PT832207E

PT832207E - Metodo para identificacao de peptidos e acidos nucleicos biologicamente activos

Info

Publication number: PT832207E
Application number: PT96916019T
Authority: PT
Inventors: Martin Roland Jensen; Finn Skou Pedersen; Soeren Mouritsen; Peter Hindersson; Mogens Duch; Michael Schandorf Soerensen; Iben Dalum; Anders Henrik Lund
Original assignee: M & E Biotech A S
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 2001-03-30
Also published as: JPH11505724A; DE69610310T2; WO1996038553A1; EP1041143A3; GR3035017T3; CA2222879A1; EP1041143A2; EP0832207A1; KR19990022157A; EP0832207B1; DE69610310D1; ATE196312T1; AU5893396A; DK0832207T3; ES2151167T3; AU699568B2

Description

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DESCRICÃO "Método para identificação de péptidos e ácidos nucleicos biologicamente activos" O presente invento refere-se a um novo método para identificação de novos péptidos e péptidos modificados após tradução bem como ácidos nucleicos com actividade biológica.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Durante os últimos cinco anos a tecnologia para expressão, teste e identificação de milhões de sequências peptídicas aleatórias diferentes evoluiu drasticamente. Tais bibliotecas peptídicas podem ser utilizadas para identificação de novos péptidos biologicamente activos e, portanto, a tecnologia acrescentou ao campo do desenvolvimento de fármacos um nova época excitante e muito promissora.

As técnicas de bibliotecas peptídicas conhecidas podem actualmente ser divididas em dois grupos fundamentalmente diferentes: as bibliotecas peptídicas sintéticas aleatórias, nas quais os péptidos aleatórios são produzidos quimicamente, e a bibliotecas peptídicas biossintéticas aleatórias, nas quais os péptidos aleatórios são codificados por sequências de ADN parcial ou totalmente aleatórias e subsequentemente sintetizados por ribossomas.

As bibliotecas peptídicas sintéticas.

As bibliotecas peptídicas sintéticas contendo milhões de péptidos podem ser produzidas através de química combinatória de péptidos e podem ser sintetizadas na forma solúvel (R.A. Houghten et a!., Nature, 354: 84-86, 1991) ou permanecerem imobilizadas nas contas de resina peptídicas (A. Furka et ai., int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493, 1991; K. S. Lam et ai., Nature, 354: 82-84, 1991). Utilizando qualquer uma destas abordagens foram isolados ligandos de receptores diferentes. A vantagem das bibliotecas peptídicas solúveis em comparação com as bibliotecas peptídicas imobilizadas em fase sólida é a de que os péptidos 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 2

solúveis se podem ligar de forma estereoquimicamente mais desimpedida aos receptores em questão. Na técnica de bibliotecas peptídicas sintéticas proposta por Furka et ai. 1991 e Lam et ai. 1991, respectivamente, o melhoramento mais importante foi, por outro lado, a abordagem de ter apenas um tipo de sequência peptídica em cada conta ("Uma conta - um péptido"). Isto permite uma selecção directa e eventualmente a sequenciação do ligando peptídico putativo activo numa única conta utilizando p. ex. degradação de Edman. Utilizando esta tecnologia podem ser identificados péptidos activos incluindo péptidos que consistam em D-aminoácidos ou outros aminoácidos não naturais (B. Gissel et a!., J. Peptide Science. No prelo, 1995).

As bibliotecas peptídicas biossintéticas.

Foram construídos vectores bacteriófagos de expressão que podem apresentar péptidos à superfície do fago (S.E. Cwirla et ai., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 87: 6378-6382, 1990). Cada péptido é codificado por uma região aleatoriamente mutada do genoma do fago, de forma que a sequenciação da região de ADN relevante do bacteriófago que se verificou ligar-se a um receptor revelará a sequência de aminoácidos do ligando peptídico. Um fago contendo um ligando peptídico é detectado através de procedimentos de prospecção ("panning") repetidos que enriquecem a população de fagos num fago de ligação a receptores fortes (J. K. Scott, TiBS, 17: 241-245, 1992).

Também foram utilizadas bactérias para expressão de bibliotecas peptídicas semelhantes. Os péptidos podem ser fundidos com uma proteína exportada, tal como um anticorpo, que pode ser imobilizada num suporte sólido. Através da pesquisa do suporte sólido com um receptor solúvel apropriado o clone bacteriano que produz o ligando peptídico putativo pode ser identificado (M.G. Cull et ai., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 89: 1865-1869, 1992).

Outro método descrito para preparação de grandes bancos de diferentes compostos possivelmente activos é através da utilização de bibliotecas constituídas por ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos aleatórios, as chamadas bibliotecas de aptâmeros. Os aptâmeros são gerados em E. co/i a partir de um vector plasmídico contendo ADN aleatório. A partir destas bibliotecas foram identificadas estruturas com actividade biológica (L.C. Bock et ai., Nature, 355: 564-566, 1992). 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 3

OBJECTIVO DO INVENTO

De forma a utilizar os métodos da arte anterior para identificação de péptidos e ácidos nucieicos biologicamente activos ou das suas respectivas proteínas alvo celulares, é necessário possuir um conhecimento detalhado acerca dos mecanismos moleculares envolvidos num determinado processo biológico. Se estes mecanismos forem conhecidos, pode subsequentemente ser possível desenvolver antagonistas ou agonistas de alvos (receptores, enzimas, etc.) envolvidos utilizando os referidos métodos. O problema a ser resolvido pelo presente invento é i.a. superar a necessidade de tal conhecimento detalhado.

