PT1514482E - Fracções de leite e preparações de leite para tratamento e/ou prevenção de doenças mediadas por cox-2 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "FRACÇÕES DE LEITE E PREPARAÇÕES DE LEITE PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS MEDIADAS POR COX-2" A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e nutricionais para o tratamento e/ou prevenção de doenças mediadas por cicloxigenase-2 e a um processo para aumentar a actividade inibidora da cicloxigenase-2 de um produto. Em particular, a presente invenção também se refere à utilização de uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite para a inibição da actividade de cicloxigenase-2, especificamente, para a preparação de um produto alimentar ou um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças mediadas por cicloxigenase-2.

As enzimas cicloxigenase (COX) são enzimas chave necessárias para a conversão de ácido araquidónico em prostaglandinas (PG). Até agora, foram identificadas duas isoformas de COX, COX-1 e COX-2, as quais diferem em vários aspectos: a COX-1 é expressa constitutivamente na maioria dos tecidos e presume-se que seja responsável pela produção de prostaglandinas que controlam funções fisiológicas normais, tais como a manutenção da mucosa gástrica e a regulação de fluxo sanguíneo renal. A segunda isoforma, COX-2, não parece ser expressa constitutivamente na maioria dos tecidos normais, mas é altamente indutível e pode ser encontrada apenas em localizações particulares, e. g., em sítios de inflamação e em células cancerígenas. 1

Apesar de se constatar que as enzimas COX estão ligadas à membrana, não têm uma região transmembranar convencional. Em vez disso, contêm quatro hélices anfipáticas sobrepostas para formar uma região de hidrofobicidade. Esta região hidrófoba fixa-se à porção "inferior" da enzima na membrana. 0 sítio activo de cicloxigenase está localizado na área de hidrofobicidade, perto das hélices anfipáticas. Considera-se que o substrato e inibidores da enzima atingem o sítio activo via um canal incluído na bicamada lipídica (W. Krause, R. N. Dubois, Prostaglandins & other Lipid Mediators 61 (2000), 145-161).

Os inibidores de COX e, em particular, inibidores de COX-2, são utilizados para tratar uma variedade de diferentes doenças, tais como doenças inflamatórias e são, também, utilizados como analgésicos. Além disso, constatou-se que a COX-2 é normalmente sobre-expressa em tecidos pré-malignos e malignos e demonstrou-se que um tratamento com inibidores de COX-2 reduz a formação de tumores intestinais, esofágicos, lingua, mama, pele, pulmão e bexiga em animais (K. Subbaramaiah, A. J. Dannenberg, TRENDS in Pharmacological Sciences 24 (2003), 96-102). Vários fármacos anti-inflamatórios não esteróides (designados por NSAID) bem conhecidos, tais como, e. g., aspirina e ibuprofeno, inibem a COX-1 e COX-2. Recentemente, uma nova classe de inibidores (COXIB) foi descrita, a qual inibe apenas, especificamente, a enzima COX-2 (Μ. E. Turini, R. N. Dubois, Physiology And Diseases. Annu. Rev. Med. 53 (2002), 35-57). No entanto, os NSAID são conhecidos por causar graves efeitos secundários, e. g., problemas renais e ulceração duodenal e estomacal. 2 0 documento WO 01/11990 divulga composições farmacêuticas e nutricionais com teor de treonina reduzido. As referidas composições podem compreender, como um ingrediente principal, proteína de soro lácteo ácido ou proteína de soro lácteo doce, a partir das quais foi removido caseino-glicomacropeptídeo. A remoção da referida proteína caseína é obtida por contacto de concentrado de proteína de soro lácteo doce com uma resina de troca catiónica seguido de tratamento com uma resina fracamente aniónica. Uma preparação de combinação dirigida a uma diminuição do risco de doenças civilizacionais é descrita no documento DE 4413839. A referida preparação compreende, inter alia, proteína de soro lácteo doce, a qual está descrita como interagindo com outros constituintes, magnésio, vitamina C, vitamina E, provitamina A, vitamina Bl e selénio, de modo a proporcionar o efeito terapêutico desejado. O documento US 4284623 divulga um método para tratar inflamação num animal, o qual compreende administrar, ao animal, uma quantidade eficaz anti-inflamatória de leite de um bovídeo mantido num estado produtor de factor anti-inflamatório.

Consequentemente, o problema da presente invenção é o de proporcionar meios adicionais para inibir cicloxigenases, em particular, a COX-2, cujos meios devem estar associados a um baixo risco de efeitos secundários perniciosos.

