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PT2046833E - Anticorpo humanizado contra amilóide beta - Google Patents

Anticorpo humanizado contra amilóide beta Download PDF

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Publication number
PT2046833E
PT2046833E PT78404084T PT07840408T PT2046833E PT 2046833 E PT2046833 E PT 2046833E PT 78404084 T PT78404084 T PT 78404084T PT 07840408 T PT07840408 T PT 07840408T PT 2046833 E PT2046833 E PT 2046833E
Authority
PT
Portugal
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antibody
fragment
amino acid
amyloid
seq
Prior art date
Application number
PT78404084T
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Pihlgren
Andreas Muhs
Ryan Watts
Andrea Pfeifer
Original Assignee
Genentech Inc
Ac Immune Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49474825&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT2046833(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc, Ac Immune Sa filed Critical Genentech Inc
Publication of PT2046833E publication Critical patent/PT2046833E/pt

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Description

ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Anticorpo humanizado contra amilóide beta" A presente invenção refere-se a anticorpos e composições para o tratamento de amiloidose, um grupo de desordens e anomalias associadas com a proteina amilóide tais como a doença de Alzheimer. A amiloidose não é uma entidade de doença única mas sim um grupo diversificado de processos de doença progressiva caracterizados por depósitos de tecidos extracelulares de uma proteina cerosa, semelhante ao amido, denominada amilóide, que se acumula em um ou mais órgãos ou sistemas corporais. Como os depósitos de amilóide se acumulam, começam a interferir com o funcionamento normal do órgão ou do sistema corporal. Existem pelo menos 15 diferentes tipos de amiloidose. As principais formas são amiloidose primária sem antecedentes conhecidos, amiloidose secundária subsequente a alguma outra condição, e amiloidose hereditária. A amiloidose secundária ocorre durante a infecção ou a doença inflamatória crónicas, tal como tuberculose, uma infecção bacteriana denominada febre mediterrânica familiar, infecções ósseas (osteomielite) , artrite reumatóide, inflamação do intestino delgado (ileite granulomatosa), doença de Hodgkin e lepra.
Os depósitos de amilóide incluem a componente amilóide P (pentagonal) (AP), uma glicoproteína relacionada com amilóide P sérica normal (SAP), e glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), hidratos de carbono complexos de tecido conjuntivo. As fibrilhas de proteína amilóide, que contabilizam cerca de 90% do material amilóide, compreendem um de vários tipos de proteínas diferentes. Estas proteínas são capazes de se dobrar nas denominadas fibrilhas em folha "beta-pregueada", uma configuração única de proteína que exibe locais de ligação para o vermelho do Congo que resultam nas propriedades de coloração únicas da proteína amilóide. 2
ΕΡ 2 046 833/PT
Muitas doenças do envelhecimento são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide e são caracterizadas, em parte, pela acumulação de depósitos extracelulares de material amilóide ou do tipo amilóide que contribuem para a patogénese, assim como para a progressão da doença. Estas doenças incluem, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam. Outras doenças que são baseadas em, ou associada a proteínas do tipo amilóide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Inicio no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular.
Embora a patogénese destas doenças possa ser diversa, os seus depósitos característicos frequentemente contêm muitos constituintes moleculares partilhados. Num grau significativo, isto pode ser atribuível à activação local de vias pró-inflamatórias, desse modo conduzindo à deposição simultânea de componentes do complemento activados, reagentes de fase aguda, moduladores imunitários, e outros mediadores inflamatórios (McGeer et al., 1994). A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurológica que primeiro se pensou ser causada por placas amilóides, uma acumulação de depósito anormal de proteínas no cérebro. O tipo mais frequente de amilóide encontrado no cérebro de indivíduos afectados é composto principalmente por fibrilhas A/3. A evidência científica demonstra que um aumento na produção e na acumulação de proteína beta-amilóide em placas conduz à morte de células nervosas, o que contribui para o desenvolvimento e para a progressão da DA. A perda de células nervosas em áreas estratégicas do cérebro, por sua vez, causa redução dos neurotransmissores e prejuízo da memória. As proteínas principalmente responsáveis pela acumulação da placa incluem a proteína precursora de amilóide (APP) e duas presenilinas (presenilina I e presenilina II) . A clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP), que é constitutivamente expressa e catabolizada na maioria das células, pelas 3 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ enzimas secretase β e γ, conduz à libertação de um péptido A/3 de 39 a 43 aminoácidos. A degradação das APP aumenta provavelmente a sua propensão para se agregar em placas. É especialmente o fragmento A/3(l-42) que tem uma elevada propensão para a construção de agregados devido a dois residuos de aminoácido muito hidrófobos no seu terminal C. Crê-se portanto que o fragmento A/3(l-42) está principalmente envolvido, e é responsável pelo inicio da formação de placas neuriticas na DA e que tem, portanto, um elevado potencial patológico. Existe portanto uma necessidade de agentes para prevenir a formação de placas amilóides e para difundir as placas existentes na DA.
Os sintomas da DA manifestam-se lentamente e o primeiro sintoma pode ser meramente esquecimento moderado. Neste estádio, os indivíduos podem esquecer eventos recentes, actividades, os nomes de pessoas ou coisas familiares e podem não ser capazes de resolver problemas matemáticos simples. À medida que a doença progride, os sintomas são mais facilmente notados e tornam-se suficientemente sérios para fazer com que as pessoas com DA ou os membros da sua familia procurem auxilio médico. Os sintomas do estádio moderado da DA incluem esquecimento de como desempenhar tarefas simples tais como vestir-se, e desenvolvem-se problemas com a fala, o entendimento, a leitura ou a escrita. Nos estádios mais tardios da DA os pacientes podem tornar-se ansiosos ou agressivos, podem deambular afastando-se de casa e finalmente necessitarem de cuidados totais.
Presentemente, a única maneira definitiva de diagnosticar a DA é identificar placas e emaranhados no tecido cerebral numa autópsia após a morte do indivíduo. Portanto, os médicos apenas podem fazer um diagnóstico de "possível" ou "provável" DA enquanto a pessoa ainda estiver viva. Utilizando os métodos actuais, os médicos podem diagnosticar a DA correctamente até 90 porcento das vezes utilizando várias ferramentas para diagnosticar DA "provável". Os médicos fazem perguntas acerca da saúde geral da pessoa, de problemas médicos anteriores e do historial de quaisquer dificuldades que a pessoa esteja a enfrentar nas actividades diárias. Testes comportamentais de memória, resolução de problemas, atenção, contagem e linguagem, proporcionam informação sobre a degeneração 4 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ cognitiva e testes médicos tais como testes de sangue, urina ou fluido espinal, e explorações do cérebro podem proporcionar alguma informação adicional. A gestão da DA consiste em tratamentos à base de medicação e sem ser à base de medicação. Tratamentos com o objectivo de alterar o decurso subjacente da doença (retardar ou inverter a progressão) têm sido até agora largamente mal sucedidos. Foi demonstrado que os medicamentos que restabelecem o défice (defeito), ou mau funcionamento, nos mensageiros químicos das células nervosas (neurotransmissores) , em particular os inibidores de colinesterase (ChEI) tais como tacrina e rivastigmina, melhoram os sintomas. Os ChEI impedem a degradação enzimática de neurotransmissores, desse modo aumentando a quantidade de mensageiros químicos disponíveis para transmitir os sinais nervosos no cérebro.
Para algumas pessoas nos estágios iniciais e médios da doença, os fármacos tacrina (COGNEX®, Morris Plains, NJ), donepezil (ARICEPT®, Tokyo, JP) , rivastigmina (EXELON®, East Hanover, NJ) ou galantamina (REMINYL®, New Brunswick, NJ) podem ajudar a prevenir que alguns sintomas se agravem durante um tempo limitado. Outro fármaco, memantina (NAMENDA®, New York, NY) , foi aprovado para o tratamento de DA moderada a grave. Estão também disponíveis medicações para abordar as manifestações psiquiátricas da DA. Também, alguns medicamentos podem ajudar a controlar sintomas comportamentais da DA tais como falta de sono, agitação, deambulação, ansiedade e depressão. 0 tratamento destes sintomas põe frequentemente os pacientes mais confortáveis e torna os seus cuidados mais fáceis para os cuidadores. Infelizmente, apesar de avanços significativos no tratamento mostrarem que esta classe de agentes é consistentemente melhor do que um placebo, a doença continua a progredir, e o efeito médio sobre o funcionamento mental tem sido apenas modesto. Muitos dos fármacos utilizados na medicação para a DA tais como, por exemplo, os ChEI, têm também efeitos secundários que incluem disfunção gastrointestinal, toxicidade hepática e perda de peso. 5
ΕΡ 2 046 833/PT
Outra doença que é baseada em, ou está associada a, acumulação e depósito de proteina do tipo amilóide é a degenerescência macular. A degenerescência macular é uma doença comum do olho que causa a deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido fino como papel no fundo do olho onde as células sensíveis à luz enviam sinais visuais para o cérebro). A visão nítida, clara, 'em frente', é processada pela mácula. Danos na mácula resultam no desenvolvimento de pontos de cegueira e visão turva ou distorcida. A degenerescência macular relacionada com a idade (DMRI) é uma importante causa de perda visual nos Estados Unidos e para pessoas com mais de 65 anos de idade é a principal causa de cegueira legal entre os caucasianos. Aproximadamente 1,8 milhões de americanos com idade de 40 e mais anos têm DMRI avançada, e outros 7,3 milhões de pessoas com DMRI intermédia têm um risco substancial de perda de visão. O governo estima que em 2020 haverá 2,9 milhões de pessoas com DMRI avançada. As vítimas de DMRI são frequentemente surpreendidas e ficam frustradas ao perceber quão pouco se conhece acerca das causas e do tratamento desta condição que conduz a cegueira.
Existem duas formas de degenerescência macular: degenerescência macular atrófica (ou seca) e degenerescência macular exsudativa (ou húmida). A forma atrófica, em que as células da mácula começam lentamente a quebrar-se, é diagnosticada em 85 porcento dos casos de degenerescência macular. Ambos os olhos são usualmente afectados pela DMRI atrófica, embora um olho possa perder a visão enquanto o outro olho permanece não afectado. Os drusen, que são depósitos amarelos sob a retina, são sinais iniciais comuns de DMRI atrófica. O risco de desenvolvimento de DMRI atrófica avançada ou DMRI exsudativa aumenta à medida que o número ou a dimensão dos drusen aumentam. É possível a DMRI atrófica avançar e causar perda de visão sem se tornar na forma exsudativa da doença; contudo, é também possível a DMRI atrófica em estádio inicial se alterar subitamente para a forma exsudativa. A forma exsudativa, embora contabilize apenas 15 porcento dos casos, resulta em 90 porcento da cegueira, e é considerada DMRI avançada (não existem os estádios inicial ou intermédio 6 ΕΡ 2 046 833/PT de DMRI exsudativa). A DMRI exsudativa é sempre precedida pela forma atrófica da doença. À medida que a forma atrófica se agrava, algumas pessoas começam a ter vasos sanguíneos anormais a crescer por detrás da mácula. Esses vasos são muitos frágeis e irão derramar fluido e sangue (e por isso a degenerescência macular "húmida" ou "exsudativa"), causando rápidos danos na mácula. A forma atrófica de DMRI irá com frequência causar inicialmente visão ligeiramente turva. O centro da visão em particular pode então ficar turvo e esta região crescer alargando-se à medida que a doença progride. Podem não ser notados sintomas se apenas um olho estiver afectado. Na DMRI exsudativa, linhas rectas podem parecer onduladas e pode ocorrer rapidamente perda de visão central. O diagnóstico da degenerescência macular envolve tipicamente um exame ao olho dilatado, teste da acuidade visual, e um visionamento do fundo do olho utilizando um procedimento denominado fundoscopia para auxiliar o diagnóstico da DMRI, e, se houver suspeita de DMRI exsudativa, pode também ser realizada uma angiografia com fluoresceína. Se a DMRI atrófica atingir os estádios avançados, não existe actualmente tratamento para prevenir a perda de visão. Contudo, uma fórmula específica de dose elevada de antioxidantes e zinco pode retardar ou prevenir a progressão da DMRI intermédia para o estádio avançado. O Macugen® (injecção com pegaptanib de sódio), a fotocoagulação com laser e a terapia fotodinâmica, podem controlar o crescimento de vasos sanguíneos anormais e o sangramento na mácula, o que é útil para algumas pessoas que têm DMRI exsudativa; contudo, a visão que já está perdida não será restabelecida através destas técnicas. Se a visão já está perdida, existem auxiliares de visão inferiores que podem ajudar a melhorar a qualidade de vida.
Um dos sinais mais precoces da degenerescência macular relacionada com a idade (DMRI) é a acumulação de depósitos extracelulares conhecidos como drusen entre a lâmina basal do epitélio retinal pigmentado (RPE) e membrana de Bruch (BM) . Estudos recentes conduzidos por Anderson et al. confirmaram 7
ΕΡ 2 046 833/PT que os drusen contêm beta-amilóide. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256) .
Investigações decorrentes continuam com estudos que exploram factores ambientais, genéticos e dietéticos que possam contribuir para a DMRI. Novas estratégias de tratamento estão também a ser exploradas, incluindo transplantes de células retinais, fármacos que irão prevenir ou retardar a progressão da doença, terapia de radiação, terapias génicas, um chip de computador implantado na retina que pode auxiliar a estimular a visão e agentes que irão prevenir o crescimento de novos vasos sanguíneos sob a mácula.
Um importante factor a considerar quando se desenvolvem novos fármacos é a facilidade de utilização pelos pacientes alvo. A entrega oral de fármacos, especificamente comprimidos, cápsulas e géis moles, contabilizam 70% de todas as formas de dosagem consumidas devido à conveniência do paciente. Quem desenvolve fármacos concorda que os pacientes preferem a entrega oral a submeter-se a injecções ou outras formas mais invasivas de administração de medicamentos. As formulações que resultam em intervalos de dosagem mais longos (i.e. uma vez por dia ou libertação sustentada) são também preferidas. A facilidade de administração de antibióticos em formas de dosagem oral resulta num aumento da aceitação pelo paciente durante o tratamento.
Do que se necessita é de métodos e composições eficazes para a prevenção ou abordagem das complicações associadas a amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de
Alzheimer (DA), demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica) , Diabetes com Início no
Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e 8 ΕΡ 2 046 833/PT outras, incluindo degenerescência macular. Em particular, do que se necessita é de agentes capazes de contrariar as manifestações fisiológicas da doença tais como a formação de placas associadas a agregação de fibras do péptido amilóide ou tipo amilóide.
Anticorpos anti-amilóide eliciados pela inoculação de A/3i_42 misturada com adjuvante completo ou incompleto de Freund foram reportados como redutores da carga amilóide em ratinhos transgénicos para a doença de Alzheimer humana (Schenk et ai., 1999). A inoculação intraperitoneal de A/3i_i6 tetrapalmitoílada reconstituída em lipossomas em ratinhos transgénicos NORBA eliciou titulos significativos de anticorpos anti-amilóide, e foi reportado que solubilizavam fibras e placas amilóides in vitro e in vivo. (Nicolau et ai., 2002).
Liu et ai., (2004) Biochemistry, 43(22):6959-6967 divulgam que um fragmento de anticorpo anti-/3-amilóide de cadeia única variável dirigido contra a região 17-28 inibe in vitro a agregação de β-amilóide e a citotoxicidade da β-amilóide. WO 00/72880 A2 divulga um anticorpo anti-p-amilóide (o anticorpo 266), que reconhece o epítopo 13-28 da β-amilóide, que reduz os niveis de β-amilóide total no cerebelo de ratinhos. WO 01/62801 A2 divulga um anticorpo antί-β-amilóide humanizado do anticorpo 266 e sugere que anticorpos que se ligam a β-amilóide entre as posições 13 e 28 (e.g., 266 e 4G8) são capazes de sequestrar formas solúveis de β-amilóide das suas formas ligadas, circulantes no sangue sem ligação com grande afinidade a β-amilóide agregada. WO 2006/066171 AI divulga um anticorpo antί-β-amilóide (15C11) que se liga à região central da β-amilóide (i.e., aminoácidos 17-24) e se liga a espécies oligoméricas de β-amilóide mas não parece ligar-se a monómeros de β-amilóide.
Nenhuma destas referências divulga um anticorpo anti-β-amilóide possuindo as propriedades estruturais e físicas particulares do anticorpo da invenção reivindicada, i.e., um 9 ΕΡ 2 046 833/PT anticorpo anti^-amilóide que possui uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:15 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:12, que se pode ligar tanto a fibras de β-amilóide como a monómeros solúveis, e é capaz de inibir a agregação de β-amilóide e desagregar fibras/agregados de amilóide.
Um possível mecanismo através do qual a dissolução de placas e fibras amilóides ocorreu foi primeiro sugerido por Bard et al., (2000), que concluiu que os anticorpos opsonizaram as placas, que foram subsequentemente destruídas pelos macrófagos da microglia. De Mattos et al., (2001) indicaram que um mAb dirigido contra o domínio central de β-amilóide foi capaz de se ligar e sequestrar completamente a amilóide plasmática. Argumentaram que a presença destes mAb na circulação desviou o equilíbrio de Αβ entre o cérebro e o plasma, favorecendo a depuração periférica e o catabolismo em vez da deposição no interior do cérebro. A terapia humana prolongada com anticorpos de roedor pode resultar numa resposta antiglobulina que é detectável em cerca de 8-12 dias após a administração e atinge um pico em cerca de 20-30 dias. Se esta resposta antiglobulina for encontrada, o tratamento tem que ser descontinuado após não mais do que cerca de 10 dias e um novo tratamento numa data posterior fica usualmente proibido pois iria conduzir a um rápido início de uma resposta antiglobulina secundária. Embora os anticorpos de roedor partilhem um grau considerável de conservação de sequência com os anticorpos humanos, existem muitas diferenças da sequência entre os anticorpos de roedor e os humanos, suficientes para os anticorpos de roedor serem imunogénicos nos seres humanos.
Este problema pode ser ultrapassado gerando anticorpos directamente em seres humanos ou através da criação de anticorpos "humanizados' (a.k.a. anticorpos "reformulados"). Os anticorpos humanizados possuem uma sequência de aminoácidos da região variável que contém as CDR derivadas de roedor intercaladas em sequências de esqueleto humanas ou semelhantes a humanas. Como a especificidade do anticorpo humanizado é proporcionada pelas CDR derivadas de roedor, os seus resíduos 10 ΕΡ 2 046 833/PT devem ser utilizados essencialmente inalterados sendo permitidas apenas modificações menores, que não interferem significativamente com a afinidade e a especificidade do anticorpo para com o seu antigénio alvo. Os resíduos de esqueleto podem ser derivados de qualquer primata ou, particularmente, de qualquer região variável humana ou podem ser uma sua combinação e a região variável desenhada resultante será considerada reformulada.
Para maximizar a probabilidade da afinidade ser retida no anticorpo reformulado é importante fazer uma selecção correcta da região de esqueleto. Sabe-se que as sequências de esqueleto servem para suportar as CDR na sua orientação espacial correcta para interacção com o antigénio, e que os resíduos de esqueleto podem por vezes até participar na ligação ao antigénio. De modo a manter a afinidade do anticorpo pelo seu antigénio é vantajoso seleccionar sequências de esqueleto humanas que são mais similares às sequências dos esqueletos de roedor. Pode então ser ainda necessário substituir um ou mais aminoácidos na sequência de esqueleto humana pelo correspondente resíduo no esqueleto de roedor para evitar perdas com a afinidade. Esta substituição pode ser auxiliada por modelação por computador. A presente invenção proporciona novos anticorpos e composições compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente eficazes, nomeadamente anticorpos humanizados incluindo seus fragmentos, possuindo a capacidade de especificamente reconhecer e ligar-se a epítopos específicos de uma gama de antigénios /3-amilóides, que podem ser apresentados ao anticorpo numa forma monomérica, dimérica, trimérica, etc., polimérica, na forma de um agregado, fibras, filamentos ou na forma condensada de uma placa. Os anticorpos permitidos pelos ensinamentos da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com a formação da placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras 11 ΕΡ 2 046 833/PT doenças que são baseadas em, ou associadas com, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular, para citar apenas algumas.
Surpreendentemente, os anticorpos da invenção ligam-se a β-amilóide em várias formas de β-amilóide, incluindo monómeros solúveis, oligómeros e fibrilhas, com elevada afinidade, e inibem a agregação de monómeros em oligómeros/fibrilhas e induzem a desagregação de oligómeros/fibrilhas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à matéria-objecto indicada nas reivindicações. Especificamente, a invenção refere-se a um anticorpo humanizado, ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a proteína β-amilóide, em que o referido anticorpo humanizado ou o seu fragmento compreendem uma Região Variável da Cadeia Pesada (HCVR, do inglês Heavy Chain Variable Region) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, e uma Região Variável da Cadeia Leve (LCVR, do inglês Light Chain Variable Region) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
Mais especificamente, o referido anticorpo humanizado, ou o seu fragmento, compreendem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Preferivelmente, no referido anticorpo humanizado ou no seu fragmento, a Lys C-terminal da região constante da cadeia pesada foi removida. A invenção refere-se ainda a moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleótidos que codificam o anticorpo humanizado, ou o seu fragmento, da invenção, e a vectores de expressão compreendendo as referidas sequências de nucleótidos. Também estão abrangidas células compreendendo os referidos vectores de expressão. 12 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ A invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo humanizado, ou o seu fragmento, da invenção, e opcionalmente compreendendo ainda um transportador farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, a invenção refere-se à utilização do anticorpo humanizado ou do seu fragmento e/ou à composição farmacêutica, para a preparação de um medicamento para prevenção, tratamento ou alivio dos efeitos de amiloidose, tais como amiloidose secundária, amiloidose relacionada com a idade, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo Demência de Guam; doenças baseadas em, ou associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degenerescência macular. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica da invenção, para utilização num método de prevenção, tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, tais como amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam, doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva e esclerose múltipla, doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Início no Adulto, amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degenerescência macular, opcionalmente em que o tratamento do animal, tal como do mamífero ou do ser humano, conduz a um aumento da capacidade de memória cognitiva, à retenção da capacidade de memória cognitiva e/ou à reversão da capacidade de memória cognitiva e a um completo restabelecimento da capacidade de memória cognitiva. 13
ΕΡ 2 046 833/PT A invenção refere-se ainda a um método de determinação da extensão da carga de placa amiloidogénica numa amostra de tecido e/ou numa amostra de fluido corporal compreendendo o teste de uma amostra de tecido ou de uma amostra de fluido corporal quanto à presença de proteína amilóide com o anticorpo humanizado ou o fragmento de anticorpo de acordo com a invenção; a determinação da quantidade de anticorpo ou de fragmento de anticorpo ligados à proteína; e o cálculo da carga de placa na amostra de tecido ou na amostra de fluido corporal.
Está também abrangido pela invenção um kit para detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo, num ou mais recipientes, o anticorpo humanizado ou o seu fragmento de acordo com a invenção, um reagente de detecção e instruções para utilização dos anticorpos. A invenção refere-se ainda a um anticorpo humanizado, ou um seu fragmento, de acordo com a invenção, para utilização na desagregação de fibras em formas monoméricas e poliméricas solúveis.
Adicionalmente, a invenção abrange o anticorpo humanizado ou o seu fragmento de acordo com a invenção, anticorpo ou seu fragmento esses que se destinam a utilização na protecção dos neurónios contra a degradação induzida por Αβ. A invenção também se refere à utilização do anticorpo humanizado ou do seu fragmento de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para prevenção da degeneração de neurónios após exposição a oligómero Αβ.
Numa concretização, a invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, e mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína β-amilóide em que o referido um, os referidos pelo menos dois e os referidos pelo menos três locais de ligação compreendem, cada um, pelo menos um ou dois resíduos de 14 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo.
Em particular, o anticorpo humanizado, ou um seu fragmento, de acordo com a invenção, ligam-se a pelo menos dois, particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína β-amilóide, em que pelo menos dois dos três locais de ligação distintos compreendem pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo e pelo menos um dos três locais de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido.
Os pelo menos dois locais de ligação distintos compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos envolvidos predominantemente na ligação do anticorpo estão localizados em estreita proximidade, um em relação ao outro, no antigénio, separados e/ou flanqueados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor em comparação com os referidos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, desse modo formando um epítopo conformacional descontínuo.
Os pelo menos três locais de ligação distintos compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos e pelo menos um resíduo de aminoácido, respectivamente, que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, estão localizados em estreita proximidade, um em relação ao outro, no epítopo, separados e/ou flanqueados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor em comparação com os resíduos de aminoácido que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, desse modo formando um epítopo conformacional descontínuo.
Em particular, são divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três 15 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ locais de ligação distintos na proteína β-amilóide, em que o referido pelo menos um ou os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos que representam um primeiro local de ligação são -Phe-Phe- embutidos no interior da seguinte sequência nuclear (SEQ ID NO:9): Xaa3 - Phe - Phe - Xaa4 — Xaa5 — Xaa6, em que Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile; Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; Xaas é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, Xaa6 é um residuo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa3, Xaa4, Xaas e Xaa6 não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -Phe-Phe-. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que
Xaa3 é Vai ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa4 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa5 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu;
Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Asp.
