PT1623019E - ALIMENTAÆO COM GLUCOSE DE MODO LIMITADO PARA CULTURA DE CéLULAS ANIMAIS - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ALIMENTAÇÃO COM GLUCOSE DE MODO LIMITADO PARA CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS"

PEDIDOS ANTERIORES RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório U.S. N° de Série 60/470937, apresentado a 15 de Maio de 2003, que é aqui incorporado, por referência, na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A invenção refere-se a um método para melhorar a produção de proteínas por células animais em cultura. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método para controlar a produção de ácido láctico para níveis baixos, por células animais em cultura (de um modo preferido, células de mamíferos) numa cultura celular em modo semi-contínuo. Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona métodos para manter a produção de lactato em níveis baixos por células em cultura, através da utilização de sistemas de distribuição de glucose que não se baseiam na recolha de amostras de culturas a intervalos regulares. Em particular, a invenção refere-se à cultura de células animais sob condições em que a glucose é alimentada à cultura ou ao seu interior, de um modo limitado, e. g., a uma velocidade que é 1 resultante de uma velocidade esperada ou pré-calculada de consumo de glucose pelas células animais, quando são expostas a um meio contendo um nível elevado de glucose. Em associação com esta alimentação limitada, a produção de ácido láctico, pelas células em cultura, é controlada para um nível reduzido durante a cultura. Como um resultado final, é aumentada a produção de proteína recombinante pelas células em cultura, por exemplo, de modo a facilitar a produção à escala comercial. Técnica Anterior Relacionada

Uma grande quantidade de produtos biotecnológicos, disponíveis comercialmente ou apenas em desenvolvimento, são proteínas terapêuticas. Além disso, a maquinaria celular de uma célula animal (versus uma célula bacteriana), é normalmente necessária, de modo a que sejam produzidas muitas formas de proteínas terapêuticas (tais como proteínas glicosiladas ou anticorpos monoclonais (MAb) produzidos por hibridoma). Consequentemente, existe uma necessidade crescente para a produção destas proteínas em culturas de células animais.

No entanto, em comparação com culturas de células bacterianas, as culturas de células animais têm baixas velocidades de produção e, tipicamente, geram rendimentos de produção reduzidos. Verificou-se que mantendo as concentrações de glucose no meio de cultura celular a baixas concentrações (e. g., entre 0,02 e 1,0 g/L (e. g., entre 0,11 e 5,5 mM) ) e cultivando as células numa fase de produção a uma osmolalidade de cerca de 400 a 600 mOsm, aumenta a produção de proteínas recombinantes por culturas de células animais, particularmente após uma cultura inicial numa osmolalidade de cerca de 280 a 2 330 mOsm (Patente U.S. N° 5856179; cada patente U.S. citada neste documento está incorporada por referência na sua totalidade) e em que a cultura em todas as fases é também a uma concentração de glutamina seleccionada (de um modo preferido, entre cerca de 0,2 a cerca de 2 mM, Patente U.S. N° 6180401) .

Algum deste aumento na produção de proteínas recombinantes pode resultar de uma redução na produção de lactato que ocorre quando as concentrações de glucose no meio de cultura são mantidas a níveis reduzidos. O lactato é conhecido como sendo um forte inibidor do crescimento celular e produção de proteína e mantendo concentrações de glucose baixas no meio de cultura pode resultar em níveis reduzidos de produção de lactato (Glacken et al. (1986) Biotechnol. Bioeng. 28: 1376-89; Kurokawa et al. (1994) Biotechnol. Bioeng. 44: 95-103; Patente U. S. N° 6156570). Consequentemente, dependendo de outras condições de cultura, manter as concentrações de glucose a níveis reduzidos relativamente à concentração celular é um factor que pode contribuir para níveis mais reduzidos de produção de lactato e, assim, a concentrações celulares mais elevadas e produção aumentada de proteínas recombinantes em culturas de células animais.

Quando as células são expostas a concentração baixa de glucose num meio, o seu metabolismo é alterado de tal modo que a velocidade de absorção de glucose e velocidade de produção de lactato são mais baixas em comparação com células mantidas em processos semi-contínuos, com meio com elevados níveis de glucose no início do processo (Patente U.S. N° 6156570). Além disso, a duração da cultura em modo semi-contínuo pode ser prolongada. Consequentemente, a velocidade de crescimento celular e a velocidade de produção proteica podem ser mantidas 3 durante um período de tempo mais longo em comparação com culturas em modo semi-contínuo de controlo nas quais as células crescem em meio que proporciona elevados níveis de produção de lactato (e. g., meio contendo níveis elevados de glucose no início do período de cultura).

Um modo de controlar a produção de lactato por células em cultura para níveis reduzidos é através de uma velocidade constante invariável de alimentação de glucose num processo semi-contínuo (Ljunggren and Hággstrõm (1994) Biotechnol. Bioeng 44: 8Q8-18 ; Hággstrõm et al. (1996) Annals N. Y. Acad. Sei. 782: 40-52). Embora esta velocidade constante invariável de alimentação de glucose num processo semi-contínuo possa ajudar a controlar a produção a níveis reduzidos de ácido láctico em células em cultura, não são obtidas concentrações celulares, velocidades de crescimento, níveis de viabilidade celular e velocidades de produção proteica máximas, porque este método de fornecer glucose resulta, tipicamente, em privação de glucose à medida que as concentrações celulares aumentam.

Outro modo de controlar a produção de lactato para níveis reduzidos em células em cultura é através da utilização de sistemas de distribuição de glucose que se baseiam na recolha de amostras da cultura em intervalos regulares. As amostras são recolhidas de uma cultura a intervalos regulares e, após ser determinada a concentração de glucose nas amostras (e. g., através de análise de injecção de fluxo, como por Male et al. (1997) Biotechnol. Bioeng. 55: 497-504 ou Siegwart et al. (1999) Biotechnol. Prog 15: 608-16; ou através de cromatografia líquida de elevada pressão, como por Kurokawa et al. (1994) Biotechnol. Bioeng. 44: 95-103), são adicionadas quantidades definidas de glucose às culturas, de modo a manter as concentrações de 4 glucose no meio, num nível constante reduzido, relativamente à concentração celular. No entanto, as células podem-se adaptar a uma concentração reduzida de glucose através, por exemplo, do aumento da sua capacidade para absorver glucose e, assim, produzir quantidades excessivas de ácido láctico, apesar da concentração reduzida de glucose. 0 documento WO 2004/048556 Al, que é um documento da técnica anterior conforme o Art. 54(3) EPC, divulga um método para controlar a produção de ácido láctico para níveis reduzidos numa cultura celular semi-contínua ao alimentar, de um modo limitado, glucose à cultura celular.

Além disso, o risco de contaminação com microrganismos através de tais métodos de controlo de informação baseados na recolha de amostras, é significativo. Consequentemente, não é surpreendente que a utilização destes métodos para a produção comercial de proteínas recombinantes em culturas de células animais não tenha ainda sido demonstrado ser possível. Os métodos de controlo de informação baseados na recolha de amostras para manter níveis reduzidos de concentração de glucose em meio de cultura celular têm sido limitados a utilizações em investigação desde o tempo em que foi publicado o primeiro artigo relativo a tais métodos (Glacken et al., supra); o artigo indica que as concentrações de glucose no meio de cultura foram determinadas utilizando um analisador automático em linha, em que uma amostra contendo glucose foi misturada com o-toluidina e um colorímetro, através do qual foi medida a absorvência da mistura a 600 nm, para determinar a concentração de glucose. 5

Pelos motivos anteriores, existe uma necessidade de métodos alternativos para controlar a produção de lactato para níveis reduzidos por células em cultura em meio de cultura.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para a alimentação limitada de glucose a culturas de células animais ou no seu interior em processos semi-contínuos. Em associação com esta alimentação limitada, a produção de lactato pelas células em cultura pode ser controlada para níveis reduzidos sem necessitar de alimentação a velocidade constante de glucose. Em algumas formas de realização, a produção de lactato pelas células em cultura, pode ser controlada para níveis reduzidos sem necessitar de recolha de amostras das culturas a intervalos regulares para a determinação da concentração de glucose num método de controlo de informação. Em particular, a presente invenção proporciona uma solução para uma necessidade há muito sentida de um método de controlar, de um modo flexível, a produção de lactato para níveis reduzidos, por células em cultura, de modo a promover a produção aumentada de proteínas recombinantes em culturas de células animais, especialmente, para produção à escala comercial. A presente invenção refere-se a um método de cultura de células animais em condições em que a glucose é fornecida a culturas de células, de um modo limitado, (i. e., alimentação limitada), o que resulta em níveis de lactato reduzidos a ser produzidos pelas células em cultura. Esta alimentação limitada ou lenta é efectuada através da alimentação contínua ou intermitente de glucose a culturas de células, a velocidades que são inferiores (i. e., uma função de) às velocidades esperadas 6 ou pré-calculadas de consumo de glucose pelas células animais expostas a um meio contendo um elevado nivel de glucose. Em particular, a invenção refere-se a um método de aumentar a produção de proteínas em culturas de células animais, controlando a produção de lactato a níveis reduzidos através da alimentação limitada de glicose.

