PT754055E - Metodos e composicoes imunogenicas de polissacarido de estreptococos do grupo a - Google Patents

Description

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DESCR1CA0 "Métodos e composições imunogénicas de polissacárido de estreptococos do Grupo A"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se ao campo de novas composições imunogénicas, processos para as produzir e métodos de imunização de animais de sangue quente, incluindo humanos, contra infecções e doenças causadas por estreptococos do grupo A.

ANTECEDENTES DO INVENTO A doença provocada por estreptococos do grupo A, tal como a taxa de infecções por grupos etários demonstra, é uma doença infantil (1-3). Muito à semelhança de outras doenças nesta categoria tais como meningite meningocócica (4) e meningite por Haemophilus (5), difteria (6) e outras (7, 8), a maioria dos casos ocorrem em crianças pequenas e a taxa de infecções diminui com a idade. Deste modo, aos dezoito anos de idade a incidência de infecções por estreptococos do grupo A é relativamente baixa (1-3). Isto poderia sugerir que alguns tipos de imunidade natural a este grupo de organismos podem ocorrer ao longo do tempo, tal como a encontrada em outras infecções infantis.

Em experiências que se estenderam por várias décadas, Lancefield e colegas (9-11) demonstraram que a grande maioria dos estreptococos hemolíticos que infectam os humanos são do grupo A. Esta distinção baseou-se em reacções serológicas ao hidrato de carbono de estreptococos do grupo A. Estudos posteriores revelaram que o determinante imunodominante era a N-acetilglucosamina (12, 13). Usando testes de protecção e ensaios de precipitina em ratinhos, sub-dividiram-se ainda estes estreptococos do grupo A em serótipos baseados na presença de proteínas M antigenicamente diferentes, existentes na superfície do organismo. Demonstrou-se claramente que os anticorpos orientados para um serótipo M específico são protectores num modelo de infecção em ratinhos (14). Em humanos, a recuperação de uma infecção provocada por estreptococos do grupo A está frequentemente associada a imunidade de longa duração que é específica do tipo, para o organismo infectante (11). Nos dois casos, a protecção é específica do serótipo 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 2

Μ e não se estende à protecção contra outros serótipos. Adicionalmente, demonstrou-se em vários estudos que os soros humanos raramente contêm múltiplos anticorpos específicos do serótipo de proteína M (11, 15). Estas experiências clássicas, tanto em humanos como em animais de experiência, estabeleceram um papel importante da proteína M na virulência de estreptococos do grupo A e constituíram a base de numerosas tentativas infrutíferas de desenvolver vacinas de estreptococos que eliciariam anticorpos protectores, quer em relação à porção do terminal amino da proteína M no qual reside a especificidade serotípica, quer, mais recentemente, em relação às regiões de repetição de C comuns da molécula (16).

No entanto, tendo em consideração a natureza relacionada com a idade de infecções do grupo A que sugere um aumento na imunidade natural a este grupo de bactérias, a questão mantém-se quer este represente um aumento lento nos anticorpos orientados para regiões mais comuns na proteína M, quer outros antigénios de superfície que receberam menos atenção possam desempenhar uma função nesta protecção específica não serotípica naturalmente adquirida. Por exemplo, a cápsula de ácido hialurónico desempenha uma importante função na virulência de infecções do grupo C, em porquinhos da índia (17) e detectaram-se anticorpos anti-hialuronato em animais (18, 34) e humanos (19). Referiu-se o ácido hialurónico de estreptococos do grupo A como sendo imunogénico em coelhos após imunização com estreptococos do grupo A formalizados, encapsulados ou ligados a lipossomas (18). Referiu-se também a utilização de lipossomas em vacinas (31). A injecção das fracções de mucopéptido da parede celular de estreptococos induz uma protecção de curta duração em animais de laboratório (20), mas o seu papel em humanos permanece desconhecido. O hidrato de carbono específico do grupo consiste num esqueleto de poli-ramnose no qual, no caso do grupo A, existe uma N-acetilglucosamina na posição terminai que não é susceptível de redução (Figura 1a). Descreveu-se e caracterizou-se a variante do Grupo A de estreptococos (12, 13). Nestes estreptococos, existe o esqueleto de poli-ramnose mas permanece por ornamentar com N-acetilglucosamina (Figura 1b). Nas primeiras experiências, injectaram-se coelhos com estreptococos do grupo A completos sem proteína M e isto mostrou eliciar anticorpos precipitantes para o hidrato de carbono do grupo A. No entanto, estes anticorpos não eram passivamente protectores

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ contra um desafio por estreptococos do grupo A positivos para a proteína A em estudos de protecção passiva de ratinhos (14). Para além disso, várias tentativas anteriores para demonstrar anticorpos precipitantes semelhantes, em humanos, foram infrutíferas, sugerindo que os anticorpos precipitantes de hidrato de carbono não desempenham um papel significativo na protecção contra infecções provocadas por estreptococos.

No entanto, porque a maioria dos primeiros métodos para detectar um aumento em anticorpos dependiam da capacidade desses anticorpos se tornarem precipitáveis com a adição de antigénio, muitos anticorpos que não eram menos reactivos com um antigénio específico mas que não precipitaram nesses ensaios, ficaram por detectar. Os anticorpos que reagem com a cápsula de ácido hialurónico de estreptococos do grupo A proporcionam um bom exemplo. Em estudos concentrados na eliminação deste problema, uma^série de relatos que se iniciam em 1965 (21, 22) utilizaram técnicas de aglutinação directa e indirecta para detectar anticorpos. A aglutinação directa detectou anticorpos precipitantes enquanto que a aglutinação indirecta mediu anticorpos precipitantes e não precipitantes. Interessante foi a demonstração de Karakawa et a! (22) de que os anticorpos de aglutinação directa, ou seja, os anticorpos precipitantes, nesses soros humanos, eram principalmente orientados contra o hidrato de carbono da variante do grupo A, o esqueleto de poli-ramnose, enquanto que as técnicas de aglutinação indirecta orientadas para os anticorpos não precipitantes detectavam um elevado título de anticorpos para o determinante N-acetilglucosamina.

Estudos posteriores de Zimmerman et a/ (23), utilizando soros humanos de uma variedade de infecções provocadas por estreptococos, indicaram que a incidência destes anticorpos não precipitantes variava desde um mínimo de 30% numa população, que tinha sido cuidadosamente seguida e tratada para infecções por estreptococos, a um máximo de 84% numa população recentemente infectada com estreptococos do grupo A. Também notaram que os títulos de anticorpos para o hidrato de carbono do grupo A apresentavam um pico aos 1 7 anos de idade e que não havia nenhuma diferença nos títulos de anticorpos para este hidrato de carbono em reumáticos com e sem doença cardíaca. Estes resultados diferiam dos apresentados por Dudding e Ayoub, nos quais os anticorpos anti-hidrato de carbono do grupo A eram, de forma

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 4 persistente, elevados em pacientes reumáticos com doença cardíaca em comparação com os pacientes sem danos valvulares (24). A questão de estes anticorpos desempenharem ou não um papel na protecção tem sido difícil de avaliar. O ensaio clássico de opsonofagocitose de Lancefield usou sangue humano completo seleccionado (15, 25, 26) ao qual se adicionaram soros hiperimunes de coelho com anticorpos específicos do serótipo de proteína M conhecidos. A selecção do sangue humano completo baseou-se em dois factos: (1) não continha quaisquer anticorpos reactivos com proteína M e/ou (2) não promovia a fagocitose de estreptococos na ausência do anti-soro de coelho específico do serótipo. A questão de os soros humanos normais poderem per se aumentar a fagocitose nunca foi realmente visada.

Reimer et ai. (Reimer, K. B. et al., Carbohydrate Res.-232 (1992), 131-142) refere-se a trissacáridos sintéticos lineares e ramificados e a pentassacá-ridos ramificados usados como haptenos para representar epítopos diferentes do polissacárido da parede celular de estreptococos do grupo A para caracterizar anticorpos policlonais e monoclonais. Revelou-se que os anticorpos criados contra o antigénio pentassacarídeo ramificado mostram reactividade cruzada com o antigénio bacteriano ao passo que os anticorpos para os outros oligossacáridos não apresentavam reactividade cruzada. Sugere-se que os glicoconjugados são úteis para proporcionar uma fonte mais acessível de antigénio definido que pode ser usado numa variedade de formatos de diagnóstico.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona uma composição imunogénica para proteger mamíferos contra infecções provocadas por bactérias estreptocócicas do grupo A. Esta composição imunogénica compreende uma quantidade imunogénica de polissacárido de estreptococos do grupo A (GASP) possuindo a seguinte estrutura: [-2) -cr-L-Rhap- (1-3) -α-L-Rhap- (1-] n---R; 3

T 1 ô-D-GlcpNAc (I) 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 5

onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução e n é um número de cerca de 3 a cerca de 30 para proporcionar uma resposta imunogénica ao resíduo β-D-GlcpNAc glicosidicamente ligado na posição 3 da ramnose, e um transportador. Esta região do GASP define um epítopo que induz a formação de anticorpos bactericidas. O GASP que se encontra nas composições imunogénicas pode estar na forma de polissacárido livre ou como um componente de um conjugado, no qual o GASP está ligado por covalência ao fosfolípido capaz de formar um lipossoma ou uma proteína. Uma proteína bacteriana, nativa ou recombinante, tal como toxóide do tétano, toxina da cólera, toxóide da difteria, ou CRM197 são exemplos de proteínas adequadas úteis como conjugados. Numa outra concretização, incorpora-se uma proteína imunogénica no lipossoma contendo GASP ligado por covalência ao fosfolípido. A composição imunogénica é útil também como vacina e pode compreender ainda um adjuvante, tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, monofosforil-lípido A, QS21 ou esteariltirosina. A composição imunogénica deste invento tem a capacidade de eliciar protecção activa e passiva contra infecção, por infecção provocada por estreptococos do grupo A. Para a protecção passiva, produzem-se anticorpos imunogénicos, imunizando um mamífero com uma vacina feita da composição imunogénica do invento e recuperando depois os anticorpos imunogénicos do mamífero.

