PT86383B - Processo de preparacao de um activador de plasminogenio e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

'•Processo de preparação de um activador de plasminogénio e de composições farmacêuticas que os contêm para que

SMITH KLINE-RIT e LEUUEN RESEARCH â DEUELCPy.ENT V.Z.W., pretendem obter privilégio de invenção em Portugal.

I

RESUMO presente invento refere-se ao processo de preparação de novos activadores de plasminogénio que compreendem a fusão de uroquinase com activador de plasminogénio de tecido e de composições farmacêuticas que os contêm.

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Ref: SKR CASE 12081

-2MEMORIA descritiva

Campo da invenção presente invento refere-se ao processo de preparação de activadores de plasminogénio e a vectores de expressão contendo moléculas de ADN recombinante que compreendem as suas sequências de codificação.

Antecedentes da invenção

A fibrinólise é o processo pelo qual os depósitos intra e extravasculares de fibrina são removidos, apôs a activação de um sistema fibrinolítico específico. Consiste em dois factos principais, i.e., a formação da plasmina e a degradação da fibrina. Na primeira etapa, um precursor inactivo, o plasmino génio, é convertido numa enzima proteolítica, a plasmina, pelos assim designados activadores de plasminogénio. Num segundo passo, a plasmina degrada a cadeia de fibrina insolúvel e lisa deste modo o coágulo. Conhecem-se activadores de plasminogénio de várias proveniências. Entre estes, os predominantes são a estreptoquinase, de origem bacteriana, e a uroquinase (UK) e o activador de plasminogénio de tecido (tPA) ambos de origem humana.

Estudos bioquímicos efectuados com a uroquinase mostraram a existência de três formas da enzima. Uma das formas tem um peso molecular (ir) de ca. 54 00G dalton e é designada por UK de alto Mr (HMW-UK); consiste em duas cadeias A e B,ligadas por dissulfureto, de 18 000 e 33 000 dalton, respectivamente. A cadeia B contém o centro activo da uroquinase e é altamente homóloga com outras proteases do soro. Uma segunda forma molecular da uroquinase, Mr 33 000 dalton, é derivada da HMW-UK por clivagem proteolítica entre os aminoácidos 135 e 136 da cadeia A (UK de baixo Mr; LMW-UK) como é evidenciado pela sequência de aminoácidos conhecida. Ambas as HMW e LMW-UK são bons activadores de plasminogénio, usados em terapia. A sua utilização como agente trombolítico é porém dificultada pela activação sistémica do plasminogénio observada, que pode

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-3ocorrer durante a infusão de UK, aumentando deste modo o risco de hemorragia.

Recentemente demonstrou-se a existência de uma forma pre cursora de uma cadeia da uroquinase. Pela exposição controlada à plasmina, este precursor ê actiuado para a HMW-UK de duas ca deias. Tal como a plasmina enzimaticamente activa, ligada à fibrina, está parcialmente protegida da inactivação pelos inibidores da plasmina, tais como a antiplasmina-alfa₂> a conversão da pro-uroquinase na molécula de duas cadeias pode estar limitada à superfície do coágulo de sangue. Deste modo, a activação de plasminogénio estaria grandemente restringida ao ambiente que rodeia as imediações do coágulo de fibrina, pela HMW-UK gerada in situ. Em relação a isto, o uso terapêutico do precursor de HMW-UK podia evitar os efeitos secundários observados com a enzima activa. De facto, a trombólise com o precursor de UK pode ser conseguida sob condições de activação sistémica muito limitada, em contraste com a trombólise obtida com a UK.

Contudo, observou-se recentemente que a pro-uroquinase é ela própria um activador de plasminogénio potente. A terceira forma da UK é assim um activador de plasminogénio do tipo uroquinase, de cadeia simples (scu-PA). A activação sistémica li mitada que se observa durante a trombólise induzida pelo scu-PA, não seria assim causada pela conversão, associada à fibri na, do scu-PA em HMW-UK, mas pela activação directa de plasminogénio pelo scu-PA, na superfície de fibrina. De facto, devi, do à presença de um competidor plasmático, o scu-PA é incapaz de activar o plasminogénio na fase plasmática. Contudo, desde que a fibrina esteja presente, a inibição é contrabalançada e forma-se a plasmina.

activador de plasminogénio de tecido é imunologicamente distinto da uroquinase. E composto por uma única cadeia de polipeptídeo (70 000 dalton) que é convertida, por clivagem proteolítica, numa molécula de duas cadeias, com actividade comparável. A cadeia leve de tPA, derivada do terminal COCH do tPA de cadeia única, contém a centro activo e é altamente

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-4homóloga com outras proteases de soro (Pennica et al. Paturé 301; 214 (1983)); a cadeia pesada derivada do terminal do tPA de cadeia única, tem características estruturais similares às de outras proteínas, na coagulação e no sistema fibrinolít_i co. A cadeia pesada contém, por exemplo, estruturas kringle similares às encontradas na protrombina, no plasminogénio e na uroquinase; possui também um domínio do tipo factor de cresci, mento e outro domínio, similar às estruturas de fibronectina do tipo dedo, que se liga à fibrina.

A comparação entre o HMW-UK e o tPA revela semelhanças importantes. As cadeias B de ambas as moléculas, que comportam os centros activos, são altamente homólogas e muito semelhantes a outros centros activos de proteases de soro. Por ou, tro lado, o terminal NH₉ de ambas as proteínas é diferente. A molécula de tPA contém dois domínios kringle enquanto que a uroquinase tem apenas um. Adicionalmente, o tPA compreende uma função de ligação à fibrina, que está ausente na uroquinase.

Sumário da invenção presente invento baseia-se na verificação de que se p£ de fundir um polipeptídeo derivado da cadeia pesada do tPA (ca deia A) com um polipeptídeo da cadeia pesada da UK (cadeia 8), para produzir um activador de plasminogénio quimérico ou híbri. do. Desta forma, podem preparar-se novos activadores de plasminogénio, que podem ter propriedades imunológicas ou biológicas diferentes das do tPA e das da UK, Estes novos activadores de plasminogénio preferidos combinam a função de ligaçãc da fibrina ao tPA com a função protease da uroquinase.

Os activadores de plasminogénio seleccionados do grupo consistindo de Fg. tPA/UK410, Fg. tPA/UK410/366, tPPUK410/366 e UK-K2410/366 são concretizaçães preferidas do presente invejo to.

Breve descrição das figuras

A figura 1 representa as moléculas de ADN recombinantes

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-5de invenção mostrando sequências derivadas da UK e sequências derivadas do tPA.

A figura 2 é uma representação actualizada do vector va_i vém eucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al. DNA, _4, 461-467, 1955).

Descrição detalhada da invenção

Usando as moléculas de ADN recombinante da invenção, podem produzir-se activadores de plasminogénio mutantes e quiméri. cos, em células eucarióticas, ou noutros hospedeiros, p.e., em bactérias e em leveduras, e que mostram actividade biológica. As moléculas naturais de uroquinase e de tPA têm a sequência de codificação e a sequência de aminoácidos que se mostram nas

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Tabelas la e lb seguintes. E de notar que a sequência de Oacobs et al. difere da apresentada por outros, p.e. por Gunzler et al., Hoppe Seyler^ Z. Physiol. Chem. 363:1155 (1982) Heyneker, EP-A-92, 182, e Steffens et al. (cite), pelo facto de terem Trp em 131 em vez de Cys, Cys em 366 em vez de Gly e Vai em 410 em vez de Ala.

