PT1817276E

PT1817276E - Inibidores da protease cisteína catepsina

Info

Publication number: PT1817276E
Application number: PT05808098T
Authority: PT
Inventors: Chun Sing Li; Christophe Mellon; Jacques Yves Gauthier
Original assignee: Merck Canada Inc
Priority date: 2004-11-23
Filing date: 2005-11-18
Publication date: 2012-10-25
Also published as: AU2005309267B2; NO20073222L; TW200631576A; WO2006056047A1; KR20070085435A; TWI353244B; AR055283A1; MX2007006136A; PL1817276T3; US7407959B2; CA2589085A1; CA2589085C; WO2006056047A9; ES2394618T3; RU2007123611A; EP1817276B1; AU2005309267A1; CN102391151A; EP1817276A1; RU2399613C2

Description

1 DESCRIÇÃO "INIBIDORES DA PROTEASE CISTEÍNA CATEPSINA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma variedade de patologias em seres humanos e em outros mamíferos envolvem ou estão associadas a uma reabsorção óssea anormal. Tais doenças incluem, entre outras, a osteoporose, a osteoporose induzida por glicocorticóides, a doença de Paget, o aumento anormal do turnover ósseo, a patologia periodontal, a perda de dentes, as fracturas de ossos, a artrite reumatóide, a osteoartrite, a osteólise periprostética, a osteogénese imperfeita, a hipercalcemia maligna ou o mieloma múltiplo. Uma das doenças mais comuns entre as referidas acima é a osteoporose, que é uma das manifestações mais frequentes que ocorre em mulheres pós-menopáusicas. A osteoporose é uma doença esquelética sistémica caracterizada pela baixa massa óssea e a deterioração microarquitectural do tecido ósseo, com o consequente aumento da fragilidade óssea e a susceptibilidade para a ocorrência de fracturas. As fracturas osteoporóticas são uma das principais causas de morbilidade e mortalidade na população idosa. Mais de 50% da população do sexo feminino e um terço da população masculina irá sofrer uma fractura osteoporótica. Um amplo segmento da população idosa já apresenta uma densidade óssea baixa e um elevado risco de fracturas. Há uma grande necessidade de prevenção e tratamento da osteoporose e de outras condições patológicas associadas à reabsorção óssea. Uma vez que a osteoporose, bem como outras patologias associadas a perdas ósseas, são geralmente condições crónicas, considera-se que uma terapêutica apropriada requer normalmente um tratamento crónico.

As catepsinas pertencem à superfamília da papaína de proteases de cisteína. Estas proteases funcionam quer na 2 degradação fisiológica normal quer na degradação patológica do tecido conjuntivo. As catepsinas desempenham um papel fundamental na degradação da proteína intracelular e no turnover e na remodelação. Até à data, um número de catepsinas foi identificado e sequenciado a partir de um número de fontes. Verificou-se que os derivados da amida de N-cianometilo desempenham uma função inibidora da cisteína que é relevante em estados patológicos dependentes de catepsina (CA2439415, Prasit et Al, 12 de Setembro de 2002 e US 2003 0232863, Bayly et al, 18 de Dezembro de 2003) . As catepsinas estão naturalmente presentes numa variedade de tecidos. Por exemplo, as catepsinas B, C, F, H, L, K, O, S, V, W e Z foram clonadas. A catepsina L está implicada na proteólise lisossomal normal, bem como em vários estados patológicos, incluindo, entre outros, as metástases de melanomas. A catepsina S está implicada na doença de Alzheimer, na aterosclerose, na doença pulmonar obstrutiva crónica e em certas doenças auto-imunes, incluindo, entre outras, a diabetes juvenil, a esclerose múltipla, o pênfigo vulgar, a doença de Graves, a miastenia grave, o lúpus eritematoso sistémico, a artrite reumatóide e a tiroidite de Hashimoto; em doenças alérgicas, incluindo, entre outras, a asma; e em respostas imunológicas alogénicas, incluindo, entre outras, a rejeição de transplante de órgãos ou enxertos de tecidos. Os níveis elevados de catepsina B e a redistribuição da enzima foram observados em tumores, sugerindo um papel na invasão de tumores e em metástases. Adicionalmente, a actividade anómala da catepsina B está implicada em estados patológicos, como a artrite reumatóide, a osteoartrite, a pneumocistose, a pancreatite aguda, a doença inflamatória das vias respiratórias e as patologias ósseas e das articulações.

As catepsinas em mamíferos estão relacionadas com as proteases de cisteína da família da papaína, expressas por parasitas causadores de doenças, incluindo os das famílias 3 dos protozoários, platelmintos, nematódeos e artrópodes. Estas proteases de cisteína desempenham um papel essencial no ciclo de vida destes organismos. 0 colagénio humano tipo I, o principal colagénio presente nos ossos, representa um bom substrato para a catepsina K. Vide Kafienah, W., et al. 1998, Biochem J 331:127-732. As experiências in vitro com oligonucleótidos anti-sense para catepsina K, demonstraram uma redução da reabsorção óssea in vitro, que ocorre provavelmente devido a uma redução na tradução do ARNm da catepsina K. Vide Inui, T., et al., 1997, J Biol Chem 272 : 8109-8112 . A estrutura de cristal da catepsina K foi resolvida. Vide McGrath, Μ. E., et al., 1997, Nat Struct Biol 4:105-109; Zhao, B., et al., 1997, Nat Struct Biol 4:109-11. Foram igualmente desenvolvidos inibidores de catepsina K com base em peptideos selectivos. Vide Bromme, D., et al., 1936, Biochem J 315:85-89; Thompson, S. K., et al., 1997, Proc Natl Acad Sei. USA 94:14249-14254. Consequentemente, os inibidores de catepsina K podem reduzir a reabsorção óssea. Os referidos inibidores seriam vantajosos no tratamento de doenças envolvendo a reabsorção óssea, tal como, a osteoporose. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se seguinte fórmula química: a compostos da

Re

R

R ?~f^i HO R* H Dí

n

N

O r2^r1

N em que R1 e R2 sao tomados em conjunto com o átomo de carbono, ao qual estão ligados, para formar um ciclopropilo, que é opcionalmente substituído com alquilo C1-3; R2 representa alquilo Ci_g, que é substituído com um até quatro fluoros ou um até quatro cloros; r4 representa alquilo C]__g, que é substituído com um até 4 cinco halogéneos; r5 representa hidrogénio ou alquilo Ci_g, que é opcionalmente substituído com um até cinco halogéneos; cada D representa fenilo; r6 representa hidrogénio ou alquilo Ci_g, que é opcionalmente substituído com um até dois hidroxilos ou dois até seis halogéneos; R-? representa alquilo Ci-6, que é opcionalmente substituído por dois até cindo halogéneos; n representa dois; ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Na invenção, R1 e r2 são tomados em conjunto com o átomo de carbono para formar ciclopropilo.

Na invenção, D representa fenil.

Em uma forma de realização da invenção, R^ representa CF3.

Em uma forma de realização da invenção, R^ representa hidrogénio.

Em uma forma de realização da invenção, R^ representa alquilo Ci_3 substituído com dois ou três fluoros.

As formas de realização preferidas mencionadas acima incluem todas as combinações de grupos particulares e preferidos, salvo indicação em contrário.

As formas de realização específicas da presente invenção incluem, entre outras:

Ni-(1-cianociclopropil)-N^-(1-{4 ' -[2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida;

Ni-(1-cianociclopropil)4-fluoro-Nl-{2,2,2-trifluoro-l-[4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxietil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida;

Ni-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-(2,2,2-trifluoro-l-{4'-[3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-1-metilpropil]bifenil-4-il} etil)-L-leucinamida; N^-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N^-(2,2,2-trifluoro- 5 1-{4'-[ 2 ,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l- (trifluorometil)etil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida;

Ni-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{2,2,2-trifluoro-1- [ 4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida;

Ni—(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-(2,2,2-trifluoro-1-{4'-[1-hidroxi-l-(trifluorometil)propil]bifenil-4-il} etil)-L-leucinamida;

Ni—(1-cianociclopropil)-n2-(1-{4'-[2,2-difluoro-l-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil}4-fluoro-L-leucinamida; N 2 —(1-cianociclopropil)-n2-(1-{4'-[2,2-difluoro-l-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; n2-[1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetil]-Nl-(1-cianociclopropil)-fluoro-L-leucinamida;

Nl-(1-cianociclopropil)-n2-{(lS)-l-{4A-{(lR)-2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifeni]-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4- fluoro-L-leucinamida;

Nl—(1-cianociclopropil)-n2-((IS)-1-(4^-[(lS)-2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-tritluoroetil)-4- fluoro-L-leucinamida; N 2 —(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{ (IS)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxietil)bifenil-4- il] etil}-L-leucinamida;

Nl — (1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((lS)-2,2,2-trifluoro-l-{4,-[(lS)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il]etil)-L-leucinamida;

Nl—(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((lS)-2,2,2-trifluoro-l-{4'-[(lR)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il} etil)-L-leucinamida; N 2 —(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{ (lS)-2,2,2-trifluoro-l-[4,-(R)-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxietil)bifenil- 6 4 — i 1 ] etil}-L-leucinamida;

Ni-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-(4'-[2,2,2-trifluoro-1-hidroxi-1-(trifluorometil)etil]bi- fenil-4-il}etil)-L-leucinamida;

Nl-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{(IS)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida;

Nl-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-{4'-[1-hidroxi-l- (trifluorometil)propil]bifenil-4- il}etil)-L-leucinamida;

Nl-(1-cianociclopropil)-n2-((lS)-l-{4'-[(IR)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroe- til)-4-fluoro-L-leucinamida;

Nl—(1-cianociclopropil)-n2-((IS)—1—{4^-[(lS)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2- trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((lS)-l-{4f-[(lS)-2,2-difluoro-l-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}- 2.2.2- trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida;

Nl-(1-cianociclopropil)-n2-((lS)-l-{4'-[(lR)-2,2-difluoro-l-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}- 2.2.2- trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; e um sal, um estereoisómero e um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção inclui igualmente um composto farmacêutico que compreende um composto da fórmula I, como descrito acima, e um agente de transporte farmaceuticamente aceitável. A invenção também compreende uma composição farmacêutica, que é composta por um agente de transporte farmaceuticamente aceitável e qualquer dos compostos especificamente descritos na presente aplicação. 7

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica oral que compreende um composto da fórmula I ou um sal, um estereoisómero ou um derivado N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo, adaptada para inibir a reabsorção óssea de acordo com um horário continuo com um intervalo de dosagem de uma vez por semana, quinzenalmente, duas vezes por mês ou uma vez por mês.

Estes e outros aspectos da invenção serão expressos nos ensinamentos expostos aqui.

Utilizações

Os compostos da presente invenção são inibidores de catepsinas e, por isso, são vantajosos no tratamento ou na prevenção de patologias ou condições dependentes da catepsina em mamíferos, preferentemente em humanos. Especificamente, os compostos da presente invenção são inibidores da catepsina K e são, por isso, vantajosos para o tratamento e prevenção de patologias ou condições dependentes da catepsina K em mamíferos, preferentemente humanos.

Os compostos da presente invenção apresentam vantagens em relação a compostos estruturalmente idênticos conhecidos do estado da técnica por apresentarem um perfil farmacocinético acentuadamente melhorado. Especificamente, os compostos da presente invenção apresentam uma excelente biodisponibilidade, como exemplificado, mas não limitado a, uma dose de 10 miligramas por quilograma em ratos machos (Sprague Dawley) em 0.5-1% de metocel. Adicionalmente, os compostos da presente invenção providencia uma exposição sistémica de fármacos superior ao dos compostos estruturalmente idênticos conhecidos do estado da técnica.

Por "patologias ou condições dependentes da catepsina" entendem-se a condições patológicas que dependem da actividade de uma ou mais catepsinas. Por "patologias ou condições dependentes de catepsina K" entendem-se a condições patológicas que dependem da actividade da catepsina K. As patologias associadas às actividades da catepsina K incluem a osteoporose, a osteoporose induzida por glicocorticóides, a doença de Paget, o aumento anormal do turnover ósseo, a perda de dentes, as fracturas ósseas, a artrite reumatóide, a osteoartrite, a osteólise periprostética, a osteogénese imperfeita, a aterosclerose, a obesidade, o glaucoma, a doença pulmonar obstrutiva crónica e o cancro, incluindo a doença óssea metastática, a hipercalcemia maligna e o mieloma múltiplo. No tratamento de tais condições com os referidos compostos, a quantidade terapêutica requerida varia de acordo com a patologia especifica e é prontamente determinada pelos peritos na especialidade. Apesar da invenção contemplar quer o tratamento quer a prevenção, o uso preferido no âmbito da mesma é constituído pelo tratamento das referidas condições. É descrito um método para a inibição da actividade da catepsina em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ao mamífero dos compostos ou das composições farmacêuticas mencionadas anteriormente.

Uma forma de realização da invenção representa o método no qual a actividade da catepsina é a actividade da catepsina K. É descrito um método para o tratamento ou a prevenção de condições dependentes da catepsina em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É descrito um método em que que a actividade da catepsina representa a actividade da catepsina K. É descrito um método para a inibição da perda óssea em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos 9 compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É descrito um método para a redução da perda óssea em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É igualmente descrito um método para o tratamento do aumento anormal do turnover ósseo e de fracturas ósseas em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. A utilidade dos inibidores da catepsina K na inibição da reabsorção óssea é conhecida da literatura, vide Stroup, G.B., Lark, M.W., Veber, DF., Bhattacharrya, A., Blake, S., Dare, L.C., Erhard, K.F., Hoffman, SJ., James. I.E., Marquis, R.w., Ru, Y., Vasko-Moser, J.A., Smith, B.R., Tomaszek, T. and Gowen, M. "Potent and selective inhibition of human cathepsin K leads to inhibition of bone resorption in vivo in a nonhuman primate" ["A inibição potente e selective da catepsina K humana conduz à inibição da reabsorção óssea in vivo em primatas não humanos"]. J. Bone Miner. Res., 16:1739-1746; 2001; e Votta, B.J., Levy, M.A., Badger, A., Dodds, R.A., James. I.E., Thompson, S., Bossard, M.J., Carr. T., Connor, J.R., Tomaszek, T.A., Szewczuk, L., Drake, F.H., Veber, D., and Gowen, M. "Peptide aldehyde inhibitors of cathepsin K inhibit bone resorption both in vivo and in vitro" ["Inibidores péptidos aldeídos da catepsina K inibem a reabsorção óssea quer in vivo quer in vitro"]. J. Bone Miner. Res. 12:1396-1406; 1997. É descrito um método para o tratamento ou a prevenção da osteoporose em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. A utilidade dos inibidores da catepsina K no tratamento ou na prevenção da 10 osteoporose, incluindo a osteoporose induzida por glicocorticóides, é conhecida na literatura, vide Saftig, P., Hunziker, E., Wehmeyer, O., Jones, S., Boyde, A., Roinmerskirch, W., Moritz, J.D., Schu, P., and Vonfigura, K. "Impaired osteoclast bone resorption leads to osteopetrosis in cathepsin K-deficient mice" ["A reabsorção óssea osteolástica reduzida conduz à osteoporose em ratos com deficiente catepsina K"]. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13453-13458; 1998. É descrito um método para o tratamento ou a prevenção da doença periodontal ou da perda de dentes em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. A utilidade dos inibidores da catepsina K no tratamento ou na prevenção da doença periodontal ou da perda de dentes foi discutida na literatura, vide Sasaki, T., "Differentiation and functions of osteoclasts and osontoclasts in mineralized tissue resorption" ["Diferenciação e funções dos osteoclastos e osontoclastos na reabsorção de tecidos mineralizada"], Microsc Res Tech. 2003 Aug 15;61(6):483-95. É ainda descrito um método para o tratamento ou a prevenção da artrite reumatóide ou condição de artrite reumatóide em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que a destruição progressiva do osso periarticular é uma das principais causas da disfunção da articulação e de deficiência em pacientes com artrite reumatóide, vide Goldring SR, "Pathogenesis of bone erosions in rheumatoid arthritis" ["Patogénese de erosão óssea na artrite reumatóide"]. Curr. Opin. Rheumatol. 2002; 14:406-10. A análise de tecido da articulação de pacientes com artrite reumatóide forneceu provas de que os 11 osteoclastos positivos em catepsina K são os tipos de células que medeiam a reabsorção óssea focal associada a lesão sinovial reumatóide, vide Hou, W-S, Li, W, Keyszer, G,Weber, E,Levy,R,Klein, MJ, Gravallese, EM, Goldring, SR, Bromme, D,"Comparison of Cathepsin K and S expression within the Rheumatoid and Osteoarthritic Synovium" ["Comparisão da expressão da catepsina K e S dentro do sinóvio reumatóide e osteoartrítico"], Arthritis Rheumatism 2002; 46: 663-74. Adicionalmente, a perda óssea generalizada é uma das principais causas da morbilidade associada à artrite reumatóide severa. A frequência de fracturas da anca e da coluna vertebral aumentou substancialmente em pacientes com artrite reumatóide crónica, vide Gould A, Sambrook, P. Devlin J et al, "Osteoclastic activation is the principal mechanism leading to secondary osteoporosis in rheumatoid arthritis" ["A activação osteoclástica é o principal mecanismo que conduz a osteoporose secundária na artrite reumatóide"]. J. Rheumatol. 1998; 25:1282-9. A utilidade dos inibidores de catepsina K no tratamento ou na prevenção da reabsorção no osso sub-articular e a perda óssea generalizada representam uma abordagem racional para a intervenção farmacológica na progressão da artrite reumatóide. and bone: A presente invenção descreve ainda um método para o tratamento ou a prevenção da progressão da osteoartrite em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que a osteoartrite (OA) é acompanhada de alterações bem definidas nas articulações, incluindo a erosão da superfície da cartilagem articular, a ossificação / osteofitose peri-articular endocondral e a esclerose óssea subcondral e a formação de quistos, vide Oettmeier R. Abendroth, K., "Osteoarthritis and bone: osteologic types of 12 osteoarthritis of the hip" ["Osteoartrite e ossos: tipos osteológicos da osteoartrite da anca"]. Skeletal Radiol. 1989; 18: 165-74. Recentemente foi sugerido um potencial contributo da esclerose óssea subcondral para a iniciação e progressão da osteoartrite. Um osso subcondral endurecido com a articulação a responder a cargas impulsivas repetitivas, provavelmente não atenuará nem distribuirá as forças pela articulação, sujeitando-a a um esforço mecânico muito grande ao longo da superfície da cartilagem articular. Por sua vez, acelera o desgaste e fibrilado da cartilagem, vide Radin, EL e Rose RM, "Role of subchondral bone in the initiation and progression of cartilage damage" ["Papel do osso subcondral na iniciação e progressão de danos na cartilagem"], Clin. Orthop. 1986; 213: 34-40. A inibição de reabsorção óssea sub-articular excessiva por um agente anti-reabsortivo, tal como um inibidor da catepsina K, irá conduzir à inibição do turnover do osso subcondral, podendo, portanto, ter um impacto favorável na progressão da osteoartrite. seus