Este invento também proporciona métodos para imunizar um mamífero contra a infecção provocada por bactérias estreptocócicas do grupo A, administrando uma quantidade imunogénica das composições do invento.

Numa outra concretização, este invento proporciona um método para produzir uma composição imunogénica compreendendo GASP ligado por covalência a lipossomas; dissolver os lipossomas num tampão adequado à solubilização de proteínas hidrófobas; combinar os lipossomas dissolvidos, com proteína dissolvida em tampão, para formarem um complexo de lipossomas e proteína. O complexo proteína/lipossoma é depois separado do tampão.

Um objectivo deste invento é proporcionar composições imunogénicas úteis para criar anticorpos que têm aplicação para fins profilácticos e de

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 6 diagnóstico. Um outro objectivo deste invento é proporcionar um método para imunizar um mamífero contra bactérias estreptocócicas do grupo A, administrando uma quantidade imunogénica de GASP. Um outro objectivo é proporcionar métodos para ligar o GASP por covalência a uma proteína, para formar um conjugado de imunogénio. Numa concretização preferida, o conjugado tem uma formula de: [•*2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (1-»] n---R' -CH2-NH-protein 3 (I) T 1 5-D-GlcpNAc onde R' é o produto de redução e oxidação do açúcar terminal susceptível de -redução. Um outro objectivo deste invento é, ainda, a utilização das composições imunogénicas para proporcionar protecção contra infecções provocadas por estreptococos do grupo A nas populações em maior risco de contrair doenças e infecções provocadas por estreptococos do grupo A, nomeadamente adultos, mulheres grávidas e, em particular, bebés e crianças.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa esquematicamente o esboço estrutural do hidrato de carbono do grupo A (Figura 1 A) e do hidrato de carbono da variante do grupo A (Figura 1B). A representação da estrutura tridimensional do hidrato de carbono do grupo A confirma claramente a observação de que a especificidade serológica do hidrato de carbono é orientada para a porção N-acetilglucosamina do hidrato de carbono. A Figura 2 ilustra graficamente as determinações de título por ELISA de anticorpos para o hidrato de carbono de estreptococos do grupo A em crianças normais na idade de 5 e 10 anos de Trinidad e New York. As leituras eram determinações do ponto final de 1,0 OD a 405 nm. A Figura 3 ilustra graficamente estudos de inibição de ELISA com soros humanos que se sabia terem anticorpos reactivos com lipossomas-Grupo A. Diluíram-se adequadamente os soros para dar um valor de 1,0 unidades de DO a 405 nm e misturaram-se com várias concentrações de antigénios diferentes durante 1 hora a 37°C, centrifugaram-se durante 5 minutos a 10000 rpm.

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Testaram-se os sobrenadantes quanto à reactividade no ensaio ELISA como se descreve no Exemplo 3. Os dados representam a média de soros testados. A Figura 4 ilustra graficamente o ensaio bactericida indirecto usando sangue humano lavado ao qual se adicionaram vários soros em tubos contendo RPMI e complemento, como delineado no Exemplo 1. O inoculo inicial era de nove UFC de estreptococos do grupo A-tipo 6. O painel A mostra o crescimento do organismo nos tubos em rotação contendo soro normal de coelho. O painel B mostra o crescimento em tubos imóveis com soro humano possuindo um elevado título de ELISA reactivo com o hidrato de carbono do grupo A. O painel C mostra a inibição do crescimento com o mesmo soro humano do painel B, mas num tubo em rotação. A Figura 5 ilustra graficamente os ensaios bactericidas indirectos, como os descritos na Fig. 4. Os organismos eram um serótipo 3 (estirpe D58/11/3), um serótipo 6 (estirpe S43), um serótipo 14 (estirpe S23/101/5), e um serótipo 28 (estirpe T28/isoA/5). O eixo da esquerda representa o número de unidades formadoras de colónias nos tubos em rotação versus nos tubos imóveis. O eixo da direita denota a percentagem de morte dos organismos nos tubos com rotação versus nos estacionários. A Figura 6 ilustra graficamente o efeito de heparina em ensaios bactericidas indirectos. O ensaio bactericida indirecto foi efectuado como se descreveu, mas em duplicado. Adicionou-se heparina (5 unidades/ml) a um conjunto de tubos em rotação e imóveis, enquanto que o outro conjunto de tubos serviram de controlos normais do ensaio bactericida. A quantidade padrão de heparina usada em ensaios bactericidas em voga, após o descrito por Lancefield, é 10 unidades/ml (33-35). Como se pode observar, a metade das concentrações vulgarmente descritas, a heparina reduz drasticamente a quantidade de mortes dependentes do anticorpo anti-hidrato de carbono do grupo A. A Figura 7 ilustra graficamente ensaios bactericidas de títulos de hidrato de carbono, de ensaios anti-grupo A como se mediram no ensaio ELISA. Testaram-se 17 soros humanos individuais, em ambos os ensaios, usando os organismos de serótipo 6. Note-se que todos os soros (13/13) que exibiam um título de CHO superior a 200000 exibem mais de 80% de mortes no ensaio

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 8 bactericida. Pelo contrário, apenas um de 4 soros com títulos inferiores a 200000 promoveram a opsonofagocitose dos organismos e o grau de fagocitose foi muito menor do que o observado com soros de título mais elevado. A Figura 8 ilustra graficamente ensaios bactericidas por opsonofagocitose, como descritos no Exemplo 1. A fagocitose dos organismos é representada em percentagem de mortes do organismo em comparação com os controlos imóveis. As barras indicam a percentagem de mortes antes da adsorsão com a coluna de afinidade de N-acetilglucosamina, após absorção com a coluna de afinidade, e a percentagem de mortes de anticorpos eluídos da coluna. Note-se a completa ausência de mortes de todos os soros, após a absorção com a coluna de afinidade de N-acetilglucosamina, e a recuperação parcial da - actividade bactericida por opsonofagocitose, após a eluição dos anticorpos da coluna de afinidade. 0 erro padrão é apresentado em cada caso, excepto nos soros absorvidos, onde existiu uma completa ausência de mortes. A Figura 9 ilustra graficamente o índice de opsonofagocitose de um soro de coelho que se sabe ter títulos elevados de anticorpos anti-hidrato de carbono do grupo A, após imunização com hidrato de carbono de estreptococos do grupo A. A fagocitose dos organismos é representada como percentagem de mortes do organismo em comparação com os controlos imóveis. Note-se a falta de fagocitose do organismo com títulos < 50000, um aumento gradual em mortes com títulos de 75000 e fagocitose completa com títulos acima de 100000. O organismo utilizado para estes estudos foi uma estirpe do grupo A, tipo 6, e o inoculo foi de 4 unidades de formação de colónias.

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO

Tendo em vista os dados serológicos conhecidos que detectam anticorpos para hidratos de carbono em soros humanos, associados com a indução, relacionada com a idade, de protecção por outros antigénios de hidrato de carbono, nomeadamente, polissacáridos de pneumococos (27), de meningnococos (4), e Haemophilus (5), decidimos reexaminar vários soros humanos quanto à presença de anticorpos de hidrato de carbono, tanto em populações normais, como nas populações com infecções provocadas por estreptococos. Também se incluíram, nestes estudos, pacientes com sequelas pós-estreptococos. Ligou-se por covalência hidrato de carbono do grupo A 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 9

purificado a fosfatidiletanolamina sintética, incorporou-se em lipossomas, e usou-se num ensaio baseado em ELISA. Este invento demonstra que se detectam facilmente anticorpos para o antigénio hidrato de carbono do grupo A em soros humanos. Para além disso, dependendo da população geográfica e da exposição a doença provocada por estreptococos, a quantidade desses anticorpos tem uma dependência relacionada com a idade. Demonstrou-se, também, um aumento no título de anticorpos para o hidrato de carbono do grupo A, a seguir a uma infecção por estreptococos conhecida. Para abordar a questão de estes anticorpos ou uma porção destes anticorpos reactivos com o hidrato de carbono do grupo A poderem ou não promover opsonofagocitose, usámos um ensaio bactericida de Lancefield modificado. Os dados resultantes demonstraram que estes anticorpos são opsónicos e o epítopo para o qual esses anticorpos de hidrato de carbono do grupo A opsónicos estão orientados são os resíduos terminais de N-acetilgiucosamina que não são susceptíveis de redução. 0 invento proporciona, tanto uma composição imunogénica, como um método de imunização para protecção em mamíferos, preferencilamente humanos, contra infecção por bactérias estreptocócicas do grupo A. Os conjugados imunogénicos deste invento formam-se por ligação do polissacárido de estreptococos do grupo A (GASP), por covalência, a uma proteína ou lipossoma adequados, formando fosfolípidos. 0 isolamento e o crescimento de estreptococos do grupo A e a preparação do polissacárido do grupo A são realizados em conformidade com os procedimentos descritos por McCarty (28) e Dubois et ai (31). 0 GASP isolado tem a seguinte estrutura química: [-2) -α-L-Khap- (1^3) -α-L-Rhap- (1-] n---R; 3 t 1 (I) β-D-G lcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução e n é um número de unidades repetidas desde cerca de 3 a cerca de 30 com uma quantidade óptima de cerca de 20. Como aqui se aplica, o termo polissacárido pretende incluir qualquer polímero de sacáridos e inclui dissacáridos,

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 10 oligossacáridos, etc. As culturas de estreptococos da variante do grupo A que produzem a estrutura de polissacárido acima estão depositadas na American Type Culture Collection, Rockville, MD. O GASP deve ser de tamanho suficiente para eliciar uma resposta imunogénica em indivíduos. O peso molecular médio é, com a maior preferência, de cerca de 10 quilodalton. Uma única quantidade repetida do GASP tem um peso molecular de cerca de 500 dalton.

