PT1750733E

PT1750733E - Método de administração de factor viii suíno sem domínio b

Info

Publication number: PT1750733E
Application number: PT57403198T
Authority: PT
Inventors: John S Lollar; Garrette E Bergman
Original assignee: Baxter Healthcare Sa; Baxter Int; Univ Emory
Priority date: 2004-05-03
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2014-02-14
Also published as: US8101718B2; JP2007536230A; PL1750733T3; ES2449044T3; US20170119857A1; EP1750733B1; US20090270329A1; EP1750733A4; CY1114809T1; US20070173446A1; US20140193441A1; EP1750733A1; US20120270788A1; US7576181B2; SI1750733T1; WO2005107776A1; HK1100900A1; US8501694B2; DK1750733T3

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODO DE ADMINISTRAÇÃO DE FACTOR VIII SUÍNO SEM DOMÍNIO B

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hemofilia A é uma doença caracterizada por um dereito na coagulação do sangue o que resulta numa variedade de sintomas clínicos e é em última análise, um risco de vida. 0 tratamento padrão da doença é a administração de factor de coagulação VIII (fVIII), uma proteína do plasma 300 kDa ausente ou deficiente em pacientes com hemofilia A. A terapia não cura a doença subjacente, mas melhora os sintomas. Portanto, os pacientes devem receber doses repetidas de fVIII durante toda a vida. Emoora a administração do fVIII humano aos pacientes com hemofixia A seja um tratamento eficaz, a terapia de xongo prazo resuxta em. eficácia reduzida para uma percentagem significativa da população de pacientes. Cerca de 20-35% dos doeni.es com hemofilia A desenvolvem anticorpos inibitórios para o fíxl^ humano, independentemente do fVIII humano ser derivado do plasma ou feito por tecnologia recomcinante. Os doentes que desenvolvem anticorpos inibidores ao fVIIi humano experimentaram uma eficácia reduzida do tratamento, ^ episódios de sangramento mais longos. Est.es doentes foram tratados com sucesso com fVIII suíno, que é uma proteína substancialmente homóloga. O fVIII suíno é muitas vezes significativamente menos reativo com os anticorpos anti humanos de FVIII encontrados em pacientes com xnibidores. HYATE: C, um fVIII suíno natural parcialmente purificado de plasma suíno agrupado, há muito estava disponível no mercado. Ambos os fVIII humanos e de suxno purifr^adoo a partir de plasma representam riscos potenciais de contaminação de vírus ou partículas de prião. iais riscos são motivo de preocupação especial para os hemofílicos, que receberão doses repetidas da terapia ao longo da lida. 0 1 fVIU humano recombinante, e, mais recentemente, o fVIII suíno recombinante, têm sido desenvolvidos para as suas respectivas indicações. Mais especificamente, um fViII porcino recombinante sem a maior parte do domínio B foi obtido e está atualmente a ser testado para a sua aplicação clínica como um substituto para o fVIII porcino purificado a partir de plasma reunido de porcino [Patente US 6458563. Os termos aplicados a estes produtos são HYATE:C (fVIII suíno natural parcialmente purificado a partir de plasma de suíno agrupado; OBI-1 (para fVIII suíno recombinante sem domínio B}. 0 OBI-1 também é denominado POL-1212 na Patente US 6458563. Ambos os nomes, OBI-1 e POL de 1212, referem-se à mesma substância, o fVIII porcino possuindo o domínio B suprimido excepto por 12 aminoácidos na parte do terminal N do domínio B e os 12 aminoácidos na parte do terminal C do domínio B. Estudos anteriores [Doering, C.B. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:39345-38349] têm documentado que o domínio B do fVIII suíno pode ser apagado sem perda de atividade.

Existem vários relatórios de vários métodos para fornecer fVIII estáveis numa composição ou formulação farmacêutica. A albumina tem sido muitas vezes utilizada para. estabilizar estas formulações. No entanto, por causa do custo e dos riscos associados com a utilização de albumina como um estabilizador, existem várias composições farmacêuticas contendo fVIII isentas de albumina na técnica. Por exemplo, a Patente US 5565427 descreve composições de fVIII que contêm, um aminoácido ou os seus sais e um detergente, tal como polissorbato ou. Tween 80, ou um polímero orgânico, tal como PEG; a Patente US 5605884 descreve uma composição de fVIII num meio de elevada força iónica que consiste em cloreto de sódio, cloreto de cálcio 2 e histidina; as Patentes US 5763401 e 5874408 divulgam uma composição de fVIII recombinante que contém glicina, histidina, sacarose, cloreto de sódio e cloreto de cálcio. Há outros exemplos de composições de fvill com vários sais, agentes tensioativos não-iónicos e antioxidantes (Patentes US 5962650, 5972885, WO 89/09784 e WO 94/07510). A WO 03/080108 descreve uma composição farmacêutica sólida estável desprovido de aminoácidos que contem o fVIII, um tensioativo, cloreto de cálcio, sacarose, cloreto de sódio, citrat.o trissódico, e um tampão e tem um pH de 6-8, antes da liofilização e após a reconstituição com água para injeção. A WO 01/68109 e US 6458563 referem-se a uma forma sem domínio B modificada do factor \ ΓΙ11 de suín< s, com um ADN que codifica o mesmo, e a sua utilização para o tratamento da hemofilia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO resultados vezes maior A presente invenção relaciona-se com os experimentais surpreendentes que OBI-l tem 2-6