Em particular, são divulgados um anticorpo quimérico, ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína β-amilóide, em que os referidos locais de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, 16 ΕΡ 2 046 833/PT respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois residuos de aminoácido consecutivos que representam um primeiro local de ligação são -Phe-Phe- e o pelo menos um resíduo de aminoácido é -His-, embutidos no interior da seguinte sequência nuclear: - Xaai - His - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Phe - Phe - Xaa7 -Xaa8-Xaag-, em que
Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em His, Asn, Gin, Lys e Arg do grupo que Xaa3 é um resíduo de aminoácido consiste em Asn e Gin seleccionado do grupo que Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em His, Asn, Gin, Lys e Arg do grupo que Xaas é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; do grupo que Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe do grupo e Ile que Xaa7 é um resíduo de aminoácido consiste em Ala, Vai, Leu e Ile seleccionado do grupo que Xaa8 é um resíduo de aminoácido consiste em Glu e Asp, seleccionado do grupo que Xaa8 é um resíduo de aminoácido consiste em Glu e Asp, seleccionado do grupo que e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa4, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8 e Xaag, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -His- e o -Phe-Phe-, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que
Xaa3 é Gin ou Asn, mas particularmente Gin;
Xaa4 é Lys Xaa5 é Leu
Xaa6 é Vai ou Leu, mas particularmente Vai; 17
ΕΡ 2 046 833/PT
Xaa7 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaag é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e
Xaa9 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que o referido pelo menos um ou os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos que representam um segundo local de ligação são -Lys-Leu- embutidos no interior da seguinte sequência nuclear (SEQ ID NO:10):
Xaai - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3 em que
Xaai é um resíduo de consiste em His, Asn, aminoácido seleccionado Gin Lys e Arg; do grupo que Xaa2 é um resíduo de consiste em Asn e Gin; aminoácido seleccionado do grupo que Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile; e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -Lys-Leu-. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos locais de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e os pelo menos dois 18 ΕΡ 2 046 833/PT aminoácidos consecutivos, que estão separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor em comparação com os resíduos de aminoácido predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, são -His- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos no interior da seguinte sequência nuclear:
His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3 - Xaa4 - Xaas - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 -em que
Xaa2 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Asn e Gin; do grupo que Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe do grupo e Ile; que Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe do grupo e Ile que Xaa5 é um residuo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe do grupo e Ile que Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; do grupo que Xaa7 é um resíduo de aminoácido seleccionado consiste em Glu e Asp, do grupo que Xaa8 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -His- e o -Lys-Leu-, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que
Xaa2 é Gin ou Asn, mas particularmente Gin;
Xaa3 é Vai ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa4 é Phe
Xaa5 é Phe
Xaa6 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala; 19
ΕΡ 2 046 833/PT
Xaa7 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e
Xaa8 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos dois locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois aminoácidos consecutivos estão separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor relativamente aos referidos resíduos de aminoácido consecutivos, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, que representam um primeiro e um segundo locais de ligação embutidos no interior da seguinte sequência nuclear:
Xaai - Xaa2 - Lys - Leu que - Xaa3 - Phe - - Phe - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6, em Xaai é um resíduo de consiste em His, Asn, aminoácido Gin Lys e Arg seleccionado r do grupo que Xaa2 é um resíduo de consiste em Asn e Gin; aminoácido seleccionado do grupo que Xaa3 é um resíduo de consiste em Ala, Vai, aminoácido seleccionado Leu, norleucina, Met, Phe do grupo e Ile; que Xaa4 é um resíduo de consiste em Ala, Vai, aminoácido seleccionado Leu, Ser e Ile; do grupo que Xaa5 é um residuo de consiste em Glu e Asp, aminoácido seleccionado do grupo que Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaas e Xaa6 não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -Lys-Leu- e o -Phe-Phe-, respectivamente. 20 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos locais de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e os pelo menos dois aminoácidos consecutivos estão separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor em comparação com os resíduos de aminoácido, que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, e em que os referidos resíduos de aminoácido são -His- e -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos no interior da seguinte sequência nuclear:
His - Xaa2 - - Lys - Leu - Xaa3 - Phe - Phe - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6, em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Asn e Gin; Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile; Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; Xaas é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, e em que os ; referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, não estão envolvidos na ligaçao do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -His-, o -Lys-Leu- e o -Phe-Phe-, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que
21 ΕΡ 2 046 833/PT
Xaa2 é Gin ou Asn, mas Xaa3 é Vai ou Leu, mas Xaa4 é Ala ou Vai, mas Xaa5 é Glu ou Asp, mas Xaa6 é Asp ou Glu, mas particularmente Gin; particularmente Vai; particularmente Ala; particularmente Glu; particularmente Asp. e São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos dois locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois aminoácidos consecutivos estão separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido numa extensão significativamente menor relativamente aos referidos resíduos de aminoácido consecutivos, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, que representam um primeiro e um segundo locais de ligação embutidos no interior da seguinte sequência nuclear:
Xaa2 - Xaa2 - Lys - Leu que - Xaa3 - Phe - - Phe - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6, em Xaai é um resíduo de consiste em His, Asn, aminoácido seleccionado Gin, Lys e Arg; do grupo que Xaa2 é um resíduo de consiste em Asn e Gin; aminoácido seleccionado do grupo que Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Vai, Ala, Leu, Met, Phe , norleucina e Ile Xaa4 é um resíduo de consiste em Ala, Vai, aminoácido Leu e Ile; seleccionado do grupo que Xaa5 é um resíduo de consiste em Glu e Asp, aminoácido seleccionado do grupo que Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4,· Xaas, Xaa6, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou 22 ΕΡ 2 046 833/PT estão envolvidos numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -Lys-Leu- e o -Phe- Phe, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que
Xaai é His ou Arg, mas particularmente His; Xaa2 é Gin ou Asn, mas particularmente Gin; Xaa3 é Vai ou Leu, mas particularmente Vai; Xaa4 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala; Xaa5 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; Xaa6 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que reconhecem e se ligam a pelo menos dois locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, que são -Phe-Phe-Ala-Glu-, particularmente -Phe-Phe-Ala-, mas especialmente -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, e em que os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos exibem a sequência de aminoácidos -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-apresentada em SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácidos His-Gln-Lys-Leu-Val- apresentada em SEQ ID NO:8, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento que reconhecem e se ligam a pelo menos um local de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois locais de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que o referido pelo menos um ou os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu- e -His-, respectivamente, em que os referidos locais de ligação distintos estão embutidos na 23 ΕΡ 2 046 833/PT sequência de aminoácidos -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-, e na sequência de aminoácidos -His-Gln-Lys-Leu-Val-, respectivamente.
Noutro aspecto, o anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, compreendem um local de reconhecimento e de ligação ao antigénio que reconhece e se liga a pelo menos dois locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação distintos compreendem, cada um, pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos no interior das sequências de aminoácidos dadas em SEQ ID NO:7 e 8, respectivamente, em que os referidos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína /3-amilóide. São também divulgados um anticorpo ou um seu fragmento, que se ligam a 4 locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos 4 locais de ligação distintos incluem 2 locais de ligação compreendendo, cada um, um resíduo de aminoácido e 2 locais de ligação compreendendo, cada um, dois resíduos de aminoácido consecutivos, resíduos esses que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os referidos 4 locais de ligação distintos estão localizados em estreita proximidade, um em relação aos outros, na proteína /3-amilóide, e em que os referidos 4 locais de ligação estão separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou envolvido na ligação mas numa extensão significativamente menor em comparação com o referido um resíduo de aminoácido e os referidos dois resíduos de aminoácido consecutivos dos 4 locais de ligação distintos, desse modo formando um epítopo conformacional descontínuo.
Em particular, os primeiros dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de aminoácido individuais é -His- e o segundo dos resíduos de aminoácido individuais é -Asp-, embutidos no interior da seguinte sequência nuclear: 24 ΕΡ 2 046 833/PT - Xaai - His - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa3 - Phe - Phe - Xaa4 - Xaas -Asp - Xaa6 em que
Xaai é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em His, Asn, Gin, Lys e Arg, mas particularmente His; Xaa2 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Asn e Gin, mas particularmente Gin; Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai , Leu, norleucina, Met, Phe e Ile, particularmente Vai r Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile, particularmente Ala; Xaa5 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, particularmente Glu; Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai , Leu, norleucina, Met, Phe e Ile, particularmente Vai; e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos na ligação mas numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -His-, -Asp-, o -Lys-Leu, e o -Phe-Phe-. São também divulgados um anticorpo ou um seu fragmento, que se ligam a 4 locais de ligação distintos na proteína /3-amilóide, em que os referidos 4 locais de ligação distintos incluem dois locais de ligação compreendendo, cada um, um resíduo de aminoácido e dois locais de ligação compreendendo, cada um, dois resíduos de aminoácido consecutivos, em que os primeiros dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de aminoácido individuais é -His- e o segundo dos resíduos de aminoácido individuais é -Asp-, embutidos no interior da seguinte sequência nuclear:
Xaai - His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3 - Phe - Phe - Xaa4 - Xaa5 - Asp - Xaa5 em que 25 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Xaai é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em His, Asn, Gin, Lys e Arg, mas particularmente His;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Asn e Gin, mas particularmente Gin;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile, particularmente Vai;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile, particularmente Ala;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp, particularmente Glu;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile, particularmente Vai; e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaae, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos na ligação mas numa extensão significativamente menor em comparação com o local de ligação -His-, -Asp-, o -Lys-Leu, e o -Phe-Phe-.
Num aspecto específico, os locais de reconhecimento e de ligação, como aqui definido anteriormente, estão a formar um epítopo conformacional descontínuo localizado numa região da proteína β-amilóide entre os resíduos de aminoácido 12 e 24, particularmente entre os residuos 14 e 23, mais particularmente entre os resíduos de aminoácido 14 e 20, em que os pelo menos dois locais de reconhecimento e de ligação distintos compreendendo, cada um, pelo menos 2 resíduos de aminoácido, estão localizados na posição 16 e 17 e na posição 19 e 20, respectivamente, e em que o pelo menos um local de reconhecimento e de ligação distinto compreendendo pelo menos 1 residuo de aminoácido está localizado na posição 14, resíduos esses que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína β-amilóide, e em que os referidos locais de reconhecimento e de ligação distintos estão, pelo menos de um lado, flanqueados por resíduos de aminoácido, particularmente os resíduos 21 e 22, e separados por um resíduo de aminoácido localizado na posição 15 e 18, residuos de aminoácido esses que não estão directamente 26 ΕΡ 2 046 833/PT envolvidos na ligação do antigénio ou, pelo menos, estão envolvidos numa extensão substancialmente menor.
Em ainda outro aspecto, os referidos pelo menos três locais de reconhecimento e de ligação distintos estão flanqueados de ambos os lados por resíduos de aminoácido, particularmente os resíduos 12 e 13, e os resíduos 21 e 22, e estão separados por um resíduo de aminoácido localizado na posição 15 e 18, resíduos de aminoácido esses que não estão directamente envolvidos na ligação do antigénio ou, pelo menos, estão envolvidos numa extensão substancialmente menor.
Num aspecto específico, os referidos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Lys-Leu- na posição 16 e 17 e -Phe- Phe- na posição 19 e 20, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína /3-amilóide, estão embutidos na seguinte região nuclear:
Vai- His- His- Gin- Lys- Leu- Vai- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Em outro aspecto específico, os referidos resíduos de aminoácido, particularmente -Lys-Leu- na posição 16 e 17 e -Phe-Phe- na posição 19 e 20 e -His- na posição 14, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína β-amilóide, estão embutidos na seguinte região nuclear:
Vai- His- His- Gin- Lys- Leu- Vai- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp- Vai- Gly- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Noutro aspecto, são divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento que compreendem na região variável da cadeia leve e da cadeia pesada, respectivamente, pelo menos uma CDR de origem não humana, particularmente duas CDR de origem não humana, mais particularmente três CDR de origem não humana, embutidas numa ou mais regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata e, opcionalmente, uma região constante derivada de um anticorpo-fonte humano ou de primata, anticorpo humanizado ou seu fragmento esses que são capazes de especificamente reconhecer e ligar proteína β-amilóide, particularmente um péptido /3-amilóide monomérico, mais 27 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ particularmente um péptido /3-amilóide polimérico, ainda mais particularmente fibras, fibrilhas ou filamentos /3-amilóides em isolamento ou como parte de uma placa /3-amilóide, num epitopo compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:11):
Xaai - Xaa2 - Lys - Leu que - Xaa3 - Phe - Phe- Xaa4 - Xaa5 - Xaa6, em Xaai é um resíduo de aminoácido seleccionado do consiste em His, Asn, Gin, mas particularmente His; grupo que Xaa2 é um resíduo de consiste em Asn e Gin, aminoácido seleccionado mas particularmente Gin; do e grupo que Xaa3 é um resíduo de consiste em Vai, Leu e aminoácido seleccionado Ile, mas particularmente do Vai; grupo que Xaa4 é um resíduo de consiste em Ala e Vai, aminoácido seleccionado mas particularmente Ala; do grupo que Xaa5 é um resíduo de consiste em Glu e Asp, aminoácido seleccionado mas particularmente Glu; do grupo que Xaa6 é um resíduo de consiste em Glu e Asp, aminoácido seleccionado mas particularmente Asp. do grupo que Em ainda outro aspecto, são divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento que compreendem na região variável da cadeia leve e da cadeia pesada, respectivamente, pelo menos uma CDR de origem não humana, particularmente duas CDR de origem não humana, mais particularmente três CDR de origem não humana, embutidas numa ou mais regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata e, opcionalmente, uma região constante derivada de um anticorpo-fonte humano ou de primata, anticorpo humanizado ou seu fragmento esses que são capazes de especificamente reconhecer e ligar proteína β-amilóide, particularmente um péptido β-amilóide monomérico, mais particularmente um péptido /3-amilóide polimérico, ainda mais particularmente fibras, fibrilhas ou filamentos /3-amilóides em isolamento ou como parte de uma placa β-amilóide, num epitopo compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:
His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3 - Phe - Phe- Xaa4 - Xaa5 - Xaa6, em que 28
ΕΡ 2 046 833/PT
Xaa2 é um resíduo de consiste em Asn e Gin, aminoácido seleccionado mas particularmente Gin; do e grupo que Xaa3 é um resíduo de consiste em Vai, Leu e aminoácido seleccionado Ile, mas particularmente do Vai; grupo que Xaa4 é um resíduo de consiste em Ala e Vai, aminoácido seleccionado mas particularmente Ala; do grupo que Xaa5 é um resíduo de consiste em Glu e Asp, aminoácido seleccionado mas particularmente Glu; do grupo que Xaa6 é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Glu e Asp , mas particularmente Glu e em que os referidos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaas, Xaa6, não estão envolvidos na ligação do anticorpo ou estão envolvidos numa extensão menor em comparação com o local de ligação -His- e o -Lys-Leu- e o -Phe-Phe-.
Num aspecto específico, a CDR de origem não humana é obtida de um anticorpo dador, mais particularmente de um anticorpo dador murino, criado contra um fragmento antigénico que não contém o referido local de ligação distinto. Este desvio na região epitópica pode ter sido, pelo menos parcialmente, causado pela utilização de uma construção antigénica supramolecular compreendendo um péptido antigénico correspondente à sequência de aminoácidos do péptido β-amilóide, particularmente de péptido β-amilóide Αβι-ιβ, modificada com uma porção hidrófila tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), em que a referida porção hidrófila está ligada covalentemente a cada um dos terminais do péptido antigénico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tais como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido ou análogo de aminoácido adequados capazes de servir como dispositivo de ligação para o acoplamento da porção hidrófila ao fragmento peptídico, como aqui descrito adiante no processo de imunização. Quando um PEG é utilizado como porção hidrófila, os terminais de PEG livres são covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou a qualquer outro composto adequado para funcionar como elemento de ancoragem, por exemplo, para embutir a construção antigénica na bicamada de um lipossoma como aqui descrito. 29
ΕΡ 2 046 833/PT
Em particular, a CDR de origem não humana é obtida a partir de um anticorpo dador murino que exibe as propriedades características de ACI-01-Ab7C2 (também denominado "mC2" ao longo de todo o pedido de patente) depositado em 01 de Dezembro de 2005 na "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, segundo as disposições do Tratado de Budapeste com o número de acesso DSM ACC2750).
Numa concretização da invenção, a CDR de origem não humana é obtida a partir do anticorpo dador murino ACI-01-Ab7C2 (também denominado "mC2" ao longo de todo o pedido de patente) depositado em 01 Dezembro de 2005 no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, segundo as disposições do Tratado de Budapeste com o número de acesso DSM ACC2750).
Também a utilização de lípido A como parte do protocolo de imunização pode ter contribuído para um desvio na região epitópica. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento compreendendo, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID N0:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO:4, que representa CDR1, da região variável da cadeia leve (LCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que o referido anticorpo humanizado compreende, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO: 2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que o referido anticorpo humanizado compreende, 30 ΕΡ 2 046 833/PT integrado em regiões de esqueleto da cadeia leve derivadas de humano ou de primata, um péptido com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, da região variável da cadeia leve (LCVR). É também divulgada uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, da região variável da cadeia leve (LCVR). É também divulgada uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que compreendem, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos, péptidos esses que são diferentes e exibem uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:l, que representa CDR1, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO:4, que representa CDR1, SEQ ID NO: 5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR) em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo. Em particular, se as pelo menos duas CDR presentes são ambas CDR da região variável da cadeia leve (LCVR), pelo menos uma das referidas CDR tem que ser CDR1 representada por SEQ ID NO:4. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:l, que representa CDR1, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada 31
ΕΡ 2 046 833/PT (HCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um seu fragmento em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo. É também divulgada uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:l, que representa CDRl, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia leve derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:4, que representa CDRl, SEQ ID NO:5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR). É também divulgada uma região variável da cadeia leve (LCVR), que possui, integrados em regiões de esqueleto da cadeia leve derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:4, que representa CDRl, SEQ ID NO:5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo e, em particular, pelo menos uma das referidas CDR tem que ser CDRl representada por SEQ ID NO:4. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, que representa CDRl, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR), particularmente pela ordem indicada acima. 32
ΕΡ 2 046 833/PT É também divulgada uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, que representa CDR1, SEQ ID NO: 2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR), particularmente pela ordem indicada acima. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia leve derivadas de humano ou de primata, péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, SEQ ID NO: 5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), particularmente pela ordem indicada acima. É também divulgada uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo, integrados em regiões de esqueleto da cadeia leve derivadas de humano ou de primata, péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, SEQ ID NO: 5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), particularmente pela ordem indicada acima. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que compreendem, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos três péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID N0:1, que representa CDR1, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO:4, que representa CDR1, SEQ ID NO:5, que representa CDR2, e SEQ ID NO:6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um seu fragmento em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que o anticorpo compreende, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, pelo menos quatro péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID 33 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ ΝΟ:1, que representa CDR1, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO:4, que representa CDRl, SEQ ID NO:5, que representa CDR2, e SEQ ID NO:6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um seu fragmento em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que compreendem, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata pelo menos cinco péptidos com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências que consiste em SEQ ID NO:l, que representa CDRl, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4, que representa CDRl, SEQ ID NO: 5, que representa CDR2, e SEQ ID NO:6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um seu fragmento em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que compreendem, integrados em regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata, péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1, que representa CDRl, SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR) e SEQ ID NO:4, que representa CDRl, SEQ ID NO:5, que representa CDR2, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia pesada (HCVR), ou um seu fragmento, em que os referidos anticorpo humanizado, região variável da cadeia pesada (HCVR), ou seu fragmento, compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, que representa CDR2, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia pesada (HCVR) ou um seu fragmento, em que 34 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ os referidos anticorpo humanizado, região variável da cadeia pesada (HCVR) ou seu fragmento, compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos um péptido com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia pesada (HCVR) ou um seu fragmento, em que o anticorpo, a região variável da cadeia pesada (HCVR) ou o seu fragmento compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, que representa CDR1, e SEQ ID NO: 2, que representa CDR2, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia pesada (HCVR) ou um seu fragmento, em que o anticorpo, a região variável da cadeia pesada (HCVR) ou o seu fragmento compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, que representa CDR1, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia pesada (HCVR) ou um seu fragmento, em que o anticorpo, a região variável da cadeia pesada (HCVR) ou o seu fragmento compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, que representa CDR2, e SEQ ID NO:3, que representa CDR3, da região variável da cadeia pesada (HCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia leve (LCVR) ou um seu fragmento, em que o anticorpo, a região variável da cadeia leve (LCVR) ou o seu fragmento compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, e SEQ ID NO: 5, que representa CDR2, da região variável da cadeia leve (LCVR). 35
ΕΡ 2 046 833/PT São também divulgados um anticorpo humanizado, uma região variável da cadeia leve (LCVR) ou um seu fragmento, em que o anticorpo, a região variável da cadeia leve (LCVR) ou o seu fragmento compreendem, integrados em regiões de esqueleto da cadeia pesada derivadas de humano ou de primata, pelo menos dois péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, que representa CDR1, e SEQ ID NO: 6, que representa CDR3, da região variável da cadeia leve (LCVR). São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que tanto a região variável da cadeia pesada (HCVR) como a região variável da cadeia leve (LCVR) do anticorpo C2 de ratinho contribuem, cada uma, com pelo menos uma das suas regiões CDR para as pelo menos duas regiões CDR do anticorpo humanizado. O anticorpo humanizado ou um seu fragmento resultantes podem assim compreender • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l que representa CDR1 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que representa CDR1 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que representa CDR2 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que representa CDR1 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que representa CDR3 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que representa CDR1 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l que representa CDR1 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, que representa CDR2 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que representa CDR2 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, que representa CDR2 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que representa CDR2 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, que representa CDR3 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l que representa CDR1 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, que representa CDR3 (LCVR); 36
ΕΡ 2 046 833/PT • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que representa CDR3 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, que representa CDR2 (LCVR); • pelo menos uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que representa CDR3 (HCVR) em combinação com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, que representa CDR3 (LCVR). São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, anticorpos esses que compreendem uma região constante da cadeia leve e/ou da cadeia pesada de origem humana ou de primata. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que pelo menos um, particularmente pelo menos um mas não mais do que 5, mais particularmente pelo menos um mas não mais do que 4, ainda mais particularmente pelo menos um mas não mais do que 3, mas especialmente pelo menos um mas não mais do que 2, dos aminoácidos representativos das regiões CDR da cadeia leve e/ou da cadeia pesada, como apresentado em SEQ ID NO: 1 -6, estão alterados por uma substituição conservativa tal que o anticorpo mantenha toda a sua funcionalidade. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que na CDR2 da região variável da cadeia leve (LCVR) como apresentado em SEQ ID NO:5, a Lys na posição de Kabat 50 está substituída por um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin e Glu, particularmente por Arg. É também divulgada uma região variável da cadeia leve (LCVR) em que na CDR2 como apresentado em SEQ ID NO: 5, a Lys na posição de Kabat 50 está substituída por um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin e Glu, particularmente por Arg. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que na CDR2 da região variável da cadeia leve (LCVR) como apresentado em SEQ ID NO:5, a Ser na posição de Kabat 53 está 37 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ substituída por um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Asn ou Thr, mas particularmente por Asn. É também divulgada uma região variável da cadeia leve (LCVR) em que na CDR2 como apresentado em SEQ ID NO: 5, a Ser na posição de Kabat 53 está substituída por um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Asn ou Thr, mas particularmente por Asn. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que são proporcionados, em que a região variável da cadeia pesada (HCVR) possui uma sequência de aminoácidos que é 90%, particularmente 95%, mais particularmente 98% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO:15 e 16, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que são proporcionados, em que a região variável da cadeia leve (LCVR) possui uma sequência de aminoácidos que é 90%, particularmente 95%, mais particularmente 98% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO:12 e 13, respectivamente. São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que são proporcionados, em que pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões CDR da região variável da cadeia pesada (HCVR) possuem uma sequência de aminoácidos que é 90%, particularmente 95%, mais particularmente 98% idêntica à região CDR correspondente como apresentado em SEQ ID N0:1 -3 . São também divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que são proporcionado, em que pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões CDR da região variável da cadeia leve (LCVR) possuem uma sequência de aminoácidos que é 90%, particularmente 95%, mais particularmente 98% idêntica à região CDR correspondente como apresentado em SEQ ID NO:4 - 6. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, em que a região variável da cadeia pesada (HCVR) possui uma sequência de aminoácidos que é 90%, 38 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO:15 e 16, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, em que a região variável da cadeia leve (LCVR) possui uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO:12 e 13, respectivamente. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, em que pelo menos uma, particularmente pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões CDR da região variável da cadeia pesada (HCVR) possuem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à região CDR correspondente como apresentado em SEQ ID NO:l - 3. São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, em que pelo menos uma, particularmente pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões CDR da região variável da cadeia leve (LCVR) possuem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à região CDR correspondente como apresentado em SEQ ID NO:4 - 6. É também divulgado um anticorpo humanizado, como aqui descrito acima, em que pelo menos um dos aminoácidos representativos das sequências de esqueleto aceitadoras obtidas a partir das sequências VH e VK da linha germinativa humana, respectivamente, está alterado, por uma substituição, para um aminoácido da região correspondente do anticorpo murino ACI-01-Ab7C2 ou uma sua substituição conservativa. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia 39 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ pesada, está substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu, tal como apresentado em SEQ ID NO:15. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que a Arg na posição de Kabat 94 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ser e Thr, mas especialmente por Ser, tal como apresentado em SEQ ID NO:15. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu, e a Arg na posição de Kabat 94 está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ser e Thr, mas especialmente por Ser, tal como apresentado em SEQ ID NO:15. São também divulgados uma região variável da cadeia leve e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia leve, respectivamente, em que a Gin na posição de Kabat 45 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VK da linha germinativa humana do subgrupo VKII de KABAT da região variável da cadeia leve está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Lys, Arg, Gin e Asn, particularmente por Lys e Arg, mas especialmente por Lys. São também divulgados uma região variável da cadeia leve e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia leve, respectivamente, em que a Tyr na posição de Kabat 87 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir 40 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ das sequências VK da linha germinativa humana do subgrupo VKII de KABAT da região variável da cadeia leve está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Phe, Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Phe, mas especialmente por Phe. São também divulgados uma região variável da cadeia leve e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia leve, respectivamente, em que a Lys na posição de Kabat 50 na região CDR2 obtida a partir de um anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente o anticorpo murino ACI-01-Ab7C2, tal como apresentado em SEQ ID NO: 12, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin, His, e Asn, mas especialmente por Arg São também divulgados uma região variável da cadeia leve e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia leve, respectivamente, em que a Asn na posição de Kabat 53 na região CDR2 obtida a partir de um anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente o anticorpo murino ACI-01-Ab7C2, tal como apresentado em SEQ ID NO: 12, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; mas especialmente Ser. É também divulgado um anticorpo humanizado, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu, e a Arg na posição de Kabat 94 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ser e Thr, mas especialmente por Ser como apresentado em SEQ ID NO: 15, e a Tyr na posição de Kabat 87 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VK da linha germinativa humana do subgrupo VKII de KABAT da região variável da cadeia leve, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Phe, 41 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Phe, mas especialmente por Phe. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO:15, está substituído por Leu. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que a Arg na posição de Kabat 94 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituída por Ser tal como apresentado em SEQ ID NO:15. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por Leu e Ile, mas especialmente Leu, e a Arg na posição de Kabat 94 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituída por Ser tal como apresentado em SEQ ID NO:15. É também divulgada uma região variável da cadeia leve e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que a Tyr na posição de Kabat 87 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VK da linha germinativa humana do subgrupo VKII de KABAT da região variável da cadeia leve, está substituída por Phe. 42
ΕΡ 2 046 833/PT São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por Leu e Ile, mas especialmente Leu, e a Arg na posição de Kabat 94 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituída por Ser tal como apresentado em SEQ ID NO:15, e a Tyr na posição de Kabat 87 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VK da linha germinativa humana do subgrupo VKII de KABAT da região variável da cadeia leve, está substituída por Phe. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIII de KABAT da região variável da cadeia pesada está substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu e, a Arg na posição de Kabat 94 está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ser e Thr, mas especialmente por Ser tal como apresentado em SEQ ID NO:15, e em que a Lys na posição de Kabat 50 na região CDR2 obtida a partir de um anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente o anticorpo murino ACI-01-Ab7C2, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin, His e Asn, mas especialmente por Arg. São também divulgados uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo humanizado compreendendo esta região variável da cadeia pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na sequência de esqueleto aceitadora obtida a partir das sequências VH da linha germinativa humana do subgrupo VHIH de KABAT da região variável da cadeia pesada, está substituído por um aminoácido seleccionado do 43 ΕΡ 2 046 833/PT grupo que consiste em Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu, e a Arg na posição de Kabat 94 está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ser e Thr, mas especialmente por Ser, tal como apresentado em SEQ ID NO:15, e em que a Asn na posição de Kabat 53 na região CDR2 obtida a partir de um anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente o anticorpo murino ACI-01-Ab7C2, está substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; mas especialmente Ser. A invenção utiliza a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:12.