Embora algumas formas de realização da invenção possam utilizar controlo de informação baseado na recolha de amostras, outras formas de realização da invenção não necessitam de controlo de informação baseado na recolha de amostras. Por exemplo, as estimativas das capacidades esperadas para as velocidades de consumo de glucose pelas células animais em cultura podem ser aumentadas pelas medições de concentração de células, que, em algumas formas de realização, são efectuadas sem recolha de amostras (e. g., efectuada fotometricamente). Com base nas medições de concentração de células, as velocidades de distribuição de glucose para as culturas de células podem ser calculadas (em tempo real, se desejado) para a alimentação limitada de glucose às culturas de células, i. e., a uma velocidade inferior a 100% de uma velocidade esperada ou pré-calculada de consumo de glucose pelas células animais numa cultura correspondente, com condições de cultura muito semelhantes mas em que a concentração de glucose, em vez de estar a um nível limitado, é tal que qualquer aumento nesta concentração não irá afectar a velocidade de consumo de glucose pelas células. Como demonstrado nas formas de realização da invenção, a alimentação limitada de glucose permite que a produção de ácido láctico pelas células em cultura seja controlada para níveis reduzidos. 7

Nalgumas formas de realização da invenção, a monitorização do pH é incluída como um método suplementar para estimar o consumo de lactato e proteger as células em cultura contra a privação de glucose. A monitorização do pH tira partido do facto de que as células irão consumir lactato da cultura caso não esteja disponível glucose. Um aumento no pH da cultura ocorre à medida que as células consomem lactato, deste modo um aumento no pH pode indicar que a glucose não está disponível na cultura celular (i. e., que as células estão privadas de glucose). Consequentemente, nalgumas formas de realização da invenção, uma estratégia de alimentação que proporcione uma adição de um bólus de glucose e/ou aumente a velocidade de alimentação limitada de glucose após um aumento no pH, pode proteger as células da privação devido à necessidade de glucose. Nalgumas formas de realização, as medições de pH são efectuadas sem "recolha de amostras" (e. g., as medições de pH são efectuadas através da utilização in situ de um sensor de pH para o qual são retiradas alíquotas da cultura, não contendo células, de modo a medir o pH) .

Em particular, a invenção proporciona um método de cultura celular para controlar a produção de ácido láctico para níveis reduzidos, numa cultura celular em modo semi-contínuo, compreendendo: misturar as células animais e um meio para formar uma cultura celular; e alimentar com glucose, de um modo limitado, a cultura celular. A alimentação limitada de glucose ocorre quando a glucose é proporcionada a uma velocidade que é uma função de uma velocidade esperada de consumo de glucose pelas células animais quando expostas a um meio contendo um nível elevado de glucose. A função é a multiplicação por uma percentagem inferior a 100%, incluindo, mas não limitada a percentagens tais como, pelo menos, 33%, ou não mais que 45%, de uma velocidade esperada. Noutras formas de realização relacionadas, a alimentação limitada de glucose para a cultura celular é efectuada sem recolha de amostras de controlo de informação durante a cultura.

Nalgumas formas de realização da invenção, é utilizado um sensor de concentração de células para monitorizar a concentração de células na cultura celular e uma medição derivada do sensor da concentração de células é adicionalmente utilizada no cálculo da velocidade à qual a glucose será alimentada, de um modo limitado, à cultura celular. Noutras formas de realização, é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da cultura celular e, em resposta a um aumento no pH acima de um valor predeterminado (e. g., aproximadamente, 7), é adicionada glucose à cultura celular (e. g., numa adição em bólus de glucose e/ou a uma nova velocidade de adição de glucose, de um modo limitado, que é superior a uma velocidade de adição de glucose imediatamente anterior; nalgumas formas de realização, uma nova velocidade pode ser, pelo menos, 15% ou não mais do que 50% superior a uma velocidade imediatamente anterior, desde que tal nova velocidade não atinja ou exceda 100% da velocidade esperada de consumo de glucose pelas células de controlo expostas a um nivel elevado de glucose). Noutras formas de realização, pode ser utilizado um sistema baseado num sensor de concentração celular, em conjunto com um sistema baseado num sensor de pH, na determinação da velocidade de alimentação de glucose, de um modo limitado, à cultura celular. Pode ser utilizado o sistema baseado num sensor de concentração celular ou o sistema baseado num sensor de pH, ou ambos, sem "amostragem" da cultura celular. 9

Outra forma de realização do método da invenção proporciona um método de cultura celular para controlar a produção de ácido láctico para níveis reduzidos, numa cultura celular em modo semi-contínuo, compreendendo: (a) misturar células animais e um meio contendo um nível elevado de glucose, para formar uma primeira cultura celular; (b) determinar uma velocidade de consumo de glucose (i. e., uma velocidade pré-calculada) para as células animais cultivadas numa primeira cultura celular; (c) misturar células animais e um meio para formar uma segunda cultura celular; e (d) adicionar glucose, de um modo limitado, na segunda cultura celular, a uma velocidade que é uma função da velocidade de consumo de glucose determinada do passo (b) (i. e., uma função da velocidade pré-calculada do consumo de glucose). Em formas de realização relacionadas, a função é multiplicação por uma percentagem inferior a 100%, tal como, pelo menos, 33%, ou não mais do que 45% da velocidade de consumo de glucose determinada (i. e., velocidade pré-calculada).

Noutras formas de realização relacionadas, a alimentação limitada de glucose para a segunda cultura celular é efectuada sem amostragem de controlo de informação da segunda cultura celular.

Nalgumas formas de realização da invenção, é utilizado um sensor de concentração de células para monitorizar a concentração de células numa segunda cultura celular, em que é utilizada, adicionalmente, uma medição derivada do sensor de concentração celular no cálculo da velocidade de alimentação de glucose, de um modo limitado, para a segunda cultura celular. Noutras formas de realização, é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da segunda cultura celular e, em resposta a um aumento no pH acima de um valor predeterminado (e. g., aproximadamente, 7), é adicionada glucose à segunda cultura 10 celular (e. g., num bólus de glucose para alimentação e/ou a uma nova velocidade de alimentação de glucose, de um modo limitado, gue é superior a uma velocidade de adição de glucose imediatamente anterior; nalgumas formas de realização, uma nova velocidade pode ser, pelo menos, 15% ou não mais do que 50% superior a uma velocidade imediatamente anterior). Noutras formas de realização, pode ser utilizado um sistema baseado num sensor de concentração celular, em conjunto com um sistema baseado num sensor de pH, na determinação da velocidade de alimentação de glucose, de um modo limitado, à segunda cultura celular. Pode ser utilizado o sistema baseado num sensor de concentração celular ou o sistema baseado num sensor de pH, ou ambos, sem "amostragem" da segunda cultura celular.

No método da invenção, as células são adaptadas para crescer sob condições de cultura em que a glucose é adicionada, a culturas celulares de teste, a velocidades que são limitadas em comparação com as velocidades de consumo de glucose, sob condições de cultura de controlo (e. g., em que a concentração de glucose é tal que qualquer aumento na concentração não irá afectar a velocidade de consumo de glucose pelas células animais). Em particular, as células das duas culturas celulares com alimentação limitada exemplificadas (diferindo nas velocidades às quais a glucose foi adicionada, de um modo limitado, às culturas), produziram niveis inferiores de lactato relativamente aos produzidos pelas culturas celulares de controlo. Apresentaram também diferentes velocidades de crescimento e velocidades de produção de proteína recombinante. As culturas com alimentação limitada "de declive baixo" apresentaram níveis inferiores de produção de lactato aos das culturas com alimentação limitada "de declive elevado". As culturas com alimentação limitada "de declive baixo" 11 apresentaram também velocidades de crescimento superiores e velocidades de produção de proteína recombinante superiores às das culturas com alimentação limitada "de declive elevado". No geral, tanto as culturas com alimentação limitada de declive baixo como as culturas com alimentação limitada de declive elevado, apresentaram velocidades de produção de lactato inferiores, velocidades de crescimento superiores e velocidades superiores de produção de proteína recombinante às das culturas de controlo.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes da seguinte descrição das suas formas de realização preferidas e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1. Controlo: vs Alimentação de Glucose Limitada: Curva de Melhor Ajuste FIG. 2. Glucose Acumulada: Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado FIG. 3. Glucose Acumulada: Controlo vs. Alimentação

Pré-Calculada FIG. 4. Concentração Celular: Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado FIG. 5. Título BMP-2 (Normalizado): Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado 12 FIG. 6. Concentrações de Glucose & Lactato: Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado FIG. 7. Concentração Celular: Controlo vs Alimentação Pré-Calculada FIG. 8. Titulo BMP-2 (Normalizado): Controlo vs. Alimentação Pré-Calculada FIG. 9. Concentrações de Glucose & Lactato: Controlo vs. Alimentação Pré-Calculada

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições: A frase "células animais" engloba células de invertebrados, vertebrados não mamíferos (e. g., aves, repteis e anfíbios) e mamíferos. Exemplos não limitantes de células de invertebrados incluem as seguintes células de insectos: Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori (bicho da seda/traça da seda). As células de mamíferos preferidas incluem células de rim de hamster bebé (BHK), de ovário de hamster Chinês (CHO), de rim humano (293), diplóides fetais de macaco Rhesus normais (FRhL-2) e de mieloma murino (e. g., SP2/0 e NSO). A frase "meio de inoculação base" refere-se a uma solução ou substância contendo nutrientes, mas não glucose, na qual é iniciada uma cultura de células. 0 "meio de alimentação base" contém os mesmo nutrientes que o meio de inoculação base, mas é 13 uma solução ou substância com a qual a cultura de células é alimentada após o inicio da cultura.

Uma "cultura em modo contínuo" refere-se a uma cultura de células na qual as células recebem meio de inoculação base contendo glucose no início da cultura e, na qual, a cultura celular proporciona produto, e. g., proteína recombinante, apenas no fim da cultura. De um modo semelhante, uma "cultura em modo semi-contínuo" de células proporciona o produto apenas no seu momento final. No entanto, as células numa cultura em modo semi-contínuo recebem meio de inoculação base contendo glucose no início da cultura e são alimentadas com meio de alimentação base contendo glucose num ou mais momentos após o início da cultura, mas antes do fim. "Níveis elevados de glucose" significam uma concentração de glucose em culturas de células animais, nas quais qualquer aumento na concentração de glucose não irá afectar a velocidade de consumo de glucose das células.