com HYATE:C. A sanguíneos atingidos determinada dose. A biodisponibilidade em comparação biodisponibilidade refere-se os níveis e mantidos após a administração de uma biodisponibilidade pode ser avaliada calculando a área sob a curva (AUC) dos níveis de sangue representada como uma função do tempo após a administração de uma determinada dose. Por conseguinte, em comparação com HYATE:C, OBI-1 pode ser administrado a uma dose substancialmente inferior, expressa em Unidades/kg de peso corporal, para proporcionar proteção equivalente contra episódios hemorrágicos graves ou na prevenção de episódios de sangramento em pacientes hemofílicos que estão em estado de não sangramento. Alternativamente, OBI-1 pode ser fornecido na mesma dose, como tal, ou uma dose semelhante ao HYAGErC, mas com uma frequência reduzida de administração em comparação com 3 HYATE:C, permitindo o controlo mais rápido do sangramento e reduzindo a inconveniência associada a várias administrações. Aliado ao fato de que OBI-1 está disponível numa maior concentração de unidades/ml que o HYATE:C, os resultados fornecem um novo modo de administração que é altamente vantajoso para o bem-estar e a qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos atuais com HYATE:C (100 Unidades/kg de peso corporal} geralmente requerem a infusão intravenosa de 280 ml de solução HYATE: C, a uma taxa de 2-5 ml por minuto, repetida a cada 6-8 horas. Esses tratamentos são entediantes, podem durar 2 horas ou mais, e limitam severamente a mobilidade dos doentes e a qualidade de vida. Por outro lado, no âmbito da presente invenção, o OBI-1 pode ser administrado como uma única injeção intravenosa de cerca de 10-100 unidades/kg de peso corporal, por exemplo, 14 ml, requerendo somente 5-15 minutos para administrar e pode ser necessária apenas uma vez, a fim de deter a hemorragia, em contraste com HYATE:C, o que leva uma média de oito administrações separadas ao longo de um período de dois dias para travar um único episódio de sangramento, de acordo com a bula. Quando um paciente hemofílico com necessidade de tal tratamento tem anticorpos inibidores do fVIII humano preexistentes que reagem significativamente de forma cruzada com OBI-1, isso exigirá mais OBI-1 para além da dosagem aqui dada para neutralizar os anticorpos. Usando o OBI-1, o controlo mais rápido da hemorragia é facilitado porque os níveis mais elevados de fVIII podem ser alcançados mais rapidamente. Como será discutido abaixo, a dose de facto administrada a um indivíduo depende de vários factores individuais, incluindo o peso corporal, o volume de plasma, e o título de anticorpos residuais para OBI-1. Os métodos de cálculo da dosagem, individual têm. sido bem estabelecidos a. partir de estudos com HYATE: C. Os métodos para o cálculo da 4 dosagem de OBI-1 irão, além disso, exigir ter em conta a a maior eficácia recentemente descoberta in vivo e a biodisponibilidade de OBI-1. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas contendo OBI-1, para utilização no tratamento de um paciente em. necessidade de fVIII de uma forma mais rápida e eficaz.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico da recuperação de atividade do fVIII (Exemplo 1), corrigida para a linha de base do fVIII após uma única injeção de HYATE:C ou OBI-1 em macacos Cynomolgus, na dose indicada, tal como descrito no Exemplo 1. A Fig. 2 é um gráfico dos resultados obtidos com a experiência descrita no Exemplo 5. Os plasmas individuais dos pacientes estão dispostos ao longo do eixo horizontal. 0 eixo vertical indica U./ml de atividade de fVIII recuperado dos plasmas individuais após a adição do fVIII como descrito no Exemplo 5. Os dados para plasmas King George Biomedical são designados como "bom" ou "mau", baseado no comportamento anómalo do último plasma (ver Exemplo 5}. A Fig. 3 é um gráfico que mostra as concentrações plasmáticas de fVIII em seis pacientes humanos após a administração intravenosa de OBI-1 ou HYATE:C. 0 eixo Y indica U/ml de atividade de fVIII recuperado dos plasmas individuais como medido pelo ensaio de atividade de uma só fase. A Fig. 4 é um gráfico que mostra as concentrações plasmáticas de fVIII em seis pacientes humanos após a 5 administração intravenosa de OBI-I ou HYATE:C. 0 eixo Y indica U/ml de actividade de fVIII recuperado dos plasmas individuais conforme medido pelo teste cromogénico, tal como aqui descrito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em geral, os termos e expressões aqui utilizados têm o seu significado reconhecido na técnica, que podem ser encontrados por referência a textos padrão, referências de jornal e contextos conhecidos dos peritos na técnica. As seguintes definições são fornecidas para clarificar a sua utilização especifica no contexto da invenção. 0 termo "transportador fisiologicamente aceitável", como aqui utilizado, é um composto orgânico ou inorgânico que serve como um transportador/estabilizador do ingrediente ativo da presente invenção, OBI-1, numa composição farmacêutica para utilização no tratamento cie um paciente que tem deficiência do fator VIII. Exemplos cie transportadores fisiol.ogicam.ente aceitáveis .incluem, mas não estão limitados a água, solução salina tamponada com fosfato, solução salina, solventes aquosos, onde a água é misturada com alcanóis inferiores, óleos vegetais, polialquilenoglicóis, geleia com base de petróleo, etil.celu.lose, oleato cie etilo, carbox.im.etil-celu.Iose, polivinilpirrolidona, miristato de isopropilo. Transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem ainda albumina, um aminoácido (por exemplo, glicina, histidina, ou seus sais), um detergente (iónico e não iónico) , tais como polissorbato ou Tween 80, um meio de elevada força iónica que consiste em sais de sódio, sais de cálcio e/ou histidina, mono-, di ou polissacáridos (por exemplo, sacarose) ou álcoois de açúcar, e outros diluentes, 6 aditivos ou transportadores conhecidos na especialidade. Para uma descrição pormenorizada dos vários excipientes e aditivos, ver as Patentes US 5925739; 5733873; 5605884; 5565427; 5763401; 5874408; 5962650; 5972885; WO 89/09784 e WO 94/07510.

Uma composição farmacêutica compreendendo OBI-1, para utilização no tratamento de um paciente tendo deficiência do factor VIII é, de preferência, uma composição sólida obtida por liofilização de uma solução desprovida de aminoácidos compreendendo OBI-1, um tensioativo ou detergente, cloreto de cálcio, sacarose, cloreto de sódio, citrato trissódico e um tampão. A solução tem. um pH de 6-8, antes da liofilização e após a reconstituição com água para injeção. O tensioativo é de preferência um tensioativo não iónico, tal como polissorbatos e copolimeros em bloco, como poloxâmeros (por exemplo, copolimeros de polietileno e propileno glicol). Um agente tensioativo mais preferido é um polissorbato tendo um grau de polimerização médio de 20 a 100 unidades de monómero (de preferência, cerca de 80) . O tensioativo mais preferido é o polissorbato 80 derivado a partir de uma planta. O tampão é preferência tris (hidroximetil) metilamina, vulgarmente conhecido como "tris". Tipicamente, a composição farmacêutica sólida é preparada por liofilização a partir da solução contendo OBI-1 a uma concentração de 50 a 10000 unidades/mL, um tensioativo com uma concentração variando entre acima da concentração micelar critica de 1% v/v, cloreto de cálcio a 0,5-10 mM, sacarose a 5-50 mM, cloreto de sódio a 0,5 M de 0,15-50, citrato de trissódio a. 1-50 mM, e um tampão a 1-50 mM. O pH da composição farmacêutica antes da liofilização e após a reconstituição em ágiaa para injeção é de preferência cerca de 6,5-7,5, 7 mais preferivelmente cerca de 7,0. A composição farmacêutica sólida contendo OBI-1 pode ser diluída com água esterilizada opcionalmente contendo cloreto de sódio antes de se administrar a um paciente em necessidade de fVIII. A administração de uma tal composição é tipicamente levada a cabo por via endovenosa. A dose ideal da composição a ser administrada será determinada pelo médico assistente com base na gravidade d. ci Cl oença em cada paciente. A WO 03/080108, divulga a descrição detalhada de um método de preparação das composições farmacêuticas sólidas que compreendem OBI-1 aqui descrito. O termo "cerca de" refere-se a um. intervalo em torno do valor considerado. Tal como utilizado no presente pedido, "cerca de X" significa um intervalo de X menos 10% de X a X mais 10% de X, e de preferência, um intervalo de X menos 5% de X a X mais 5% de X. A frase, "redução do tempo de coagulação de sangue" como é aqui utilizada, refere-se ao comprimento de tempo reduzido para a coagulação de sangue ocorrer num determinado paciente com deficiência de fVIII quando o OBI-1 é administrado em comparação com quando HYATE:C é administrado, isto é, a diferença na duração do tempo de coagulação do sangue que ocorre em pacientes tratados com a administração de OBI-1 e aqueles tratados com HYATE: C. O termo "nível terapeuticamente eficaz ou a concentração de factor VIII", tal como aqui utilizado, significa o nível de fVIII no plasma de um doente com deficiência de fVIII, que recebeu uma composição farmacêutica de OBI-1, que é suficiente para apresenrar um mensurável melhoramento ou 8 efeito protetor no paciente (por exemplo, para parar o sangramento). Os pacientes com deficiência de fVIII normalmente são pacientes de hemofilia, mas também incluem os indivíduos diagnosticados com "hemofilia adquirida", uma condição na qual aqueles que não são hemofílicos congénitos desenvolvem espontaneamente anticorpos inibidores para o seu fVIII, criando uma deficiência séria em fVIII. Em geral, o nível terapeuticamente eficaz é estimado ser de cerca de 1%, de preferência cerca de 10%, rriais preferivelmente cerca de 25-35% e acima, do nível de fVIII num sujeito não-hemofílico normal. O intervalo de concentração de fVIII em seres humanos normais não hemofílicos A é definido como 50% a 200% da atividade de fVIII encontrado num conjunto cie amostra de plasma derivada de, pelo menos, 20 dadores normais. O nível de fVIII em seres humanos normais oscila através deste intervalo normal, em resposta a vários estímulos fisiológicos e não fisiológicos. (Ver Bithell, T.C., "The Diagnostic Approach to the Bleeding Disorders", página 1302, Capítulo 48 em Lee GR, Bithell TC, Foerster J, Athens JW e Lukens JN (eds) , WintrobeVs Clinicai Hematology, nona edição, 1993, Lea & Febiger, Malvern, PA) . A frase "dose de OBI-1 neutralizante de anticorpo", é usada para indicar a quantidade de OBI-1 necessário administrar para neutralizar os anticorpos contra OBI-lpré-existentes do paciente. 0 nível de anticorpos de um paciente com hemofilia A para o f :viii porcino é diferente para cada indivíduo. A quantidade de anticorpo anti-OBI-1 presente pode ser facilmente calculado através da medição da concentração de anticorpos, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica, e a partir deste valor, pode ser estimada a quantidade de OBI-1 necessária para neutralizar 9 o anticorpo. Por causa de características de ligação e inativação diferentes individualmente de anticorpos inibidores de cada paciente, a quantidade precisa de OBI-1 necessária só pode ser estimada, e a quantidade exata a ser administrada deve ser determinada empiricamente. (ou "titulada"). A deficiência de fVIII humano pode ser estudada em mamíferos deficientes em fVIII, porque os passos de formação de coágulos de sangue são partilhadas entre todos os vertebrados, e as proteínas de fVIII de várias espécies são conhecidas por terem um elevado grau de homologia de sequência. A biodisponibilidade também pode ser avaiiada em macacos não-hemofílicos