Na invenção, é proporcionado um anticorpo humanizado que compreende a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:12.
Numa concretização específica, a invenção utiliza a região variável da cadeia leve incluindo sequências de sinal como apresentado em SEQ ID NO:13.
Noutra concretização especifica da invenção, é proporcionado um anticorpo humanizado que compreende a região variável da cadeia leve completa incluindo sequências de sinal como apresentado em SEQ ID NO:13. É também divulgado um anticorpo humanizado, que compreende a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:12 e a região constante da cadeia leve de SEQ ID NO:14. É também divulgado um anticorpo humanizado, que é proporcionado, que compreende a região variável da cadeia leve completa de SEQ ID NO: 13 e a região constante da cadeia leve de SEQ ID NO:14. A invenção utiliza a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:15.
Na invenção, é proporcionado um anticorpo humanizado que compreende a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:15. 44
ΕΡ 2 046 833/PT
Numa concretização específica, a invenção utiliza a região variável da cadeia pesada incluindo sequências de sinal como apresentado em SEQ ID NO:16.
Noutra concretização específica da invenção, é proporcionado um anticorpo humanizado, que compreende a região variável da cadeia pesada completa incluindo sequências de sinal como apresentado em SEQ ID NO:16. E também divulgado um anticorpo humanizado, que compreende a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15 e a região constante da cadeia pesada de SEQ ID NO:17. É também divulgado um anticorpo humanizado, que compreende a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 16 e a região constante da cadeia pesada de SEQ ID NO:17.
Num aspecto, o anticorpo humanizado após co-incubação com um péptido Αβ monomérico possuindo pelo menos 30, particularmente pelo menos 35, mais particularmente pelo menos 38, ainda mais particularmente pelo menos 40 resíduos de aminoácido e/ou um péptido amilóide solúvel Αβ polimérico compreendendo uma pluralidade das referidas unidades Αβ monoméricas, mas especialmente com um péptido amilóide solúvel A/3i -42 monomérico e/ou A/3 polimérico compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3i_42 monoméricas, particularmente numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e A/31-42 de até 1:1000, particularmente até 1:500, mais particularmente até 1:300, ainda mais particularmente até 1:200, mas especialmente numa proporção de concentrações molares entre 1:10 e 1:100, inibe a agregação dos monómeros de A/3 em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular.
Em particular, a co-incubação do anticorpo com péptidos amilóides solúveis, monoméricos e/ou poliméricos, é realizada durante 24 horas a 60 horas, particularmente durante 30 horas a 50 horas, mais particularmente durante 48 horas, mas especialmente 24 horas, a uma temperatura entre 28°C e 40°C, particularmente entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 3 7 °C. 45
ΕΡ 2 046 833/PT
Num aspecto específico, a co-incubação com péptidos amilóides solúveis, monoméricos e/ou poliméricos, é realizada durante 24 horas a uma temperatura de 37°C.
Em particular, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado aqui divulgado incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, liga-se a péptido A/3i_42 monomérico e/ou péptido amilóide solúvel A/3 polimérico compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3i_42 monoméricas e, após co-incubação com péptido AjSi _42 monomérico e/ou péptido amilóide solúvel A/3 polimérico compreendendo uma pluralidade das referidas unidades Aj3i _42 monoméricas inibe a agregaçao dos monómeros e/ou polímeros de A/3 em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular.
Num aspecto, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado aqui divulgado incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, inibe a agregação dos monómeros de A/3 e/ou polímeros de A/3 solúveis compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3 monoméricas, em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular, em pelo menos 50%, particularmente em pelo menos 60%, particularmente em pelo menos 65%, mais particularmente em pelo menos 75%, ainda mais particularmente em pelo menos 80%, mas especialmente em pelo menos 85%-90%, ou mais, comparativamente com os monómeros de péptido amilóide respectivos incubados em tampão (controlo), numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e A/31-42 de até 1:1000, particularmente numa proporção de concentrações molares entre 1:10 e 1:100, mas especialmente numa proporção de concentrações molares de 1:10.
Num aspecto específico, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado aqui divulgado incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, inibe a agregação dos monómeros de A/3 e/ou polímeros de A/3 solúveis compreendendo uma pluralidade das referidas unidades Λβ monoméricas, em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular, em pelo menos 30%, numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e A/31-42 de 1:100. 46
ΕΡ 2 046 833/PT
Em outro aspecto específico, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado aqui divulgado incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, inibe a agregação dos monómeros de A/3 e/ou polímeros de A/3 solúveis compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3 monoméricas, em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular, em pelo menos 80%, numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e A/31-42 de 1:10. A ligação dos anticorpos aqui divulgados e como aqui descrito a péptidos amiloidogénicos monoméricos e/ou poliméricos mas, particularmente, à forma amilóide (1-42), conduz a inibição da agregação de péptidos amiloidogénicos monoméricos e/ou poliméricos em fibrilhas ou filamentos de levado peso molecular. Através da inibição da agregação de péptidos amiloidogénicos monoméricos e/ou poliméricos, os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas amilóides, particularmente a forma amilóide (1-42), que se sabe tornar-se insolúvel por alteração da conformação secundária e ser a parte principal das placas amilóides no cérebro de animais ou seres humanos doentes. O potencial de inibição da agregação do anticorpo pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na especialidade, particularmente por ultracentrifugação em gradiente de densidades seguida por uma análise de sedimentação por SDS-PAGE num gradiente pré-formado e/ou por um ensaio de fluorescência com tioflavina T (Th-T).
Num aspecto, é aqui divulgado um anticorpo, particularmente um anticorpo humanizado como aqui descrito incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, anticorpo esse que, após co-incubação, particularmente numa proporção de concentrações molares entre 1:5 e 1:1000, particularmente entre 1:10 e 1:500, mais particularmente numa proporção de 1:10 a 1:300, ainda mais particularmente numa proporção entre 1:10 e 1:100, com fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos de elevado peso molecular pré-formados, formados pela agregação de péptidos A/3 monoméricos possuindo pelo menos 30, particularmente pelo menos 35, mais particularmente pelo menos 38, ainda mais 47 ΕΡ 2 046 833/PT particularmente pelo menos 40 resíduos de aminoácido e, mas especialmente péptidos A/3i_42 monoméricos, é capaz de desagregar as fibrilhas ou filamentos poliméricos pré-formados em pelo menos 20%, particularmente em pelo menos 30%, mais particularmente em pelo menos 35%%, ainda mais particularmente em pelo menos 40%, mas especialmente em pelo menos 50% ou mais.
Num aspecto especifico, o potencial de inibição da agregação e de desagregação do anticorpo, respectivamente, é determinado por ultracentrifugação em gradiente de densidade seguida por uma análise de sedimentação por SDS-PAGE num gradiente pré-formado.
Em outro aspecto especifico, o potencial de inibição da agregação e de desagregação do anticorpo, respectivamente, é determinado por ensaio de fluorescência com tioflavina T (Th-T) .
Em outro aspecto especifico, o anticorpo é co-incubado com fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos de elevado peso molecular pré-formados, durante 12 horas a 36 horas, particularmente durante 18 horas a 30 horas, mais particularmente durante 24 horas, a uma temperatura entre 28°C e 40°C, particularmente entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C.
Em particular, a co-incubação com fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos de elevado peso molecular pré-formado é realizada durante 24 horas a uma temperatura de 37°C.
Num aspecto especifico, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, é capaz de desagregar as fibrilhas ou filamentos poliméricos pré-formados em pelo menos 24% numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e Αβ1-42 de 1:100.
Em outro aspecto especifico, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado aqui divulgado, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais, é capaz de desagregar as fibrilhas ou filamentos 48 ΕΡ 2 046 833/PT poliméricos pré-formados em pelo menos 32% numa proporção de concentrações molares entre anticorpo e Αβ1-42 de 1:10.
Através da desagregação de fibrilhas ou filamentos poliméricos amiloidogénicos, os anticorpos são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas amilóides, o que conduz a um alivio dos sintomas associados à doença e a um atraso ou uma reversão da sua progressão.
Deste modo, constitui um aspecto adicional aqui divulgado proporcionar um anticorpo, particularmente um anticorpo humanizado, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou suas partes funcionais como aqui descrito, anticorpo esse que é capaz de diminuir a quantidade total de A/3 no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano, que sofre de uma doença ou condição que conduzem a uma concentração aumentada de A/3 no cérebro.
Noutro aspecto, é aqui divulgado um anticorpo humanizado, como aqui descrito acima, anticorpo esse que é bi-eficaz na medida em que exibe tanto uma propriedade de inibição da agregação como uma propriedade de desagregação, particularmente a par de um grau elevado de sensibilidade conformacional.
Em particular, são aqui divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, anticorpos esses que, após co-incubação com péptidos amilóides monoméricos e/ou amilóides poliméricos solúveis, particularmente com péptidos /3-amilóides monoméricos tais como, por exemplo, péptidos A/3 monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, ou 1-42, e/ou um péptido β- amilóide polimérico solúvel compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3 monoméricas, mas especialmente com um péptido amilóide A/3i_42 monomérico e/ou um A/3 polimérico solúvel compreendendo uma pluralidade das referidas unidades A/3i—42 monoméricas, inibe a agregação dos monómeros de A/3 em fibrilhas ou filamentos poliméricos de elevado peso molecular e, em adição, após co-incubação com fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos de elevado peso molecular pré-formados, formados pela agregação de péptidos amilóides monoméricos, 49 ΕΡ 2 046 833/PT particularmente péptidos /3-amilóides monoméricos tais como, por exemplo, péptidos A/3 monoméricos 1-39; 1-40, 1-41 ou 1-42, mas especialmente péptidos A/3i_42 monoméricos, são capazes de desagregar as fibrilhas ou filamentos poliméricos pré-formados.
Noutro aspecto, são aqui divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, anticorpos esses que são capazes de induzir uma transição da conformação em folha /3 para uma conformação em hélice α e/ou em serpentina aleatória, mas particularmente para uma conformação em serpentina aleatória, ainda mais particularmente para uma conformação em serpentina aleatória numa determinada localização na molécula, especialmente na vizinhança de TyrlO e Vall2 da proteína A/3, que conduz a um aumento da conformação em serpentina aleatória às custas da conformação em folha β e a uma solubilização melhorada das fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos de elevado peso molecular pré-formados. Em particular a diminuição da conformação em folha β é de pelo menos 30%, particularmente pelo menos 35%, e mais particularmente pelo menos 40%, e mais, comparativamente com as fibrilhas ou filamentos amilóides poliméricos pré-formados respectivos incubados em tampão (controlo). O potencial dos anticorpos para induzir uma transição na estrutura secundária é determinado por espectroscopia de 13C RMN em estado sólido mas, em particular, por medição das intensidades integrais das conformações de Tyr 10 e Vai 12 C/3 no péptido A/3i_42 . São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, compreendendo pelo menos uma cadeia leve ou um seu fragmento ou pelo menos uma cadeia pesada ou um seu fragmento, em que os referidos anticorpo ou fragmento se ligam a um monómero de A/3 com uma elevada afinidade de ligação com uma KD na gama entre pelo menos cerca de 1 x 10“7 M e pelo menos cerca de 1 x 10-12 M, particularmente entre pelo menos cerca de 1 x 10“8 M e pelo menos cerca de 1 x 10-11 M, mais particularmente entre pelo menos cerca de 1 x 10 9 M e pelo menos cerca de 1 x 10“10 M, ainda mais particularmente 50 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ entre pelo menos cerca de 1 x 10“8 M e pelo menos cerca de 2 x 1CT8 M mas, preferivelmente, não apresentam qualquer reactividade cruzada significativa com a proteína precursora de amilóide (APP). São também divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, compreendendo pelo menos uma cadeia leve ou um seu fragmento ou pelo menos uma cadeia pesada ou um seu fragmento, em que os referidos anticorpo ou fragmento se ligam a uma fibra, fibrilha ou filamento de A/3 com uma elevada afinidade de ligação com uma KD numa gama entre pelo menos cerca de 1 x IO-7 M e pelo menos cerca de 1 x 10~12 M, particularmente entre pelo menos cerca de 1 x 10 Me pelo menos cerca de 1 x 1CT11 M, mais particularmente entre pelo menos cerca de 1 x 10~9 M e pelo menos cerca de 1 x 1CT10 M, ainda mais particularmente entre pelo menos cerca de 2 x IO-9 M e pelo menos cerca de 5 x 10“9 M, mas, preferivelmente, não apresentam qualquer reactividade cruzada significativa com a proteína precursora de amilóide (APP).
Noutro aspecto, o anticorpo, como aqui descrito acima, ou um seu fragmento, exibem uma afinidade de ligação para com uma fibra, fibrilha ou filamento de A/3 que é pelo menos 2 vezes, particularmente pelo menos 4 vezes, particularmente pelo menos 10 vezes, particularmente pelo menos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, mas especialmente pelo menos 25 vezes superior à afinidade de ligação para com um monómero de A/3 .
Em ainda outro aspecto, são aqui descritos um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, anticorpos esses que substancialmente se ligam a A/3 agregada, incluindo placas de A/3, no cérebro de mamífero, particularmente humano, mas, preferivelmente, não apresentam qualquer reactividade cruzada significativa com a proteína precursora de amilóide (APP).
Noutro aspecto, são descritos aqui um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, anticorpos esses que substancialmente se ligam a amilóide polimérica solúvel, particularmente amilóide β (A/3) , 51 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ incluindo monómeros de Αβ, no cérebro de mamífero, particularmente humano, mas, preferivelmente, não apresentam qualquer reactividade cruzada significativa com a proteína precursora de amilóide (APP). São ainda divulgados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, anticorpos esses que significativamente reduzem a carga de placa de A/3 no cérebro de mamífero, particularmente humano. Isto pode ser conseguido quer por ligação do anticorpo à placa quer por desvio do equilíbrio da amilóide, particularmente amilóide β (A/3) , do seu estado insolúvel e agregado para a sua forma solúvel, por desagregação das fibras em formas poli- e monoméricas solúveis, por indução de um desvio na conformação e ligação e estabilização das formas amilóides desagregadas e solubilizadas, particularmente formas amilóides β (Αβ), no tecido e/ou em fluidos corporais, particularmente no cérebro. Através da actividade do anticorpo, o depuramento periférico e o catabolismo são assim favorecidos relativamente à deposição no interior do tecido e/ou dos fluidos corporais, particularmente o cérebro. O efeito benéfico do anticorpo pode assim ser obtido sem ligação do anticorpo à placa.
Através desta actividade de estabilização, o anticorpo é capaz de neutralizar os efeitos tóxicos da proteína amilóide solúvel polimérica e menos agregada, particularmente proteína amilóide β (Αβ), no tecido e/ou nos fluidos corporais. Num aspecto específico o anticorpo aqui descrito pode assim atingir os seus efeitos benéficos sem necessariamente ligar amilóide beta agregada no cérebro.
Num aspecto adicional são divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, compreendendo pelo menos uma cadeia leve ou um seu fragmento ou pelo menos uma cadeia pesada ou um seu fragmento incorporando pelo menos uma, particularmente duas e mais, particularmente três, regiões CDR obtidas a partir de um anticorpo de ratinho dador, particularmente do anticorpo de ratinho ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, em todo o pedido de patente) depositado em 01 de Dezembro de 2005 na "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 52
ΕΡ 2 046 833/PT und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, com o número de acesso DSM ACC2750, em que o referido anticorpo ou o seu fragmento possuem uma afinidade para com o antigénio Αβ que é pelo menos 5 vezes, particularmente pelo menos 8 vezes, mais particularmente pelo menos 10 vezes, mas especialmente pelo menos 15 vezes superior à do anticorpo de ratinho dador. O anticorpo da presente invenção pode ser, numa concretização, um anticorpo completo (e.g., com duas cadeias leves de comprimento completo e duas cadeias pesadas de comprimento completo) de qualquer isotipo e subtipo (e.g., IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl e IgA2); mas especialmente um anticorpo do isotipo IgG4; alternativamente, em outra concretização, pode ser um fragmento de ligação ao antigénio (e.g., Fab, F(ab')2 e Fv) de um anticorpo completo. A invenção refere-se assim também a fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos aqui descritos. Numa concretização da invenção, o fragmento é seleccionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e um fragmento Fv, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab e fragmentos de ligação a epitopos de qualquer dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.
Em outra concretização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio da invenção estão conjugados a polietilenoglicol. Em ainda outra concretização, a região constante do anticorpo da invenção é modificada para reduzir pelo menos uma função efectora biológica mediada pela região constante relativamente a um anticorpo não modificado. Em ainda outra concretização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio da invenção compreendem uma região Fc possuindo uma função efectora alterada. A invenção refere-se ainda uma molécula nucleotidica compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, de acordo com a invenção, e como aqui divulgado acima. 53
ΕΡ 2 046 833/PT
Em particular, a invenção utiliza uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um trecho de moléculas de aminoácidos contíguas, como apresentado em SEQ ID NO:2 e 3, respectivamente, ou a sequência complementar, que representam as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) 2 e 3 da região variável da cadeia pesada (HCVR).
Mais particularmente, a invenção utiliza uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um trecho de moléculas de aminoácidos contíguas, como apresentado em SEQ ID NO:4, ou a sequência complementar, que representam as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) 1 da região variável da cadeia leve (LCVR).
Noutro aspecto é proporcionada uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos, como apresentado em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ou a sequência complementar, que codifica a sequência de aminoácidos de CDR 2 e CDR 3, respectivamente, da região variável da cadeia pesada (HCVR).
Noutro aspecto é proporcionada uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos, como apresentado em SEQ ID NO:20, ou a sequência complementar, que codifica a sequência de nucleótidos de CDR 1 da região variável da cadeia leve (LCVR).
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:21, ou a sequência complementar, que codifica a região variável da cadeia leve.
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:22, ou a sequência complementar, que codifica a região variável da cadeia leve completa incluindo sequências de sinal.
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 22 e a região constante da cadeia leve de SEQ ID 54
ΕΡ 2 046 833/PT NO:23. A invenção também compreende a cadeia complementar da referida molécula nucleotidica.
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotidica compreendendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:24 que codifica a região variável da cadeia pesada. A invenção também compreende a cadeia complementar da referida molécula nucleotidica.
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotidica compreendendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:25 que codifica a região variável da cadeia pesada completa incluindo sequências de sinal. A invenção também compreende a cadeia complementar da referida molécula nucleotidica.
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma molécula nucleotidica compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25 e a região constante da cadeia pesada de SEQ ID NO:26. A invenção também compreende a cadeia complementar da referida molécula nucleotidica.
Está aqui também compreendida uma sequência de nucleótidos que híbrida com uma das sequências de nucleótidos que codificam anticorpos da invenção acima descritas, particularmente com a sua cadeia complementar, quer isoladamente quer como parte de uma molécula nucleotidica maior.
Em particular, a divulgação refere-se a uma sequência de nucleótidos que híbrida sob condições convencionais de hibridação, particularmente sob condições rigorosas de hibridação, com qualquer das sequências de nucleótidos apresentadas em SEQ ID NO: 18-26 e 29-32, particularmente com a sua cadeia complementar.
Em outra concretização da invenção é proporcionado um vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção e como aqui mencionado acima. 55
ΕΡ 2 046 833/PT
Em outra concretização da invenção é proporcionada uma célula compreendendo um vector de expressão compreendendo o ácido nucleico de acordo com a invenção e como aqui mencionado acima.
Em ainda outra concretização, a invenção refere-se a uma composição compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer seu derivado ou quaisquer suas partes funcionais, numa quantidade terapeuticamente eficaz, em particular uma composição que é uma composição farmacêutica opcionalmente compreendendo ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.
Em outra concretização da invenção, a referida composição compreende o anticorpo numa quantidade terapeuticamente eficaz. É ainda divulgada uma mistura compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer seu derivado ou quaisquer suas partes funcionais, numa quantidade terapeuticamente eficaz e, opcionalmente, uma outra substância biologicamente activa e/ou um transportador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Em particular, a invenção refere-se a uma mistura, em que a outra substância biologicamente activa é um composto utilizado na medicação para amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com proteína amilóide ou do tipo amilóide tais como a proteína A/3 envolvida na doença de Alzheimer.
Em outra concretização da invenção, a outra substância ou composto biologicamente activos podem também ser um agente terapêutico que possa ser utilizado no tratamento de amiloidose causada por amilóide β ou possa ser utilizado na medicação de outras desordens neurológicas. 56
ΕΡ 2 046 833/PT A outra substância ou composto biologicamente activos podem exercer o seu efeito biológico através do mesmo mecanismo, ou de um similar, que o anticorpo de acordo com a invenção ou através de um mecanismo de acção não relacionado ou através de uma multiplicidade de mecanismos de acção relacionados e/ou não relacionados.
Geralmente, o outro composto biologicamente activo pode incluir potenciadores da transmissão de neutrões, fármacos psicoterapêuticos, inibidores da acetilcolina-esterase, bloqueadores dos canais do cálcio, aminas biogénicas, tranquilizadores de benzodiazepina, potenciadores da síntese, armazenagem ou libertação da acetilcolina, agonistas do receptor pós-sináptico da acetilcolina, inibidores da monoamina-oxidase-A ou -B, antagonistas do receptor de glutamato de N-metil-D-aspartato, fármacos anti-inflamatórios não esteróides, antioxidantes e antagonistas do receptor serotonérgico.
Mais particularmente, a invenção refere-se a uma mistura compreendendo pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em compostos eficazes contra o stress oxidativo, compostos anti-apoptóticos, quelantes de metais, inibidores da reparação do ADN tais como pirenzepina e metabolitos, ácido 3-amino-l-propanossulfónico (3APS), 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), activadores de α-secretase, inibidores de β- e γ-secretase, proteínas tau, neurotransmissores, destruidores da folha β, atractores para depuração de amilóide beta / esgotamento de componentes celulares, inibidores de amilóide beta truncada no terminal N incluindo amilóide beta piroglutamatada 3-42, moléculas anti-inflamatórias, ou inibidores de colinesterase (ChEI) tais como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina, agonistas Ml e outros fármacos incluindo qualquer fármaco modificador de tau ou amilóide e suplementos nutricionais, e suplementos nutricionais, juntamente com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um transportador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis. A invenção refere-se ainda a uma mistura, em que o composto é um inibidor de colinesterase (ChEI), 57 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ particularmente uma mistura, em que o composto é seleccionado do grupo que consiste em tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacina e memantina.
Numa outra concretização, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina juntamente com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um transportador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Em ainda outra concretização da invenção são proporcionadas misturas que compreendem "antipsicóticos atípicos" tais como, por exemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazole ou olanzapina, para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos incluindo alucinações, ilusões, desordens do pensamento (manifestadas por incoerência marcada, descarrilamento, tangenciabilidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, assim como anedonia, afectos diminuídos, apatia e retraimento social, juntamente com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, de acordo com a invenção e como aqui descrito e, opcionalmente, um transportador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Numa concretização específica da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima, compreendem o anticorpo e a substância biologicamente activa, respectivamente, numa quantidade terapeuticamente eficaz.
Outros compostos que podem ser adequadamente utilizados em misturas em combinação com o anticorpo de acordo com a presente invenção estão descritos em WO 2004/058258 (veja-se especialmente as páginas 16 e 17) incluindo alvos de fármacos terapêuticos (páginas 36-39), ácidos alcanossulfónicos e ácidos alcanolsulfúricos (páginas 39-51), inibidores de colinesterase (páginas 51-56), antagonistas do receptor de NMDA (páginas 56-58), estrogénios (páginas 58-59), fármacos anti-inflamatórios não esteróides (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas do receptor activado 58 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ por proliferadores de peroxissoma (PPAR) (páginas 63-67), agentes de diminuição do colesterol (páginas 68-75); inibidores de amiloide (paginas 75—77), inihidores da formação de amilóide (páginas 77-78), quelantes de metais (páginas 78-79), anti-psicóticos e antidepressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83—89) e compostos gue aumentam a disponibilidade de substâncias biologicamente activas no cérebro (veja—se as páginas 89—93) e pró—fármacos (páginas 93 e 94).
Em outra concretização, a invenção refere-se a uma mistura compreendendo o anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo guimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção e, como agui descrito acima, e/ou a substância biologicamente activa numa quantidade terapeuticamente eficaz. A invenção refere-se ainda à utilização de um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima, e/ou uma sua parte funcional e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo o referido anticorpo, para a preparação de um medicamento para tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica) , Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular. É aqui também divulgado um método para a preparação de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou 59 ΕΡ 2 046 833/PT um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, como aqui descrito acima, e/ou uma sua parte funcional e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo o referido anticorpo e/ou uma sua parte funcional, particularmente numa quantidade terapeuticamente eficaz, para utilização num método de prevenção, tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular compreendendo a formulação de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção, numa forma farmaceuticamente aceitável. É ainda proporcionado um método para a prevenção, tratamento ou alivio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Inicio no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, 60 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ incluindo degenerescência macular, por administração de um anticorpo e/ou uma sua parte funcional, mas particularmente um anticorpo humanizado e/ou uma sua parte funcional, ou uma composição ou mistura compreendendo um tal anticorpo e/ou uma sua parte funcional, a um animal ou um ser humano afectados por uma tal desordem, compreendendo a administração do anticorpo numa quantidade terapeuticamente eficaz.
Constitui também um objecto proporcionar um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), particularmente uma doença ou condição caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva, por administração a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, de um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como aqui descrito.