Uma "velocidade de consumo de glucose" reflecte o consumo de glucose pelas células animais em cultura num ponto temporal. As velocidades de consumo de glucose podem ser representadas graficamente (como na curva "de melhor ajuste" superior da FIG. 1) ou através de uma função matemática (como na legenda da FIG 1). A "alimentação com glucose, de um modo limitado" e/ou "alimentação limitada de glucose" e/ou "glucose é alimentada, de um modo limitado" e/ou frases semelhantes referem-se a proporcionar uma quantidade limitada de glucose a uma cultura, tal que a quantidade limitada proporcionada é determinada ou 14 calculada por uma função e é inferior a 100% da quantidade de glucose esperada ou determinada a ser consumida por uma cultura de controlo. Uma "cultura de controlo" significa uma cultura das mesmas células animais sob condições de cultura semelhantes (e. g., uma cultura das mesmas células numa base de inoculação e meio de alimentação semelhante, à mesma temperatura, começando com a mesma concentração celular inicial, etc.) excepto que a cultura tem um nivel elevado de glucose. Deste modo, a função pela qual a quantidade limitada de glucose proporcionada pode ser determinada ou calculada pode ser uma função de uma velocidade esperada de consumo de glucose ou uma função de uma velocidade de consumo de glucose determinada, pelas células numa cultura de controlo. A alimentação de glucose, de um modo limitado, pode ocorrer ao proporcionar a glucose a uma determinada concentração ou concentrações ao longo de um período de tempo, i. e., a uma determinada velocidade ou velocidades, e/ou ao proporcionar a glucose por um ou mais bólus de alimentação de glucose.

As frases "função de uma velocidade esperada de consumo de glucose" ou "função de uma velocidade de consumo de glucose determinada" (onde a velocidade de consumo de glucose determinada é uma velocidade pré-calculada) podem incluir várias relações matemáticas entre uma velocidade de consumo de glucose esperada ou pré-calculada e uma velocidade de alimentação limitada de glucose (ou velocidade limitada de adição de glucose), incluindo relações em que a velocidade de alimentação de glucose é o produto de (i. e., o resultado de multiplicação de) (1) uma velocidade pré-calculada ou esperada de consumo de glucose num momento específico durante a duração da cultura celular e (2) um valor percentual inferior a 100%. As funções quadráticas, cúbicas e exponenciais estão também entre as muitas 15 relações matemáticas englobadas pela invenção. No entanto, as funções aplicáveis no âmbito da invenção não incluem aquelas em que a velocidade de alimentação limitada de glucose é uma adição invariável da velocidade constante durante a duração da cultura celular. 0 "nível reduzido de ácido láctico" (ou "nível reduzido de lactato") numa cultura celular refere-se a uma concentração de ácido láctico (ou lactato) que é inferior às concentrações de ácido láctico (ou lactato) encontradas em células cultivadas com um nível elevado de glucose. A " recolha de amostras" inclui a recolha de amostras contendo células de culturas de células animais (e. g., num bioreactor) com o objectivo de medir características do meio de cultura. A "recolha de amostras" não inclui medições de concentração celular, em que amostras ou alíquotas não contendo células são removidas ou separadas da cultura como o objectivo de medir a concentração celular. Por exemplo, as estimativas baseadas em fotometria da concentração celular podem ser efectuadas sem "recolha de amostras" de uma cultura mantida num recipiente transparente ou translúcido. Além disso, a "recolha de amostras" não inclui a utilização in situ de um sensor de pH para medir o pH de um meio no qual as células animais são cultivadas, em que as amostras ou alíquotas não contendo células são removidas da cultura com o objectivo de medir o pH. A utilização de uma sonda para medir o pH de um meio de cultura celular não é "recolha de amostras", como aqui definido, se as amostras ou alíquotas não contendo células forem removidas ou separadas da cultura. 16

Após convenção prolongada, os termos "um" e "uma" significam "um ou mais" quando utilizados neste pedido, incluindo as reivindicações. Embora a invenção tenha sido descrita com um certo nível de particularidade, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os especialistas na técnica tendo em consideração a divulgação. Consequentemente, pretende-se que todas estas alternativas, modificações e variações, que estão englobadas no espírito e âmbito da invenção, estejam englobadas pelas reivindicações definidas. A presente invenção refere-se a um método de cultura de células animais, tal que as culturas mantêm níveis reduzidos de ácido láctico, resultam em viabilidade celular aumentada durante um período de tempo mais longo e produzem níveis elevados de proteína recombinante. Um especialista na técnica irá reconhecer que o método aqui divulgado pode ser utilizado para cultura de muitas das células animais bem conhecidas, normalmente utilizadas e cultivadas na técnica, i. e., o método aqui divulgado não está limitado à utilização apenas com as células animais listadas no âmbito da definição de células animais. 0 método da invenção refere-se a alimentação de glucose, de um modo limitado, a uma cultura de células animais. Como também descrito em detalhe no Exemplo 2, a alimentação de glucose, de um modo limitado, pode ocorrer ao proporcionar a glucose a uma velocidade que é uma função de uma velocidade de consumo de glucose esperada ou determinada (e. g., uma velocidade pré-calculada de consumo de glucose) por células animais numa cultura de controlo, e. g., células cultivadas com um nível elevado de glucose. A alimentação de glucose, de um modo 17 limitado, pode também incluir proporcionar um ou mais bólus de glucose.

As condições da cultura de controlo podem ser determinadas por um especialista na técnica sem experimentação indevida. Por exemplo, um especialista na técnica entende que as células animais são normalmente cultivadas num "meio", que se refere, geralmente, a uma solução compreendendo nutrientes, incluindo glucose. Como tal, um especialista na técnica saberá que a glucose pode ser adicionada ao meio de inoculação e alimentação base, antes da inoculação e alimentação das células animais, respectivamente. Será evidente que a quantidade de glucose adicionada ao meio de inoculação base e meio de alimentação base podem diferir. Adicionalmente, um especialista na técnica irá reconhecer que o meio é apropriado para cultivar uma célula animal particular (e. g., células CHO) e a quantidade de glucose que o meio deve conter para gerar culturas de células animais, tal que existe um nivel elevado de glucose (ver, e. g., Mather, J. P., et al. (1999) "Culture media, animal cells, large scale production. "Encyclopedia of Bioprocess Technology:

Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. Vol. 2: 777-785).

Por outras palavras, um especialista na técnica irá reconhecer a concentração de glucose na qual uma célula particular deve ser cultivada, tal que qualquer aumento na concentração de glucose da cultura não irá afectar a velocidade de consumo de glucose da célula. Um nivel elevado de glucose numa cultura celular é para ser distinguido de um nivel elevado de glucose adicionado ao meio de inoculação base e meio de alimentação base; a concentração de glucose neste último (e. g., a 44200 ou 280 g/L) é normalmente diluída após adição a uma cultura celular. 18

Um especialista na técnica irá reconhecer adicionalmente que a concentração óptima de outros nutrientes (e. g., glutamina, ferro, Elementos vestigiais D) ou agentes concebidos para controlar outras variáveis da cultura (e. g., a quantidade de espuma e osmolalidade) irá variar dependendo da célula animal. Como tal, na técnica é rotina o ajuste das concentrações de tais nutrientes ou agentes no meio de inoculação base e meio de alimentação base. Além disso, um especialista na técnica irá reconhecer a que temperatura e concentração uma célula particular deve ser cultivada.

Nalgumas formas de realização da invenção, a concentração celular e/ou pH da cultura é monitorizada e utilizada no cálculo da velocidade de alimentação limitada de glucose. Os métodos de medição da concentração celular e/ou pH de uma cultura são bem conhecidos na técnica; tais métodos incluem, mas não estão limitados a, utilizar um instrumento Cedex (innovais GmbH, Bielefeld, Alemanha) e/ou CASY (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Alemanha) para determinar a concentração celular e/ou um sensor de pH. São particularmente úteis para a invenção reivindicada os métodos de determinação da concentração celular e pH que não requerem a recolha de amostras, i. e., recolha de amostras contendo células da cultura animal, incluindo, mas não limitados a, utilização de uma sonda de capacitância, sonda de densidade óptica e/ou uma sonda de turbidez para determinar a concentração celular e/ou uma sonda potenciométrica ou corantes sensíveis ao pH para medir o pH.

Nalgumas formas de realização da invenção, uma determinação derivada da concentração celular e/ou uma determinação derivada do sensor de pH, determina que a alimentação de glucose, de um modo limitado, deve, subsequentemente, continuar numa nova 19 velocidade que é superior a uma velocidade imediatamente anterior. Um especialista na técnica irá reconhecer que a nova velocidade à qual a glucose é adicionada, de um modo limitado, deve ainda ser inferior a 100% de uma velocidade de consumo de glucose esperada ou determinada. Deste modo, quando a velocidade imediatamente anterior é, e. g., 99% de uma velocidade de consumo de glucose esperada ou determinada, a nova velocidade não deve aumentar em mais do que 1% da velocidade imediatamente anterior. Noutras formas de realização, a nova velocidade é aumentada em 1-15% da velocidade imediatamente anterior. Nalgumas formas de realização da invenção, a nova velocidade é aumentada em, pelo menos, 15% da velocidade imediatamente anterior. Noutras formas de realização da invenção, a nova velocidade é aumentada em não mais que 50% da velocidade imediatamente anterior. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Meio

Exemplo 1.1: Meio de Inoculação O meio de inoculação base foi formulado para incluir os mesmos componentes que o Meio DMEM/F12, mas com os seguintes componentes a serem adicionados: sulfato de dextrano 200 mg/L (Patente U.S. N° 5318898 descreve a utilização de sulfato de dextrano em meio de cultura) , Nucelina 10 mg/L (um análogo de insulina humano com origem em ADN recombinante; Eli Lilly (Indianapolis, IN)) e álcool polivínilico (PVA) 2,4 g/L. O meio 20 de inoculação base preparado para estas experiências não tem glucose. Para o meio de inoculação de controlo foi adicionada glucose, aproximadamente 10 g/L ao meio de inoculação base antes da inoculação. Para o meio de inoculação utilizado nas culturas com alimentação limitada de glucose foram adicionados, aproximadamente 0,8 g/L de glucose e 1,3 g/L de NaCl ao meio de inoculação base; o NaCl foi adicionado de modo a que a osmolalidade inicial do meio de inoculação utilizado nas culturas com alimentação limitada de glucose fosse semelhante à osmolalidade inicial do meio de inoculação de controlo.