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento as sequências peptídicas ou os ácidos ribonucleicos são identificados a partir de bibliotecas eucarióticas expressas biossinteticamente contendo milhões de péptidos e ácidos ribonucleicos parcial ou totalmente aleatórios. Em relação a este invento o termo "péptido" deve ser entendido como compreendendo também uma sequência peptídica introduzida em, ou fundida com, uma proteína maior (p. ex. um anticorpo). Os péptidos e ácidos ribonucleicos são sintetizados pelas células a partir de sequências de ADN aleatórias que foram transduzidas eficazmente nas células. Alguns dos péptidos ou ácidos ribonucleicos na biblioteca afectarão funções biológicas importantes nas células que os expressam. As células que mudam de fenótipo devido à presença de tais substâncias podem ser isoladas e a sua estrutura química pode ser subsequentemente clarificada através de sequenciação do ADN que os codifica. Tais péptidos podem possivelmente ser utilizados terapeuticamente ou como compostos indiciadores para futuro desenvolvimento de fármacos ou podem ser utilizados para identificação de novas proteínas alvo que estejam a causar a mudança na função biológica da célula. Tais proteínas alvo podem eventualmente ser utilizadas no desenvolvimento de fármacos através p. ex. de química medicinal convencional ou de bibliotecas peptídicas sintéticas.

De forma concordante, o método do invento compreende um método para identificação de ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos ou para isolamento de ligandos celulares para os ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos, o qual compreende os passos de:

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 4 (a) produção de um banco de vectores apropriados contendo cada um uma sequência de ADN a ser examinada, (b) transdução eficiente dos referidos vectores em várias células eucarióticas idênticas de tal forma que cada célula expresse um único ácido ribonucleico e possivelmente um péptido codificado pela sequência de ADN a ser examinada ou um número limitado de diferentes ácidos ribonucleicos e péptidos codificados pelas sequências de ADN a serem examinadas, (c) pesquisa das referidas células transduzidas para ver se algumas delas alteraram uma determinada característica fenotípica; e (d) selecção e clonagem das referidas células alteradas, caracterizado por o banco de vectores apropriados no passo (a) conter sequências de ADN total ou parcialmente aleatórias seleccionadas a partir do grupo que consiste em: i) sequências de ADN aleatórias sintéticas obteníveis através de síntese convencional aleatória de oligonucleótidos; ii) sequências de ADN aleatórias sintéticas em que os codões de terminação estão ausentes e as quais codificam sequências de aminoácidos aleatórias com uma distribuição equilibrada de aminoácidos; iii) sequências de ADN sintéticas definidas em (i) ou (ii) incluindo codões que permitem modificações após tradução específicas de todos os péptidos expressos ou que codificam resíduos âncora; iv) sequências de ADN sintéticas definidas em (i), (ii) ou (iii) fundidas com, ou tendo nelas inseridas, sequências de codificação para marcadores de purificação que facilitam a purificação e identificação dos péptidos expressos; e v) sequências de ADN sintéticas definidas em (i), (ii), (iii) ou (iv) inseridas em, ou fundidas com, a sequência de codificação de uma proteína;

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ e em que (e) o ADN vector nas células fenotipicamente alteradas é isolado e sequenciado, e as sequências dos ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos são deduzidas a partir do ADN vector sequenciado; e/ou (f) os ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos expressos nas células fenotipicamente alteradas são utilizados directamente para isolamento de uma molécula de ligando para os referidos ácidos ribonucleicos ou péptidos.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Figura 1 é um desenho esquemático de um vector de expressão de um péptido retroviral padrão. A forma plasmídica do vector (em cima) possui um promotor de citomegalovírus (CMV) que dirige a expressão de um ARN retroviral (ao centro) com uma estrutura (R, U5, PBS, ψ, PPT, U3 e R) do vírus da leucemia de murídeo Akv e uma cassete de tradução peptídica seguida por um local de entrada ribossómico interno (IRES) do vírus EMC que dirige a tradução de um gene de resistência à Neomicina (Neo). O provírus vector na célula alvo (em baixo) contém uma repetição terminal longa retroviral regenerada - LTR (U3, R, e U5). A sequência do promotor de CMV proporciona um marcador único para uma mutagénese e amplificação por PCR inicial eficiente. 0 tamanho do vector sem uma cassete de expressão peptídica inserida é de 4,0 kb.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Um requisito intrínseco de todas as técnicas de bibliotecas peptídicas actualmente conhecidas é a necessidade de um conhecimento detalhado acerca dos mecanismos através dos quais um dado receptor ou enzima regula uma determinada característica fenotípica da célula. Este receptor ou enzima tem para além disso de estar disponível numa forma relativamente pura antes que um ligando possa ser seleccionado em qualquer um dos dois tipos de bibliotecas peptídicas. Quando potenciais ligandos peptídicos são eventuaimente identificados, têm de ser efectuados ensaios funcionais para se determinar se os 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 6