Numa concretização específica a invenção proporciona um método para retenção ou aumento da capacidade de memória cognitiva mas, particularmente, para o restabelecimento da capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofre de prejuízo da memória, por administração a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, de um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima,.
Constitui ainda um objecto proporcionar uma composição terapêutica e um método de produção desta composição, assim como um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , particularmente a doença ou condição caracterizada por uma perda de capacidade de memória cognitiva, utilizando um anticorpo de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima,. 61 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Em particular, a invenção refere-se à utilização num método para o tratamento de um animal, particularmente um mamifero ou um ser humano, que sofre de uma condição associada a amilóide caracterizada por uma perda da capacidade de memória cognitiva, que conduz à retenção da capacidade de memória cognitiva. É também divulgado um método de diagnóstico de uma doença ou condição associadas a amilóide num paciente compreendendo a detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo, ou um seu fragmento activo, a um epítopo da proteína amilóide numa amostra ou in situ, que inclui os passos de (a) levar uma amostra ou uma parte corporal ou área corporal específicas que se suspeita conterem a proteína amilóide ao contacto com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima, e/ou uma sua parte funcional, anticorpo esse que se liga a um epítopo da proteína amilóide; (b) permitir que o anticorpo e/ou uma sua parte funcional, se liguem à proteína amilóide para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína amilóide na amostra ou na parte ou área do corpo específicas. A invenção também se refere a um método de determinação da extensão da carga de placa amiloidogénica num tecido e/ou em fluidos corporais compreendendo (a) o teste de uma amostra de tecido e/ou fluido corporal quanto à presença de proteína amilóide com o anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção; (b) a determinação da quantidade de anticorpo ligado à proteína; e (c) o cálculo da carga de placa na amostra de tecido ou fluido corporal. 62 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Em particular, a formação do complexo imunológico no passo b) é determinada de modo a que a presença ou a ausência do complexo imunológico se correlacione com a presença ou a ausência de proteína amilóide. Em outra concretização da invenção, é proporcionado um kit de teste para a detecção e o diagnóstico de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo o anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a invenção.
Em particular, o kit de teste compreende um recipiente contendo um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção, e instruções para utilização dos anticorpos com o fim de ligação da proteína amilóide para formar um complexo imunológico e detecção da formação do complexo imunológico de modo que a presença ou a ausência do complexo imunológico se correlacionam com a presença ou ausência de proteína amilóide.
Noutro aspecto, é aqui divulgado um anticorpo compreendendo uma região variável como apresentada em SEQ ID NO:27, ou uma sua variante. Num aspecto, uma linha celular que expressa o anticorpo.
Noutro aspecto, é aqui divulgado um gene de um anticorpo compreendendo uma região variável como apresentada em SEQ ID NO:29, ou uma sua variante. Num aspecto, uma linha celular expressa o anticorpo.
Noutro aspecto, é aqui divulgado um método para a desagregação de fibras beta-amilóides pré-formadas, compreendendo a interacção de um anticorpo hC2 com as fibras beta-amilóides pré-formadas.
Noutro aspecto, são aqui divulgados um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, em que os referidos anticorpo ou seu fragmento protegem os neurónios contra a degradação induzida por Abeta.
Noutro aspecto, é aqui divulgado um método de prevenção da degradação dos neurónios induzida por Abeta compreendendo o tratamento dos neurónios com uma quantidade eficaz de um 63 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a presente divulgação.
Noutro aspecto, é aqui divulgada a utilização de um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de acordo com a presente descrição para a preparação de um medicamento para a prevenção da degeneração dos neurónios após exposição a oligómero Abeta.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E SEQUÊNCIAS
Figura 1 (Exemplo 2): Cassete de expressão da região variável da cadeia leve de ratinho do anticorpo quimérico
Figura 2 (Exemplo 2) : Cassete de expressão da região variável da cadeia pesada de ratinho do anticorpo quimérico
Figura 3 (Exemplo 5.2): Comparação da região variável da cadeia pesada de ratinho com a sequência mais próxima da linha germinativa murina
Figura 4 (Exemplo 8): Actividade de anticorpos C2 humanizados purificados
Figura 5 (Exemplo 9): Actividade de ligação de anticorpos produzidos por expressão transiente de construções de CDRL2 modificadas de C2 em conjunto com cadeia pesada quimérica de C2, comparativamente com anticorpo quimérico C2ChVHAF/ChVK, produzido por transfecção transiente e anticorpo purificado.
Figura 6 (Exemplo 11) : Resultados do Ensaio de Ligação Imuno-histoquímica com anticorpo quimérico AF e anticorpo humanizado H4K1.
Figura 7 (Exemplo 12) : Funcionalidade de mC2 em fibras amilóides
Figura 8 (Exemplo 12): Afinidade de ligação de C2 humanizado em ELISA.
Figura 9 (Exemplo 14) : Ligação de específica da conformação, de mC2 a diferentes classes de proteína amilóide. 64 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ A preparação da pelete na legenda desta figura refere-se a fibras de A/3i_42, a preparação de sobrenadante refere-se a monómeros de amilóide.
Figura 10: Sequências de VK de C2 humanizadas comparadas com a sequência murina e sequências aceitadoras humanas DPK15 E JK1
Figura 11: Sequências de VH de C2 humanizadas comparadas com a sequência murina e sequências aceitadoras humanas DP54 E Jh6
Figura 12: Sequência completa de ADN e de proteína da região variável da cadeia leve de anticorpo C2 humanizado, C2HuVKl
Figura 13: Sequência completa de ADN e de proteína da região constante da cadeia leve (Capa C humana) de anticorpo C2 humanizado.
Figura 14: Sequência completa de ADN e de proteína da região constante da cadeia pesada (IgG4 humana ser228-pro) de anticorpo C2 humanizado
Figura 15A-C (Exemplo 15): Resultados de experiências de mapeamento de epítopos
Figura 16 (Exemplo 13) : Resultados de experiências do ensaio de agregação
Figura 17 (Exemplo 13): Resultados de experiências do ensaio de desagregação
Figura 18: (Exemplo 16): Resultados de experiências de neuroprotecção com anticorpo C2 humanizado. SEQ ID NO:l Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR1) SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR2)
65 ΕΡ 2 046 833/PT SEQ ID NO:3
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR3) SEQ ID NO:4
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR1) SEQ ID NO:5
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR2) SEQ ID NO:6
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR3) SEQ ID NO:7
Sequência de aminoácidos da região 2 de epitopo de A/3 SEQ ID NO:8
Sequência de aminoácidos da região 1 de epitopo de A/3 SEQ ID NO:9
Sequência de aminoácidos da região 2 de epitopo de A/3 modificada SEQ ID NO:10
Sequência de aminoácidos da região 1 de epitopo de A/3 modificada SEQ ID NO:11
Sequência de aminoácidos da região de epitopo modificada completa SEQ ID NO:12
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 SEQ ID NO:13
Sequência de aminoácidos da cadeia leve humanizada de C2 SEQ ID NO:14
Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve de C2 humanizado SEQ ID NO:15
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 SEQ ID NO:16
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de C2 66 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ SEQ ID NO:17
Sequência de aminoácidos da região C da cadeia gama-4 de IG - modificada SEQ ID NO : lí
Sequência de nucleótidos de CDR2 da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 SEQ ID NO:19
Sequência de nucleótidos de CDR3 da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 SEQ ID NO:20
Sequência de nucleótidos de CDR1 da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 SEQ ID NO:21
Sequência de nucleótidos da região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 SEQ ID NO:22
Sequência de nucleótidos da cadeia leve humanizada de C2 SEQ ID NO:23
Sequência de nucleótidos da região constante da cadeia leve humanizada de C2 SEQ ID NO:2 4
Sequência de nucleótidos da região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 SEQ ID NO:25
Sequência de nucleótidos da cadeia pesada humanizada de C2 SEQ ID NO:26
Sequência de nucleótidos da região constante da cadeia pesada humanizada de C2 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de C2 de ratinho Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de C2 de ratinho SEQ ID NO:29
Sequência de nucleótidos da região variável da cadeia leve de C2 de ratinho 67 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:30 Sequência de nucleótidos da Cadeia leve de C2 de ratinho SEQ ID NO:31 Sequência de nucleótidos da região variável da cadeia pesada de C2 de ratinho SEQ ID NO:32 Sequência de nucleótidos da cadeia pesada de C2 de ratinho
DEFINIÇÕES
Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína", como aqui se utilizam, são indiferentes e são definidos como significando uma biomolécula composta por aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.
Os termos "um", "uma", "o" e "a", como aqui se utilizam, são definidos como significando "um ou mais" e incluem o plural a menos que o contexto seja inapropriado. A frase "doenças e desordens que são causadas por, ou estão associadas a, proteína amilóide ou do tipo amilóide" inclui, mas não se lhes limita, doenças e desordens causadas pela presença ou actividade de proteínas do tipo amilóide no estado monomérico, de fibrilha ou polimérico, ou qualquer combinação dos três. Estas doenças e desordens incluem, mas não se lhes limitando, amiloidose, tumores endócrinos e degenerescência macular. O termo "amiloidose" refere-se a um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo, mas não se lhes limitando, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tais como, por exemplo, deficiência cognitiva moderada (MCI), demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear 68 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), miosite com corpos de inclusão (MCI), Diabetes com Inicio no Adulto e amiloidose cardíaca senil; e várias doenças oculares incluindo degenerescência macular, neuropatia óptica relacionada com drusen, e cataratas devidas a deposição de beta-amilóide.
Os termos "detecção" ou "detectar", como aqui se utilizam, significam a utilização de técnicas conhecidas para a detecção de moléculas biológicas tais como métodos imunoquímicos ou histológicos e referem-se à determinação qualitativa ou quantitativa da presença ou de concentração da biomolécula em investigação. "Amilóide polimérica solúvel" refere-se a múltiplos monómeros agregados de péptidos amilóides, ou de péptidos do tipo amilóide, ou de péptidos amilóides modificados ou truncados ou de outros derivados de péptidos amilóides que formam estruturas oligoméricas ou poliméricas que são solúveis no corpo do mamífero ou do ser humano, mais particularmente no cérebro, mas particularmente a múltiplos monómeros agregados de amilóide β (A/3) ou de péptidos amilóide β (A/3) modificados ou truncados ou seus derivados, que são solúveis no corpo da mamífero ou do ser humano, mais particularmente no cérebro. "Amilóide /3, A/3 ou /3-amilóide" são termos reconhecidos na especialidade e referem-se a proteínas e péptidos de amilóide /3, proteína precursora de amilóide β (APP) , assim como modificações, fragmentos e quaisquer seus equivalentes funcionais. Em particular, amilóide /3, como aqui se utiliza, significa qualquer fragmento produzido por clivagem proteolitica de APP mas especialmente os fragmentos que estão envolvidos ou associados às patologias amilóides incluindo, mas não se lhes limitando, A/34-38, A/3i_39, A/3i_40, A/3i_4i A/34_42 e A/3i_43. A estrutura e as sequências dos péptidos de amilóide /3, como mencionado acima, são bem conhecidas dos peritos na especialidade e os métodos de produção dos referidos péptidos ou para a sua extracção do cérebro e outros tecidos estão descritos, por exemplo, em Glenner e Wong, Biochem Biophys Res 69
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Comm 129, 885-890 (1984). Adicionalmente, os péptidos de amilóide β estão também comercialmente disponíveis em várias formas. "Isolado" significa uma molécula biológica isenta de pelo menos alguns dos componentes com os quais ocorre na natureza.
Os termos "anticorpo" ou "anticorpos", como aqui se utilizam, são termos reconhecidos na especialidade e entende-se que se referem a moléculas ou fragmentos activos de moléculas que se ligam a antigénios conhecidos, particularmente a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e. moléculas que contêm um local de ligação que se liga especificamente a um antigénio. Uma imunoglobulina é uma proteína compreendendo um ou mais polipéptidos substancialmente codificados pelos genes da região constante capa e lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu de imunoglobulinas, assim como uma miríade de genes da região variável de imunoglobulinas. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Também são conhecidas subclasses da cadeia pesada. Por exemplo, as cadeias pesadas de IgG em seres humanos podem ser de qualquer subclasse IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A imunoglobulina de acordo com a invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou subclasse (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) de molécula de imunoglobulina.
Como aqui se utiliza, "ligar especificamente" com referência a um anticorpo, significa que o anticorpo se liga ao seu antigénio alvo com maior afinidade do que a um antigénio(s) estruturalmente diferente(s).
Sabe-se que uma unidade estrutural de imunoglobulina típica compreende um tetrâmero. Cara tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kD) . O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos 70 ΕΡ 2 046 833/PT primariamente responsáveis pelo reconhecimento dos antigénios. Os termos "cadeia leve variável (VL)" e "cadeia pesada variável (VH) " referem-se a essas cadeias leves e pesadas, respectivamente.
Os anticorpos existem na forma de anticorpos intactos de comprimento completo ou sob a forma de vários fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases ou químicos. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfureto na região de charneira para produzir F(ab')2f um dímero de Fab que, ele próprio, é uma cadeia leve unida a Vh-CH, através de uma ligação dissulfureto. O F(ab')2 pode ser reduzido sob condições moderadas para quebrar a ligação dissulfureto na região de charneira, desse modo convertendo o dimero F(ab')2 num monómero Fab'. O monómero Fab' é essencialmente um fragmento Fab com parte da região de charneira (veja-se, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um perito notará que qualquer de uma variedade de fragmentos de anticorpo pode ser sintetizado de novo quer quimicamente quer utilizando metodologia de ADN recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui se utiliza, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos completos ou sintetizados de novo ou anticorpos e fragmentos obtidos utilizando metodologias de ADN recombinante. "Anticorpos", no âmbito da presente invenção pretende incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, e cadeia única, biespecíficos, simianizados, humanos e humanizados assim como seus fragmentos activos. Os exemplos conhecidos de fragmentos activos de moléculas que se ligam a antigénios incluem cadeias leves e pesadas separadas, fragmentos Fab, Fab/c, Fv, Fab', e F(ab')2 /· incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab e fragmentos de ligação a epítopos de quaisquer dos anticorpos e fragmentos acima mencionados.
Estes fragmentos activos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção através de várias técnicas. Por 71 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser clivados com uma enzima, tal como pepsina, e submetidos a filtração em gel e HPLC. A fracção apropriada contendo os fragmentos Fab pode então ser recolhida e concentrada por filtração em membrana e similares. Para uma descrição adicional de técnicas gerais para o isolamento de fragmentos activos de anticorpos, veja-se por exemplo, Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.
Os anticorpos preparados recombinantemente podem ser anticorpos de comprimento completo convencionais, fragmentos activos de anticorpos conhecidos a partir de digestão proteolitica, fragmentos de anticorpo activos únicos tais como Fv ou Fv de cadeia única (scFv), anticorpos com domínios eliminados, e similares. Um anticorpo Fv tem cerca de 50 Kd de dimensão e compreende as regiões variáveis da cadeia leve e pesada. Um polipéptido Fv de cadeia única ("scFv") é um heterodímero VH::VL covalentemente ligado que pode ser expresso a partir de um ácido nucleico incluindo sequências de codificação de VH e VL, unidas directamente ou unidas através de um ligante que codifica de um péptido. Veja-se Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 85:5879-5883 . Várias estruturas para a conversão das cadeias polipeptídicas leve e pesada naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas, de uma região V de anticorpo, numa molécula de scFv que se irá dobrar numa estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um local de ligação ao antigénio. Veja-se, e.g. as Patentes U.S. 5,091,513, 5,132,405 e 4,956,778. O local de combinação refere-se à parte de uma molécula de anticorpo que participa na ligação ao antigénio. O local de ligação ao antigénio é formado por resíduos de aminoácido das regiões variáveis ("V") N-terminais das cadeias pesada ("H") e leve ("L"). As regiões variáveis do anticorpo compreendem três trechos altamente divergentes referidos como "regiões hipervariáveis" ou "Regiões Determinantes de Complementaridade" (CDR), que estão interpostos entre trechos flanqueadores mais conservados conhecidos como "regiões de esqueleto" (FR) . Numa molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada (CDR1, HCDR2 72
ΕΡ 2 046 833/PT e HCDR3) estão dispostas umas relativamente às outras no espaço tridimensional para formar uma superfície ou bolsa de ligação ao antigénio. O local de combinação do anticorpo representa portanto os aminoácidos que constituem as CDR de um anticorpo e quaisquer resíduos de esqueleto que constituem a bolsa do local de ligação. A identidade dos resíduos de aminoácido num anticorpo particular que constituem o local de combinação pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, as CDR dos anticorpos podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis originalmente definidas por Kabat et al. (veja-se, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G e Wu, TT (2001) Kabat Database e its applications: future directions. Nucleic Acid Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu). As posições das CDR podem também ser identificadas como as estruturas em ansa estrutural originalmente descritas por Chothia e outros, (veja-se Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989), e Tramontano et al.,
J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Outros métodos incluem a "definição de AbM" que é um compromisso entre Kabat e Chothia e é derivada utilizando o software de modelação de anticorpos AbM da Oxford Molecular (agora Accelrys) ou a "definição de contacto" de CDR de Macallum et al., ("Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J
Mol Biol. 1996 Oct \—1 \—1 262(5): 732-45). 0 quadro seguinte identifica CDR com base em várias definições conhecidas. Ansa Kabat AbM Chothia Contacto LI L24 — L34 L24 — L34 L24 — L34 L30 — L36 L2 L50 — L56 L50 — L56 L50 — L56 L46 — L55 L3 L89 — L97 L89 — L97 L89 — L97 L89 — L96 Hl H31 — H35B H26 — H35B H26 — H32 . .34 H30 — H35B (Numeração de Kabat) Hl H31 — H35 H26 — H35 H26 — H32 H30 — H35 (Numeração de Chothia) H2 H50 — H65 H5 — H58 H52 — H56 H47 — H58 H3 H95 — Hl 02 H95 — Hl 02 H95 — Hl 02 H93 — H101 73
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As orientações gerais através das quais se podem identificar as CDR num anticorpo apenas a partir da sequência são as seguintes: LCDR1:
Inicio - Aproximadamente resíduo 24. O resíduo anterior é sempre uma Cys. O resíduo posterior é sempre um Trp. Tipicamente o TRP é seguido por TYR-GLN, mas também pode ser seguido por LEU-GLN, PHE-GLN ou TYR-LEU. O comprimento é de 10 a 17 resíduos. LCDR2:
Início - 16 resíduos após o final de Ll. A sequência anterior é geralmente ILE-TYR, mas também pode ser VAL-TYR, ILE-LYS OU ILE-PHE. O comprimento é geralmente de 7 resíduos. LCDR3:
Início - geralmente 33 resíduos após o final de L2. O resíduo anterior é uma Cys. A sequência posterior é PHE-GLY-X-GLY. O comprimento é de 7 a 11 resíduos. HCDR1:
Início - aproximadamente no resíduo 26 (quatro resíduos após uma CYS) [definição Chothia / AbM] na definição de Kabat inicia-se 5 resíduos mais à frente. A sequência anterior é CYS-X-X-X. O resíduo posterior é um TRP, tipicamente seguido por VAL, mas também seguido por ILE ou ALA. O comprimento é de 10 a 12 resíduos pela definição AbM enquanto a definição de Chothia exclui os últimos 4 resíduos. 74
ΕΡ 2 046 833/PT HCDR2:
Início - 15 resíduos após o final da definição de Kabat /AbM de CDR-H1. A sequência anterior é tipicamente LEU-GLU-TRP-ILE-GLY. (SEQ ID NO. 1), mas são possíveis várias variações.
A sequência posterior é LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA O comprimento é de 16 a 19 resíduos pela definição de Kabat (a definição AbM termina 7 resíduos antes). HCDR3:
Início - 33 resíduos após o final de CDR-H2 (dois resíduos após uma CYS). A sequência anterior é CYS-X-X (tipicamente CYS-ALA-ARG). A sequência posterior é TRP-GLY-X-GLY. O comprimento é de 3 a 25 resíduos. A identidade dos resíduos de aminoácido num anticorpo particular que estão fora das CDR, mas ainda assim fazem parte do local de combinação porque possuem uma cadeia lateral que é parte do revestimento do local de combinação (i.e., está disponível para ligação através do local de combinação), pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade tais como modelação molecular e cristalografia de raios-X. Veja-se e.g., Riechmann et al., (1988) Nature, 332:;323-327.
Os anticorpos quiméricos são aqueles em que uma ou mais regiões do anticorpo são de uma espécie de animal e uma ou mais regiões do anticorpo são de uma espécie de animal diferente. Um anticorpo quimérico preferido é um que inclui regiões de uma imunoglobulina de primata. Um anticorpo quimérico para uso clinico humano é tipicamente entendido como possuindo regiões variáveis de um animal não humano, e.g. um roedor, com as regiões constantes de um ser humano. Pelo contrário, um anticorpo humanizado utiliza as CDR do anticorpo não humano com a maioria ou todas as regiões de esqueleto variáveis e todas as regiões constantes de uma imunoglobulina 75 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ humana. Um anticorpo quimérico humano é tipicamente entendido como possuindo as regiões variáveis de um roedor. Um anticorpo quimérico humano tipico possui regiões constantes pesadas humanas e regiões constantes da cadeia leve humanas com as regiões variáveis de ambas as cadeias, pesada e leve, provenientes de um anticorpo de roedor. Um anticorpo quimérico pode incluir algumas alterações na sequência de aminoácidos nativa das regiões constantes humanas e na sequência nativa da região variável de roedor. Os anticorpos quiméricos e humanizados podem ser preparados por métodos bem conhecidos na especialidade incluindo abordagens de enxerto de CDR (veja-se, e.g., as Patentes U.S. 5,843,708; 6,180,370; 5,693,762; 5,585,089; 5,530,101), estratégias de baralhamento de cadeias (veja-se e.g., Patente U.S. 5,565,332; Rader et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1998) 95:8910-8915), estratégias de modelação molecular (Patente U.S. 5,639,641), e similares.
Um "anticorpo humanizado" como aqui se utiliza no caso de um anticorpo de duas cadeias é um em que pelo menos uma cadeia é humanizada. Uma cadeia de anticorpo humanizada possui uma região variável em que uma ou mais das regiões de esqueleto são humanas. Um anticorpo humanizado que é uma cadeia única é um em que a cadeia possui uma região variável em que uma ou mais das regiões de esqueleto são humanas. As porções não humanas da região variável da cadeia de anticorpo humanizada, ou seu fragmento, são derivadas de uma fonte não humana, particularmente um anticorpo não humano, tipicamente originário de roedor. A contribuição não humana para o anticorpo humanizado é tipicamente proporcionada na forma de pelo menos uma região CDR que está intercalada entre regiões de esqueleto derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana(s). Em adição, resíduos de esqueleto de suporte podem ser alterados para preservar a afinidade de ligação. 0 anticorpo humanizado pode ainda compreender regiões constantes (e.g., pelo menos uma região constante ou uma sua porção, no caso de uma cadeia leve, e preferivelmente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). As regiões constantes de um anticorpo humanizado, se presentes, são geralmente humanas. 76
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Os métodos para obter "anticorpos humanizados" são bem conhecidos dos peritos na especialidade. (Veja-se, e.g., Queen et al., Proc. Natl Acad Sei USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).
Um "anticorpo humanizado" pode também ser obtido através de uma nova abordagem de engenharia genética que permite a produção de anticorpos policlonais semelhantes a humanos maturados por afinidade em grandes animais tais como, por exemplo, coelhos e ratinhos. Veja-se, e.g. a Pat. U.S. 6,632,976. A expressão "região constante" (CR), como aqui se utiliza, refere-se a genes de regiões constantes da imunoglobulina. Os genes de regiões constantes codificam a porção da molécula de anticorpo que confere funções efectoras. Para anticorpos quiméricos humanos e anticorpos humanizados, tipicamente não humanos (e.g., murinos), as regiões constantes estão substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos presentes anticorpos quiméricos ou humanizados são tipicamente derivadas de imunoglobulinas humanas. A região constante da cadeia pesada pode ser seleccionada entre qualquer dos cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gama ou mu. Adicionalmente, cadeias pesadas de várias subclasses (tais como as subclasses de IgG de cadeias pesadas) são responsáveis por diferentes funções efectoras e assim, escolhendo a região constante da cadeia pesada desejada, podem ser produzidos anticorpos com a função efectora desejada. As regiões constantes que podem ser utilizadas no âmbito da presente invenção são a gama 1 (IgGl), particularmente uma região Fc do isotipo gama 1 (IgGl), a gama 3 (IgG3) e especialmente a gama 4 (IgG4) . A região constante da cadeia leve pode ser do tipo capa ou lambda, preferivelmente do tipo capa. Numa concretização, a região constante da cadeia leve é a cadeia constante capa humana (Heiter et al. (1980) Cell 22:197-207) e a cadeia constante pesada é a cadeia constante de IgG4 humana. A expressão "anticorpo monoclonal" é também bem reconhecida na especialidade e refere-se a um anticorpo que é o produto de uma única célula produtora de anticorpo clonado. Os anticorpos monoclonais são tipicamente preparados por fusão de uma célula B produtora de anticorpo, normalmente de vida 77 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ curta, com uma célula de crescimento rápido, tal como uma célula cancerosa (por vezes referida como uma célula "imortal"). A célula híbrida resultante, ou hibridoma, multiplica-se rapidamente, criando um clone que produz o anticorpo.
Para os fins da presente divulgação, "anticorpo monoclonal" é também entendido como compreendendo anticorpos que são produzidos por um clone-mãe que ainda não atingiu a total monoclonalidade.