Exemplo 1.2: Meio de Alimentação O meio de alimentação base foi formulado para consistir nos mesmos componentes que o meio de inoculação base do Meio DMEM/F12; o meio de alimentação base formulado para estas experiências não apresenta glucose. Para o meio de alimentação de controlo, foram adicionadas cerca de 44 g/L de glucose ao meio de alimentação base. EXEMPLO 2

Estabelecer as Velocidades de Adição de Glucose

Uma abordagem para estabelecer as velocidades de adição de glucose, para culturas com alimentação limitada de glucose, envolve analisar as velocidades de consumo de glucose por células CHO, através de uma cultura típica de controlo em modo semi-contínuo. A concentração de glucose, numa cultura de controlo típica, começou num nível elevado (e. g., cerca de 21 10 g/L) e diminuiu, de modo regular, durante o normal crescimento exponencial; as adições de glucose foram efectuada após o Dia 3. Para estas culturas de controlo, o suplemento com glucose é necessário para prevenir a diminuição de glucose (e. g., ver perfil de concentração de glucose para cultura de controlo na FIG. 9).

As concentrações de glucose foram determinadas para as culturas de controlo utilizando métodos baseados na recolha de amostras, em que as amostras foram recolhidas a vários pontos no tempo após inoculação e foram determinadas as concentrações de glucose das amostras. As amostras foram recolhidas diariamente e foram analisadas utilizando o Analisador Bioprofile 100 (Nova Biomedical Corp., Waltham, MA) , que mede as concentrações de glucose, lactato, glutamina < e amónio. As concentrações de glucose de algumas amostras foram também estimadas utilizando um kit de glucose HK (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO ; Cat. N° GAHK-2 0) .

Nesta abordagem baseada na recolha de amostras, a velocidade de glucose consumida durante a fase de crescimento exponencial a partir do meio de culturas de controlo foi representada graficamente versus o tempo em incrementos de horas e dias. Foi, depois, gerada uma curva de melhor ajuste exponencial (i. e., y = a-ebx) utilizando estes pontos (para a curva de melhor ajuste da FIG. 1, por exemplo, a = 2,058 e b = 0,0064). A partir desta curva, foram extrapoladas as velocidades de consumo de glucose (g/L/h) para proporcionar quantidade de alimentação de glucose limitada de declive baixo e de declive elevado a qualquer ponto de tempo considerado. Para as culturas de alimentação limitada de declive baixo, os valores do gráfico da curva de melhor ajuste de controlo foram multiplicados por 33% para estimar as 22 velocidades às quais a glucose deve ser fornecida às culturas de alimentação limitada de declive baixo (ver os triângulos sólidos "de declive baixo" da FIG. 1). De um modo semelhante, os valores do gráfico da curva de melhor ajuste de controlo foram multiplicados por 45% para estimar as velocidades às quais a glucose deve ser fornecida às culturas de alimentação limitada de declive elevado (ver os quadrados sólidos "de declive elevado" da FIG. 1). Os multiplicadores 33% e 45% foram escolhidos arbitrariamente. Todos os multiplicadores com percentagens inferiores a 100% ou funções, relacionando a velocidade de alimentação de glucose limitada a uma velocidade de consumo de glucose esperada ou pré-calculada, em que uma velocidade de alimentação de glucose limitada calculada é inferior a uma velocidade de consumo de glucose esperada ou pré-calculada, estão no âmbito da invenção (excepto que as funções permissiveis não incluem as relações em que velocidade de adição de glucose resultante é uma velocidade de adição constante invariável ao longo da duração da cultura celular).

Outra abordagem para alimentar glucose, de um modo limitado, envolve utilizar um sistema de resposta controlado por pH num sistema de cultura com alimentação limitada de glucose programada. Quando uma cultura de células de mamíferos (tal como células CHO) é privada de glucose, as células em cultura começam a consumir lactato como uma fonte de energia de hidratos de carbono alternativa. A diminuição na concentração de lactato na cultura celular resulta num aumento no pH (ao qual reage o sistema de resposta controlado por pH) .

Ao implementar esta abordagem, uma bomba de seringa de uma solução de glucose foi programada para distribuir glucose a uma velocidade limitada (e. g., 0, 032 g/L/h; ver velocidade de 23 adição "de declive baixo" inicial da Tabela 2) excepto que, quando o pH do meio de cultura aumentou em 0,02 unidade de pH acima de um valor predeterminado de 7,00, foi accionada a distribuição de um bólus de alimentação de glucose (0,05 a 0,2 g de glucose distribuída pelo meio de alimentação por litro de cultura) e, além disso, a velocidade de distribuição limitada pela bomba de seringa foi subsequentemente aumentada para um nível 15% a 50% superior à velocidade de distribuição limitada anterior. Por exemplo, a distribuição de um bólus de 0,25 a 1,0 mL de meio de alimentação contendo 0,2 g/mL de glucose proporciona a uma cultura celular com 1 L, aproximadamente, 0,05 a 0,2 g de glucose.

Noutra abordagem, a concentração celular de uma cultura celular é medida sem recolha de amostras de modo a ajudar nos cálculos das velocidades de alimentação limitada de glucose. Ao iniciar os testes desta abordagem, a glucose foi adicionada à cultura de modo a que concentração de glucose permanece-se num nível considerado como sendo adequado para a concentração celular na cultura. Foi utilizado um espectrofotómetro Wedgewood (Monitor de Absorvância 653 com Sensor da Série Insertion Modelo BT65, Wedgewood Technology Inc., San Carlos, CA) para estimar a concentração celular em culturas em tempo real. Alternativamente, pode ser utilizada uma sonda laser de turbidez (e. g., Modelo LA-300LT, ASR Co., Ltd., Tóquio) para estimar a concentração celular. Um feixe laser da sonda laser de turbidez é emitida através da cultura celular a partir fonte de luz da sonda e é utilizada uma curva de calibração para converter os valores de densidade óptica em concentrações celulares. Embora as propriedades de absorção de luz das células não sejam constantes e a distribuição de tamanhos das células mudem durante o cultivo, Zhou e Hu ((1994) Biotechnol. Bioeng. 44: 170-77) descobriram que a concentração celular total de uma linha celular de hibridoma murganho-murganho, MAK, estava correlacionada, de um modo linear, com o sinal de uma sonda laser de turbidez para concentrações celulares inferiores a 3,0xl09 células/litro. Consequentemente, as medições espectrofotométricas da concentração celular podem ser efectuadas (sem recolha de amostras) de modo a ajudar no cálculo das velocidades de alimentação limitada de glucose.

Outra abordagem combina um sistema de resposta baseado em sensor de pH e um sistema derivado da concentração celular com a utilização de um programa de alimentação de declive elevado (programado para se aproximar das necessidades de glucose esperadas de uma cultura celular ao longo do tempo). Tanto o sistema de resposta baseado em sensor de pH como o sistema derivado de concentração celular ou ambos podem ser utilizados sem recolha de amostras da cultura celular. A utilização de uma sonda com sensor de glucose para medir directamente a concentração de glucose (e não apenas como um reflexo das medições de pH ou concentração celular) em tempo real (e de um modo que não necessita de recolha de amostras de uma cultura) não é necessária para praticar a invenção, particularmente, porque a invenção proporciona velocidades limitadas de distribuição de glucose a culturas de células animais, em vez de simplesmente manter uma concentração reduzida de glucose na cultura, para superar a capacidade das células para se adaptaram a uma concentração reduzida de glucose. No entanto, a utilização de um sensor de glucose na prática dos métodos divulgados pode estar no âmbito da presente invenção. 25 EXEMPLO 3

Produção de BMP-2 em Células CHO O objectivo destas experiências foi implementar as estratégias de alimentação limitada de glucose de modo a controlar a produção de lactato a niveis reduzidos em culturas celulares em modo semi-continuo (especificamente culturas com 1 litro (1 L)) que utilizam células CHO (especificamente células EMCG5) para a produção de proteína morfogenética óssea recombinante 2 (BMP-2) (Patente U. S. N° 5318898; Patente U. S. N° 5618924 e Patente U. S. N° 5631142, descrevem também as proteínas BMP-2 e sua produção). Foram monitorizados os efeitos das estratégias de alimentação limitada de glucose na concentração e viabilidade celular, produção de lactato, produtividade proteica e duração prolongada do lote. A solução de glucose estéril foi alimentada, de um modo limitado, no biorreactor, utilizando uma bomba de seringa programada para aumentar a glucose proporcionada para a cultura celular em modo semi-continuo. Num conjunto de testes, a glucose foi adicionada à cultura em função de (e. g., como uma percentagem de) de uma velocidade anteriormente determinada de consumo de glucose pelas células animais quando expostas a um nível elevado de glucose (i. e., como uma função de uma velocidade pré-calculada).

Foram também monitorizados os incidentes de privação de glucose utilizando um sensor de pH (Bradley-James Corp.) que não necessita de recolha de amostras. Consequentemente, um aumento no pH de 0,02 unidades acima de um valor predeterminado de 7,00 foi considerado como indicativo de que a glucose foi 26 completamente consumida do meio de cultura e que as células começaram a consumir ácido láctico. A diminuição nos niveis de ácido láctico em culturas provoca um aumento no pH do meio de cultura celular; esta relação permite que um sistema baseado em sensor de pH antecipe os incidentes de privação de glucose.

