afinidade do Ac5. Para delinear a. fracção de anticorpos Ac3 com capacidade de se ligarem ao antigénio do melanoma (anticorpos Ac 1's) submeteram-se cs soros a purificação por afinidade. Os soros foram primeiro absorvidos por passagem através de uma coluna Ig de rato - Sepharose 4B normal a fim de eliminar os anticorpos anti-isotípicos. A amostra absorvida foi então aplicada sobre uma coluna IMelpgl Sepharose 4B. Ds anticorpos ligados foram eluídos com ácido acética 0,1 M e imediatamente neutralizado. Estes anticorpos anti-idiotípicos foram pormenorizadamente examinados quanto à sua capacidade de se ligarem a células transportando antigénios de melanoma.

Análise da reacção Ac 1 em anticorpos purificados por af in idade. Os Ac3's purificados por afinidade foram analisados quanto à sua actividade anti-melanoma mediante um TRI destinado a testar a sua capacidade de se ligarem a células de melanoma. Incubaram-se diferentes concentraçSes de anticorpos purificados durante 2 horas em células de melanoma cultivadas e fixadas em placas microtituladas tal como atrás se descreveu.

A especifidade da actividade antimelanoma dos Ac3's purificados foi subsequentemente demonstrada num teste de inibição em que se determinou a capacidade dos Ac3's purificados por

125 afinidade de inibição da ligação de 1-225 a linhas celulares

Colo 38. Misturou—se uma concentração fixa de (20 000 cpm) com diferentes concentrações de Ac3 purificado que em seguida s-e adicionou a células Colo 33 fixadas sobre placas microtituladas. Após incubação de um dia para o outro lavaram-se as placas e a radioactividade retida foi contada com um contador gama. Os resultados são indicados sob a forma de percentagens de inibição. Como controlo, determinou-se de modo semelhante a capacidade do soro para inibir a ligação de I —MEM136 a células Colo 38. D MEM136 é um anticorpo anti-PSM monoclonal que se liga ao AAM-EMM num local diferente do 225.28, isto é, ο MEM136 e o 225.28 não se inibem cruzadamente no que se refere â ligação a linhas de células de melanoma.

Exame da reactividade cruzada de anticorpos anti-HKL. Para examinar se os anticorpos antitumor induzidos pelo anti—idiótipo conjugado com HKL reagem cruzadamente com o HKL realizaram-se as seguintes experiências. Adsorveram-se separadamente soros de coelhos imunizados com IMelpgl—HKL sobre HKL-Sepharose 4B durante 1 hora em tubos Eppendorf sob agitação suave. Ds tubos foram centrifugados numa centrifugadora Eppendorf durante 2 minutas a fim de separar os anticorpos anti-HKL. Os anticorpos isentos de HKL-Sepharose foram testados quanto à sua capacidade de se ligarem a células Colo 38 mediante um TRI tal como atrás se descreveu.

Como experiência-corolário testaram-se também os Ac3's purificados por afinidade quanto à sua ligação a HKL mediante um TRI. Revestiram-se placas microtituladas com 100 ng de HKL em STF por concavidade durante 18 horas a 4°C. As placas foram lavadas e depois incubadas com BSA a 17. durante 1 hora. Os Ac3's purificados por afinidade foram incubados nas placas durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem das placas adicionaram-se 20 000 cpm de Ig's anti—coelho de cabra iodadas e incubaram-se aquelas de um dia para o outro a 4*C. As placas foram lavadas e mediu-se a radioactividade.

Imunoorecipitação cie AAM-EMM. Rotularam-se biossinteticamente células Calo 38 (1,5 x 10^Z) durante 3 horas com 200 pC.i de ''^S-metionina em 1 ml de meio RPMI isento de metionina (cf. G. T. Nepom e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:2864 (1984). As células foram centrifugadas e o granulo foi solubilizado em tampão RIPAlisis (10 mM Tris, 150 mM NaCl, desoxicolato a 17-, Triton X-100 a 17, 0,17 SDS, ImM aprotinina, 10 mM PMSF, 5 mM N-etilmaleimida) durante 1 hora sobre gelo. □ lisato foi clarificado mediante centrifugação a 110 000 g durante 45 minutos. 0 lisato correspondente a 5 x 10? cpm foi adicionado a um imunoadsorvente pre-preparado contendo 100 pg de Ac3's purificados por afinidade de Ac2 adsorvidos sobre proteína A - Sepharose a 107 num volume de 100 μΐ. Como controla adiciainaram-se anticorpos eluídos IgG de rato normal a proteína A - Sepharose. Após incubação durante 18 horas a 4^CC sob agitação suave lavaram-se por três vezes os imunoadsorventes com 8TF contendo ovalbumina a 17 e Tween-20 a 0,57. Os antigénios foram libertados da proteína A - Sepharose mediante ebulição durante 2 minutos em amostra de tampão e aplicados sobre SDS-PAGE (67). 0 gel foi secada e exposto a película com crivos intensificadores a -70°C durante 48 horas.