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Tabela la

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570 500 300 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1050 10701000 (MGAATTCTACCOACTATCTCTATCCQaAOCAOCTOAAAATXUCTOTniTgAAOCTOATTTCCCACCaOOAOTOTCAOCAOCCCXUICTACTACaaCTCTOAAOTCACCACCAAAATOCTa BBBTDYLYPBgbKHTYVKI.XBHRBCggPHYYOBBVTTKMI* 310 320 330340

1030 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1150 1170 1100 11301200 τατο»7ΐ3θταλα»ιβΛα7οαΑΑΑΑβΑαΑΤ7ΐχτοοβΑα<ΜΑαΑοτοΑοαα<χ>Αοαχτα<ττβτ<πτ(χοτ6θΛΑΤ<κχ»ΚΜταΑετττθΑθταολΑττατοΑασηΜ<3αοαηοαΑτατ OAAOPgnxTDBcgaosaapi₍vcsi.gcBi<TX.To i v e w a 1 □ a 350 350 370300

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-80s activadores de plasminogénio mutantes e quiméricos, tal como são aqui utilizados, têm sequências de ADN e sequências de aminoácidos diferentes das de moléculas naturais de uroquinase e de tPA. A sequência de codificação de um activador de plasminogénio, mutante ou quimérico, difere das sequências de codificação da UK e do tPA naturais, tal como se mostra na figura 1. As moléculas de ADN recombinante da .invenção são pois estas sequências de codificação, mutantes ou quiméricas, quer isoladas quer contidas numa molécula de ADN maior tal como, por exemplo, num vector de clonação ou de expressão. As moléculas recombinantes da invenção são preparadas por técn_i cas sintéticas convencionais ou de engenharia genética, ou por uma combinação de ambas, tal como aqui depois se explica.

As sequências de codificação da invenção,compreendidas nas moléculas de ADN recombinantes da invenção, combinam, quer uma ou várias sequências derivadas das moléculas de ADN da UK ou do tPA, quer uma ou mais substituições, adições ou delecções de um ou mais codões, em regiões definidas das moléculas de UK e de tPA. Os activadores de plasminogénio mutantes ou quiméri cos em moléculas de ADN recombinante exemplares da invenção, cuja construção e utilização são aqui exemplificadas, estão ilustrados na figura 1, bem como as moléculas naturais de UK e de tPA para comparação, apresentadas nas Tabelas la e 1b. Na Tabela 2 que se segue apresentam-se a expressão e a actividade biológica de activadores de plasminogénio, mutantes ou quiméri. cos, expressas em células eucarióticas por moléculas de ADN ve combinante da invenção. Todos os vectores de expressão plasmí dicos apresentados utilizam o promotor inicial SV40 e o centro de poliadenilação da hormona de crescimento bovina.

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LEGENDA: níveis de expressão: +*+ = 45-90 ng/ml ++ = 21-45 ng/ml + = 3-18 ng/ml

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Ref: SKR CASE 12081

-10Nos exemplos que se seguem descrevem-se as construções de plasmídeos. Os dados representativos de expressão e de acti vidade biológica apresentados foram obtidos por técnicas conve_n cionais (Drapier 3.C., Tenu 3.P., Lemaire G. e Petit 3F Bioche mie 61, 463-471, 1979). A figura 1 eaTabela 2 mostram também a designação dada ao produto de cada vector.

As sequências de codificação para as moléculas naturais de UK e de tPA, para as quais se pode usar como material de partida, para a realização da invenção, quaisquer polimorfos naturais, podem ser obtidas por técnicas convencionais tais c_o mo as utilizadas por Jacobs et al. (1985) para a uroquinase e por °ennica et al. (1983) para o tPA. Ver também, por exemplo, para o tPA: Opdenakker et al., Eur. 3. Biochem. 121:269 (1982); Edlund et al., Proc. Natl. Açad. Sei. USA 30:349 (1983); Goeddel et al., EP-A-93 619; Levinson et al., EP-A-117 059, Goldberg et al., PCT W085-03949; Keyhack et al., EP-A-143 081; e para a UK: Heyneker et al., EP-A-92 182; Hiramatsu et al., EP-A-154 272 ; Kovacevic et al., GB 2133797.

As moléculas de ADN recombinante aqui apresentadas são apenas ilustrativas. Podem efectuao-se combinações alternativas ou adicionais de fragmentos de ADN, ou substituições de pa, res de bases ou delecção de codães, por técnicas bem conhecidas no campo da genética molecular. 0 efeito destas combinações, substituições e delecções, na expressão em células eucarióticas pode ser facilmente determinado por um imuno-ensaio de absorção, ligado a uma enzima (ELISA), envolvendo anticorpos monoclonais tal como é descrito, por exemplo, por Herion et al. (1983). A actividade das proteínas resultantes pode ser facilmente testada em ensaios bem conhecidos, tais como, por exemplo, o ensaio de actividade amidolítica directa com o substrato cromogénico S2444 (Kabi Vitrum, Estocolmo, Suécia) ou por um ensaio no qual se detecta a conversão catalisada, do plasminogénio em plasmina, pelo substrato cromogénico S2251 (Kabi Vitrum, Estocolmo, Suécia) (Drapier et al., 1979).

Podem efectuar-se mutações nas moléculas do activador de plasminogénio por técnicas bem conhecidas. Para uma revisão de algumas destas úteis técnicas, ver Botstein et al.

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-11Science (19B5). Estas incluem, por exemplo, a delecção de codões por tratamento da sequência de codificação com uma end_o nuclease de restrição, facultativamente seguida por um tratamento com uma exonuclease, p.e., Bal31 ou nuclease de mung bean (feijão tipo soja). Após esta delecção podem inserir-se sequências sintéticas para substituir, em todo ou em parte, a região delectada.

A sequência de codificação do activador de plasminogénio é tipicamente clonada numa célula bacteriana, p.e., numa

E. coli, para propagação. Apés a clonação, funde-se a sequência de codificação com uma região reguladora que funciona num hospedeiro seleccionado para preparar uma unidade de expressão genética. Este hospedeiro pode ser qualquer microrganismo ou célula para o qual esteja disponível um sistema de clonação e expressão. Estas incluem, p.e. bactérias, tais como E, coli, Bacillus e Streptomyces; leveduras, tais como Saccharomyces e Pichia; e células de mamífero, tais como células CHO, R1610, NIH3T3 e COS.

As regiões reguladoras úteis compreendem geralmente sequências necessárias ou desejáveis para ligação da ARN polimerase e iniciação da transcrição no ribossoma. No caso das células de bactérias ou de leveduras é algumas vezes vantajoso incluir, a jusante da sequência de codificação, um terminador de transcrição para estabilizar a expressão.