Este problema foi resolvido proporcionando fracções específicas e/ou preparação de leite, as quais exibem uma actividade inibidora de COX-2, para o tratamento e/ou prevenção de doenças mediadas por COX-2. 3

Nas figuras, A Fig. 1 é um diagrama que exibe a preparação de fracções de leite bovino, como apresentado no Exemplo 1.1.; A Fig. 2 é um diagrama que exibe a preparação de fracções de leite humano, como apresentado no Exemplo 1.2.; A Fig. 3 é um diagrama que exibe a preparação de fracções de leite de búfalo, como apresentado no Exemplo 1.3.; e A Fig. 4 mostra uma comparação das actividades inibidoras de COX-2 de várias fracções de proteína de leite e preparações de proteína de leite, derivadas de leite humano (HM), de leite de vaca (CM) e de leite de búfalo (BM).

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de acordo com a reivindicação 1. O termo "tratar e/ou prevenir doenças mediadas por cicloxigenase-2", como utilizado no presente pedido, compreende, tratar uma doença associada com a expressão, em particular, com uma expressão aumentada de cicloxigenase-2 e prevenir uma doença, a qual pode ser influenciada por redução do nível de cicloxigenase-2 num sítio específico no corpo de um indivíduo, ou por prevenção do aumento do nível de cicloxigenase-2, num sítio específico, no corpo de um indivíduo. Um nível acrescido de cicloxigenase-2 designa uma quantidade, a qual é superior ao nível de cicloxigenase-2 estatisticamente presente, em média, num indivíduo saudável num sítio específico. 4

Um primeiro grupo de doenças mediadas por cicloxigenase-2, o qual pode ser tratado e/ou o seu inicio prevenido, de acordo com a presente invenção, é cancro, compreendendo quaisquer dos seus estados pré-cancerosos. De acordo com os dados científicos disponíveis, presume-se, actualmente, que em tecidos pré-malignos e malignos, a COX-2 está sobre-expressa e que a referida expressão aumentada de COX-2 está associada, pelo menos em parte, à indução da formação de tumor. De facto, uma tal sobre-expressão de COX-2 tem sido observada em várias condições pré-malignas e malignas em órgãos, tais como, e. g., cólon, estômago, esófago, fígado, corpo biliar, pâncreas, cabeça e pescoço, pulmão, mama, bexiga, órgãos genitais femininos e pele. Além disso, também já foi conseguido um tratamento bem sucedido de tumores, com base em inibidores de COX-2 da técnica anterior. Assim, a administração de uma composição de acordo com a presente invenção será útil para tratar ou prevenir estados de cancro e/ou pré-cancerosos.

Além disso, demonstrou-se que os inibidores de COX-2 bloqueiam a formação de prostaglandinas, a presença das quais está associada ao desenvolvimento e progressão de dor, febre e inflamação. De acordo com a presente invenção, outros grupos alvo de doenças mediadas por cicloxigenase-2, para os quais um tratamento e/ou prevenção é direccionado, são artrite, febre reumática, sintomas associados a gripe ou outras infecções virais, dismenorreia, dor de cabeça, dor de dentes, doenças degenerativas de articulação, etc. Também a doença de Alzheimer é considerada como sendo uma doença alvo, de acordo com a presente invenção, uma vez que os inibidores de COX-2 mostraram ter um efeito protector no desenvolvimento desta doença. 5 A utilização da presente invenção é projectada para qualquer indivíduo necessitado da mesma, de um modo preferido, mamíferos, em particular, humanos e animais, e. g.r animais de estimação.

Uma "actividade inibidora da cicloxigenase-2", como aqui mencionada, pode ser determinada de acordo com um método de rastreio de COX-2 com base em células HUV-EC-C, como indicado nos exemplos a seguir, mas também com base em outros ensaios conhecidos na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite especificamente necessárias para um dado indivíduo pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica, de acordo com o seu conhecimento geral na técnica, considerando uma variedade de factores, tais como peso corporal, idade, saúde em geral, sexo, alimentação, tempo de administração, via de administração, velocidade de excreção, combinação de fármaco, etc. Basicamente, o regime de dosagem específico para um indivíduo em particular irá depender do facto do alvo ser ou uma prevenção em geral ou um tratamento agudo de uma doença. Por exemplo, a dosagem diária da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite pode ser seleccionada desde entre 7 mg até 70 g, no caso de uma pessoa de 70 kg, correspondendo a uma dosagem diária de desde cerca de 0,1 mg até cerca de 1 g por quilo de peso corporal, de um modo preferido, desde cerca de 0,5 mg até cerca de 100 mg, de um modo mais preferido, desde cerca de 5 mg até cerca de 70 mg e, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 10 mg até cerca de 50 mg. 6 A composição nutricional preparada pela utilização da presente invenção é qualquer composição adequada para consumo humano ou animal compreendendo, pelo menos, um material seleccionado do grupo consistindo em água, proteínas e/ou péptidos, carboidratos, gorduras. A composição farmacêutica preparada pela utilização da presente invenção é qualquer composição compreendendo, pelo menos, um composto terapeuticamente activo como aqui pormenorizado.