Numa concretização preferida do inventor, o GASP liga-se por covalência à proteína para formar um conjugado. Esses conjugados convertem preferencialmente a resposta imunogénica ao polissacárido numa que é independente das células T a dependente das células T. Em conformidade, qualquer proteína ou seu fragmento tolerados pelo indivíduo e capazes de eliciar uma resposta dependente das células T, é adequada para uma conjugação com GASP. Essencialmente, qualquer proteína podia servir como proteína conjugada. Especificamente, a proteína seleccionada deve possuir pelo menos um grupo amino livre para usar na conjugação com o polissacárido do grupo A. Preferencialmente, a proteína é qualquer proteína bacteriana, nativa ou recombinante, e é ela própria um imunogénio que elicia respostas dependentes de células T, tanto em mamíferos adultos como em jovens. Exemplos dessas proteínas incluem, mas não se limitam a, toxóide do tétano, toxina da cólera, toxóide da difteria e CRM197. Outras candidatas a proteínas conjugadas incluem toxinas ou toxóides de pseudomonas, estafiiococos, estreptococos, bactérias da tosse convulsa e entertoxigénicas incluindo Escheríchia coli.

Numa concretização preferida, as moléculas de conjugado deste invento compreendem uma proteína central à qual se ligam os GASP, através de uma forma modificada do açúcar terminal susceptível de redução. Essas moléculas de conjugado compreenderiam portanto proteína ligada a GASP monofuncionalizada. Preferencialmente, liga-se a cada proteína uma multiplicidade de GASP, mais especificamente entre cerca de 1 e 12 GASP. Mais preferencialmente, ligam-se a cada proteína pelo menos cerca de 5 GASP.

Numa outra concretização os GASP ligam-se à proteína através de dois ou mais locais, em cada GASP. Uma vez que o epítopo bactericida parece estar presente nas ramificações das unidades repetidas de GASP, a funcionalização do GASP e a ligação à proteína deve ser efectuada de forma a conservar uma quantidade imunogénica de epítopo bactericida.

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As proteínas com as quais o GASP se conjuga podem ser toxinas nativas ou uma toxina destoxicada (isto é, um toxoide). Também, formas mutantes não tóxicas de toxinas proteicas podem igualmente ser usadas. De preferência, essas mutações retêm epítopos das toxinas nativas. Estas toxinas mutadas foram denominadas "materiais de reacção cruzada", ou CRM. A CRM197, que tem uma alteração de um único aminoácido relativamente à toxina da difteria activa e não se distingue imunologicamente desta, é um componente de uma vacina de conjugado de Haemophilus influenzae que tem sido muito usada em crianças pequenas.

Uma cultura de estirpe C7 de Corynebacterium diphtheria (β 197), que produz proteína CRM197, está depositada na American Type Culture Collection, Rockville, Md. (número de acesso ATCC 53281).

Podem-se também usar para conjugar com GASP, fragmentos de proteínas desde que tenham comprimento suficiente, isto é, preferencialmente de pelo menos 10 aminoácidos, para definir um epítopo de célula T.

Podem-se utilizar inúmeros métodos de conjugação para criar o conjugado proteína-polissacárido do grupo A deste invento. De preferência, o método usado seria um que conservasse a imunogenicidade do epítopo bactericida existente nas ramificações β-D-GlcpNAc que se ligam glicosidicamente à posição 3 da ramnose. Quando um único GASP se liga a duas ou mais moléculas de proteína, o conjugado resultante é reticulado em relação à proteína. 0 grau de reticulação e o tamanho total da molécula de conjugado podem ser regulados por variações de rotina nas condições usadas durante a reacção de conjugação, que são bem conhecidas dos peritos na arte. Essas variações incluem por exemplo, a velocidade da reacção de conjugação e a razão de proteínas e GASP presentes na mistura reaccional.

Conhecem-se vários métodos químicos para conjugar polissacáridos a proteínas e descreveram-se na arte. Por exemplo, a Patente U.S. 4644059 descreve um conjugado obtido usando di-hidrazida de ácido adípico (ADH) como ligante homo-difuncional. A Patente U.S. 4695624 descreve métodos de preparação de polissacáridos e de conjugados usando espaçadores bigenéricos. Uma revisão de vários métodos de preparação e factores usados na concepção

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 12 de conjugados é discutida em Dick, William E. e Michael Beurret, Microbiol. Immunol. (1989), Vol. 10, pág. 48.114. 0 método de conjugação preferido para os conjugados proteína-GASP deste invento é a aminação redutora, como se descreve na Patente U. S. 4356170. Resumidamente, na concretização preferida, o açúcar terminal susceptível de redução do GASP é reduzido para abrir o anel usando um agente redutor moderado, por exemplo, boro-hidreto de sódio ou um seu equivalente. A seguir, utiliza-se a oxidação selectiva com metaperiodato de sódio ou um seu equivalente para oxidar os grupos hidroxilo vicinais terminais da porção de açúcar previamente reduzida, formando um grupo aldeído terminal. Isto forma um GASP activado que é agora capaz de se ligar por covalência ao transportador proteico seleccionado. Numa outra concretização deste invento, este GASP activado também se pode ligar por covalência a um fosfolípido, tal como a fosfatidiletanolamina que está na forma de lipossomas. A estrutura química do GASP activado é a seguinte:

[-2) -β-L-Rhap- (1-3) -α-L-Rhap- (1-] n---R'CHO 3 t 1 β-D-GlcpNAc onde R' é o produto da redução e da oxidação do açúcar terminal susceptível de redução, excepto a porção do açúcar terminal susceptível de redução que forma o resíduo aldeído (CHO). Oxidam-se, de forma adequada, aproximadamente 10 mg de polissacárido com cerca de 1 ml de solução de metaperiodato de sódio de aproximadamente 20 mM, durante cerca de 10-15 minutos, à temperatura ambiente. Pode-se variar o tempo de reacção para fornecer outras quantidades de periodato para obter oxidação equivalente. A redução e abertura do açúcar terminal susceptível de redução faz com que os grupos hidroxilo vicinais, no açúcar susceptível de redução, sejam muito mais reactivos do que os existentes nas ramificações β-D-GlcpNAc ligadas glicosidicamente. No entanto, podem também ocorrer locais de ligação adicionais através da oxidação de alguns dos resíduos β-D-GlcpNAc glicosidicamente ligados. Conjugam-se então o GASP activado e a proteína de conjugação seleccionada na presença de iões cianoboro-hidrato, ou um outro agente redutor, acoplando os grupos amino da proteína transportadora aos grupos aldeído terminais do

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 13 GASP. Ο polissacárido do grupo A e a proteína ligam-se assim através de uma ligação -CH2-NH- à proteína conforme a formula II.

[-2) -α-L-Rhap-(1—3 ) -a-L-Rhao- (l—]n---R'-CH-,-NH-protein 3 (II) t 1 β-0-GlcpNAc

Os conjugados GASP-proteína resultantes do processo de aminação redutora têm preferencialmente reticuiação limitada e são de preferência solúveis em soluções aquosas. Isto faz do conjugado GASP-proteína do invento, um candidato preferido para utilização como vacina.

Numa outra concretização do invento,-os GASP são embutidos em lipossomas, formando uma composição imunogénica. Usam-se frequentemente lipossomas em conjugados devido à sua capacidade para induzir um efeito de capping em linfócitos B. Sem ficar ligados à teoria, acredita-se que os conjugados GASP-lipossoma aumentam os títulos de anticorpos através de capping, activando assim os linfócitos B. O fenómeno de capping é bastante conhecido no campo da biologia celular. Resumidamente, devido às características estruturais dos lipossomas, os lipossomas são capazes de ser embutidos com um antigénio, criando dessa forma estruturas imunogénicas multivalentes. Uma vez que as moléculas receptoras, na membrana da célula de lipossomas, são móveis, muitos destes receptores podem ser reticulados por reagentes bivalentes para formar áreas ou porções de precipitação bidimensionais. Estas porções coalescerão ou agrupar-se-ão nas extremidades polares dos linfócitos B, formando um "cap" na membrana celular do linfócito. Este acto de capping do antigénio dos linfócitos B, se efectuado na presença de células T auxiliares efectoras, activará a produção de anticorpos pelos linfócitos B.

Conhecem-se e encontra-se descritos na arte vários métodos para conjugar polissacáridos com lipossomas. Por exemplo, a Patente U.S. 5283185 descreve a transferência de ácidos nucleicos para células preparando uma dispersão lipídica mista, de um lípido catiónico com um co-lípido, e introduzindo depois na dispersão ácidos nucleicos, formando um complexo. Tratam-se depois as células com este complexo. Numa concretização preferida deste invento, 14 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ produzem-se os lipossomas dispersando um lípido numa solução aquosa tanto por injecção através de uma agulha fina como, de preferência, por aplicação de ultra-sons como se descreve em Fillit, H.M. Milan Blake, Christa MacDonald e Maclyn McCarty (1988), Immunogenicity of liposome-bound hyaluronate in mice, J. Exp. Med. 168:971-982.