Os hospedeiros preferidos para expressão das moléculas de ADN recombinante da invenção são células de mamífero. Nestas células, a região reguladora pode ser a que é normalmente utilizada na construção de vectores de expressão de células de mamíferos, ou uma região que desempenhe funções similares. Ejs ta região compreende tipicamente, a montante da sequência de codificação do activador de plasminogénio recombinante, uma r£ gião promotora, isto é, uma região que funciona na ligação da ARN polimerase e na iniciação da transcrição do ARN. Os promo tores que são normalmente usados em vectores de expressão de células de mamíferos, e que deste modo são úteis no presente invento, incluem o promotor metalotioneína, especialmente o

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Ref: SKR CASE 12081

-12promotor metalotioneína de macaco, de ratinho e humano; promo tores virais tais como o promotor inicial de Simian Virus 40 (SV40) ou o promotor final de SV40: LTR’s virais, tais como o LTR do vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV), o LTR de vírus linfotréficos de células T humanas (HTLV) I, II ou III, ou LTR do vírus do sarcoma de Rous. Estes promotores podem ser derivados de genes ou de células, nas quais estejam naturalmejn te presentes. Estes promotores podem também ser modificados para alterar a sua sequência.

A jusante da sequência de codificação do activador de plasminogénio recombinante existe, tipicamente, uma região de poliadenilação (poli A), isto é, uma região que funciona na p.o liadenilação dos transcritos de ARN. Esta região poli A desem penha aparentemente um papel na estabilização da transcrição. Regiões de poliadenilação que são normalmente utilizadas em vectores de expressão de células de mamíferos, e que deste modo são úteis no presente invento, incluem as regiões de poliadenilação da região inicial do Sl/40, da hormona de crescimento bovina e do colagénio pro-alfa£ (I) humano. Estas regiões podem ser derivadas de genes nos quais estão naturalmente presentes. Estas regiões podem também ser modificadas para alterar a sua sequência, desde que as funções de poliadenilação e de estabilização do transcrito não sejam significativa s adve_r samente afectadas.

Na unidade de expressão genética ou noutro local qualquer da molécula de ADN compreendendo a unidade de expressão ge.néti ca, podem estar compreendidas outras funções reguladoras, inclui indo centros de função, activadores e melhoradores da transcri ção.

Uma célula de mamífero é transfectada com a unidade de expressão genética do activador de plasminogénio recombinante, por qualquer técnica que permita a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira, sem afectar significativa e adversameri te o ADN estranho ou a célula hospedeira. Estas técnicas inclu em a precipitação por fosfato de cálcio, a electroporação, a

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Ref: SKR CASE 12081

-13fusão de protoplasto, a microinjecção e a transfecção virai.

A unidade de expressão genética do activador de plasminogénio da invenção é preferivelmente incorporada numa molécula de ADN maior antes da transfecção. Esta molécula de ADN maior compreende preferivelmente, pelo menos um marcador de selecção genética em adição às funções do activador de plasminogénio r£ combinante. 0 marcador de selecção pode ser qualquer gene, ou genes, que origine uma modificação fenotípica facilmente detectável, numa célula hospedeira transfectada. Esta mudança fenotípica pode ser, por exemplo, uma formação de foci que poI de ocorrer quando se utiliza o vector do vírus do papiloma bovino (VPB), resistência a drogas, tal como os genes de resistência à neomicina, G418 ou higromicina B; ou outros marcadores seleccionáveis tais como xantina-guanina-fosforribosilo transferase (xgprt), timidinoquinase (TK) e galactoquinase (galk). Pode utilizar-se um marcador de selecção que forneça funções de amplificação para aumentar o número de cópias, quer por uma maior eficiência de transfecção, quer por uma melhor replicação intracelular, do marcador e da unidade de expressão genética. Estes marcadores que também servem para amplificar o número de cópias genéticas incluem genes para a di-hidrofola toredutase (resistência ao metotrexato), a CAD (resistência ao L-aspartato de N-(fosfonoacetilo) e a adenosinodesaminase (resistência a 2-desoxicorfomicina).

A molécula de ADN maior, compreendendo a unidade de expressão genética do activador de plasminogénio recombinante, pode ser um plasmídeo, que pode ou não ser capaz de conservação epissómica deo que é capaz de conservação rá, adicionalmente à unidade função de conservação, isto é, cação do ADN numa célula HAK, cromossómica mitótica. Estas

Este plasmí compreendedo tPA, uma numa célula de mamífero transfectada. epissómica estável genética de expressão uma região que provoque a repliindependentemente da replicação funções de manutenção são tipica mente de origem virai, incluindo, por exemplo, vírus animais tais como o vírus do papiloma bovino (VBP), o Vírus Simian 4-0 (SV40), vírus BK (SKV), adenovírus, Vírus de Epstein Sarr (E3V),

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Ref: SKR CASE 12081

-14vírus polioma e vírus do herpes simplex (VHS). Estas funções de conservação podem ser facilmente preparadas e testadas para determinar a conservação epissómica estável numa célula de mamífero. 0 número de cópias do plasmídeo, e deste modo de gene do activador de plasminogénio recombinante, está tipicamente compreendido na gama de 1-1000.

Os plasmídeos,nos quais se pode incorporar uma unidade de expressão genética do activador de plasminogénio recombinante podem ser conseguidos em muitas fontes, ou podem ser construídos por técnicas bem conhecidas na arte da expressão genética, em hospedeiros mamíferos, por técnicas de ADN recombinante. Entre estas fontes estão os depósitos públicos inclu indo o American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,

E.U.A., que inclui no seu catálogo, vários plasmídeos úteis.

A unidade de expressão genética pode ser co-transfectada com outras funções de ADN, tais como um gene para uma função de amplificação, tal como anteriormente se descreve. Esta outra função de ADN pode estar ligada, directa ou indirectamente, à unidade de expressão genética do activador de plasminogénio recombinante ou pode estar não ligada, isto é, numa molécula diferente. l/êr, por exemplo, Αχοί, Patente dos E.U.A., n2.

399 216.

Após a transfecção, cultiva-se a célula que transporta a unidade de expressão genética num meio nutriente sob condições tais que produzam quantidades recuperáveis de activador de pias, minogénio recombinante. Pode utilizar-se um meio de cultura de células de mamífera, convencional. As culturas de células são mantidas à pressão ambiente, a uma temperatura de 30 a 4590, preferivelmente a uma temperatura de 35 a 4290 e muito preferi, velmente a 37QC.

Um protocolo padrão inclui a transformação com ADN de plasmídeo, compreendendo uma unidade de expressão genética do activador de plasminogénio recombinante, pela técnica da precjL pitação com cálcio, seguida, após cerca de 4-6 horas de incuba ção, por um tratamento de choque com glicerol. A transformação resulta tipicamente numa célula hospedeira contendo de cer

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Ref: SKR CASE 12081

-15ca de 1 a 20 cópias da unidade de expressão genética do tPA.