ligandos exercem efeitos antagonistas ou agonistas na característica fenotípica celular desejada. O método de acordo com o presente invento supera este grande problema. Através do presente método não é assim necessário conhecer a cadeia de mecanismos, receptores, vias de sinalização, enzimas, etc. que geram o fenómeno dentro ou à superfície da célula uma vez que é o efeito biológico ou característica fenotípica resultante que se pesquisa. Isto é alcançado através dos seguintes passos: (a) produção de um banco de vectores apropriados contendo cada um sequências de ADN total ou parcialmente aleatórias, (b) transdução eficiente dos referidos vectores em várias células eucarióticas idênticas, p. ex. de mamífero, de tal forma que apenas seja expressa uma única espécie de ácido ribonucleico e péptido ("uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido") ou opcionalmente seja expresso um número limitado de diferentes ácidos ribonucleicos e péptidos aleatórios por cada célula, (c) pesquisa das referidas células transduzidas para ver se algumas destas alteraram uma determinada característica fenotípica, (d) selecção e clonagem das referidas células alteradas, (e) isolamento e sequenciação do ADN vector nas referidas células fenotipicamente alteradas, e (f) dedução das sequências de ARN e peptídicas a partir da sequência de ADN. O ARN ou o péptido codificado pelas sequências de ADN isoladas pode ser a causa das referidas alterações fenotípicas da célula e pode portanto possuir actividade biológica.

Os péptidos introduzidos são expressos p. ex. no citoplasma de células biologicamente interessantes, as quais antes disso eram totalmente idênticas, utilizando p. ex. os sistemas de vectores retrovirais descritos no Exemplo 1. Estes são expressos a partir de um banco de vectores contendo sequências de ADN aleatórias que foram construídas p. ex. tal como descrito no Exemplo 1. Utilizando uma razão apropriada entre retrovírus infecciosos e células não infectadas apenas uma única cópia de ADN derivado do banco de vectores retrovirais é introduzida em cada célula. A principal vantagem deste conceito de "uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido" é a de que as células que sofrem alteração fenotípica após a introdução de péptidos podem ser isoladas através de métodos de clonagem e selecção, e que o péptido activo que causa a alteração fenotípica pode ser subsequentemente identificado. Isto é alcançado isolando o fragmento de ADN que codifica o péptido, p. ex. através de tecnologia de Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR), e subsequentemente

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 7 identificando a sequência de ADN.

Durante o procedimento de pesquisa inicial um maior número de vectores retrovirais pode ser introduzido em cada célula o que permite que cada uma das células expresse vários ácidos ribonucleicos ou péptidos diferentes. Quando um clone de células alteradas fenotipicamente é subsequentemente isolado todos os ADN retrovirais nesse clone específico podem ser isolados por PCR e o produto da PCR pode ser utilizado para nova transfecção de células de empacotamento normalmente utilizadas para produção de vírus. Os vectores retrovirais isolados a partir destas células de empacotamento podem ser subsequentemente utilizados para transdução de novas células biologicamente interessantes utilizando o conceito "uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido". Finalmente, após um segundo procedimento de clonagem a substância activa pode ser identificada tal como descrito acima. Além disso, o ácido ribonucleico, o péptido ou a proteína, biologicamente activos, isolados por este método podem ser utilizados como um composto indiciador para o desenvolvimento de fármacos ou como um ligando de afinidade com o objectivo de isolamento e identificação do alvo proteico responsável pela actividade biológica. Tais proteínas alvo são ferramentas muito úteis no desenvolvimento de fármacos. A utilização de vectores pequenos (abaixo de 3 kb de ADN) tem a principal vantagem de permitir mutagénese e amplificação por PCR simples sem os passos de ligação e clonagem. Outra vantagem importante da utilização de vectores pequenos é a de que os vectores num banco de células alvo podem ser amplificados directamente por PCR e novamente transfectados em células de empacotamento, permitindo deste modo múltiplos ciclos de selecção para eliminar a análise demorada de falsos positivos ou células contaminantes. A análise directa das sequências dos clones plasmídicos aleatórios derivados é utilizada para assegurar a aleatoriedade da biblioteca de expressão. O vector padrão capaz de expressar a biblioteca peptídica aleatória é mostrado esquematicamente na Fig. 1.

As células que se verificou terem-se alterado fenotipicamente após a introdução das sequências de ADN aleatórias podiam alternativamente ter-se alterado como consequência de interacções com a molécula de ácido ribonucleico transcrita a partir do ADN introduzido, em analogia com as bibliotecas descritas que consistem em ribonucleótidos ou 8 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ desoxirribonucleótidos aleatórios, as chamadas bibliotecas de aptâmeros. Tais moléculas de ácido ribonucleótido possuiriam também portanto actividade biológica. Para além disso, o efeito observado podia também dever-se à actividade biológica de porções hidrato de carbono, ou outras modificações pós-tradução, nos péptidos expressos na célula. Utilizando um marcador de purificação adequado nos péptidos da biblioteca, seria possível nesse caso purificá-los e analisar a estrutura química exacta das modificações pós-tradução em questão.