Para preparar lipossomas contendo fosfolípido ligado por covalência ao componente GASP, formam-se os lipossomas por métodos conhecidos. Por exemplo, numa concretização deste invento dissolve-se fosfatidiletanolamina num solvente tal como o clorofórmio e adiciona-se a um recipiente. Remove-se o solvente clorofórmio revestindo assim o recipiente com fosfatidiletanolamina. Adiciona-se ao recipiente um tampão aquoso, tal como água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), e submete-se a mistura a ultra-sons para formar lipossomas. Depois, adiciona-se GASP, que f-oi activado de preferência por redução seguida de oxidação, aos lipossomas numa quantidade molar igual, e misturam-se os dois componentes, durante a noite, na presença de qualquer tampão adequado, tal como solução salina, solução de Ringer ou, com maior preferência, solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adiciona-se então cianoboro-hidreto de sódio à mistura para formar a ligação covalente estável entre a fosfatidiletanolamina e o polissacárido GASP. Pode-se separar o produto final, como se apresenta na formula III, do cianoboro-hidreto de sódio, por centrifugação, por cromatografia em peneiro molecular ou por diálise. ---R' -CH2-NH-R2

III

[-2)-α-L-Rhap-(1-3)-α-L-Rhap-(1-]n 3 t 1 β-D-GlcpNAc R' e n na formula III são como previamente descritos e R2 é fosfatidiletanolamina.

Numa concretização preferida, combinam-se os GASP-lipossomas com proteína para incorporar proteína hidrófoba nos lipossomas. Em conformidade com um método, solubilizam-se os GASP-lipossomas numa solução a 5% de β-octilglucósido. Solubiliza-se também a proteína a adicionar ao lipossoma em β-octilglucósido a 5% e combinam-se a proteína e os lipossomas. Depois de se misturar para incorporar a proteína no lipossoma, remove-se o β-octilglucósido

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 15 por diálise. Pode-se depois utilizar o complexo resultante, GASP-lipossoma-proteína, como um imunogénio ou uma vacina.

Pode-se também ligar o GASP a fosfolípidos usando outras técnicas menos preferidas, tais como usando benzoquinona, como descrito em Fillit, H.M., M. McCarty, e M.S. Blake (1986), a indução de anticorpos para ácido hiálurónico por imunização de coelhos com estreptococos encapsulados Jj. Exp. Med. 164:762-776. No entanto, a utilização destes reagentes pode não ser desejável se a composição for para utilizar como vacina.

Podem-se usar as composições imunogénicas do invento como um meio para aumentar os anticorpos úteis para fins profiláticos e de diagnóstico. Os diagnósticos são particularmente úteis na monitorização e detecção de várias infecções e doenças eausadas por estreptococos do grupo A. Uma outra concretização do invento utiliza as composições imunogénicas como imunogénio para usar em protecção imunogénica tanto activa como passiva nos indivíduos em risco de contacto com infecções ou doenças provocadas por estreptococos do grupo A. Os anticorpos imunogénicos usados para protecção passiva são produzidos imunizando um mamífero com qualquer uma das composições imunogénicas do invento e recuperando depois os anticorpos bactericidas numa fracção de gama-globulina ou como soro, ou como anticorpos específicos dos mamíferos. Como aqui se usam, as vacinas deste invento são capazes de eliciar anticorpos úteis ou proporcionar protecção contra infecções de bactérias estreptocócicas do grupo A.

Adicionalmente, pode-se utilizar o polissacárido do grupo A sozinho como um agente imunizante associado de preferência a um adjuvante, tal como o hidróxido de alumínio, o fosfato de alumínio, monofosforil-lípido A, QS21 ou esteariltirosina. Uma outra concretização do invento consiste em utilizar as composições imunogénicas como protecção imunogénica contra infecções provocadas pelo estreptococo do grupo A. Em particular, este invento proporcionaria protecção para as populações em maior risco de contrair infecções e doenças provocadas por estreptococos do grupo A, nomeadamente adultos, mulheres grávidas e em particular bebés e crianças. A composição imunogénica e as vacinas do invento formam-se tipicamente, dispersando o GASP ou o conjugado num transportador farmaceu-

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 16 ticamente aceitável adequado, tal como solução salina fisiológica, solução salina tamponada com fosfato ou outros líquidos injectáveis. Administra-se a vacina parentericamente, por exemplo subcutânea, intraperitoneal ou intramuscularmente. Podem também estar presentes os aditivos usuais em vacinas, por exemplo estabilizantes tais como lactose ou sorbitol e adjuvantes como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio, monofosforil-lípido A, QS21 ou esteariltirosina. A dose de composições imunogénicas será a que eliciará resultados imunogenicamente eficazes. As dosagens estarão normalmente dentro da gama de cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal. Pode-se dar uma série de doses para imunidade óptima. Podem-se proporcionar formas de dosagem unitária da vacina com quantidades de GASP ou conjugado equivalente desde cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg (microgramas).- 0 invento é ilustrado pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1

Os métodos para crescimento, preparação e testes aos anticorpos para hidratos de carbono de estreptococos do grupo A e a sua utilização como nova vacina, em adultos e crianças, enumeram-se da seguinte forma:

Crescimento de estreptococos do grupo A

Inoculou-se na forma de riscado, uma sementeira de reserva de estreptococos do grupo A a -70°C, numa placa de meio que contém Caldo de Todd Hewitt a 3g/l e extracto de levedura a 3 g/l (meio GAS). Incubou-se a placa a 37°C durante 48 horas, altura em que as colónias (8-9) se transferiram para um balão de agitação de 200 mi de meio GAS e cresceram durante 18 horas a 37°C e 120 rpm. Transferiu-se a cultura de sementeira (150 ml) para um fermentador de 15 L (New Brunswick, BioFIo 4) em caldo de Todd Hewitt. A cultura desenvolveu-se durante 7-8 horas a pH 7,0 e 37°C. Adicionou-se glucose a 3 g/l quando a cultura atingiu uma fase estacionária (densidade óptica a 600 nm à volta de 1,5). Deixou-se crescer a cultura durante mais 8 horas e fizeram-se colheitas. A densidade óptica final é aproximadamente 2,7 a 600 nm.

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Preparação de polissacárido de estreptococos do grupo A

Combinaram-se sessenta gramas de células de estreptococos do grupo A em 600 ml de água com 75 ml de nitrito de sódio 4 N e 75 ml de ácido acético glaciar. Misturou-se a solução durante 15 minutos e centrifugou-se durante 10 minutos, a 11000 rpm, num rotor SS34. Removeu-se o sobrenadante, submeteu-se a diálise contra água e liofilizou-se. Purificou-se o polissacárido do grupo A, a partir do extracto liofilizado bruto, por filtração em gel através de uma coluna Sephadex G-50 (Pharmacia) usando como eluente PBS. Monitorizaram-se as fracções que eluiram da coluna quanto à presença de hidratos de carbono, usando o ensaio de ácido fenolsulfúrico de Dubois (31). Reuniram-se as fracções positivas para hidrato de carbono, submeteram-se a diálise a 4°C contra água e liofilizaram-se. A preparação de polissacárido (240 mg) continha menos de 1 % (p/p) de proteínas e ácidos nucleicos. Confirmou-se ainda a sua pureza por 'H-RMN a 500 MHz usando um espectrómetro AM-500 BRUKER.

Preparação de lipossomas

Isolou-se hidrato de carbono de estreptococos do grupo A por métodos previamente descritos por McCarty (28). Suspendeu-se novamente o material liofilizado, ajustou-se a 10 mg/ml e ligou-se por covalência a lipossomas usando métodos previamente descritos por Fillit et ai (18) usando benzoquinona como agente de ligação que é aqui incorporado por referência para hialuronato de estreptococos. Resumidamente, faz-se reagir GASP com benzoquinona para formar um intermediário activado. Faz-se então reagir este intermediário com fosfatidiletanolamina na forma de lipossoma para formar o conjugado imunogénico GASP-lipossoma.

Ensaios ELISA 0 método ELISA foi essencialmente o descrito por Fillit et a/ (18) com as seguintes modificações. Testes preliminares com soros humanos indicaram que 0,5 pg de CHO/ ml em PBS, pH 7,2 da preparação lipossómica, para sensibilizar as placas de microtitulação deram os melhores resultados com leituras de fundo mínimas contra as preparações de lipossoma de controlo. Em conformidade, colocam-se 100 μΙ da preparação por poço em placas de microtitulação (placas Dynatech, EUA) e incubam-se a 37°C, durante a noite. Lavaram-se então as placas 3x em tampão de lavagem de ELISA (10 mM de acetato de sódio, 100 mM de NaCI; Brij 35 a 0,1 %; pH 8,0). Diluíram-se os soros humanos no mesmo

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 18 tampão de ELISA e colocaram-se nas placas 100 μΙ de uma dada diluição de soro e incubaram-se 1 hora a 37°C. Todos os soros foram testados em duplicado. Após lavagens adequadas, usaram-se diluições 1:1000 de F(ab')2 de cabra anti-lgG (específica para a cadeia gama) ou IgM (específica para a cadeia Mu) humanas, conjugado com fosfatase alcalina (Tago, Inc., EUA) como anticorpo secundário e incubaram-se durante mais uma hora, a 37°C. Após mais três lavagens em tampão ELISA, adicionou-se um substracto de fosfatase (Sigma 104) em Dietanolamina 0,1 M, pH 9,6 aos poços, incubaram-se as placas a 37°C, durante 1 hora, e leram-se num instrumento Elida V (Physica Co.) a 405 nm. Considerou-se o título como a diluição que deu uma leitura de 1,0.