Adicionalmente à hipótese mencionada acima, a expressão proteica da catepsina K foi recentemente identificada em fibroblastos sinoviais, células tipo macrófagos e condrócitos de sinóvio e espécimes de cartilagem articular derivados de pacientes com osteoartrite, vide Hou, W-S, Li, W. Keyszer, G, Weber. E. Levy, R, Klein, MJ, Gravallese, EM, Goldring, SR, Bromme, D, "Comparison of Cathepsin K and S expression within the Rheumatoid and Osteoarthritic Synovium" ["Comparação da expressão da catepsina K e S dentro do sinóvio reumatóide e osteartrítica"], Arthritis Rheumatism 2002; 46:663-74; e Dodd, RA, Connor, JR, Drake, FH, Gowen, M, "Expression of Cathepsin K messenger RNA in giant cells and their precursors in human osteoarthritic synovial tissues" ["Expressão do RNA mensageiro da catepsina K em células gigantes e os seus precursores em tecidos humanos 13 osteoartríticos sinoviais"]. Arthritis Rheumatism 1993; 42: 1588-93; and Konttinen, YT, Mandelin, J, Li, T-F, Saio, J, Lassus, J et al. "Acidic cysteine endoproteinase cathepsin K in the degeneration of the superficial articular hyaline cartilage in osteoarthritis" ["Endoproteinase cisteina acidica catepsina K na degeneração da cartilagem hialina superficial articular na osteoartrite"] , Arthritis Rheumatism 2002; 46: 953-60. Estes estudos recentes estão, portanto, implicados no papel da catepsina K na destruição de colagénio tipo II da cartilagem articular associada à progressão de osteoartrite. A utilidade dos inibidores da catepsina K no tratamento ou na prevenção de osteoartrite como descrita compreende, portanto, dois mecanismos diferentes, um deles é a inibição de turnover ósseo sub-condral controlado por osteoclastos e o outro é a inibição directa da degeneração do colagénio tipo II no sinóvio e na cartilagem dos pacientes com osteoartrite. A invenção descreve um método para o tratamento da osteólise periprostética em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. O uso de inibidores da catepsina K para o tratamento da osteólise periprostética é discutido na literatura, vide Mandelin, J., et al., "Interface tissue fibroblasts from loose total hip replacement prosthesis produce receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand, osteoprotegerin and cathepsin K" ["Fibroblastos de tecido de interface de próteses soltas de substituição completa da anca produzem um activador do receptor do ligando nuclear factor-kappaB, osteoprotegerina e catepsina K"]. J Rheumatol. 2005 Apr; 32(4):713-20. É ainda descrito um método para o tratamento de patologias ósseas, tais como, a doença de Paget, a osteogénese imperfeita e as lesões ósseas de mieloma múltiplo em mamíferos que necessitem do mesmo, que 14 compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. 0 uso de inibidores da catepsina K para o tratamento da doença de Paget, da osteogénese imperfeita e das lesões ósseas do mieloma múltiplo é debatido na literatura, vide Lipton, A., "New therapeutic agents for the treatment of bone diseases" ["Novos agentes terapêuticos para o tratamento de patologias ósseas"], Expert Opin Biol Ther. 2005 Jun;5(6):817-32. E ainda descrito um método para o tratamento de cancro em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos ou das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que a catepsina K é expressiva em cancros humanos da mama, da próstata e em cordomas e apresenta capacidades de degradação da matriz, vide Littlewood-Evans AJ, Bilbe G, Bowler WB, Farley D, Wlodarski B, Kokubo T, Inaoka T. Sloane J, Evans DB, Gallagher JA, "The osteoclast-associated protease cathepsin K is expressed in human breast carcinoma" ["A protease associada aos osteoclastos catepsina K é expressada no carcinoma humano da mama"], Câncer Res 1997 Dec 1;57(23):5386-90. Brubaker KD, Vessella RL, True LD. Thomas R, Corey E, "Cathepsin K mRNA and protein expression in prostate câncer progression" ["Expressão da catepsina K mRNA e da proteína na progressão do cancro da próstata"], J Bone Miner Res 2003 18, 222-30. Haeckel C, Krueger S, Kuester D, Ostertag H, Samii M, Buehling F, Broemme D, Czerniak B, Roessner A., "Expression of cathepsin K in chordoma" ["Expressão da catepsina K nos cordoma"], Hum Pathol 2000 Jul;31(7):834-40. É ainda descrito um método para o tratamento de aterosclerose em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade 15 terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. E conhecido da literatura que a catepsina K é expressiva no ateroma humano e apresenta uma actividade significante de elastase, vide Sukhova GK, Shi GP, Simon Dl, Chapman HA, Libby P, "Expression of the elastolytic cathepsins S and K in human atheroma and regulation of their production in smooth muscle cells" ["Expressão da catepsinas S e K elastolíticas em atheroma humano e regulação da sua produção em células musculares suaves"], J Clin Invest 1998 Aug 102, 576-83. É ainda descrito um método para o tratamento da obesidade em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que o ARNm da catepsina K aumenta no tecido adiposo de vários modelos de obesidade em ratinhos e também em tecidos adiposos de seres humanos obesos do sexo masculino, vide Chiellini C, Costa M, Novelli SE, Amri EZ, Benzi L, Bertacca A, Cohen P, Del Prato S, Friedman JM, Maffei M, "Identification of cathepsin K as a novel marker of adiposity in white adipose tissue" ["Identificação da catepsina K como um novo marcador da adiposidade em tecido adiposo branco"], J Cell Physiol 2003, 195, 309-21. É ainda descrito um método para o tratamento de glaucoma em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. A catepsina K apresenta um nível elevado de expressão na íris, no corpo ciliar e no epitélio pigmentário retiniano e como tal pode ser vantajosa no tratamento de glaucoma, vide Ortega, J., et al., "Gene. Expression of Proteases and 16

Protease Inhibitors in the Human Ciliary Epithelium and ODM-2 cells" ["Gene. Expressão das proteases e inibidores da protease no epitélio ciliar humano e nas células ODM-2"], Exp. Eye Res (1997) 65, 289-299; International Publication WO 2004/058238 (Alcon, Inc.). É ainda descrito um método para o tratamento da doença pulmonar obstrutiva crónica em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que a catepsina K desempenha um papel importante na fibrose pulmonar, vide Buhling, F., et al., "Pivotal role of cathepsin K in lung fibrosis" ["Papel essencial da catepsina K na fibrose pulmonar"], Am J Pathol. 2004 Jun;164(6):2203-16. É ainda descrito um método para o tratamento de infecções parasitárias em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que a catepsina de mamíferos está relacionada com proteases de cisteína da família da papaína que desempenham um papel importante no ciclo de vida destes parasitas. Tais parasitas estão envolvidos nas patologias da malária. Tripanossomíase americana, tripanossomíase africana, leishmaniose, giardiose, tricomoníase, amebíase, esquistossomose, fasciolíase, paragonimose e nematódeos intestinais, vide Lecaille F, Kaleta J, Bromme D., "Human and parasitic papain-like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design" ["Proteases de cisteína tipo papaína humana e parasitária: o seu papel na fisiologia e patologia e desenvolvimentos recentes no desenho de inibidores"], Chem Rev 2002 102, 4459-88. A invenção descreve ainda um método para o tratamento 17 da síndrome respiratória aguda grave (SARS) em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. A invenção descreve ainda um método para o tratamento da doença óssea metastática em mamíferos que necessitem do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou de alguma das composições farmacêuticas descritas acima ao mamífero. É conhecido da literatura que os osteoclastos são responsáveis pela reabsorção óssea e que a destruição óssea e a hipercalcemia induzida por tumores metastáticos são efectuadas por osteoclastos. Consequentemente, a inibição de osteoclastos pode prevenir a destruição óssea e a metástase óssea, vide Miyamoto, T. and Suda, T., "Differentiation and function of osteoclasts" ["Diferenciação e função de osteoclastos"], Keio J Med 2003 Mar;5 2(1) :l-7. A invenção descreve ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de algum dos compostos ou alguma das composições farmacêuticas descritas acima a um mamífero para o tratamento de patologias em mamíferos associadas à catepsina S, incluindo a doença de Alzheimer, a aterosclerose, a doença pulmonar obstrutiva crónica, o cancro e determinadas doenças auto-imunes, incluindo, entre outras, a diabetes juvenil, a esclerose múltipla, o pênfigo vulgar, a doença de Graves, a miastenia grave, o lúpus eritematoso sistémico, a artrite reumatóide e a tiroidite de Hashimoto; as doenças alérgicas, incluindo, entre outras, a asma e as respostas imunológicas alogénicas, incluindo, entre outras, a rejeição de transplante de órgãos ou enxertos de tecidos. É conhecido na literatura que a actividade da catepsina S está associada aos estados patológicos descritos acima, vide 18

Munger JS, Haass C, Lemere CA, Shi GP, Wong WS, Teplow DB, Selkoe DJ, Chapman HA, "Lysosomal Processing of amyloid precursor protein to A beta peptides: a distinct role for cathepsin S" [ "Processmaneto lisosomal da proteína precursora amilóide para péptidos beta A: um papel específico para a catepsina S"], Biochem J 1995 311, 2 9 9 — 305. Sukhova GK, Zhang Y, Pan JH, Wada Y, Yamamoto T, Naito M, Kodama T, Tsimikas S, Witztum JL, Lu ML, Sakara Y, Chin MT, Libby P, Shi GP, "Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice" ["Deficiência de catepsina S reduz a aterosclerose em LDL ratos com deficiência de receptores" ] , J Clin Invest 2003 111, 897-906. Zheng T, Zhu Z, Wang Z, Homer RJ, Ma B, Riese RJ Jr, Chapman HA Jr, Shapiro SD, Elias JA, "Inducible targeting of IL-13 to the adult lung causes matrix metalloproteinase and cathepsin- dependent emphysema" ["Direccionamento induzível do IL-13 para o pulmão adulto provoca metaloprotease da matriz e enfisema dependente da catepsina"], J Clin Invest 2000 106,1081-93. Shi GP, Sukhova GK, Kuzuya M, Ye Q, Du J, Zhang Y, Pan JH, Lu ML, Cheng XW, Iguchi A, Perrey S, Lee AM, Chapman HA, Libby P, "Deficiency of the cysteine protease cathepsin S impairs microvessel growth" ["Deficiência da protease cisteína catepsina S prejudica o crescimento de microvasos"] , Circ Res 2003 92, 93-500. Nakagawa TY, Brissette WH, Lira PD,

Griffiths RJ, Petrushova N, Stock J, McNeish JD, Eastman SE, Howard ED, Clarke SR, Rosloniec EF, Elliott EA, Rudensky AY, "Impaired invariant chain degradation and antigen presentation and diminished collagen-induced arthritis in cathepsin S null mice" ["Degradação prejudicial da cadeia invariante e presentação antigénio e artrite induzida por colagénio reduzido em ratos com catepsina S nula"], Immunity 1999 10,207-17.

Exemplificativo da invenção é o uso de qualquer um dos compostos descritos acima na preparação de um medicamento 19 para o tratamento e/ou a prevenção da osteoporose em mamíferos que necessitem dele. Ainda mais exemplificativo da invenção é o uso de qualquer um dos compostos descritos acima na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção: da perda óssea, da reabsorção óssea, de fracturas de ossos, de doença óssea metastática e/ou patologias relacionadas com o funcionamento de catepsinas.

Ainda mais exemplif icativo da invenção é o uso de um inibidor da catepsina K da presente invenção ou um sal, um estereoisómero ou um derivado N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a manufaturação de um medicamento, que com uma única dose oral permite o tratamento de uma patologia seleccionada de: osteoporose, osteoporose induzida por glicocorticóides, doença de Paget, aumento anormal do turnover ósseo, doença periodontal, perda de dentes, fracturas de ossos, artrite reumatóide, osteoartrite, osteólise periprostética, osteogénese imperfeita, aterosclerose, obesidade, glaucoma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença óssea metastática, hipercalcemia maligna e mieloma múltiplo, em mamíferos que necessitem do mesmo, de acordo com um horário contínuo com um intervalo de dosagem de uma vez por semana, quinzenalmente, duas vezes por mês ou uma vez por mês. É também descrito um método para o tratamento de uma patologia seleccionada de: osteoporose, osteoporose induzida por glicocorticóides, doença de Paget, aumento anormal do turnover ósseo, doença periodontal, perda de dentes, fracturas de ossos, artrite reumatóide, osteoartrite, osteólise periprostética, osteogénese imperfeita, aterosclerose, obesidade, glaucoma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença óssea metastática, hipercalcemia maligna e mieloma múltiplo, por administração de um inibidor da catepsina K da presente invenção a um mamífero que necessite do mesmo, de acordo com um horário contínuo com um intervalo de dosagem de uma vez por semana, 20 quinzenalmente, duas vezes por mês ou uma vez por mês.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados a mamíferos, preferentemente humanos, quer isoladamente ou, preferentemente, em combinação com agentes de transporte ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, opcionalmente com adjuvantes conhecidos, tais como, alume, em uma composição farmacêutica, de acordo com a prática farmacêutico padrão. Os compostos podem ser administrados oralmente ou parenteralmente, incluindo as vias de administração intravenosa, intramuscular, intraperitonial, subcutânea, rectal e tópica.

No caso de comprimidos para o uso oral, os agentes de transporte habitualmente usados incluem a lactose e o amido de milho e são habitualmente adicionados agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio. Para a administração oral em forma de cápsula, os diluentes vantajosos incluem a lactose e o amido de milho seco. Para a via de administração oral de um composto terapêutico de acordo com a invenção, o composto seleccionado pode ser administrado, por exemplo, em forma de comprimidos ou cápsulas, ou como uma solução aquosa ou uma suspensão. Para a administração oral em forma de um comprimido ou cápsula, o componente activo do fármaco pode ser combinado com um agente de transporte oral, não-tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como, a lactose, o amido, a sacarose, a glucose, a celulose de metilo, o estearato de magnésio, o fosfato de dicálcio, o sulfato de cálcio, o manitol, o sorbitol, para a administração oral em forma líquida, os componentes orais do fármaco podem ser combinados com algum agente de transporte oral, não-tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como, o etanol, o glicerol, a água. Além disso, quando desejado ou necessário, também podem ser incorporados na mistura aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes adequados. De entre os aglutinantes 21 adequados incluem-se o amido, a gelatina, os açúcares naturais, tais como, a glucose ou a beta-lactose, os adoçantes de milho, as gomas naturais ou as sintéticas, tais como, a acácia, a adragante ou o alginato de sódio, a carboximetilcelulose, o polietilenoglicol, as ceras. Os lubrificantes usados nestas formas de dosagem incluem o oleato de sódio, o estearato de sódio, o estearato de magnésio, o benzoato de sódio, o acetato de sódio, o cloreto de sódio. Os desintegradores incluem, sem restrições, o amido, a metilcelulose, o ágar, a goma xantana. Quando forem requeridas suspensões aquosas para a administração oral, o ingrediente activo é combinado com agentes emulsionantes e agentes de suspensão. Se desejado, podem ser adicionados certos agentes edulcorantes e/ou agentes flavorizantes. Para o uso intramuscular, intraperitonial, subcutâneo e intravenoso, são geralmente preparadas soluções estéreis do ingrediente activo, e o pH das soluções deve ser adequadamente ajustado e tamponado. Para o uso intravenoso, a concentração total de solutos pode ser controlada para tornar a preparação isotónica.

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados em forma de sistemas de transporte de lipssomas, tais como, o transporte de vesículas uni-lamelares pequenas, o transporte de vesículas uni-lamelares grandes e o transporte de vesículas multi-lamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, tais como, o colesterol, as estearilaminas ou as fosfatidilcolinas.

Os compostos da presente invenção também podem ser transportados pelo uso de anticorpos monoclonais que funcionam como agentes de transporte individuais aos quais estão ligadas as moléculas do composto. Os compostos da presente invenção também podem estar acoplados a polímeros solúveis como agentes de transporte de fármacos dirigidos. 22

Tais polímeros podem incluir: polivinilpirrolidona, copolímero pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxi-etilaspartamida-fenol ou polietileno-óxido-polilisina substituída por resíduos de palmitoil. Além disso, os compostos da presente invenção podem estar acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis vantajosos em alcançar sistemas controlados de libertação de fármacos, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliáctico e poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido butanóico polihidroxi, poliortésters, poli- acetais, polidihidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros negros de hidrogéis reticulados ou antipáticos.

Os presentes compostos são igualmente favoráveis em conjunto com agentes conhecidos para o tratamento ou a prevenção da osteoporose, da osteoporose induzida por glicocorticóides, da doença de Paget, do aumento anormal do turnover ósseo, da doença periodontal, da perda de dentes, das fracturas de ossos, da artrite reumatóide, da osteoartrite, da osteólise periprostética, da osteogénese imperfeita, da doença óssea metastática, da hipercalcemia maligna e do mieloma múltiplo. Combinações entre os compostos presentemente descritos e outros agentes favoráveis ao tratamento ou à prevenção da osteoporose ou de outras patologias ósseas encontram-se abrangidas no âmbito da invenção. Um perito na especialidade é capaz de distinguir com facilidade quais as combinações favoráveis dos agentes com base nas características dos fármacos e da patologia envolvida. Tais agentes incluem: um bifosfonato orgânico; um modulador do receptor do estrogénio; um modulador do receptor do androgénio; um inibidor da H+-ATPase de osteoclastos; um inibidor da redutase HMG-CoA; um antagonista do receptor da integrina; uma vitamina D; um análogo sintético da vitamina D; um agente anabólico, tal como, PTH; um fármaco anti-inflamatório não esteróide; um 23 inibidor selectivo da ciclooxigenase-2; um inibidor da interleucina-1 beta, um inibidor de LOX/COX; um inibidor de RANKL; e os sais f armaceut icamente aceitável e as suas misturas. Uma combinação preferida é um composto da presente invenção e um bisfosfonato orgânico. Outra combinação preferida é um composto da presente invenção e um modulador do receptor do estrogénio. Outra combinação preferida é um composto da presente invenção e um modulador do receptor do androgénio. Outra combinação preferida é um composto da presente invenção e um agente anabólico para os osteoblastos.