Um "anticorpo funcionalmente equivalente" é entendido como referindo-se a um anticorpo que substancialmente partilha pelo menos uma propriedade funcional principal com um anticorpo acima mencionado e aqui descrito compreendendo: especificidade de ligação para com a proteína β-amilóide, particularmente com a proteína A/3i-42, e mais particularmente com a região de epítopo 16-21 da proteína A/3i-42, imunorreactividade in vitro, inibição da agregação dos monómeros de A/3i_42 em fibrilhas poliméricas de elevado peso molecular e/ou desagregação de fibrilhas de A/3i-42 polimérica pré-formadas, e/ou uma propriedade de destruição da folha β e alívio dos efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica) , Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular, quando administrado profilacticamente ou terapeuticamente. Os anticorpos podem ser de qualquer classe tal como IgG, IgM ou IgA, etc. ou qualquer subclasse tal como IgGl, IgG2a, etc. e outras subclasses aqui mencionadas acima ou conhecidas na especialidade, mas particularmente da classe IgG4. Adicionalmente, os anticorpos 78 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ podem ser produzidos por qualquer método, tal como exibição em fagos, ou produzidos em qualquer organismo ou linha celular, incluindo bactérias, insectos, mamíferos ou outro tipo de célula ou linha celular que produza anticorpos com caracteristicas desejadas, tais como anticorpos humanizados. Os anticorpos podem também ser formados por combinação de uma porção Fab e uma região Fc de diferentes espécies. O termo "hibridar", como utilizado, refere-se a condições de hibridação convencionais, preferivelmente a condições de hibridação em que se utilizam SSPE 5x, SDS a 1%, solução de Denhardt lx, como solução e/ou as temperaturas de hibridação estão entre 35°C e 70°C, preferivelmente 65°C. Após a hibridação, a lavagem é preferivelmente realizada primeiro com SSC 2x, SDS a 1%, e subsequentemente com SSC 0,2x a temperaturas entre 35°C e 70°C, preferivelmente a 65°C (quanto à definição de SSPE, SSC e solução de Denhardt, veja-se Sambrook et al. loc. cit.). As condições de hibridação rigorosas como, por exemplo, descrito em Sambrook et al., supra, são particularmente preferidas. As condições de hibridação rigorosas particularmente preferidas estão presentes, por exemplo, se a hibridação e a lavagem ocorrerem a 65°C como indicado acima. As condições de hibridação não rigorosas, por exemplo, com hibridação e lavagem realizadas a 45°C, são menos preferidas e a 35°C ainda menos. A "homologia" entre duas sequências é determinada pela identidade de sequências. Se duas sequências que se pretendem comparar uma com a outra diferem de comprimento, a identidade de sequências refere-se preferivelmente à percentagem dos residuos de nucleótidos da sequência mais curta que são idênticos aos residuos de nucleótidos da sequência mais longa. A identidade de sequências pode ser determinada convencionalmente com utilização de programas de computador tais como o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711) . O Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, de modo a encontrar o segmento possuindo a maior identidade de sequências entre duas sequências. Quando se utiliza o Bestfit ou outro programa de alinhamento de 79 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ sequências para determinar se uma sequência particular possui por exemplo 95% de identidade com uma sequência de referência da presente invenção, os parâmetros são preferivelmente ajustados de modo a que a percentagem de identidade seja calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de referência e que sejam permitidos hiatos de homologia de até 5% do número total dos nucleótidos na sequência de referência. Quando se utiliza o Bestfit, os denominados parâmetros opcionais são preferivelmente deixados nos seus valores preestabelecidos {"default") . Os desvios que surgem na comparação entre uma determinada sequência e as sequências da invenção acima descritas podem ser causados, por exemplo, por adição, deleção, substituição, inserção ou recombinação. Uma tal comparação de sequências pode preferivelmente também ser realizada com o programa "fasta20u66" (versão 2.0u66, Setembro de 1998, de William R. Pearson e University of Virgínia; veja-se também W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, exemplos anexos e http://workbench.sdsc.edu/). Para este fim, podem ser utilizados os parâmetros de "default". 0 anticorpo pode ser uma imunoglobulina ou anticorpo, o que é entendido como possuindo todos os seus locais de ligação idênticos (se multivalente) ou, em alternativa, pode ser um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional".
Um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial possuindo dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja-se, e.g., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). O termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo compreendendo menos resíduos de aminoácido do que um anticorpo ou uma cadeia de anticorpo intactos ou completos. Os fragmentos podem ser obtidos por via química ou tratamento enzimático de um anticorpo ou uma cadeia de anticorpo intactos ou completos. Os fragmentos podem também ser obtidos por meios recombinantes. Exemplos destes fragmentos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc e/ou 80
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Fv. A expressão "fragmento de ligação ao antigénio" refere-se a um fragmento polipeptídico de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga ao antigénio ou compete com o anticorpo intacto (i.e.r com o anticorpo intacto do qual são derivados) pela ligação ao antigénio (i.e., ligação especifica).
Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de ADN recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias únicas, e anticorpos de cadeia única. O termo "antigénio" refere-se a uma entidade, ou seu fragmento, que podem ligar-se a um anticorpo. Um imunogénio refere-se a um antigénio que pode eliciar uma resposta imunitária num organismo, particularmente um animal, mais particularmente um mamífero incluindo um ser humano. O termo antigénio inclui regiões conhecidas como determinantes antigénicos ou epítopos que se referem a uma porção do antigénio (que são contactadas ou que desempenham um papel significativo no suporte de um resíduo de contacto no antigénio responsável pela antigenicidade ou determinantes antigénicos.
Como aqui se utiliza, o termo "solúvel" significa parcial ou completamente dissolvido numa solução aquosa.
Também como aqui se utiliza, o termo "imunogénico" refere-se a substâncias que eliciam a produção de anticorpos, células T e outras células imunorreactivas dirigidas contra um antigénio do imunogénio.
Uma resposta imunitária ocorre quando um indivíduo produz suficientes anticorpos, células T e outras células imunorreactivas contra composições imunogénicas administradas da presente invenção para moderar ou aliviar a desordem a tratar. O termo imunogenicidade, como aqui se utiliza, refere-se a uma medida da capacidade de um antigénio para eliciar uma resposta imunitária (humoral ou celular) quando administrado a um beneficiário. A presente invenção refere-se a abordagens 81
ΕΡ 2 046 833/PT que reduzem a imunogenicidade dos presentes anticorpos quiméricos humanos ou humanizados.
Anticorpo humanizado de imunogenicidade reduzida refere-se a um anticorpo humanizado que exibe reduzida imunogenicidade relativamente ao anticorpo progenitor, e.g., o anticorpo murino.
Anticorpo humanizado que substancialmente retém as propriedades de ligação do anticorpo progenitor refere-se a um anticorpo humanizado que retém a capacidade para se ligar especificamente ao antigénio reconhecido pelo anticorpo progenitor utilizado para produzir esse anticorpo humanizado. Preferivelmente o anticorpo humanizado irá exibir as mesmas, ou substancialmente as mesmas afinidade de ligação e avidez em relação ao antigénio que o anticorpo progenitor. Idealmente, a afinidade do anticorpo não será inferior a 10% da afinidade do anticorpo progenitor, mais preferivelmente não menos do que cerca de 30%, e mais preferivelmente a afinidade não será inferior a 50% do anticorpo progenitor. Os métodos para ensaiar a afinidade de ligação ao antigénio são bem conhecidos na especialidade e incluem ensaios da ligação semi-máxima, ensaios de competição e análise de Scatchard. Estão descritos no presente pedido ensaios de ligação ao antigénio adequados.
Uma "mutação de reversão" é uma mutação introduzida numa sequência de nucleótidos que codifica um anticorpo humanizado, em que a mutação resulta num aminoácido correspondente a um aminoácido no anticorpo progenitor (e.g., anticorpo dador, por exemplo, um anticorpo murino). Certos resíduos de esqueleto do anticorpo progenitor podem ser retidos durante a humanização dos anticorpos da invenção de modo a reter substancialmente as propriedades de ligação do anticorpo progenitor, enquanto ao mesmo tempo minimizando a potencial imunogenicidade do anticorpo resultante. Numa concretização da invenção, o anticorpo progenitor é originário de ratinho. Por exemplo, a mutação de reversão altera um resíduo de esqueleto humano para um resíduo progenitor de murino. Os exemplos de resíduos de esqueleto que podem sofrer mutação de reversão incluem, mas não se lhes limitando, resíduos canónicos, resíduos de interface de empacotamento, resíduos progenitores invulgares que estão próximos do local de ligação, resíduos na "Zona de 82
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Vernier" (que forma uma plataforma em que assentam as CDR) (Foote & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224, 487-499), e os próximos de CDR H3.
Como aqui se utiliza, uma "alteração conservativa" refere-se a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária do polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos dos polipéptidos mutantes, respectivamente, em comparação com a proteína nativa. Quando em referência aos anticorpos e fragmentos de anticorpo, uma alteração conservativa significa uma substituição de aminoácidos que não torna o anticorpo incapaz de ligação ao receptor em questão. As pessoas competentes na material serão capazes de prever que substituições de aminoácidos podem ser feitas enquanto mantendo uma elevada probabilidade de serem conformacional e antigenicamente neutras. Esta orientação é proporcionada, por exemplo, em Berzofsky, (1985) Science 229:932-940 e Bowie et al. (1990) Science 247:1306-1310. Factores a considerar que afectam a probabilidade de manter a neutralidade conformacional e antigénica incluem, mas não se lhes limitando: (a) a substituição de aminoácidos hidrófobos é menos provável que afecte a antigenicidade porque os resíduos hidrófobos estarão mais provavelmente localizados no interior de uma proteína; (b) a substituição de aminoácidos físico-quimicamente similares, é menos provável que afecte a conformação porque o aminoácido substituído mimetiza estruturalmente o aminoácido nativo; e (c) a alteração de sequências evolucionariamente conservadas provavelmente afecta adversamente a conformação pois tal conservação sugere que as sequências de aminoácidos podem ter importância funcional. Uma pessoa competente na matéria será capaz de avaliar alterações na conformação da proteína utilizando ensaios bem conhecidos, tais como, mas não se lhes limitando, métodos de fixação do microcomplemento (Wasserman et al. (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol. 11:928-936) e através de estudos de ligação utilizando anticorpos monoclonais dependentes da conformação (Lewis et al. (1983) Biochem. 22:948-954). 83
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Adicionalmente, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de anticorpo que, quando administrada a um ser humano ou um animal, é suficiente para resultar num efeito terapêutico no referido ser humano ou animal. A quantidade eficaz é prontamente determinada por um perito na especialidade seguindo procedimentos de rotina.
Como aqui se utilizam, os termos "tratar", "prevenir" e "prevenção" referem-se à prevenção da recidiva ou do inicio de um ou mais sintomas de uma desordem num indivíduo, que resulta da administração de um agente profiláctico ou terapêutico.
Construção de Anticorpos Humanizados São aqui divulgados métodos e composições compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente eficazes possuindo a capacidade para especificamente reconhecerem e se ligarem a epítopos específicos de uma gama de antigénios /3-amilóides. Os anticorpos permitidos pelos ensinamentos da presente divulgação são particularmente úteis para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; assim como outras doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica) , Diabetes com Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degenerescência macular, para nomear apenas algumas.
Uma região variável completamente humanizada ou reformulada pode ser criada desenhando primeiro uma sequência de aminoácidos da região variável que contém CDR não humanas, particularmente derivadas de roedor, mas especialmente CDR derivadas de anticorpo murino ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" 84 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ ao longo de todo o pedido de patente e depositado em 01 de Dezembro de 2005 no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, segundo as disposições do Tratado de Budapeste e a que foi atribuído o n.° de acesso DSM ACC2750) embutidas em sequências de esqueleto derivadas de humanas. As CDR não humanas, particularmente as derivadas de roedor, que podem ser obtidas a partir do anticorpo, proporcionam a especificidade desejada. Deste modo, esses resíduos devem ser incluídos no desenho da região variável reformulada essencialmente inalterados. Quaisquer modificações deverão portanto estar restritas a um mínimo e estreitamente vigiadas quanto a alterações na especificidade e na afinidade do anticorpo. Por outro lado, os resíduos de esqueleto, em teoria, podem ser derivados de qualquer região variável humana.
De modo a criar um anticorpo reformulado que apresenta uma afinidade aceitável ou mesmo melhorada, deverá ser escolhida uma sequência de esqueleto humana, que é igualmente adequada para criar uma região variável reformulada e para reter a afinidade do anticorpo.
De modo a atingir este objectivo, desenvolveu-se a estratégia do melhor ajustamento. Como se sabe que as sequências de esqueleto servem para suportar as CDR na sua orientação espacial correcta para interacção com o antigénio, e que os resíduos de esqueleto podem por vezes participar mesmo na ligação ao antigénio, esta estratégia tem como objectivo minimizar as alterações que possam afectar negativamente a estrutura tridimensional do anticorpo derivando a sequência de esqueleto humana utilizada para reformular o anticorpo da região variável humana que é mais homóloga ou similar à região variável não humana, particularmente a derivada de roedor. Isto irá também maximizar a probabilidade de a afinidade ser retida no anticorpo reformulado.
Ao seu nível mais simples, a estratégia do "melhor ajustamento" envolve a comparação da região V de roedor dadora com todas as sequências de aminoácidos conhecidas da região V humana, e depois a selecção da mais homóloga para proporcionar 85
ΕΡ 2 046 833/PT as regiões de esqueleto aceitadoras para os exercícios de humanização. Na realidade existem vários outros factores que deverão ser considerados, e que podem influenciar a selecção final de regiões de esqueleto aceitadoras. Previsões obtidas por modelação molecular podem ser utilizadas a este respeito antes de qualquer trabalho experimental numa tentativa de maximizar a afinidade do anticorpo reformulado resultante. Essencialmente, o objectivo da modelação consiste em prever que resíduos-chave (se algum) do esqueleto humano mais homólogo deverão ser deixados como no roedor para obter a melhor afinidade no anticorpo reformulado.
Numa concretização da invenção, as CDR são obteníveis a partir de anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente de anticorpo monoclonal de ratinho ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" ao longo de todo o pedido de patente) descrito no pedido co-pendente EP 05 02 7092.5 apresentado em 12.12.2005.
As células de hibridoma FP-12H3-C2, que produzem anticorpo monoclonal de ratinho ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, ao longo de todo o pedido de patente) foram depositadas em 01 de Dezembro de 2005 no pedido co-pendente EP05027092.5 no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, segundo as disposições do Tratado de Budapeste e a que foi atribuído o n.° de acesso DSM ACC2750. 0 anticorpo de ratinho pode ser criado contra uma construção antigénica supramolecular compreendendo um péptido antigénico correspondente à sequência de aminoácidos do péptido β-amilóide, particularmente de péptido β-amilóide Αβ1-15, Κβι-ιβ e Α/3ι_ΐ6 (Δΐ4> / modificada com uma porção hidrófoba tal como, por exemplo, ácido palmítico ou uma porção hidrófila tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou uma combinação de ambas, em que a porção hidrófoba e hidrófila, respectivamente, estão covalentemente ligadas a cada um dos terminais do péptido antigénico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tais como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido ou análogo de aminoácido adequados capazes de servir como um dispositivo de ligação para acoplamento da 86 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ porção hidrófoba e hidrófila ao fragmento peptídico. Quando é utilizado um PEG como porção hidrófila, os terminais livres do PEG estão covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como o elemento de ancoragem, por exemplo, para embutir a construção antigénica na bicamada de um lipossoma.
Em particular, um anticorpo de ratinho pode ser criado contra uma construção antigénica supramolecular compreendendo um péptido antigénico correspondente à sequência de aminoácidos do péptido β-amilóide Αβι-ιβ modificada com uma porção hidrófila tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) estando a porção hidrófila covalentemente ligada a cada um dos terminais do péptido antigénico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tais como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteina ou qualquer outro aminoácido ou análogo de aminoácido adequados capazes de servir como dispositivo de ligação para acoplamento da porção hidrófoba e hidrófila ao fragmento peptídico. Quando é utilizado um PEG como porção hidrófila, os terminais livres do PEG estão covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como elemento de ancoragem, por exemplo, para embutir a construção antigénica na camada de um lipossoma.
Num aspecto, são proporcionados um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, que compreendem na região variável pelo menos uma CDR de origem não humana embutida numa ou mais regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata e combinada com uma região constante derivada de um anticorpo-fonte humano ou de primata, em que o anticorpo quimérico ou um seu fragmento, ou o anticorpo humanizado ou um seu fragmento são capazes de especif icamente reconhecer e ligar péptido /3-amilóide monomérico.
As CDR contêm os resíduos que mais provavelmente se ligam ao antigénio e têm que ser retidos no anticorpo reformulado. As CDR estão definidas pela sequência de acordo com Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. 87
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As CDR caiem em classes canónicas (Chothia et al., 1989 Nature, 342, 877-883) onde resíduos-chave determinam em grande extensão a conformação estrutural da ansa de CDR. Estes resíduos são quase sempre retidos no anticorpo reformulado.
No processo para a preparação de um anticorpo humanizado, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de C2 (VH e VK) são comparadas com sequências VH e VK de anticorpo de roedor nas bases de dados NCBI e Kabat. O gene da linha germinativa de ratinho com a correspondência mais próxima de VK de C2 é bbl, Locus MMU231201, (Schable et al, 1999). Uma comparação revela que dois aminoácidos diferem desta sequência da linha germinativa, ambos localizados no interior de CDRL1. Podem ser encontrados anticorpos murinos maduros com sequência similar, mas não idêntica. Vários têm uma CDRL2 idêntica e uma CDRL3 idêntica, mas a CDRL1 de C2 parece ser única. A comparação com sequências VK da linha germinativa humana mostra que genes do subgrupo VKII são a melhor correspondência para VK de C2 (Cox et al, 1994) . A VK de C2 pode assim ser atribuída ao subgrupo de Kabat MuVKII. A sequência DPK15 juntamente com a região J humana HuJKl podem ser seleccionadas para proporcionar as sequências de esqueleto aceitadoras para a VK humanizada.
Foram definidos os resíduos na interface entre as cadeias variáveis leve e pesada (Chothia et al., 1985 J. Mol. Biol., 186, 651-663). Estes são usualmente retidos no anticorpo reformulado. A Phe na posição 87 de VK de C2 de ratinho é invulgar na interface, onde é mais comum uma Tyr no subgrupo VKII, indicando que este resíduo de esqueleto pode ser importante para a actividade do anticorpo. A Tyr 87 está presente na VK de C2 humanizada e da linha germinativa humana.
As sequências VK humanizadas podem assim ser desenhadas de modo a que a C2HuVKl consista nas CDR de VK de C2 de ratinho com esqueletos de DPK15 e JK1 humanos. Numa concretização específica da invenção, resíduos de murino podem ser substituídos na região de esqueleto humana nas posições 45 e/ou 87. Na região CDR2 obtenível de um anticorpo monoclonal 88 ΕΡ 2 046 833/PT de ratinho, particularmente do anticorpo murino ACI-0l-Ab7C2, podem ser feitas substituições de aminoácidos nas posições de Kabat 50 e/ou 53. O resíduo 45 pode estar envolvido no suporte da conformação das CDR. O resíduo 87 está localizado na interface dos domínios VH e VK. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação do anticorpo. O gene da linha germinativa de ratinho com correspondência mais próxima de VH AF de C2 é VH7183, Locus AF120466, (Langdon et al, 2000). A comparação com sequências de VH da linha germinativa humana mostra que os qenes do subgrupo VHIII são a melhor correspondência para VH de C2. A VH AF de C2 pode ser atribuída ao subgrupo de Kabat MuVHIIID. A sequência DP54 juntamente com a região J humana HuJh6 podem ser seleccionadas para proporcionar as sequências de esqueleto aceitadoras para a VH humanizada. A comparação mostra que existem nove diferenças de aminoácidos entre as sequências de VH de C2 e a sequência da linha germinativa aceitadora humana DP54 e JH6, estando a maioria localizadas no interior de CDRH2. Encontram-se anticorpos murinos maduros com CDRH1 idênticas ou similares (um resíduo diferente) ou com CDRH2 similar (um resíduo diferente), mas nenhuma com todas as três CDR idênticas a VH AF de C2. A CDRH3 do anticorpo C2 é invulgarmente curta, consistindo em apenas três resíduos. Contudo, encontram-se outros anticorpos na base de dados com CDRH3 com este comprimento. O resíduo 47 de VH de C2 é Leu em vez do mais comum Trp, e o resíduo 94 é Ser em vez da normal Arg, indicando que estes resíduos de esqueleto podem ser importantes para a actividade do anticorpo.
Podem ser desenhadas várias sequências VH humanizadas. C2HuVHl consiste em CDR de VH AF de C2 com esqueletos de DP54 e HuJh6. Numa concretização específica da invenção, resíduos de murino podem ser substituídos na região de esqueleto humana nas posições 47 ou 94 ou ambas. O resíduo 47 no esqueleto 2 está em contacto tanto com as CDR como com o domínio VK. O resíduo 94 pode estar envolvido no suporte da conformação das CDR. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação do anticorpo. 89 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Podem ser desenhadas diferentes regiões HCVR e LCVR que compreendem as CDR não humanas obteniveis do anticorpo dador, por exemplo, um anticorpo murino, embutidas nas regiões de esqueleto nativas ou modificadas derivadas de humano ou de primata. A modificação pode referir-se particularmente a uma troca de um ou mais resíduos de aminoácido dentro da região de esqueleto por resíduos não humanos, particularmente resíduos de murino, mais vulgarmente encontrados nesta posição nos respectivos subgrupos ou por resíduos que possuem propriedades similares aos vulgarmente encontrados nesta posição nos respectivos subgrupos. A modificação da região de esqueleto as sequências de esqueleto servem para suportar as CDR na sua orientação espacial correcta para interacção com o antigénio, e que resíduos de esqueleto podem por vezes até participar na ligação ao antigénio. Numa concretização da invenção são realizadas medidas para adicionalmente adaptar as sequências de esqueleto humanas seleccionadas para as tornar o mais similares às sequências dos esqueletos de roedor de modo a maximizar a probabilidade de que a afinidade será retida no anticorpo reformulado.
Deste modo, resíduos de murino na região de esqueleto humana podem ser substituídos. Em particular, resíduos de murino podem ser substituídos na região de esqueleto humana da região variável da cadeia pesada (HCVR) nas posições 47 ou 94 ou em ambas e na região de esqueleto humana da região variável da cadeia leve (LCVR) nas posições 45 e/ou 87. Na região CDR2 obtenível de um anticorpo monoclonal de ratinho, particularmente o anticorpo murino ACI-0l-Ab7C2, podem ser feitas substituições de aminoácidos nas posições de Kabat 50 e/ou 53.
Os resíduos encontrados nas posições acima indicadas na região de esqueleto humana podem ser trocados por resíduos murinos mais vulgarmente encontrados nesta posição nos subgrupos respectivos. Em particular, o Trp na posição de Kabat 4 7 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO: 15 pode ser substituído por uma Leu ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e a 90 ΕΡ 2 046 833/PT cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, o Trp na posição de Kabat 47 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO:15 pode adicionalmente ser substituído por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente por Ile. Podem estar contempladas substituições conservativas alternativas que são conformacional e antigenicamente neutras. A Arg na posição de Kabat 94 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO:15 pode ser substituída por Ser ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, a Arg na posição de Kabat 94 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO:15 pode alternativamente ser substituída por Thr.
Em outra alternativa, ambos os resíduos podem ser substituídos no anticorpo humanizado. A Gin na posição de Kabat 45 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO:12 pode ser substituída por Lys ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, a Gin na posição de Kabat 45 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve, como 91 ΕΡ 2 046 833/PT apresentado em SEQ ID NO: 12, pode ser substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin e Asn, particularmente por Arg. A Leu na posição de Kabat 50 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO:12 pode ser substituída por Lys ou por um residuo de aminoácido que tenha propriedades similares e cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, a Leu na posição de Kabat 50 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO: 12 pode ser substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Arg, Gin e Asn, particularmente por Arg. A Asn na posição de Kabat 53 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO:12 pode ser substituída por His e Gin ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, a Asn na posição de Kabat 53 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO: 12 pode ser substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Gin, His, Lys e Arg. A Thr na posição de Kabat 8 7 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO:12 pode ser substituída por Phe ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e cuja substituição conduza a alterações que são substancialmente neutras do ponto de vista conformacional ou antigénico, produzindo alterações mínimas na estrutura terciária dos polipéptidos mutantes, ou produzindo alterações 92 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ mínimas nos determinantes antigénicos. Em particular, a Tyr na posição de Kabat 87 na região de esqueleto derivada de humano ou de primata da região variável da cadeia leve como apresentado em SEQ ID NO: 12 pode ser substituída por um aminoácido seleccionado do grupo que consiste em Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu. A região variável assim obtida compreendendo pelo menos uma CDR de origem não humana embutida numa ou mais regiões de esqueleto derivadas de humano ou de primata pode então ser combinada com uma região constante derivada de um anticorpo-fonte humano ou de primata, particularmente com IgG4 humana ou regiões constantes K respectivamente. A região constante de IgG4 pode ser modificada por, por exemplo, alteração de Serina na posição 228 na região de charneira para Prolina (HuIgG4 Ser-Pro). Esta mutação estabiliza a ligação dissulfureto intercadeias e previne a formação de meias-moléculas que pode ocorrer em preparações de IgG4 humana nativa. A região constante de IgG4 pode ser adicionalmente modificada por deleção da Lys terminal na posição 439 como apresentado em SEQ ID NO:16.
As regiões variáveis modificadas podem ser construídas por métodos conhecidos na especialidade tais como, por exemplo recombinação por PCR com sobreposição. As cassetes de expressão para o anticorpo quimérico, C2 ChVH AF e C2 ChVK, podem ser utilizadas como moldes para a mutagénese das regiões de esqueleto para as sequências requeridas. São sintetizados conjuntos de pares de iniciadores mutagénicos abrangendo as regiões a alterar. As cassetes de expressão de VH e VK humanizadas produzidas podem ser clonadas em vectores de clonagem apropriados conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, pUC19. Após se confirmar que toda a sequência de ADN está correcta para cada uma de VH e VK, os genes da região V da cadeia pesada e leve modificadas podem ser excisados do vector de clonagem sob a forma de cassetes de expressão. Estas podem então ser transferidas para vectores de expressão apropriados tais como pSVgpt e pSVhyg que incluem IgG4 Ser-Pro humana ou regiões constantes K, respectivamente. 93
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VECTORES DE EXPRESSÃO O vector de expressão pSVgpt é baseado em pSV2 gpt (Mulligan e Berg, 1980) e inclui o gene de resistência a ampicilina para selecção em células bacterianas, o gene gpt para selecção em células de mamífero, a região potenciadora da cadeia pesada de imunoglobulina murina, a sequência genómica que codifica o gene da região constante e sequências poli A de SV40. A região variável da cadeia pesada para expressão é inserida sob a forma de um fragmento de HindiII a BamRI. O vector de expressão pSVhyg inclui o gene de resistência a ampicilina para selecção em células bacterianas, o gene hyg para selecção em células de mamífero, a região potenciadora da cadeia pesada de imunoglobulina murina, a sequência genómica que codifica o gene da região constante capa e incluindo as sequências potenciadora de capa e poli A de SV40. A região variável da cadeia leve para expressão é inserida sob a forma de um fragmento de HindiII a Bamtil. É então confirmado que a sequência de ADN é correcta para as VH e VK humanizadas nos vectores de expressão.