De modo a avaliar um sistema baseado em sensor de pH para a sua eficácia em prevenir a privação de glucose em experiências de alimentação limitada de glucose, foi programada uma bomba de seringa para distribuir um bólus de alimentação de glucose ao biorreactor caso o pH aumente acima de um valor predeterminado de 7,00. Um aumento no pH de 0,02 unidades acima de 7,00 activa a distribuição de um bólus de alimentação de glucose, sendo subsequentemente a velocidade limitada de distribuição continua de glucose aumentada em 15% em alguns testes e em 50% noutros testes.

Nestas experiências, foram utilizados biorreactores 2L Applikoe® com 1 L de volume de trabalho (Applikon Biotechnology, Foster City, CA). Foi proporcionada injecção de ar quando necessário, para manter o oxigénio dissolvido a 23% de saturação do ar e foi utilizada a emulsão antiespuma C Medicai Grade (Dow Corning Corporation, Midland, MI) para prevenir a formação de espuma. A temperatura foi mantida a 37 °C através da cultura em modo semi-continuo. Foram preenchidas assepticamente seringas Becton Dickinsone® (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) com solução de controlo ou de glucose experimental para distribuir a glucose às culturas de controlo ou de alimentação limitada, respectivamente, nos biorreactores. 27

Numa primeira experiência (i. e., uma experiência de alimentação aumentada esperada), uma cultura de controlo representativa utilizou quantidades crescentes de glucose a cada dia, e foi utilizada uma curva de melhor ajuste exponencial para aproximar a quantidade de glucose consumida pela cultura de controlo a cada dia. Utilizando a curva de melhor ajuste como base, foi estabelecida uma bomba de seringa (Yale Apparatus, Wantagh, NY) para alimentar glucose à cultura experimental a uma velocidade de alimentação limitada, i. e., aproximadamente, 50-70% da quantidade consumida pela cultura de controlo. Cada dia, a velocidade de alimentação limitada foi alterada para compensar o aumento na densidade celular. A concentração de glucose alimentada foi de 200 g/L. A concentração inicial de glucose na cultura de controlo (1 L) foi de 10,38 g/L. Após aproximadamente mais de três dias, foi adicionada glucose (2,2 g) em intervalos de 24 h à cultura de controlo (i. e., a 75,5, 99,5 e 123,5 h de cultura) (Tabela 1; FIG. 2; e FIG. 6) . A concentração inicial de glucose na cultura de alimentação limitada (1 L) foi de 1,1 g/L. A velocidade de alimentação limitada continua de glucose para a cultura de alimentação limitada foi aumentada quatro vezes (após 27,5, 51,5 75,5 e 99,5 h de cultura) a partir de uma velocidade de alimentação limitada continua inicial de 0,046 g/L/h (que foi mantida no período de cultura de 20 a 27,5 h) (Tabela 1). 28

Tabela 1. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Adição de Glucose

Adição de Glucose a 1 L de Cultura de Controlo (concentração inicial de glucose: 10,38 g/L) Velocidades de Adição a Cultura com Alimentação Limitada (concentração inicial de glucose: 1,1 g/L) Ponto (h) Quantidade (g) Período (h) Taxa (g/L/h) — — 0-20 0 -- — 20-27,5 0, 046 -- — 27,5-51,5 0,068 75, 5 2,2 51,5-75,5 0,088 99,5 2,2 75,5-99,5 0,104 123,5 2,2 99,5-147,5 0, 12 A velocidade de consumo de glucose na cultura de alimentação limitada aproximou-se da velocidade limitada de distribuição de glucose ao longo da duração da alimentação limitada continua de glucose para a cultura de alimentação limitada. Isto é evidenciado pela concentração de glucose na cultura de alimentação limitada permanecer próxima de zero após alimentação continua de glucose, de um modo limitado, começar após 20 h de cultura (FIG. 6). As velocidades de consumo de glucose nas culturas de controlo, por outro lado, não foram limitadas por uma velocidade limitada de distribuição de glucose. Consequentemente, as velocidades de consumo de glucose nas culturas de controlo continuaram durante vários dias a níveis superiores aos das culturas de alimentação limitada (Tabela 6). As concentrações de lactato (FIG. 6) e velocidades de produção de lactato (Tabela 7) permaneceram também inferiores para as 29 culturas de alimentação limitada comparativamente às culturas de controlo ao longo desta experiência de alimentação esperada aumentada.

Numa segunda experiência (i. e., uma experiência de alimentação pré-calculada) , foi utilizada uma programação em de declive de uma bomba de seringa dupla (KD Scientific, Holliston, MA), Para esta experiência de alimentação pré-calculada, a concentração de glucose foi de 0,28 g/mL para a alimentação de glucose de declive elevado e 0,20 g/mL para a alimentação de glucose de declive baixo. Em contraste com a experiência de alimentação de aumento esperado, na qual a bomba de seringa distribui, de um modo contínuo, a glucose a uma velocidade de alimentação limitada pré-estabelecida ao longo de um período de tempo, e. g., 0,046 g/h entre 20-20,7 h e 0,068 g/h entre 27,5 a 51,5, etc., a programação do declive da bomba de seringa na experiência de alimentação pré-calculada permitiu que a velocidade de alimentação limitada de glucose aumentasse gradualmente, para se assemelhar aos 33% e 45% da curva de melhor ajuste exponencial de glucose consumida pela cultura de controlo cada dia. A programação em declive permitiu que as velocidades limitadas final e inicial sejam programadas para cada período de tempo, e. g., 12 h, e a bomba irá alterar a velocidade continuamente de um modo linear durante esse período de tempo. A Tabela 2 proporciona dados representativos da adição de glucose para esta experiência de alimentação pré-calculada. 30

Tabela 2. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Adição de Glucose

Adição de Glucose a 1 L de Cultura de Controlo (concentração inicial de glucose: 8,4 g/L) Ponto (h) Quantidade (g) — -- — — — — 67,5 2,2 94, 75 2,2 119,75 2,2 143,75 2,2 167,75 2,2 191 2,2 Alimentação Limitada Velocidades de Adição a Cultura com Alimentação Limitada (concentração inicial de glucose: 0,88 g/L) Declive Baixo Declive Elevado (alimentação com (alimentação com Velocidade na 0,2 g/mL) 0,28 g/mL) Seringa g/h adicionada a g/h adicionada a 1 Período (h) mL/h 1 L L 0-19,75 0 0 0 19,75-43,75 0, 160-0,184 0,0320-0,0368 0,0448-0,0515 43,75-67,75 0, 184-0, 224 0,0368-0,0448 0,0515-0,0627 67,75-91,75 0,224-0,264 0,0448-0,0528 0,0627-0,0739 91,75-115,75 0,264-0,304 0,0528-0,0608 0,0739-0,0851 115,75-139,75 0,304-0,344 0,0608-0,0688 0,0851-0,0963 139,75-140,25 0,344-0,346 0,0688-0,0692 0,0963-0,0969 140,25-164,25 0,400-0,450 0,0800-0,0900 0, 1120-0, 1260 164,25-191 0, 450 0,0900 0,1260 31 A FIG. 2 representa a quantidade cumulativa de glucose distribuída ao longo do tempo para a experiência de alimentação com aumento esperado e a FIG. 3 representa a quantidade cumulativa de glucose distribuída ao longo do tempo para a experiência de alimentação pré-calculada. As FIGS. 2 e 3 incluem, cada, as quantidades iniciais de glucose proporcionada nos reactores de controlo e alimentação limitada (e não apenas as quantidades de glucose total distribuída por seringa). Em ambas as experiências, um lote de controlo tinha um nível inicialmente elevado de glucose e foi adicionada glucose (2,2 g) numa base diária após cerca de 72 h. Para as culturas de alimentação limitada, os biorreactores tinham, no Dia 0, cerca de 1 g/L de glucose e a distribuição de glucose com a seringa começou após cerca de 20 h. A experiência de alimentação com aumento esperado demonstrou que o crescimento celular na cultura de alimentação limitada teve um atraso inicial comparativamente ao crescimento celular na cultura de controlo, mas que o crescimento celular na cultura de alimentação limitada atingiu, eventualmente, uma concentração celular final superior no Dia 6 (FIG. 4). Na cultura de controlo, a concentração celular atingiu um máximo muito mais cedo e a viabilidade começou a diminuir rapidamente após o Dia 4 (FIG. 4) . Ao contrário da cultura de controlo, a velocidade de crescimento celular na cultura de alimentação limitada permaneceu positiva até ao Dia 6 (Tabela 3).

Embora a cultura de alimentação limitada tenha atingido uma concentração celular final superior em comparação com a cultura de controlo ao dia 6, as culturas tiveram concentrações semelhantes no dia 5 (Figura 4) . Estes dados demonstram que a viabilidade diminuída das células na cultura de controlo 32 comparada com a viabilidade das células na cultura de alimentação limitada não ocorreu em função das células que atingiram a capacidade máxima do biorreactor. Em vez disso, os dados na Figura 4, combinados com a demonstração de um nível baixo de lactato nas culturas de alimentação limitada em comparação com o nível de lactato nas culturas de controlo (Figura 6) sugere que a viabilidade aumentada das células cultivadas nas culturas de alimentação limitada ocorreu em função do nível reduzido de lactato obtido por alimentação de glucose, de um modo limitado, às células.