Podem usar-se técnicas de amplificação para aumentar esse núme ro de cópias até cerca de 1000. Cerca de 24 horas após a incu bação, colocam-se as células num meio selectivo e cultiuam-se por um período de cerca de 2 a 3 semanas. As colónias scbrevi. uentes são colocadas em placas de microtitulação com 24 depósi. tos e incubadas até à confluência, i.e., durante cerca de 1/2 a 1 semana. Os depósitos são então testados para determinar a produção de activador de plasminogénio recombinante. As colónias mais produtoras são então expandidas por incubações suces. sivas, cada uma de cerca de 1 semana, em balões T25, balões T75, garrafas rotativas e finalmente, em unidades de produção. Nas unidades de produção pode-se fazer circular o meio condicio nado, ou pode retirar-se e substituir-se periodicamente, por forma a que o activador de plasminogénio possa ser colhido co_n tínua ou periodicamente. As unidades de produção são, preferi velmente, qualquer sistema de cultura concebido para células aderentes, unidades de cultura de células que utilizam fibras, micro-transportadores ou microcápsulas e fábricas de células.

Após a cultura das células, isola-se o activador de pias, minogénio recombinante, a partir do meio condicionado, por técnicas convencionais de isolamento de proteínas. Estas envolvem tipicamente uma série de procedimentos cromatográficos, incluindo por exemplo, procedimentos cromatográficos de permuta iónica, de fase inversa e de afinidade. Após a purificação o activador de plasminogénio é formulado na forma de uma compo, sição farmacêutica tal que cada unidade de dosagem compreenda uma quantidade não tóxica de activador de plasminogénio, isto é, isenta de efeitos secundários adversos significativos, e que seja eficaz em provocar a trombólise após administração a um animal, particularmente o Homem. Esta composição farmacêutica para tratamento do enfarte do miocárdio está tipicamente numa forma adequada para injecção ou infusão intravenosa, e compreende de 0,1 a 10 mg de activador de plasminogénio por ml num diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Um tratamento típico para uma pessoa adulta sofrendo de um enfarte agudo do miocárdio, compreende a infusão intravenosa de 8067 032

Ref: SKR CASE 12081

-16-150 mg do activador de plasminogénio por um período de 0,25-6 horas. Os diluentes e transportadores adequados são bem conhe eidos para um químico farmacêutico, bem como o são as técnicas para preparação da composição farmacêutica.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitativos do presente invento. Todas as enzimas foram conseguidas comercialmente e utilizadas substancialmente de acordo com as instruçães dos vendedores. Os adaptadores foram preparados por síntese de ADN e apresentam-se na Tabela 3 seguinte.

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Ref: SKR CASE 12081

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Isolou-se o gene da uroquinase a partir do clone de ADN-c· pULBIOOO, descrito por Oacobs et al. (1985).

gsne foi obtido de um fragmento Bgll-Bgll (1440 pb) englobando a molécula ds ADN-C da UK, desde o aa-16 na sequência de sinal até ao codão de paragem, a extensão poli C e as sequências pBR322 com 124 pb. Tratou-se este fragmento com ADN-polimerase T4 (Maniatis et al. (1982)) e ligou-se o seu terminal 5' a um adaptador de ADN sintético de cadeia dupla, HindlII-BglI (local terminado com rombo) de 21 pb (adaptador 1, Tabela 3) para reconstruir a sequência correspondente ao codão de iniciação ATG e ao peptídeo de sinal da uroquinase até ac aa-16.

Ligou-se então a molécula reconstruída codificando a pré-pró-uroquinase, ppUK (Maniatis et al. (1982)) ao plasmídeo de E» noli» intermediário, pULB1221 (Oacobs et al. (1984)), cortado com HindIII e Bali. 0 plasmídeo recombinante resultari te foi ainda manipulado, primeiro para remover as sequências 3' de pBR322 em excesso, e depois para substituir o codão de Val410 presente no pULBIOOO ou no pULB1135 (Oacobs et al. (1985)) por um codão especificando a alanina. Esta substituição foi efectuada atendendo ao facto de a sequência de aminoácidos descrita por Gunzler et al. (1982), Steffens et al. (1982) e Heyneker et al., EPA-92 182 conter uma alanina na posição 410.

Esta operação foi efectuada eliminando, do plasmídeo, um fragmento BamHI-SacI com 211 pb, englobando a sequência de codificação da uroquinase, desde o aa398 até ao codão de para gem e as sequências pBR322. Este fragmento foi substituído por um adaptador de ADN, sintética, de cadeia dupla, BamHI-SacI, com 48 pb (adaptador 2, Tabela 3) que codifica desde o aminoácido 398 até ao codão de paragem que está imediatamente a mojn tante do centro 5acl. Introduziu-se o plasmídeo recombinante que deriva desta construção, c pb'LB9117, por transformação em células de E. coli competentes (Maniatis et al. (1982). Cultivou-se um dos transformantes em meio rico contendo ampicili67 032

Ref: SKR CASE 12031

-21na (f.aniatis et al. (1982por forma a amplificar o plasmídeo recombinante. Excisou-se a cassette HjndllI-3acI de 1309 pb, de codificação do ppUK41C (fig. 1, ppUK410) do plasmídeo pULB9117, por digestão com enzimas apropriadas, qus foram inse. ridas por ligação no vector vaivém sucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al. DNA, 4, 461-467, 1385). Ver fig. 2.

plasmídeo híbrido resultante, o pULB9122, foi introduzido em células de E. coli competentes e amplificado. Usou-se então para transfectar células eucarióticas R161C de hamster e Cosi. As condiçcSes forsm as seguintes: adicionaram-se 20 JH de ADN plasmídico pUL39122 puro, purificado duas vezes por cen trifugação de gradientesde CsCl, a discos F3L· cm com aproxima damente 2 x 10 células em meio essencial mínimo de Dulbecco, modificado (DfO') suplementado 5/a com soro fetal de vitela, via o procedimento de co-precipitação com fosfate de cálcio descrito por Wigler et al. (1979) e por Pfarr et al. (1985). Após 4 horas de incubação as células foram sujeitas a um trata, mento de choque com 10/3 de glicerol em DMEM durante 4 minutos. Após 3-5 dias, recolheu-se o sobrsnadante das células para determinar o nível de produção e a actividade biológica do produ, tc codificado pele pULB9122. Este teste foi efectuado medindo a quantidade de ppUK410 no meio por uma técnica de ELISA, usan do anticorpos mor.cclonais (AAU2 e AAU6) criados contra a uroquinase (Herion et al. (1983)) e medindo o potencial de activa. ção de plasminogénio pelo ppL'K410 no meio, usando um substrato cromogénico (S 2251) (Drapier et al., 1979). Na Tabela 2 apre sentam-se os resultados obtidos.

Subsequentemente introduziu-se na sequência de ADN de codificação do ppUK410, o promotor Sl/40 de flanqueamento e a poli A BGH, na forma de uma cassette de expressão Sall, num outro vector eucariótico derivado do 1/ΘΡ. Este vector de expressão estável derivado do VBP contém um único centra Sall e o gene DHFR do ADN~c do ratinho, àparte das sequências vaivém em ^E· coli. Usou-se o plasmídeo recombinante (Kini l/BP-DHFR-ppUK410) para transformar células HAK pela técnica de copreci. pitação com fosfato de cálcio, tal como anteriormente se descreve. Obtiveram-se colónias individuais, 11-14 dias mais tar

032

Ref: SKR CASE 12081 —Zz— de, por selecção directa destas células transfechadas em meio contendo níveis elevados de metotrexato. Estas colónias fGram subsequentemente isoladas no dia 16-18 em cilindres de clonação, adicionalmente propagadas, expandidas e testadas, para de. terminar a actividade de UK pelo teste directo com S2444 e a presença de antigénio UK relacionado foi seguida por ELISA, tal como se descreve.