Uma vez que a eficiência dos métodos não virais normalmente utilizados para transferência estável de genes para células de mamífero é muito baixa, não seria possível estabelecer uma biblioteca peptídica de expressão em células de mamífero através de tais métodos. Adicionalmente os métodos não virais conduzem geralmente a integrações múltiplas de ADN no genoma celular em desacordo com o conceito "uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido". Para se alcançar a necessária transferência de alta eficiência de uma única cópia de um gene tem de ser utilizado um vector virai. Muito recentemente foram descritas bibliotecas de expressão de ADNc as quais foram construídas utilizando vectores retrovirais. De tais bibliotecas foram isoladas citóquinas e factores de crescimento celulares (A.J.M. Murphy et a!., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 84: 8277-8281, 1987, B.Y. Wong et ai., J. Viro/., 68: 5523-31, 1994, J.R. Rayner et ai., Moi. Cell BioL, 14: 880-887, 1994). A expressão de péptidos bem definidos em células eucarióticas transfectadas foi também anteriormente estabelecida, embora não utilizando vectores retrovirais (M.S. Malnati et al., Nature, 357: 702-704, 1992, E.O. Long et a!., J. Immunol., 153: 1487-1494, 1994). Nunca foi expressa uma biblioteca de péptidos aleatórios em células de mamífero com o objectivo de identificar péptidos ou ácidos ribonucleicos biologicamente activos. A imunologia é um campo biológico importante onde o método de acordo com o invento pode ser utilizado. As células T reconhecem apenas fragmentos de antigénios proteicos e apenas se estes se encontrarem ligados a moléculas de MHC. Dois tipos de moléculas de MHC - as moléculas de classe I e II -apresentam fragmentos de antigénios às células T. Os péptidos apresentados pelas moléculas de MHC de classe I, as quais estão na superfície de essencialmente todas as células nucleadas, têm 8-9 aminoácidos de comprimento e são geralmente derivados de proteínas do citosol da célula.

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Estes podem ser auto-proteínas, proteínas virais, péptidos introduzidos no citosol por transfecção ou antigénios tumorais. É de considerável interesse ser-se capaz de identificar tais péptidos ou epítopos de células T, p. ex. em relação ao desenvolvimento de vacinas ou em imunoterapia de cancro. A identificação de tais fragmentos é, no entanto, uma tarefa muito difícil, exigente e por vezes impossível que requer grandes quantidades de moléculas de MHC purificadas por afinidade derivadas da célula tumoral em questão e combinações iterativas de espectroscopia de massa avançada, HPLC e ensaios funcionais de células T. Para além disso, a maioria dos antigénios peptídicos não podem ser identificados devido à presença de quantidades muito reduzidas de cada um dos péptidos nas moléculas de MHC. No Exemplo 2 é demonstrado que o método de acordo com o presente invento pode ser utilizado para identificação dos referidos epítopos de células T.

Linhas celulares que expressem moléculas de superfície biologicamente importantes podem também ser transduzidas com uma biblioteca peptídica aleatória de acordo com o invento. Um exemplo de tais moléculas podia ser a molécula co-estimuladora B7, que se sabe ser importante para a activação das células T, ou a família de proteínas da selectina que se sabe estarem envolvidas no encaminhamento de células inflamatórias para tecido inflamado. As células que mudam de fenótipo (p. ex. que regulam positiva ou negativamente B7) podem ser seleccionadas e clonadas tal como descrito no Exemplo 3. Após o isolamento do ADN transduzido por PCR podem ser transduzidas novas células com o ADN isolado para confirmar a observação. Subsequentemente, a sequência peptídica pode ser deduzida a partir da sequência de ADN.

Foi descrito por outros que anticorpos monoclonais específicos ou fragmentos F(ab) podem ser expressos no citoplasma de um célula e aí exercer uma actividade biológica (T.M. Werge et a!., Febs Letters, 274: 193-198, 1990).

De acordo com o presente invento a sequência peptídica total ou parcialmente aleatória pode também ser introduzida na região variável de um fragmento F(ab) de anticorpo. Portanto, uma biblioteca de fragmentos F(ab) contendo sequências peptídicas aleatórias pode ser expressa num clone celular de um modo que cada um de todos expresse uma única especificidade de anticorpo. Subsequentemente, células biologicamente alteradas são isoladas e

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 10 clonadas, e ο fragmento F(ab) intracelular identificado pode ser utilizado para purificação da proteína alvo envolvida nas proteínas biológicas. Tal proteína alvo pode subsequentemente ser utilizada para desenvolvimento de fármacos capazes de modificar as referidas proteínas alvo. O invento é ilustrado através dos seguintes exemplos: EXEMPLO 1