Ensaios bactericidas

Efectuou-se o ensaio bactericida indirecto descrito por Lancefield (15, 25, 26) da seguinte forma: os organismos das várias estirpes cresceram durante 18 horas a 37°C em caldo Todd Hewitt. Primeiro, diluiu-se 1:2 uma amostra da cultura da noite em caldo Todd Hewitt fresco e cresceu-se durante mais 2 horas, a 37°C. Diluiu-se a suspensão 1:100 seguida de diluições em série de duas vezes para libertar entre 5-15 colónias em 50 ul de caldo Todd Hewitt. Usou-se sangue com heparina para a fonte de fagócitos humanos. Para evitar a presença de plasma autólogo na suspensão fagocítica, centrifugou-se o sangue a 2000 rpm, durante 10 minutos, removeu-se o plasma, lavou-se a pelete 3x com PBS (pH 7,2) e finalmente fez-se nova suspensão em RPMI (Gibco-BRL, Co., Rockville, MD) até ao mesmo volume que a amostra original de sangue. Forneceu-se complemento ao sistema de ensaio usando soro recentemente isolado de um dador normal que se sabe conter quantidades baixas de anticorpo anti-hidratos de carbono e que foi repetidamente absorvido a 0°C, com estreptococos do grupo A, e armazenou-se em quantidades alíquota a -70°C (29). Antes de usar, analisou-se esta fonte de complemento, tanto quanto à actividade de complemento como quanto à ausência de anticorpos para o hidrato de carbono do grupo A. Efectuou-se o ensaio bactericida em duplicado em tubos selados. A mistura reaccional era a seguinte: 300 μΙ de fagócitos humanos suspensos em RPMI, 100 μΙ de complemento humano, 200 μΙ do soro a testar, e 50 111 da cultura de estreptococos diluída. Como no ensaio de Lancefield, fez-se rodar um dos tubos duplicados, no sentido longitudinal, durante 3 horas, a 37°C e o segundo tubo, que serve como controlo, mantém-se imóvel, à mesma temperatura. Após 3 horas, plaquearam-se 100 μΙ

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 19 de cada tubo sobre placas de ágar com sangue e incubou-se durante a noite, a 37°C. Contou-se então o número de colónias em cada placa. Calculou-se a actividade opsonofagocítica como a percentagem de estreptococos mortos de um determinado soro através da seguinte equação: (1-ufc em soro de teste em rotacão/ufc em tubo imóvel) χ 100.

Absorção de anticorpos de N-acetilglucosamina de soros humanos

Colocaram-se 600 μΙ de uma suspensão a 50% de uma N-acetilglucosa-mina acoplada a contas de Sepharose (Sigma Chemical Co.) em PBS, num tubo eppendorf estéril e centrifugou-se a 4°C, a 14000 rpm, durante 10 minutos. Removeu-se o sobrenadante e adicionaram-se 300 μΙ de soro às contas. Fez-se rodar, no sentido longitudinal, a suspensão durante 1 hora, a 37°C. A seguir a uma segunda centrifugação nas mesmas condições, removeu-se o soro absorvido e usou-se no ensaio bactericida, da forma previamente descrita. Para remover os anticorpos de N-acetilglucosamina da coluna de afinidade, compactaram-se as contas contendo os anticorpos absorvidos numa seringa de 1 ml de tuberculina, sobre a qual se faz passar uma solução de ácido acético glaciar a 0,58% (v/v) em NaCI 0,15 M, pH 2,2. Monitoriza-se o eluente por absorção a 280 nm e recolhem-se as fracções de pico, submetem-se a diálise contra PBS, pH 7,2, e concentram-se de volta ao volume original de soro usando um concentrador Amicon centriprep 30 (Amicon, Beverly, MA).

Soros humanos

Os indivíduos incluídos neste estudo eram de Trinidad, New York, e da estação naval de treino Great Lakes Naval Training Sation. As suas idades variavam de 5-20 anos. O sangue foi obtido por venipunctura e o soro foi recolhido usando técnicas estéreis padrão. Todos os soros foram agrupados por idades, origem e condições de saúde, como se apresenta no Quadro I. (Segue Quadro I)

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 20

Quadro I

Distribuição de população

Pacientes Idade (anos) N.° de pacientes Crianças normais-Trinidad 5 36 Crianças normais-Trinidad 10 16 Crianças normais-New York 5 32 Crianças normais-New York ' 10 22 Febre reumática-Trinidad 7 19 Nefrite-Trinidad 4 18 Febre escarlatina sem complicações 18-20 6 Febre escarlatina com complicações (ARF) 18-20 5

Ensaios bactericidas

Tendo estabelecido que soros humanos contêm anticorpos para hidratos de carbono do grupo A e que os títulos desses anticorpos variam nos indivíduos, abordámos a seguir a questão de estes anticorpos também promoverem a opsonofagocitose num sistema de ensaio in vitro. O ensaio bactericida foi essencialmente o usado pela Dra Lancefield (15, 25, 26) para testar soros humanos com as modificações acima delineadas. A Figura 4 ilustra os resultados dos ensaios de fagocitose. Usando um inoculo de nove unidades formadoras de colónias de uma estirpe de estreptococos do grupo A, do serótipo 6, houve um aumento significativo no número de colónias nos tubos em rotação na presença de soro de coelho normal (Painel A). O painel B mostra um ligeiro aumento no tubo imóvel onde se usou soro humano. Em evidente oposição, o tubo em rotação contendo o soro humano (Painel C) aboliu completamente com o crescimento dos organismos (compare-se o painel B e C).

Para ter a certeza de que a opsonofagocitose de estreptococos do grupo A não se limita a um serótipo, repetiram-se estas experiências usando outras três estirpes do grupo A de diferentes serótipos de proteína M. Como se observa na Figura 5, todas as outras três estirpes sofreram fagocitose na presença de soros humanos, de forma semelhante à observada para a estirpe do tipo 6. A percentagem de mortes variou de 80-100% quando se compararam os tubos em rotação com os imóveis. As estirpes dos serótipos 3, 14, 28 são as

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 21 estirpes idênticas utilizadas pela Dra Lancefield nos seus ensaios de fagocitose (15, 25, 26).

Relação entre os títulos anti-CHO e opsonofaaocitose por soros humanos

Usando o ensaio de fagocitose, é evidente que os soros humanos diferem na sua capacidade para promover fagocitose de estreptococos do grupo A. Geralmente, as propriedades fagocíticas de um dado soro correlacionam-se com os títulos dos anticorpos anti-hidratos de carbono do grupo A. Como se observa na Figura 6, todos os soros exibindo títulos superiores a 200000 apresentaram mais de 80% de mortes, enquanto que três dos quatro soros com títulos inferiores a 200000 não apresentaram. Um soro com um título de CHO de 40000 promoveu fagocitose mas o grau de mortes foi muito menor do que o observado com soros anti-CHO com títulos elevados.

Estudos de fagocitose por soros humanos em ensaios de sangue com heparina versus sem heoarina

Devido à conhecida capacidade da heparina para se ligar e inactivar numerosos componentes de complemento e correlacionar o nosso ensaio de fagocitose com os que foram previamente usados, testaram-se as capacidades opsonofagocíticas, descritas acima, de soros humanos normais em ensaios de fagocitose na presença e na ausência de heparina. Recolheu-se sangue humano por venipunctura, com heparina, lavou-se extensivamente com PBS, como se descreveu acima, e dividiu-se em duas porções alíquotas. Fez-se novamente a suspensão de uma porção alíquota até ao volume original com RPMI e efectuou-se o ensaio opsónico, como se descreveu acima. Tratou-se a segunda porção alíquota da mesma maneira mas com a adição de 5 unidades por ml de heparina, a seguir ao que se efectuou o ensaio, da mesma maneira que a outra porção alíquota.

Os resultados representados na Figura 6 revelam que na ausência de heparina houve em média 94% de fagocitose dos estreptococos do grupo A pelo soro humano. No entanto, na presença de heparina, o mesmo soro conseguiu atingir apenas uma média de 12% de fagocitose do mesmo inoculo.

Experiências de absorção

Numa tentativa para determinar qual a parte da porção hidrato de carbono do estreptococos foi responsável pela actividade bactericida, absor-

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 22 veram-se soros humanos em contas de Sepharose acopladas a N-acetil-glucosamina, como se descreve na secção dos métodos. Usaram-se então soros absorvidos e não absorvidos nos ensaios padrão bactericidas. A Figura 7 mostra os resultados dessas experiências. O soro não absorvido aumentou claramente a fagocitose dos estreptococos. Pelo contrário, o soro absorvido nas contas acopladas a N-acetilglucosamina removeu os anticorpos opsonizantes. Como controlo de viabilidade, o soro de coelho normal não aumentou a fagocitose. Estas experiências indicam que os anticorpos orientados contra o resíduo terminal que não é susceptível de redução, N-acetilglucosamina, no hidrato de carbono do grupo A eram extremamente importantes na opsonofagocitose de estreptococos do grupo A, nos nossos ensaios bactericidas. Para confirmar estes resultados, eluíram-se os anticorpos de soros seleccionados, absorvidos na coluna de afinidade de N-acetilglucosamina, e usaram-se no ensaio bactericida. Como se mostra também na Figura 9, estas experiências demonstraram que os anticorpos específicos para N-acetilglucosamina eluídos da coluna de afinidade foram capazes de repor parcialmente a actividade opsonofagocítica bactericida do soro.

Usando métodos concebidos para medir anticorpos precipitantes e não precipitantes reactivos com o hidrato de carbono de estreptococos do grupo A, ligou-se por covalência este hidrato de carbono a fosfatidiletanolamina e incorporou-se num lipossoma capaz de se ligar a placas de microtitulação. Este método demonstra claramente que a maioria dos soros humanos contém anticorpos para polissacáridos de estreptococos do grupo A.