B. Resu1tados

Indução de Ac3's em ratos. Nos nossos estudos murinos preclínicos maximizámos a reacção imunológica induzida por Ac2's mediante a injecção do IMelpgl derivado de BALB/c numa estirpe alogeneica de ratos. Usaram—se neste estudo ratos A/J. Como se mostrará adiante, as nossas descobertas indicam que o IMelpgl tem capacidade de indução de reacção antimelanoma num ajuntamento xenogénico (isto é, pacientes com melanoma).

Os ratos imunizados com IMelpgl não conjugado não produziram qualquer reacção Ac3 mesmo após quatro imunizações (dados não apresentados). Os ratos que receberam IMelpgl conjugada com Ht<L originaram uma reacção IgG antitumoral manifestando o idiótipo. A Tabela III apresenta a reacção Ac3 induzida em cada rato por IMelpql-HKL. Não se observou uma reacção antitumoral significativa nos ratos de controlo imunizados com HKL isolada. Tal como se indica na Tabela III (coluna da direita) 20 a 307. dos anticorpos que se ligam a Colo 38 puderam ser inibidos pe1 o 225.2B.

se ligam a Colo 38 puderam ser

TABELA III

Indução de anticorpos antitumorais pelo anti-idiótipo IMelpgl

Título dD anticorpo (pg/ml) anti-Colo 38 idiótipo 225

HKL	1 : 100 1 :100 1:200	(1,6) (1,6) (3,2)	-
IMelpgl-HKL	1:1600	(25,6)	20-1
	1 :800	(12,8)	20-
	1:1600	(25,6)	20-

Adicionaram—se diferentes diluiçSes de soros experimental (IMelpgl-HKL-imunizado) e de controla (HKL-imunizado) (sangrados 7 e 14 dias após a segunda imunização) a placas revestidas com a linha celular Colo 38. Em seguida as placas foram reveladas com IgG antimurina de cabra marcada com peroxidase. Indicam—se dados de três ratos individuais. Usaram-se diferentes concentrações de 225 como controlo de anticorpo.

A análise do realizada num teste 20 000 cpm de 2.25 idiótipo 225 (sulfato anticondroitina) foi de inibição competitiva em que se adicionaram a cada concavidade contendo Colo 38 (linha celular de melanoma) e diferentes diluições de soros experimental e de controlo. As placas foram incubadas de um dia para o outro.

Análise da reacção Ac3 em coelhos. Para ma ;·: i in i z a r ainda mais a imunogenicidade dos Ac2's de rato imunizámos coelhos com IMelpgl e investigámos se, na situação xenoqeneica, é necessária ou útil a conjugação com um suporte para que um Ac2 induza uma reacção humoral antitumoral

Imunizaram-se coelhos com

IMelpgl isolado ou com IMelpgl-HKL em SAF-M. Imunizaram—se coelhos com HKL isolado como controlo para o grupo imunizado com IMelpgl conjugado com HKL e com IC01 como controlo para o grupo imunizado com IMelpgl não conjugado. Os coelhos imunizados por duas vezes intradermicamente com IMelpgl nãD conjugado em adjuvante SAF-1 não produziram anticorpos antimelanoma apesar de ter sido observada uma reacção idiotípica. Contudo, observou-se uma reacção humoral antitumoral de fraca intensidade após quatro imunizações. Ds dados são apresentados na Figura 2 que, quando comparado com o controlo, o IMelpgl reacção humoral antitumoral significativa após repetidas.

e demonstram induziu uma imunizações

Nos coelhos imunizados com HKL conjugado cdhi IMelpgl também se observou uma reacção humoral antitumoral significativa. Os dados obtidos numa experiência significativa são apresentados nas Figuras 3a e b. A Figura 3 representa a ligação tumoral de diferentes diluições de soro de coelhos imunizados cDm HKL-IMelpgl antes e depois da absorção de células tumarais murinas não relacionadas. Estes dados demonstram que a imunização IMelpgl—HKL induziu uma reacção Ac3 que se ligava preferencialmente à linha celular Colo 38. 0 soro de controlo, isto é, o soro de coelhos imunizados apenas com HKL não produziu quaisquer anticorpos com ligação tumoral.