Construção de uma biblioteca peptídica eucariótica intracelular É construído um vector retroviral capaz de expressar sequências peptídicas aleatórias. Se as sequências de ADN aleatórias utilizadas no vector fossem produzidas utilizando síntese aleatória convencional de oligonucleótidos seria inevitavelmente introduzido um grande número de codões de terminação. Para além disso, devido à degenerescência do código genético o resultado seria uma distribuição desequilibrada dos aminoácidos codificados. Evitamos isto através da produção de sequências de ADN aleatórias por síntese aleatória de codões: Uma quantidade apropriada de resina utilizada para síntese de oligonucleótidos em fase sólida (opcionalmente contendo já uma sequência de ADN correspondente a um local apropriado de clonagem do vector) é dividida em 20 porções diferentes. Na porção n° 1 é efectuada uma síntese química em fase sólida convencional de três bases correspondentes a um codão que codifique o aminoácido alanina. Na porção n° 2 é sintetizado um codão codificando cisteína e por aí adiante. Quando cada uma das 20 porções foi acoplada com os codões correspondentes a cada um dos aminoácidos naturais, todas as porções são misturadas e divididas novamente em 20 porções de resina de tamanho igual. A síntese de codões é então novamente repetida e todo o procedimento é repetido até a sequência de ADN aleatória desejada ter sido sintetizada - p. ex. correspondendo a 6-10 aminoácidos aleatórios. Isto pode também ser alcançado utilizando fosforamiditos de trinucleótidos bloqueados e protegidos codificando os 20 aminoácidos naturais numa síntese aleatória total de oligonucleótidos (J. Sondek et ai., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 89: 3581-5, 1992). Finalmente, podem ser sintetizados outros locais apropriados de clonagem do vector em todos os oligonucleótidos antes de estes serem eventualmente clivados da resina.

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 11 Ο banco de oligonucleótidos sintéticos aleatórios pode ser utilizado para gerar um banco de vectores com sequências aleatórias em posições apropriadas ou por clivagem de restrição e ligação ou, de preferência, para evitar passos de ligação ineficientes, por mutagénese por PCR. Os procedimentos seguem os princípios da mutagénese mediada por PCR dirigida ao local (S. Perrin et a!., Nucl. Acids Res. 18: 7433-38, 1990), mas a metodologia foi adaptada para distribuir uma mistura complexa de produtos. Resumidamente, os

oligonucleótidos aleatórios que possuem sequências do vector que flanqueiam a sequência aleatória são utilizados como iniciadores numa reacção PCR juntamente com um único iniciador terminai do vector. Para manter a complexidade são utilizadas grandes quantidades do molde bem como do vector e de iniciadores aleatórios, e a diversidade do produto é ainda assegurada reunindo múltiplas reacções de PCR independentes. Subsequentemente, é produzido um fragmento de PCR sobreponível contendo o restante segmento do vector por PCR padrão. Finalmente, este segmento sobreponível é ligado aos fragmentos de PCR contendo o ADN aleatório utilizando outro conjunto único de iniciadores terminais.

Os fragmentos de ADN produzidos pela enzima ADN-polimerase Taq podem conter nucleótidos adicionais na cadeia 3' do ADN. Estes nucleótidos extra serão deletérios para a combinação de dois produtos de PCR com terminais sobreponíveis num fragmento. Através da adição da enzima ADN-polimerase de Klenow estes nucleótidos podem ser removidos pela actividade de exonuclease 3' -> 5' da referida enzima, aumentando a eficiência de combinação.

Alternativamente o produto de PCR pode ser cortado nos terminais por digestão com enzimas de restrição cujas sequências de reconhecimento foram incorporadas nos oligonucleótidos utilizados como iniciadores para a reacção de PCR. Através da utilização do método de ciclo de temperaturas desenvolvido por (Lund et a!., Nucl. Acids Res., 24: 800-801, 1996) a eficiência da reacção de ligação pode ser aumentada e o produto da ligação utilizado para transfecção directa das células de empacotamento.

Para manter a diversidade, o ADN vector linear gerado por PCR é utilizado directamente para transfecção de células de empacotamento, è os viriões que contêm o banco de diferentes vectores são colhidos sob condições transientes. 12 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ

Pequenos vectores bicistrónicos de um único transcrito contendo uma cassete de tradução dos péptidos aleatórios seguida por um local de entrada ribossómica interno (IRES) do vírus EMC a dirigir a tradução de um gene de resistência à Neomicina (Neo). 0 gene Neo funciona como marcador de selecção para permitir a determinação do título e, se necessário, a eliminação de células não transduzidas. Outros vectores relevantes disponíveis empregam outros genes seleccionáveis tais como a resistência à fleomicina e à higromicina B e têm a cassete de tradução de péptidos após o elemento IRES. Alternativamente, podem também ser utilizados vectores ainda mais pequenos, possuindo apenas a cassete de expressão de péptidos e sem um marcador de selecção. A utilização de vectores pequenos (abaixo de 4 kb de ADN) tem a principal vantagem de permitir uma mutagénese e amplificação por PCR simples sem passos de ligação e clonagem. Outra vantagem importante da utilização de vectores pequenos é a de que os vectores num banco de células alvo podem ser amplificados directamente por PCR e novamente transfectados para células de empacotamento, permitindo deste modo múltiplos ciclos de selecção para eliminar uma análise demorada de falsos positivos ou de células contaminantes. A análise directa das sequências dos clones plasmídicos aleatórios derivados é utilizada para assegurar a aleatoriedade da biblioteca de expressão. 0 vector padrão capaz de expressar a biblioteca peptídica aleatória é mostrado esquematicamente na Fig. 1.