Depois, tendo em conta as basais de fVIII e variações no volume de sangue, níveis semelhantes nas espécies, os resultados de estudoo animaio Ί , , , ,n-aHos em humanos. A sao geralmente previstos dos resuiwjUJ _ n . , nartj r dos resultados presente invenção foi desenvolvida a FaJ·-' , ... , .H^talhe abaixo. Foram das experiencias, descritas em aeLo. tipos; estudos de hemofílicos, estudos experiencias, realizados estudos de quatro biodisponibilidade em macacos e cães de eficácia em cães hemofilicoí ra estudo in vitro da recuperação da humano, e em estudos de biodisponibil*0 tos hemofílicos, um •ivida.de no plasma iade m vivo em seis seres humanos cj0 a recuperação da. a administração de aV-aliada através da temp° de hemorragia ae mortalidade em-m0delo de ratinhos e o HYATE;C também A biodisponibilidade foi avaliada medin atividade num determinado momento ap°s uma determinada dose. A eficácia 1°1 medição do efeito de uma dada dose η° da cutícula (TCC) em cães hemofílicos e sangramento por transecção da cauda. hemofílicos. As recuperações de OBJ·'·1 10 foram medidas in vitro por adição de cada uma das substâncias para as amostras de plasma hemofílico humano e amostras de plasma inibidor de hemofílicos humanos. A biod.ispon.ibilida.de foi ainda. avaliada em seis seres humanos, medindo a recuperação da atividade num determinado momento após a administração de uma dose padrão de 100 U/kg.

Hm estudos iniciais de recuperação da atividade (biodisponibilidade), a macacos não-hemofílicos foram dados OBI-1 ou HYATE:C por via intravenosa para aumentar os níveis de fVIII no seu sangue. As amostras de sangue foram retiradas periodicamente para se determinar a atividade do fVIII e a persistência do produto na corrente sanguínea do animal ao longo do tempo. A biodisponibilidade de OBI-1 foi encontrada ser várias vezes maior do que a de HYATE:C (ver Tabelas 1 e 2, e Fig. 1}. Foram observadas diferenças semelhantes entre HYATE:C e OBI-1 em estudos de biodisponibilidade em cães hemofílicos como mostram as

Tabelas 3 e 4.

Num estudo de eficácia, cães hemofílicos foram testados para tempos de sangramento após um corte da cutícula da unha, utilizando um intervalo de doses de OBi-1 ou HYATE:C. Os tempos de sangramento de cutícula (CBT) foram medidos para avaliar a eficácia dos produtos de ívill. Tanto o OBI-1 e HYATE: C reduziram, o TCC para o intervalo normal observados em cães não hemofílicos, embora os resultados fossem variáveis. Consistente com os estudos do rato como descrito abaixo, o OBI-1, com base em unidades comparáveis, pareceu ser mais eficaz na redução do TCC do que o HYATE:C. 11

Os estudos de eficácia foram realizados com uma estirpe de ratos nocaute fVIII": ratos nos quais o gene que codifica para o fVIII foi inativado. Esses ratos são altamente suscetíveis a hemorragia após uma lesão, mesmo trivial. A transecçâo de 2 cm distai da cauda irá conduzir a hemorragia fatal em 24 horas para a maior parte dos ratinhos hemofílicos. Através da administração de uma gama de doses de OBI-1 ou HYATE:C a ratinhos hemofílicos, 15 minutos antes da transecçâo da cauda, foi possível estimai uma dose que protege 50% dos ratinhos da mortalidade (ED50) . Nestes estudos, em que OBI-1 e HYATE: C foram testados separadamente, a ED5o (unidades kg) de OBI-i pareceu ser cerca de um quarto da do HYATE:C, como pode ser visto nas Tabelas 6 e 7.

Em experiências com ratos e cães hemofílicos, doses comparáveis de OBI-1 e HYATE :C resultaram numa maior-recuperação de OBI-1 do que HYATE :C com base num teste de coagulação fVIII padrão.

Os resultados acumulados indicam que OBI-1 pode ser administrado a uma dose eficaz significativamente inferior do que HYATE:C, em que o nível de atividade de cada uma foi medido através de um ensaio padrão de fVIII. Será entendido por aqueles peritos na técnica que a dose eficaz pode ser calibrada de acordo com os requisitos individuais do paciente, incluindo os níveis residuais de fVIII existentes no plasma do paciente e o nível de anticorpos inibidores no plasma do paciente que devem ser neutralizados.

As recuperações de OBI-1 e de HYATE:C também foram medida in vitro, após a adição de cada um a uma concentração 12 nominal de 1 U./mL de amostras de plasma humano a partir de pacientes com hemofilia com inibidores. As recuPeraÇ°es de ambos OBI-1 e HYATE:C foram menores do 4ue a concentração Ί , > r-paçao cruzada de nominal, o que se deveu em parte a T-^ v , , ,T , qc Hô 3D 3.ΓΠΟ S11Γ3.S / B. anticorpos inibidores. No entanro, em 2o ' atividade de OBI-1 recuperada foi maior do 4ue a atxv^dade de HYATE:C recuperada, e em 18 de 35 amostras, α atividade de OBI-1 recuperada era mais do que duas vezes maior do que a atividade de HYATE:C recuperada.

Estudos de biodisponibilidade foram realizados amaa em seis seres humanos, com anticorpos inibitórios ausentes ou mínimos para OBI-1, numa forma, duplo-cego randomizado, duplo-placebo, grupos paralelos cegos, como descrito no Exemplo 6. Como mostrado na Tabela 8 e Figuras 3 e 4, a biodisponibilidade de OBI-1 era muito maior do que a de HYATE:C, quando ambos foram administrados a 100 U/kg. A substancialmente maior recuperação e biodisponibilidade de OBI-1 em comparação com HYATE:C é surpreendente e não pode ser prevista nem explicada pelo facto de OBI-1 ser um produto recombinante e HYATE:C ser um produto derivado do plasma. Na verdade, com o factor IX humano (utilizado no tratamento da hemofilia B) , o produto derivado do plasma mostrou realmente recuperações cerca de duas vezes maior do que o produto recombinante derivado (1,71 / - 0,73 UI por dL por IU por kg em comparação com 0,86 +/- 0.313 UI por dl, por Ui por kg [ver Ewenstein BM et al. Transfusion (2002), 42:190]. Igualmente importante, quando a biodisponibilidade de um domínio B recombinante excluído do produto do fVIII humano foi comparada com a de um produto derivado do plasma do fVIII humano, os dois produtos foram 13 considerados bioequivalentes. [Ver Kessler, CM, et al. Hemophilia (2005), 11:84].