Purificação por afinidade de Ac3's de soro. Para determinar conc1usivamente que é o Ac3 que se liga à linha celular de melanoma Colo 38 purificámos por afinidade Ac3's numa coluna de IMelpg1-Sepharose. 0 soro imunizado com IMelpgl foi primeiro passado através de uma coluna de IgG de coelho normal a fim de absorver actividade anti-isotípica. D material não ligado pela Ig de rato normal foi passado através de uma coluna de IMelpql-Sepharose. 0 material ligado foi eluído e testado quanto à actividade antimelanoma na linha celular de melanoma (Fig. 4). A especificidade da ligação do Ac3 foi determinada num teste de inibição em que a. ligação de 1-225 à linha celular Colo 38 foi determinada na presença de diferentes concentrações de Ac3's. Os resultados são indicados na Figura 5 e demonstram que a ligação de ^1-225 ao tumor pode ser inibida por Ac3's purificados.

Reactividade cruzada com HKL de anticorpos antitumorais induzidos por Ac2's. Para determinar se os anticorpos antitumorais reagem cruzadamente com HKL realizaram-se dois conjuntos de experiências. No primeiro conjunto, removeram-se anticorpos que se ligavam a HKL da amostra de soro. Incubaram-se separadamente soros recolhidos individualmente de coelhos imunizados com IMelpgl-HKL com HKL-Sepharose 4B em tubos Eppendorf durante 1 hora sob misturação intermitente. Em seguida centrifugaram—se os tubos e o material não ligado foi testado quanto à sua capacidade de se ligar a Colo 38 e a HKL. Após a remoção de anticorpos que se ligavam a HKL, os soros de coelho ainda tinham capacidade de se ligarem a linhas celulares Colo 38 mas não a HKL (dados não indicadas). Na segunda série de experiências os Ac3's purificados por afinidade em IMelpgl foram testados quanto à sua capacidade de se ligarem a HKL. Os dados são apresentados na figura 4b e demonstram gue os Ac3's purificados numa coluna de IMelpgl são melanoma-específicos e não se ligam significativamente a HKL.

Reali zouIinunoprecipitacão de AAM-EMM por Ac 1 e Ac3.

—se uma radioifflunoprecípitação piara determinar se os Ac 1 ' s e Ac3's reconhecem a mesma espécie molecular. A intunoprecipitação do AAM-EMM de células Colo 36 por anticorpos diferentes foi efectuada tal como se descreve na secção Materiais e Métodos; 225.28 foi usado como controlo positivo. 0 CC92 que não está relacionado com melanoma foi usado como controlo negativo. Ds Ac3's purificados por afinidade anti-id de dois coelhos diferentes imunizados quatro vezes com IMelpgl anti-id foram usados no processo de imunoprecipitação. Parece que c>s Ac 1 ' s e Ac3's reconhecera a mesma espécie molecular com uma dimensão de 250 K. Além disso, a imunoprecipitação pelo Ac3 revelou ser específica dado que foi apreciavelmente exaurida pela pré-tratamento do lisato de melanoma com 225.28.

Discussão

Ds anti-id's podem ser usados como imunorregu1 adores quer para estimular ou suprimir uma reacção específica para um dado antigénio (cf. H. Cosenza e outros, Science 176:1027 (1972); W. R. Thoraas e outros, J. Immunol. 130:2079 (1983). Aqui estudámos uma reacção iraunológica antitumoral induzida pelo Ac2. Em particular, estes estudos descrevem a especificidade e o papel biológico de uma reacção Ac3 induzida por um Ac2. Ds nossos dados podem ser resumidos do seguinte modo: (i) para que a indução de uma reacção humoral antitumoral em ratos seja eficaz, os Ac2's murinos t?m de ser conjugados com um suporte; (ii) os Ac2's não conjugados podem induzir uma reacção humoral antitumoral em coelhos após sucessivas imunizações enquanto que os Ac2's conjugados com um suporte induzem uma reacção humoral antitumoral logo após duas imunizações; (iii) uma parte da reacção idiotípica total é especifica em relação ao tumor (cf. Fig. 3a; ligação de 225.28 e Ac3 à linha celular do melanoma);

(iv) a ligação do anticorpo antimelanoma monoclonal a uma linha celular de melanoma pode ser inibida por fic3's; (v) os anticorpos antitumorais induzidos pelos Ac2's não reagem cruzadamente com a hemocianina e (vi) os Ac 1's e Ac2's precipitam espécies com massas moleculares semelhantes de uma linha celular de melanoma.

Nem o Ac 1 nem o Ac2 medeiam a citotoxicidade dependente de complementos ou a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (dados não indicados). Esta ausência de actividade mortífera é muito provavelmente devida à localização do antigénio na matriz extracelular (MEC). Consequentemente, se existe qualquer associação positiva entre a indução de Ac3's e o crescimento do melanoma, ela não poderá ser devida à destruição de células tumorais mediada por Ac3's. Por outro lado, o Ac3 pode mediar uma função ainda mais profunda gue interfere com a biologia da ligação às células tumorais à membrana basal, minimizando assim o potencial metastático das células de melanoma.