Além disso, a presente invenção proporciona uma composição nutricional e/ou farmacêutica, preparada pela utilização da presente invenção, a qual compreende uma quantidade aumentada da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite proporcionando uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 e a qual proporciona uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 que é superior à actividade inibidora da cicloxigenase-2 de uma composição nutricional e/ou farmacêutica, em que a quantidade da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite não foi aumentada.

Uma tal quantidade aumentada da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite, proporcionando uma actividade inibidora da cicloxigenase-2, pode ser obtida por adição de uma quantidade adicional da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite e/ou por substituição de uma fracção de leite com uma fracção de leite em que o(s) composto(s) bioactivo(s) foi(foram) enriquecido(s). Um enriquecimento pode ser conseguido de acordo com técnicas 7 físicas, químicas e biológicas bem conhecidas na matéria e pode ser realizado, e. g., com base no ensaio descrito nos exemplos. A actividade inibidora da cicloxigenase-2 de um produto que resulta de um enriquecimento ou adição, como apresentado acima, deve ser, por exemplo, pelo menos 1%, de um modo mais preferido, pelo menos 5%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos 10% superior e, em particular, pelo menos 25% superior, à actividade inibidora da cicloxigenase-2 da composição nutricional/farmacêutica de referência, i. e., da composição nutricional/farmacêutica tendo - além da uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite adicionais e/ou enriquecidas - a mesma composição como a composição nutricional/farmacêutica tendo uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 aumentada.

Durante estudos extensos, a presente requerente demonstrou que fracções específicas de proteína de leite proporcionam uma actividade inibidora da cicloxigenase-2, a qual essencialmente poderá não ser constatada no ou excede o, leite como tal. Sem querer estar ligado a nenhuma teoria, pode supor-se que a baixa actividade inicial observada no leite humano parece estar associada com proteínas de soro. As próprias caseínas podem ter um efeito supressor ou conter uma "bioactividade latente" que é activada (e então encontrada na fracção de soro lácteo) por acidificação ou tratamento com coalho.

Uma vez que se constata que as referidas fracções de leite exibem uma actividade inibidora de COX-2 aumentada, podem ser mencionadas fracções de soro lácteo doce de leite humano, leite de bovino, fracção de caseína doce de leite de bovino, etc. ou suas combinações. 0 sub-fraccionamento adicional de proteína de soro lácteo solúvel e rastreio revela que algumas sub-fracções de proteina de soro lácteo solúvel de leite de bovino são preferidas.

Em principio, a separação e isolamento de sub-fracções de proteína de soro lácteo solúvel pode ser conseguida por cromatografia de interacção hidrófoba (HIC), ou por cromatografia líquida de alta pressão de interacção hidrófoba (HI-HPLC), cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RP-HPLC), e semelhantes, todas as quais têm por base os mesmos princípios de separação, por exemplo. Os princípios de HIC são conhecidos pelo especialista na técnica. Geralmente, as amostras são carregadas numa coluna equilibrada (fase estacionária) compreendendo um material hidrófobo que retém as amostras. 0 material hidrófobo pode ser, por exemplo, poliestireno reticulado macroporoso, comercializado como Amberlite Xad 16 XAD 16 da Rohm and Hass, por exemplo. Também pode ser utilizado 15 RPC TN 17-0727-02 (poliestireno-divinilbenzeno) da Amersham ou equivalentes.

Antes da proteína ser carregada na coluna, esta pode ser equilibrada com um tampão. Após a fracção ser carregada, pode fazer-se a corrida, pela coluna, de um tampão ou uma mistura de tampões (fase móvel) pelo que a mistura de tampões varia e pode ter, assim, propriedades variadas de sub-fracções de proteína eluentes, de acordo com a sua hidrofobicidade a partir da coluna. A separação de proteínas de soro lácteo, de acordo com este método, está descrito em: "Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including protease peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on 9 polystyrene-divinylbenzene", D. F. Elgar et al., Journal of Chromatography A 878 (2000) 183-196.