EXEMPLO 2 - pULB9120

Inseriu-se uma sequência de codificação de ADN-c, que ti nha sido preparada por transcrição inversa de ARN-m de células HeLa (Schleuning et al., Sixth Int’l. Conf. Fibrinolysis, Lausanne, Suiça, 22-23 de Julho de 1982), em estrutura num DSP1.1BGH entre o promotor de proteína inicial do SV40 e um centro de poliadenilação BGH (Woychik et al., Biochem. 81; :3944 (1984)); Goodwin et al», EP-A-173 552) para preparar uma unidade de expressão genética do tPA. A unidade de expres. são genética do tPA foi ligada, em ambas as extremidades, por um centro de clivagem de endonuclease de restrição SalI, no plasmídeo DSP1.1TPA25BGH.

Obteve-se do clone de tPA, um fragmento de ADN com 409 pb, por digestão com as enzimas HindiII e Rsal. Este fragmento inclui as sequências correspondentes ao tripleto de iniciação ATG, a sequência de sinal, o módulo designado por dedo e parte do módulo EGF, assim designado (até ao aa67) da molécula de tPA (Pennica et al., 1983).

Por outro lado, obteve-se um fragmento de ADN com 1219 pb a partir do ADN-c da uroquinase, clone pULB1135 (Jacobs et al., 1985), por digestão com as enzimas Bali e Sall. Este fragmento inclui a molécula do ADN-c, desde o aal45, na parte proteolítica da uroquinase, até ao codão de paragem, e inclui sequências pBR322 3'.

Preparou-se um adaptador de ADN sintético de cadeia dupla com 43 pb contenda os terminais Rsal e BalI, codificando os aminoácidos 67 do tPA e de 136 a 149 da pró-uroquinase (adapta dor 3, Tabela 3), por técnicas de síntese química bem conhecidas na arte. Ligaram-se então os três fragmentos anteriormente

032

Ref: SKR CASE 12081

-2 3descritos, entre si e ao vector de ADM de E. coli intermediário (pULB1221, Jacobs et al., 1984·) previamente cortado com HindIII e 3all. 0 plasmídeo recombinante resultante, introduzido em células de E, coli, competentes, MM294 e amplificado, foi ainda manipulada para remover sequências p8R322 3' estranhas. Esta operação foi efectuada como se descreve no exemplo 1. A molécula recombinante final, o pULB9115, foi usada para transformar células de E. coli competentes, e amplificada. Excisou-se a cassette Hindi II~SacI com 1247 pb, de codificação do Fg,tPA/llK410 (Figura 1), do plasmídeo pULB9115 por digestão com as enzimas apropriadas, e inseriu-se por ligação no vector de vaivém eucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1935). 0 plasmídeo recombinante resultante, o pULB9120, foi amplificado e usado então para transfectar células eucarióticas R1610 de hamster, tal como se mostra no exemplo 1. Efectuaram-se outras manipulaçães, tal como se descreve nc exemple 1, para tes. tar a produção de Fg.tPA/UK410 e para medir a actividade bicló gica. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2. Efectuou-se como no exemplo 1, a introdução subsequente da sequência de ADN de codificação do Fg.tPA/UK410 no outro vector de expressão eucariótica de VBP, para obter uma linhagem de cé. lulas permanente para expressão da molécula híbrida Fg.tPA/ /UK410. Mas aqui seleccionaram-se agora colónias resistentes ao G418 (400 y<g/ml de Geneticin Gibco) dependendo do tipo de vector UBP utilizado. 0 subsequente isolamento, propagação, expansão e teste, para determinar a actividade biológica, e a expressão relacionada com o antigénio UK, foram efectuadas como no exemplo 1. Os testes de produção e de actividade biológica, no meio de crescimento, das células transfectadas com este plasmídeo recombinante, foram efectuados de acordo com o procedimento do exemplo 1. Ha Tabela 2 apresentam-se os resultados obtidos.

EXEMPLO 3 - pULB9129

Esta construção é um plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação da pré-pró-uroquinase, modificada por forma a que o centro de activação natural (Arg 156 Phel57 βΊ 032

Ref: SKR CASE 12081

-24Lysl58) seja alterado (Thrl56 Phel57 Thrl58) de modo a evitar a activação proteolítica da molécula neste local.

Partindo do plasmídeo pULB9117 (ver exemplo 1) recuperou, -se, após digestão com as enzimas apropriadas, um fragmento de ADN BalI-BamHl com 3175 pb. Este fragmento contém no seu terminal 3’, o sinal de iniciação ATG, a sequência de codificação desde o aal9 até ao aal49 da pré-pró-uroquinase e, no seu terminal 5’, a sequência de codificação desde o aa39B até ao sinal de paragem, estando estas regiões separadas pelas sequências do pULB1221 presentes no plasmídeo. Por outro lado, obte ve-se, a partir do pULB9117, um fragmento de ADN EcoRI-XholI com 292 pb; este codifica desde o aal63 até ao aa260 da pré-pró-uroquinase. Preparou-se, também a partir do p‘dLB9117, um terceiro fragmento necessário para a construção; é uma peça XholI-BamHI com 414 pb que codifica desde o aa260 até ao aa398 da molécula de pré-pró-uroquinase.

Finalmente preparou-se, por técnicas de síntese química bem conhecidas, um adaptador de ADN sintético BalI-EccRI com 41 pb, de cadeia dupla, codificando desde o aal49 até ao aal63, incluindo as duas substituições de aminoácidos anteriormente referidas (adaptador 4, Tabela 3). Ligaram-se então os quatro fragmentos anteriormente referidos e introduziu-se o plasmídeo recombinante resultante, o pUL59128, em células de E, coli, competentes, MM294. Após amplificação de um dos transformantes e purificação do plasmídeo pULB9128, recuperou-se a cassette HindiII-SacI de codificação do produto Scupa no 410 (fig. 1), na forma de um fragmento com 1309 pb, por digestão com enzimas apropriadas e introduziu-se por ligação no vector de vaivém eucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1985). 0 plasmídeo recombinante resultante, o pULB9129, foi usado para trans formar células de E, coli, competentes e amplificado.

Foi então introduzido em células R1610 e CosI como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se, como nos exemplos 1 e 2, os níveis de expressão e de capacidade de activação de plasminogénio, do produto segregado.

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Ref: SKR CASE 12081

-25EXEMPLO 4 - pULB9134

Esta construção é um plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação da pré-pró-uroquinase, modificada para substituir o codão da Cys366, presente no p(JL310C0 e no pULB1135, por um codão especificando glicina. Esta substituição foi efectuada atendendo ao facto de a sequência de aminoácidos da UK referida por Guntzler et al. (1982) e por Steffens et al. (1982) conter uma glicina na posição 366.