Os resultados clínicos para OBI-1 e HYATE:C são consistentes com os dados farmacocinéticos obtidos com macacos, cães hemofílicos e ratos, hemofílicos. Estes resultados indicam ainda que OBI-1 pode ser administrado a uma dose inferior ou uma de igual importância pode ser administrada com uma frequência muito reduzida de administração, em comparação com HYATE:C, para se obter efeitos terapêuticos equivalentes em pacientes com deficiência de fVIII. Os dados também mostram que OBI-1 atinge o pico e os níveis terapêuticos muito mais rapidamente do que as doses equivalentes de HYATE:C, permitindo um controlo mais rápido da hemorragia. EXEMPLOS EXEMPLO 1

Estudo de biodisponibilidade em macacos

Macacos cinomolgos não hemofílicos foram utilizados para comparar a biodisponibilidade de OBI-1 e HYATE:C. Grupos de quatro macacos receberam uma dose de cada HYATE: C 100 U/kg, ou OBI-1 em doses de 49 ou 77 U/kg, As amostras cie sangue foram colhidas nos pontos de tempo especificados, post.eriorm.ente, e os níveis de fVIII obtidos foram utilizados para calcular os parâmetros farmacocinéticos, incluindo os níveis de atividade integrados ao longo do tempo. 0 valor integrado é referido como a área sob a curva para o período de tempo especificado (AUC0 _ t) ·

As análises de farmacocinética foram calculadas usando métodos não compartimentados, corrigidas para linha de base 14

(nível de fVIII endógeno no animal de teste) - A concentração máxima no plasma, Cmax, e o tempo para a concentração máxima no plasma, Tmax, foram tomados diretamente a partir dos dados. A área sob a curva desde o tempo zero até a amostra final (AUCo _ t.) foi calculada usando o método trapezoidal linear. Os resultados são mostrados na Figura. 1.

Houve um aumento proporcional à dose na Cmax e AUCo t entre as duas doses de OBI-1. Significa que os níveis no plasma de fVIII para os macacos que receberam HYATS:C 100 U/kg foram menores do que os níveis de fVIII de macacos que receberam OBI-1, tanto a 49,5 e 77 U/kg, em cada ponto do tempo, mas um. A biodrsponibilidade (AOC) de HYATE:c rOu U/kg (299 ± 191 U · h/dL), foi de apenas cerca de 1/3 a da OBI-1 dado a uma dose de 49,5 U/kg (900 ± 311 h · U/dL) e um quarto que de OBI'1 dado a uma dose de 77 U/kg (1178 ± 669 h · L/dl). Em um ponto do tempo, 0,66 horas, os níveis de fVIII medido apareceram espúrios para vários animais, provavelmente devido ao mau uso das amostras de plasma. Calculando os valores farmacocinéticos excluindo os valores de fVIII em 0,66 horas para a análise resultou apenas em pequenas alterações para. AUO0-24· A Tabela 1 apresenta os parâmetros farmacocinéticos para níveis de fVIII da linha de base corrigida após administração iv de HYATE:C e OBI-1 em macacos. TABELA 1 Parameter1 OBI-1 49.5 U/kg OBI-1 77 U/kg HYATE:C 100 U/kg Cmax (U/dL) i 107 ± 22.6 169 ± 32.2 78.7 ± 20.4 15

Parameter1 OBI-1 49.5 U/kg OBI-1 77 U/kg HYATE:C 100 U/kg Tmax (h) 2.00 1.98 2.22 AUC0^24 (h-U/dL) 900 ± 311 1,178 ± 669 299 ±191 1 Arithmetic mean ± Standard deviation except for Tmax for which the median is reported.

Em conclusão, o OBI-1 administrado a macacos cinomologos numa dose de 49,5 U/kg ou 77 U/kg, resultou numa área muito maior sob a curva tempo-concentração do que uma dose de HYATE:C a 100 U/kg. Este achado acidental revela uma diferença imprevisível entre OBI-1 e HYATE:C, especificamente, que OBI-1 exibe uma atividade melhorada in vivo, quando administrado em macacos, em comparação com HYATE:C. Quando os dados da Tabela 1 são comparados numa base equivalente U/kg pode ser visto que uma dose de 49,5 U/kg de OBI-1, proporciona desde cerca de 6 vezes mais AUCo _ 24 do que uma dose de 100 U/kg de HYATE:C. A uma dose de 77 U/kg de OBI-1, desde cerca de 5 vezes mais AUCo ^ 24 do que 100 U/kg de HYATE:C. Resultados semelhantes foram obtidos num estudo separado com cinco macacos recebendo 40 U/kg de OBI-1, cinco macacos que receberam 100 U/kg de QBI-1 e 6 macacos que receberam 100 U/kg de HYATE:C. (Tabela 2) . TABELA 2 | Pharmscokineiic Paramexers for Sasoiine Ccrrected f-scior VIH Aiíer l.v. Admintsirstion cf QBI-1 ano HYATfãC :n j | Monkeys. j | Paramsteá 081-1 m u/kg j OBI-11000,'kg HYAT&IC 100 U*8 :i |: i Davi j | Crosx (U'dl.) 73.4 · <3.24 j 230 · 66.5 101 < 23.0 i | tmax {h> 0.50 \ 0.50 0.50 i l Aucq.^f ίΐ-υ«!.ι: 323 ·· 120 j 1.8154 · .857 : 507 * 304 j \ \ 1 %íy! \ | Cmax íU,'s‘l.) j Tmax (h) 71.2 ‘ 52.3 i 153 > 201 | S.53 50.3 ’ 24 7 I ---------- -|| 1 AUCp >l2 {h-u.yg 353 r 533 I «42 í 255 193185 i | ’.AfiUiín«vic m*a-i i stangard dsviatiofi excep íor Tnisx&r^iiieiífte rseiíiSfiiS 'eporis-d j 16 EXEMPLO 2

Biodisponibilidade em cães portadores de hemofilia

Originalmente descoberta como uma mutação espontânea, cães com hemofilia A, foram mantidos numa colónia protegida por mais de vinte anos. A colónia alojada no Queens University, em Kingston, Ontário, está na sua décima geração. Eles não têm nenhuma atividade de fVIII circulante ou proteína e o seu quadro fenotípico é análogo à hemofilia A. grave em humanos, com sangramentos espontâneos recorrentes dos tecidos moles graves e articulares e deformidades articulares crónicas. Eles exigem frequentes injeções de plasma ou crioprecipitado derivado do canino para controlar a sua hemorragia. A oito cães saudáveis com idade entre 6 meses ou mais, pesando pelo menos 6 kg, e sem anticorpos anti-fVIIl suíno foram individualmente administrados por uma única dose de OBI-1 ou de HYATE:C. Dois animais receberam cada 3 U/kg, 25 U/kg, ou 100 U/kg de cada produto. Amostras de sangue foram colhidas no início e nos seguintes pontos de tempo após a injeção dos produtos: 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Os níveis de fVIII foram determinados por ensaio de coagulação de uma fase e os métodos de ensaio cromogénico.