Tabela 3. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Velocidades de Crescimento Celular (valores μ Cedex por h; valores μ Cedex = concentração celular em unidades de 105 células por mL)

Dia Controlo Velocidades de Crescimento (p.(h-1)) Alimentação Limitada Velocidades de Crescimento (μ. (h_1) ) 1 0,027 0,027 2 0,032 0,026 4 0,016 0,017 5 0,001 0,007 6 -0,014 0, 005 A FIG. 5 apresenta os gráficos dos títulos BMP-2 normalizados. Os valores dos títulos BMP-2 foram normalizados como uma fracção do valor do título BMP-2 no Dia 6 da experiência de alimentação com aumento esperado. A Tabela 4 33 apresenta os valores para as velocidades de produção de BMP-2 correspondentes. As velocidades de produção de BMP-2 são normalizadas como uma fracção da velocidade de produção de BMP-2da cultura de controlo no Dia 1. Após o Dia 4, os titulos de BMP-2 nivelaram para a cultura de controlo, mas continuaram a aumentar para a cultura de alimentação limitada (FIG. 5). Em contraste com a cultura de controlo, as velocidades de produção de BMP-2 da cultura de alimentação limitada permaneceram positivas até ao Dia 6 (Tabela 4) . Deve ser notado que embora a FIG. 5 sugira que as culturas de controlo demonstraram uma diminuição ligeira no titulo de BMP-2 no dia 5, é provável que a pequena redução observada seja um reflexo da variabilidade experimental e não resultante de uma verdadeira diminuição no título de BMP-2 na cultura.

Tabela 4. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Taxa de Produção de BMP-2 (Normalizada)

Dia Controlo Taxa de Produção Alimentação Limitada Taxa de Produção 1 O 0 1 1 0,84 2 0, 71 0, 77 4 0,40 0,65 5 o o 1 0,21 6 0,08 0,40

Mantendo um nivel reduzido de ácido láctico, utilizando uma estratégia de alimentação de glucose, de um modo limitado, aumentou o crescimento celular e produtividade proteica. 0 titulo final de BMP-2 foi cerca de 70% superior na cultura de 34 alimentação limitada (FIG. 5) e a velocidade de produção de BMP-2 não ficou negativa como ocorreu na cultura de controlo. A FIG. 6 apresenta os perfis da concentração de glucose (g/L) e concentração de lactato (g/L) da experiência de alimentação com aumento esperado e a Tabela 5 apresenta os dados representativos correspondentes na concentração de glucose (g/L) e concentração de lactato (g/L) desta experiência. A Tabela 6 apresenta os valores das velocidades de consumo de glucose correspondentes e a Tabela 7 apresenta os valores das velocidades de produção de lactato correspondentes.

Tabela 5. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Concentrações de Glucose e Lactato

Concentração de Glucose (g/L) Horas Controlo Alimentação Limitada 0 10,38 1,10 20, 75 8,96 0,22 51,25 5,20 0,06 75, 5 7, 40 — 92,5 0, 78 0,07 99,5 2,98 — 115,25 0,10 0,08 123,5 2,30 — 142,5 0,10 0,07 35

Concentração de Lactato (g/L) Horas Controlo Alimentação Limitada 0 0,12 0,16 20, 75 1, 40 1, 14 51,25 3,40 2,26 75, 5 — — 92,5 5, 78 3,82 99,5 -- -- 115,25 6,50 4,20 123,5 — — 142,5 6,96 4,60

Tabela 6. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado Taxa de Consumo de Glucose

Dia Controlo Qgiucose (mg/10 células/dia) Alimentação Limitada Qgiucose (mg / 1 0 células/dia) 1 1,90 1,32 2 1,54 1,02 4 0,90 0,66 5 0,51 0,53 6 0,39 0,48 36

Tabela 7. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado:

Taxa de Produção de Lactato

Dia Controlo Qlactato (mg/106 células/dia) Alimentação Limitada Qlactato (mg/106 células/dia) 1 1, 71 1, 41 2 0,82 0,55 4 0,32 0,26 5 0,13 0, 08 6 0,08 0, 06

Para a cultura de alimentação limitada na experiência de alimentação com aumento esperado, as velocidades de consumo de glucose foram inferiores para a cultura de alimentação limitada relativamente à cultura de controlo do Dia 1 até ao Dia 3 (Tabela 6) e as velocidades de produção de lactato ao longo do período de cultura foram inferiores para a cultura de alimentação limitada relativamente à cultura de controlo (Tabela 7), o que resultou em concentrações de lactato inferiores para a cultura de alimentação limitada ao longo do período de cultura (FIG. 6).

Foram também medidos os perfis de osmolalidade e a quantidade de titulante (uma mistura de carbonato de sódio e bicarbonato de sódio) utilizada por dia em cada um dos biorreactores. A Tabela 8 apresenta os perfis de osmolalidade e a Tabela 9 apresenta a quantidade de titulante utilizada por dia 37 (por 1 L de volume de trabalho), sob cada uma das duas condiçoes de cultura.

Tabela 8. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Osmolalidade

Dia Controlo Osmolalidade (mOsm/L) Glucose Limitada Osmolalidade (mOsm/L) 0 286 289 1 295 312 2 340 324 4 382 371 5 394 362 6 413 375

Tabela 9. Experiência de Alimentação com Aumento Esperado: Utilização de Titulante o

Dia Controlo Titulante Utilizado (mL/dia) Alimentação Restrita Utilização de Titulante (mL/dia) 0-1 3 1 1-2 16 3 2-4 25 20 4-5 10 1 5-6 6 6 38 0 nível de osmolalidade geralmente inferior (Tabela 8) e a utilização do titulante inferior (Tabela 9) na cultura de alimentação limitada (versus a cultura de controlo) são atribuídos às quantidade inferiores de lactato produzidas (necessitam de menos neutralização com titulante).

Na experiência de alimentação pré-calculada, um biorreactor foi considerado como um controlo; uma cultura em modo semi-contínuo convencional foi mantida neste biorreactor. Além disso, foram considerados dois biorreactores de teste com cultura de alimentação limitada - um para distribuição de glucose limitada "de declive baixo" e um para distribuição de glucose limitada "de declive elevado".

Para cada biorreactor de teste, foi utilizada uma bomba de seringa para aumentar, de modo contínuo, a velocidade de alimentação limitada de glucose. A concentração da solução de glucose administrada para o biorreactor de declive baixo foi de 0,2 g/mL; a concentração para o biorreactor de declive elevado foi de 0,28 g/mL. A FIG. 7 apresenta graficamente os dados de concentração celular (linhas sólidas) e a viabilidade celular (linhas a tracejado) durante os períodos de cultura nos biorreactores de controlo e teste; a Tabela 10 apresenta a velocidade de crescimento celular para os biorreactores de controlo e teste.

Tabela 10: Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Velocidades de Crescimento Celular (valores μ Cedex por h; valores μ Cedex = concentração celular em unidades de 105 células por mL) 39

Velocidades de Velocidades Velocidades Dia Controlo Declive Baixo Declive Elevado (μ. (h-1) ) (μ. (h^1) ) (μ. (h_1) ) 1 0,030 0,026 0, 024 2 0,035 0,029 0, 030 3 0,029 0,026 0, 025 4 0,009 0,016 0, 017 5 0,005 0,011 0, 010 6 -0,004 0,012 0, 009 7 -0,013 0,006 0, 005 8 -0,012 0,002 0, 003

Em ambas as culturas de alimentação limitada, a concentração celular continuou a aumentar até ao Dia 8 (192 h); além disso, a viabilidade celular manteve-se a níveis elevados durante este período (FIG. 7). Em contraste, a concentração celular na cultura de controlo atingiu o máximo no Dia 5 (120 h) ; seguido por uma redução acentuada na concentração celular e uma redução acentuada na viabilidade celular (FIG. 7) . A cultura de declive baixo atingiu uma concentração celular de mais de 12xl06 células/mL no Dia 8 e a viabilidade celular permaneceu superior a 90% (FIG. 7).

Os níveis de título de BMP-2 observados nas culturas de alimentação limitada suportam a utilidade dos métodos da invenção para melhorar a produção de proteína em células animais em cultura (particularmente para a cultura de declive baixo). A FIG. 8 apresenta os níveis de título de BMP-2 para os biorreactores de controlo e teste, normalizados como uma fracção do título máximo de BMP-2 (Dia 5) para a cultura de controlo. A 40

Tabela 11 apresenta as velocidades de produção de BMP-2 para os biorreactores de controlo e teste, normalizados como uma fracção da velocidade de produção de BMP-2 da cultura de controlo no Dia 1 (como também normalizado na Tabela 4).

Tabela 11. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Taxa de Produção de BMP-2 (Normalizada)

Dia Controlo Taxa de Produção Declive Baixo Velocidades de Produção Declive Elevado Velocidades de Produção 1 1,00 1,19 1,17 2 1, 01 0, 75 0, 77 3 O > 0,94 1, 02 4 0,67 0,86 1,02 5 0,16 1,06 0,56 6 -0,19 1,15 0,59 7 -0,39 0,52 -0, 02 8 -0,02 0,43 -0, 03 0 titulo final mais elevado foi obtido na cultura de alimentação limitada de declive baixo; este nível de título é mais do que três vezes superior ao título máximo de BMP-2 obtido na cultura de controlo (FIG. 8) . A velocidade de produção de BMP-2 permaneceu elevada durante seis dias na cultura de declive baixo (Tabela 11) . A velocidade de produção de BMP-2 na cultura de alimentação limitada de de declive elevado diminuiu mais rapidamente do que a velocidade de produção de BMP-2 na cultura de alimentação limitada de declive baixo (Tabela 11). Esta diminuição mais rápida na velocidade de produção de BMP-2 41 ocorreu, provavelmente, devido à presença de um nível mais elevado de inibidores, tal como lactato, na cultura de declive elevado comparativamente à cultura de declive baixo. A FIG. 9 apresenta os perfis das concentrações (g/L) de glucose (linhas sólidas) e lactato (linhas a tracejado) da experiência de alimentação pré-calculada para biorreactores de controlo e teste e a Tabela 12 apresenta os dados representativos correspondentes às concentrações de glucose e lactato (g/L) desta experiência. A Tabela 13 apresenta os dados da velocidade de consumo de glucose e a Tabela 14 apresenta os dados da velocidade de produção de lactato, para os biorreactores de controlo e teste.