é sabida que as células tumorais atravessam a MEC durante o processo de invasão e metástase. A MEC mais relevante para a metástase é a lâmina basal ou membrana de base. As membranas de base são compostas essencia 1mente por laminina, entactina, fibronectina e prateoglicanos entretecidas com colagénio do tipo IV. A maioria dos dados experimentais sugere gue existe uma correlação íntima entre a degradação da membrana extracelular e a invasão e metástase das células tumorais. Consequentemente, a ligação dos Ac3's à MEC pode interferir com a biologia do crescimento e metástase celulares mediante a inibição da ligação das células tumorais à MEC.

No seu conjunto, os nossos dados demonstram a utilidade do IMelpgl como agente imunoterapêutico activo contra o melanoma.

□ IMelpql também pode ser útil na processa de indução de imunidade protectora.

III, Utilização dos anticorpos anti-idiótipo no diagnóstico, controlo e imunoterapia

Qs anticorpos anti-idiotípicos de acordo com o presente invento podem ser usados no diagnóstico e controlo de doenças e na imunoterapia activa ou passiva de acordo com o seguinte método. (Apesar de a discussão que se segue se referir à utilização do MF11-30 na análise e controlo de doenças e na imunoterapia activa ou passiva, os especialistas da técnica reconhecerão -facilmente que os métodos também são aplicáveis so

No diagnóstico e controlo de doenças 0 MF11-30 pode ser

IMelpg 1 ) .

incorporado em testes in vitro (tais como ELISA e RIA) com d objectivo de medição de níveis de idiótipo serológico reactivo com o MF11-30 antes, durante e depois da imunoterapia; por exemplo, na medição do efeito potenciador de administrações múltiplas de MF11-3O em imunoterapia activa.

Em imunoterapia activa o MF11-30 pode ser administrado com o objectivo de aumentar a reacçãD imunológica para estimular as componentes benéficas do sistema imunológico; por exemplo, rio tratamento do melanoma maligno é desejável elicitar reacçóes celulares e humorais dirigidas contra o antigénio associado ao melanoma.

Quando usados em imunoterapia activa os anticorpos anti-idiótipo de acordo com o presente inventa podem ser ministrados numa formulação adjuvante, isto é, com adjuvantes, suportes veículos e mediante técnicas de conjugação conhecidas ou concebidas pelos especialistas da técnica. (Preferido no caso do IMelpgl). Estas formulações podem .incorporar Formulação

Adjuvante Syntex - 1 (FA3-1), derivados de dipeptídeo murami1 o, 1ipopolissacarídeos, polímeros plurónicos, Bacillus Calmette-Guèrin (BCG), lipossomas, emulsões em óleo mineral, adjuvantes aluminados, tais como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas tais como Quil A, complexos imunoestimulantes (COMIS), lípido A, hemocianina keyhole limpet (HKL), antigénio do núcleo da hepatite, toxóide do tétano, emulsões água-em-óleo, ligação cruzada de q1utara1deído e outros procedimentos de conjugação para conjugar os anticorpos anti-idiótipo a adjuvantes ou suportes. Exemplos de formulações adjuvantes que incorporam estes materiais e processos foram descritos por A. Steinberger e outros, Experimental Parasitoloqy 58:223-229 (1984); B. Morein, Nature 532:287-288 (1988); A. C. Allison, J. Immunol. Methods 95:157-168 (1986); B. E. Clarke e outros, Nature 330:381-384 (1987); S. Raychaudhuri e outras, J. Immunol. 137:1743 (1986); J. Eskola e outros, New Enq. 3. Med . 317:717-722 (1987); A. C. Allison, Bio/Technology 5:1041 (1987); J. E. Leonard e outros, Blood 65:1149-1157 (1985); Practical Guide for Use in Affinitv Chromatoqraphy and Related Techniques (Guia prático de cromatografia. de afinidade e técnicas relacionadas) (2é ed., 1983, Reactiff IBF) pub. pela Societé Chimique Pointet-Girard, França.

Quando usados em imunoterapia activa os anticorpos são ministrados ao paciente de um modo e em doses que induzam a regressão dos tumores. Normalmente serão ministrados através de injecções subcutâneas ou intramusculares (IM). A dose adequada de Ac2 a ser administrada a um determinado paciente dependerá do peso do paciente e do estada de funcionamento do seu sistema imunológico. As doses podem variar entre 500 pg e 5 mg. 0 provável intervala de dosagem preferida situa-se entre 100 pg e 5 mq por local de injecção. D objectivo é, evidentemente, usar a dose mínima indicada para a obtenção de uma reacção antitumoral

Podem usar—se múltiplos locais de bumoral e/ou celular eficaz, in j ecção.