Surpreendentemente, verificámos que as crianças de locais geográficos diferentes apresentavam diferenças significativas nos seus títulos do hidrato de carbono do grupo A. Embora a quantidade de exposição a estreptococos (tanto impetigo como faringite) seja maior em Trinidad do que em New York, as infecções provocadas por estreptococos também são comuns em New York. Neste contexto, Zimmerman et al. (23) observaram títulos de anticorpos para hidratos de carbono do grupo A menores, em pacientes cuidadosamente monitorizados e tratados para infecções por estreptococos do grupo A, em comparação com um grupo não monitorizado. Para além disso, os antigénios de hidrato de carbono são, em geral, independentes de células T e é portanto concebível que seja necessária uma exposição repetida ao antigénio para eliciar a resposta de anticorpos. 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 23

Os estudos com soros obtidos de pacientes durante estádios agudos e convalescentes de febre escarlatina sugerem que os títulos de anticorpos para o hidrato de carbono de estreptococos do grupo A existiam já no início da doença, mas duplicaram durante a convalescência. Quando se examinaram os soros com ARF, a seguir a infecção aguda por estreptococos, os títulos do hidrato de carbono do grupo A eram inferiores na altura da apresentação com o início da febre escarlatina em comparação com soros de febre escarlatina sem complicações, mas quadruplicou na altura da apresentação com ARF, sugerindo talvez uma resposta imunitária mais forte para o antigénio em relação a pacientes com febre escarlatina sem complicações. Os títulos de anticorpos para o hidrato de carbono do grupo A foram significativamente menores do que os observados em pacientes com febre escarlatina que não desenvolveram ARF. Estudos de inibição com hidrato de carbono do grupo A e da variante do grupo A demonstram claramente que a maioria desses anticorpos estão orientados para o resíduo terminal que não é susceptível de redução, N-acetilglucosamina, específico do grupo A, no grupo hidrato de carbono e não contra o esqueleto de ramnose. A questão de estes anticorpos de hidrato de carbono promoverem ou não a opsonofagocitose de estreptococos do grupo A foi respondida afirmativamente e o grau de opsonização correlaciona-se bem com o nível de anticorpos anti-hidrato de carbono. Títulos de ELISA inferiores a 100000 foram, na generalidade, ineficazes, enquanto que a maioria dos soros com títulos superiores a 200000 promoveram fagocitose. Uma importante observação foi o facto desta opsonofagocitose não se limitar a um serótipo de estreptococos do grupo A visto que pelo menos três outras estirpes de serótipos diferentes também sofreram fagocitose. Certificou-se a importância do papel dos anticorpos reactivos com N-acetilglucosamina na opsonização pelo facto da absorção destes anticorpos de soros humanos abolirem completamente a actividade bactericida dos soros e de, quando se eluíram estes anticorpos e se adicionaram novamente aos ensaios bactericidas, se restabelecerem as mortes.

Vale a pena comentar várias observações relativas à cinética do ensaio bactericida com soros humanos. Primeiro, apenas pequenos inóculos de estreptococos no ensaio bactericida foram eficazes enquanto que inóculos maiores frequentemente destruíram a capacidade dos soros humanos para 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 24

opsonizar os organismos. Em segundo lugar, a actividade bactericida funcionou principalmente com soros não diluídos, numa forma semelhante à observada pela Dr.a Lancefield nos seus estudos de soros humanos e de anticorpos específicos dos tipos (15, 25, 26). Pelo contrário, os soros animais imunizados com uma dada proteína específica do tipo foram eficazes, mesmo a diluições de 1:20 ou mais.

Exemplo 2

Comparação de títulos de anticorpos reactivos com hidrato de carbono do grupo A em criancas normais: Os nossos primeiros esforços orientaram-se para determinar se as crianças normais desenvolviam ou não anticorpos para hidrato de carbono de estreptococos do grupo A e se o título desses anticorpos variava com a idade do indivíduo e com a área geográfica em que o indivíduo vivia. Em conformidade, mediram-se os títulos de anticorpo reactivo com hidrato de carbono do grupo A em soros obtidos de crianças normais de 5 e 10 anos em Trinidad ( exposição elevada a estreptococos) e compararam-se com crianças de idades correspondentes em New York (exposição baixa a estreptococos), usando o ensaio de ELISA descrito na secção de materiais e métodos. A Figura 2 ilustra que à idade de 5 anos, 94% das crianças de Trinidad apresentavam títulos de anticorpos inferiores a 1:10000, com um título médio de anticorpos de 1:158472. Estes títulos de anticorpos não foram significativamente diferentes dos soros de crianças testadas aos 10 anos de idade. Pelo contrário, as crianças de 5 anos na área de New York apresentavam títulos significativamente menores, com uma média de 1:6100, que aumentou para 1:25500 na idade de 10 anos. Os títulos de crianças na área de New York, em ambos os grupos etários, foram claramente menores do que os títulos correspondentes de crianças em Trinidad, como se demonstrou pelo facto de 69% das crianças de New York terem títulos superiores a 1:10000.

Para determinar se a resposta imunitária ao hidrato de carbono do grupo A era da classe IgG ou IgM, efectuou-se a seguinte experiência. Diluíram-se, de forma adequada, soros seleccionados exibindo títulos elevados de hidrato de carbono do grupo A, de tal forma que cada soro deu uma leitura de 1,0 a 405 nm, no ensaio de ELISA. Testou-se então cada soro, anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina anti-lgM ou anti-lgM humano. Como se observa no quadro II, a maioria dos anticorpos detectados, contra o

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 25 hidrato de carbono de estreptococos, era da classe IgG e observaram-se apenas reacções mínimas na classe IgM.

QUADRO II

Determinações de ELISA de títulos de anticorpos IgG e IgM para o complexo Lipossoma-CHO-estreptococos

Paciente Classe de imunoglobina IgG IgM 1 1200000 6000 2 640000 2000 3 . 480000 2000 4 360000 2000 5 320000 1000

Diluiu-se adequadamente cada soro para dar uma leitura de densidade óptica de 1,0 a 405 nm no leitor ELIDA V.

Exemplo 3

Determinação estrutural parcial dos anticorpos reactivos com o grupo A: Zimmerman et al (23) demonstraram previamente que alguns soros humanos continham anticorpos reactivos com o grupo hidrato de carbono, isolado de estreptococos variantes do grupo A, e deste modo eram orientados para a porção do esqueleto de poli-ramnose da molécula de polissacárido do grupo A. Para determinar a quantidade desses anticorpos reactivos com o esqueleto de ramnose comparativamente com anticorpos reactivos com o determinante do grupo A, N-acetilglucosamina terminal, em soro individual, efectuaram-se estudos de inibição de soros normais usando hidratos de carbono purificados, tanto do grupo A como da variante do grupo A. Como anteriormente, usou-se o complexo de lipossoma e hidrato de carbono do grupo A para sensibilizar placas de microtitulação. Misturaram-se 100 μΙ do soro apropriado com diferentes concentrações de hidrato de carbono e incubou-se durante 1 hora, num banho de água a 37°C. Centrifugou-se então a mistura a 10000 RPM, durante 5 minutos, e fez-se reagir o sobrenadante no ensaio de ELISA. Os controlos incluíram o soro misturado com solução salina. Como se mostra na Figura 3, a maioria dos anticorpos reactivos anti-hidrato de carbono do grupo A, em soros normais, eram orientados contra a porção hidrato de carbono do grupo A, ou

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 26 seja, ο determinante N-acetilglucosamina. Observou-se alguma inibição com o hidrato de carbono da variante do A mas a quantidade necessária para atingir o mesmo grau de inibição foi 1000-5000 vezes maior do que o hidrato de carbono do grupo A. Uma vez que o hidrato de carbono da variante do grupo A está contaminado com aproximadamente 4% de N-acetilglucosamina (em comparação com 36% para o hidrato de carbono do grupo A), alguma da inibição detectada podia ser reactiva com a restante N-acetilglucosamina. Isto mostrou que a maioria da imunorreactividade dos soros estava orientada para a porção N-acetilglucosamina, o que se pode observar pela perda de reactividade do anticorpo para o grupo A, no ensaio ELISA, pela adição de N-acetilglucosamina purificada (Sigma). Isto pode ser comparado directamente com á perda de qualquer inibição, pela adição do monossacárido intimamente relacionado N-acetilgalactosamina.

Exemplo 4

Comparação de títulos de anticorpo anti-hidrato de carbono do grupo A em pacientes de ARF versus APSGN: Para determinar se os títulos de anticorpo anti-hidrato de carbono do grupo A diferiam em pacientes com sequelas pós-estreptococos bem documentadas, compararam-se amostras de soro obtidas de pacientes com febre reumática aguda (ARF), com soros obtidos de pacientes com glomerulonefrite aguda pós-estreptococos (APSGN). Obtiveram-se todos os soros de pacientes hospitalizados com ARF e AGN bem documentadas em Trinidad e foram recolhidos antes do tratamento durante os estágios agudos da doença. O Quadro III resume os resultados e pode-se observar que houvia uma reactividade aumentada com o hidrato de carbono do grupo A nos soros de pacientes com APSGN (<50%) em comparação com pacientes com ARF no início da doença. Quando comparado com crianças normais em Trinidad, houve também uma diferença significativa nos títulos entre esses pacientes e os títulos de crianças normais em Trinidad (ver Fig. 2).