As sub-fracções de proteína eluídas da coluna podem ser descritas de forma rigorosa pela composição da mistura de tampão ou teor de acetonitrilo que desenvolveu a sua eluição a partir da fase estacionária. Por exemplo, a proteína de soro lácteo solúvel pode ser carregada numa coluna enchida com esferas de polistireno-divinilbenzeno (15 RPC TN 17-0727-02 da Amersham) um tampão A pode ser definido como 0,1% vol de ácido trifluoroacético (TFA) em água e um tampão B pode ser definido como 80% vol de acetonitrilo e 0,85% vol de TFA (% vol). Em seguida, a mistura e transporte dos tampões A e B podem ser controlados por um sistema específico, por exemplo, uma estação UNICORN (Pharmacia/Amersham) de FPLC (Cromatografia líquida rápida de proteínas) e feitas fluir pela coluna. A sub-fracção de proteína eluída pode ser definida por uma gama de eluição de razões de mistura dos tampões A e B acima mencionados. Utilizando a composição de tampão específica (porque a ordem de eluição depende do pH), o momento de eluição ou intervalo de uma sub-fracção de proteína pode ser descrito simplesmente pela quantidade relativa de acetonitrilo presente no momento de eluição de uma fracção de proteína de acordo com a invenção.

Se desejável, as sub-fracções assim obtidas podem ser concentradas por técnicas bem conhecidas na matéria, tais como evaporação, ultrafiltração ou diálise para eliminar solvente orgânico antes da secagem, por exemplo, por vácuo, congelamento, pulverização, leito fluidizado, forno, ou qualquer outro processo de secagem adequado. 10

Demonstrou-se que as sub-fracções apresentadas nos exemplos na tabela 7 são particularmente eficazes na promoção de inibição de COX II. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, a presente invenção refere-se às sub-fracções 1, 9, 10 e 14, como apresentado na tabela 7, as quais são altamente eficazes.

Geralmente, o leite de humanos, vacas, pode ser utilizado para preparar as fracções de proteína de leite ou preparações de proteína de acordo com a presente invenção.

Leite magro, soro lácteo ácido e soro lácteo doce podem ser preparados de acordo com um processo como descrito nos exemplos. Os termos "proteína de soro lácteo solúvel" ou "proteína solúvel", como utilizados no contexto da presente invenção, significam proteína recuperada em solução aquosa após uma ultra-centrifugação (e. g., durante 1 h, a 100000 g) ou de acordo com outro processo conhecido por um especialista na técnica. Os termos "proteína não solúvel" ou "caseína micelar" indicam o material lavado recuperado do sedimento após uma referida ultra centrifugação (e. g., de acordo com os passos como apresentado no exemplo 1 ou de acordo com outro processo conhecido por um especialista na técnica).

Particularmente, são proporcionadas elevadas actividades inibidoras da cicloxigenase-2 por soro lácteo doce de leite humano e por várias fracções de leite de vaca, i. e., soro lácteo doce, caseína doce. Para todas as três espécies de leite investigadas nos exemplos (humano, bovino, búfalo), as maiores taxas de inibição de COX-2 mais elevadas são obtidas com soro lácteo doce que, em conformidade, representam uma forma de realização preferida da presente invenção. 11

As preparações de proteína de soro lácteo proporcionaram bons resultados, no entanto, não foram tão eficazes como várias fracções de proteína de leite. Assim, pode assumir-se que nas fracções de proteína de leite, de acordo com a presente invenção, são proporcionados efeitos sinérgicos positivos que aumentam a actividade inibidora de COX-2. Se desejado, as fracções de proteína de leite e as preparações de proteína de soro lácteo também podem ser combinadas.

Estudos dirigidos para a identificação do(s) composto(s) que inibe(m) a cicloxigenase-2 presente nas fracções de proteína de leite, de acordo com a presente invenção, mostraram que os compostos têm de ser proteináceos. A lactoferrina, um composto conhecido, mostrou não ter qualquer actividade inibidora de cicloxigenase-2. A bio-disponibilidade e a estabilidade em relação à biodegradação das referidas uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite podem ainda ser aumentadas por protecção de um ou mais grupos funcionais, tais como, e. g., -OH, -NH2, -SH, -COOH, de compostos presentes nas referidas uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite. A referida protecção pode ser realizada, e. g., por uma reacção com um ou mais açúcares ou carboidratos, tais como, e. g., lactose. Por exemplo, um aquecimento de proteínas de leite na presença de lactose proporciona proteínas lactosiladas. Após protecção, os compostos irão proporcionar uma resistência aumentada contra a degradação, em particular, uma degradação proteolítica no corpo que, por sua vez, resulta geralmente numa bio-disponibilidade aumentada. Uma derivatização também pode ser 12 utilizada para obter uma solubilidade desejada e, assim, uma biodisponibilidade desejada e controlada. A presente invenção refere-se à utilização da reivindicação 1. A uma ou mais fracções de proteina de leite e/ou uma ou mais preparações de proteina de leite proporcionando actividade inibidora de COX-2 podem ser administradas, e. g., numa forma de dosagem oral, tópica, parentérica ou rectal contendo transportadores, adjuvantes e excipientes e veículos convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo parentérico, como aqui utilizado, inclui técnicas de injecções subcutâneas, injecção intravenosa, intramuscular, intra-esternal ou infusão. A composição farmacêutica ou nutricional, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada para tratar ou prevenir doenças mediadas por cicloxigenase-2, tais como cancro ou estados pré-cancerosos, em particular, do cólon, estômago, esófago, fígado, corpo biliar, pâncreas, cabeça e pescoço, pulmão, mama, bexiga, órgãos genitais femininos e pele e/ou doenças inflamatórias, tais como artrite, febre reumática, sintomas associados a gripe ou outras infecções virais, dismenorreia, dor de cabeça, dor de dentes, doenças degenerativas de articulação, etc. e/ou doença de Alzheimer.