Para a produção dos anticorpos os vectores de expressão da cadeia pesada e leve humanizadas podem ser introduzidos em linhas celulares de produção apropriadas conhecidas na especialidade tais como, por exemplo, células NSO. A introdução dos vectores de expressão pode ser realizada por co-transfecção por electroporação ou através de qualquer outra tecnologia de transformação adequada disponível na especialidade. As linhas celulares que produzem o anticorpo podem então ser seleccionadas e expandidas e os anticorpos humanizados podem ser purificados. Os anticorpos purificados podem então ser analisados por técnicas padrão tais como SDS-PAGE.
ANTICORPO COM AFINIDADE, ESPECIFICIDADE, ESTABILIDADE
MELHORADAS A sequência CDRL2 ("KVSNRFS") do anticorpo C2 de ratinho pode ser modificada ligeiramente sem adversamente afectar a 94 ΕΡ 2 046 833/PT actividade do anticorpo. Podem ser efectuadas substituições conservativas através da troca de K por R na posição 50 e de N por S na posição 53. As duas sequências CDRL2 alternativas são portanto "RVSNRFS" e "KVSSRFS", respectivamente. Estas são incorporadas na sequência VK murina sem qualquer outra alteração, como VK-R de C2 e VK-S de C2, respectivamente. A afinidade, a especificidade e a estabilidade de um anticorpo, como aqui descrito acima, ou de um seu fragmento, podem ser modificadas por alteração do seu perfil ou padrão de glicosilação resultando valores terapêuticos melhorados.
Para conseguir esta alteração no padrão de glicosilação, as células hospedeiras podem ser manipuladas de modo a serem capazes de expressar uma gama preferida de actividade de glicosil-transferase modificadora da glicoproteina que aumenta oligossacáridos ligados a N complexos portadores de GlcNAc de bissecção. Adicionalmente, podem ser obtidas glicoformas modificadas de glicoproteínas, por exemplo anticorpos, incluindo moléculas de anticorpo completas, fragmentos de anticorpo ou proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina, possuindo uma citotoxicidade celular mediada por Fc melhorada.
Os métodos para obtenção de anticorpos com padrão de glicosilação modificado são conhecidos dos peritos na especialidade e estão descritos, por exemplo, em EP1071700, US2005272128, Ferrara et al. (2006) JBiol Chem 281 (8), 5032-5036); Ferrara et al. (2006) Biotechnology and Bioengineering 93(5), 851-861.
PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA E ADMINISTRAÇÃO
Os anticorpos aqui divulgados podem ser preparados numa formulação fisiologicamente aceitável e podem compreender um transportador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis utilizando técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo de acordo com a invenção e, como aqui descrito acima, é combinado com um transportador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis para formar uma composição terapêutica. Os transportadores, diluentes e/ou excipientes farmacêuticos adequados são bem conhecidos na especialidade e incluem, por exemplo, soluções salinas 95 ΕΡ 2 046 833/PT tamponadas com fosfato, água, emulsões tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. A formulação da composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser realizada de acordo com metodologia padrão conhecida dos peritos na especialidade.
As composições da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo na forma de um sólido, líquido ou aerossol numa dose adequada, farmaceuticamente eficaz. Os exemplos de composições sólidas incluem pílulas, cremes e unidades de dosagem implantáveis. As pílulas podem ser administradas oralmente. Os cremes terapêuticos podem ser administrados topicamente. As unidades de dosagem implantáveis podem ser administradas localmente, por exemplo, num local de um tumor, ou podem ser implantadas para libertação sistemática da composição terapêutica, por exemplo, subcutaneamente. Os exemplos de composições líquidas incluem formulações adaptadas para injecção intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, e formulações para administração tópica e intra-ocular. Os exemplos de formulações de aerossol incluem formulações para inalador para administração nos pulmões.
As composições podem ser administradas por vias de administração padrão. Em geral, a composição pode ser administrada pelas vias tópica, oral, rectal, nasal, intradérmica, intraperitoneal ou parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular). Em adição, a composição pode ser incorporada em matrizes de libertação sustentada tais como polímeros biodegradáveis, sendo os polímeros implantados na vizinhança de onde se pretende a entrega, por exemplo, no local de um tumor. O método inclui a administração de uma única dose, a administração de doses repetidas a intervalos de tempo predeterminados, e a administração sustentada durante um período de tempo predeterminado. A matriz de libertação sustentada, como aqui se utiliza, é uma matriz feita de materiais, usualmente polímeros que são degradáveis por hidrólise enzimática ou ácida/básica ou por dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz é influenciada 96 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ por enzimas e fluidos corporais. A matriz de libertação sustentada é desejavelmente escolhida nos materiais biocompativeis tais como lipossomas, polilactidas (ácido poliláctico), poliglicolida (polimero de ácido glicólico), polilactida-co-glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colagénio, sulfato de condroitina, ácidos carboxilicos, ácidos gordos, fosdolipidos, polissacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicone. Uma matriz biodegradável preferida é uma matriz de um de quaisquer de entre polilactida, poliglicolida ou polilactida-co-glicolida (copolimeros de ácido láctico e ácido glicólico). É bem conhecido dos peritos na especialidade pertinente que a dosagem da composição irá depender de vários factores tais como, por exemplo, a condição que se está a tratar, a composição particular utilizada, e outros factores clínicos tais como o peso, dimensão, sexo e condição geral de saúde do paciente, área de superfície corporal, do composto ou composição particulares a administrar, de outros fármacos que estão a ser administrados simultaneamente, e da via de administração. A composição pode ser administrada em combinação com outras composições compreendendo uma substância ou composto biologicamente activos, particularmente pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em compostos contra stress oxidativo, compostos anti-apoptóticos, quelantes de metais, inibidores da reparação de ADN tais como pirenzepina e metabolitos, ácido 3-amino-l-propanossulfónico (3APS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), activadores de a-secretase, inibidores de β- e γ-secretase, proteínas tau, neurotransmissor, destruidores da folha /3, atractores para componentes celulares de depuração/esgotamento de amilóide beta, inibidores de amilóide beta truncada no terminal N incluindo amilóide beta piroglutamada 3-42, moléculas anti-inflamatórias, "antipsicóticos atípicos" tais como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazole ou olanzapina ou inibidores da colinesterase (ChEI) tais como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina, agonistas 97 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ de Ml e outros fármacos incluindo qualquer amilóide ou fármaco modificador de tau e suplementos nutricionais tais como, por exemplo, vitamina B12, cisteina, um precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acetil-L-carnitina, idebenona, propentofilina, ou um derivado de xantina, juntamente com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um transportador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis e procedimentos para o tratamento de doenças. A matéria proteinácea farmaceuticamente activa pode estar presente em quantidades entre 1 ng e 10 mg por dose. Geralmente, o regime de administração deverá estar na gama entre 0,1 pg e 10 mg do anticorpo de acordo com a invenção, particularmente numa gama de 1,0 pg a 1,0 mg, e mais particularmente numa gama entre 1,0 pg e 100 pg, com todos os números individuais que caiem nestas gamas fazendo também parte da invenção. Se a administração ocorrer através de infusão continua, uma dosagem mais correcta pode estar na gama entre 0,01 pg e 10 mg unidades por quilograma de peso corporal por hora com todos os números individuais que caiem nestas gamas fazendo também parte da invenção. A administração será geralmente parentérica, eg intravenosa. As preparações para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis, aquosas ou não aquosas. Os solventes não aquosos incluem, sem lhes estarem limitados, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal tal como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os solventes aquosos podem ser escolhidos do grupo que consiste em água, soluções, emulsões ou suspensões em álcool/aquosas incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer lactada, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reconstituintes de fluidos e nutrientes, reconstituintes de electrólitos (tais como os baseados em dextrose de Ringer) e outros. Podem também estar presentes conservantes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc. 98 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ A composição farmacêutica pode adicionalmente compreender transportadores proteináceos tais como, por exemplo, albumina sérica ou imunoglobulina, particularmente de origem humana. Podem estar presentes outros agentes biologicamente activos na composição farmacêutica da invenção dependendo da sua utilização pretendida.
Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, certas concretizações da invenção proporcionam o anticorpo ou seu fragmento activo para atravessar a barreia hemato-encefálica. Certas doenças neurodegenerativas estão associadas a um aumento na permeabilidade da barreira hemato-encefálica, de modo que o anticorpo ou o seu fragmento activo podem ser prontamente introduzidos no cérebro. Quando a barreira hemato-encefálica permanece intacta, existem várias abordagens conhecidas na especialidade para transportar moléculas através dela, incluindo, mas não se lhes limitando, métodos físicos, métodos à base de lípidos, e métodos à base de receptores e canais.
Os métodos físicos de transporte do anticorpo ou do seu fragmento activo através da barreira hemato-encefálica incluem, mas não se lhes limitando, contornando completamente a barreira hemato-encefálica, ou a criação de aberturas na barreira hemato-encefálica. Os métodos de contorno da barreira incluem, mas não se lhes limitando, injecção directa no cérebro (veja-se, e.g., Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantação de um dispositivo de entrega no cérebro (veja-se, e.g., Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); e Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Os métodos de criação de aberturas na barreira incluem, mas não se lhes limitando, ultra-sons (veja-se, e.g., a Publicação da Patente U.S. 2002/0038086), pressão osmótica (e.g., por administração de manitol hipertónico (Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilização por, e.g., bradiquinina ou permeabilizador A-7 (veja-se, e.g., as Patentes U.S. 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206 e 5,686,416), e a transfecção de neurónios que povoam a barreira hemato-encefálica com vectores contendo genes que codificam o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio (veja-se, e.g., a Publicação da Patente U.S. 2003/0083299). 99
ΕΡ 2 046 833/PT
Os métodos à base de lípidos de transporte do anticorpo ou do seu fragmento activo para atravessar a barreira hemato-encefálica incluem, mas não se lhes limitando, a encapsulação do anticorpo ou do seu fragmento activo em lipossomas que são acoplados a fragmentos de ligação ao anticorpo que se ligam a receptores no endotélio vascular da barreira hemato-encefálica (veja-se, e.g., Publicação do Pedido de Patente U.S. 20020025313), e revestimento do anticorpo ou do seu fragmento activo de partículas de lipoproteína de baixa densidade (veja-se, e.g., a Publicação do Pedido de Patente U.S. 20040204354) ou apolipoproteína E (veja-se, e.g., a Publicação do Pedido de Patente U.S. 20040131692).
Os métodos à base de receptores e canais de transporte do anticorpo ou do seu fragmento activo para atravessar a barreira hemato-encefálica incluem, mas não se lhes limitando, a utilização de bloqueadores de glucocorticóides para aumentar a permeabilidade da barreira hemato-encefálica (vejam-se, e.g., as Publicações de pedidos de Patente U.S. 2002/0065259, 2003/0162695 e 2005/0124533); a activação de canais de potássio (veja-se, e.g., a Publicação do Pedido de Patente U.S. 2005/0089473), a inibição de transportadores de fármacos ABC (veja-se, e.g., Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0073713); o revestimento de anticorpos com uma transferrina e a modulação da actividade de um ou mais receptores de transferrina (veja-se, e.g., a Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0129186), e cationização dos anticorpos (veja-se, e.g., a Patente U.S. 5,004,697).
DETECÇÃO/DIAGNÓSTICO
Numa outra concretização a presente invenção proporciona métodos e kits para a detecção e diagnóstico de doenças ou condições associadas a amilóide. Estes métodos incluem métodos imunológicos vulgarmente conhecidos utilizados para a detecção ou quantificação de substâncias em amostras biológicas ou numa condição in situ. O diagnóstico de uma doença ou condição associada a amilóide num paciente pode ser conseguido por detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou de um 100 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ seu fragmento activo a um epítopo da proteína amilóide numa amostra ou in situ, o que inclui levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas que se suspeita conterem a proteína amilóide ao contacto com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína amilóide, permitir que o anticorpo se ligue à proteína amilóide para formar um complexo imunológico, detectar a formação do complexo imunológico e correlacionar uma presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína amilóide na amostra ou na parte ou área específicas do corpo.
As amostras biológicas que podem ser utilizadas no diagnóstico de uma doença ou condição associadas a amilóide são, por exemplo, fluidos tais como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, muco, fluido cerebrospinal, fluido linfático e similares ou amostras de tecido ou de células obtidas de um organismo tais como tecido neural, cerebral, cardíaco ou vascular. Para a determinação da presença ou ausência da proteína amilóide numa amostra pode-se utilizar qualquer imunoensaio conhecido das pessoas competentes na matéria. (Veja-se Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612) tais como, por exemplo, ensaios que utilizam métodos de detecção indirecta utilizando reagentes secundários para a detecção, ensaios ELISA e imunoprecipitação e aglutinação. É dada uma descrição detalhada destes ensaios, por exemplo, em WO96/13590 de Maertens e Stuyver, Zrein et ai. (1998) e WO96/29605.
Para o diagnóstico in situ, o anticorpo ou qualquer sua parte activa e funcional podem ser administrados ao organismo a diagnosticar por métodos conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, injecção intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial, de modo a que possa ocorrer a ligação específica entre o anticorpo de acordo com a invenção e uma região epitópica na proteína amilóide. O complexo anticorpo/antigénio pode ser detectado através de um marcador ligado ao anticorpo ou a um seu fragmento funcional.
Os imunoensaios utilizados em aplicações de diagnóstico assentam tipicamente em antigénios, anticorpos ou reagentes secundários marcados para detecção. Estas proteínas ou 101
ΕΡ 2 046 833/PT reagentes podem ser marcados com compostos geralmente conhecidos dos peritos na especialidade incluindo enzimas, radioisótopos e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogénicas incluindo partículas coloridas, tais como contas de látex e de ouro coloidal. Destas, a marcação radioactiva pode ser utilizada para quase todos os tipos de ensaios e com a maioria das variações. Os marcadores conjugados com enzimas são particularmente úteis quando a radioactividade tem que ser evitada ou quando são necessários resultados rápidos. Os fluorócromos, embora requerendo equipamento dispendioso para a sua utilização, proporcionam um método de detecção muito sensível. Os anticorpos úteis nestes ensaios incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos policlonais purificados por afinidade.
Alternativamente, o anticorpo pode ser marcado indirectamente por reacção com substâncias marcadas que possuem uma afinidade para com imunoglobulina, tais como proteína A ou G ou segundos anticorpos. O anticorpo pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada possuindo uma afinidade para com a segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e o conjugado anticorpo-biotina pode ser detectado utilizando avidina ou estreptavidina marcadas. Similarmente, o anticorpo pode ser conjugado com um hapteno e o conjugado anticorpo-hapteno pode ser detectado utilizando anticorpo anti-hapteno marcado.
As pessoas competentes na matéria conhecerão estes e outros marcadores adequados que podem ser empregues de acordo com a presente invenção. A ligação destes marcadores aos anticorpos ou seus fragmentos pode ser realizada utilizando técnicas padrão vulgarmente conhecidas pessoas competentes na matéria. As técnicas típicas estão descritas por Kennedy, J.H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), e Schurs, A.H.W.M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 81:1-40). As técnicas de acoplamento mencionadas neste último são o método do glutaraldeído, o método do periodato, o método da dimaleimida, e outros.
Os imunoensaios correntes utilizam um método de anticorpo duplo que detecta a presença de um analito, em que o anticorpo 102 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ é marcado indirectamente por reactividade com um segundo anticorpo que foi marcado com um marcador detectável. O segundo anticorpo é preferivelmente um que se liga a anticorpos do animal do qual o anticorpo monoclonal é derivado. Por outras palavras, se o anticorpo monoclonal é um anticorpo de ratinho, então o segundo anticorpo, marcado, é um anticorpo anti-ratinho. Para o anticorpo monoclonal ser utilizado no ensaio descrito adiante, estes marcador é preferivelmente uma conta revestida com anticorpo, particularmente uma conta magnética. Para o anticorpo policlonal ser empregue no imunoensaio aqui descrito, o marcador é preferivelmente uma molécula detectável tal como uma substância radioactiva, fluorescente ou electro-quimioluminescente.
Um sistema de anticorpo duplo alternativo, frequentemente referido como sistema de formato rápido porque está adaptado a determinações rápidas da presença de um analito, pode também ser empregue dentro do âmbito da presente invenção. O sistema requer elevada afinidade entre o anticorpo e o analito. De acordo com uma concretização da presente invenção, a presença da proteína amilóide é determinada utilizando um par de anticorpos, cada um específico para a proteína amilóide. Um dos referidos pares de anticorpos é referido aqui como um "anticorpo detector" e o outro dos referidos pares de anticorpos é referido aqui como um "anticorpo de captura". O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser utilizado tanto como anticorpo de captura ou anticorpo detector. O anticorpo monoclonal da presente invenção pode também ser utilizado tanto como anticorpo de captura como detector, conjuntamente num único ensaio. Uma concretização da presente invenção utiliza assim o método sanduíche de anticorpo duplo para a detecção de proteína amilóide numa amostra de fluido biológico. Neste método, o analito (proteína amilóide) é ensanduichado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura, estando o anticorpo de captura irreversivelmente imobilizado num suporte sólido. O anticorpo detector conterá um marcador detectável, de modo a identificar a presença da sanduíche anticorpo-analito e portanto a presença do analito.
Os exemplos de substâncias de fase sólida incluem, mas não se lhes limitando, placas de microtítulo, tubos de ensaio 103 ΕΡ 2 046 833/PT de poliestireno, contas magnéticas, de plástico ou vidro e lâminas, que são bem conhecidos no campo do radioimunoensaio e imunoensaio enzimático. Os métodos para acoplamento de anticorpos a fases sólidas são também bem conhecidos dos peritos na especialidade. Mais recentemente, foram empregues como suportes sólidos vários materiais porosos tais como nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos. É também divulgado um kit de diagnóstico para a detecção de proteína amilóide numa amostra biológica compreendendo uma composição, como acima definido. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a este último kit de diagnóstico que, em adição à composição como definido acima, também compreende um reagente de detecção, como definido acima. A expressão "kit de diagnóstico" refere-se em geral a qualquer kit de diagnóstico conhecido na especialidade. Mais especificamente, esta última expressão refere-se a um kit de diagnóstico como descrito em Zrein et al. (1998). É ainda um outro objecto proporcionar novas imuno-sondas e kits de ensaio para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo anticorpos. Para as imuno-sondas, os anticorpos são directamente ou indirectamente ligados a uma molécula repórter adequada, e.g., uma enzima ou um radionuclido. O kit de teste inclui um recipiente contendo um ou mais anticorpos e instruções para utilização dos anticorpos com a finalidade de ligar a proteína amilóide para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlacionam com a presença ou ausência de proteína amilóide.
EXEMPLOS
Materiais O desenvolvimento e a preparação do anticorpo monoclonal de ratinho ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, ao longo de todo o pedido de patente) está descrito no pedido co-pendente EP 05 02 7092.5, apresentado em 12.12.2005. 104
ΕΡ 2 046 833/PT Células de hibridoma FP-12H3-C2, produtoras do anticorpo monoclonal de ratinho ACI-01-Ab7C2 (denominado "mC2" e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, ao longo de todo o pedido de patente) foram depositadas em 01 de Dezembro de 2005 no pedido co-pendente EP 05027092.5 no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, segundo as disposições do Tratado de Budapeste e foi-lhes atribuído o n.° de acesso DSM ACC2750.
As células de hibridoma foram cultivadas em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (Penicilina/Estreptomicina). O isotipo do anticorpo produzido foi verificado e constatou-se ser IgG2b/capa de ratinho, como esperado.
Ensaio
Um ELISA para a ligação a Amilóide Beta proporcionou uma medida fiável da potência de anticorpos C2. Anticorpos de controlo positivo, o anticorpo murino FP-12H3-C2 (Genovac Lote N.°: AK379/01), e anticorpo 1560 padrão Chemicon (Lote n.°: 0508008791).
Escolha de regiões constantes humanas
Como o recrutamento do sistema imunitário não é desejável para o candidato a anticorpo clínico, a região constante humana seleccionada para a cadeia pesada foi IgG4 humana, modificada para a troca de Serina na posição 228 na região de charneira para Prolina (HuIgG4 Ser-Pro). Esta mutação estabiliza a ligação dissulfureto intercadeias e previne a formação de meias-moléculas que pode ocorrer em preparações de IgG4 humana nativa. O anticorpo expresso a partir de linhas celulares de produção terá também a lisina terminal removida. As sequências de regiões constantes humanas HuIgG4 Ser-Pro e capa humana são dadas em SEQ ID NO:17 e 14, respectivamente.
Exemplo 1. Clonagem e Sequenciação de Regiões Variáveis de Anticorpos
Preparou-se o ARN total a partir de 3 x 106 células de hibridoma (um balão T175) utilizando o kit RNeasy mini da 105
ΕΡ 2 046 833/PT
Qiagen (N.° de Cat.: 74104). Eluíu-se o ARN em 50 yL de água e verificou-se num gel de agarose a 1,2%. O meio condicionado das células foi retido e foi utilizada uma amostra para o teste no ensaio da actividade do anticorpo.
Os ADNc de VH e VK foram preparados utilizando transcriptase inversa com iniciadores de IgG de ratinho e região constante k. Os ADNc da primeira cadeia foram amplificados por PCR utilizando um grande conjunto de iniciadores de sequência de sinal. Os ADN amplificados foram purificados em gel e clonados no vector pGem® T Easy (Promega). Os clones de VH e VK obtidos foram rastreados quanto a inserções do tamanho esperado por PCR e a sequência de ADN dos clones seleccionados foi determinada por sequenciação automática de ADN. As localizações das regiões determinantes de complementaridade (CDR) nas sequências foram determinadas com referência a outras sequências de anticorpos (Kabat EA et al., 1991) . A convenção de numeração de Kabat para regiões variáveis de anticorpos é utilizada ao longo de todo o presente pedido; portanto os números dos resíduos podem diferir da numeração estritamente linear. A sequência de ADN e a sequência de aminoácidos deduzida para VK de mC2 estão apresentadas em SEQ ID NO: 29 e 27, respectivamente. Quatro clones originaram esta sequência produtiva idêntica. Foi também encontrada em vários clones uma sequência VK aberrante, não produtiva, que surge do parceiro de fusão do hibridoma.
Para a VH de mC2, foram isoladas duas sequências produtivas diferentes. A sequência VH AF de mC2 (veja-se SEQ ID NO:30) foi encontrada num total de 29 clones, com 14 alterações de um único par de bases em clones individuais. A sequência VHB de mC2 foi encontrada num total de 8 clones. Cinco destes representaram a sequência maioritária, sendo os outros 3 clones variações desta. É possível que estas sequências VH B similares surjam como um artefacto da amplificação por PCR. Foi também obtida uma VH aberrante não produtiva a partir do hibridoma de C2 e é atribuída a uma união V-D-J defeituosa. 106 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Para determinar qual é a VH de mC2 activa correcta, prepararam-se dois anticorpos quiméricos com as duas diferentes sequências de VH, AF e B, combinadas com a VK de mC2, para serem testados quanto à correcta actividade do anticorpo.
Exemplo 2. Construção de Genes do Anticorpo Quimérico
Um anticorpo quimérico humano na sua forma mais comum consiste em regiões constantes humanas ligadas a regiões variáveis murinas (ou outras não humanas). Um anticorpo quimérico proporciona uma ferramenta muito útil, primeiro para a confirmação de que foram identificadas as regiões variáveis correctas, e depois para utilização como anticorpo de controlo em ensaios de ligação ao antigénio com as mesmas funções efectoras e utilizando os mesmos reagentes de detecção secundários como anticorpo humanizado ou manipulado, e também pode ser utilizado para investigar a farmacocinética e outras propriedades das regiões constantes humanas com referência ao alvo particular para o anticorpo.
Foram construídos dois vectores de expressão da cadeia pesada quimérica consistindo em regiões variáveis VH AF de mC2 ou VH B de mC2 ligadas à região constante HuIgG4 (Ser-Pro) no vector de expressão pSVgpt. Este baseia-se no pSV2 gpt (Mulligan e Berg, 1980) e inclui o gene de resistência a ampicilina para selecção em células bacterianas, o gene gpt para selecção em células de mamífero, a região potenciadora da cadeia pesada de imunoglobulina murina, a sequência genómica que codifica o gene da região constante e sequências poli A de SV40. A região variável da cadeia pesada para expressão é inserida sob a forma de um fragmento de HindiII a BamEI.
Foi construído um vector da cadeia leve quimérica consistindo em VK de C2 ligada à região constante capa C humana no vector de expressão pSVhyg. (Hieter PA et al., 1980) O pSVhyg inclui o gene de resistência a ampicilina para selecção em células bacterianas, o gene hyg para selecção em células de mamífero, a região potenciadora da cadeia pesada de imunoglobulina murina, a sequência genómica que codifica o gene da região constante capa e incluindo sequências potenciadoras capa e poli A de SV40. A região variável da 107 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ cadeia leve para expressão é inserida sob a forma de um fragmento de HindiII a BamEI.
Foram construídas cassetes de expressão para as sequências VH e VK de C2 murino por adição de uma sequência flanqueadora a 5' incluindo o péptido de sinal de comando, o intrão de comando e o promotor de imunoglobulina murina, e uma sequência flanqueadora a 3' incluindo o local de splicing e a sequência de intrão, utilizando os vectores VH-PCR1 e VK-PCR1 como moldes (Riechmann et al., 1988). A sequência de ADN foi confirmada como estando correcta para VH e VK nos vectores de expressão quiméricos. As sequências de ADN e de aminoácidos dos genes de VH e VK nas cassetes de expressão estão apresentadas nas Figuras 1 e 2.
Exemplo 3. Expressão de Anticorpos Quiméricos 3.1 Expressão em linhas celulares estáveis A linha de células hospedeiras para expressão do anticorpo foi a NSO, um mieloma de ratinho não produtor de imunoglobulina, obtida da European Collection of Animal Cell Cultures, Porton RU (ECACC N.° 85110503). Os vectores de expressão da cadeia pesada e leve foram co-transfectados em células NSO por electroporação. As colónias que expressam o gene gpt foram seleccionadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 0,8 yg/ml de ácido micofenólico e 250 yg/ml de xantina. Os clones de células transfectadas foram rastreados quanto à produção de anticorpo humano por ELISA para IgG humana. As linhas celulares que segregam anticorpo foram expandidas e as melhores produtoras foram seleccionadas e congeladas em azoto liquido. As linhas celulares melhores produtoras para cada anticorpo foram expandidas em meio como acima mas com apenas 5% de FBS. Os anticorpos quiméricos foram purificados utilizando Prosep®-A (Bioprocessing Ltd) . A concentração foi determinada por ELISA para anticorpo IgGx humano. Os anticorpos foram também analisados por SDS-PAGE. 3.2 Expressão transiente de anticorpos quiméricos
Para facilitar o teste dos diferentes anticorpos quiméricos, utilizou-se expressão transiente para produzir 108 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ rapidamente pequenas quantidades de sobrenadante celular contendo anticorpo recombinante para teste. As cassetes de expressão de VH e VK de mC2 foram transferidas para vectores baseados em pcDNA3.1 (Invitrogen) para expressão transiente. O vector da cadeia pesada incluía uma região constante de IgG humana. O vector da cadeia leve incluía uma região constante capa humana. Ambas a VH AF de mC2 e a VH B de mC2 foram transfectadas com VK de mC2 em células de rim embrionário humano (HEK 298) com o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen N.° de Cat.: 11668) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O meio condicionado foi recolhido das células 3 dias após a transfecção. A quantidade de anticorpo produzida foi determinada por ELISA para anticorpo IgGx humano.