No que se refere à utilização dos anticorpos de acordo passiva, podem existir que o com o presente invento em imunoterapia casos de doenças (por exemplo, doença auto-imune) em AAM-EMM é o alvo de reacções imunológicas de células B ou células T deletérias que atacam o tecido saudável. A imunoterapia passiva pode ser usada nestes casos de doença. Quando usados em imunoterapia passiva os anticorpos revelados no presente invento não são utilizados em formulações adjuvantes. 0 método de administração é a injecção intravenosa e, em geral, ministram-se doses mais elevadas de anticorpo ( entre 50 mg e 5 g). Outras utilizações destes anticorpos em imunoterapia passiva tornar-se-So evidentes para os especialistas da técnica. De um modo geral, as utilizaçóes imunoterapêuticas passivas destes anticorpos serão apropriadas sempre que o AAM-EMM seja o alvo de reacçóes imunológicas que se deseja suprimir.

I0. Resultados de ensaios clínicos que utilizam o MF11-50__no tratamento de pacientes com melanomas malignos avançados

Foram relatados ensaios clínicos bem sucedidos em pacientes com linfomas em células B. Ds dados aqui apresentados representam os primeiros ensaios clínicos em pacientes com tumores sólidos.

Trinta e quatro pacientes com melanomas malignos não dissecáveis recorrentes foram submetidos a dois ensaios clínicos. No primeiro ensaio trataram—se 12 pacientes com 0,5 mg, aumentados depois para 4,0 mg, de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos ministrados por injecção subcutânea. No segundo ensaio apenas se ministraram subcutaneamente 2,0 mg de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos nos dias 0, 7 e 2S. Em ambos os estudos as injecções subsequentes foram determinadas em função da produção de anticorpos anti-anti-idiotípicos (Ac3's). Em ambos os ensaios não se observou toxicidade apesar da produção de anticorpos Ig antimurina. Num dos pacientes verificou-se uma remissão completa com redução de nódulos linfáticos abdominais múltiplos. Observou-se uma reacção menor em três pacientes com um decréscimo da dimensão de metástases cutâneas bem como pulmonares e do fígado. A análise do soro revelou que todos os pacientes produziram Ac's Ig antimurina enquanto que dezanove pacientes apenas produziram anticorpos que inibiam a liqação de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos aos correspondentes anticorpos monoclonais anti-AAM-EMM. A maior probabi1 idade de sobrevivência parece estar relacionada com a produção de Ac3's específicas, a diminuição dos níveis de AAM-EMM e a existência de elevados níveis de Ac3's. Estes resultados sugerem que o anticorpo monoclonal anti-idiotípica murino relativo aos anticorpos monoclonais AAM-EMM pode desempenhar um papel determinante na terapia do melanoma maligno.

Apresentam—se adiante pormenores destes estudos.

A. Material e métodos

Usou-se nestes ensaios clínicos o anticorpo monoclonal MF11-30. 0 MF11-30 revelou uma forte reactividade nos três ensaios como demonstra a tabela adiante apresentada.

TABELA IV

Características fase pacientes n-12

Dose (mg ) N'2 de pacientes

0,5 2,0 3,0

4,0

Macho/Fêmea = 5/7

Idade = média 58 (38-72)

Terapia anterior - Nenhuma - 4

Imunoterapia - 6 Radiação - 2

Quimioterapia - 1

No teste do anticorpo monoclonal MF11-30 com um painel de anticorpos monoclonais relativos a determinantes distintas de AAM-EMM e relativos a distintos antigénios associados a melanoma apenas se detectou radioactividade com o anticorpo monoclonal 225.28. Este facto confirma que o anticorpo monoclonal MF11-30 reconhece um idiótipo privado situado no local de combinação com o antigénio dc< anticorpo monoclonal 225.28.

B. Fase I dos ensaios clínicos com anticorpo monoclonal anti-idiotípico MF11-30

Ministrou-se anticorpo monoclonal MF11-3Õ a doze pacientes com melanoma maligno avançado. A dose inicial administrada neste ensaio foi de 0,5 mg, depois aumentada até 4 mg por injecção. □ calendário do estudo caracterizava-se por administrações de MF11-30 nos dias 0, 7 e 28. As injecçSes subsequentes foram determinadas pela produção de Ac3's.