Os "bisfosfatos orgânicos" incluem, entre outros, compostos da fórmula guimica P03H2

A-(CH2)n-C-X P03H2 na qual n representa um valor inteiro de 0 a 7 e na qual A e X são seleccionados, independentes entre si, de um grupo composto por H, OH, halogéneos, NH2, SH, fenilo, alquilo C1-C3CU C3-C30 ramificado ou cicloalquilo, estrutura em anel biciclica contendo dois ou três N? alquilo C1-C30 substituído, NH2 substituído por alquilo C]_-CiOr NH2 substituído por C3-C10 ramificado ou cicloalquilo, NH2 substituído por dialquilo C1-C10, alcóxi C]_-CiOr tio

substituído por alquilo C]_-CiOr tiofenilo, halof eniltio, fenilo substituído por alquilo Ci-Cio, piridilo, furanilo, pirrolidinilo, imidazolilo, imidazopiridinila e benzilo, de modo que ambos A e X não são seleccionados de H ou OH quando n é 0; ou A e X são tomados em conjunto com o átomo do carbono ou átomos ao qual estão ligados para formar um anel C3-C10·

Na fórmula química antecedente, os grupos de aquilo podem ser lineares, ramificados ou cíclicos, desde que seja 24 seleccionado um número suficiente de átomos para a fórmula química. 0 alquilo C1-C30 substituído pode incluir uma variedade grande de substituintes, exemplos não limitadores incluem os seleccionados do grupo composto por fenilo, piridilo, furanilo, pirrolidinilo, imidazonilo, NH2, NH2 substituído por alquilo ou dialquilo Οχ-0χο, OH, SH, e alcóxi Ci-Cio- A fórmula química antecedente também engloba estruturas complexas carbocíclicas, aromáticas e de heteroátomos para os substituintes de A e/ou X, exemplos não limitadores incluem naftilo, quinolilo, isoquinolilo, adamantilo e clorofeniltio.

Igualmente vantajosos são os sais e os derivados de bisfosfonatos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitadores dos sais incluem aqueles seleccionados do grupo composto por metal álcali, metal alcalino, amónio e mono-, di-, tri-, or tetra-amónio substituído por alquilo Οχ-Οχο·

Os sais preferidos são aqueles seleccionados de um grupo composto por sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio e amónio. De modo particularmente preferidos são os sais de sódio. Exemplos não limitadores de derivados incluem os seleccionados do grupo composto por ésteres, hidratos e amidas.

Gostaríamos de salientar que os termos "bisfosfonato" e "bisfosfonatos" são aqui usados como referentes aos agentes terapêuticos da presente invenção e englobam também os difosfonatos, ácidos bifosfónicos e ácidos difosfónicos; bem como, os sais e derivados destes materiais. 0 uso de nomenclatura específica para fazer referência ao bisfosfonato ou aos bisfosfonatos não limita o âmbito da presente invenção, salvo indicação específica. Devido à nomenclatura mista actualmente usada pelos peritos na especialidade, a referência a um peso ou uma percentagem específica do composto de bisfosfonato na presente invenção, tem como base o peso activo do ácido, salvo 25 indicação em contrário. Por exemplo, a frase "aproximadamente 5 mg de um bisfosfonato inibidor da reabsorção óssea seleccionado do grupo composto por alendronato, os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e as suas misturas, com base no peso activo do alendronato de sódio" significa que a quantidade do composto de bisfosfonato seleccionada é calculada com base em 5 mg de alendronato de sódio.

Exemplos não limitadores de bisfosfonatos favoráveis incluem os seguintes:

Alendronato, que também é conhecido como alendronato de sódio, 4-amino-l-hidroxibutilideno-l,1-ácido bisfosfónico, alendronato de sódio ou alendronato monosódio trihidrato, 4-amino-l-hidroxibutilideno-l,1-ácido bisfosfónico monosódio trihidrato. 0 alendronato é descrito nas patentes dos EUA 4,922,007, to Kieczykowski et al., emitida em Maio 1, 1990; 5,019.651. to Kieczykowski et al., emitida em Maio 28.1991; 5,510,517, to Dauer et al., emitida em Abril 23, 1996; 5,648,491, to Dauer et al, emitida em Julho 15, 1997.

Cicloheptilaminometileno-1,1-ácido bisfosfónico, YM 175, Yamanouchi (incadronato, anteriormente designados de cimadronato) , como descrito na patente dos EUA 4, 970.335, to Isomura et al., emitida em Novembro 13, 1990. 1,1-dicllorometileno-1, 1-ácido difosfónico (ácido clodrónico) e o sal disódio (clodronato, Procter e Gamble), são descritos na patente belga 672,205 (1966) e J. Org.

Chem 32, 4111 (1967). l-hidroxi-3-(1-pirrolidinil)-propilideno-1,1-ácido bisfosfónico (EB-1053). 1-hidroxietano -1,1-ácido difosfónico (ácido etidrónico). l-hidroxi-3-(N-metil-N-pentilamino)propilideno-1, 1-ácido bisfosfónico, também conhecido como BM-210955, Boehringer-Mannheim (ibandronato), é descrito na patente dos E.U.A. n° 26 4 927 814, emitida em Maio 22, 1990. l-hidroxi-2-imidazo-(1,2-a)piridina-3-i-etilideno (minodronato). 6-amino-l-hidroxihexilideno-l,1-ácido bisfosfónico (neridronato). 3-(dimetilamino)-1-hidroxipropilideno-l, 1-ácido bisfosfónico (olpadronato). 3-amino-l-hidroxipropilideno-l,1-ácido bisfosfónico (pamidronato).

[2-(2-piridinil)etilideno]1,1-ácido bisfosfónico (piridronato) é descrito na patente dos EUA n° 4,761,406. l-hidroxi-2-(3-piridinil)-etilideno-1,1-ácido bisfosfónico (risedronato). (4-clorofenil)tiornetano-1,1-ácido disfosfónico (tiludronato) como descrito na patente dos EUA 4,876,248, to Breliere et al., Outubro 24, 1989. l-hidroxi-2-(lH-imidazol-l-il)etilideno-1,1-ácido bisfosfónico (zoledronato).

Exemplos não limitadores dos bisfosfonatos incluem alendronato, cimadronato, clodronato, etidronato, ibandronato, incadronato, minodronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, piridronato, risedronato, tiludronato e zolendronato, e os seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis. Um bisfosfonato particularmente preferido é o alendronato, especialmente um sal de sódio, um potásio, um cálcio, um magnésio ou um amónio de ácido alendrónico. A titulo de exemplo, o bisfosfonato preferido é um sal de sódio de ácido alendrónico, especialmente um sal de sódio hidratado de ácido alendrónico. O sal pode ser hidratado com um número inteiro de moles de água ou um número fraccionado de moles de água. Exemplificando mais o bisfosfonato preferido, temos um sal de sódio hidratado de ácido alendrónico, especialmente quando o sal hidratado é alendronato monosódio trihidrato. 27 É reconhecido que as misturas de dois ou mais activos de bisfosfonato podem ser utilizadas. A dosagem precisa do bisfosfonato orgânico varia de acordo com os seguintes aspectos: o horário de dosagem, o bisfosfonato especifico escolhido, a idade, o peso, o sexo e a condição do mamífero ou humano, a natureza e a gravidade da patologia que deve ser tratada e outros factores médicos e físicos relevantes. Portanto, não é possível especificar previamente com precisão a quantidade f armaceut icamente eficaz. Contudo, pode ser prontamente determinada pelo prestador de cuidados ou médico. As quantidades apropriadas podem ser determinadas por experimentação de rotina em modelos animais e em estudos clínicos com humanos. Generalmente é seleccionada uma quantidade apropriada do bisfosfonato para obter um efeito inibidor da reabsorção óssea, ou seja, é administrada uma quantidade inibidora de reabsorção óssea do bisfosfonato. Para os seres humanos, uma dose oral eficaz de bisfosfonato varia normalmente entre 1.5 até aproximadamente 6000 μ/kg do peso corporal e preferentemente entre aproximadamente 10 até aproximadamente 2000 μ/kg do peso corporal. As doses humanas de alendronato de monosódio trihidrato normalmente administradas situam-se geralmente num intervalo de aproximadamente 2 mg/dia até aproximadamente 40 mg/dia, preferentemente aproximadamente 5 mg/dia até aproximadamente 40 mg/dia. Presentemente nos E.U.A. as dosagens aprovadas para a administração de alendronato de monosódio trihidrato são de 5 mg/dia para a prevenção da osteoporose, 10 mg/dia para o tratamento da osteoporose e 40 mg/dia para o tratamento da doença de Paget.

Num regine de dosagem alternativo, os bisfosfonatos podem ser administrados em intervalos diferentes das tomas diárias, por exemplo, uma dose uma vez por semana, uma dose duas vezes por semana, uma dose quinzenal e uma dose duas 28 vezes por mês. Num regime de dosagem de uma dose por semana, o alendronato de monosódio trihidrato seria administrado em doses de 35 mg/semana ou 70 mg/semana.

Por "modulador selectivo do receptor do estrogénio" entende-se um composto que interfere ou inibe a ligação do estrogénio ao receptor, independentemente do mecanismo. Alguns exemplos de moduladores do receptor do estrogénio incluem, entre outros, o estrogénio, o progestogénio, o estradiol, o droloxifeno, o raloxifeno, o lasofoxifeno, o TSE-424, o tamoxifeno, o idoxifeno, LY353381, LY117081, o toremifeno, o o fulvestranto, 4—[7—(2,2— dimetil-l-oxopropoxi-4-metil-2-[4—[2—(1— piperidinil)etóxi]fenil]-2H-l-benzopirano-3-il]-fenil-2,2-dimetilpropanoato, 4,4'-dihidroxibenzofenona-2,4- dinitrofenil-hidrazona, e SH646.

Por "modulador do receptor beta do estrogénio" entende-se um composto que selectivamente agoniza ou antagoniza o receptor beta do estrogénio (ERPAgonizante ERp aumenta a transcrição do gene de hidroxílase do triptofano (TPH, a enzima chave na síntese da serotonina) via um evento mediado por ERβ. Alguns exemplos dos antagonistas do receptor beta de estrogénio podem ser encontrados na publicação internacional PCT WO 01/82923, publicada em Novembro 08, 2001, e WO 02/41835, publicada em Maio 20, 2002.

Por "modulador do receptor do androgénio" entende-se um composto que interfere ou inibe a ligação do androgénio ao receptor, independentemente do mecanismo. Alguns exemplos de moduladores dos receptores de androgénio incluem a finasterida e outros inibidores da redutase 5a, a nilutamida, a flutamida, a bicalutamida, a liarozole e o acetato de abiraterona.

Por "inibidor da H+-ATPase de osteoclastos" entende-se um inibidor da H+-ATPase, que se encontra na membrana apical do osteoclasto e que desempenha um papel importante 29 no processo de reabsorção óssea. Esta bomba de protões representa um alvo muito atractivo para a concepção de inibidores de reabsorção óssea, que são potencialmente favoráveis ao tratamento e à prevenção da osteoporose e patologias metabólicas relacionadas. Vide C. Farina et al., "Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase as novel bone antiresorptive agents" ["Inibidores selectivos do protão ATPase vacuolar dos osteoclastos como novos agentes de reabsorção óssea"], DDT, 4: 163-172 (1999) ) .

Por "inibidor da HMG-CoA redutase" entende-se um inibidor da 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductase. Os compostos que apresentam uma actividade inibitória da redutase HMG-CoA podem ser prontamente identificados, usando ensaios bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, vide os ensaios descritos ou citados na patente dos E.U.A. 4 231 938 at col. 6 e WO 84/02131 at pp. 30-33. Os termos "inibidor da redutase HMG-CoA " e "inibição da redutase HMG-CoA " têm o mesmo significado no presente documento.

Alguns exemplos de inibidores da HMG-CoA redutase que podem ser usados incluem, entre outros, o lovastatin (MEVA-COR®; vide Patentes U.S. 4 231 938, 4 294 926 e 4 319 039), o simvastatin (XOCOR®; vide Patentes U.S. 4 444 784, 4 820 850 e 4 916 239), o pravastatin (PRAVACHOL®; vide Patentes U.S. 4 346 227, 4 537 859, 4 410 629, 5 030 447 e 5 180 589), o fluvastatin (LESCOL®; vide Patentes U.S. 5 354 772, 4 911 165, 4 929 437, 5 189 164, 5 118 853, 5 290 946 e 5 356 896), o atorvastatin (LIPITOR®; vide

Patentes US 5 273 995, 4 681 893, 5 489 691 e 5 342 952) e o cerivastatin (também conhecido como rivastatin e BAYCHOL®; vide Patente US 5 177 080). As fórmulas estruturais destes e de outros inibidores adicionais da redutase HMG-CoA que podem ser usados nos presentes métodos encontram-se descritos na página 87 de M. Yalpani, 30 "Cholesterol Lowering Drugs" ["Fármacos redutores do colesterol"], Chemistry & Industry, pp. 85-89 (5 Fevereiro 1996) e nas patentes US 4 782 084 e 4 885 314. O termo inibidor da redutase HMG-CoA, tal como utilizado neste documento, inclui todas as lactonas farmaceuticamente aceitáveis e as formas de ácido aberto (i.e., onde o anel de lactona se encontra aberto para formar ácido livre), bem como, as formas de sal e de éster dos compostos gue apresentam uma actividade inibidora da redutase HMG-CoA. Deste modo, o uso de tais sais, ésteres, formas de ácido-aberto e lactonas encontra-se incluído no âmbito da presente invenção. Uma ilustração da porção de lactona e da sua correspondente forma de ácido-aberto é representada abaixo nas fórmulas I e II.

HO*Y^COOH

k^OH j: j:

Lactona Ácido aberto I Π

Nos inibidores da redutase HMG-CoA, nos quais pode existir uma forma de ácido-aberto, as formas de sal e de éster podem preferentemente ser formadas por ácido-aberto e todas estas formas encontram-se incluídas dentro do significado do termo "inibidor da redutase HMG-CoA ", tal como é utilizado aqui. Preferentemente, o inibidor da redutase HMG-CoA é seleccionado do lovastatin e so simvastatin e, preferentemente, do simvastatin. Tal como usado aqui, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" com respeito ao inibidor da redutase HMG-CoA significa sais não tóxicos dos compostos empregados nesta invenção, que são generalmente preparados pela reacção do ácido livre com uma base orgânica ou inorgânica adequada, em particular as 31 formadas de catiões, tais como, o sódio, o potássio, o alumínio, o cálcio, o lítio, o magnésio, o zinco e o tetrametilamónio, bem como, os sais formados de aminas, tal como, o amoníaco, a etilenodiamina, a N-metilglucamina, a lisina, a arginina, a ornitina, a colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, a cloroprocaína, a dietanolamina, a procaína, N-benzilfenetilamina, l-p-clorobenzil-2-pirrolidina-1'-il-metilbenzimidazola, a dietilamina, a piperazina e o tris(hidroximetil) aminometano. Outros exemplos de formas de sal de inibidores da redutase HMG-CoA podem incluir, entre outros, o acetato, o benzenosulfonato, o benzoato, o bicarbonato, o bisulfato, o bitartrato, o borato, o bromido, o edetato de cálcio, o camsilato, o carbonato, o cloreto, o clavulanato, o citrato, o dihidrocloreto, o edetato, o edisilato, o estolato, o esilato, o fumarato, o gluceptato, o gluconato, o glutamato, o glicollilarsanilato, o hexilresorcinato, o hidrabamino, o hidrobromido, o hidrocloreto, o hidroxinaptoato, o iodito, o isotionato, o lactato, o lactobionato, o laurato, o malato, o maleato, o mandelato, o mesilato, o metilsulfato, o mucato, o napsilato, o nitrato, o oleato, o oxalato, o pamaoto, o palmitato, o pantotenato, o fosfato/difosfato, o poligalacturonato, o salicilato, o estearato, o subacetato, o succinato, o tannato, o tartrato, o teoclato, o tosilato, o trietiodido e o valerato.

Os derivados de éster dos compostos do inibidor da redutase HMG-CoA descritos podem agir como pró-fármacos que, quando absorvidos para a corrente sanguínea de um animal de sangue quente, podem separar-se de maneira a libertar a forma do fármaco e permitir que o fármaco melhore a eficácia terapêutica.

Tal como utilizado previamente, o termo "antagonistas de receptor da integrina" refere-se aos compostos que selectivamente antagonizam, inibem ou compensam a ligação 32 de um ligando fisiológico à integrina ανβ3, aos compostos que selectivamente antagonizam, inibem ou compensam a ligação de um ligando fisiológico à integrina ανβ5, aos compostos que selectivamente antagonizam, inibem ou compensam a ligação de um ligando fisiológico à integrina ανβ3 e a integrina ανβ5 e aos compostos que selectivamente antagonizam, inibem ou compensam a actividade de integrina(s) particular (es) expressas em células endoteliais capilares. 0 termo também se refere a antagonistas de integrinas ανβ6/· θίνβ 8 «ιβι, «2βι, oí5 β l, οίββι e αζβ4· 0 termo também se refere a antagonistas de alguma combinação de integrinas ανβ3, ανβ5/- «νββ^ 0ίνβ8/-ofi β ι, oí2 β 1 / oí5 β 1 a todas e integrina αδβ4· Η.Ν. Lode e coworkers na PNAS USA 96: 1591-1596 (1999) observaram 0s efeitos sinergéticos entre um antagonista da integrina antiangiogénico av e uma proteína de fusão de anticorpos de citocina (interleucina-2) específica de tumores na erradicação de metástases espontâneas de tumores. Os seus resultados sugerem que esta combinação apresenta um grande potencial no tratamento de cancro e do crescimento de tumores metastáticos. Os antagonistas dos receptores da integrina ανβ3 inibem a reabsorção óssea através de um novo mecanismo completamente diferente do dos fármacos actualmente disponíveis. As integrinas são receptores transmembranares heterodiméricos de adesão que medeiam as interacções célula-célula e célula-matriz. As sub-unidades das integrinas cx e β interagem não-covalentemente e unem ligandos extracelulares da matriz de uma maneira dependente do catião divalente. A integrina mais abundante nos osteoclastos é ανβ3 (>10^/osteoclasto), que parece ter um papel limitador na taxa da organização do citoesqueleto importante na migração e polarização celular. 0 efeito antagonizante da integrina ανβ3 é seleccionado da inibição da reabsorção óssea, da inibição da reestenose, da inibição da degeneração macular, da inibição da artrite e da 33 inibição de cancro e do crescimento metastático.