Os níveis de fVIII foram determinados contra um padrão de fVIII suíno designado HY98P. Embora estes cães hemofílicos não tenham atividade de fVIII canino mensurável, e nenhum antígeno fVIII esteja presente no seu sangue, eles foram encontrados para ter atividade fVIII mensurável no início do estudo (0,1 a 0,3 U/ml) , quando testado contra um padrão fVIII suíno. Este padrão de suíno foi feito pela adição de quantidades variáveis do produto de teste actual HYATE:C ou 17 OBI-1 (em 1% de albumina de soro de bovino/tampão de imidazol) para o plasma deficiente em factor VIII hemofílico humano. Para fins de determinação de parâmetros farmacocinéticos, por conseguinte, a atividade da linha de base medida foi subtraída da atividade medida em cada ponto de tempo e a diferença na atividade do fVIII foi inserida para todos os cálculos. Para ambos os produtos testados, houve uma variabilidade substancial dos valores farmacocinéticos obtidos a partir dos cães testados em cada nível de dose.

Os valores médios para os parâmetros farmacocinéticos selecionados são mostrados na Tabela 3 (Ensaio cromogénico) e Tabela 4 (Ensaio de coagulação de uma fase). TABELA 3

18 TABELA. 4

Os resultados do ensaio de coagulação e do ensaio cromogénico foram semelhantes. A concentração máxima (Cmax) no sangue para OBI-1 foi maior do que para HYATE:C em todas as doses. A média de tempo para a concentração máxima (Tmax) foi menor para OBI-1 do que para HYATE:C a doses de 3 e 25 U/kg, mas o oposto foi observado na dose de 100 U/kg. A média de percentagem de recuperação foi maior para OBI-1 do que para HYATE: C em todas as doses: a 25 e 100 U/kg, os valores de recuperação para OBI-1 foram de aproximadamente 2-5 vezes maiores do que para HYATE:C. Para a Área Sob a Curva, independentemente do grupo de tratamento a média geométrica da AUC aumentou na medida em que a dose aumentou. Em geral, os valores farmacocinéticos como medidos pelos dois métodos de ensaio, a coagulação numa fase e os ensaios cromogénicos, seguiram as mesmas tendências em toda a maioria dos parâmetros. 19 EXEMPLO 3

Eficácia em cães portadores de hemofilia 0 TCC, o tempo que leva para estancar a hemorragia depois de uma cutícula da unha do cão ser cortada, é uma medida útil da eficácia em cães hemofílicos. No cão com hemofilia não tratado, a cutícula geralmente para o sangramento em cerca de 2 minutos, não sangra por um breve período e depois voltar a sangra constantemente por pelo menos 12 minutos ou até que a lesão seja cauterizada. 0 TCC normal é definido como 5 ou menos minutos de sangramento e não há necessidade de cauterização. 0 TCC em cães com hemofilia congénita tem sido amplamente utilizado como uma medida da eficácia dos produtos experimentais de fVIII. 0 delineamento experimental foi o descrito no Exemplo 2. A Tabela 5 demonstra que as alterações individuais nos resultados de TCC para cada cão em cada injeção. TABELA 5

Effect of Porcíne fVIII Products on Dag Cutíde Bfeeding Times P08 0 oseUíkg C BI aftsr OBM minutos i8BT:p®íH¥AT|:e Pte injection Post injeciion P« injecticn Post injecíiors Reduction Bedsy 3 8.5 12 -3.5 Hsmish 3 11 4 7 8 10 -2 Zmy A 3 12 12 0 12 12 Ô Misxiy 25 9 3 S 8 8 2 Jura 25 13 6 7 2 4 •2 Wende! 108 12 9.5 2.5 12 12 8 Arsenio A 108 12 2 10 4 5 -1 Afsenlo 8 108 11 t 10 5 2 4 2oey B 108 12 w 4 12 3 9 Μ&3Ώ Recíucttoií, ostoutes 4.78 1.25 §.D> 4.51 3.73 5 In Zoey-2 (second stuclyi thecuíiUe teedírts wãs oxtrernoiy s.íow sftertfieZ mín peini with Q:níyt2dros>s/fnm up to 8 fftin 20

Apesar de haver uma variação substancial entre cães individuais, os dados sugerem uma maior eficácia in vivo em caes que receberam OBI-1. a redução média no TCC sobre todas as doses em cães com OBI-1 e HYATE:C foi de 4,78 min e 1,25 min respectivamente. Esta diferença não foi estatisticamente significativa, mas houve uma tendência à significância (p = 0,10, teste t) . A diferença entre a eficácia de OBI-1 e HYATE:C foi mais pronunciada com as doses mais baixas de 3 U/kg e 25 U/kg, onde OBI-1 reduziu a TCC em alguns cães, mas HYATE:C não. EXEMPLO 4

Estudo de eficácia em ratos

Ratos com hemofilia A foram criados por rompimento alvo de exon 16 do gene do fVIII. Os ratinhos E16 têm atividade detectável de fVIII, sangramento espontâneo ocasional, e hemorragia prolongada e aumento da mortalidade após a transecção da cauda ou laceração da veia da cauda. Um modelo de eficácia tem sido desenvolvido em que a capacidade de fVIII para diminuir a mortalidade em ratinhos Ξ16 após transecção de 2 cm distai da cauda é avaliada. O grau de investigação de OBI-1 foi preparado por expressão do OBI-1 cADN numa linha de células de rim de hamster bebé e purificação a partir do meio de expressão sem soro utilizando um método de cromatografia em dois passos tal como descrito em Doerrng et al. (200z; J. Bior. Chem. 277:38345-9. A experiência seguinte foi concebida para testar a eficácia de QBI-1 no modelo de transecção da cauda.. 21

Ratos, machos ou fêmeas, com hemofilia A, com idades entre 9 a 10 semanas, foram injetados pela veia da cauda com várias concentrações de QBI-1 ou tampão de controlo. Os ratinhos foram, anestesiados e, 15 minutos após a injeção, 2 cm de cauda distai foi seccionada e deixada sangrar livremente. Esta lesão supostamente é fatal em 24 horas na maioria dos ratos com E16 hemofilia A. A sobrevivência às 24 noras foi determinada com os seguintes resultados: TABELA 6

Efficacy of OBI-1 in Hemophilia A Mice: T ail T ransection Model Survivai Dose (U/kg) (Alive/Total) Survivai (%) 0.0 6/38 16 0.015 2/8 25 0.044 5/7 71 0.130 4/7 57 0.400 7/7 100 1.200 7/7 100 >1.200 14/14 100

Os dados são consistentes com a afirmação de que uma dose de fVIII de 1,2 Unidades/kg é eficaz na prevenção dA morte nesse modelo. Combinando os dados em 0,4 e 1,2 Unidades/kg, há 14/14 sobreviventes em comparação com 6/38 sobreviventes no grupo de controlo (sem tratamento). Uma dose estimada que confere 50% de sobrevivência (ED5o) foi de 0, 044 U/kg. Além disso, cada rato que recebeu pelo menos 0,4 U/kg sobreviveu. 22

Eficácia de HYATE:C em. ratinhos hemofílicos

Antes de xn~i ecoes ns veia da cauda de HYAIEuC (0 a rOO Unidades/kg de fVIII), ou placebo (solução salina), os ratinhos foram aquecidos sob uma lâmpada de 60 watt durante 2 minutos para difater a veia da cauda. Quinze minutos após a injeção, os ratos foram anestesiados com Metofane e os 2 cm da cauda distai foram amputados. Os ratos foram colocados em gaiolas limpas com toalhas de papel e observados durante 24 horas, para determinar a. sobrevivência. Alimentos bem humedecidos foram colocados no interior de cada gaiola para além da garrafa de água normal e arânulos secos. Os sobreviventes foram eutanasiados após 24 horas, utilizando Metofane, seguido por deslocação cervical.