Tabela 12. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Concentrações de Glucose e Lactato

Concentração de Glucose (g/L) Alimentação Limitada Horas Controlo Declive Baixo Declive Elevado 0 10,46 1,09 1,09 18, 75 8,68 0,01 0,00 42, 75 6,38 0,12 0,08 66,25 3,07 0,05 0,05 67, 75 5, 82 — — 92,25 1,61 0,16 0,11 94, 75 4,36 — — 115,75 0,44 0,06 0,05 119,75 3,19 — — 42 (continuacao)

Concentração de Glucose (g/L) Alimentação Limitada Horas Controlo Declive Baixo Declive Elevado 139,75 0 0 0 143,75 2, 75 -- -- 164,5 0,54 0,07 0,22 167,75 3,29 — — 187,25 0,87 0,06 0,39 191 3,62 -- -- Concentração de Lactato (g/L) Horas Controlo Alimentação Limitada Declive Baixo Declive Elevado 0 0,01 0,02 0,01 18, 75 1,20 1,06 1,08 42, 75 2,90 1,58 1,88 66,25 4,68 2,06 2, 77 67, 75 -- -- -- 92,25 5, 92 2,20 3,43 94, 75 — — — 115,75 7, 76 1,86 3,68 119,75 -- -- -- 139,75 8,04 1,24 4, 08 143,75 — — — 164,5 7,60 1, 18 4,36 167,75 -- -- -- 187,25 7, 72 1,09 4, 76 191 — — — 43

Tabela 13. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Taxa de Consumo de Glucose

Dia Controlo Qgiucose (mg/106 células/dia) Declive Baixo Qgiucose (mg/10 células/dia) Declive Elevado Qgiucose (mg / 1 0 células/dia) 1 2,90 1,67 1,69 2 1, 43 0, 45 0,68 3 0,99 0,36 0,48 4 0, 73 0,22 0,33 5 0,63 0,22 0,29 6 0, 49 0,18 0,26 7 0,40 0,18 0,27 8 0,65 0,18 0,26

Tabela 14. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Taxa de Produção de Lactato

Dia Controlo Qlactato (mg/106 células/dia) Declive Baixo Qlactato (mg /106 células/dia) Declive Elevado Qlactato (mg /106 células/dia) 1 1, 94 1,61 1,66 2 1,06 0,35 0,53 3 0,53 0,17 0,31 4 0,22 0,03 0,13 5 0,30 -0, 05 0,04 6 0,04 1 O O 0,05 7 1 o o co -0,01 0,03 8 0,03 -0,01 0,04

Os perfis com a linha a tracejado da FIG. 9, realçam as diferenças na produção de lactato entre as três culturas. A 44 comparação estes perfis na FIG. 9 revela que os níveis mais baixos de lactato resultaram de quando a alimentação limitada de glucose foi estabelecida numa velocidade "de declive baixo". A velocidade de produção de lactato muito baixa (FIG. 9 e Tabela 14) é provavelmente responsável pela capacidade das células nessa cultura manterem tal elevada produtividade. A velocidade de consumo de glucose estabilizou a cerca de 0,2 mg/106 células/dia na cultura de declive baixo (Tabela 13). A Tabela 15 apresenta os perfis de osmolalidade para as culturas de controlo e alimentação limitada e a Tabela 16 apresenta os dados de titulante utilizado para estas culturas (novamente, por 1 L de volume de trabalho).

Tabela 15. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Osmolalidade

Dia Controlo Osmo. (mOsm/L) Declive Baixo Osmo. (mOsm/L) Declive Elevado Osmo. (mOsm/L) 0 290 288 271 1 299 290 293 2 320 298 304 3 349 306 324 4 n. a. n. a. n. a. 5 408 296 334 6 427 287 353 7 437 221 308 8 413 237 366 45

Tabela 16. Experiência com Alimentação Pré-Calculada: Utilização de Titulante

Controlo Declive Baixo Declive Elevado Dia Titulante Titulante Titulante (mL/dia) (mL/dia) (mL/dia) 1 1 0 5 2 8 2 3 3 10 2 4 4 13 2 6 5 10 1 4 6 8 3 8 7 5 1 2 8 5 0 7 A osmolalidade na cultura de alimentação limitada de declive baixo aumentou ligeiramente de um nível inicial de 288 mOsm/L para apenas 306 mOsm/L no Dia 3, antes de estabilizar a um nível de 237 mOsm/L no Dia 8 (Tabela 15) . A cultura de declive baixo necessitou também de pouco titulante desde o Dia 1 até Dia 8 (Tabela 16). Por outro lado, a osmolalidade na cultura de controlo aumentou em cerca de 50% até ao Dia 7 (Tabela 15) e a utilização de titulante para a cultura de controlo excedeu sempre a utilização de titulante para a cultura de declive baixo (Tabela 16) . De um modo semelhante, excepto no Dia 1 e Dia 8, a utilização de titulante para a cultura de controlo excedeu também a utilização de titulante para a cultura de alimentação limitada de declive elevado (Tabela 16). Como na experiência de alimentação com aumento esperado, o nível de osmolalidade mais baixo (Tabela 15) e, de um modo geral, a utilização de titulante mais baixa (Tabela 9) nas culturas de alimentação limitada 46 (ambas as culturas de alimentação limitada de declive baixo e de declive elevado) versus a cultura de controlo são atribuídos às quantidade de lactato mais baixas produzidas (necessitando menos neutralização com titulante) na experiência de alimentação pré-calculada. A alimentação de glucose, de um modo limitado, no meio de cultura celular (e, deste modo, mantendo a produção de lactato no meio baixa) tem vários efeitos positivos nestas experiências (particularmente na produtividade proteica; FIG. 5 e Tabela 4; e FIG. 8 e Tabela 11) . Estes efeitos positivos foram obtidos ao programar o aumento das distribuições de glucose durante estas alturas de alimentação limitada de modo a antecipar as necessidades de glucose para os aumentos esperados ou pré-calculados nas necessidades de glucose (e. g., como resultado de aumentos na concentração celular), mas todas enquanto alimentando com glucose, de um modo limitado.

Esta estratégia de alimentação limitada resultou em reduções significativas nas velocidades de produção de lactato (ao longo de toda a experiência de alimentação com aumento esperado -Tabela 7; ver também Fig. 6 - e no total de experiência de alimentações pré-calculadas - Tabela 14; ver também a FIG. 9) em comparação com as culturas de controlo, nas quais o meio de cultura celular continha inicialmente um nível elevado de glucose (e. g., cerca de 10 g/L) . A concentração celular (ver Tabelas 3 e 10) e níveis de produção proteica (ver Tabelas 4 e 11) nas culturas de teste de alimentação limitada continuaram a aumentar após estes determinantes terem atingido um máximo nas culturas de controlo. Particularmente na experiência de alimentação pré-calculada, a cultura de alimentação limitada de declive baixo atingiu um título final de proteína recombinante 47 que foi mais de três vezes superior ao título máximo da cultura de controlo (FIG. 8).

Considerando os níveis de título BMP2 normalizados obtidos (FIG. 8), pode ser observado que uma vantagem fundamental da alimentação limitada com glucose para controlar a produção de ácido láctico a níveis reduzidos é a melhoria da produtividade do processo (particularmente quando medido em termos de velocidades de produção proteica). A alimentação com glucose, de um modo limitado, para controlar a produção de ácido láctico a níveis reduzidos pode também facilitar a produtividade do processo quando esta última é medida em termos de crescimento celular (FIG. 7).

Com importância, os benefícios da invenção são alcançados por velocidades limitadas de distribuição de glucose a culturas de teste em vez de simplesmente por manutenção de concentrações reduzidas de glucose nas culturas de teste. Por exemplo, os perfis de concentração de glucose de ambas as culturas de declive baixo e de declive elevado da experiência de alimentação pré-calculada foram, de um modo semelhante, reduzidos, mas o perfil de produção de lactato da cultura de declive baixo permaneceu significativamente abaixo do perfil de produção de lactato da cultura de declive elevado (FIG.9 e Tabela 12). Consequentemente, os perfis metabólicos benéficos são o resultado da adaptação das células animais em cultura ao crescimento sob condições de cultura, em que a disponibilidade de glucose na cultura, é limitada pela distribuição restrita de glucose à cultura, particularmente quando a distribuição limitada é baseada nas velocidades esperadas ou pré-calculada das capacidades de consumo de glucose pelas células animais em cultura. Independentemente do número de transportadores de 48 glucose expressos pelas células em cultura, as células são capazes de obter glucose suficiente para produzir apenas níveis reduzidos de ácido láctico quando a glucose é alimentada às culturas apenas a uma velocidade limitada. EXEMPLO 4

Sistema Baseado num Sensor de Concentração Celular

Um sensor de concentração celular que não se baseia na recolha de amostras pode ser utilizado para facilitar a distribuição de glucose a velocidades limitadas em tempo real. Um sistema de monitorização computorizado através do qual podem ser determinadas as concentrações celulares sem recolha de amostras (e. g., através da utilização de um sistema em que a concentração celular de uma cultura de células animais é estimada através de medições fotométricas da turbidez da cultura) é programado para registar as concentrações celulares a cada cinco minutos, e para encaminhar esses dados para um sistema ligado a um computador que controla a distribuição de glucose à cultura de células animais. Este sistema ligado a computador é, por sua vez, programado para calcular uma velocidade de distribuição limitada de glucose e para distribuir a glucose à cultura de células animais a uma velocidade limitada. Esta velocidade limitada de distribuição de glucose é uma função da velocidade esperada ou pré-calculada do consumo de glucose para as células a uma concentração celular estimada.