Para manter a diversidade do banco de vectores, uma fracção elevada dos transcritos de ARN do vector tem de ser encapsidada em partículas retrovirais. Através de transfecção das células de empacotamento com uma construção de ADN expressando um ARNt coincidindo com o PBS correspondente no vector retroviral, podemos aumentar em 10 vezes a produção de vector funcional contendo partículas virais sob condições transientes.

Uma nova linha celular de empacotamento será gerada após uma única transfecção de uma construção codificando todas as proteínas retrovirais. Para diminuir o risco de criação de vírus competentes para replicação e para obter uma expressão máxima, o vector terá o seguinte esboço simplificado: promotor-transcrito gag-pol-IRES-gene de resistência à fleomicina-IRES-env-sinal de poliadenilação. Uma vantagem do referido vector é a de que o gene de 13 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ resistência à fleomicina permite uma selecção quanto a elevada expressão e que o tamanho após o corte do transcrito do vector restringe a encapsidação de partículas retrovirais diminuindo assim o risco de criação de vírus competentes para replicação. O limite de tamanho para encapsidação dos transcritos de ARN é de cerca de 10 kb.

Para além da linha celular de empacotamento tradicional será utilizada uma linha celular de semi-empacotamento com um vector miniviral correspondente. A linha celular de semi-empacotamento consiste em vectores que codificam dois transcritos gag-pol mutados que se complementam um ao outro. A utilização de dois transcritos gag-pol diferentes reduz o risco de se criarem vírus de tipo selvagem. Cada célula na linha celular de semi-empacotamento contém agora todas as proteínas retrovirais necessárias para a produção de partículas retrovirais excepto as proteínas do envelope, proteínas essas que são fornecidas pelo vector miniviral. Este vector é um vector bicistrónico com o seguinte esboço: LTR-PBS-sinal de empacotamento-péptido aleatório-IRES-env-tracto de polipurina-LTR. Este vector será capaz de transduzir as células de semi-empacotamento uma vez que estas não produzem proteínas do envelope antes da infecção com o vector miniviral. Assim, a infecção da célula de semi-empacotamento não será restringida pela interferência do receptor.

Podem ser introduzidas restrições sobre a "aleatoriedade" da sequência peptídica, com o objectivo de limitar o número de sequências disponíveis na biblioteca celular de mamífero e para a introdução de p. ex. locais de N-glicosilação, ou outras modificações pós-tradução de todos os péptidos expressos, se assim desejado. Marcadores de purificação - p. ex. poli-His ou outros - podem também ser incluídos nos péptidos expressos para facilitar a purificação e identificação do próprio péptido. Isto é necessário para a identificação de modificações pós-tradução, as quais não são óbvias a partir da sequência peptídica.

Uma população de células eucarióticas é infectada com o retrovírus que possui construções genéticas contendo sequências de ADN aleatórias as quais codificam uma biblioteca de milhões de péptidos aleatórios. Inicialmente pode ser utilizado um número de vírus em excesso em comparação com as células eucarióticas. Isto conduz à expressão de vários péptidos diferentes em cada f

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EP 0 832 207/PT 14 célula eucariótica. Estas células podem subsequentemente ser pesquisadas tal como descrito abaixo e o ADN pode ser isolado p. ex. por PCR e utilizado para reinfecção de outras células. Se for escolhida uma razão apropriada entre o número de retrovírus contendo as sequências de ADN aleatórias e de células, cada célula será transduzida com uma sequência de ADN aleatória diferente ("uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido"). Isto permite eventualmente a identificação de um péptido activo. 0 péptido pode opcionalmente ser direccionado para compartimentos diferentes na célula através da incorporação de sequências de sinal apropriadas nas sequências traduzidas. EXEMPLO 2

Identificação de epítopos de células T através da utilização de bibliotecas de expressão intracelulares de mamífero A linha celular dependente de interleucina 2 (IL-2), CTLL-2, é transfectada com a molécula de classe I de Histocompatibilidade Principal (MHC), Kb, de murídeo. Subsequentemente esta linha celular é infectada com uma biblioteca peptídica de retrovírus que foi descrita no Exemplo 1. Esta biblioteca peptídica de CTLL-2 expressa uma grande variedade de péptidos aleatórios e, se apropriado, são introduzidos na sequência peptídica retroviral resíduos âncora associados a Kb que se sabe serem importantes para a ligação peptídica a Kb, sendo uma grande biblioteca de péptidos ligados a K° apresentada na superfície das células CTLL-2. São gerados hibridomas de células T restringidas com Kb contra um antigénio virai apropriado utilizando tecnologia imunológica celular convencional (Current Protocols in Immunology, Eds. Coligan et al., NIH). Tais hibridomas segregam IL-2 após o reconhecimento do antigénio. Um hibridoma de células T, que reconhece um epítopo virai de células T ligado a Kb desconhecido, é subsequentemente incubado com amostras da biblioteca de CTLL-2 Kb. Se o hibridoma reconhece um péptido, a célula CTLL-2 que apresenta o péptido será estimulada para proliferar pela IL-2 segregada pelo hibridoma. Deste modo a célula CTLL-2 que expressa o epítopo virai de células T desconhecido pode ser seleccionada e clonada. A sequência de ADN que codifica o epítopo peptídico

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 15 em questão pode ser isolada a partir deste clone utilizando tecnologia de PCR seguida por sequenciação de ADN convencional. Isto conduz eventualmente à identificação do epítopo virai de células T desconhecido. EXEMPLO 3

Identificação de péptidos ou ácidos ribonucleicos biologicamente activos que regulam a expressão de proteínas na superfície celular São infectadas células que expressam a molécula membranar imunorreguladora B7 com as bibliotecas peptídicas aleatórias construídas tal como descrito no Exemplo 1. Neste exemplo é introduzida uma biblioteca de péptidos oito-mero aleatórios.