Partindo do pULB9117 (ver exemplo 1) produziu-se um fragmento de ADN HindiII-BamHl, com 2661 pb, por digestão com as enzimas apropriadas. Este fragmento contém de 5' a 3’, a sequência desde o aa393 ao codão de paragem do ADN da uroquina se e sequências derivadas do pULB1221. Por outro lado, excisou-se também do pUL99117 (exemplo 1), um fragmento de ADN HindiII-AyalI, com 1140 pb, codificando o sinal de iniciação ATG, o peptídeo de sinal e desde o aal ao aa358 da molécula de uroquinase. Preparou-se um terceiro fragmento de ADN natural, necessário para a construção, por digestão do pULB9117 com as enzimas Fnu4Hj e BamHl. E uma porção de ADN com 95 pb de comprimento codificando os aa367 a aa398 da uroquinase. Finalmente, sintetizou-se quimicamente, por técnicas bem conhecidas na arte, um fragmento de ADN sintético AvalI-Fnu4Hl com 26 pb de comprimento, de cadeia dupla, codificando desde o aa358 ao aa366, incluindo a ánica substituição de aminoácidos anteriormente referida (adaptador 5, Tabela 3).

Ligaram-se então os quatro fragmentos anteriozmente descritos, e introduziu-se o plasmídeo recombinante resultante, o pULB9119, em células de E. coli, competentes, FF294, para ser amplificado. Apés purificação do plJLB9119, recuperou-se a cassette HindiII-SacI de codificação do ppUK410/366 (fig. 1) na forma de um fragmento com 1309 pb, e introduziu-se, por ligação, num vector vaivém eucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1985). 0 plasmídeo recombinante, o pULS9134, foi usado para transformar células competentes de E, coli s amplificado.

Introduziu-se então, finalmente, o plasmídeo pULB9134 em células R1610 e Cosi como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os

6Ί 032

Ref: SKR CASE 12081

-26níveis de expressão e de capacidade de activação de plasminogénio do produto segregado, tal como se descreve nos exemplos 1 e 2.

EXEMPLO 5 - pULB9135 plasmídeo recombinante, o pULB9135, á idêntico ao pULB9129 (exemplo 3) com a diferença de se ter substituído o codão da cisteína 366 por um codão da glicina. 0 procedimento usado para construir o plasmídeo recombinante pLÍLB9135 í idêntico ao descrito no exemplo 0 ADN recombinante aqui construído codifica a pré-pró-urcquinase não clivâvel no seu centro de activação natural (scupa nc 410/366) e fci amplificado num plasmídeo de E. coli intermediário (pULS9131) como se descreve nos exemplos anteriores (Fig. 1).

Excisou-se então una cessette HindiII-SacI do 1309 pb a partir do pULB9131 s introduziu-se no DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1985). 0 plasmídeo recombinante pL'LB9135 foi então introduzico ^na Ls. £2ÃÍ ^e amplificado.

Foi finalmente usado para transfectar células R1610 e Cosi como nos exemplos 1 e 2 (Tabela 2). Testaram-ss os níveis de expressão e a capacidade para activação de plasminogé. nio do produto segregado como se descreve nos exemplos 1 e 2. A subsequente introdução da sequência de ADN de codificação do Scupa nc 410/366 no outro vector de expressão eucarióticc V8P para obtenção de uma linhagem de células permanente para expressão do Scupa nc 410/366, foi efectuada como no exemplo 1. A selecção, isolamento de colónias, propagação e teste subsequentes para determinação da actividade biológica e expressão relacionada com o anticénic UK foram efectuadas como no exemplo 1.

EXEMPLO 6 - pL'LB9124 plasmídeo recombinante, o pULB9124, è idêntico ao pULB9120 (ver o exemplo 3) com a diferença ds se ter substituí do o codão correspondente ao aa366 da pré-pró-uroquinase por um codão da glicina, por forma a ter-se uma sequência de acordo com a sequência de amincácidos previamente publicada por

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Ref: SKR CASE 12DS1

-27Guntzler et al. (1982) e Steffens st al. (1982). 0 procedimen.

to para construir este plasmídeo consistiu em ligar um fragme_n to HindiII-Ball, purificado, com 452 pb do pULB9115 (ver o exemplo 2) codificando as rsgiães desde o codão de iniciação ATG até ao aa67 do tPA e desde o aal36 até ao 149 da pré-pré-uroquinase, com um fragmento HindiΠ-Ball de 6975 pb do pULS9134 (ver o exemplo 4), englobando □ fragmento HindiII-SacI grande do DSP1.1BGH, onde todas as cassettes HindiII-SacI da invenção estão inseridas para serem expressas, e a sequência de codificação desde o aa!49 até ao codão de paragem da pré-pró-uroquinase.

Intrcduziu-se então o plasmídeo pULB9124 em células R1610 como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade de activaçãc de plasminogénio do produto segregado, o Fg.tPA/UK41C/366, t al como se descreve nos exemplos 1 e 2 (figura 1, Tabela 2).

EXEMPLO 7 - pULB9125

Esta construção é um plasmídeo recombinante codificando uma molécula híbrida constituída pela parte do tPA (sequêri cia de sinal e aal até ao aa313) e a parte COOH da uroquinase (do aal95 até ao sinal de paragem). Obtém-se por ligação dos 6 fragmentos seguintes:

- uma peça de ADN HindiII-SacI, com 6180 pb, derivada do vector plasmídico DSP1.1BGH. Contém todas as sequências neces sárias para exprimir o ADM recombinante em células eucariéticas,

- um fragmento de ADM HindiII-EcoRI, com 822 pb, excisado do DSP1.1.TPA25BGH. Contém as sequências de codificação do sinal de iniciação, do peptídeo de sinal e do aal ao aa204 da molécula de tPA,

- um fragmento de ADN EcoRl-AluI, com 326 pb, purificado do DSP1.1.TPA25BGH e codificando desde o aa205 ao aa313 da mo lécula de tPA,

- um adaptador de ADft! sintético de cadeia dupla, com 12

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Ref: SKR CASE 12081

-29pb, codificando desde o aal95 até ao aal99 da uroquinase (adaptador 6, Tabela 3) que é rombo no seu terminal 5’ e tem um fim coesivo Bcll do lado 3',

- um fragmento de ADN Bcll-Taql, com 248 pb purificado, do pULB9117 (ver o exemplo 1) e codificando desde o aa!99 até ao aa282 da molécula de pré-pró-urcquinase,

- uma peça de ADN Tagl-SacI, com 397 pb, derivada do pULB9117 (ver o exemplo 1) e codificando desde o aa282 até ao codão de paragem da pré-pró-uroquinase.

Neste exemplo particular,a cassette de codificação para a nova molécula, aqui designada por tPKUK410 (fig. 1), é constituída como um fragmento com 1805 pb, entre os centros HindiII e Saci únicos no vector de expressão DSP1.13GH (Pfarr et al. 1985). 0 plasmídeo recombinante, pULB9125, foi então introduzido em células de E. coli, competentes, MM294, e amplificado.

Introduziu-se então o plasmídeo pULB9125 em células R1610 e CosI como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade para activação de plasminogénio, dc pr£ duto segregado tal como se descreve nos exemplos 1 e 2 (Tabela 2).