Além disso, a composição nutricional ou farmacêutica, de acordo com a presente invenção, pode ser aplicada como um co-tratamento durante um tratamento de cancro convencional e/ou um tratamento de um estado pré-canceroso, uma quimioterapia, uma terapia por radiação, uma bioterapia e/ou durante o tratamento 13 de uma doença inflamatória e/ou durante o tratamento de doença de Alzheimer. A uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite proporcionando uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 também podem ser úteis como um substituto parcial ou completo para medicamentos convencionais, tal como, e. g-. NSAID. Assim, a invenção compreende composições farmacêuticas para tratar doenças mediadas por cicloxigenase-2, como definidas acima, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida uma ou mais fracções de proteína de leite e/ou uma ou mais preparações de proteína de leite e um ou mais ingredientes terapeuticamente eficazes, tal como um analgésico; um potenciador; um antagonista H2, um descongestionante; um antitússico; um diurético; uma anti-histamina sedativa ou não sedativa; um agente para tratar ou prevenir cancro e/ou estados pré-cancerosos, etc.

As composições farmacêuticas contendo o(s) ingrediente (s) activo(s) podem estar em qualquer forma adequada para utilização oral, tais como, e. g., comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou em óleo, pós ou grânulos dispersíveis, emulsões, cápsulas duras ou macias, ou xaropes ou elixires.

As composições projectadas para utilização oral podem ser preparadas, de acordo com qualquer método conhecido na técnica, para o fabrico de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais agentes seleccionados do grupo consistindo em agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes conservantes de modo a proporcionar preparações farmaceuticamente elegantes e saborosas. 14

Os comprimidos contêm o(s) ingrediente(s) activo(s) em mistura com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes diluentes, granulantes, desagregantes e lubrificantes inertes, os quais são adequados para o fabrico de comprimidos. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no tracto gastro-intestinal e, assim, proporcionar uma acção sustida durante um período mais longo.

As formulações para utilização oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido inerte ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente activo é misturado com água ou um meio oleoso.

As suspensões aquosas contêm o material activo em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas, tais como, e. g., agentes de suspensão, agentes de dispersão ou molhantes, conservantes, agentes corantes, agentes aromatizantes e agentes adoçantes.

Os pós e grânulos dispersíveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa, pela adição de água, proporcionam o(s) ingrediente(s) activo(s) em mistura com um agente de dispersão ou molhante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Também podem estar presentes outros excipientes, por exemplo, agentes adoçantes, aromatizantes e corantes.

As fracções de proteína de leite e/ou as preparações de proteína de leite, como ilustradas acima, podem ser utilizadas em qualquer composição nutricional, farmacêutica ou alimentar 15 funcional, cujas composições podem compreender, e. g., pelo menos um componente do grupo consistindo em água, proteínas e/ou péptidos, gorduras e carboidratos. A referida composição pode ainda compreender minerais e vitaminas, e. g., numa quantidade de forma 30% a 150% da dosagem diária de acordo com U.S. RDA. Além disso, tais composições podem compreender material de fibra, agentes aromatizantes, emulsionantes, armadilhas de radicais, conservantes, ácidos, lípidos, frutos e sumos de fruta, chás, etc.

Em particular, as composições preparadas pela utilização da presente invenção podem compreender, e. g., uma composição alimentar seleccionada de leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados com base em leite, gelados, produtos com base em cereais, pós com base em leite, fórmulas infantis ou alimento para animal de estimação.

As formulações que se esperam ser muito aceites pelos consumidores são, por exemplo, bebidas, e. g., com base em produtos lácteos, bebidas convencionais, tais como água, sumos de fruta ou chás, compreendendo as fracções de proteína de leite e/ou preparações preparadas pela utilização da presente invenção.