Utilizando anticorpos monoclonais específicos, a expressão de B7 é analisada através de métodos convencionais. As células que regulam positiva ou negativamente B7 podem ser seleccionadas positivamente, p. ex. utilizando Separação Celular Activada por Fluorescência, ou negativamente, p. ex. utilizando anticorpos apropriados em combinação com lise pelo complemento.

As células que mostram mudanças na expressão de B7 são clonadas através de meios convencionais e o ADN introduzido através de vectores retrovirais é isolado utilizando PCR e um conjunto de iniciadores retrovirais específicos. A sequência peptídica ou possivelmente o ARN correspondente ao referido ADN pode ser capaz de modificar a expressão de B7 e assim a activação de células T. Isto pode ser subsequentemente testado em ensaios de células T convencionais. EXEMPLO 4

Identificação de um fragmento F(ab) capaz de modificar a molécula imunorreguladora B7. É produzida uma biblioteca retroviral codificando os fragmentos génicos da cadeia pesada variável (VH) bem como da leve variável (VL) da molécula de imunoglobulina. A região génica de ambos os fragmentos génicos correspondente ao local de ligação ao antigénio dos fragmentos F(ab) 16 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ resultantes contém para além disso sequências génicas parcialmente aleatórias tal como descrito no Exemplo 1. Isto conduzirá a um grande número de sequências peptídicas diversas no local de ligação ao antigénio do fragmento F(ab). A biblioteca de vectores retrovirais codifica portanto um grande número de diferentes fragmentos F(ab) com diferentes especificações de ligação ao antigénio.

Esta biblioteca é subsequentemente transduzida para um clone celular de tal modo que cada célula expresse uma única espécie de fragmento F(ab) p. ex. no citoplasma. As células fenotipicamente alteradas são subsequentemente clonadas e a sequência do péptido no fragmento F(ab) intracelular é identificada tal como descrito no Exemplo 1. Este anticorpo pode ser subsequentemente produzido em grande escala através de meios convencionais e ser utilizado para purificação de afinidade da proteína celular alvo responsável pela alteração biológica do fenótipo celular. Isto pode p. ex. ser feito a partir de lisados produzidos a partir do clone celular original não modificado.

Alternativamente, a biblioteca de F(ab) retroviral pode ser construída utilizando p. ex. um marcador poli-His ou outros marcadores apropriados. Desse modo o anticorpo e o alvo correspondente podem ser isolados directamente a partir da célula fenotipicamente alterada através de cromatografia de afinidade. O alvo isolado pode subsequentemente ser identificado através p. ex. de sequenciação de aminoácidos do terminal N em combinação com metodologia de clonagem convencional. Tais proteínas alvo são alvos de fármacos muito importantes para a identificação de mais fármacos.

Lisboa, 13. DF7 2C-G0

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Claims

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificação de ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos ou para isolamento de ligandos celulares para os ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos, o qual compreende os passos de: (a) produção de um banco de vectores apropriados contendo cada um uma sequência de ADN a ser examinada, (b) transdução eficiente dos referidos vectores em várias células eucarióticas idênticas de tal forma que cada célula expresse um único ácido ribonucleico e possivelmente um péptido codificado pela sequência de ADN a ser examinada ou um número limitado de diferentes ácidos ribonucleicos e péptidos codificados por sequências de ADN a serem examinadas, (c) pesquisa das referidas células transduzidas para ver se algumas delas alteraram uma determinada característica fenotípica; e (d) selecção e clonagem das referidas células, caracterizado por o banco de vectores apropriados no passo (a) conter sequências de ADN total ou parcialmente aleatórias seleccionadas a partir do grupo que consiste em: i) sequências de ADN aleatórias sintéticas obteníveis através de síntese convencional de oligonucleótidos aleatórios; ii) sequências de ADN aleatórias sintéticas em que os codões de terminação estão ausentes e as quais codificam sequências de aminoácidos aleatórias com uma distribuição equilibrada de aminoácidos; iii) sequências de ADN sintéticas definidas em (i) ou (ii) incluindo codões que permitem modificações após tradução específicas de todos os péptidos expressos ou os quais codificam resíduos âncora; iv) sequências de ADN sintéticas definidas em (i), (ii) ou (iii) fundidas a, ou tendo nelas inseridas, sequências de codificação para marcadores de 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 2/6