EXEMPLO 8 - pUL99137

A construção aqui descrita consiste num plasmídeo recombinante de codificação de uma molécula híbrida, onde a sequência de aminoácidos correspondente ao Kringle” 2 do tPA está inserida entre o domínio Kringle e a porção protease da pré-pró-uroquinase. A construção aqui depois descrita, foi obtida por subclonação de vários fragmentos de ADN em vectores plasmídicos de E. coli, intermediários. Por razães práticas, usaram-se o pBRD158 (Davison et al. (1984)) s o p8RD134 (Heusterspreute et al. (1985)) ainda que estes não sejam vecto res intermediários obrigatórios para se obter esta construção. Primeiro, excisou-se um fragmento de ADN Ncol-Fnu4Hl, com 164 pb, codificando desde o aa66 ao aa!21 da pré-pró-uroquinase, do pULB9119 (exemplo 4) e preparou-se um fragmento de ADN sin.......-íB»

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Ref: SKR CASE 12081

-29tético Fnu4Hl-SalI com 40 pb, de cadeia dupla (adaptador 7, Tabela 3) por técnicas bem conhecidas na arte. 0 adaptador 7 ccdifica em linha, desde o aal21 ao aal30 da uroquinase e des. de o aal73 ao aal75 do tPA, sendo esta sequência imediatamente seguida por urn centro Sall adicional. Ligaram-se então os dois fragmentos anteriormente descritos a uma SalI-Ncol, com 2916 pb, derivado do vector de coli pJPRD184 (Heusterspreute et al. (1985)). combinante intermediário resultante, o pBAl, em células de E. coli, competentes, FH294, e segundo lugar,

Pstl-Rsal, com 258 pb, derivando do DSP1.1.TPA25BGH et al., Sixth -23 ãulho, 1982), de tPA. Adicionalmente preparou-se um tico Rsal-Ball, 55 pb, de cadeia dupla 0 adaptador 8 codifica em linha, desde e desde o aal39 ao aal49 da uroquinase fragmentos a uma porção de ADN Ball-Pstl, do do vector de clonação da E, coli, (1984)).

porção de ADN clonação de E.

plasmídeo refoi introduzido amplificado. Em recuperou-se por digestão um fragmento de ADM (Schleuning Suíça, 22da molécula A DL' sintéTabela 3).

Int'l. Conf. Fibrinolysis, Lausanne, codificado desde o aal69 ao aa255 fragmento de (adaptador 3, o aa255 ao aa262 do tPA Ligaram-se as dois com 3436 pb, o pJRD158 (Davison derivaet al.

plasmídeo intermediário recombinante resultante, p3A2, foi então introduzido em células de E. coli, FM294 petentes, e amplificado. Finalmente, obteve-se a partir pBAl, um fragmento de ADN Ncol-Ddel, com 198 pb, codificando desde o aa66 ao aalJO da uroquinase s desde o aal73 ao aa!74 do tPA. Adicionalmente, excisou-se do pBA2, um fragmento de ADN Ddel-Ball, com 297 pb, codificando desde o aal74 ao aa255 do tPA e desde o aal39 ao aal49 da uroquinase. Ligaram-se estes dois fragmentos a um fragmento de ADN Ncol-Ball, com 3673 pb, derivado do pULB9119 (exemplo 4). Este último fragmento de ADN contém no seu terminal 3’, as sequências para o sinal de iniciação ATG, para o peptídeo de sinal e para os aal a aa66 da pré-pró-uroquinase. No seu terminal 5' codifica desde o aal49 ao sinal de paragem da pré-pré-uroquinase. As sequências que separam estas duas regiães 3’ e 5' são originárias do pULB1221.

comdo

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Ref: SKR CASE 12081

-300 plasmídeo intermediário recombinante (pUL39136) resultante da ligação dos Fragmentos anteriormente referidos foi in troduzido em células de E. coli, competentes, MM294, e amplifi cado. Foi então usado para se obter, por digestão com as enzi. mas apropriadas, uma cassette de codificação HindiII-SacI, com 1555 pb, (figura 1) correspondente ao produto aqui designa do por UK-K2 410/366. Esta cassette foi introduzida por ligação ao vector de expressão eucariótica de vaivém, DSP1.13GH (Pfarr et al., 1985) e o plasmídeo recombinante resultante, o pULB9137 foi amplificado antes de ser usado para transfectar células eucariéticas.

Introduziu-se então o plasmídeo pULB9137 em células R1610 e CosI como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade de activação de plasminogénio do produto segregado, tal como se descreve nos exemplos 1 e 2.

EXEMPLO 9 - pULB9151

Esta construção é um plasmídeo recombinante de codificação de um activador de plasminogénio híbrido, compreendendo um segmento terminal do tPA até ao aa262, combinado com a par, te terminal COOH da uroquinase, desde o aal39 até ao último aa da molécula. Difere do p'JLB9125 (exemplo 7) pelas dimensões relativas dos fragmentos do tPA e da uroquinase reunidas no plasmídeo.

A construção envolve três fragmentos de ADN. Um primeiro fragmento de ADN EcoRI-BalI, com 2C6 pb, foi excisado do pULB9136 (exemplo 8); constitui a sequência que reúne o Kringle 2 do tPA com a porção protease da uroquinase. Um se gundo fragmento de ADN HindiII-EcoRI, com 822 pb, codificando o sinal ATG, a sequência de sinal e desde o aal ao aa204 do tPA, foi obtido por digestão do plasmídeo de ADN DSP1.1.TPA25BGH com as enzimas apropriadas. 0 último fragmento foi obtido na forma de uma porção HindIII-BalI por digestão do pULB9134 (exem pio 4). Este fragmento contém a sequência de codificação desde o aa!49 até ao sinal de paragem da uroquinase e todas as sje quências do vector eucariótico DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1985)

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Ref: SKR CASE 12081

-31desde o seu único centro HindiII ao seu único centro Saci.

Ligaram-se os três fragmentos anteriormente descritos por forma a obter-se o plasmídeo recombinante resultante, o pULB9151, que contém na forma de uma cassette de codificação HindiII-SacI, a informação genética para o produto aqui designado por tPPUK410/366 (figura 1). 0 plasmídeo pUL39151 foi introduzido em células de £« coli, competentes, MM294, e amplificado antes da sua utilização para transfectar células eucarióticas de Hamster R1610.

Introduziu-se então o plasmídeo pULB9151 em células R1610 e CosI como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade de activação de plasminogénic., do produto segregado tal como se descreve nos exemplos 1 e 2 (Tabela 2).

EXENPLO 10 - pULB9139

A molécula recombinante que aqui a seguir se descreve é um activador de plasminogénio mutanto, duplo; combina os efci tos da substituição de um aminoácido com a eliminação de vários aminoácidos. 0 plasmídeo recombinante contém a sequência de codificação da pré-pró-uroquinass com as modificações seguintes :

a) o aminoácido Trpl31 foi substituído por um resíduo cisteína. Esta operação foi efoctuada atendendo ao facto de a molécula de uroquinase descrita por Guntzler et al. (1982) e por Steffens et al. (1982) conter uma cisteína na posição 131,

b) eliminou-se da molécula a sequência de aminoácidos que se expande desde o resíduo 132 até ao resíduo 147 e subst_i tuiu-se por um dipeptídeo Ser-Thr como é o caso da molécula de tPA.