Um sistema de distribuição de glucose baseado em seringa é estabelecido para alimentar com glucose, de um modo limitado, de declive baixo, a cultura (i. e., com uma solução de alimentação 49 de glucose de 0,2 g/mL) do exemplo anterior. Para concentrações celulares entre l,4xl06 células/mL e Ι,βχΙΟ6 células/mL num sistema de cultura de células animais de 1 L, é determinada uma velocidade limitada de distribuição de glucose a uma cultura de (em função de uma velocidade esperada ou pré-calculada de consumo de glucose) 8,4 mg de glucose/h, enquanto para concentrações celulares entre l,9xl06 células/mL e 2,lxl06 células/mL num sistema de cultura de células animais de 1 L, é determinada uma velocidade limitada de distribuição de glucose a uma cultura de (novamente em função de uma velocidade esperada ou pré-calculada de consumo de glucose) 11 mg de glucose/h. Consequentemente, quando o sistema de monitorização computorizado mede a concentração celular como sendo de, aproximadamente, l,5xl06 células/mL, o sistema ligado a computador que controla a distribuição de glucose à cultura de células animais ajusta, em tempo real, a velocidade de distribuição de glucose à cultura de modo a que a seringa distribua 0,042 mL/h da solução de alimentação de glucose de 0,2 g/mL (i. e., a glucose é distribuída ao sistema de cultura celular a uma velocidade de 8,4 mg/h). Mais tarde, quando o sistema de monitorização computorizado mede a concentração celular como sendo de, aproximadamente, 2,0xl06 células/mL, o sistema ligado a computador que controla a distribuição de glucose à cultura de células animais ajusta, em tempo real, a velocidade de distribuição de glucose à cultura, de modo a que a seringa distribua 0,055 mL/h da solução de alimentação de glucose de 0,2 g/mL (i. e., a glucose é distribuída ao sistema de cultura celular a uma velocidade de 11 mg/h). A invenção acima descrita, para a alimentação limitada de glucose a culturas celulares, proporciona um método prático para melhorar o desempenho da cultura de células animais. Este método 50 prático proporciona uma opção directa para melhorar a cultura celular à escala industrial. A descrição detalhada e exemplos anteriores foram apenas apresentados com o objectivo de clarificar a sua compreensão. A partir destes não devem ser indicadas limitações desnecessárias. A invenção não está limitada aos detalhes exactos apresentados e descritos, uma vez que variação alcançável para um especialista na técnica estarão incluídos na invenção definida pelas reivindicações.

Lisboa, 13 de Julho de 2010 51

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de cultura celular, para controlar a produção de ácido láctico para níveis reduzidos, numa cultura celular em modo semi-contínuo, compreendendo: misturar as células animais e um meio para formar uma cultura celular; e adicionar glucose, de um modo limitado, à cultura celular, em que a adição de glucose, de um modo limitado, compreende proporcionar a glucose à cultura celular a uma velocidade que é uma função de uma velocidade esperada ou pré-calculada do consumo de glucose pelas células animais cultivadas em meio contendo um nível elevado de glucose, em que a função é a multiplicação da velocidade esperada por uma percentagem inferior a 100%.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a percentagem é de, pelo menos, 33%.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a percentagem é de, pelo menos, 45%.
4. 4/9 Figura 4 Concentração Celular Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado > densidade celular (controlo) 1 - densidade celular (alimentação limitada de glucose) viabilidade (controlo) viabilidade (alimentação limitada de glucose) - o- - a-

   4. Método da reivindicação 1, em que a alimentação da glucose, de um modo limitado, compreende a adição de um ou mais bólus de alimentação de glucose. 1
5. 5/9 Figura 5 Título de BMP-2 (Normalizado): Controlo vs. Alimentação com aumento esperado -controlo igjim alimentação limitada de glucose

   5. Método da reivindicação 1, em que a adição da glucose, de um modo limitado, é efectuada sem amostragem para controlo de informação durante a cultura.
6. 6/9 Figura 6Concentrações de Glucose & Lactato: Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado controlo (G) alimentação limitada de glucose (G) controlo (L) alimentação limitada de glucose (L) θ α-

   6. Método da reivindicação 1, em que é utilizado um sensor para monitorizar a concentração celular na cultura celular e uma medição derivada do sensor da concentração celular é adicionalmente utilizada no cálculo da velocidade de adição de glucose, de um modo limitado, à cultura celular.
7. 7/9 Figura 7Concentração Celular:Controlo vs. Alimentação Pré-Calculada - -o - Q • £> densidade celular (controlo) densidade celular (declive elevado) densidade celular (declive baixo) viabilidade (controlo) viabilidade (declive elevado) viabilidade (declive baixo) Densidade Celular (106 células/mL)

   Viabilidade (%) 8/9 Figura 8 Título de BMP-2 (normalizado) Controlo vs. Alimentação pré-calculada • controlo • declive elevado • declive baixo

   7. Método da reivindicação 1, em que é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da cultura celular e, em resposta a um aumento acima de um valor predeterminado de pH, é adicionada glucose adicional, de um modo limitado, à cultura celular.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que a alimentação adicional de glucose, de um modo limitado, compreende um ou mais bólus de alimentação de glucose.

   9. Método da reivindicação 7, em que o valor de pH predeterminado é de, aproximadamente, 7.

   10. Método da reivindicação 1, em que é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da cultura celular e, em resposta a um aumento acima de um valor predeterminado de pH, a alimentação de glucose, de um modo limitado, continua, subsequentemente, a uma nova velocidade que é superior a uma velocidade imediatamente anterior. 2 11. Método da reivindicação 10, em que a nova velocidade é superior em cerca de, pelo menos, 15% em relação à velocidade imediatamente anterior.

   12. Método da reivindicação 10, em que a nova velocidade é superior em não mais que cerca de 50% em relação à velocidade imediatamente anterior.

   13. Método da reivindicação 10, em que a resposta a um aumento acima de um valor de pH predeterminado compreende ainda a adição de um ou mais bólus de alimentação de glucose à cultura celular.

   14. Método da reivindicação 10, em que o valor de pH predeterminado é de, aproximadamente, 7.

   15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que (i) é utilizado um sensor de concentração celular para monitorizar a concentração celular na cultura celular sem amostragem e uma medição derivada do sensor da concentração celular é utilizada, adicionalmente, no cálculo da velocidade de adição de glucose, de um modo limitado, à cultura celular; (ii) é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da cultura celular sem amostragem e, em resposta a um aumento acima de um valor predeterminado de pH, a alimentação com glucose, de um modo limitado, continua, subsequentemente, a uma nova velocidade que é superior a uma velocidade imediatamente anterior; ou 3 (iii) o sensor de concentração celular e o sensor de pH são utilizados como descrito em (i) e (ii), respectivamente.

   16. Método da reivindicação 15, em que a resposta a um aumento acima de um valor de pH predeterminado em (ii) e/ou (iii) compreende ainda a adição de um ou mais bólus de alimentação de glucose à cultura celular.

   17. Método da reivindicação 15, em que o valor predeterminado de pH é de, aproximadamente, 7.

   18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a velocidade pré-calculada é determinada por misturar células animais e um meio contendo um nível elevado de glucose, para formar uma primeira cultura celular; e determinar uma velocidade de consumo de glucose para as células animais cultivadas na primeira cultura celular.

   19. Método da reivindicação 18, em que é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da segunda cultura celular e, em resposta a um aumento acima de um valor predeterminado de pH, a alimentação com glucose, de um modo limitado, compreende, também, a adição de um ou mais bólus de alimentação de glucose à segunda cultura celular.

   20. Método da reivindicação 19, em que a adição de glucose, de um modo limitado, da segunda cultura compreende ainda continuar, subsequentemente, a alimentação a uma nova velocidade que é superior a uma velocidade imediatamente anterior. 4

   21. Método da reivindicação 19, em que o valor predeterminado de pH é de, aproximadamente, 7.

   22. Método da reivindicação 20, em que a nova velocidade é superior em cerca de, pelo menos, 15% em relação à velocidade imediatamente anterior.

   23. Método da reivindicação 20, em que a nova velocidade é superior em não mais que 50% em relação à velocidade imediatamente anterior.

   24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a velocidade pré-calculada é determinada por misturar as células animais e um meio contendo um nível elevado de glucose, para formar uma primeira cultura celular; determinar uma velocidade de consumo de glucose para as células animais cultivadas na primeira cultura celular; misturar as células animais e um meio para formar uma segunda cultura celular; e adição de glucose, de um modo limitado, à segunda cultura celular a uma velocidade que é uma função da velocidade de consumo de glucose determinada; em que i) é utilizado um sensor de concentração celular para monitorizar a concentração celular na segunda cultura celular sem amostragem e uma medição derivada do sensor da concentração celular é utilizada, adicionalmente, no cálculo da velocidade de alimentação de glucose, de um 5 modo limitado, à segunda cultura celular; ii) é utilizado um sensor de pH para monitorizar o pH da segunda cultura celular sem amostragem e, em resposta a um aumento acima de um valor predeterminado de pH, a adição de glucose, de um modo limitado, continua, subsequentemente, a uma nova velocidade que é superior a uma velocidade imediatamente anterior; ou iii) o sensor de concentração celular e o sensor de pH são utilizados como descrito em (i) e (ii) , respectivamente.

   25. Método da reivindicação 24, em que a resposta a uma aumento acima de um valor predeterminado de pH em (ii) e/ou (iii) compreende ainda a adição de um ou mais bólus de alimentação de glucose à segunda cultura celular. Lisboa, 13 de Julho de 2010 6 8.0 7.0 5.0 - 4.0 3.0 2.0 · 1.0 0.0 1/9 Figura 1 Controlo vs. Alimentações Limitadas de Glucosa Curva de Melhor Ajuste ♦ controlo 45% ▲ 33% -y=2.058*exp(0.0064*x) — — programa de elevado declive - - - programa de baixo declive 4 vJf- A 50 100 Horas 150 200 250 2/9 Figura 2 Glucose acumulada Controlo vs. Alimentação com Aumento Esperado -controlo -alimentação de glucose limitada

   Horas 3/9 Figura 3 Glucose Acumulada Controlo vs. Alimentação pré-calculada controlo -declive elevado declive baixo
9. 9/9