Por "agente anabólico do osteoblasto" entende-se os agentes que estimulam a formação óssea, tais como PTH. A administração intermitente da hormona da paratiróide (PTH) ou os seus fragmentos amino-terminais e análogos demonstraram efeitos de prevenção, detenção e de reversão parcial da perda óssea e efeitos que estimulam a formação óssea em animais e humanos. Vide o debate em D.W. Dempster et al., "Anabolic actions of parathyroid hormone on bone" ["Acções anabólicas da hormona da paratiróide nos ossos"], Endocr Rev 14: 690-709 (1993). Estudos demonstraram os benefícios clínicos da hormona da paratiróide na estimulação da formação óssea e, portanto, no aumento da massa e força óssea. Estes resultados foram relatados por RM Neer et al., in New Eng J Med 344 1434-1441 (2001).

Adicionalmente, os fragmentos de proteína relacionados com a hormona da paratiróide ou análogos, tais como, a PTHrP-(l-36) demonstraram efeitos anticalciúricos potentes [vide M.A. Syed et al., "Parathyroid hormone-related protein-(1-36) stimulates renal tubular calcium reabsorption in normal human volunteers: implications for the pathogenesis of humoral hypercalcemia of malignancy" ["Proteína (1-6) relacionada com a hormona da paratiróide estimula a reabsorção de cálcio renal tubular em voluntários humanos normais: implicações para a patogénese da hipercalcemia maligna humoral"], JCEM 86: 1525-1531 (2001)] e pode também apresentar potencial como agente anabólico para o tratamento da osteoporose. A "vitamina D" inclui, entre outras, a vitamina D3 (colecalciferol) e a vitamina D2 (ergocalciferol), que ocorrem naturalmente, percursores biologicamente inactivos dos metabólitos hidroxilados biologicamente activos da vitamina D: vitamina D Ια-hidroxi; vitamina D 25-hidroxi e la, vitamina D 25-dihidroxi. A vitamina D2 e a vitamina D3 apresentam a mesma eficácia biológica nos humanos. Quando a 34 vitamina D2 ou D3 entra em circulação, é hidroxilada por citocromo P450_vitamina D-25-hidroxílase para dar vitamina D 25-hidroxi. 0 metabólito da vitamina D 25-hidroxi é biologicamente inerte e é ainda mais hidroxilado no rim pelo citocromo P450-mono-oxigenase, 25 (OH) D-la hidroxílase para dar 1,25-dihidroxi vitamina D. Quando o cálcio sérico diminui, aumenta a produção da hormona da paratiróide (PTH), que regula a homeostase de cálcio e aumenta a conversão da vitamina D 25- hidroxi para a vitamina D 1,25-dihidroxi . A vitamina D 1,25-dihidroxi é reponsável pelos efeitos da vitamina D no metabolismo do cálcio e dos ossos. 0 metabólito 1,25-dihidroxi é a hormona activa requerida para manter a absorção de cálcio e a integridade do esqueleto. A homeostase do cálcio é mentida pela vitamina D 1,25 dihidroxi ao induzir células tronco de monócitos para a diferenciação em osteoclastos e por manter o cálcio em níveis normais, o que resulta na mineralização óssea por deposição de hidroxiapatita de cálcio na superfície óssea, vide Holick, MF, "Vitamin D photobiology, metabolism, and clinicai applications" ["Fotobiologia, metabolismo e aplicações clínicas da vitamina D"], in Endocrinology, 3rd ed., 990-1013 (1995), editado por DeGroot L, et al.

Contudo, os níveis elevados de vitamina D3 1α25- dihidroxi pode resultar num aumento da concentração de cálcio no sangue e num controlo anormal da concentração de cálcio pelo metabolismo ósseo, resultando em hipercalcemia. A vitamina D3 la,25-dihidroxi também regula indirectamente a actividade osteoclástica no metabolismo ósseo e os níveis elevados podem aumentar excessivamente a reabsorção óssea na osteoporose.

Em formas de realização da presente invenção, é escolhida uma quantidade apropriada do composto da vitamina D para fornecer a nutrição adequada de vitamina D durante o intervalo de dosagem sem interferir com o efeito inibidor 35 da catepsina K, permitindo obter o efeito inibidor da reabsorção óssea. Para as composições orais da presente invenção compostas por um inibidor da catepsina K e um composto da vitamina D, uma quantidade do composto da vitamina D compreende de aproximadamente 100 IU até aproximadamente 60,000 IU. Exemplos não limitadores da quantidade oral do composto da vitamina D em formas de realização da presente invenção incluem, entre outros, dosagens de 2,800, IU, 5,600 IU, 7,000 IU, 8,400 IU, 11,200 IU, 14,000 IU, 16,800 IU ou 19,600 IU. Exemplos não limitadores de uma quantidade oral da vitamina D para uma dose semanal são 2,800, IU, 5,600 IU, 7,000 IU, 8,400 IU e 11,200 IU. Exemplos não limitadores de uma quantidade oral da vitamina D para uma dose mensal são 11,200, IU, 14,000 IU, 15,400 IU, 16,800 IU e 19,600 IU.

Por "análogos sintéticos da vitamina D" entendem-se os compostos que não ocorrem naturalmente e que agem como a vitamina D.

Os "fármacos anti-inflamatórios não esteróides" ou AINEs inibem o metabolismo de ácido araquidónico para prostaglandinas pró-inflamatória via cicloxigenase (COX)-l e COX-2. Exemplos não limitadores de AINES incluem: aspirina, ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco, etodolaco, fenoporfeno, flubiprofeno, indometacina, ketoprofeno, cetorolaco, meloxicam, nabumetona, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetina, diflunisal, meclofenamato e fenilbutazona.

Por "inibidor selectivo de cicloxigenase-2" ou inibidor COX-2 entende-se um tipo de fármaco anti-inflamatório não esteróide (AINES), que inibe a co-enzima COX-2, que contribui para a dor e inflamação no corpo. Exemplos não limitadores dos inibidores COX-2 incluem: celecoxib, etoricoxib, parecoxib, rofecoxib, valdecoxib e lumiracoxib.

Por "inibidor de interleucina-1 beta" ou IL-Ιβ, 36 entende-se um inibidor de IL-1, que é um factor solúvel produzido por monócitos, macrófagos e outras células que activam T-linfócitos e potência a sua resposta a mitógenios ou antigénios. Exemplos não limitadores de inibidores IL-Ιβ incluem diacereina e reina.

Por "inibidor de LOX/COX" entende-se um inibidor ou todas as três principais enzimas envolvidas na via do ácido araquidónico - nomeadamente, 5-LOX, COX-1 e COX-2. Um exemplo não limitador do inibidor de LOX/COX é a licofelona.

Por "inibidor de RANKL" entende-se um inibidor do receptor activador ligando de NF-kB (RANKL), que foi previamente chamado de factor de diferenciação do osteoclasto (ODF), ligando de osteoprotegerina (OPGL) e citocina induzida por activação relacionada com TNF (TRANCE). RANKL representa um estimulador chave da formação e maturação dos osteoclastos. Um exemplo não limitador do inibidor de RANKL é AMG-162.

Se formulados como uma dose fixa, tais produtos combinados empregam os compostos da presente invenção dentro da margem de dosagem descrita abaixo e os outros agentes farmaceuticamente activos dentro da sua margem de dosagem. Os compostos da presente invenção podem alternativamente ser usados sequencialmente com agentes farmaceuticamente aceitáveis conhecidos quando uma formulação combinada não for apropriada. 0 termo "administração" e as suas variantes (p. ex., "administrar" um composto) em referência a um composto da invenção significam a introdução de um composto ou de um pró-fármaco do composto no sistema do animal que necessita do tratamento. Quando um composto da invenção ou um pró-fármaco do mesmo é fornecido em combinação com um ou mais outros agentes activos (p. ex., um agente citotóxico, etc.), a "administração" e as suas variantes devem ser compreendidas para incluir a introdução simultânea e 37 sequencial do composto ou pró-fármaco do mesmo e, portanto, outros agentes. A presente invenção inclui, no seu âmbito, pró-fármacos do composto desta invenção. Em geral, tais pró-fármacos serão derivados funcionais dos compostos desta invenção, que são prontamente convertidos in vivo para o composto requerido. Alguns exemplos não limitadores dos pró-fármacos previstos na presente invenção incluem os ésteres que podem ser hidrolisados para fornecer álcoois da presente invenção; as cetonas que podem ser reduzidas in vivo para fornecer álcoois da presente invenção. Entende-se que em alguns casos, a redução da cetona pode ocorrer estereospecificamente para fornecer predominantemente um único álcool diastereomérico. Mais examplos de pró-fármacos adequados, além dos processos convencionais para a selecção e preparação de tais derivados, encontram-se descritos, por exemple, em "Design of Prodrugs" ["Desenho de pró-fármacos"], ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985. Por isso, nos métodos de tratamento da presente invenção, o termo "administrar" engloba o tratamento de várias condições descritas com o composto especificamente descrito ou com o composto que pode ser especificamente descrito, mas que se converte no composto especifico in vivo depois da administração ao paciente. Os metabólitos destes compostos incluem espécies activas produzidas após introdução dos compostos desta invenção no seu meio biológico.

Tal como é utilizado aqui, o termo "composição" engloba o produto que compreende os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulta directa ou indirectamente da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como usado aqui, significa a quantidade do composto activo ou agente farmacêutico que produz a resposta biológica ou médica num tecido, sistema, animal ou humano que é 38 procurada por um investigador, veterinário, médico ou outro clínico.

Os termos "tratar" ou "tratamento" da patologia, tal como usado aqui, inclui: a prevenção da patologia, i.e., evitando o desenvolvimento dos sintomas clínicos da patologia num mamífero que possa ser exposto à ou predisposto à patologia, mas que ainda não sente nem apresenta os sintomas da patologia; a inibição da patologia, i.e., a detenção ou redução do desenvolvimento da patologia ou dos seus sintomas clínicos; ou o alívio da patologia, i.e., provocando a regressão da patologia ou dos seus sintomas clínicos. 0 termo "reabsorção óssea" tal como usado aqui, refere-se ao processo pelo qual os osteoclastos provocam a degradação óssea.

Os termos "uma vez por semana" e "uma por semana", tal como usados aqui, significam que, por exemplo, uma dose unitária do inibidor da catepsina K é administrada uma vez por semana, i.e., uma vez durante um período de sete dias, de preferência no mesmo dia da semana. No regime de uma dose semanal, a dose unitária é geralmente administrada a cada sete dias. Um exemplo não limitador do regime de dosagem uma vez por semana, engloba a administração de uma dose unitária do inibidor da catepsina K todos os domingos. É habitualmente recomendado que a dose unitária da administração no regime de uma vez por semana não seja administrada em dias consecutivos, mas o regime de dosagem uma vez por semana pode incluir um regime de dosagem em que as doses unitárias são administradas em dois dias consecutivos em dois períodos semanais diferentes. A dose "quinzenal" significa que a dose unitária do inibidor da catepsina K é administrada uma vez num período de duas semanas, i.e., uma vez durante um período de catorze dias, de preferência no mesmo dia durante cada período de duas semanas. No regime quinzenal de dosagem, a 39 dose unitária é geralmente administrada a cada catorze dias. Um exemplo não limitador do regime de dosagem quinzenal engloba a administração de uma dose unitária do inibidor da catepsina K em cada domingo de duas em duas semanas. É habitualmente recomendado que a dose unitária da administração no regime quinzenal não seja administrada em dias consecutivos, mas o regime de dosagem quinzenal pode incluir um regime de dosagem em que as doses unitárias são administradas em dois dias consecutivos dentro de dois períodos quinzenais diferentes. A dose "duas vezes por mês" significa que a dose unitária do inibidor da catepsina K é administrada duas vezes durante um período de um mês. No regime de dosagem duas vezes por mês, as doses são preferentemente administradas nas mesmas duas datas de cada mês. No regime de dosagem duas vezes por mês, a dose unitária é geralmente administrada a cada catorze a desaseis dias. Um exemplo não limitador do regime de dosagem de duas vezes por mês engloba a administração no ou próximo do primeiro dia do mês e no ou próximo do dia quinze do mês, i.e. o ponto médio do mês. É habitualmente recomendado que as doses unitárias não sejam administradas em dias consecutivos, mas o regime de dosagem duas vezes por mês pode incluir um regime de dosagem em que as doses unitárias são administradas em dois dias consecutivos dentro de um período mensal ou diferentes períodos mensais diferentes. 0 regime de duas vezes por semana é definido aqui como diferente e não englobando o regime de dosagem quinzenal, porque estes dois regimes apresentam uma periodicidade distinta e o resultado da administração de um número diferente de doses ao longo de períodos longos de tempo. Por exemplo, ao longo de um período de um ano, um total de aproximadamente vinte e quatro doses seriam administradas de acordo com o regime de duas vezes por mês (porque existem doze meses durante um ano civil), enquanto um total 40 de vinte e seis doses seriam administradas de acordo com o regime quinzenal (porque existem aproximadamente cinquenta e duas semanas por ano). O termo "uma vez por mês" é usado de acordo com o significado geralmente aceite como a medida de tempo cifrando-se em aproximadamente quatro semanas, aproximadamente 30 dias ou 1/12 do ano civil. A presente invenção também engloba uma composição farmacêutica vantajosa no tratamento da osteoporose ou outras patologias ósseas, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos da invenção, com ou sem agentes de transporte ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Composições adequadas desta invenção incluem soluções aquosas que compreendem os compostos desta invenção e agentes de transporte farmacologicamente aceites, por exemplo, salina com um nível de pH de, p. ex., de 7.4. As soluções podem ser introduzidas na corrente sanguínea do paciente por via intravenosa em injecção de bolus.

Quando um composto de acordo com esta invenção é administrado a um sujeito humano, a dose diária é normalmente determinada pelo médico assistente com uma dose que geralmente varia de acordo com a idade, peso e resposta do paciente individual, bem como da gravidade dos sintomas do paciente.

Em uma aplicação exemplificativa, uma quantidade adequada do composto é administrada a um mamífero submetido a um tratamento para uma condição dependente da catepsina. As doses orais da presente invenção, quando usadas para os efeitos indicados podem variar entre aproximadamente 0,01 mg por kg do peso corporal por dia (mg/kg/dia) e aproximadamente 100 mg/kg/dia, de preferência 0,01 até 10 mg/kg/dia, e de modo particularmente preferido 0,1 até 5,0 mg/kg/dia. Para a administração oral, as composições são preferentemente providenciadas em forma de comprimidos 41 contendo 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 3,5, 5,0, 10,0, 15, 0, 20,0, 25, 0, 35, 0, 40, 0, 50, 0, 80, 0, 100, 200 e 500 miligramas do ingrediente activo para o ajuste sintomático da dose ao paciente que está a ser tratado. Um medicamento contém habitualmente entre aproximadamente 0,01 mg até aproximadamente 500 mg do ingrediente activo, de preferência entre aproximadamente 1 mg até aproximadamente 100 mg do ingrediente activo. Por via intravenosa, a dose preferida situa-se entre 0,1 até aproximadamente 10 mg/kg/minuto durante um fluxo de infusão constante. De forma vantajosa, os compostos da presente invenção podem ser administrados numa única dose diária ou a dose diária total pode ser administrada dividida em doses de dois, três ou quatro vezes por dia. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser administrados de acordo com um horário continuo com um intervalo de dosagem de uma vez por semana, quinzenalmente, duas vezes por mês ou uma vez por mês. Além disso, os compostos preferidos da presente invenção podem ser administrados por via intranasal por uso tópico dos meios intranasais adequados ou por via transdérmica, usando a forma de adesivos cutâneos transdérmicos conhecidos dos peritos na especialidade. Para ser administrado em forma de um sistema de fornecimento transdérmico, a dosagem será naturalmente continua e não intermitente ao longo de todo o regime de dosagem.

Os compostos da presente invenção podem ser usados em combinação com outros agentes favoráveis ao tratamento de condições mediadas pela catepsina. Os componentes individuais de tais combinações podem ser administrados separadamente em horas diferentes durante o tratamento ou simultaneamente em formas divididas ou de combinação única. A presente invenção deve, por isso, ser entendida como abrangendo estes regimes de tratamento simultâneo ou alternado e o termo "administração" deve ser interpretado de modo correspondente. Entenda-se que no âmbito das 42 combinações dos compostos desta invenção com outros agentes vantajosos no tratamento de condições mediadas pela catepsina se incluem, em principio, qualquer combinação com qualquer composto farmacêutico vantajoso no tratamento de patologias relacionadas com o funcionamento do estrogénio.

No âmbito da invenção inclui-se, portanto, o uso dos compostos reivindicados aqui em combinação com um segundo agente seleccionado de um bifosfonato orgânico; um modulador do receptor do estrogénio; um modulador do receptor do androgénio; um inibidor da H+-ATPase de osteoclastos; um inibidor da HMG-CoA redutase; um antagonista do receptor da integrina; um agente anabólico do osteoblasto, tal como, PTH; uma vitamina D; um análogo sintético da vitamina D; um fármaco anti-inflamatório não esteróide; um inibidor selectivo da ciclooxigenase-2; um inibidor da interleucina-1 beta, um inibidor de LOX/COX; um inibidor de RANKL; e os sais farmaceuticamente aceitáveis e as suas misturas.

Definições

Os compostos da presente invenção podem apresentar centros assimétricos, eixos quirais e planos quirais (como descrito em: E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, páginas 1119-1190), e ocorrem como racemates, misturas racémicas e como diastereómeros individuais, sendo incluídos nas presente invenção todos os isómeros possíveis e suas misturas, incluindo os isómeros ópticos.

Adicionalmente, os compostos aqui descritos podem existir como tautómeros e ambas as formas tautoméricas estão englobadas no âmbito da invenção, apesar de apenas se descrever uma estrutura tautomérica. Por exemplo, qualquer reivindicação do composto A abaixo deve ser entendida como incluindo a estrutura tautomérica B e vice-versa, bem como 43 as suas misturas.