A construção envolve a ligação de três fragmentos de A2N. Um primeiro foi excisado do pUL39119 (exemplo 4) na forma de um fragmento de ADi\i Ball-Ncol, com 3673 pb. Contém no seu ter. minai 3', o sinal de iniciação ATG, a sequência ds sinal e os codões para o aal ao aa66 da pré-pró-uroquinase. Ag sequências de codificação do aal49 até ao codão de paragem estão loca67 032

Ref: SKR CASE 12081

-32lizadas no terminal 5' do fragmento.

Ambos os terminais 3' e 5' estão separados por sequências derivadas do pULB1221. C segundo fragmente de ADE foi obtido a partir do pULS9119 (exemplo 4) na forma de um fragmer; to de ADN i\lcoI-Fnu4Η1 com 164 pb. Cooifica desde o aa66 até ao aal21 da pré-pró-uroquinase. 0 terceiro é um adaptador de ADN sintético Fnu4Hl-BalI, con 43 pb, de cadeia dupla (adaptador 9, Tabela 3) obtido por métodos químiccs bom conhecidos. Ligaram-se os três fragmentos anteriormente descritos e o pias, mídeo intermediário recombinante, resultante pULB9133 foi introduzido em células de E. coli, competentes, MM294 para ser amplificado. A cassette de codificação HindiII-SacI, com 1267 pb, foi excisada do pL'LE’9138 por digestão com as enzimas apropriadas; codifica o produto aqui designado por ppUK(41C/ /366/131)del (figura 1). Introduziu-ss a cassette no vector de vaivém eucariótico DSP1.13GH (Pfarr et al,, 1985) e c plasmídeo recombinante resultante, o pULB9139, foi amplificado antes de ser usado para transfectar células eucariéticas de Hamster R1610.

Introduziu-se então o plasmídeo pULB9139 em células R1610 e Cosi como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade de activação de plasminogénio do produto segregado tal como se descreve nos exemplos 1 e 2 (Tabela 2).

EXEMPLO 11 - pUL59152

Este exemplo descreve a construção de um plasmídeo recom binante, o pULB9152, contendo as sequências de codificação de uma pré-pró-uroquinase não activável (os aa!56 e 158 são Thr em vez de Arg e Lys, ver c Exemplo 3) e não degradávsl (delectou-se a região desde o aa!32 até ao aal47 e substituiu-se por um dipeptídeo Ser-Thr, ver Exemplo 10). Esta construção foi efec. tuada por ligação de um fragmento HindiII-Ball, com 472 pb, ex. cisado do pULB9138 (Exemplo 1C) codificando a região desde o codão de iniciação ATG até ao aal35 do scupa nc (410/366/131)del, com um HindIII-Ball de 6975 pb purificado, obtido a partir do

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Ref: SKR CASE 12081 pULB9135 (Exempla 5), englobando o fragmente grande HindiII-SacI do DSP1.1BGH (Pfarr et al., 1985) onde todas as cassettes HindiII-SacI da invenção estão inseridas para se exprimirem e a sequência de codificação desde c aal49 ao codõo de paragem do scupa nc 410/366 (figura 1).

Introduziu-se então c plasmídeo pULB9152 em E. coli, amplificou-se e usou-se finalmente para transfectar células R161C e Cosi como nos exemplos 1 e 2. Testaram-se os níveis de expressão e a capacidade de activação, de plasminogério, do produto segregado tal como se descreve nos exemplos I e 2 (Tabela 2).

A descrição anterior e os exemplos descrevem exaustivamente a invenção e as suas concretizações preferidas. 0 presente invento não é limitado às construções especificamente descritas mas engloba todas as modificações abrangidas pelas reivindicações.

Claims (6)

1 - Vector de expressão caracterizado por conter um activador de plasminogénio seleccionado do grupe consistindo de Fg.tPA/UK410, Fg. tPA/UK410/366, tPPUK41C/366 e UK-K2 410/ /366.

2 - Vector de expressão caracterizado por conter uma molécula de ADN recombinante que compreende uma sequência de codificação para um activador de plasminogénio seleccionado de um grupo consistindo de Fg.tPA/UK410, Fg.tPA/UK410/366 ou tPPUK410/366 e UK-K2 410/366.

3 - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por ser um vector de expressão de mamífero e no qual a sequência de codificação do activador de plasminogénio está fundida em cadeia com uma região reguladora.

4 - Célula de mamífero transformada caracterizada por compreender a molécula de ADN recombinante da reivindicação 3.

5 - Processo de preparação de um activador de plasminogénio caracterizado por se cultivarem as células de mamífero transformadas da reivindicação 4 e em seguida se isolar o acti vador de plasminogénio desse modo produzido.

6 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se associar o activador de plasminogénio da reivindicação 1 a um transportador farmaceuticamente aceitá vel de forma a obter uma composição com 0,1 a 10 mg de ingredi, ente activo por ml da composição.

Lisboa,

16. 12 1987

FIG. 1

Legenda: □

SequênciaSffl^Sequênciaspwi Adaptadores de de ppUK β de t-PA ADN sintético

RIM tl| PIPMHII MIKL II Η·Η1 II BlIMI t| OIM· tl (IKMII HFnuíMI HIRKM ΙΙΙΙΚΜΜ l| >ISM II UIM I

ATO «Ter •ULI lBli -LC- II MM» Mltli ΚΙΜΠ 00(14·» ΛΤβ iw IIL» 1138 “LCZ Ί Π I “ OPUK oõun •dl 14) 0(114 0 01(1744) NP J L.l BGH TP»29^ ΙΒΒΛβίΙ 1-OA Mil» 011074) pULB »122 Yaw -- MMR410 Hd) ot(ii> •‘«Λαη» >UL» »134 OOUK 410/444 Hd» Mtat) A d 144) 0(1441) 0(1144) 0(144» pULB 9129 l%! sctvonc·)· Hd) jiat) 41(114) K(M4) II1MII 0(1M» OcuHnc 410/444 pULB 9139 V/YA Hd) H<11) •Hl 14) K(OH) A(1140) 0(1141) 0(1144) SdM» Of«t«FA/UK 410 pULB 912» Ef Ytâ Md) 11(40» 0) <4M) 0<114t) 0(114?) pULB 9124 —πι Ol.t-FAAHC 410/444 Hd) 4(441) 01 (40C) AC 107» 0(11441 0(1104) 0(1147) pULI »137 w. υκ·κι 410/444 Hd) 00(11) 0(410) *(700) 0(44» 01(740) A( 1004) 0(1007) 0(141» 0(1040) pULB 9129 H 1 IOKUK 410 Hd) pULB 9191 m 10FUK 410/444 M(n A(1004) 0(177» 0(1440) 0(10*1)

pULB »139 VÁ'A —B 88» Md) HOD 0Π47Χ) AdOM) Odll» 0((114) 0(1147)

pULB 9192 WÁ'À W YM Hd) 00(11) 0U47S) A (1040) 0(111» 1(014) FdlK) 1(1*47)

MHH KLINE-RIT e LEUVEN RESEARCH & PEVELOPIVIENT V.Z.W λ/2

DSP1.1BGH (Eco RU .(Eco RA) .(Bom Hl) USoll) (Hlnd3) Xbol ^J (Hind3) βρ| i .(Eco RI) éSffi21 \(Clo1) (Soll)

Locais de inserção para as sequências de codificação

Cassete de transcrição klnd III ^χ _β|Τ·^? mensageminicial¹