Houve um aumento dependente da dose, na sobrevivência em ambos os grupos tratados a seguir à injeção do produto (Tabela 7). TABELA 7

Efficacy of HYATE:C in Hemophilia A Mice Survival Dose (U/kg) (Alive/Total) Survival (%) 0.0 2/17 11 23

Efficacy of HYATE:C in Hemophiíia A Mice Survival Dose (U/kg) (Alive/Total) Survival (%) 0.3 4/8 50 0.1 5/17 30 0.2 5/10 50 0.5 16/20 80 1.0 7/10 70 2.0 14/18 78 5.0 9/10 90 8.0 8/8 100 10.0 10/10 100 25.0 2/2 100 50.0 2/2 100 75.0 1/1 100 100.0 2/2 100 A ED50 estimada para HYATE:C foi de 0,2 U/kg, 4-5 vezes maior do que a estimada para OBI-1, prevendo uma maior eficácia de OBI-1. No geral, a eficácia comparativa de HYATE:C e OBI-1 não foi rigorosamente estudada em ratinhos com hemofilia A. EXEMPLO 5

Recuperação de plasma humano Materiais

Plasma humano normal citratado (FACT, produto n° 0020-0} e plasma humano deficiente em fVIII (plasma de hemofilia A humana, produto n° 0800) foram adquiridos a George King Bio-Medical, Inc.). Foram armazenados a -70°C. O reagente de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) (produto n° 35513) foi adquirido a Organon Teknika Corp. Foi armazenado num estado liofilizado a 4°C. O veiculo OBI-1, 24

Lote n° 214-02-001, foi reconstituído com 1 ml de água para injeção por frasco (60 frascos no totai). Quatro frascos de OBI-1, Lote n° 214-01-001, foram cada reconstituído com 1 ml de água para injeção, produzindo uma concentração esperada de 550 U/ml de acordo com o rótulo do fabricante. O OBI-1 foi diluído 15,9 vezes mais por adição de 59,6 ml de veículo OBI-1 reconstituído, obtendo-se uma concentração prevista de 34,6 U/ml. Três frascos de HYATE: C, Lote n° 656, foram reconstituídos com 20 ml de água para injeção, produzindo uma concentração esperada de 34, 6 U/ml, de acordo com o rótulo do fabricante. HYATE:C foi sub-aliquotado em 120 alíquotas de 0,5 ml cada e congeladas a -70 °C. OBI-1 foi sub-aliquotado em 127 alíquotas de 0,5 mi cada e congeladas a -70°C.

Plasmas com citrato de pacientes com anticorpos inibidores para fVIIl foram enviadas em gelo seco para a Universidade de Emory de vários centros de tratamento de hemofilia. As amostras foram congeladas a -7 0 °C até serem, usadas. De 58 plasmas que foram obtidos, 25 foram selecionados aleatoriamente para o estudo.

Ensaios de fVIIl

Ensaios de coagulação de fVIIl num estágio foram realizados utilizando um Instrumento de Coagulação da Diagnostica Stago, ST art 4. Reagente liofilizado aPTT foi solubilizado em 3 ml de H20 de acordo com as instruções do fabricante e mantido à temperatura ambiente até ser utilizado. FACT e plasma deficiente em fVIIl foram armazenados em gelo após o descongelamento rápido num banho de águia a 37 °C. O plasma deficiente em fVIIl (50 μΐ) foi adicionado a. cuvetes de amestra e deixado aquecer por 30-45 segundos antes da adição dos restantes reagentes. As diluições de fVIIl padrão ou amostras (5 μΐ) foram adicionadas, seguido pela 25 adição de 50 μΐ de reagente APTT e incubado durante 2 50 segundos. A coagulação foi iniciada pela adição de 50 ul de solução de CAC12 pré-aquecida utilizando uma pipeta retorcida. A adição ativa um temporizador interno e regista 0 tempo de coagulação em segundos. Uma curva padrão foi preparada utilizando-se quatro diluições de FACT em solução salina tamponada de Hank: não diluída, 1/3, 1/11 e 1/21. A uma concentração de fVIII em FACT não diluido é de cerca de 1 U/ml e varia entre 1,04-1,09 U/mi de acordo com o fabricante. 0 tempo de coagulação foi traçado contra o logaritmo da concentração de fVIII e a curva padrão foi calculada por regressão linear. A concentração de fVIII das amostras foi determinada por interpolação na curva padrão, excepto no caso de análise de soluções de stock de OBI-1 e HYATE:C, para as quais as medições mais extensas foram feitas, como descrito em Resultados. A reconstituição cia atividade de fVIII dos plasmas enriquecidos com OBI-1 ou HYATE :C foi medida em 33 das amostras de plasma inibidor disponíveis {Figura 2) . Em todos os casos, os plasmas foram enriquecidos com uma atividade de fVIII prevista de 0,9 U/ml. Além disso, dois plasmas de hemofilia A obtidos de King George foram incluídos, e são mostrados à direita na figura. O plasma "bom" corresponde ao plasma reagente disponível no mercado em que a recuperação de fVIII em HYATE:C e OBI-1 já haviam sido encontradas ser no intervalo esperado. 0 plasma "mau" corresponde ao plasma em que a recuperação de fVIII em HYATE:C anteriormente havia sido encontrado ser inferior a 10% do esperado em Ipsen. Os resultados confirmam que a recuperação esperada de OBI-1 é obtida no plasma "bom" e que a recuperação de HYATE:C está perto do intervalo esperado. No entanto, a recuperação da atividade a partir do plasma "mau" enriquecido com HYATE:C foi novamente 26 observada ser muito pobre. A recuperação de OBI-1 a partir deste plasma foi consideravelmente maior, mas menor do que o esperado, A recuperação da atividade de fVIII em plasmas de pacientes inibidores foi muito baixa, menos de 0,1 U/ml em quase todos os plasmas enriquecidos com. HYATE: C, A recuperação foi significativamente maior, quando esses mesmos plasmas foram enriquecidos com OBI-1, mas foi inferior ao esperado (devido à presença de anticorpos inibidores). Vários dos plasmas que tinham sido previamente ensaiados como negativo para os anticorpos inibidores para HYATE:C foram testados e são apresentados na Figura 2. A recuperação de HYATE:C era pobre, na maioria das amostras. Isto aumentou a possibilidade de que um tempo de incubação de HYA^TE: C com plasma de hemofilia A, tal como ocorre durante a incubação de 2 horas, no ensaio de Bethesda, pode levar a um aumento de recuperação da atividade de HYATE:C. No entanto, quando HYATE:C foi adicionado a uma das amostras inibidoras de HYATE:C negativas dos pacientes, não houve um aumento de atividade ao longo de 2 horas.

Em conclusão, quando OBI-1 é introduzido no plasma humano, quer contenha ou não um anticorpo inibidor humano para o fVIII, a recuperação in vitro é maior do que a de HYATE:C A implicação desta descoberta é que se pode atingir o mesmo nível de circulação de fVIII num paciente por administração de uma dose muito baixa de OBI-1 do que de HYATE:C. 27 EXEMPLO 6