A B

Quando qualquer variável (p. ex. Rl, r2, r3 etc.) ocorrer mais do que uma vez em qualquer constituinte, a sua definição em cada ocorrência é independente em cada ocorrência. Também, as combinações dos substituintes e variáveis são admissíveis se tais combinações resultarem em compostos estáveis. As linhas desenhadas até aos sistemas anelares dos substituintes indicam que a ligação indicada pode ser unida a qualquer um dos átomos de carbono substituíveis do sistema anelar. Se o sistema anelar for policíclico, pretende-se que a ligação seja a qualquer um dos átomos de carbono adequados apenas no anel proximal.

Entende-se que os substituintes e os padrões de substituição dos compostos da presente invenção podem ser seleccionados por um perito na especialidade para proporcionar compostos quimicamente estáveis e que podem ser prontamente sintetizados através de técnicas conhecidas do estado da técnica, bem como aqueles métodos apresentados abaixo, a partir de materiais prontamente disponíveis. Se um substituinte é substituído com mais de um grupo, entende-se que esses múltiplos grupos podem estar no mesmo carbono ou em carbonos diferentes, desde que resulte em estruturas estáveis. A expressão "opcionalmente substituído com um ou mais substituintes" é entendida como equivalente à expressão "opcionalmente substituído com pelo menos um substituinte" e em tais casos, a forma de realização preferida terá entre zero a três substituintes.

Tal como é utilizado aqui, "alquilo" deve incluir quer os grupos ramificados quer lineares de hidrocarbonetos alifáticos saturados com um até dez átomos de carbono, a 44 menos que especificado de outra forma. Por exemplo, C]_-CiOf como em "alquilo C1-C10" é definido para incluir qrupos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 carbonos numa disposição linear, ramificada ou ciclica. Por exemplo, "alquilo Ci-Cio " especificamente inclui metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. O termo "cicloalquilo" ou "carbociclo" significam anéis cíclicos de alcanos de três até oito átomos de carbono, a menos que indicado de outra forma, ou qualquer número dentro deste intervalo (i.e., ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ci-cloheptilo ou ciclooctilo) .

Em determinadas situações, os substituintes podem ser definidos com uma gama de carbonos que inclui zero, tais como, (Co-Cg) alquileno-arilo. Se arilo é entendido como sendo fenilo, esta definição incluiria o próprio fenilo, bem como, -CH2Ph, -CH2CH2Ph, CH (CH3) CH2CH(CH3)Ph, etc.

Tal como é usado aqui, "arilo" é entendido como um anel de carbono monocíclico ou bicíclico estável, que apresenta até 12 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático. Exemplos de tais elementos de arilo incluem fenilo, naftilo, tetrahidro- naftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antrilo ou acenaftilo. Nos casos em que o substituinte de arilo é bicíclico e um anel não é aromático, entende-se que a ligação é feita através do anel aromático. O termo "heteroarilo", tal como usado aqui, representa um anel estável monocíclico, bicíclico ou tricíclico com até 10 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático e contém entre 1 até 4 heteroátomos seleccionados de um grupo composto por 0, N e S. Dentro do âmbito desta definição, os grupos de heteroarilo incluem, entre outros: benzoimidazolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzothiofenilo, benzoxazolilo, carbazolilo, carbolinilo, cinnolinilo, 45 furanilo, indolinilo, indolilo, indolazinilo, indazolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isothiazolilo, isoxazolilo, naftpiridinilo, oxadiazolilo, oxazolilo, oxazolino, isoxazolino, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridopiridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tetrazolilo, tetrazolopiridilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, dihidrobenzoimidazolilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzothiofenilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidroindolilo, dihidroquinolinilo, metilenodioxibenzeno, benzotiazolilo, benzotienilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo e tetrahidroquinolino. Nos casos em que o substituinte de heteroarilo é bicíclico e um anel não é aromático ou não contém heteroátomos, entende-se que a ligação é feita através do anel aromático ou através do anel que contém o heteroátomo, respectivamente. Se o heteroarilo compreender átomos de azoto, entende-se que os N-óxidos correspondentes do mesmo também se encontram englobados por esta definição.

Tal como valorizado pelos peritos na especialidade, "halo" ou "halogénio", tal como usados aqui, incluem cloro, fluoro, bromo e iodo. 0 termo "cetona" significa carbonilo (C=0). A presente invenção também inclui os derivados de N-óxido e derivados protegidos dos compostos da fórmula L. Por exemplo, quando os compostos da fórmula I contêm um átomo de azoto oxidável, o átomo de azoto pode ser convertido em N-óxido por métodos bem conhecidos do estado da técnica. Igualmente, quando os compostos da fórmula I contêm grupos tais como hidroxilo, carboxilo, tiol ou qualquer grupo contendo um átomo de azoto, estes grupos podem ser protegidos com um grupo protector adequado. Uma lista completa dos grupos protectores adequados pode ser encontrada em T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc. 1981. Os derivados 46 protegidos dos compostos da fórmula I podem ser preparados por métodos bem conhecidos do estado da técnica.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem os sais não tóxicos convencionais dos compostos desta invenção como ácidos inorgânicos ou orgânicos formados. Por exemplo, os sais não tóxicos convencionais incluem derivados de ácidos inorgânicos, tais como, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico, bem como, os sais preparados de ácidos orgânicos, tais como ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutámico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico, trifluoroacético. A preparação dos sais farmaceuticamente aceitáveis descritos acima e de outros sais farmaceuticamente aceitáveis habituais encontra-se mais detalhadamente descrita por Berg et al., "Pharmaceutical Salts" ["Sais farmacêuticos"], J. Pharm. Sei., 1977:66:1-19. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção podem ser sintetizados a partir dos compostos desta invenção que contêm uma união básica ou ácida através de métodos químicos convencionais. Generalmente, os sais dos compostos básicos são preparados quer por cromatografia de intercâmbio iónico quer por reacção da base livre com quantidades estequiométricas ou com um excesso do ácido orgânico ou não orgânico formador de sal desejado num solvente adequado ou em várias combinações de solventes. Do mesmo modo, os sais dos compostos ácidos são formados por reacções com a base inorgânica ou orgânica adequada.

Para efeitos destas especificações, as abreviaturas apresentadas as seguir têm os significados indicados: i-BuCOCl = cloroformato de isobutilo 47 t-BuMe2SiCl = terc-butildimetilclorosilano BuLi = butil-lítio CH2C12 = cloreto de metileno CH3CN = cianeto de metilo Cr03 = cromato DAST = trifluoreto de dietilaminoenxofre DMF = N,N-dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido DTT = ditiotreitol EDTA = ácido etilenodiamino tetra-acético EtOH = etanol KOH = hidróxido de potássio HATU = 2-(7-Aza-lH-benzotriazola-l-il) -1,1,3,3 tetrametiluronio hexafluorofosfato HC1 = ácido clorídrico H5I06 = ácido periódico MeMgBr = MgSC>4 = brometo de metilmagnésio sulfato de magnésio Na2C03 = 20 carbonato de sódio NaCl = cloreto de sódio NH4CI = cloreto de amónio Na2BH4 = boroidreto de sódio PdCl2(dppf) = de paládio(II) [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloreto 1 PG = grupo protector rt = temperatura ambiente sat.aq. = Si02 = aquoso saturado sílica TBAF = fluoreto de tetrabutilamónio THF = tetrahidrofurano t lc = (Ts)20 = cromatografia em camada fina p-toluenosulfónico anidrido Me = metilo Et = et ilo 48

Os novos compostos da presente invenção podem ser preparados de acordo com os procedimentos gerais apresentados a seguir, usando os materiais apropriados, e são exemplificados pelos exemplos específicos apresentados a seguir. Os compostos ilustrados nos exemplos não devem, contudo, ser interpretados como o único género considerado pela invenção. Os exemplos ilustram melhor os detalhes da preparação dos compostos da presente invenção. As pessoas competentes na técnica prontamente compreendem que as variações conhecidas das condições e processos dos seguintes processos preparativos podem ser usados para preparar estes compostos. Todas as temperaturas são indicadas em graus Celsius, salvo indicação em contrário.

Como descrito no Exemplo 12 e no Esquema 1, a partir de N-t-Boc-ácido apártico-beta-benzilo-éster disponível comercialmente, o ácido livre foi activado via o método de anidrido misto (vide, Chen, F.M.F.; Lee, Y; Steinauer, R., Benoiton, N.L., Can. J. Chem. 1987,65,613-618.) para redução com boroidreto de sódio. 0 álcool foi convertido para um grupo lábil e a ciclização in situ do carbamato ocorreu após aquecimento. 0 éster foi tratado com um excesso de reagente de Grignard para produzir o álcool terciário solúvel em água. Este último foi tratado com DAST para a obtenção de um produto fluorado. A hidrólise do carbamato cíclico e a sililação do álcool resultante originou a amina primária. A imina foi formada após remoção azeotrópica dos voláteis. A monolitiação de 1,4-dibromobenzeno proporcionou um nucleófilo que reagiu com a imina para gerar a amina secundária. 0 álcool foi desprotegido e oxidado para dar lugar ao ácido. A formação padrão das amidas deu lugar ao intermediário versátil de bromo. 49 Esquema 1

N-t-Boc-ãcido apártico-beta-benzilo-éster

0 bromo obtido no Esquema 1 pode ser convertido para um éster de boronato sob condições de reacção mediada por paládio, como ilustrado no Esquema 2. Por seu turno, o éster de boronato resultante é facilmente convertido para um produto biaril após acoplamento com um brometo sob condições mediadas por paládio. 50

Esquema 2 50

OH

Alternativamente, mostramos no Esquema 3 que um brometo de aril pode ser convertido para um éster de boronato sob catálise de paládio. Sob reacção mediada por paládio, este éster de boronato pode ser acoplado com o brometo descrito no Esquema 1 para produzir um composto de biaril. 51

Esquema 3 51

EXEMPLO 1 Síntese de N^~(1-cianociclopropil) -N^-((1S)-1- {4'- [(IR)-2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2, 2-trifluoroetil)-4 -fluoro-L-leucinamida

Etapa 1: Preparação de 1-(4-bromofenil) -2,2- difluoroetanona A uma solução fria (-78°C) e agitada de 1,4-dibromobenzeno (86,4 g, 366 mmol) em tetrahidrofurano (800 mL) foi adicionado n- butil-lítio (228 mL, 1,6 M em 52 hexanos, 366 iranol). Esta mistura foi agitada a -78°C durante 30 min e depois foi adicionado etil-difluoroacetato (50 g, 402 mmol) num periodo de 2 min. Esta mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. A reacção foi submetida a têmpera com 1 N ácido cloridrico (250 mL) e deixada a aquecer até à temperatura ambiente. O meio foi diluído com éter metil-terc-butílico (250 mL) e as camadas foram separadas. O orgânico foi lavado com salmoura (100 mL) , seco (MgSC>4) e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi distilado sob vácuo para obter a difluorocetona como um sólido branco vítreo.

Etapa 2; Preparação de (IR)-1-(4-bromofenil)-2,2-difluoroetanol (Análogo a: Ramachandran, P.V. et al., Tet. Asym. 1994, Vol.5, No.6, pp.1075-86.) A cetona preparada na etapa 1 do exemplo 1 (2,35g, 10 mmol) e R-Alpine Borane comercial (3,lg, 12 mmol) foram misturados à temperatura ambiente e agitados durante quatro dias com alguma evolução de gás. Após quatro dias, a 1h NMR de uma alíquota revelou um consumo total da cetona. A reacção foi arrefecida para 0°C para a adição de acetaldeído (168 pL, 3 mmol) . 0 banho foi removido e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi adicionado éter etílico (20 mL) , seguido de etanolamina (725 pL, 12 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. O precipitado foi removido por filtração e lavado com pentano. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia flash (90% de hexanos; 10% de acetato de etilo para 70% de hexanos; 30% de acetato de etilo) para produzir o produto desejado como um óleo incolor. A pureza óptica não foi verificada neste ponto.

Etapa 3: Preparação de N^~(1-cianociclopropil)- 4-fluoro- n2- { (IS)- 2,2,2-trifluoro- 1-[4-(4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-di- oxaborolano- 2 — i1] fenil] etil}-L-leucinamida 53 ν2-[(S)-1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetil]-NÍ-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-L-leucinamida da etapa 9 do exemplo 12 (24g, 53 mmol), bis(pinacolato)diboron (15.24g, 60 mmol) e acetato de potásio (16.2g, 165 mmol) foram agitados em dioxano (240 mL) e azoto foi passado por uma pipeta durante 15 minutos. [ 1,1-Bis(difenil- fosfina)ferroceno] dicloreto de paládio(II), 1:1 complexo com dicloreto de metano (PdCl2dppf.CH2CI2, 2.4g, 3 mmol) foi adicionado e a mistura reaccional foi submersa num banho de óleo a 80°C durante 105 minutos sob atmosfera de azoto. A 1h NMR de uma alíquota mostrou um consumo total do brometo. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e a maioria do solvente foi removido sob pressão reduzida. O residuo foi dissolvido num minimo de dicloreto de metano e filtrado com gel de sílica. Foram recolhidas duas fracções e concentradas sob pressão reduzida para produzir sólidos. A fracção menos polar foi agitada à temperatura ambiente durante a noite em 90% de hexanos; 10% de mistura de éter dietílico e mais fracção polar foi agitada a 0°C durante a noite em hexanos. Ambos produziram materiais puros de sólidos brancos.

Etapa 4: Preparação de N^~(1-cianociclopropil)-n2-((1S)—1— {4'-[(IR)-2,2-difluoro- 1-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (20g, 40 mmol) e o brometo de aril da etapa 2 do exemplo 1 (11.4g, 48 mmol) foram dissolvidos em dimetilformamida (400 mL), seguido de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (60 mL, 120 mmol) . O azoto foi passado por uma pipeta durante 15 minutos. [1,1-Bis(Difenilfosfina)ferroceno] dicloreto de paládio(II), 1:1 complexo com dicloreto de metano (PdCl2dppf .CH2CI2/· 2.4g, 3 mmol) foi adicionado e a mistura reaccional foi submersa num banho de óleo a 80°C durante 16 horas sob atmosfera de azoto. A maior parte da dimetilformamida foi removida sob o evaporador rotativo a baixa pressão (45°C, aprox. 1-5 mmHg). O resíduo foi 54 dissolvido em acetato de etilo (400 mL) e filtrado em celite. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O residuo foi absorvido em aprox. 10 mL de dicloreto de metano e separado por cromatografia flash. As fracções mais puras foram desagregadas em hexanos (100 mL) a 0°C três vezes durante a noite e separadas novamente por cromatografia flash (90% de hexanos; 10% acetato de etilo para 45 de hexanos; 55% de acetato de etilo). Após evaporação dos voláteis sob pressão reduzida, o sólido foi agitado em hexanos durante 2 dias. O produto ainda continha 4% de pinacol, assim a mistura foi divida em dois. A fracção A foi dissolvida num mínimo de álcool isopropílico sob aquecimento suave. Os hexanos foram adicionados até a solução estar um pouco turva e depois foi deixada a arrefecer. Produziram-se cristais brancos e a reação foi arrefecida ainda mais até 0°C durante 15 minutos. Os sólidos foram recolhidos por filtração para obter o produto não contaminado por pinacol. A fracção B foi agitada em 20% de éter dietílico; 1% de acetato de étilo; 79% de hexanos (100 mL) durante 3 horas à temperatura ambiente. Os sólidos foram recolhidos por filtração e continham apenas aproximadamente 1% de pinacol segundo a NMR. O excesso enantiomérico foi verificado por AD-RH quiral usando 32% de acetonitrilo; 68% de água; 0.1% ácido fórmico; isocrático (24 min. para enantiómero e 27 minutos para a molécula desejada). (MH)+ ESI = 528.0. EXEMPLO 2 Síntese de N1-(1-cianoclopropil)-N2-((IS)-1- {4'- [ (IS)-2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2- trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida_trifluoroetil)-4- fluoro-L-leucinamida 55

Etapa 1: Preparaçao de (IS)-1-('4-bromofenil)- 2.2- difluoroetanol A cetona preparada na etapa 1 do exemplo 1 (2.35g, 10 mmol) e S-Alpine Borane comercial (3.1g, 12 mmol) foram misturados à temperatura ambiente e agitados durante quatro dias com alguma evolução de gás. Após quatro dias, a NMR de uma aliquota revelou a presença da matéria-prima. Foi adicionado mais S-Alpine Borane (1 mL) e foi agitado durante mais 2 dias adicionais. A NMR de uma aliquota revelou um consumo total da cetona. A reacção foi arrefecida para 0°C para a adição de acetaldeído (393 uL, 7 mmol) . O banho foi removido e a agitação à temperatura ambiente continuou durante 30 minutos. Foi adicionado éter dietílico (20 mL), seguido de etanolamina (966 uL, 16 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. O precipitado foi removido por filtração e lavado com pentano. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia flash (90% de hexanos; 10% de acetato de etilo para 70% de hexanos; 30% de acetato de etilo) para produzir o produto desejado como um óleo incolor. _Etapa 2: Preparação de N^~(1-ciangciclopropil)-N^- ( (IS)-l-{4'-[(IS)-2,2-difluoro-l-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (200 mg, 0.40 mmol) e o brometo de aril da etapa 1 do exemplo 2 (114 mg, 0.48 mmol) foram tratados como na etapa 4 do exemplo 1 para produzir um sólido branco. (MH)+ ESI = 528.0 56 EXEMPLO 3 Síntese de N^- (1-cianociclopropil)-4-fluoro-N^- { (IS) - 2,2,2-trifluoro- 1-[4(2,2,2-trifluoro- 1- hidroxietil) bifenil-4-il] etil}-L- leucinamida

A uma solução à temperatura ambiente de 4'-bromo-2,2,2-trifluoroacetofenona comercial (100 mg) em 1.9 mL de metanol foi adicionado boroidreto de sódio (15 mg). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Foi adicionada água, foi extraída com éter metil-terc-butílico (3 X 20 mL), lavada com água e salmoura. Foi seca com sulfato de magnésio e o solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto titular e foi usado como tal na próxima etapa. ifí NMR do composto titular (CDCI3) δ (ppm): 7.55(2H, d), 7.35(2H, d), 4.92-5.05 (1H, m) , 3.20(1H, s).