85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 27 QUADRO 1111 Títulos médios de anticorpos anti-hidrato de carbono nos soros de pacientes com APSGN, ARF, e febre escarlatina sem complicações. Série de Great Lake

Pacientes Número Títulos médios no inicio Títulos médios 4 semanas mais tarde Febre 6 8838 18050 escarlatina ARF 5 • 2045 7950 Série de Trinidad Pacientes Número Títulos médios ARF 19 202300 APSGN 18 299900

Exemplo 5

Determinação de títulos de anticorpo anti-hidrato de carbono do qruoo A em pacientes com infeccões provocadas por estreptococos sem complicações versus com ARF: Obtivemos a nossa colecção de soros de Great Lakes de pacientes, dos quais todos contraíram febre escarlatina na estação Great Lakes naval Training Station em 1946. Uma fracção desses pacientes evoluiu para o desenvolvimento de ARF clássica. Em conformidade, seleccionaram-se soros desses pacientes da seguinte forma: 1) durante o início agudo de febre escarlatina, 2) durante o estádio de convalescência da febre escarlatina (4 semanas mais tarde) ou 3) durante o inicio de ARF (3 a 4 semanas) após a infecção aguda por estreptococos. O Quadro III demonstra que, num pequeno número de casos, a reactividade com o hidrato de carbono do grupo A aumentou durante os estágios de convalescência da doença, em comparação com o início (definido como a altura da apresentação de febre escarlatina). Estes aumentos no título de anticorpo para o hidrato de carbono do grupo A foram observados tanto nos grupos de febre escarlatina sem complicações como também nos pacientes que desenvolveram ARF, 4 semanas após o inicio de febre escarlatina. Uma vez que o número de casos estudados foi pequeno, é interessante que 4 semanas depois os títulos para o hidrato de carbono do grupo A tenham sido inferiores em pacientes com ARF, tanto no inicio da febre escarlatina, como no inicio de febre reumática, em comparação com os casos de febre escarlatina sem complicações.

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Exemplo 6

Conjugados proteína-polissacárido do grupo A A. Redução com NaBH4 dos terminais susceptíveis de redução do polissacárido do grupo A.

Dissolveu-se polissacárido do grupo A (GASP) purificado (100 mg) em 10 ml de água e ajustou-se o pH da solução para 10 com NaOH 0,5 N. Adicionou-se NaBH4 sólido (100 mg) à solução e após a incubação da mistura reaccional, à temperatura ambiente, durante duas horas, destruiu-se o excesso de boro-hidreto com AcOH 1 M. Fez-se a diálise da solução contra água no frio e liofilizou-se, produzindo 91 mg de GASP reduzido. B. Introdução de um aldeído terminal no polissacárido do grupo A por oxidação controlada com periodato.

Dissolveu-se o GASP reduzido (90 mg) em 4,5 ml de água e depois combinou-se com 4,5 ml de Nal04 50 mM. Após 30 minutos à temperatura ambiente, destruiu-se o excesso de periodato pela adição de 1 ml de etileno-glicol e submeteu-se a solução a diálise, contra água, no frio e liofilizou-se, produzindo 73 mg de GASP oxidado.

C. Conjugados GASP-TT e GASP-HSA

Ligou-se o GASP oxidado, ou a toxóide do tétano monomérico (TT) (SSI, Copenhaga, Dinamarca), ou a albumina de soro humano (HSA) (Sigma), por aminação redutora com NaBH3CN.

Dissolveu-se GASP oxidado (40 mg) e TT monomérico (20 mg) ou HSA (20 mg) em tampão de fosfato 0,2 M, pH 7,4 (0,7 ml). Após a adição de

NaBH3CN (20 mg), incubou-se a mistura reaccional a 37°C, durante 4 dias. Monitorizou-se o desenvolvimento da conjugação por HPLC de pequenas porções alíquotas da mistura reaccional, analisadas em Superose-12 (Pharmacia). Purificaram-se os conjugados por cromatografia numa coluna de Superdex G-200 (Pharmacia) usando PBS como eluente. Monitorizaram-se as fracções que eluiram da coluna por um refractómetro diferencial Waters R403 e por Espectroscopia de U.V. a 208 nm. Juntaram-se as fracções que continham os conjugados de polissacárido do grupo A, submeteram-se a diálise e a liofilização. Estimou-se o teor de proteína dos conjugados pelo método de

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Bradford (Bradford, Μ. Μ., 1976. Anal. Biochem. 72:248-254) com albumina de soro humano como padrão. Mediu-se o teor de hidrato de carbono pelo método de Dubois et ai (31) com GASP purificado como padrão. O conjugado de TT continha 39% (p/p) de hidrato de carbono e 61% (p/p) de proteína. Assumindo um peso molecular médio de 10 quilodalton para o polissacárido (como se determinou por HPLC em Superose-12 usando dextranos como marcadores de peso molecular e como se mediu por dispersão de laser como marcadores de peso molecular) e um peso molecular de 1 50 quilodalton para o TT monomérico, o conjugado GASP-TT tinha uma razão molar de polissacárido para TT de 9-10:1, respectivamente.

Exemplo 7

Imunizações e imunoensaios A. Procedimentos de imunização

Vacinou-se subcutaneamente um grupo de cinco fêmeas de coelho branco, da nova Zelândia (7-8 semanas de idade), em dois locais no dorso (três vezes, com intervalos de três semanas) com 10 mcg de polissacárido do grupo A nativo não acoplado ou na forma de conjugado com TT, num volume total de 0,5 ml. Administraram-se as vacinas, quer absorvidas quer não absorvidas em oxi-hidróxido de alumínio (Alhydrogel; Superfos, Dinamarca), quer em esteariltirosina (ST), sempre em concentrações de 1,0 mg em alúmen ou ST/ml de solução salina. Adicionou-se timerosal às vacinas, a uma concentração final de 1/ 10000. Um grupo de cinco coelhos recebeu a vacina de conjugado, emulsionado em adjuvante de Freund completo (Sigma Laboratories), para a primeira injecção e em adjuvante de Freund incompleto para as injecções de reforço seguintes. Recolheu-se o soro de cada animal nos dias 0, 21,42 e 52.

B. ELISA

Revestiram-se placas de microtitulação (placas Nunc Polysorb de ELISA) com 100 ng de conjugado GASP-HSA diluído para 1,0 mcg/ml em PBS e incubaram-se as placas a 37°C, durante uma hora. Após o revestimento, lavaram-se com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBS-T) e bloquearam-se com BSA a 0,5% em PBS, durante uma hora, à temperatura ambiente. Encheram-se então os poços com 100 μΙ de diluições duplas em série, em PBS-T de anti-soro de coelho, e incubaram-se as placas durante uma hora, à 30 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ temperatura ambiente. Após lavagem com PBS-T, incubaram-se as^lâtas durante 30 minutos à temperatura ambiente com 100 μΙ de IgG de cabra anti-coelho marcada com peroxidase (H&L) (Kirkegaard & Perry Laboratories) e depois lavaram-se cinco vezes com PBS-T. Finalmente, adicionaram-se 50 μΙ de substracto de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) a cada poço e depois de se incubarem as placas durante 10 minutos, à temperatura ambiente, parou-se a reacção adicionando 50 μΙ de H3P04 1 M. Leram-se as placas a 450 nm com um leitor de microplacas Molecular Devices Emax usando como comprimento de onda de referência 650 nm (ver Quadro IV).

Embora tivéssemos anteriormente descrito várias concretizações deste invento, é obvio que as construções básicas podem ser alteradas para proporcionar outras concretizações que utilizem os métodos deste invento. Deste modo, verificar-se-á que o - âmbito deste invento é definido pelas reivindicações aqui anexadas e não pelas concretizações específicas que aqui se apresentaram antes, como exemplos.

QUADRO IV Títulos de anticorpo específico para polissacárido GAS de coelhos vacinados com polissacárido GAS ou conjugado polissacárido GAS-toxóide do tétano em várias formulações.

Vacina Título de anticorpo em ELISA no dia* 0 21 42 52 GASP (Solução salina) 100 100 100 100 GASP-TT (Solução salina) 100 100 4130 (900-12000) 7600 (2600-13500) GASP-TT (AI(OH)3) 100 10600 (4800-21000) 81800 (51000-129000) 141800 (76700-287500) GASP-TT (ST) 100 6200 (2300-12700) 21100 (8300-31000) 59600 (21300-95500) GASP-TT (CFA, IFA) 100 188000 (2200-428500) 1664000 (1000000-2299000) 1760000 (1100000-2370000) * Média geométrica do título (gama) com um valor de 100 indicando um título de anticorpos á100. Os valores são as médias de determinações em duplicado. Injectaram-se s.c. coelhos (grupos de 5 NZW) com 100 mcg de polissacárido (nativo ou conjugado) no dia 0, 21 e 42. 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 31

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Claims (51)

1. 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 1/8 REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo uma quantidade imuno-génica de polissacárido do grupo A de formula (I): [-2) -a-L-Rhap- (1-3) -a-L-Rhap- (1-] α---R; 3 ' ' t 1 β-D-GlcpNAC onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução; onde n é um número de cerca de 3 a cerca de 30, e um transportador, onde a dita composição proporciona protecção em mamíferos contra infecções provocadas por bactérias estreptocócicas do grupo A
2. 2. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, onde o polissacárido do grupo A tem um peso molecular de cerca de 10 Kd.
3. . 3. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, onde se selecciona o transportador do grupo que consiste em solução salina, solução de Ringer, solução salina tamponada com fosfato.
4. 4. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 3, onde a composição imunogénica compreende ainda um adjuvante.
5. 5. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 4, onde se selecciona o adjuvante do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, monofosforil-lípido A, QS21 e esteariltirosina.
6. 6. Molécula de conjugado imunogénico polissacárido-proteína que induz a produção em mamíferos de anticorpos opsónicos que são bactericidas na presença de complemento e fagócitos, compreendendo a dita molécula de conjugado um polissacárido do grupo A de formula (I) [-2) -a-L-Rhap- (1-3) -a-L-Rhap- (1-] n---R; 3 t .1 β-D-GlcpNAC (I)

   85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 2/8 onde R é D-G!cpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, e n é um número de cerca de 3 a cerca de 30 e, onde o polissacárido se liga por covalência à proteína.
7. 7. Conjugado imunogénico poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 6, onde o polissacárido se liga a proteína através de uma ligação de amina secundária para formar um conjugado de formula (II) [-*2) -α-L-Riiao- (1-3 ) -or-L-Rhao- (1-] _---R' -CH,-NH-proteÍR 3 ‘ ‘ dl) t 1 B-D-GlcpNAc onde R' é o produto da redução e da oxidação do açúcar terminal susceptível de redução que - não está representado na ligação de amina secundária -CH2-NH-proteína de formula II.
8. 8. Conjugado imunogénico poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 7, onde a proteína é qualquer proteína bacteriana, nativa ou recombinante.
9. 9. Conjugado imunogénico poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 8, onde a proteína é seleccionada do grupo que consiste em toxóide do tétano, toxina da cólera, toxóide da difteria ou CRM197.
10. 10. Conjugado imunogénico poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 9, onde a proteína é toxóide do tétano.
11. 11. Conjugado imunogénico poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 10, onde o polissacárido tem um peso molecular de cerca de 10 kd.
12. 12. Conjugado poiissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 6, onde a proteína do conjugado compreende um epítopo de células T e tem um comprimento de pelo menos cerca de 10 aminoácidos.