Exemplo 4. Actividade de Anticorpos C2 Quiméricos 4.1 Actividade de anticorpos C2 quiméricos produzidos por transfecção transiente
Amostras de meio condicionado de transfecção transiente para os dois anticorpos quiméricos diferentes foram testadas no ELISA quanto a ligação a Amilóide Beta. Os resultados indicam claramente que a VH AF de C2 é a sequência correcta. O anticorpo quimérico C2 VH AF/C2 VK liga-se bem no ensaio, mas o C2 VH B/C2 VK não apresenta, de todo, qualquer ligação. O anticorpo de controlo murino Chemicon 1560 apresentou boa ligação, mas a ligação pelo anticorpo C2 murino purificado fornecido foi baixa. Deverá notar-se que foi empregue um anticorpo secundário diferente para os anticorpos murinos com as regiões constantes de ratinho em comparação com os anticorpos quiméricos com regiões constantes humanas, de modo que os resultados não são directamente comparáveis.
Verificou-se mais tarde que o meio condicionado do hibridoma de C2 dá um bom resultado no ensaio. 4.2 Actividade de anticorpos C2 quiméricos purificados
Os dois anticorpos C2 quiméricos diferentes foram purificados a partir de linhas celulares NS0 estáveis como descrito e testados utilizando o ELISA para Amilóide Beta. Os resultados obtidos estão de acordo com os resultados obtidos com anticorpo expresso transientemente. O anticorpo 109 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ C2 ChVH AF/ChVK liga-se bem no ELISA e o anticorpo C2 ChVH B/ChVK não se liga de todo.
Exemplo 5. Desenho de Genes de Anticorpo C2 Humanizado
As sequências de aminoácidos de VH e VK de mC2 foram comparadas com sequências VH e VK de anticorpo de roedor nas bases de dados NCBI e Kabat. 5.1 Região variável da cadeia leve O gene da linha germinativa de ratinho com correspondência mais próxima de VK de mC2 é bbl, Locus MMU231201, (Schable et al, 1999). Apenas dois aminoácidos diferem desta sequência da linha germinativa, ambos localizados no interior de CDRL1. Encontraram-se anticorpos murinos maduros com sequência similar, mas não idêntica. Vários possuem uma CDRL2 idêntica e uma CDRL3 idêntica, mas a CDRL1 de mC2 parece ser única. A VK de mC2 pode ser atribuída ao subgrupo de Kabat MuVKII. A posição 87 de VK de mC2 é F em vez de Y que é mais comum no subgrupo, indicando que este resíduo de esqueleto pode ser importante para a actividade do anticorpo. Uma comparação com sequências VK da linha germinativa humana mostra que os genes do subgrupo VKII são a melhor correspondência para VK de mC2 (Cox et al, 1994) . A sequência DPK15 juntamente com a região J humana HuJKl foram seleccionadas para proporcionar as sequências de esqueleto aceitadoras para a VK humanizada.
Foram desenhadas quatro sequências VK humanizadas. C2HuVKl consiste em CDR de VK de mC2 com esqueletos de DPK 15 e JK1 humana. Nas versões 2, 3 e 4, resíduos de murino foram substituídos no esqueleto nas posições 45 ou 87 ou ambas. O resíduo 45 pode estar envolvido no suporte da conformação das CDR. O resíduo 87 está localizado na interface dos domínios VH e VK. Portanto, estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação do anticorpo.
As posições e alterações que foram feitas nas regiões de esqueleto da cadeia leve estão apresentadas na Tabela 6. Uma comparação das sequências humanizadas com a sequência VK de mC2, e com DPK15 e JK1 humana. 110 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ 5.2 Região variável da cadeia pesada O gene da linha germinativa de ratinho com a correspondência mais próxima de VH AF de mC2 é VH7183, Locus AF120466, (Langdon et al, 2000). A comparação está apresentada na Figura 3. Nove aminoácidos diferem desta sequência da linha germinativa, estando a maioria localizados no interior da CDR2. Encontram-se anticorpos murinos maduros com CDR1 idêntica ou similar (um resíduo diferente) ou com CDR2 similar (um resíduo diferente) , mas nenhum com todas as três CDR idênticas a VH AF de mC2. A CDR3 do anticorpo mC2 é invulgarmente curta, consistindo em apenas três resíduos. Contudo, encontram-se outros anticorpos na base de dados com a CDR3 com este comprimento. A VH AF de mC2 pode ser atribuída ao subgrupo de Kabat MuVHIIID. O resíduo 4 7 de VH de mC2 é L em vez de W, mais comum, e o resíduo 94 é S em vez do normal R, indicando que estes resíduos de esqueleto podem ser importantes para a actividade do anticorpo. Uma comparação com sequências VH da linha germinativa humana mostra que os genes do subgrupo VHIII são a melhor correspondência para VH de mC2. A sequência DP54 juntamente com a região J humana HuJh6 foram seleccionadas para proporcionar as sequências de esqueleto aceitadoras para a VH humanizada.
Foram desenhadas quatro sequências VH humanizadas. A C2HuVHl consiste em CDR de VH AF de mC2 com esqueletos de DP54 e HuJh6 . Nas versões 2, 3 e 4, resíduos de murino foram substituídos no esqueleto nas posições 47 ou 94 ou ambas. O resíduo 47 no esqueleto 2 está em contacto tanto com as CDR como com o domínio VK. O resíduo 94 pode estar envolvido no suporte da conformação das CDR. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação do anticorpo.
As posições e alterações que foram feitas nas regiões de esqueleto da cadeia pesada estão apresentadas na Tabela 7.
Exemplo 6. Construção de Genes do Anticorpo Humanizado
As regiões variáveis modificadas foram construídas através do método de recombinação por PCR com sobreposição. As cassetes de expressão para o anticorpo quimérico, C2 ChVH AF e 111 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ C2 ChVK, foram utilizadas como moldes para mutagénese das regiões de esqueleto para as sequências requeridas. Foram sintetizados conjuntos de pares de iniciadores mutagénicos abrangendo as regiões a alterar. As cassetes de expressão de VH e VK humanizadas produzidas foram clonadas em pUC19 e confirmou-se que toda a sequência de ADN estava correcta para cada VH e VK. Os genes da região V da cadeia pesada e leve modificados foram excisados de pUC19 sob a forma de cassetes de expressão de HindiII a BamHI. Estas foram transferidas para os vectores de expressão pSVgpt e pSVhyg que incluem IgG4 Ser-pro humana ou regiões constantes k, respectivamente, como para os vectores de anticorpo quimérico. Confirmou-se que a sequência ADN estava correcta para as VH e VK humanizadas nos vectores de expressão.
Exemplo 7. Expressão de Anticorpos Humanizados 7.1 Expressão em linhas celulares estáveis
Os vectores de expressão de cadeia pesada e leve humanizadas foram co-transfectados em células NSO por electroporação, como para a expressão de anticorpos quiméricos. As linhas celulares produtoras de anticorpo foram seleccionadas e expandidas e os anticorpos humanizados foram purificados, exactamente como para o anticorpo quimérico. Os anticorpos purificados foram analisados por SDS-PAGE. 7.2 Expressão transiente de anticorpos humanizados
Para facilitar o teste das diferentes construções de VH e VK humanizadas, as cassetes de expressão de VH e VK humanizadas de C2 foram também transferidas para os vectores para a expressão transiente descrita na secção 7.2. As quatro construções de VK de C2 humanizado foram co-transfectadas com a construção de VH de C2 quimérico em células HEK293. Similarmente, as quatro construções de VH de C2 humanizado foram co-transfectadas com a construção de VK de C2 quimérico em células HEK293. O meio condicionado foi recolhido das células três dias após a transfecção. A quantidade de anticorpo produzido foi determinada por ELISA para anticorpo IgGx humano. 112
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Exemplo δ. Actividade de Anticorpos C2 Humanizados 8.1 Actividade de anticorpos C2 humanizados produzidos por transfecção transiente
Amostras de meio condicionado da transfecção transiente foram testadas no ELISA para Amilóide Beta. Os resultados obtidos indicam claramente que as construções de VH humanizada C2 HuVH AF versões 2 e 4 são funcionais quando combinadas com a cadeia capa de C2 quimérico, e são comparáveis com o anticorpo C2 quimérico no ensaio. Pelo contrário, os anticorpos contendo C2 HuVH AF versões 1 e 3 combinadas com a cadeia capa de C2 quimérico não apresentam qualquer ligação, de todo no ensaio. Isto indica que a substituição do resíduo de murino na posição 94 é essencial para a actividade do anticorpo. Os anticorpos contendo a cadeia pesada de C2 quimérico combinada com as quatro cadeias capa de C2 humanizado apresentaram todos boa ligação, comparável com o anticorpo quimérico, no ELISA. 8.2 Actividade de anticorpos C2 humanizados purificados
Oito diferentes anticorpos C2 humanizados compreendendo todas as combinações de duas cadeias pesadas humanizadas e quatro cadeias leves humanizadas foram purificados a partir de linhas celulares NSO estáveis como descrito e testado utilizando o ELISA para Amilóide Beta (Figura 4).
Os resultados obtidos indicam claramente que os anticorpos C2 HuVH4 têm melhor desempenho no ensaio do que os anticorpos C2 HuVH2. Dos anticorpos C2 HuVH2, o C2 HuVH2/HuVK3 apresentou a melhor actividade de ligação, mas esta é aproximadamente 2 vezes reduzida em comparação com o anticorpo quimérico de controlo C2 ChVHAF/ChVK. A actividade de C2 HuVH2/HuVK2 é quatro a cinco vezes reduzida comparativamente com o controlo. As actividades dos anticorpos compreendendo C2HuVH4 com as quatro diferentes cadeias leves humanizadas são similares. A maior actividade é observada para C2HuVH4/HuVKl e todos os quatro anticorpos estão próximos do anticorpo quimérico de controlo no ensaio. 113
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Exemplo 9. Modificações em CDRL2 9.1 Desenho da cadela leve com CDR2 modificada
Como notado acima, muitos anticorpos partilham a mesma sequência CDRL2 ("KVSNRFS") com o anticorpo C2. Foi decidido testar se a CDRL2 podia ser modificada ligeiramente sem afectar adversamente a actividade do anticorpo. Foram seleccionadas duas substituições conservativas: K por R na posição 50 e N por S na posição 53. As duas sequências CDRL2 alternativas são portanto "RVSNRFS" e "KVSSRFS". Estas foram incorporadas na sequência VK murina sem qualquer outra alteração, como VK-R de mC2 e VK-S de mC2, respectivamente. 9.2 Expressão transiente de anticorpo com CDRL2 modificada
As duas construções da cadeia leve de C2 com CDRL2 modificada descritas na Secção 11.2.1 foram clonadas no vector da cadeia leve para expressão transiente. Cada uma foi co-transfectada com o vector de VH de C2 quimérico em células HEK293. O meio condicionado foi recolhido das células três dias após a transfecção. A quantidade de anticorpo produzida foi determinada por ELISA para anticorpo IgGx humano. 9.3 Actividade de anticorpo C2 com CDRL2 modificada
Amostras de meio condicionado da transfecção transiente de VKs de mC2 com CDRL2 modificada combinada com VH de mC2 foram testadas no ELISA para Amilóide Beta. (Figura 5) Ambos os anticorpos VK-R e VK-S são comparáveis ao anticorpo C2 quimérico, indicando que as modificações individuais em CDRL2 escolhidas não afectam marcadamente a actividade do anticorpo no ensaio.
Exemplo 10. Determinação da Afinidade
Para determinar a especificidade e a afinidade de ligação de anticorpos de ratinho (ACI-01-Ab-7-C2) quiméricos (AF) e humanizados (H4K1; H4K4) , realizou-se a análise BIACORE™ utilizando monómeros e fibras de amilóide beta 1-42 como antigénio imobilizado num chip CM5. A tecnologia BIACORE™ 114 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ utiliza alterações no índice de refracção na camada de superfície após ligação do anticorpo ao antigénio imobilizado sobre a camada. A ligação é detectada por ressonância plasmónica de superfície (SPR) de luz laser que sofre refracção a partir da superfície. A análise da cinética do sinal "on rate" e "off rate" permite a discriminação entre interacção não específica e específica. A concentração de anticorpo utilizada estava na gama de 0,05 μΜ a 1,0 μΜ.
Tabela 1: Especificidade e afinidade de ligação de anticorpos de ratinho (ACI-01-Ab-7-C2) quiméricos (AF) e humanizados (H4K1; H4K4) relativamente a monómeros e fibras de amilóide beta 1-42
Monómeros Fibras ka (1/Ms) kd(l/s) KD (M) ka(l/Ms) kd(l/s) KD (M) Ratinho ACI-0l-Ab-7-C2 1,8E+04 2,7E-03 1,5E-07 2,4E+04 9,9E-04 4,1E-08 quimérico AF 4,7E+04 9,5E-0 4 2E-08 5,1E+04 3,3E-0 4 6,5E-0 9 humanizado H4K1 5,0E+04 9,5E-04 1,9E-08 4,9E+04 2,3E-04 4,7E-09 humanizado H4K4 2,5E+04 4,4E-04 1,8E-08 1,3E+05 3,0E-04 2,3E-09
Exemplo 11. Ensaio de Ligação Imuno-histoquímico 11.1 Secções de cérebro humano Cérebros de pacientes saudáveis, pré-DA não dementes e pacientes de DA foram obtidos da Universitátsklinik em Bonn após aprovação ética. Os cérebros foram fixados em formaldeído e a região do hipocampo foi desidratada, embebida em parafina e foram cortadas secções de 5 μιη com um micrótomo. As secções de parafina foram armazenadas à TA até à utilização. Para o material fresco, cortaram-se criossecções de 5 ym com um crióstato e armazenaram-se as secções a -80°C até à utilização. 11.2 Imuno-histoquímica
As secções em parafina foram desparafinizadas e reidratadas banhando as lâminas em xileno seguido de etanol a 100%, etanol a 90% e etanol a 70%. O ruído de fundo foi 115 ΕΡ 2 046 833/PT diminuído por incubação 30 minutos em H2O2 a 10%, metanol a 10% em água. A recuperação do antigénio foi realizada incubando as lâminas em ácido fórmico a 100% durante 3 minutos. Após 3 lavagens com solução salina tamponada com Tris (TBS, pH 7,5), bloqueou-se a marcação não específica através de uma incubação de 2 horas das lâminas em BSA a 10%, Triton X-100 a 0,25% em TBS. Após a lavagem (3 lavagens com TBS) realizou-se o bloqueio de anticorpos endógenos por adição de uma IgG anti-humana não marcada (Biomeda) e incubação das lâminas em câmaras húmidas durante a noite à TA. Após mais 3 lavagens, o anticorpo primário humano anti-amilóide foi adicionado às lâminas e incubou-se mais 24 horas à TA. Após lavagem, adicionou-se um anticorpo secundário anti-IgG humana (Sigma) marcado com fosfatase alcalina às lâminas e incubou-se durante 2 horas à TA. Após lavagem, revelaram-se as lâminas com Vermelho permanente líquido (DakoCytomation), lavaram-se com água e secaram-se ao ar antes da montagem com meio de montagem permanente (CorbitBalsam).
As criossecções foram fixadas em metanol durante 30 minutos a -80°C e o ruído de fundo foi diminuído por adição de H2O2 ao metanol frio até uma concentração final de 10% e incubação durante 30 minutos à TA. Após 3 lavagens com solução salina tamponada com Tris (TBS, pH 7,5), bloqueou-se a marcação não específica através de uma incubação de 2 horas das lâminas em BSA a 10%, Triton X100 a 0,25% em TBS como acima e realizou-se o mesmo procedimento de coloração que foi realizado acima.
As secções foram examinadas com um microscópio Leica DMLB e fotografadas utilizando uma câmara Leica DC500 e software Leica FireCaml.2.0.
Ambos os anticorpos humanos A e C marcaram placas de cérebros de pacientes da doença DA (Figura 6). Foram marcadas tanto placas difusas como nucleadas. Adicionalmente, placas difusas em pacientes de pré-DA não dementes podiam também ser detectadas pelos anticorpos A e C. A amilóide na angiopatia amilóide cerebral (AAC) foi marcada com ambos os anticorpos e foi também detectada alguma coloração de neurónios que pode corresponder a amilóide intracelular. Não foi observada qualquer marcação em cérebros de controlo de pacientes 116 ΕΡ 2 046 833/PT saudáveis. As placas podiam ser detectadas em secções de parafina pré-tratadas com ácido fórmico mas nenhuma placa foi marcada em secções de parafina sem pré-tratamento com ácido fórmico e em criossecções fixadas em metanol. O anticorpo B humano não detectou placas em secções de parafina e o anticorpo de ratinho não corou nem em secções de parafina nem em criossecções de cérebros humanos.
Abreviaturas: A = anticorpo quimérico AF (IgG4) (mC2ChVHAF) com ligação B = anticorpo quimérico B (IgG4) (mC2VHB) sem ligação C = anticorpo humanizado H4K1 (IgG4) (HuVH4/HuVKl) com ligação
Ratinho = anticorpo de ratinho ACI-01-Ab-C2 (IgG2b)
Exemplo 12. Funcionalidade de mC2 em Fibras Amilóides 12.1 Modificação da Conformação de Fibras de Αβ1-42 e Iniciação da Desagregação após Ligação do Anticorpo mC2
Para avaliar o mecanismo através do qual o anticorpo é capaz de desagregar fibras pré-formadas de beta-amilóide (AySi_42) realizou-se uma comparação do ensaio de fluorescência com Tioflavina-T (Th-T) lado a lado medindo a desagregação e a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em estado sólido de péptido A/31-42 marcado com U“13C Tirosina 10 e Valina 12 analisando a conformação secundária (Figura 7A). O anticorpo mC2 solubilizou 35,4% das fibras de A/31-42 pré-formadas e simultaneamente induziu um desvio na conformação secundária de folha beta para serpentina aleatória. A redução na população de conformação em folha beta relativamente à serpentina aleatória é da ordem de 35% e está portanto em estreita concordância com a que foi medida utilizando o ensaio de fluorescência com Th-T (Figura 7B). Estes resultados indicam que a ligação do anticorpo mC2 inicia uma transição da estrutura secundária que potencialmente causa uma destabilização do arranjo intermolecular paralelo das folhas beta que efectua uma quebra de fibras alongadas em fragmentos menores. 117 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ 12.2 Afinidade de Ligação Dependente da Conformação de Anticorpo mC2
Como é bem conhecido na literatura cientifica que uma proporção da energia da ligação anticorpo-antigénio pode ser utilizada para a modificação dependente da energia da conformação de um antigénio (Blond e Goldberg, 1987), realizou-se uma experiência de comparação da afinidade de ligação do anticorpo C2 com a proteina A/3i_42 completa e com um péptido menor, de nove aminoácidos de comprimento, compreendendo o epítopo do anticorpo (Figura 8) . Para esta comparação, as afinidades do anticorpo humanizado C2 foram analisadas por ELISA utilizando péptidos biotinilados cobrindo a sequência de aminoácidos completa do epítopo de C2 (produzidos por Mimotopes e adquiridos a ANAWA Trading SA) e um péptido A/3i_42 completo biotinilado (Bachem) . A análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes) . Como demonstrado na Figura 8 e na Tabela 2, o anticorpo liga-se com uma afinidade 36,0% maior ao péptido compreendendo o seu epítopo específico (aminoácidos 13-21 da sequência de A/3i_42) do que à proteína A/31-42 completa. É portanto sugerido que a diferença na energia da afinidade de ligação foi utilizada para a transição consumidora de energia da conformação secundária da proteína amilóide para apresentar o antigénio numa posição mais aceitável para a interacção com o anticorpo. Isto explica porque a afinidade do anticorpo é menor para a proteína nativa (uma proteína amilóide completa) do que para a subunidade isolada.
Tabela 2 D. 0. Amilóide beta 13-21 Amilóide beta 1-42 hC2 1,225 0,9005 IgG de Controlo 0,171 0,196
Exemplo 13. Efeitos do hC2 anti-amilóide sobre a agregação de péptido amilóide beta 1-42
Para avaliar a capacidade do anticorpo monoclonal hC2 humanizado anti-amilóide beta humana mediar os efeitos anti- 118 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ agregação e de desagregação sobre a amilóide beta (A/3) realizou-se um ensaio de espectrofluorescência com tioflavina T. 13.1 Ensaio de Inibição da Agregação Pó de A/3i_42 liofilizada foi reconstituído em hexafluoroisopropanol (HFIP) até 1 mM. A solução de péptido foi tratada com ultra-sons durante 15 min à temperatura ambiente, agitada durante a noite, e dividida em alíquotas em tubos de microcentrífuga não siliconizados. 0 HFIP foi depois evaporado sob uma corrente de árgon. 0 filme de péptido resultante foi seco sob vácuo durante 10 min e armazenado a -80°C até ser utilizado.
Para o ensaio quanto à inibição mediada por anticorpos da agregação de A/31-42, o anticorpo hC2 foi pré-diluído em PBS e foi preparada uma solução de ensaio contendo os seguintes componentes num tubo de incubação não siliconizado: anticorpo pré-diluído a 3,3 ou 0,33 μΜ, tioflavina T 10 μΜ, A/31-42 33 μΜ e DMSO a 8,2%. Portanto as proporções molares finais entre anticorpo e A/31-42 eram de 1:10 e 1:100. Foram também preparadas soluções de controlo apropriadas. As soluções foram então incubadas durante 24 h a 37°C, e a espectrofluorescência (unidades de fluorescência relativa; RFU) foi lida em seis réplicas em placas pretas de 384 poços (Perkin-Elmer) num espectrofluorómetro Perkin-Elmer FluoroCount. A espectrofluorêscencia foi então medida e a % de desagregação foi calculada como descrito adiante. 13.2 Ensaio de Desagregação
Para o ensaio quanto à desagregação mediada por anticorpos de A/31-42 pré-agregada, reconstituiu-se uma A/31-42 de baixo peso molecular, preparada como descrito acima, sob a forma de uma solução 110 μΜ em DMSO a 27% e PBS lx. Esta solução foi então deixada agregar a 37°C durante 24 h após o que se adicionou o seguinte: anticorpo pré-diluído a 3,3 ou 0,33 μΜ, e tioflavina T 10 μΜ. Isto resultou numa proporção molar de 1:10 e 1:100 entre anticorpo e A/31-42. Esta solução foi então incubada durante mais 24 h a 37°C. A 119 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ espectrofluorescência foi então medida e a % de desagregação foi calculada como descrito adiante. 13.3 Cálculo A inibição da agregação ou a desagregação são expressas como a % média de inibição ou desagregação, respectivamente, ± o erro padrão da média (SEM), de acordo com a seguinte equação: % de inibição = (RFU de oontr pos-RFU de contr neq) - (RFU de amostra coro Agl-42-KFP de amostra sem Αβ1-42) xl00% (RFU de contr pos - RFU de contr neg) 13.4 Resultado 13.4.1 Inibição da agregação de Αβ1-42 A inibição da agregação de A/31-42 utilizando o anticorpo hC2 está mostrada na Tabela 3 e na Figura 11. Para uma proporção molar entre anticorpo e A/31-42 de 1:100 a inibição foi em média de 30% (2 experiências independentes), enquanto para uma proporção molar de 1:10 a inibição foi de 80% (2 experiências independentes; veja-se a Tabela 3).
Tabela 3. Inibição mediada por hC2 da agregação de A/31-42 para proporções molares entre anticorpo e A/3i_42 de 1:100 e 1:10.
Anticorpo Proporção molar (entre anticorpo e A/31-42) 1:100 1:10 hC2 30, 0 ± 4,1% 80,4 ± 6,9% 13.4.2 Desagregação de Αβ1-42 pré-agregada A desagregação de A/31-42 pré-agregada utilizando o anticorpo hC2 está mostrada na Tabela 4 e na Figura 12. Para uma proporção molar entre anticorpo e A/31-42 de 1:100 a desagregação foi em média de 24%, enquanto para uma proporção molar de 1:10 a desagregação foi de 32% (3 experiências independentes; veja-se a Tabela 4). 120
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Tabela 4. Desagregação mediada por hC2 de Αβ1-42 pré-agregada para proporções molares entre anticorpo e A/31-42 de 1:100 e 1:10.
Anticorpo Proporção molar (entre anticorpo e A/31-42) 1:100 1:10 hC2 23,9 ± 4,4% 31,9 ± 3,5%
Utilizando o ensaio com tioflavina T, podem ser demonstradas as propriedades bifuncionais do anticorpo hC2 anti-A/3 humanizado, nomeadamente para inibir a agregação de A/31-42 na conformação protof ibrilar patogénica e em adição para desagregar protof ibrilhas de A/31-42 pré-f ormadas. O hC2 inibiu a agregação de A/31-42 em 80% para uma proporção molar entre anticorpo e A/31-42 de 1:10. A capacidade do hC2 desagregar protof ibrilhas de A/31-42 pré-agregadas para uma proporção molar de 1:10 mostrou-se ser de 32%.
Exemplo 14. Ligação específica da conformação de mC2 a diferentes classes de proteína amilóide
Para avaliar a especificidade do mC2 para com diferentes formas de proteína amilóide polimerizada, amilóide monomérica, polimérica solúvel e fibrílica, realizou-se um ELISA revestido com estas diferentes formas de beta-amilóide polimérica (Figura 9) . Os monómeros foram preparados de acordo com um método modificado publicado por (Klein, 2002), a amilóide beta polimérica solúvel de acordo com (Barghorn et al., 2005), enquanto as fibras foram formadas por incubação de amilóide (Bachem, Suíça) com uma concentração final de lpg/μΐ em Tris/HCl, pH 7,4 a 37°C durante 5 dias seguindo-se um passo de centrifugação (10 000 rpm durante 5 minutos). Depois, revestiram-se as placas de ELISA com os polímeros de amilóide com uma concentração final de 55 pq/ml e foi realizado um ELISA de afinidade de ligação utilizando um anticorpo monoclonal anti-IgG de ratinho (Jackson) marcado com fosfatase alcalina. Como demonstrado na Tabela 5, o anticorpo mC2 liga-se com maior afinidade a amilóide beta polimérica solúvel do que a fibras e com a menor afinidade a monómeros. Estes resultados indicam que a ligação do anticorpo é influenciada 121 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ pelo epítopo de amilóide e pela conformação dos diferentes agregados de amilóide.