Farmacocinética de OBI-1 contra HYATE:C em seres humanos

Para avaliar vários parâmetros farmacocinéticos do OBI-1 contra HYATE:C em seres humanos, foi realizado o seguinte estudo comparativo de grupos paralelos randomizados cegos com nove pacientes humanos. Destes nove pacientes, cinco não tinham nenhum inibidor anti-suíno detectável na linha de base (isto é, menos de 0,8 unidades de Bethesda) e um (atribuído ao grupo OBI-1) tinha um. muito baixo inibidor de 1,0 unidades de Bethesda. Dos seis pacientes com ou sem inibidor preexistente ou um inibidor muito baixo para fVIII suíno, três receberam HYATE:C e três receberam OBI-1. Os três pacientes com níveis significativamente mais elevados de inibidores foram excluídos da avaliação da biodisponibilida.de, uma vez que a. presença de tais inibidores deprime a biodisponibilidade, confundindo deste modo a análise. Todos os pacientes tinham mais de 12 anos de idade, foram diagnosticados clinicamente com hemofilia A, e estavam atualmente no estado de não-sangramento. OBI-1 foi fornecido em frascos estéreis contendo 535 unidades de atividade de fVIII por frasco. Cada frasco foi reconstituído com 1,0 ml de água estéril para injetáveis USP, até uma concentração finai de 535 U/ml. 0 HYATE:C foi fornecida em frascos estéreis contendo 541 UI de fVIII por frasco. Cada frasco foi reconstituído com 20 ml de água estéril para .injetáveis USP, até uma concentração final de 27 lU/ml. A dose de cada produto administrado foi de 100 IU/kg, independentemente do título de anticorpos dos sujeitos. Os investigadores, pacientes e patrocinadores eram cegos para qual o produto ativo o paciente recebeu, numa concepção duplo-placebo, duplo-cego. Os pacientes receberam 100 UI/kg de HYATE:C ativo seguido por um placebo (três pacientes), ou um placebo, seguido de 100 Ul/kg de 28 OBI-1 ativo (três pacientes), enquanto num estado de não-sangramento estável. Cada paciente recebeu uma infusão ao longo de ap r o x i ma darne n 16 5 uma hora do primeiro produto (HYATE:C o u placebo com o mesmo vol ume) , seguido por um impulso de infusão lenta a partir de uma . cobertura de uma seringa ao longo de 10 minutos do segundo produto (OBI-1 ou o placebo no mesma de volume).

As amostras de sangue foram retiradas nos tempos 0 (pré-injeção), 20, 40, 60, 65,75, 85, 105, e 125 minutos, e 3, 6, 9, 24, 27, 30 e 48 horas após a primeira infusão fiara determinação dos níveis de atividade de plasma fVIII tanto pelos métodos de ensaio de coagulação de uma fase e cromogénico, utilizando plasma humano agrupado como um padrão de fVIII. A partir destes níveis, análises de farmacocinética padrão foram realizadas e os resultados são apresentados na Tabela 8 e Figuras. 3 e 4. Os parâmetros farmacocinéticos medidos neste estudo incluem depuração (CL, ml/h/kg), a Área Sob a Curva (AUC, L/dl), concentração máxima (Cmax, U/ml), volume de distribuição (Vz), tempo médio para a concentração máxima (Tmax, h) , e metade do tempo (11/2, h) · 29 TABELA 8 | Samroa^of íJtermaísfeineSe parafr eters for · paítenís. Actiy iíyAssay HYATE;# La ftumsn 1 Ch*»nrjageí4e Assay ! 1 Parameteá'2 GSi-1 | HYATE :C Q8L1 | HYATE :C j Crrtad (U/dU 1Τβ3;8δ.Ο' ] 82.3 i 19.2 151 n 31.5 ! iS?;? 1 13.8 ΪΙΤ:3Χ 00 :0,8¾ I 1.93 0.82 | 1.50 [ :AÈiC(£Wt) i>U/dL) 2,083 * 1,323 [ 1,178 <- 489 1.81? c 625 | 708 i 420 j i§D(inO (h»U/dL) 2.18» *· 1.390 j 967 - 365 1.89'? 805 1 7?1 * 480 | ’ b (ti 10.3 1 1.85 j €.80 2.19 10.5 ' 3.38 | 9.45 r 5.14 ! CL pUcrnin} 9.11 ·► 8.31 11.8 - 1,44 8.00 · 2.S1 | 17.3 a&SO j fmbmió/Yg):: 0.12 > :&:1í | 018 · 0.07 0.10 0.04 | 0.27 p õyiâ ! VZ (Í)í 7.55 " 4:04 S.83 · 1ΥΌ 7.517:3:05: | 116 7::2:,24 1 ϊϋΜ 0.10 7. 0.07 0 10 · 0.00 0.09 0,07 | 0.!8 ·> 0.02 j Iwteãti'» df Trílax torwOicH thsimédíáíi is rspcsífe *d. | 2 N =;âfer Wb praduete. Como pode ser vist o na Tabel _a 8, e as Figs. 3 e 4, os valores cia AUC para o OBI-1 eram cerca de 2-2,5 vezes maiores do que para HYATE:C. A diferença na AUC entre OBI-1 e HYATE:C foi mais pronunciada no ensaio cromogénico do que no ensaio da atividade de uma só fase. A concentração máxima (Crnax) no sangue para OBI-1 foi de cerca de 3 vezes maior do que para o HYATE:C (151 vs 53 pelo ensaio cromogénico). 0 tempo médio para a concentração máxima (Tmax) foi de aproximadamente 2,5 a 3 vezes mais curto para o OBI-1 do que para o HYATE:C. Estes resultados são consistentes com os dados farmacocinéticos anteriores obtidos com macacos, cães hemofílicos e ratos hemofílicos, e demonstra ainda que o OBI-1 tem muito maior biodisponibilidade em comparação com o HYATE:C. Portanto, o OBI-1 pode ser administrado a uma dose inferior ou ser administrado com uma frequência reduzida de administração, em comparação com o HYATE:C, para se obter efeitos terapêuticos equivalentes em doentes deficientes em fVIII. E o OBI-1 em. doses equivalentes a HYATE: C pode trazer um controlo mais rápido da hemorragia. 30 EXEMPLO 7 Significado clinico das diferenças nos valores d®

recuperação para OBI-1 e HYATE: C

Os estudos descritos acima demonstram que a recuperação a partir do plasma humano, a concentração máxima (Cmax), e a área sob a curva (AUC) foram muito mais elevados para o fVIII porcino recombinante com o domínio B excluído (OBI-1) do que para o fVIII porcino derivado de plasma (HYATE:C), após injeção de doses idênticas. A concentração do fVIII em indivíduos normais sem hemofilia A é de cerca de 100 Unidades/dL. 0¾ episódio de sangramento típico é muito susceptível de ser controlado, se o nível plasmático de fVIII é atingido a cerca de 25% e 35% do nível normal, e mantido durante várias horas (Roberts H e Hoffman M, "Hemophilia A and Hemophilia B", capítulo 123 em Beutler E, Lichtman M, Coller B, Kipps T e Seligsohn U (Eds), Williams Hematology, 6a edição (2001): páginas 1639-1657; McGraw-Hill, New York) . Usando os dados farmacocinéticos obtidos a partir de pacientes sem ou com baixo inibidor do fVIII suino (OBI-1, n = 3; HYATE: C, n = 3, tal como descrito no Exemplo 6), os cálculos adicionais foram realizadas para determinar os valores farmacocinéticos da administração de OBI-1 e HYATE:C que correspondem aos níveis terapêuticos de fVIII (isto é, 25-35%). Os resultados são apresentados na Tabela 9. 31 TABELA 9

Calcuíaied pharmaaokine-ie vatues «Hsssspondíng te therspeufcc leveis of fVlll wiíh OBl-1 arvá HYATE :C adrrsinistration. >25% TiREÂ1$ÍENÍ* ám TIMÉpif T®SE(hij OSI-1 12SS.2 25.6 709.2 7.6 2218.3 27.2 1839.4 24.2 210.4 7.5 127.7 4.5 mean 1232.0 20.1 925.4 12.1 Ste Dav 1004 9 10.9 923.0 10.6 HYATiíC· MT-. 7 9 302.7 9 28-6.4 :9 170:9 9 103.4 m 10) 4 6 meátl 272.3 W. 1047 6.0 Std Dsv 102.1 to· 101.5 1.6

Como mostrado nas tabelas acima: (1) a AUC acima de 25% e 35% é aproxim.adam.ente 5 vezes maior para OBI-1 do que para HYATE:C (Tabela 9); (2) as concentrações máximas (Cmax) são 2-3 vezes superiores para OBI-1 do que para HYATE:C (Tabela 8) ; (3) OBI-1 irá atingir o seu pico de concentração muito rnais rapidamente do que HYATE :C (ver Tmax na Tabela 8, em que o Tmax para OBI-1 estava aproximadamente em 0,6 horas, em comparação com 1,5-2,0 horas para HYATE:C); e (4) o comprimento do tempo que fVIIl estará na gama terapêutica após a administração de OBI-1 a 100 U/kg é maior (1,5 a 2 vezes} do que para HYATE:C a 100 U/kg.