Ministrou-se uma potenciação adicional sempre que os níveis existentes de Ac3 que foi pacienao soro semanai!

decresceram.. Realizaram-se análises analisado quanto aos títulos de Ac3 e Ig antimurina. Os tes que intervieram neste estudo são indicados na Tabela V. Neste estudo a Ig murina foi detectada numa fase inicial da terapia. Observaram-se anticorpos Ig antimurina CDm títulos de 1:320 em todos os pacientes e um aumento cios títulos de anticorpos duas semanas após a fase inicial da terapia. Dos doze pacientes intervenientes, seis produziram anticorpos anti-anti-idiotípicos relativos ao anticorpo monoclonal MF11-30 o que era demonstrado pela capacidade apresentada pelo soro dos pacientes de inibição da ligação do anticorpo monoclonal MFU-30 ao anticorpo monoclonal 225.23. Alcançaram-se níveis de inibição de 907. com títulos situados entre 1:2 e 1:128. A produção de anticorpos anti-anti-idiotípicos foi posterior à produção de anticorpos Ig antimurina. Com o nível de dosagem de 0,5 mg os níveis de Ac3 situavam—se em valores titulares muito baixos. Um dos pacientes cuja dosagem foi aumentada de 0,5 mg para 2,0 mg de MFU-30 revelou um aumento significativo dos níveis de Ac3 consequindo-se, no seu caso, uma inibição a 907. da ligação de MF11-30 sd anticorpo monoclonal 225.23 apenas com o nível de 2,0 mg.

Outros pacientes também tratados com níveis de 2,0 mg igualmente níveis elevados de Ac3. Com níveis de 3,0 mg e 4,0 mg, alguns dos pacientes também produzide Ac3enquanto que o tempo decorrido até ã produção de era diferente do do grupo tratado com o nível de 2,0 mg. Não se observou toxicidade no decurso deste qualquer um dos níveis de dosagem usados.

produzi ram dosagem de ram níveis

Ac3's não dosagem de ensaio com

Concluiu-se que 2,0 mg era a dose mínima que induzia eficazmente a produção de Ac3's nos pacientes tratados. Com base nestas descobertas iniciou-se um ensaio clínico destinado a determinar a eficácia do MF11-30, sendo os pacientes intervenientes tratados com 2,0 mg segundo o calendário atrás indicado.

C. FOpulaçgp de pacientes (ensaio de eficácia)

Submeteram-se pacientes com melanoma maligno, no estádio IV avançado, a este ensaio clínico. Em relação a todos os pacientes submetidos a este ensaio tinham falhado outras modalidades de tratamentos (radiação, quimioterapia e imunoterapia) e outros anticorpos monoclonais (R24). D calendário de terapia usado neste ensaio clínico era semelhante ao usado no primeiro estudo. Os pacientes foram tratados nos dias 0, 7 e 28. As injecções subsequentes foram ministradas em função das produções de anticorpos Ac3.

Submeteram-se 22 pacientes a este ensaio clinico. Desses pacientes, 10 eram do sexo feminino e 12 eram do sexo masculino. Os resultados são apresentados na Tabela V adiante A idade mediana de Karnofsky era de 54 (27-74). A eficiência foi de 707. no domínio 50—907. Entre os 22 pacientes submetidos a este ensaio, 6 pacientes não tinham sido tratados previamente tratados, 9 pacientes tinham sido anteriormente submetidos a imunoterapia que incluía 11-2, anticorpos monoclonais R24 e vacinas associadas a melanoma, 7 pacientes tinham sido submetidos a quimioterapia que incluía cisplatina, nitrossuras e DTIC, 7 pacientes tinham sido submetidosq a radioterapia dos quais 3 devida a metástases no cérebro. Os pacientes receberam um total de 93 injecções de 2,0 mg por injecção. Dos 22 pacientes submetidos a este ensaio clínico, um dos pacientes apresentava urticária. 5 horas após a administração destes anticorpos que desapareceu espontaneamente. Esta urticária ocorreu num paciente que tinha sido previamente submetido a. terapia com anticorpo antimelanoma murino. Os outros pacientes intervenientes neste ensaia e que tinham sida previamente submetidas a terapia com anticorpos antimelanoma murinos, tais como o R24, não sofreram efeitos tóxicos e não manifestaram reacçSes anafilácticas apesar da administração repetida de MFÍ1-30.

TABELA V

Macho/Fêmea

Idade

Eficiência

Estádio

Terapia anterior

- 12/10

- 54 (27-74)

- 707. <00-907.)