purificação que facilitam a purificação e identificação dos péptidos expressos; e v) sequências de ADN sintéticas definidas em (i), (ii), (iii) ou (iv) inseridas em, ou fundidas com, a sequência de codificação de uma proteína; e em que (e) o ADN vector nas células fenotipicamente alteradas é isolado e sequenciado, e as sequências dos ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos são deduzidas a partir do ADN vector sequenciado; e/ou (f) os ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos expressos nas células fenotipicamente alteradas são utilizados directamente para isolamento de uma molécula de ligando para os referidos ácidos ribonucleicos ou péptidos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as células eucarióticas idênticas são células de uma linha celular.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o péptido é uma sequência peptídica introduzida em, ou fundida com, uma proteína.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína é um. fragmento F(ab) ou um molécula de anticorpo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, no qual as sequências de ADN/oligonucleótidos sintéticas foram produzidos através de síntese aleatória de codões, onde codões de ADN definidos são sintetizados numa ordem aleatória.
6. Método de acordo com as reivindicações 1-4, no qual as sequências de ADN/oligonucleótidos sintéticas foram produzidas através de síntese aleatória de oligonucleótidos convencional.

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7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, no qual as sequências de ADN aleatórias são introduzidas no vector de expressão através de mutagénese mediada por PCR dirigida ao local assegurando deste modo a complexidade das sequências de ADN total ou parcialmente aleatórias.
8. Método de acordo com a reivindicação 7 no qual o corte com exonuclease 3'-*5' das extremidades 3' do produto de PCR é utilizado para eficiências óptimas de combinação de dois produtos de PCR.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, no qual as sequências de ADN aleatórias são introduzidas nas várias células eucarióticas de tal forma que apenas uma sequência de ADN seja introduzida em cada célula, uma célula expressando um ácido ribonucleico e possivelmente um péptido, permitindo assim que uma determinada sequência seja isolada e analisada.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, no qual as sequências de ADN aleatórias são introduzidas nas células eucarióticas através da utilização de vectores virais apropriados seleccionados de entre vectores retrovirais e vectores do vírus vacinia.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, no qual o vector utilizado é um vector retrovirai.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, no qual o vector utilizado é um vector do vírus vacinia.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual o vector retrovirai contém um promotor de CMV a substituir o promotor virai na LTR 5’.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, no qual as sequências de ADN aleatórias são produzidas como produtos de PCR lineares que são introduzidos directamente em células de empacotamento de vírus através de métodos de transfecção não virai.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-14, no

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 4/6 qual ο ADN virai introduzido nas células é amplificado directamente através de PCR e utilizado para nova transfecção de células de empacotamento para produzir vírus subsequentemente utilizados para transdução de novas células com o objectivo de eliminar falsos positivos e/ou permitir o conceito "uma célula - um ácido ribonucleico ou péptido".
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-15, no qual o título virai das linhas celulares de empacotamento retroviral é aumentado através de transfecção transiente com um gene de ARNt funcional correspondente ao PBS no vector.
17. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-16, no qual é utilizada uma linha celular de empacotamento construída a partir de um vector que expressa um único transcrito- o qual é traduzido nas três poliproteínas/proteínas, gag-pol, um marcador de resistência a um fármaco e env.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-17, no qual é utilizada uma linha celular de semi-empacotamento com um vector miniviral correspondente que permite a expressão do vector após a transdução em vez de após a transfecção das células.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, em que os péptidos expressos são modificados após tradução ou incluem resíduos âncora.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que as modificações pós-tradução compreendem a introdução de locais de glicosilação.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, no qual o péptido biologicamente activo ou a proteína expressa contendo o péptido aleatório contém também um marcador de purificação que permite o isolamento directo da proteína biologicamente activa bem como da proteína alvo que causa a actividade biológica.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, no qual são também codificados péptidos de sinal apropriados, outras moléculas de

85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 5/6 comando ou sequências de reconhecimento, pelo ADN introduzido de tal forma que estes sejam fundidos com os péptidos aleatórios expressos ou com as proteínas expressas contendo as sequências peptídicas aleatórias, permitindo que estes sejam direccionados para compartimentos celulares definidos.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, no qual as sequências de ADN aleatórias são introduzidas em, ou fundidas com, uma sequência de ADN que codifica uma proteína expressa simultaneamente com as sequências de ADN aleatórias a partir dos vectores da biblioteca.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, no qual a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste em proteínas segregadas, proteínas intracelulares e proteínas membranares p. ex. moléculas de transdução de sinal.
25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, no qual a proteína é derivada total ou parcialmente da cadeia pesada e/ou leve de uma molécula de anticorpo.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, o qual é utilizado para a identificação de epítopos de células T.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, o qual é utilizado para a identificação de péptidos biologicamente activos que regulam a expressão de proteínas da superfície celular.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as células eucarióticas idênticas são células de mamífero.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as sequências de ADN aleatórias codificam 6-10 aminoácidos aleatórios.
30. Método de desenvolvimento de fármacos que compreende a identificação de ácidos ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos ou o isolamento de ligandos celulares para estes, de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 1-28.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que os ácidos 85 559 ΕΡ Ο 832 207/ΡΤ 6/6 ribonucleicos ou péptidos biologicamente activos identificados servem como compostos indiciadores. Lisboa, p;-- pr*.nQ Por M&E BIOTECH A/S - O AGENTE OFICIAL -