Outros exemplos para formulações vantajosas são, e. g., composições na forma de preparações de sobremesa, géis ou espumas (tais como, e. g., "mousses" ("espumas"), manjares-brancos, gomas, flans, preparações com base em iogurte) ou na forma de refeições leves compreendendo um produto de padaria tendo um enchimento ou centro compreendendo as fracções de proteína de leite e/ou preparações de acordo com a presente invenção. As fracções de proteína de leite e/ou preparações 16 preparadas pela utilização da presente invenção também podem ser aplicadas, e. g., na forma de uma camada de topo ou revestimento em qualquer produto alimentar convencional ou serem incluídas como um material de enchimento em qualquer produto alimentar convencional. 0 produto preparado pela utilização da presente invenção, em que a actividade inibidora da cicloxigenase-2 é aumentada, pode ser, e. g., uma composição nutricional e/ou uma farmacêutica e/ou uma alimentar funcional, em particular, um produto alimentar lácteo. 0 processo para isolar a proteína de soro lácteo doce proporcionando uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 compreende os seguintes passos: centrifugar leite a 13600 g durante 30 minutos para obter uma camada de nata e uma camada de leite magro; separar a referida camada de nata; isolar o referido leite magro; adicionar uma solução aquosa de CaCl2, ao leite magro, numa quantidade tal que se obtenha uma mistura tendo uma concentração de 2 mmol/L de Ca2+; aquecer a referida mistura a 35 °C e adicionar coalho tendo uma actividade de 50 mg de quimosina activa por litro (e. g., numa quantidade de 0,4 a 0,6, de um modo preferido, 0,5 pL de coalho por mL de leite magro) à referida mistura ou aquecer a referida mistura a 25 °C e acidificar a referida mistura a um pH de 4,6 com uma solução aquosa de HC1 (32%); centrifugar a mistura a 13600 g durante 30 minutos de modo a obter uma separação de fase; e isolar a proteína de soro lácteo doce. O processo para isolar proteína de soro lácteo solúvel proporcionando uma actividade inibidora da cicloxigenase-2 compreende os seguintes passos: centrifugar leite a 13600 g 17 durante 30 minutos para obter uma camada de nata e uma camada de leite magro; separar a referida camada de nata; isolar o referido leite magro; adicionar uma solução aquosa de CaCl2, ao leite magro, numa quantidade tal que se obtenha uma mistura tendo uma concentração de 2 mmol/L de Ca2+; centrifugar durante 1 hora a 100000 g para separar a fase de proteína de soro lácteo solúvel a partir da fase de caseina micelar não solúvel; e isolar a fase de proteína de soro lácteo solúvel.

Devido à sua actividade inibidora da cicloxigenase-2, a fracção de proteína de leite preparada pela utilização da presente invenção irá proporcionar alternativas aos NSAID convencionais, em particular, em casos em que os referidos NSAID estão contra-indicados, tais como em casos de indivíduos que sofrem de úlceras, distúrbios de coagulação, doenças renais, etc. Além disso, pode esperar-se que tal produto irá estar essencialmente isento de efeitos secundários perniciosos e, assim, pode ser consumido até mesmo durante um longo período de tempo. Isto irá ser particularmente de elevado interesse quando for desejada uma prevenção de uma doença mediada por cicloxigenase-2, e. g., no caso de pessoas em que se presume terem um risco acrescido de desenvolver cancro devido à sua pré-disposição genética ou devido a uma exposição a factores de risco bem conhecidos (nutrição de elevado risco, tais como, e. g., uma típica "Alimentação ocidental" elevada em gorduras e baixa em fibras, exposição a químicos, etc.).

Como os produtos de leite têm sido consumidos desde longa data pelo Homem, pode esperar-se que um alimento funcional ou medicamento preparado pela utilização da presente invenção será muito bem aceite pelos consumidores. 18

Os seguintes exemplos ilustram a invenção sem a limitar às formas de realização especificas mencionadas.

Exemplos

Todos os solventes eram de grau analítico ou HPLC e foram adquiridos da Merck (Dietikon, Suiça). A água foi purificada internamente utilizando um sistema de purificação de água Millipore Milli-Q (Millipore, Volketswil, Suiça) ou era de grau HPLC (Merck, Darmstadt, Alemanha). CaCl2 x 2 H20, HC1 (32%), hidróxido de sódio, peridrol 30% H202 p. A. eram todos da Merck.

Coalho ("pressão simples") foi produzido pela TEXEL (38470 Vinay, França) e foi obtido da Rhone Poulenc Rohrer (Cooperation Pharmaceutique Francaise, 77000 Melun, França; Lote N° 101089007) com uma actividade de 50 mg de quimosina activa por litro.