- IV

Nenhuma - ó Imunoterapia - 9 Quimioterapia - 7 Radiação - 7

Realizou-se uma avaliação imunológica extensiva em 19 dos 22 pacientes que incluiu a determinação de níveis de Ac3's e a especificidade relativa a Ig antimurina, níveis de AAM-EMM. Em alguns pacientes foi efectuada uma estimulação celular. Com base na cinética do AAM-EMM a especificidade do Ac3 e os níveis de Ac3 que se produziram nestes pacientes parecem estar correlacionados com a sobrevivência dos pacientes tratados com MF11-30 e anticorpo anti-idiotípico. Seis dos pacientes produziram Ac3's específicos. Em análises da inibição da ligação do MF11-30 ao anticorpo monoclonal 225.28 observou—se nos pacientes um decréscimo nos títulos de AAM-EMM apresentando 10 dos pacientes níveis reduzidos de Ac3.

D. Discussão

Dos 22 pacientes intervenientes, um paciente manifestou uma remissão completa enquanto que três outros pacientes manifestaram uma reacção menor. Apesar de uma reacção menor não ser considerada significativa, a permanência da estabilidade da doença nesta população de pacientes apesar da presença de uma doença no estádio IV parece estar relacionada com os parâmetros atrás indicados (Tabela V).

Também foram realizados ensaios clínicos com anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos em pacientes com linfomas em células B. Os ensaios clínicos aqui descritos representam os primeiros ensaios clínicos com anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos em pacientes com tumores sólidos. A razão e o(s) mecanismo(s) subjacentes ao efeito terapêutico potencial, nestes últimos pacientes, dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos elicitados com anticorpos monoclonais relativos a antigénios associados a tumores são diferentes dos que dizem respeito a pacientes com linfomas em células B uma vez que nestes últimos se forma de imunoterapia passiva enquanto que nos trata de uma forma de imunoterapia específica activa. Especificamente, os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos exercem os seus efeitos mediante a interacção directa com as células tumorais em pacientes com linfomas nas células B mas supSe-se que estimulam o sistema imunitário dD hóspede a produzir uma reacção imunológica contra as células tumorais no caso de pacientes com tumores sólidos.

uma trata de primeiros se □ aspecto de maior garantia das nossas investigações prende-se com a ausência de efeitos secundários após repetidas injecçSes de anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino MFll-30 em pacientes com melanoma no estádio IV apesar da produção de pacientes manifestaram anticorpos Ig antimurina. Quatro dos indícios de reacção antitumoral e regressão de lesSes não só cutaneas como oculares. Mais importante ainda é o facto de a capacidade de produção de Ac3's específicos e o decréscimo dos níveis de AAM-EMM poder representar um mecanismo de reacção à terapia. Esta descoberta, em conjunção com a regressão das lesSes causadas pelo melanoma associada à administração de MF11-30 demonstra a utilidade e eficiência dos anticorpos anti-idiátipo, dos compostos com eles relacionados e dos métodos descritos e reivindicados no presente texto.

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES: iê - Anticorpo anti-idiotípico, fragmento de anticorpo, péptido ou antissoros, caracterizado por serem capazes de reagir com um idiótopo de: (a) um anticorpo monoclonal murino 225.28 e seus derivados; ou com (b) qualquer anticorpo monoclonal apresentando as mesmas características imunológicas do anticorpo 225.28; ou com (c) quaisquer antissoros policlonais apresentando as mesmas características imunológicas do anticorpo 225.287, e por serem capazes de reagir com um determinante específico (epítopo) de um antigénio associada a um melanoma de elevado peso molecular. 2ê - Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado por ser capaz de reagir com o idiótopo do anticorpo monoclonal murino 225.28 e por ser capaz de reagir com um determinante específico de um antigénio associado a um melanoma de elevado peso molecular . 3ê - Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado por ser capaz de reagir com o idiótopo do anticorpo monoclonal murino 225.28 ou com os equivalentes imuno1ógicos do referido anticorpo 225.28. 4é - Anticorpo anti-idiotípico caracterizado por ser desenvolvido num sistema monoclonal ou paliclonal para o idiótopo de um anticorpo de um antigénio associado a um melanoma de elevada peso molecular, conhecida par 225.28, ou para anticorpos capazes de competir com o referida anticorpo 225.28 relativamente à. ligação ao referido antigénio HMW-MAA. 52 - Anticorpo anti-idiotípico caracterizado por ser capaz de se ligar ao anticorpo 225.28 do antigénio associado ao melanoma de elevado peso molecular ou a anticorpos capazes de competir com o referido anticorpo 225.28 relativamente à ligação ao referida antigénio HMW-MAA e à indução da formação de anticorpos nu.m melanoma da mesma espécie ou de uma espécie diferente. 62 - Anticorpo anti-idiotípico caracterizado por ser o anticorpo anti-idiotípico murino MF11-30 e anticorpos que tem as mesmas características imunológicas do referido anticorpo MF 11-30. 72 - Anticorpo anti-idiotípico caracterizado por ser o anticorpo anti-idiotípico murino IMelpgl e anticorpos que têm as mesmas características imunológicas do referido anticorpo IMelpgl. capaz de se derivado de molecular ou melanoma da - Anticorpo anti-idiot ligar aos anticorpos um antigénio associado a MF11-30 e de induzir a mesma espécie ou de espé pico caracterizado por ser formados contra um péptido um melanoma de elevado peso formação de anticorpos num ie diferente. 92 - Anticorpo anti-idiotípico caracterizado por ser capaz de se ligar aos anticorpos formados contra um péptido derivado de um antigénio associado a um melanoma de elevado peso molecular ou IMelpgl e de induzir a formação de anticorpos num melanoma da mesma espécie ou de espécie diferente. t-'ranticor pos an ti-i d io t ί ρicos a iíiíunoierâ de acordo po