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13. 13. Vacina para proporcionar protecção contra infecções por estreptococos do grupo A compreendendo uma quantidade imunogénica de polissacárido do grupo A de formula (I) [-2) -c-L-Rhap- (1-3) -c-L-Rhap- (1-] n--R; 3 t (I) 1 Ô-D—GlcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, e n é um número de cerca de 3 a cerca de 30, e um transportador, onde a dita composição proporciona protecção em mamíferos contra infecções por bactérias estreptocócicas do grupo A.
14. 14. Vacina de acordo com a reivindicação 13, onde o polissacárido se liga por covalência à proteína.
15. 15. Vacina de acordo com a reivindicação 13, onde o polissacárido se liga à proteína através de uma ligação de amina secundária para formar um conjugado de fórmula (II) [—2) -α-L-Rhap- (1—3) -or-L-Rhap- (1—] n---R' -CH,-NH-protein í dl) 1 Ô-D—GlcpNAc onde R' é o produto da redução e da oxidação do açúcar terminal susceptível de redução que não está representado na ligação amina secundária -CH2-NH-proteína de fórmula II.
16. 16. Vacina de acordo com a reivindicação 15, onde a proteína é qualquer proteína bacteriana nativa ou recombinante.
17. 17. Vacina de acordo com a reivindicação 16, onde se selecciona a proteína do grupo que consiste em toxóide do tétano, toxina da cólera, toxóide da difteria, e CRM197.
18. 18. Vacina de acordo com a reivindicação 17, onde a proteína do conjugado polissacárido-proteína é toxoide de tétano.

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19. 19. Vacina de acordo com a reivindicação 18, onde o polissacárido no conjugado tem um peso molecular de cerca de 10 Kd.
20. 20. Molécula de conjugado imunogénico polissacárido-lipossoma compreendendo um polissacárido do grupo A de fórmula (I) [-2) -e-L-Rhao- (1-3) -α-L-Rhap- (1-] B---R ? : ? . 1 ô-D-GlcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, e n é um número de cerca de 3 a cerca de 30, ligado por covalência a lipossomas para formar moléculas de conjugado.
21. 21. Conjugado polissacárido-lipossoma de acordo com a reivindicação 20, onde os lipossomas são construídos a partir de lípidos catiónicos.
22. 22. Conjugado polissacárido-lipossoma de acordo com a reivindicação 21, onde os lipossomas são constituídos por fosfatidiletanolamina.
23. 23. Conjugado polissacárido-lipossoma de acordo com a reivindicação 22, onde o polissacárido do grupo A tem um peso molecular de cerca de 10 Kd.
24. 24. Conjugado de acordo com a reivindicação 20, onde o conjugado lipossoma-polissacárido compreende ainda proteína embutida no dito lipossoma.
25. 25. Vacina de acordo com a reivindivação 13, onde o polissacárido se liga por covalência a lipossomas.
26. 26. Vacina de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda proteína bacteriana, nativa ou recombinante, embutida nos lipossomas.
27. 27. Vacina de acordo com a reivindicação 26, onde a proteína bacteriana é toxóide do tétano.

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28. 28. Vacina de acordo com a reivindicação 25, onde a composição polissacárido-lipossoma da vacina tem um peso molecular de cerca de 10 Kd.
29. 29. Composição imunogénica para conferir imunidade passiva contra bactérias estreptocócicas do grupo A, compreendendo a dita composição imunogénica anticorpos opsónicos que são bactericidas na presença de complemento e fagócitos contra bactérias estreptocócicas do grupo A e onde os ditos anticorpos são a) obtidos de um mamífero e b) se ligam ao polissacárido de bactérias estreptocócicas do grupo A de fórmula (I) [-2) -c-L-Rhap- (1—3) -cr-L-Rhap- (1-] n---R ? 3 W • ' t '1 β-D-GlcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, e n é um número de cerca de 3 a cerca de 30.
30. 30. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 29, onde os anticorpos bactericidas se encontram presentes em soro, numa fracção de gama-globina ou numa preparação de anticorpos purificados.
31. 31. Método para ligar por covalência polissacárido do grupo A de fórmula I [-2) -cr-L-Rhap- (1-3) -cr-L-Rhap- (1-J n---R; 3 (D T 1 ô—D—GlcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, e n é um número de unidades de repetição de cerca de 3 a cerca de 30, a um lipossoma compreendendo fosfatidiletanolamina que compreende: a) formar lipossomas de fosfatidiletanolamina; b) activar polissacárido do grupo A reduzindo o açúcar terminal e oxidando o açúcar reduzido para formar um aldeído terminal; c) combinar o polissacárido do grupo A activado e os lipossomas e ligar por covalência o polissacárido do grupo A ao lipossoma,

    85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 6/8 por aminação redutora, para formar um conjugado lipossoma-polissacárido do grupo A; e d) recuperar o conjugado lipossoma-polissacárido do grupo A.
32. 32. Utilização da composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 para o fabrico de um medicamento para proteger mamíferos contra infecções provocadas por bactérias estreptocócicas do grupo A.
33. 33. Utilização da composição imunogénica de acordo com a reivindicação 32, em que se administra a dita composição imunogénica a um indivíduo numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal.
34. 34. Utilização da molécula de conjugado imunogénico polissacárido-proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 12 para o fabrico de um medicamento para induzir a produção de anticorpos opsónicos em mamíferos, que são bactericidas na presença de complemento e fagócitos.
35. 35. Utilização da molécula de conjugado imunogénico polissacárido-proteína de acordo com a reivindicação 34, em que se administra o dito conjugado imunogénico polissacárido-proteína a um indivíduo numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 μg a cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal.
36. 36. Utilização da vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 3 a 1 9 para o fabrico de um medicamento para protecção contra infecções provocadas por estreptococos do grupo A.
37. 37. Utilização da vacina de acordo com a reivindicação 36, em que se administra a dita vacina a um indivíduo numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal.
38. 38. Utilização da molécula de conjugado imunogénico polissacárido-lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24 para o fabrico de um medicamento para protecção contra infecções provocadas por bactérias estreptocócicas do grupo A. 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 7/8
39. 39. Utilização da molécula de conjugado imunogénico polissacárido-lipossoma de acordo com a reivindicação 38, em que se administra a dita molécula de conjugado imunogénico polissacárido-lipossoma a um indivíduo numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 ,ug a cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal.
40. 40. Utilização da vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28 para o fabrico de um medicamento para protecção contra infecções provocadas por estreptococos do grupo A.
41. 41. Utilização da vacina de acordo com a reivindicação 40, em que se administra a dita vacina a um indivíduo numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg por-quilograma de peso corporal.
42. 42. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 29, onde se produzem os ditos anticorpos imunizando um indivíduo com qualquer das composições imunogénicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6, 13 e 20.
43. 43. Composições imunogénicas de acordo com a reivindicação 29, em que os anticorpos são obtidos a partir do soro de um indivíduo.
44. 44. Composições imunogénicas de acordo com a reivindicação 43, em que os anticorpos são isolados de soros humanos possuindo um título superior a cerca de 40000.
45. 45. Composições imunogénicas de acordo com a reivindicação 44, em que os anticorpos são isolados de soros humanos possuindo um título superior a cerca de 200000.
46. 46. Composição farmacêutica compreendendo a composição imunogénica de acordo com a reivindicação 29 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
47. 47. Utilização de anticorpos que contribuem para uma resposta bactericida na presença de complemento e fagócitos e que se obtém a partir de 85 672 ΕΡ Ο 754 055/ΡΤ 8/8 um mamífero e se ligam a polissacáridos de bactérias estreptocócicas do grupo A de formula (I) [-2) -c-L-Rhap- (1"*3) -a-L-Rhap- (1-*] n---H.1

    Ô-D-GlcpNAc onde R é D-GIcpNAc ou L-ramnose terminal susceptível de redução, n é um número de cerca de 3 a cerca de 30, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir infecções provocadas por bactérias estreptocócicas do grupo A.
48. 48. Utilização dos anticorpos de acordo com a reivindicação 47, em que os anticorpos são obtidos de um indivíduo.
49. 49. Utilização de anticorpos de acordo com a reivindicação 47, em que os anticorpos para preparar a composição farmacêutica estão presentes em soro, fracção de gama-globulina, ou numa preparação de anticorpos purificada.
50. 50. Utilização de anticorpos de acordo com a reivindicação 49, em que a composição farmacêutica compreende um anticorpo derivado de soros humanos possuindo um título superior a cerca de 40000.
51. 51. Utilização de anticorpos de acordo com a reivindicação 50, em que a composição farmacêutica compreende um anticorpo derivado de soros humanos possuindo um título superior a cerca de 200000. Lisboa, ^ ‘••'J·· 2u:jQ Por THE ROCKEFELLER UNIVERSITY e NORTH AMERICAN VACCINE, INC. - O AGENTE OFICIAL -