Etapa 2: Preparação de Nl-(l-cianociclopropil)-4-fluoro-N^-{(IS)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(2,2,2-trifluoro-1-hidroxietil)bi- fenil-4-il]etil}-L-leucinamida

Um fluxo de azoto foi passado por uma solução de DMF (4 mL), Ni-(1-cianociclopropil)-4-fluoro -N^-{(is)-2,2,2-trifluoro-1-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil]etil}-L-leucinamida descrita na etapa 3 do exemplo 1 (150 mg), 1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetanol da etapa 1 do exemplo 3 (92 mg) e 2 M Na2CC>3 (750 pL) durante 15 minutos, seguido da adição de [1, 1'-bis(difenilfosfino)- 57 ferroceno]dicloreto de paládio(II), complexo (1:1) com dicloreto de metano (12 mg). A mistura foi aquecida a 80°C durante 3 horas sob azoto. A mistura foi arrefecida para a temperatura ambiente, vertida para gelo (20 g) e saturada com bicarbonato de sódio aquoso (20 mL) e extraída com 50% de acetato de etilo em éter dietílico (3 X 50 mL) . Os extractos combinados foram lavados com salmoura e secos com sulfato de magnésio. A remoção do solvente deixou um resíduo que foi purificado por cromatografia em S1O2 usando acetato de etilo e hexanos (20 até 50%) como eluente, seguido de trituração, usando éter dietílico e hexanos para produzir o composto titular. 1H NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 8.18(1H, s), 7.60-7.70(4H, m) , 7.50-7.55 (1H, m) , 7.33(1H, d), 7.28(1H, d), 6.40(1H, bs), 4.38-4.48 (1H, m) , 3.56 (1H, t) , 2.67-2.69 (1H, m) , 1.92-2.01 (2H, m), 1.45-1.46(10H, m), 1.05-1.11 (3H, m), 0.92-0.99 (1H, m) , 0.56-0.60 (2H, m) , 0.36-0.38(2H, m) . EXEMPLO 4 Síntese de N^~(1-cianociclopropil)-4-fluoro- N^-((1S)~ 2,2,2-trifluoro-l-{4'-[(IS)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metil- propil ] bif enil-4-il} et il)-L-leucinamida e N^--(l-cianociclopropil)-4-fluoro-N^-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-{4'-[(IR)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-1-metilpropil]bifenil-4- il}etil)-L-leucinamida

58

trifluorobutano-2-ol A uma solução de 1,4-dibromobenzeno (2.5 g, 10.6 mmol) em THF (50 mL) a -78°C foi adicionado n-BuLi (6.5 mL, 10.4 mmol; 1.6 M em hexanos) e a mistura foi agitada a -78°C durante 15 min. Depois foi adicionada 4,4,4-trifluoro-2-butanona (1.3 g, 10.3 mmol). Depois de agitar durante mais 15 min., a mistura foi arrefecida com NH4CI aquoso e extraida com acetato de etilo. Purificação por cromatografia combi-flash (coluna 40 g; eluido com hexanos -acetato de etilo (10%-20%) durante 20 min.; taxa de fluxo: 35 mL/min e recolhido 18 mL/fracção), produzindo o composto titular como um líquido castanho claro. !h NMR (CD3COCD3) δ (ppm) : 7.5 (4H, m) , 4.64 (1H, s) , 1.64 (3H, s) .

Etapa 2: Preparação de N^--(P-cianociclopropil) — 4-f luoro-N^-( (IS)-2,2,2-trifluoro-1-{ 4 ' - [(lS)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metiluropil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida e N^-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N^-((IS)-2,2,2-trifluoro-1—{4'—[(IR)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida

Um fluxo de azoto foi passado pela solução de DMF (5 mL), Nl-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{(IS)-2,2,2- trifluoro-1-[4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil]etil}-L-leucinamida descrita na etapa 3 do exemplo 1 (150 mg), 2-(4-bromofenil)-4,4,4-trifluorobutano-2-ol da etapa 1 do exemplo 4 (100 mg) e 2 M Na2CC>3 (360 pL) durante 59 15 minutos, seguido da adição de [1, 1'- bis(difenilfosfino)-ferroceno]dicloreto de paládio(II), complexo (1:1) com dicloreto de metano (5 mg) . A mistura foi aquecida a 80°C durante 3 horas sob azoto. A mistura foi arrefecida para a temperatura ambiente, vertida para gelo (20 g) e saturada com bicarbonato de sódio aquoso (20 mL) e extraída com 50% de acetato de etilo em éter dietílico (3 X 50 mL). Os extractos combinados foram lavados com salmoura e secos com sulfato de magnésio. A remoção do solvente deixou um resíduo que foi purificado por cromatografia em gel de sílica, usando um sistema de bomba gradiente automatizado CombiFlash (acetato de etilo/hexano, 20:80 até 50:50 durante 25 minutos), seguido de trituração, usando éter dietílico e hexanos para produzir a mistura de dois diastereómeros.

Para a separação, uma solução de 200 pL da mistura de dois diastereómeros (concentração de 50 μ/ pL em 33% do 2-propanol e 67% de hexanos) de Nl-(1-ciyanociclopropil)-4 -fluoro-N2-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-[ 4 ' - (3,3,3-trifluoro-1-hi- droxi-l-metilpropil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida foi injectado em Chiralcel OD, 250 X 20 mm (OD00C-CK004) , usando 33% de 2-propanol em hexanos como solventes, o fluxo a 6 mL/min e a detecção a 260 nm. Após várias injecções, Ni—(1-cianociclopropil)-n2- ((lS)-l-{4'-[(lR)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida foi isolada das primeiras fracções eluídas e N^-(l-cianociclopropil-N2-((is)-1-{4'-[(IS)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida foi isolada das segundas fracções eluídas.

Primeiro diastereómero eluído: 1H NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 8.19 (1 H, s), 7.74-7.68 (6H, m), 7.57 (2H, d), 4.60 (1H, s), 4.42-4.36 (1H, m) , 3.57-3.53 (1 H, m) , 2.78-2.88 (2H, m) , 1.94-2.00 (2H, m) , 1.73 (3H, s) , 1.49-1.31 (8H, m) , 60 1.07-1.13 (1Η, m) , 1.00-0.90 (1H, m) , NH de trifluoroetilamina não foi observada. (MH)+ APCI = 573.9. A estereoquímica é preliminar.

Segundo diastereómero eluido: 1H NMR (CD3COCD3) δ (ppm) : 8.19 (1 H, s), 7.74-7.68 (6H, m) , 7.57 (2H, d), 4.60 (1H, s), 4.42-4.36 (1H, m) , 3.57-3.53 (1 H, m), 2.78-2.88 (2H, m) , 1.94-2.00 (2H, m) , 1.73 (3H, s) , 1.49-1.31 (8H, m) , 1.07-1.13 (1H, m) , 1.00-0.90 (1H, m) , NH de trifluoroetilamina não foi observada. (MH)+ APCI = 574.0. A estereoquímica é preliminar. EXEMPLO 5 Síntese de NÍ- (1-cianociclopropil)-4- fluoro-N^-((is)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(R)-(2,2,2-trifluoro-1-hidroxietil)bife- nil-4-il]etil}-L-leucinamida

Etapa 1: Preparação de (R)-2,2,2-trifluoro-1-[4- (4,4,5,5 -tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)fenil]etanol Uma suspensão de (R)-1-(4-bromofenil)-2,2,2 trifluoroetanol (2.26 g, 8.86 mmol), bis(pinacolato)diboron (2.9 g, 11 mmol) e acetato de potásio (3 g, 30 mmol) em DMF (80 mL) foi passado por azoto durante 15 minutos [1,1-bis (difenilfosfina)ferroceno] dicloreto de paládio (II), 1:1 complexo com dicloreto de metano (362 mg, 0.44 mmol) foi adicionado e passado outra vez por azoto durante 10 minutos. A mistura reaccional foi agitada a 85°C durante 2h, vertida para gelo e água e extraída com acetato de etilo (2 X 80 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução NaCl, secas (MgS04) e concentradas 61 sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (acetato de etilo/ hexano, 5:95 até 20:80 durante 25 minutos e depois 20:80 durante 5 minutos) para produzir o produto titular.

Ifí NMR (CD3COCD3) δ (ppm) : 7.8(2H, d), 7.55(2H, d), 5.9(1H, OH), 5.2-5.3(1H, m), 1.3(12H, s).

Etapa 2: Preparação de N^-(1-cianociclopropil)-4- fluoro_-N2-{ (IS ) -2,2,2-trif luoro-1- [4'-(R)-(2,2,2- trifluoro-l-hidroxie- til)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 1 do exemplo 5 (250 mg, 0.83 mmol) e N2-[(IS)-1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetil]-N^--(1-cianociclopropil)-4-fluoro-L-leucinamida (374 mg, 0.83 mmol) da etapa 9 do exemplo 12 foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para fornecer o composto titular como um pó branco. lH NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 8.1-8.2(1H, bs), 7.75- 7.8 (4H, m) , 7.7 (2H, m) , 7.6(2H, m) , 5.9(1H, m) , 5.25-5.35 (1H, m) , 4.35(1H, m) , 3.5-3.6(lH, m) , 1.9-2.1(2.H, m) , 1.2- 1.6(8H, m), 0.9-l.l(2H, m); NH não observado. (MH)+ ESI = 545.8. EXEMPLO 6 Síntese de N1-(1-cianociclopropil)-4- fluoro-N2-( (IS)- 2.2.2- trifluoro-1-{4'-[2,2,2-trifluoro-1-hidroxi-1-

Etapa 1: Preparação de 2-(4-bromofenil)-1,1,1,3,3,3 -hexafluoropropano-2-ol. A um solução de dibromobenzeno (4.7 g) a -78°C em 62 tetrahidrofurano (100 mL) foi adicionado n-butil-lítio (8 mL; 2.5 M em hexanos) e a mistura foi agitada durante 15 minutos. Um fluxo suave de hexafluoroacetona foi passado pela suspensão durante 15 minutos. A mistura foi deixada a reagir durante 1 hora. Foi vertida para gelo e diluida com cloreto de amónio e e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio e o solvente foi removido sob pressão reduzida, usando calor mínimo. 0 resíduo foi passado por SÍ02, usando 10% de acetato de etilo/90% de hexanos como eluente para produzir álcool terciário. !h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.75-7.8(4H, s), 7.65(1H, OH) .

Etapa 2: Preparação de N^-(l-cianociclopropil)-4-fluoro-N^-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-{4'-[2,2,2-trifluoro-1- hidroxi-1-(trifluorometil)_etil]bifenil-4-il}etil)-L- leucinamida

Ni-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{(IS)-2,2,2-trifluoro-l-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano-2-il) fenil]etil}-L-leucinamida descrita na etapa 3 do exemplo 1. (220 mg, 0.44 mmol) e o brometo da etapa 1 do exemplo 6 (323 mg, 1 mmol) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para fornecer o composto como uma espuma. lH NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 8.2(1H, bs), 7.85-7.95 (4H, m), 7.75-7.8(2H, d), 7.6(2H, d), 7.55(1H, OH), 4.4(1H, m), 3.55(1H, m) , 2.8-2.9(lH, m) , 1.9-2.1(2H, m) , 1.4-1.5(6H, m) , 1.3-1.4(2H, m) , 1.1(1H, m) , 0.95(1H m) . (MH)+ ESI = 614.1. EXEMPLO 7 Síntese de N^~ (1-cianociclopronil)-4-fluoro -n2-{(is)-2,2,2-trifluoro-l-[4(2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l-metiletil) bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida 63

Etapa 1: Preparação de 2-(4-bromofenil)-1,1,1- trifluoropropano-2-ol. 1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetanona comercial (lg, 4 mmol) em éter dietílico (8 mL) foi arrefecido para -78°C para a adição de brometo de metilmagnésio comercial (2.65 mL, 7.9 mmol, 3 M em éter dietílico). 0 meio reaccional turvo foi deixado até atingir a temperatura ambiente e foi agitado durante a noite. A mistura reaccional foi transferida para um funil separador, contendo 1.2 M de ácido clorídrico (20 mL) . A camada aquosa foi extraída 3 vezes com acetato de etilo (30 mL) . As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura, secas sobre sulfato de magnésio e concentradas sob pressão reduzida. O óleo claro era suficientemente puro para ser usado sem mais purificação.

Etapa 2: Preparação de NÍ-(1-cianociclopropil)-4-fluoro -n2-{(IS)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(2,2,2-trifluoro-1-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (250 mg) e o brometo da etapa 1 do exemplo 7 (150 mg) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para fornecer o composto titular como um pó branco. (MH)+ ESI = 560 EXEMPLO 8 Síntese de N^-(1-cianociclopropil)-4- fluoro-N^-((IS)-2,2,2-trifluoro-l-{4'~[1-hidroxi-l- (trifluorometil)propil]bi-fenil-4-il}etil)-L-leucinamida 6 4

trifluorobutano-2-ol. A uma solução de 1,4-dibromobenzeno (2.5 g, 10.6 mmol) em THF (50 mL) a -78°C foi adicionado n-BuLi (6.5 mL, 10 mmol; 1.6 M em hexanos) e a mistura foi agitada a -78°C durante 15 min. Depois foi adicionada 1,1,1-trifluoro-2-butanona (1.3 g, 10 mmol). Depois de agitar durante mais 15 min., a mistura foi submetida a têmpera com NH4CI aquoso e extraída com acetato de etilo. Purificação por cromatografia combi-flash (coluna 40 g; eluído com hexanos -acetato de etilo (10% - 20%) durante 20 min.; taxa de fluxo: 35 mL/min e recolhido 18 mL/fracção) , produzindo o composto titular como um líquido incolor. 1h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.58 (m, 5H), 5.52 (s, 1H), 2.28 (m, 1H), 2.10 (m, 1H).

Etapa 2: Preparação de NÍ-(1-cianociclopropil)4-fluoro -n2-((IS)-2,2,2-trifluoro-l-{4'~[1-hidroxi-l-(trifluorometil)propil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (150 mg) e o brometo da etapa 1 do exemplo 8 (100 mg) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para fornecer o composto titular como um pó branco. (MH)+ ESI = 574 EXEMPLO 9 Síntese de N1-(1-cianociclopropil) -N2-((IS)-1-{4'-[(IR)-2,2- difluoro-l-hidroxi-1- metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-tri- fluoroetil)-4- fluoro- L-leucinamida e N^--(l-cianociclopropil) -N^-((1S)-1- {4'-[(IS)-2,2-difluoro-1- 65 hidroxi-l-metil- etil]bifenil-4-il}-2, 2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida

Etapa_lj_Preparação_de_2- ( 4-Bromof enil) -1,1- difluoropropano-2-ol A uma solução de 1-(4-bromofenil)-2,2-difluoroetanona (2.5 g, 10.6 mmol) em THF (60 mL) foi adicionado cloreto de metilmagnésio (10 mL, 30 mmol; 3 M em THF) a 0°C durante um periodo de 10 min e a mistura foi agitada a 0°C durante 1 h. Um work-up pequeno mostrou que a matéria-prima permaneceu e foi adicionado mais cloreto de metilmagnésio (5 mL, 15 mmol, 3 M em THF). Após mais agitação durante 15 min., a mistura foi arrefecida com H2O, cuidadosamente acidificada com 1 M HC1 (100 mL) e extraida com acetato de etilo. Purificação por cromatografia combi-flash (coluna 120 g; eluído com hexanos - acetato de etilo (5% -25%) in 20 min.; taxa de fluxo: 70 mL/min e recolhido 25 mL/fracção), produzindo o composto titular como um liquido incolor. 1h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.54 (m, 4H), 5.86 (t, 1H), 66 5.10 (s, 1H), 1.64 (s, 3H) .

Etapa 2: Preparação de N1-(1-cianociclopropil)-N2-{(IS) -1-[4'-(2,2-difluoro-l-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]-2,2,2-trifluoroetil}-4-fluoro-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (2,5 g) e o brometo da etapa 1 do exemplo 9 (1.6 mg) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para produzir a mistura de diatereómeros como um pó branco.

Etapa 3: Separação de diastereómeros

A mistura 1:1 diastereómerica da etapa 2 do exemplo 9 (80 mg) foi dissolvida em etanol (2 mL) . A mistura dos compostos foi resolvida em ~ 10 injecções (10 x 200 pL) com uma coluna semi-preparativa Chiralcel OD (2 cm I.D. x 25 cm), eluida com 32.5% 2-propanol em hexanos e uma taxa de fluxo de 6 mL/min. As fracções rápidas eluiram a 21-23 min, foram reunidas e concentradas para produzir n1-(Ιοί anociclopropil)-N^-((lS)-l-{4'-[(IR)-2,2-difluoro-l-hidroxi-l-metiletil ] bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida como um pó branco (98% d.e.). A estereoquimica é preliminar. (MH)+ ESI = 542

As fracções lentas eluiram a -25 min, foram reunidas e concentrada para produzir N^-(1-cianociclopropil)-n2-((is)-1-{4'-[(IS)-2,2-difluoro-l-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida como um pó branco (98% d.e.). A estereoquimica é preliminar. (MH)+ ESI = 542 EXEMPLO 10 Síntese de N^-(1-cianociclopropil)-N^-((is)- l-{4'~ [(IS)-2,2-difluoro-l-hidroxi-l-(hidroximetil)etiljbifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida 67

Etapa 1: Preparação de l-Bromo-4-[1-(difluorometil) vinil]benzeno A pó de zinco activado (13.3 g, 0.2 mol) em um frasco de 1 L foi adicionado THF (200 mL) . Diiodometano (8.9 mL, 110 mmol) foi gotejado durante 10 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. A mistura foi arrefecida em banho de gelo-acetona, uma solução de tetracloreto de estanho 1M em CH2CI2 (22.1 mL, 22.1 mmol) foi adicionada durante 15 min (ponta da agulha inserida dentro da mistura). A mistura foi agitada durante 15 min e o banho de refrigeração foi removido. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. Depois de arrefecer numa solução de gelo-acetona, a solução de 1-(4-bromofenil)-2,2- difluoroetanona (5.2 g, 22.12 mmol) em THF (30 mL) foi gotejada durante 10 min. O banho de refrigeração foi removido e a mistura foi agitado à temperatura ambiente durante 30 min. A mistura foi depois adicionada às porções a uma mistura de bicarbonato de sódio (300 mL, 300 mmol) e hexanos (300 mL) a 0°C. Depois de agitada durante 15 min, a mistura foi filtrada através de celite. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca (Na2SC>4) e concentrada. Cromatografia sobre gel de silica e eluição com hexanos: acetato de etilo (20:1) produziu o composto titular como um liquido amarelo pálido. 1h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.60 (d, 2H), 7.50 (d, 2H), 6.70 (t, 1H), 5.92 (s, 1H), 5.80 (s, 1H) . 68

Etapa 2: Preparação de (2S)-2-(4-bromofenil)-3,3- difluoropropano-1,2-diol A um frasco de 250 mL com AD-mix-alfa comercial (7 g) foi adicionado álcool terc-butilico (25 mL) e H2O (25 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente para produziu 2 fases claras e a fase baixa apareceu laranja-amarelada.