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173, - Método para ama línunoterapia pa caracte ό,οο: o por ss admin i st rarsm a um pacienta acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ó,

517Í. do dooriÇaS, os an·

O ou , de por injecção intravenosa numa gama ds dosagem compreendida entre 50 mg e 5 mg por local de injecção.

ISã. - Método para uma imunoterapia passiva de doenças, caracterizado por se administrarem a um paciente os anticorpos altamente purificados de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou. 9, por injecção intravenosa.

193. - Processo para efectuar ensaios in vitro, caracterizado por se utilizarem nos referidos ensaios os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações i, 2, 3, 4, 5, ó, 7, 8 ou 9.

2Cõ. - Processo para efectuar ensaios in vitro., caracterizado por se ut.iliza.rem nos referidos ensaios os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ó, 7, S ou 9, como adjuvantes.

2'lâ. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por os adjuvantes serem seleccionados entre o grupo constituído por derivados de murami1-dipéptidos, lipopolissacarídeos, Bacillus, Ca 1mette—Guérin (BCG), adjuvantes de alúmen, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, saponinas, Cluil A e 1 í p i d O H .

223. - Processo sara efectuar ensaios in vitro, caracterizado por se utilizarem nos referidos ensaios os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ó, 7, 8 ou 9, con; formulações de adjuvantes.

2 ό . — r r cc es s o das entre o orupo constituído por (SAF-l) e complexos estimuladores de acoroo com reivind.

y n t e x A d j u y ant F o r m u 1 a t i ο η -1 '¹ da imunid (ISC0K3).

24â. - Processo para efectuar ensaios in vitro, caracterizado por se utilizarem nos referidos ensaios os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, com suportes.

25ã. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por os adjuvantes serem seleccionados entre o grupo constituído por hemocianina de lapa lapa de fechadura (KLH), antigénio do núcleo da hepatite, toxoide do tétano,

265-u - Processo para efectuar ensaios i n vitro. caracterizada par se utilizarem nos referdos ensaios os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ó, 7, 8 ou 9, com veículos.

275·., — Processo de acordo com a reivindicação 2ó, caracterizado por os adjuvantes serem seleccionados entre o grupo constituído por emulsões áqua-em—ó1eo, emulsões de óleos minerais, lipossomas e polímeros plurónicois.

1 15

Μ θ h O d O d <3 3. G Ο Γ d O C O Í7i ·3. Γ t? ΐ V i Γι d ί C 3. Ç <3 O 1 0 , G 3. Γ 3. C ~~ terizado por a doença ser o cancro.

125·. ^— Método de acordo com a reivindicação 11, carac· terizado por o cancro ser melanoma maligno.

135·. — Método para o diagnóstico, rastreio ou terapia de doenças, caracterizado por se administrarem a um paciente os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, c, 7, 3 ou 9.

145,, - Método para uma imunoterapia ac ti va de doenças, caracterizado por se administrarem a um paciente os anticorpos da acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, por injecção intramuscular ou subcutânea.

155. - Método para uma, imunoterapia. activa de doenças, caracterizado por se administrarem a um paciente as anticorpos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, por injecção intramuscular ou subcutânea numa gama de dosagem compreendida entre 100 pq e 50’ mq por local de injecção.

2‘Sâ. - Método para a imunoterapia activa ou passiva dos anticorpos anti-idiatípicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, S ou 9, caracterizado por os referidos anticorpos ser 'em empregados oom prucessus de liyaçá •/alente cie qlutaraldeídos.

ou con j ugação correspondente ao depósito do MF11-30.

30â - Anticorpo anti-idiotipo, caracterizado por s encontrar depositado no ATCC, Rockville, MD, sob o n° de acess correspondendo ao depósito do IMelpql»

Ah t. i c or po