Em resumo, os dados aqui apresentados indicam que OBI-1, unidade para unidade, vai conseguir muito mais rápida, eficaz e prolongado controlo do sangramento do que HYATE:C em. pacientes com deficiência de fator VIII.

Resumo

Os dados combinados dos Exemplos 1-6 demonstram o resultado inesperado de que o OBI-1 comporta-se de forma diferente a 32 partir de HYATE:C no plasma humano e animal. Em particular, os estudos descritos no Exemplo 6 que empregam pacientes humanos estabelecem que o fVIII suíno recombinante (QBI-1) tem de facto muito maior biodisponibilidade do que o fVIII derivado de plasma suíno (HYATE: C) em seres humanos. Este resultado surpreendente é precisamente o oposto do que foi observada com o factor IX, em que o concentrado derivado de plasma tinham significativamente maior recuperação e biodisponibilidade que o produto de factor IX recombinante (Ewenstein et al. Supra). Além disso, a maior biodisponibilidade de OBI-1 em comparação com o HYATE: C também era surpreendente, tendo em conta o relatório Kessler et al. (Haemophilia (2005) 11:84-91), em que o domínio B suprimido do fVIII humano recombinante (Refacto®) foi encontrado ser bioequivalente ao derivado do plasma humano fVIII (Hemofil®M) em vários parâmetros farmacocinéticos medidos num estudo randomizado, cruzado de três vias.

Os resultados de todos os estudos em animais e humanos em conjunto tornam possível conceber novos protocolos para administração de OBI-1, que diferem substancialmente dos métodos convencionais e dosagem utilizados para HYATE:C. Um aspecto da invenção proporciona um novo regime de dosagem para OBI-1, em que OBI-1 pode ser administrado a um paciente em tão pouco como 1/6 da dose da atividade padrão em unidades/kg recomendada para HYATE:C. A dose recomendada para HYATE:C é de 100 Ul/kg de peso corporal em excesso da dose necessária, para neutralizar qualquer anticorpo do paciente para fVIII suíno. O nível de anticorpos de um paciente para o fVIII suíno é diferente para cada indivíduo. A dose de OBI-1 necessária para neutralizar os anticorpos do paciente pode ser calculada a partir da 33 medição do título de anticorpos, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Deste modo, para um dado paciente, pode-se administrar OBI-1 no lugar do HYATE:C com uma dose tão pequena como 10-20 U/kg de peso corporal em excesso da dose neutralizante. Se um paciente com hemotilia A tem um anticorpo inibidor contra o tVIII, exigirá mais OBI para neutralizar os anticorpos inibidores. Uma dose eficaz de OBI-1 pode ser administrada numa fracção do volume de solução necessária para administrar uma dose de HYATE:C, não só porque OBI-1 pode ser preparado de forma mais concentrada, mas também porque uma dose menor de OBI-1 pode originar uma recuperação da atividade comparável à de 2 a 6 vezes maior dose de HYATE:C. Alternativamente, se 100 U/kg de OBI-1 é utilizado como uma dose, os pacientes podem ser tratados com sucesso com muito menos infusões necessárias para interromper uma hemorragia ou intervalos mais longos entre as injeções de OBI-1. Por exemplo, onde HYATE:C, necessita de uma média de oito infusões para travar um único episódio de sangramento durante um período de dois dias, o OBI-1 pode requerer apenas uma infusão, um enorme avanço no tratamento do paciente. Em adição, os episódios de sangramento agudo podem ser tratados com menos e menores doses de OBI-1, em comparação com 8 doses durante 2 dias, a dose média de HYATE:C relatada na sua embalagem. A dosagem O OBI-1 pode provocar um controlo mais rápido da hemorragia e, por conseguinte, é provável que seja mais eficaz e mais seguro do que HYATE:C. É também vantajoso para o conforto do paciente e qualidade de Λ/ida, assim como fornece uma redução do risco de infecçâo e de efeitos secundários de contaminantes. Níveis terapêuticos do fVIII podem ser alcançados mais rapidamente através da infusão do concentrado do produto OBI-1. Outro regime posológico aqui descrito fornece um protocolo terapêutico que inclui uma etapa de medição da recuperação de OBI-1 como: parte do 34 processo para o estabelecimento de uma dose ideal cara um paciente individual. A recuperação de OBI —1 pode ser medida essencialmente como descrito no Exemplo 5, por adição de uma quantidade medida de uma atividade de OBI-I a uma amostra de plasma de um paciente, em seguida, medindo a atividade recuperada a partir da amostra depois de um curto intervalo de tempo. Uma série de tais testes podem estabelecer uma dose de OBI-1 adequada para cada paciente. Em. alternativa, os dados individuais de recuperação podem ser medidos diretamente num doente.

Sempre que um intervalo é dado na especificação, por exemplo, um intervalo de temperatura, um intervalo de tempo, ou uma composição ou intervalo de concentração, todos os intervalos intermédios e sub-intervalos, bem como todos os valores individuais incluídos nas gamas indicadas destinam-se a ser incluídos na divulgação.

Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são indicativas dos níveis de perícia dos peritos na técnica à qual pertence a invenção.

Tal como aqui usado, "compreendendo" é sinónimo de "incluindo", "contendo", ou "caracterizado por" e é inclusivo ou aberto e não exclui, elementos não citados adicionais ou passos do processo. Tal como aqui utilizado, "consistindo em" exclui qualquer elemento, passo, ou ingrediente não especificado na reivindicação. Tal como aqui utilizado, "consistindo essencialmente em" não excliai materiais ou passos que não afectem materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Em cada caso aqui qualquer dos termos "compreendendo", "consistindo 35 essencialmente em" e "consistindo em" podem ser substituídos com qualquer um dos outros dois termos. A invenção descrita aqui de forma ilustrativa pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente aqui reveladas.

Um perito na técnica vai apreciar que os materiais de partida, reagentes, substratos sólidos, métodos de síntese, métodos de purificação, e outros métodos de análise que não os especificamente exemplificados podem ser empregues na prática da invenção sem recurso a experimentação indevida. Os termos e expressões que foram empregues são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que, quaisquer descritas possíveis o uso de tais termos e expressões, de excluir equivalentes das características mostradas e ou sua )orções, mas é reconhecido que são várias modificações dentro do escopo da invenção reivindicada. 36

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Combinação do factor VIII suíno tendo o domínio B suprimido excepto por 12 aminoácidos na parte do terminal. N do domínio B e os 12 aminoácidos na parte do terminal C. do domínio B (OBI-1) e um transportador fisiologicamente aceitável para utilização no tratamento de um paciente tendo uma deficiência de factor VIII, em que o OBI-1 é administrado uma vez por uma única injeção intravenosa de 10-100 unidades/kg de peso do corpo ± 10 %, du rante um período de 5-15 minutos , a fim de parar um sangramento.
Combinação para utilização no tratamen to de um doente possuindo defici .ência do factor VIII, de acordo com a r e i v i ndi cação 1, em que a dose de OBI-1 é d .e 10-50% ± 10 Unidades/kg de peso corporal do referido paciente.
3. Combinação piara utilização no tratamento de um doente possuindo deficiência do factor VIII, de acordo com a reivindicação 2, em que a dose de OBI-1 é de 15 ± 10% Unidades/kg de peso corporal do referido paciente.
4. Combinação para utilização no tratamento de um doente possuindo deficiência do factor VIII, tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o doente está no estado de hemorragia.