Após arrefecer para 0°C, foi adicionado de uma só vez 1-bromo-4-[1-(difluorometil) vinil]benzeno (1.1 g, 4.7 mmol) e a mistura foi agitada a aproximadamente 4°C durante a noite. Produziu-se uma mistura amarelo clara. A mistura foi mantida a 0°C e foi adicionado sulfito de sódio sólido (8 g, 64 mmol). A mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 30 min. Foi adicionado acetato de etilo (50 mL) e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo. (2 x 10 mL). Os extractos de acetato de etilo combinados foram secos (Na2S04) e concentrados. Purificação por combi-flash (coluna de 40 g; eluído com hexanos -acetato de etilo (20% -60%) durante 25 min.; taxa de fluxo: 35 mL/min e recolhido 18 mL/fracção), produzindo o composto titular com um óleo incolor. 1h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.56 (s, 4H), 6.14 (t, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.40 (t, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.80 (m, 1H).

Etapa 3: Preparação de of N^~(1-cianociclopropil)- N^- ( (IS)_-l-{4'~ [ (IS) - 2,2-difluoro_-1-hidroxi-l- (hidroximetil) etil]bi- fenil-4-il}- 2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (900 mg) e o brometo da etapa 2 do exemplo 10 (450 mg) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para fornecer o composto titular como um pó branco.

Um derivado de éster mono-fosfonato (Yves Leblanc, et. al. Tetrahedron Asymmetry 2001, 12, 3063-3066) foi preparado para medição óptica da pureza (94% d.e.; 69

Chiralpak AD, 40% 2-propanol em hexanos, taxa de fluxo 1 mL/min; tempo de retenção 7.4 min). !h NMR (CD3COCD3) δ (ppm) : 8.15 (s, 1H) , 7.70 (m, 6H) 7.55 (d, 2H), 6.20 (t, 1H), 4.92 (s, 1H) , 4.35 (m, 2H) 4.08 (m, 1H) , 3.85 (m, 1H) , 3.52 (m, 1H) , 1.98 (m, 2H) 1.50 - 1.28 (m, 8H), 1.05 (m, 1H), 0.90 (m, 1H) . EXEMPLO 11 Síntese de N^-(1-cianociclopropil) _n2_ ( dS) -1- {4'

Etapa 1: Preparação de (2R)-2-(4-bromofenil)-3,3 difluoropropano-1,2-diol A um frasco de 250 mL com AD-mix-beta comercial (7 g) foi adicionado t-BuOH (25 mL) e H2O (25 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente para produzir 2 fases claras e a fase baixa apareceu laranja-amarelada. Após arrefecer para 0°C, foi adicionado de uma só vez l-bromo-4-[1-(difluorometil)vinil) benzeno (1.1 g, 4.7 mmol) e a mistura foi agitada a aproximadamente 4 °C durante a noite. Produziu-se uma mistura amarelo clara. A mistura foi mantida a 0°C e foi adicionado sulfito de sódio sólido (8 g, 64 mmol). A mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 30 min. Foi adicionado acetato de etilo (50 mL) e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 x 10 mL). Os extractos de acetato de etilo combinados foram secos (Na2S04) e concentrados. Purificação por Flash combinado (coluna de 40 [(IR)-2,2-difluoro-l-hidroxi-1-(hidroximetil)etiljbifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida

70 g; eluído com hexanos -acetato de etilo (20% -60%) durante 25 min.; taxa de fluxo: 35 mL/min e recolhido 18 mL/fracção) produzindo o composto titular como um óleo incolor. 1h NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 7.56 (s, 4H), 6.14 (t, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.40 (t, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.80 (m, 1H).

Etapa 2: Preparação de N^~(1-cianociclopropil)-n2-( (IS)-l-{4'-[(IR)-2,2-difluoro-l-hidroxi-1- (hidroximetil)etil]bi- fenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil) -4-fluoro- L-leucinamida O éster de boronato da etapa 3 do exemplo 1 (1,5 g) e o brometo da etapa 1 do exemplo 11 (740 mg) foram acoplados como na etapa 4 do exemplo 1 para produzir o composto titular como um pó branco.

Um derivado de éster mono-fosfonato (Yves Leblanc, et. al. Tetrahedron Asymmetry 2001, 12 3063-3066) foi preparado para medição óptica da pureza (94% d.e.; Chiralpak AD, 40% 2-propanol em hexanos, taxa de fluxo 1 mL/min, tempo de retenção 11.1 min). 1H NMR (CD3COCD3) δ (ppm): 8.15 (s, 1H) , 7.70 (m, 6H) , 7.55 (d, 2H) , 6.20 (t, r 1H) , 4.92 (s, 1H), 4.35 (m, 2H) , 4.08 (m, 1H) , 3.85 (m, 1H) , 3.52 (m, 1H), 1.98 (m, 2H) , 1.50- 1.28 (m, 8H) , 1.05 (m, 1H), 0 .90 (m, 1H) . EXEMPLO Referência 12 Síntese_de n2- [ (1S)-1- (4-bromof enil) 2, 2,2, trifluoroetil]-Ni-(1-cianociclopropil)- 4-fluoro- L-leucinamida

butoxicarboxi)amino]-4-hidroxibutanoato 71 Ν-(terc-butoxicarbonil)-L-ácido aspártico 4-benzil éster (30 g) foi dissolvido em dimetoxietano (90 mL) e a solução foi arrefecida para -5°C. N-metilmorfolina (10.32 mL) foi adicionada, seguido de uma adição lenta de isobutil cloroformato (12.66 mL) , de modo manter a temperatura de reacção abaixo de -10°C. A mistura foi deixada durante 0.5 hora. Os sólidos foram rapidamente filtrados e lavados com dimetoxietano (90 mL). O filtrado foi arrefecido para -50°C e uma solução de boroidreto de sódio (4.4 g) em água (45 mL) foi adicionado lentamente, de modo a manter a temperatura de reacção entre -30°C e -15°C. Depois foi adicionada água (500 mL) de modo a manter a temperatura da mistura reaccional abaixo de -15°C. A suspensão foi filtrada, o sólido foi lavado com água (400 mL) e seco para produzir benzilo (3S)-3-[ (terc-butoxicarbonil)amino]-4-hidroxibutanoato. !h NMR (CD3COCD3) δ 7.3-7.45 (5H, m) , 5.85-5.95 (1H, NH), 5.15 (2H, s), 3.95-4.1 (2H, m) , 3.5-3.7 (2H, m), 2.55-2.75 (2H, m), 1.4 (9H, s).

Etapa 2: Preparação de benzilo [ (4S)-2-oxo-l,3 oxazolidina -4-il]acetato A uma solução de álcool (95.7 g) da etapa 1 em dicloroetano (925 mL) foi adicionada piridina (625 mL) e a mistura foi arrefecida para 0-5°C. Foi adicionado anidrido p-toluenossulfónico (anidrido (105.7 g) e a mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 1 hora e depois aquecida até 90°C durante 2 horas. A mistura foi arrefecida, diluída com diclorometano (1000 mL) e lavada com IN HC1 (3 X 600 mL) . A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio e os solventes foram removidos em vácuo. Os resíduos foram purificados por cromatografia em S1O2 usando acetato de etilo e hexanos em uma razão de 1:1 seguido de acetato de etilo para produzir benzil [(4S)-2-oxo-l,3-oxazolidina-4- 72 il] acetato. 1H NMR (CD3SOCD3) δ 7.8 (1H, NH) , 7.3-7.45 (5H, m) , 5.05-5.15 (2H, m) , 4.4-4.5 (1H, m) , 4.1-4.2 (1H, m) , 4.0- 4.05 (1H, m) , 3.6-3.8 (2H, m).

Etapa_3j_Preparação_de_(4S)-4-(2-hidroxi-2- metilpropil)-1,3-oxazolidina-2-ona

Foi adicionado brometo de etilmagnésio (227 mL de solução 3M em éter dietilico) à mistura de tolueno (340 mL) e THF (340 mL) a -20°C. Uma solução de THF (170 mL) do éster da etapa 2 (40 g) foi adicionada às gotas, mantendo a temperatura abaixo de -10°C. A mistura foi deixada durante 2 horas e foi depois adicionada lentamente a uma mistura de água (1000 mL) e ácido acético (200 mL) e a mistura resultante foi agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. A camada aquosa foi separada e a camada orgânica foi extraída com água (2 X 200 mL). O produto foi extraído das camadas aquosas combinadas usando diclorometano e um extractor contínuo. O extracto de diclorometano foi evaporado até secar, usando heptano como um co-solvente para azeótropo ácido acético. O resíduo foi purificado por cromatografia em SiC>2, usando etanol e diclorometano (1:30) para produzir (4S)-4-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1,3-ox-azolidina-2-ona. lH NMR (CD3COCD3) δ 6.1-6.4 (1H, NH) , 4.45-4.55 (1H, m) , 4.1-4.2 (1H, m) , 3.95-4.05 (1H, m) , 3.7 (1H, s), 1.65- 1.85 (2H, m), 1.25 (6H, m).

Etapa 4: Preparação de (4S)-4-(2-fluoro-2-metilpropil) -1,3-oxazolidina-2-ona

Uma solução de diclorometano (100 mL) de álcool (47.8 g) da etapa 3 foi adicionada a uma solução de (diet ilamino) trif luoreto de enxofre (48.5 g) a -70 °C em diclorometano (500 mL). A mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 1 hora. A mistura foi depois cuidadosamente adicionada a uma mistura a 0°C de NaHCC>3 aquoso saturado (800 mL) . A camada orgânica foi 73 separada e lavada com NaHCC>3 aquoso saturado. 0 aquoso foi extraído com diclorometano (100 mL) e as camadas combinadas de diclorometano foram secas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatograf ia em SiC>2 usando acetato de etilo e hexanos (1:5) seguidos de acetato de etilo para produzir (4S)—4—(2— fluoro-2-metilpropil)-1,3-oxazolidina- 2-ona. !h NMR (CD3SOCD3) δ 7.6 (1H, NH), 4.4-4.5 (1H, m) , 3.95-4.05 (1H, m) , 3.9-3.95 (1H, m) , 1.8-1.95 (2H, m) , 1.25-1.4 (6H, 2s) .

Etapa 5: Preparação de (2S)-2-amino-4-fluoro-4 metilpentano-l-ol A uma solução de derivados de fluoro (21.0 g) da etapa 4 em 90% de álcool etílico aquoso (216 mL) foi adicionado hidróxido de potássio (21.9 g). A mistura foi aquecida sob refluxo durante 4 horas e arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura foi depois concentrada e co-evaporada com tolueno (3 X 300 mL) . O resíduo foi dissolvido em diclorometano (500 mL) e agitado durante 0.5 hora. A suspensão foi filtrada através de celite e a celite foi lavada com diclorometano (3 X 100 mL) . O filtrado foi concentrado para secar para produzir (2S)-2-amino-4-fluoro-4-metilpentano-l-ol. lH NMR (CD3OD) δ 3.4-3.5 (1H, m) , 3.2-3.3 (1H, m) , 3.0-3.1 (1H, m) , 1.5-1.7 (2H, m) , 1.35 (3H, s), 1.3 (3H, s) .

Etapa_6j_Preparação_de_(2S)-l-{ [terc-butil (dimetil)silil] oxi}4-fluoro-4-metilpentano-2-amina O amino-álcool (21.0 g) da etapa 5 foi dissolvido em diclorometano (300 mL) e a solução foi arrefecida para 0°C. 4-(Dimetilamino)piridina (0.051 g) e terc-

butildinetilsililchloreto (21 g) foram adicionados, seguidos de trietilamina (25 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reaccional foi lentamente vertida para cloreto de amónio aquoso a 0°C 74 e extraída com diclorometano (3 X 300 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio e os solventes foram removidos em vácuo para produzir (2S) — 1— {[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-4-fluoro-4- metilpentano- 2- amina. !h NMR (CD3OD) δ 3.6-3.65 (1H, m) , 3.4-3.5 (1H, m) , 3.1-3.2 (1H, m) , 1.6-1.8 (2H, m) , 1.35-1.45 (6H, m) , 0.93 (9H, s), 0.1 (6H, s) .

Etapa 7: Preparação de (2S)-1-{[terc-butil (dimetil) silil ]_oxi } - 4-f luoro-4-metil-_N- [ (1E)-2,2,2- trifluoroetilidenelpentano-2-amina A uma solução de amina (31.5 g) da etapa 6 em benzeno (126 mL) foi adicionado trifluoroacetaldeído metil hemiacetal (21.6 mL. ) . A solução foi aquecida sob refluxo durante a noite, usando um aparelho Dean-Stark para recolher água. A mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada até secura. O resíduo foi purificado em SÍO2 usando 4% do acetato de etilo em hexanos para produzir (2S)-1-{[terc- butil (dimetil)silil]oxi}-4-fluoro-4-metilpentano-2-amina. 1h NMR (CD3COCD3) δ 7.9-7.95 (1H, m) , 3.75-3.85 (1H, m), 3.7-3.75 (1H, m) , 3.53-3.6 (1H, m) , 1.9-2.0 (2H, m) , 1.3-1.4 (6H, m), 0.9 (9H, s), 0.1 (3H, s), 0.05 (3H, s).

Etapa 8: Preparação de (2S)-2-{[(IS)-1-(4-bromofenil) -2,2,2- trifluoroetil]amino} -4-fluoro-4-metilpentano-l-ol A um solução de 1,4-dibromobenzeno (0.26 g) a -75°C em THF (4 mL) foi adicionado n-BuLi (0,42 mL de uma solução de hexanos 2.5M) e a mistura foi deixada durante 20 minutos. A imina (0.329 g) da etapa 7 em THF (2 mL) foi adicionada e a mistura foi deixada durante 2 horas. A mistura foi depois adicionada a uma mistura de água (50 mL) , NH4CI (1 g) e gelo picado. Foi extraída com acetato de etilo (2 X 25 mL) e as camadas combinadas de acetato de etilo foram secas e evaporadas até secura. 75 0 mesmo procedimento foi repetido a uma escala maior, usando 1,4-dibromobenzeno (1.2 g), n-BuLi (1.84 mL) e a imina (1.38 g) e a mistura reaccional foram tratadas como descrito acima. Os resíduos combinados de ambas as preparações foram dissolvidos em THF (10 mL) e arrefecidos para 0°C. n-Fluoreto de tetrabutilamónio (6 mL de uma solução 1M THF) foi adicionado e a mistura foi agitada a + 5°C durante 16 h. A mistura foi adicionada a uma mistura de água (50 mL), cloreto de amónio (1 g) e gelo picado e a camada orgânica foi separada. A aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 X 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram secas e concentradas. O resíduo foi purificado em Si02 usando acetato de etilo e hexanos (1:5) para produzir (2S)-2-{ [(IS)-1-(4-bromofenil)- 2,2,2- trifluoroetil] amino}-4-fluoro-4-metilpentano-l-ol. !h NMR (CD3COCD3) δ 7.65 (2H, m), 7.5 (2H, m), 4.5-4.6 (1H, m) , 3.8 (1H, m) , 3.6 (1H, m) , 3.3-3.4 (1H, m) , 2.85-2.0 (1H, m) , 2.55 (1H, m) , 1.7-1.9 (2H, s), 1.3-1.4 (6H, m) .

Etapa 9: Preparação de N2((lS)-l-(4-bromofenil)- 2,2,2-trifluoroetil]-N^~(1-cianociclopropil)- 4-fluoro- L-leucinamida

Uma suspensão de H5IO6 /Cr03 (66 mL of 0.44 M in CH3CN; Nota) foi arrefecida para 0°C e uma solução de álcool da etapa 8 (1.55 g) em CH3CN (5 mL) foi adicionada às gotas. A mistura foi agitada a 0-5°C durante 3.5 horas. Foi vertida para Na2HPC>4 (200 mL) com pH 4 sob agitação vigorosa e a mistura foi extraída com éter dietílico (3 X 50 mL) . Os extractos combinados de éter foram lavados com água e salmoura (1:1), seguido de NaHS03 diluído aquoso e salmoura. A mistura foi seca com sulfato de sódio, filtrada e os solvente foram evaporados até secura para produzir N-[(1S)-1-(4- bromofenil)-2,2,2- trifluoroetil]-4-fluoro-L-leucina que foi usada como tal na etapa seguinte. 76

Nota. 0 comburente (H5l0g/Cr03) foi preparado como descrito em Tetrahedron Letters 39 (1998) 5323-5326, mas usando qualidade CH3CN (contém 0.5% água); não foi adicionada água.

Diisopropiletilamina (4.2 mL) foi adicionada a uma suspensão a 0°C do ácido (1.5 g) anterior, 1-amino-l-ciclopropanocarbonitrilo hidrocloreto (1.18 g) , O-(7-azabenzotriazol-l-il)-N, N, Ν', N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (1.94 g) e dimetilformamida (5 mL) e a mistura foram reagidos à temperatura ambiente durante 48 h. Foi depois vertido para gelo e cloreto de amónio aquoso diluído. A mistura foi extraída com acetato de etilo e éter (1:1) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com Na2HP04 diluído com pH 3 e salmoura. Os solventes foram evaporados até secura e o resíduo foi purificado por cromatografia em S1O2 usando acetato de etilo e hexanos (1:2) para produzir n2-[ (IS)-1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetil]-N^-- (1-cianociclopropil)-4-fluoro-L-leucinamida num estado de pureza suficiente para a próxima etapa. 1H NMR (CD3COCD3) δ 8.15 (1H, NH) , 7.6 (2H, m) , 7.45 (2H, m) , 4.35-4.45 (1H, m), 3.45-3.55 (1H, m), 1.9-2.1 (2H, 25 m) , 1.75-1.85 (1H, NH), 1.35-1.55 (8H, m) , 1.1-1.15 (1H, m), 0.95-1.05 (1H, m).

Composição farmacêutica

Em uma forma de realização específica desta invenção, 100 mg de (IR,2R)-N-(cianometil)-5,5-difluoro-2-[4'-(metittio)- 1,1'-bifenil-2-il] ciclohexanocarboxamida são formulados com lactose finamente dividida para proporcionar uma quantidade total de 580 até 590 mg para encher uma cápsula de gelatina dura de tamanho 0.

Os compostos descritos na presente aplicação revelaram actividade nos ensaios apresentados a seguir. Adicionalmente, os compostos descritos na presente aplicação apresentam um perfil farmacológico melhorado em 77 relação a compostos previamente descritos.