Exemplo 1

Preparação de Amostra de Leite

Os passos padrão para a preparação de fracções de leite foram realizados como descrito em: C. Alais, Science du Lait, Príncipe des Techniques Laitieres. SEPAIC, Paris, 4a ed., 1984, p. 29-35 e 159-178, a não ser que de outro modo explicitamente indicado.

Os passos do fraccionamento à escala laboratorial indicados foram desenvolvidos a partir de processos lácteos industriais 19 convencionais. Surpreendentemente, a selectividade e eficácia de separação poderiam ser significativamente aumentadas pela realização dos passos de processo indicados a seguir. Em particular, pela realização de uma centrifugação a taxas de aceleração elevadas e passos de lavagem especificamente adaptados. 1.1 Leite bovino 0 leite bovino foi obtido de um mercado local ("Toni lait", Suiça).

Num primeiro passo, a nata foi extraída de leite inteiro por meio de uma centrifugação tendo uma taxa de aceleração até 13600 g utilizando um rotor de ângulo fixo Sorvai GS3 (9000 rpm, durante 30 minutos) . Partindo de 2200 mL de leite inteiro, foram recuperadas 90 g de nata na camada superior. Após separação da camada superior, foram obtidos 2090 mL de leite magro. A separação de soro lácteo doce a partir de caseína é conseguida por tratamento enzimático de leite magro induzindo a coagulação de caseína. 520 pL de uma solução aquosa de CaCl2 a 200 mM (200 mmol/L) foram adicionados a 520 mL de leite magro de modo a conseguir uma mistura tendo uma concentração final de 2 mM (mmol/L) de Ca2+. Esta mistura de leite magro foi aquecida a 35 °C e, em seguida, 250 pL de coalho foram imediatamente adicionados sob agitação magnética moderada. Após 1 min, a mistura foi incubada durante 50 min (minuto (s)) a 35 °C num banho de água, vertida em garrafas para centrifugação e subsequentemente centrifugadas durante 30 minutos a 13600 g 20 (rotor com ângulo fixo Sorvai GS3; 9000 rpm, 30 min) de modo a separar o soro lácteo doce da caseína do coalho não solúvel.

Os 4 76 mL de sobrenadante (í. e., o "soro lácteo doce ") foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo doce), congelados por imersão em azoto liquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína do coalho (45 g) foi dispersa em 286 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl e, em seguida, centrifugada; o sobrenadante (246 mL) foi dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (Lavagem de caseína do coalho) e congelados em azoto líquido.

As 31 g de caseína do coalho lavada recuperadas foram dispersas numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, de modo a que se obteve um volume de 250 mL. A mistura foi, então, dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (Caseína do coalho) e congelados. A separação de soro lácteo ácido de caseína é obtida por acidificação química de leite magro induzindo coagulação de caseína. 520 pL de uma solução aquosa a 200 mM (mmol/L) de CaCl2 foram adicionados a 520 mL de leite magro de modo a conseguir uma mistura tendo uma concentração final de 2 mM (mmol/L) de Ca2+. Esta mistura foi acidificada a 25 °C por adição de uma solução aquosa de HC1 (32%) desde pH 6,6 até pH 4,6 sob agitação magnética moderada. Após 1 min de agitação, a mistura foi incubada durante 60 min a 25 °C, vertida em garrafas para 21 centrifugação e, subsequentemente, centrifugada durante 30 min a 13600 g (rotor com ângulo fixo Sorvai GS3; 9000 rpm, durante 30 min) para separar soro lácteo ácido da caseína ácida não solúvel.

Os 503 mL de sobrenadante (i. e., o soro lácteo ácido) foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo ácido) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a -20 °C. A caseína ácida (41 g) foi dispersa em 233 mL de uma solução aquosa de acetato de sódio a 20 mM (mmol/L) tendo pH 4,6. A mistura assim obtida foi centrifugada e o sobrenadante (250 mL) foi separado e, subsequentemente, dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (Lavagem de caseína ácida) e congelados em azoto líquido.

Os 28,6 g recuperados de caseína ácida lavada foram dispersos em água. O pH desta mistura foi ajustado de 4,67 para 6,6 por uma adição de NaOH. Subsequentemente, o volume foi ajustado a 250 mL e a mistura assim obtida foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (Caseína ácida) e congelados.