Tabela 5. Ligação específica da conformação de mC2 a monómeros, oligómeros e Fibras de amilóide mC2 D.O. Cone. de Ab (ug/ml) Oligómero Fibras Monómeros 0, 625 2,806 1,620 1,155 0,312 1,724 0,989 0,649 0,156 1,036 0,631 0,397 0, 078 0, 652 0,499 0,333
Exemplo 15. Mapeamento de epítopos do anticorpo monoclonal hC2 de AC Immune O mapeamento de epítopos do anticorpo monoclonal hC2 humanizado foi realizado por ELISA utilizando três diferentes bibliotecas peptídicas. Uma biblioteca compreendia um total de 33 péptidos biotinilados que cobriam a sequência de aminoácidos (aa) completa de Αβ1-42 (produzida por Mimotopes e adquirida a ANAWA Trading SA) , a segunda biblioteca contém péptidos biotinilados utilizando o péptido 12 (aal2-20 de A/3) da primeira biblioteca peptídica e substituindo cada aa na sequência por uma alanina (veja-se a tabela 8 adiante), e a terceira biblioteca contém os péptidos biotinilados 13, 14 ou 15 (aa 13-21, 14-22 ou 15-23 de A/3) e substituindo em cada caso os últimos aminoácidos por uma alanina, ou por uma glicina o aa 21 que é já uma alanina (veja-se a tabela 9 adiante) . Utilizou-se péptido A/3i_42 biotinilado completo como controlo positivo (Bachem). O mapeamento de epítopos foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Resumidamente, placas revestidas com estreptavidina (NUNC) foram bloqueadas com BSA a 0,1% em PBS durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS-Tween 20 a 0,05%, revestiram-se as placas durante 1 hora à TA com os diferentes péptidos da biblioteca, diluídos em BSA a 0,1%, Azida de Sódio a 0,1% em PBS até uma concentração final de 10 pM. Após lavagem, as placas foram incubadas durante 1 hora à TA com o anticorpo hC2 ou um anticorpo IgG4 quimérico que não se liga a Αβ diluído para 200 ng/ml em BSA a 2%, Azida de Sódio a 0,1% 122 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ em PBS. As placas foram lavadas novamente e incubadas com IgG de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina durante lh à TA. Após a lavagem final, as placas foram incubadas com substrato de fosfatase (pNPP) e foram lidas a 405 nm utilizando um leitor de placas ELISA.
Foi demonstrado que o anticorpo monoclonal humanizado hC2 se ligou especificamente aos péptidos 12, 13, 14, 15 e 16 da primeira biblioteca peptídica. Estes péptidos compreendem os aminoácidos 12-20, 13-21, 14-22, 15-23 e 16-24, respectivamente, de Αβ1-42, sugerindo que o epítopo se estende na região 12-24 de A/3. Utilizou-se uma segunda biblioteca com substituições por alanina para determinar o aa critico para a ligação a A/312-20 (VHHQKLVFF) . A ligação do anticorpo hC2 é completamente perdida quando os aminoácidos 16, 17, 19 ou 20 são substituídos por uma alanina, indicando que estes aa são absolutamente críticos para a ligação do anticorpo a A/3. A ligação do anticorpo hC2 é parcialmente perdida quando os aminoácidos 15 e 18 são substituídos. A ligação foi também quase completamente perdida quando o aminoácido 14 foi substituído por uma alanina, indicando que o aminoácido 14 é também muito importante para a ligação.
Finalmente, utilizou-se uma terceira biblioteca para determinar se os aa 21, 22 ou 23 são críticos para a ligação ao epítopo. A ligação do anticorpo a aa 15-23 foi reduzida quando o aa 23 foi substituído por uma alanina, indicando que o aminoácido 23 é também importante para a ligação. A ligação foi parcialmente perdida quando o aa 21 foi substituído por uma glicina e ligeiramente perdida quando o aminoácido 22 foi substituído por uma alanina.
Exemplo 16. Neuroprotecção pelo Anticorpo hC2 A capacidade do anticorpo hC2 proteger os neurónios contra a degeneração induzida por oligómeros de Abeta foi determinada num ensaio in vitro. Neurónios corticais de ratinho embrionário do dia 16,5-17,5 foram isolados, dissociados e cultivados in vitro em meio N3-F12. As células foram crescidas durante nove dias no total, e foram alimentadas no dia 3 e no dia em que se adicionou oligómero de 123
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Abeta, ou oligómero de Abeta mais anticorpo hC2 anti-Abeta. No dia cinco ("4 dias Abeta") ou no dia seis ("3 dias Abeta"), alguns poços de células foram tratados com oligómero de Abeta 2 μΜ somente, ou com uma combinação de oligómero de Abeta 2 μΜ e anticorpo hC2 anti-Abeta a 50 pg/mL. O oligómero de Abeta foi preparado dissolvendo Abeta 1-42 (rPéptido) em HFIP, a partir do que os péptidos de Abeta foram divididos em alíquotas de 10 μΐ a 1 mg/ml e depois evaporados numa hotte durante 30 minutos e os filmes de péptido foram armazenados a -80°C até serem utilizados. Para utilização, o filme de péptido foi dissolvido em 10 μΐ de DMSO, e depois 78,6 μΐ de F12 de HAMS, e a solução de péptido de Abeta foi incubada a 4°C durante 24-48 horas (concentração final de Abeta de 25 μΜ).
Para as células de controlo adicionou-se apenas DMSO-F12 no mesmo volume que Abeta-DMSO no dia 5, e as células foram cultivadas durante mais 4 dias sem qualquer tratamento adicional. No dia 9, os neurónios de todas as condições de cultura foram fixados e corados com Tujl (um anticorpo anti-beta-tubulina) , seguindo-se a coloração com anticorpos secundários marcados com FITC para visualizar os microtúbulos, e desse modo os processos neuronais em geral. Os resultados estão mostrados na Figura 13. Os neurónios corticais embrionários de ratinho não tratados apresentaram uma morfologia normal após nove dias de cultura (Figura 13, painel mais à esquerda) . O tratamento das células com oligómero de Abeta durante três dias induziu a degeneração de axónios e causou uma diminuição do número total de axónios (Figura 13, painel central inferior), e este efeito foi ainda mais pronunciado com quatro dias de tratamento (Figura 13, painel central superior). Pelo contrário, as células tratadas com a combinação de oligómero Abeta e anticorpo anti-Abeta hC2 pareciam similares às células de controlo (Figura 13, painéis superior e inferior à direita) . Estes resultados indicam que o anticorpo hC2 anti-Abeta foi capaz de proteger os neurónios corticais de ratinho embrionário contra a degeneração induzida por oligómeros de Abeta. 124
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Tabela 6: Posições e alterações efectuadas nas regiões de esqueleto da cadeia leve de C2 humanizado
Posição da Cadeia leve 45 87 50 53 C2VK (VK de C2) de Ratinho K F K N C2HuVKl Humanizado Q Y K N C2HuVk2 Humanizado Q F K N C2HuVK3 Humanizado K Y K N C2HuVK4 Humanizado K F K N dpklõ da linha germinativa humana Q Y L N C2VK-R (VK-R de C2) de Ratinho R C2VK-S (VK-S de C2) de Ratinho S
Tabela 7: Posições e alterações efectuadas nas regiões de esqueleto da cadeia pesada de C2 humanizado
Posição da Cadeia pesada 47 94 C2VHAF de Ratinho L S C2HuVHAFl Humanizado W R C2HuVHAF2 Humanizado w S C2HuVHAF3 Humanizado L R C2HuVHAF4 Humanizado L S DP-54 da linha germinativa humana W R
Construíram-se um total de 8 diferentes anticorpos com cadeias leves humanizadas C2HuVKl, C2HuVK2, C2HuVK3, C2HuVK4 e cadeias pesadas C2HuVHAF4 e C2HuVHAF2 125
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Tabela 8. Sumário de péptidos utilizados na segunda biblioteca. Os aa que são importantes para a ligação estão assinalados com itálico e sublinhado e os aa absolutamente criticos negrito. para a ligaçao estão assinalados com itálico e pl2- 20 V H H Q K L V F F A12 A H H Q K L V F F A13 V A H Q K L V F F AI 4 V H A Q K L V F F AI 5 V H H A K L V F F AI 6 V H H Q A L V F F AI 7 V H H Q K A V F F AI 8 V H H Q K L A F F AI 9 V H H Q K L V A F A2 0 V H H Q K L V F A aa n . 0 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tabela 9. Sumário de péptidos utilizados na terceira biblioteca. Os aa que são importantes para a ligação estão assinalados com itálico e sublinhado e os aa absolutamente criticos para a ligação estão assinalados com itálico e negrito pl3-21 H H Q K L V F F A pl3-21 G21 H H Q K L V F F G pl4-22 H Q K L V F F A E pl4-22 A22 H Q K L V F F A A pl5-23 Q K L V F F A E D pl5-23 A23 Q K L V F F A E A aa n.0 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
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<210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR1) <400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10
<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR2) <400> 2
Ser ile Asn ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser vai Lys 15 10 15
Gly 128
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<210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR3) <400> 3 Gly Asp Tyr 1
<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR1) <400> 4
Arg ser Ser Gin Ser i_eu Vai Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu hís 15 10 15
<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR2) <400> 5
Lys Vai Ser Asn Arg Phe ser 1 5
<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR3) <400> 6
Ser Gin ser Thr i-lis vai Pro Trp Thr 1 5
<210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> epitopo de A-beta, região 2 <400> 7 vai Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 129
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<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> epítopo de A-beta, região 1 <400> 8
His Gin lys Leu vai 1 5 <210 > 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > misc_feature <222> (D · · (D <223> Xaa pode ser Ala, Vai, Leu, <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa pode ser Ala, Vai, Leu, <2 2 0 > <2 21 > misc_feature <222> (5) . . (5) <223> xaa pode ser Glu ou Asp <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (6) . . (6) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <400> 9 xaa Phe Phe xaa xaa xas 1 5 <210 > 10 <211 > 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <2 21 > misc_feature <222> (D · · (D <223> Xaa pode ser His, Asn, Gin <2 2 0 > <2 21 > misc_feature <222> (2) . . (2) <223> Xaa pode ser Asn ou Gin <2 2 0 > <2 21 > misc_feature <222> (5) . . (5) norleucina, Met, Ser ou Ile
Phe ou Ile
Gin Lys ou Arg 130 ΕΡ 2 046 833/PT <223> xaa pode ser Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe ou Ile <400> 10
Xaa Xaa Lys Leu Xaa 1 5
<210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa pode ser His, Asn, Gin Lys ou Arg <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa pode ser Asn ou Gin <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa pode ser Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe ou Ile <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa pode ser Ala, Vai, Leu, Ser ou Ile <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> xaa pode ser Glu ou Asp <400> 11 xaa xaa Lys lgu xaa Phe Phe xaa xaa xaa 1 5 10
<210 > 12 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> cadeia leve variável C2 HuVK 1 humanizada artificial 131
ΕΡ 2 046 833/PT <400> 12 ASp Ile Vai Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu vai Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Hl s Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe 5er Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Al a Glu A5p vai Gly vai Tyr Tyr Cys Ser Gin ser 85 1 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110 <210 > 1 3 <211 > 2 19 <212 > PRT <213 > s< equência arti fic ial <220 > <223 > c, adeia leve de C2 humanizado arti ficial 132
ΕΡ 2 046 833/PT <4 0 0 > 13
Asp lie vai Met Thr Gin Ser pro Leu Ser Leu Pro val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Xle ser cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu val Tyr ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys ΡΓΟ Gly Gin ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val ser Asn Arg Phe Ser Gly Val pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gl y Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 ser Arg val Gl U Ala 85 Gl u ASp val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys ser Gin 95 Ser Thr His vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin Glv Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 110 Arg Thr val Ala Ala Pro ser val Phe lie Phe Pro Pro Ser ASp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys ASp Ser 165 170 175 Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 18S 190 Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gl n Gl y Leu ser Ser 195 200 205 Pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 210 215
<210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> sequência artificial <2 2 0 > <223> região constante da cadeia leve de C2 humanizado artificial 133 ΕΡ 2 046 833/PT <400> 14
Arg Thr vai Ala Ala Pro Ser vai phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu ser Ser 85 90 95
Pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> cadeia pesada variável C2 HuVH AF 4 humanizada artificial <400> 15
Glu Vai Gin Leu vai Glu 5er Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala ser Gly phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met ser 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Leu Vai Ala Ser 50 rle Asn ser Asn Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Ser Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr lie 70 ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu ASP 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Ser Gly ASP 100 Tyr rrp Gly Gin Gly 105 Thr Thr vai Thr vai 110 Ser Ser 134 134 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
<210> 16 <211> 439 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> cadeia pesada de C2 humanizado antificial <4θΟ> 16 glu Vai Gin 1 Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val g1 n Pro Gly Gly 15 ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Thr phe Ser 30 Ser Tyr Giy Met Ser 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Leu val Ala ser 50 He Asn Ser Asn Gly 55 dy Ser Thr Tyr Tyr 60 pro Asp Ser Val Lys Gly 65 Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 j_eu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Ser Gly Asp 100 Tyr Trp Gly Gin Gly 105 Thr Thr val Thr val 110 Ser Ser Ala ser Thr 115 Lys Gly Pro ser val 120 Phe pro Leu Ala Pro 125 Cys Ser Arg ser Thr 130 Ser Glu Ser Thr Ala 135 Ala Leu Gly Cys Leu 140 val Lys A5p Tyr Phe Pro 145 GlU Pro Vai Thr 150 Val ser Trp Asn Ser 155 Gly Ala Leu Thr Ser 160 Gly vai HÍS Thr Phe 165 Pro Ala val Leu Gin 170 Ser Ser Gly Leu Tyr 175 Ser Leu ser Ser vai 180 Vai xhr val pro Ser 185 ser ser Leu Gly Thr 190 Lys Thr Tyr Thr Cys 195 Asn val Asp HÍS Lys 200 Pro ser Asn Thr Lys 205 val ASp Lys Arg vai 210 Glu Ser Lys Tyr Gly 215 Pro Pro cys Pro Pro 220 cys Pro Ala Pro Glu Phe 225 Leu Gly Gly pro 230 ser Val Phe Leu Phe 235 Pro ΡΓΟ Lys pro Lys 240 Asp Thr Leu Met lie 245 Ser Arg Thr pro Glu 250 val Thr cys val val 255 val 135
ΕΡ 2 046 833/PT ASP vai ser Gin Glu ASp pro Glu val Gin phe Asn Trp Tyr val Asp 260 265 270 Gly vai Glu 275 val His Asn Ala Lys 280 Thr Lys Pro Arg Glu 285 Glu Gl n Phe Α5Π ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu His Gin ASP 290 295 300 Trp 305 Leu Asn Gly Lys Glu 310 ry.r Lys Cys Lys val 315 ser Α5Π Lys Gly Leu 320 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 325 330 335 Glu pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 340 34 5 3 50 ΑΞΠ Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser ASp 355 360 365 lie Ala val Gl u Trp Glu Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Arg Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Α5Π Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser val Met HiS Glu Ala Leu His Asn HiS Tyr Thr Gin Lys Ser 420 425 430 Leu ser Leu Ser Leu Gly cys 435
<210> 17 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> REGIÃO C DA CADEIA GAMA-4 DE IG - modificada <400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys 5er Arg 15 10 15 ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr 20 25 30 phe Pro Glu Pro Vai Thr vai ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser 35 40 45
Gly Vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr ser 50 55 60 136 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ
Leu Ser ser val Val Thr val pro Ser Ser ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr cys Asn Val ASP His Lys Pro ser Asn Thr cys val Asp Lys 85 90 95 Arg vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro cys Pro Pro cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp vai Ser Gin Glu Asp pro Glu val Gl n Phe Asn Trp Tyr val Asp 145 150 155 160 Gly Vai Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Gl u Glu Gin Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val val ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys GlU Tyr Lys cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro ser Ser lie Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 ASn Gin Vai Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr pro ser ASp 245 2 50 255 Ile Ala Vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Th r Thr Pro Pro Val Leu Asp 5er Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn val Phe ser 290 295 300 cys Ser Vai Met Hí S Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325
<210> 18 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <223> região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR2) 137 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ <400> 18 agcatcaata gtaatggtgg tagcacctat tatccagaca gtgtgaaggg c 51
<210> 19 <211> 9 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <223> região variável da cadeia pesada humanizada C2 HuVH AF 4 (CDR3) <400> 19 ggtgactac 9
<210> 20 <211> 49 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <223> região variável da cadeia leve humanizada C2 HuVK 1 (CDR1) <400> 20 agatctagtc agagccttgt atatagtaat ggagacacct atttacatt 49
<210> 21 <211> 336 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> cadeia leve variável C2 Hu VK 1 humanizada artificial <400> 21 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcçtggtga gcctgcctcc. 60 atcxcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccacag etcctgatct acaaagtttc caaccgattt ISO rctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagattteac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gcçaâggçac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 22 <211> 657 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> cadeia leve de C2 humanizado artificial 138 ΕΡ 2 046 833/PT <400> 22 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggtga gcctgcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga ggccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gccaaggcac caaggtggaa atcaaaagga ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgetgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 23 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> região constante da cadeia leve de C2 humanizado artificial <400> 23 aggactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 24 <211> 336 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> cadeia pesada variável C2 HuVH AF humanizada artificial <400> 24 gaggtgcagc tggtcgagtç tgggggaggç ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240
ctgçaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac 30Q tactggggcc aaggcâccac tgtcacagtc tcçrea. 336 780 139
ΕΡ 2 046 833/PT gacactctca tgatctcccg gaagaccccg aggtccagtt acaaagccgc gggaggagca ctgcaccagg actggctgaa ccgtcctcca tcgagaaaac tacaccccgr. ccccatccca gtcaaaggct tctaccccag aacaactaca agaçcacgcc aggctaaccg tggacaagag catgaggctc tgcacaacca gacccctgag gtcacgtgcg caactggtac gtggatggcg gttcaacãgc acgtaccgtg cggcaaggag tacaagtgca catctccaaa gccaaagggc ggaggagatg accaagaacc cgacatcgcc gtggagtggg tcccgtcctc gattccgacg caggtggcag gaggggaatg ctacacacag aagagcctct tggtggtgga cgtgagccag tggaggtgca taatgccaag tggtcagcgt cctcaccgtc aggtctccaa caaaggcctc agccccgaga gccacaggtg aggtcagcct gacctgcctg agagcaatgg gcagccggag gctccttctt cctctacagc tcttctcatg ctccgtgatg ccctgtctct gggtaaa 840 900 960 1020 10S0 1140 1200 1260 1317
<210> 25 <211> 1317 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> cadeia pesada de C2 humanizado artificial <400> 25 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac 300 tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc 360 ttccccctgg cgccctgctc cagatcgacc tccgagagca cagccgccct gggctgccrg 420 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 480 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 540 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag 600 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc gtgtccccca 660 tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 720
<210> 26 <211> 981 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> pesada de C2 humanizado artificial <223> região constante da cadeia 140
ΕΡ 2 046 833/PT <400> 26 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccagatc gacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccgtgtcc cccatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc taagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat tccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttcracc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt cctcgattcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> 1 Mus mus CO 2 1-1 o <400> 27 ASp vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro val Ser Leu Gly 1 5 10 15 ASp Gin Ala Ser Ile ser Cys Arg Ser Ser Gin ser Leu Val Tyr ser 20 25 30 Α5Π Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin ser 35 40 45 ΡΓΟ Lys Leu Leu Ile Tyr Lvs Vai Ser Α5Π Arg Phe Ser Gly Val pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Phe Cys Ser Gin ser 85 90 95 Thr His vai ΡΓΟ Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 141 ΕΡ 2 046 833/PT <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Glu Vai Gin 1
Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 5 10
Ser Leu Lys i.pu Ser leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr
Gly Met ser 35
Trp val Arg Gin Ttir Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu val án 45 40
Ala Ser lie Asn Ser Asn Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr cys 85 90 93
Ala 5er Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser ser 100 105 110
<210> 29 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 29 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagaçaggtt cagrggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tct.gggagtt tatttctgct ctcaaagtac aeatgttcct tggacgttcg gtggaggcac caagctagaa atcaaa
<210> 30 <211> 417 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 30 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat gttgtgatga cccaaactcc actctccctg eetgtcagtc ttggagatca agcctccatc tcttgcagat ctagtcagag ccttgtatat agtaatggag acacctattt acattggtac ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccttgg acgttcggtg gaggcaccaa gctagaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgta 60 120 180 240 300 336 60 120 180 240 300 3.60 417 142 ΕΡ 2 046 833/ΡΤ <210> 31 <211> 336
<212> ADN <213> Mus musculus <400> 31 gaggtgcagc tggtggagrc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggea tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attca.ccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagtggtgac 300 tactggggcc aaggctccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 32 <211> 408
<212> ADN <213> Mus musculus <400> 32 atgrasttsg ggytcagmtt grttttcctt gcccttattt taaaaggtgt ccaatgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagragc tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggaattggt cgcaagcatc aatagtaatg gtggtagcac ctattatcca 240 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag tggtgactac 360 tggggccaag gctccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacaccc 408
Lisboa, 2013-11-21

Claims (23)

  1. ΕΡ 2 046 833/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humanizado, ou um seu fragmento, que reconhecem e ligam proteína β-amilóide, em que o referido anticorpo humanizado ou o seu fragmento compreendem: i) uma Região Variável da Cadeia Pesada (HCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15, e ii) uma Região Variável da Cadeia Leve (LCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
  2. 2. Anticorpo humanizado, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13.
  3. 3. Anticorpo humanizado, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 2, em que a Lys C-terminal da região constante da cadeia pesada foi removida.
  4. 4. Anticorpo humanizado, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo humanizado ou o seu fragmento são do isotipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.
  5. 5. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo humanizado, ou o seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4.
  6. 6. Molécula de ácido reivindicação 5 compreendendo SEQ ID NO:22 ou a sequência de
  7. 7. Molécula de ácido reivindicação 5 compreendendo SEQ ID NO:25 ou a sequência de
  8. 8. Vector de expressão nucleótidos de qualquer uma da nucleico de acordo com a a sequência de nucleótidos de nucleótidos de SEQ ID NO:21. nucleico de acordo com a a sequência de nucleótidos de nucleótidos de SEQ ID NO:24. compreendendo a sequência de reivindicações 5-7.
  9. 9. Célula compreendendo o vector de expressão da reivindicação 8. ΕΡ 2 046 833/PT 2/5
  10. 10. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo humanizado, ou o seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e opcionalmente compreendendo ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.
  11. 11. Composição farmacêutica da reivindicação 10, opcionalmente compreendendo ainda um ou mais dos seguintes: uma substância biologicamente activa, um diluente ou um excipiente.
  12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, compreendendo ainda uma substância biologicamente activa que é um composto utilizado no tratamento de amiloidose.
  13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 compreendendo pelo menos um dos seguintes compostos: um composto anti-stress oxidativo; um composto anti-apoptótico; um quelantes de metais; um inibidor da reparação do ADN tal como pirenzepina e metabolitos; ácido 3-amino-l-propanossulfónico (3-APS); 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS); activador de α-secretase; inibidor de Αβ-secretase; um inibidor de γ-secretase; uma proteina tau; um neurotransmissor; um destruidor de folhas-β; um atractor para depuração de amilóide beta / esgotamento de componentes celulares; um inibidor de amilóide beta truncada no terminal N, tal como amilóide beta 3-42 piroglutamada; uma molécula anti-inflamatória; ou um inibidor de colinesterase (ChEI) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina; um agonista de MI; ou outro fármaco tal como um fármaco modificador de amilóide ou de tau ou um suplemento nutricional.
  14. 14. Utilização do anticorpo humanizado ou do seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, para a preparação de um medicamento para tratamento ou alivio dos efeitos de amiloidose, tais como amiloidose secundária, amiloidose relacionada com a idade, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA), demência de corpos de Lewy, sindrome ΕΡ 2 046 833/PT 3/5 de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam; doenças baseadas em, ou associadas a proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Inicio no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degenerescência macular.
  15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o tratamento do animal, tal como do mamífero ou do ser humano, conduz a um ou mais dos seguintes: i) um aumento da capacidade de memória cognitiva; ii) a retenção da capacidade de memória cognitiva; e/ou iii) um restabelecimento completo da capacidade de memória cognitiva.
  16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 ou 13, para utilização num método de prevenção, tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, tal como amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não se lhes limitando, desordens neurológicas tais como a Doença de Alzheimer (DA) , demência de corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo Parkinsonismo - Demência de Guam, doenças que são baseadas em, ou estão associadas a, proteínas do tipo amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, e esclerose múltipla, doença de Creutzfeld-Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com VIH, ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes com Início no Adulto, amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degenerescência macular.
  17. 17. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o tratamento do animal, tal como do mamífero ou do ser humano, conduz a: i) um aumento da capacidade de memória cognitiva, ii) a retenção d capacidade de memória cognitiva, e/ou ΕΡ 2 046 833/ΡΤ 4/5 iii) uma reversão da capacidade de memória cognitiva e um restabelecimento completo da capacidade de memória cognitiva.
  18. 18. Método de determinação da extensão da carga de placa amiloidogénica numa amostra de tecido e/ou numa amostra de fluido corporal compreendendo: a) o teste da amostra de tecido ou da amostra de fluido corporal quanto à presença de proteína amilóide com o anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4; b) a determinação da quantidade de anticorpo ou fragmento de anticorpo ligados à proteína; e c) o cálculo da carga de placa na amostra de tecido ou na amostra de fluido corporal.
  19. 19. Kit para detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo, num ou mais recipientes, o anticorpo humanizado ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, um reagente de detecção, e instruções para utilização dos anticorpos.
  20. 20. Anticorpo humanizado, ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, para utilização na desagregação de fibras em formas solúveis poliméricas e monoméricas.
  21. 21. Método in vitro para desagregação de fibras de beta-amilóide pré-formadas, compreendendo o contacto do anticorpo ou do seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3, com fibras de beta-amilóide pré- formadas.
  22. 22. Anticorpo humanizado, ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o anticorpo ou o seu fragmento se destinam a utilização na protecção de neurónios contra a degradação induzida por Αβ.
  23. 23. Utilização do anticorpo humanizado ou seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para a ΕΡ 2 046 833/PT 5/5 preparação de um medicamento para prevenção da degeneração de neurónios após exposição a oligómero de Αβ. Lisboa, 2013-11-21
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