Ensaio à catepsina K

Diluições em série (1/3) de 500 μΜ para 0,0085 μΜ dos compostos de ensaio foram preparados em dimetil sulfóxido (DMSO). Depois, 2 pL de DMSO de cada diluição foram adicionados a 50 pL da solução-tampão de ensaio (MES, 50 mM (pH 5,5); EDTA, 2,5 mM; DTT, 2,5 mM e 10% DMSO) e 25 pL de catepsina K humana (0,4 nM) em solução-tampão de ensaio. As soluções de ensaio foram misturadas durante 5-10 segundos num prato misturador e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Z-Leu-Arg- AMC (8 μΜ) em 25 pL da solução-tampão de ensaio foi adicionada às soluções de ensaio. A hidrólise do grupo de saída de cumarina (AMC) foi seguida de espectrofluorimetria (Εχλ =355 nm; EmX = 460 nm) durante 10 minutos. A percentagem da inibição foi calculada, colocando valores experimentais aos modelos matemáticos padrão para obter a curva dose-resposta.

Ensaio à catepsina L

Diluições em série (1/3) de 500 pM para 0,0085 μΜ dos compostos de ensaio foram preparados em dimetil sulfóxido (DMSO). Depois, 2 pL de DMSO de cada diluição foram adicionados a 50 pL da solução-tampão de ensaio (MES, 50 mM (pH 5,5); EDTA, 2,5 mM; DTT, 2,5 mM e 10% DMSO) e 25 pL de catepsina L humana (0.5 nM) em solução-tampão de ensaio. As soluções de ensaio foram misturadas durante 5-10 segundos num prato misturador e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Z-Leu-Arg- AMC (8 pM) em 25 pL da solução-tampão de ensaio foi adicionada às soluções de ensaio. A hidrólise do grupo de saída de cumarina (AMC) foi seguida de espectrofluorimetria (Εχλ =355 nm; EmÀ = 460 nm) durante 10 minutos. A percentagem da inibição foi calculada, colocando valores experimentais aos modelos matemáticos padrão para obter a curva dose-resposta.

Ensaio à catepsina B

Diluições em série (1/3) de 500 pM para 0,0085 pM dos 78 compostos de ensaio foram preparados em dimetil sulfóxido (DMSO). Depois, 2 pL de DMSO de cada diluição foram adicionados a 50 pL da solução-tampão de ensaio (MES, 50 mM (pH 5,5); EDTA, 2,5 mM; DTT, 2,5 pM e 10% DMSO) e 25 pL de catepsina B humana (4,0 nM) em solução-tampão de ensaio. As soluções de ensaio foram misturadas durante 5-10 segundos num prato misturador e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Z-Leu-Arg- AMC (8 pM) em 25 pL da solução-tampão de ensaio foi adicionada às soluções de ensaio. A hidrólise do grupo de saída de cumarina (AMC) foi seguida de espectrofluorimetria (Εχλ =355 nm; EmX = 460 nm) durante 10 minutos. A percentagem da inibição foi calculada, colocando valores experimentais aos modelos matemáticos padrão para obter a curva dose-resposta.

Ensaio à catepsina S

Diluições em série (1/3) de 500 pM para 0.0085 pM dos compostos de ensaio foram preparados em dimetil sulfóxido (DMSO). Depois, 2 pL de DMSO de cada diluição foram adicionados a 50 pL da solução-tampão de ensaio (MES, 50 pM (pH 5.5); EDTA, 2.5 mM; DTT, 2.5 mM e 10% DMSO) e 25 pL de catepsina S humana (20 nM) em solução-tampão de ensaio. As soluções de ensaio foram misturadas durante 5-10 segundos num prato misturador e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Z-Leu-Arg- AMC (8 pM) em 25 pL da solução-tampão de ensaio foi adicionada às soluções de ensaio. A hidrólise do grupo de saída de cumarina (AMC) foi seguida de espectrofluorimetria (Εχλ =355 nm; EmX = 460 nm) durante 10 minutos. A percentagem da inibição foi calculada, colocando valores experimentais aos modelos matemáticos padrão para obter a curva dose-resposta.

Farmacocinética em ratos

Per Os (PO) farmacocinética em ratos PROCEDIMENTO:

Os animais são mantidos, alimentados e cuidados em 79 conformidade com os regulamentos do Conselho Canadiano de Tratamento Animal (Canadian Council on Animal Care) .

Ratos Sprague Dawley machos (250-400 g) foram mantidos a jejum durante a noite na véspera de cada exame aos níveis sanguíneos PO.

Os ratos são colocados, um de cada vez, no limitador e a caixa é firmemente fixada. A amostra de sangue zero é obtida por corte de um pedaço pegueno (1 mm ou menos) da ponta da cauda. A cauda é depois manipulada com um movimento firme mas gentil desde o topo até à base para retirar o sangue. Aproximadamente 0,5 mL do sangue foi recolhido para um tubo heparinizado sob vácuo.

Os compostos são preparados como requerido, num volume de dosagem padrão de 10 mL/kg e administrados oralmente, passando uma seringa de gavagem 3" (16 gauge) para o esófago.

As recolhas subsequentes de sangue são feitas da mesma forma como para a amostra de sangue zero, excepto que não é necessário voltar a cortar a ponta da cauda. A cauda é limpa com uma gaze e manipulada como descrito acima para recolher o sangue para os tubos adequadamente rotulados.

Imediatamente após a recolha das amostras, o sangue é centrifugado, separado, o plasma é colocado em frascos claramente marcados e armazenados num congelador até serem analisados.

Os pontos no tempo para a determinação dos níveis sanguíneos dos ratos PO são: 0,15min, 30min, lh, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h Após o ponto de tempo de 4 horas é fornecido alimento aos ratos ad libitum. Por vezes, também é fornecida água durante o estudo.

Veículos:

Os seguintes veículos (com os volumes de dose correspondentes) podem ser usados nas determinações do nível sanguíneo dos ratos PO: 80 PEG 200/300/400 (0-60% em água): igual ou menos do que 10 mL/kg

Methocel (0.5% - 1.0% em água) : igual ou menos do que lOmL/kg

Tween 80 (1-10% em água): igual ou menos do que lOmL/kg

Compostos para níveis sanguíneos PO podem ser em forma de suspensão. Para uma melhor homogeneidade, a suspensão pode ser colocada num sonicador durante aproximadamente 5 minutos.

Para análise, são diluídas alíquotas com 1.2 até 1.5 volumes de acetonitrila, opcionalmente contendo um padrão interno e centrifugadas, para remover a proteína precipitada. O supernadante é directamente injectado para uma coluna C-18 HPLC com espectrometria de massa (MS) ou absorvância ultra-violeta (UV) ou detecção de fluorescência (Fluo). A quantização é realizada em relação a uma curva padrão preparada com amostras de sangue limpas com adição de uma quantidade conhecida do fármaco em acetonitrila opcionalmente contendo um padrão interno. Acetonitrila adicional, opcionalmente contendo um padrão interno, é usada para ascender a 1.2 até 1.5 volumes da quantidade inicial de sangue para corresponder ao que foi feito no caso das amostras. A biodisponibilidade (F) é avaliada para comparar a área sob a curva (AUC) i.v. versus p.o. F = AUCpo x DOSEiv x 100% AUCiv DOSEpo e AUC = (Cl+C2)*(T2-Tl)/2

onde C é a concentração medida por MS ou UV ou Fluo num determinado ponto de tempo T

Farmacocinética intravenosa (IV) em ratos PROCEDIMENTO:

Os animais são mantidos, alimentados e cuidados em 81 conformidade com os regulamentos do Conselho Canadiano de Tratamento Animal (Canadian Council on Animal Care).

Neste estudo são utilizados ratos Sprague Dawley machos (325-375 g) em jejum. 0 composto é preparado como requerido, num volume de dosagem padrão de 1 mL /kg. A dosagem aos ratos conscientes para a administração intravenosa é realizada via veia jugular usando uma seringa de 25 gauge. Este constitui o ponto zero no tempo. 0 sangramento de 5 min é realizado através do corte da ponta da cauda (1-2 mm). A cauda é depois manipulada com um movimento firme mas gentil desde o topo até à base da cauda para recolher o sangue da cauda. Aproximadamente 0.5 mL do sangue foi recolhido para um tubo heparinizado

As recolhas subsequentes de sangue são feitas da mesma forma, excepto que não é necessário voltar a cortar a ponta da cauda. A cauda é limpa com uma gaze e manipulada como descrito acima para recolher o sangue para os tubos adequadamente rotulados.

Os pontos no tempo habituais para a determinação dos níveis sanguíneos dos ratos IV são: 0, 5 min, 15min, 30min, lh, 2h, 4h, 6h ou 0, 5 min, 30min, lh, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h Veículos:

Os seguintes veículos podem ser usados nas determinações do nível sanguíneo dos ratos IV:

Dextrose: 1 mL /kg Moleculosol 25%: 1 mL / 1 kg DMSO (dimetilsulfóxido): Restringido a 10% da dose até 0.1 mL por quilograma do animal PEG 200 : Não mais de 80% misturado com 20% de água estéril - lmL/kg

Com dextrose, pode ser adicionado bicarbonato de sódio se a solução estiver turva. 82

Para análise, são diluídos alíquotas com 1.2 até 1.5 volumes de acetonitrila, opcionalmente contendo um padrão interno e centrifugadas, para remover a proteína precipitada. 0 supernadante é injectado directamente para uma coluna C-18 HPLC com espectrometria de massa (MS) ou absorvância ultra-violeta (UV) ou detecção de fluorescência (Fluo) . A quantização é realizada em relação a uma curva padrão preparada com amostras de sangue limpas com adição de uma quantidade conhecida do fármaco em acetonitrila opcionalmente contendo um padrão interno. Acetonitrila adicional, opcionalmente contendo um padrão interno, é usada para ascender a 1.2 até 1.5 volumes da quantidade inicial de sangue para corresponder ao que foi feito no caso das amostras. A biodisponibilidade (F) é avaliada para comparar a área sob a curva (AUC) i.v. versus p.o. F = AUCpo x DOSEiv x 100% AUCiv DOSEpo e AUC = (C1+C2)*(T2-T 1 )/2 onde C é a concentração medida por MS ou UV ou Fluo num determinado ponto de tempo T. 83

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição

• CA • US • WO • US • US • US • US • US • BE • US • US • US • WO • WO • US • WO • US • US • US • US • US • US • US • US • US • US 2439415, Prasit [0002] 20030232863 A, Bayly [0002] 2004058238 A [0035] 4922007 A, Kieczykowski [0053] 5019651 A, Kieczykowski [0053] 5510517 A, Dauer [0053] 5648491 A, Dauer [0053] 4970335 A, Isomura [0053] 672205 [0053] 4927814 A [0053] 4761406 A [0053] 4876248 A, Breliere [0053] 0182923 A [0059] 0241835 A [0059] 4231938 A [0062] [0063] 8402131 A [0062] 4294926 A [0063] 4319039 A [0063] 4444784 A [0063] 4820850 A [0063] 4916239 A [0063] 4346227 A [0063] 4537859 A [0063] 4410629 A [0063] 5030447 A [0063] 5180589 A [0063] 84 us 5354772 A [0063] us 4911165 A [0063] us 4929437 A [0063] us 5189164 A [0063] us 5118853 A [0063] us 5290946 A [0063] us 5356896 A [0063] us 5273995 A [0063] us 4681893 A [0063] us 5489691 A [0063] us 5342952 A [0063] us 5177080 A [0063] us 4782084 A [0063] us 4885314 A [0063]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula:

N o R2 r1 HO em que R1 e R2 são tomados em conjunto com o átomo de carbono, ao qual estão ligados, para formar ciclopropilo, que é opcionalmente substituído com alquilo C1-3; R1 representa alquilo Ci-6, que é substituído com um até quatro fluoros ou um até quatro cloros; R2 representa alquilo Cq-6, que é substituído com um até cinco halogéneos; R3 representa hidrogénio ou alquilo Cq-6, que é opcionalmente substituído com um até cinco halogéneos; cada D representa fenilo; R4 representa hidrogénio ou alquilo Cq-6, que é opcionalmente substituído por um até dois hidroxilos ou dois até seis halogéneos; R7 representa Ci~6, que é opcionalmente substituído com dois até cinco halogéneos; n representa dois; ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. 2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 representa hidrogénio e R2 representa CF3; ou um sal, um estereoisómero ou um derivado N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. 1 0 composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em 2 que R7 representa alquilo C1-3 substituído por dois ou três 3 fluoros; ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N- 4 óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. 2 4. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, que é: N1-(1-cianociclopropil)-N2-(1-{4'-[2, 2-difluoro-1-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{ 2,2,2-trifluoro-1-]4'-(2,2,2-trifluoro-1-hidroxietil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-(2,2,2-trifluoro-1-{4'-[3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-(2,2,2-trifluoro-1-{4'-[2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l-trifluorometil)etil]bi-fenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-[2,2,2-trifluoro-1-[ 4' -(2,2,2-trifluoro-1-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-(2,2,2-trifluoro-1-{4'-[1-hidroxi-l-(trifluorometil)propil]bifenil-4-il}etil)-L- leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-(1-{4'-[2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil ]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L- leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-(1-{4'-[2,2-difluoro-l-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; ou um sal, estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. 5. 0 composto de acordo com a reivindicação 4, que é: N1-(1-cianociclopropil)-N2-((lS)-l-{4'-[(IR)-2,2-difluoro-1-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((IS) - l-{4'-[(IS)-2,2-difluoro-1-hidroxietil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; 3 Ν1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{ (IS)-2,2,2-trifluoro- l-[4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxietil)bifenil-4-il]etil}-L- leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((IS)-2,2,2-trifluoro-1-{4 '- [ (IS)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((IS) - 2,2,2-trifluoro-1-{4'-[(IR)-3,3,3-trifluoro-l-hidroxi-l-metilpropil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2 -{ (lS)-2,2,2-trifluoro-1-[4' -(R)-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxietil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-((IS) - 2,2,2-trifluoro-1-{4 ' -[2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l- (trifluorometil)etil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluoro-N2-{(IS)-2,2,2-trifluoro-1-[4'-(2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l-metiletil)bifenil-4-il]etil}-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-4-fluor-N2-((IS) -2,2,2-trifluoro-l-{4'-[1-hidroxi-l-(trifluorometil)propil]bifenil-4-il}etil)-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((lS)-l-{4'-[(lR)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((lS)-l-{4'-[(lS)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-metiletil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((IS) -1-{4Λ-[(IS)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; N1-(1-cianociclopropil)-N2-((IS) - l-{4'-[(IR)-2,2-difluoro-1-hidroxi-l-(hidroximetil)etil]bifenil-4-il}-2,2,2-trifluoroetil)-4-fluoro-L-leucinamida; ou um sal, estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo. 4

6. Uma composição farmacêutica, que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

7. A utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a preparação de um medicamento útil para o tratamento de: osteoporose, osteoporose induzida por glicocorticóides, doença de Paget, aumento anormal do turnover ósseo, patologia periodontal, perda de dentes, fracturas ósseas, artrite reumatóide, osteoartrite, osteólise periprostética, osteogénese imperfeita, aterosclerose, obesidade, obesidade, glaucoma, doença pulmonar obstrutiva crónica, patologia óssea metastática, hipercalcemia maligna ou mieloma múltiplo.

8. Uma composição farmacêutica que compreende um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo e outro agente seleccionado de um grupo composto por: um bisfosfonato orgânico, um modulador do receptor do estrogénio, um modulador do receptor beta do estrogénio, um modulador do receptor do androgénio, um inibidor da H+-ATPase de osteoclastos, um inibidor da HMG-CoA redutase, um antagonista do receptor da integrina ou um agente anabólico para os osteoblastos, vitamina D, um análogo sintético da vitamina D, um fármaco anti-inflamatório não esteróide, um inibidor selectivo da ciclooxigenase-2, um inibidor da interleucina-1 beta, um inibidor de LOX/COX, um inibidor de RANKL e os sais e misturas farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

9. A utilização de um composto de qualquer uma das 5 reivindicações 1 a 5 ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo e outro agente seleccionado de um grupo composto por: um bisfosfonato orgânico, um modelador do receptor do estrogénio, um modulador do receptor do androgénio, um inibidor da H+-ATPase de osteoclastos, um inibidor da HMG-CoA redutase, um antagonista do receptor da integrina, um agente anabólico dos osteoblastos, vitamina D, um análogo sintético da vitamina D, um fármaco anti-inflamatório não esteróide, um inibidor selectivo da ciclooxigenase-2, um inibidor da interleucina-1 beta, um inibidor de LOX/COX, um inibidor de RANKL e os sais e misturas farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, na preparação de um fármaco vantajoso para o tratamento de: osteoporose, osteoporose induzida por glicocorticóides, doença de Paget, aumento anormal do turnover ósseo, doença periodontal, perda de dentes, fracturas ósseas, artrite reumatóide, osteoartrite, osteólise periprostética, osteogénese imperfeita, aterosclerose, obesidade, glaucoma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença óssea metastática, hipercalcemia maligna ou mieloma múltiplo em mamíferos que necessitem do mesmo.

10. Uma combinação do composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo e outro agente seleccionado de um grupo composto por: um bisfosfonato orgânico, um modulador do receptor do estrogénio, um modulador do receptor beta do estrogénio, um modulador do receptor do androgénio, um inibidor da H+-ATPase de osteoclastos, um inibidor da HMG-CoA redutase, um antagonista do receptor da integrina ou um agente anabólico para os osteoblastos, vitamina D, um análogo sintético da vitamina D, um fármaco anti-inflamatório não esteróide, um 6 inibidor selectivo da ciclooxigenase-2, um inibidor da interleucina-1 beta, um inibidor de LOX/COX, um inibidor de RANKL e os sais e misturas farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

11. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um sal, um estereoisómero ou um derivado de N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo, para usar num método para o tratamento do corpo humano por terapêutica.

12. Um composto de acordo com a reivindicação 11, em que a terapêutica é um tratamento da osteoporose, da osteoporose induzida por glucocorticóides, da doença de Paget, do aumento anormal do turnover ósseo, da doença periodontal, da perda de dentes, das fracturas ósseas, da artrite reumatóide, da osteoartrite, da osteólise periprostética, da osteogénese imperfeita, da aterosclerose, da obesidade, do glaucoma, da doença pulmonar obstrutiva crónica, da doença óssea metastática, da hipercalcemia maligna ou do mieloma múltiplo.