De modo a separar proteínas (soro lácteo) solúveis e proteínas não solúveis lavadas (caseína micelar), foram realizados os seguintes passos: 250 pL de uma solução aquosa de CaCl2 a 200 mM (mmol/L) foram adicionados a 250 mL de leite magro para obter uma mistura tendo uma concentração final de 2 mM (mmol/L) de Ca2+. Este leite 22 foi ultra-centrifugado (6 tubos contendo 42,1 g de leite magro num rotor com ângulo fixo 45 TI foram centrifugados durante 1 h numa ultracentrifugadora Beckman L8-60M a uma velocidade de 32000 rpm correspondendo a 100000 g no meio do tubo) de modo a separar proteína de soro lácteo solúvel de caseina micelar não solúvel.

Os 228 mL de sobrenadante (i. e., a proteína de soro lácteo solúvel) foram fraccionados em alíquotas de 10 X 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Proteína de soro lácteo solúvel) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína micelar (24 g) foi dispersa em 220 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl. A mistura foi ultra-centrifugada (numa ultracentrifugadora Beckman L8-60M durante lha uma velocidade de 32000 rpm correspondendo a 100000 g no meio do tubo. O sobrenadante (229 mL) foi separado e, em seguida, dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (Lavagem de caseína micelar) e congelados em azoto líquido.

Os 22 g recuperados de caseína micelar lavada foram dispersos numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, de modo a obter-se um volume final de 250 mL. Esta mistura foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (caseína micelar) e congelados. 23 1.2. Leite materno humano 0 leite materno humano foi obtido de mães saudáveis que concordaram em doar amostras de leite materno em quantidades que não colocavam em risco o suplemento nutricional do bebé (10-60 mL) . As amostras foram obtidas até 70 dias após o parto por meio de bomba de peito ou, ocasionalmente, por meio manual e foram processadas dentro das 2 h após a recolha. Quando não indicado explicitamente de outro modo, todos os passos do processo foram realizados como descrito em 1.1. acima. 7,2 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 200 mM (mmol/L) foram adicionados a 715 mL de leite inteiro de modo a obter uma mistura de uma concentração final de 2 mM (mmol/L) de Ca2+. Após uma centrifugação para a separação de nata (como descrito em 1.1., acima), foram recuperados 26,6 g de nata como camada superior e foram separados 713 g de leite magro. A separação de soro lácteo doce/caseina é obtida por tratamento enzimático de leite magro induzindo coagulação de caseína. Foi aquecido leite magro (200 g) a 35 °C e, em seguida, foram imediatamente adicionados 100 pL de coalho sob agitação magnética moderada. Após 1 min, a mistura foi incubada durante 50 min a 35 °C num banho de água, vertida em garrafas para centrifugação e, subsequentemente, centrifugadas a 13600 g durante 30 min (como descrito em 1.1.) de modo a separar soro lácteo doce da caseina do coalho não solúvel.

Os 199 mL de sobrenadante (i. e., o soro lácteo doce) foram fraccionados em aliquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo doce) 24 e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a -20 °C. A caseína do coalho (2 g) foi dispersa em 98 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl. A mistura resultante foi centrifugada; o sobrenadante (99 mL) foi separado e, em seguida, dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (lavagem de caseína do coalho) e congelados em azoto líquido. A caseína do coalho 1,15 g recuperada foi dispersa numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso por volume de NaCl, de modo a obter um volume de 100 mL. Em seguida, a mistura resultante foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (caseína do coalho) e congelados. A separação de soro lácteo ácido de caseína é obtida por acidificação química de leite magro induzindo coagulação de caseína. Foram acidificados 200 mL de leite magro a 25 °C por adição de uma solução aquosa de HC1 (32%) desde pH 6,6 a pH 4,6 sob agitação magnética moderada. Após 1 min de agitação, a mistura foi incubada durante 60 min a 25 °C, vertida em garrafas para centrifugação e, subsequentemente, centrifugadas a 13600 g durante 30 min (como descrito no Exemplo 1.1) de modo a separar soro lácteo ácido da caseína ácida não solúvel.

Os 195 mL de sobrenadante (i. e., soro lácteo ácido) foram fraccionados em aliquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo 25 ácido) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína ácida (4,9 g) foi dispersa em 95 mL de uma solução aquosa de acetato de sódio a 20 mM (mmol/L) tendo pH 4,6, e a mistura foi centrifugada. O sobrenadante (96 mL) foi dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (Lavagem de caseína ácida) e congelados em azoto líquido.

Os 2,9 g recuperados de caseína ácida lavada foram dispersos em 95 mL de água. O pH desta mistura foi ajustado a 6,2 por adição de NaOH. Subsequentemente, o volume foi ajustado a 100 mL. Em seguida, a mistura foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (Caseína ácida) e congelados.

De modo a separar proteínas solúveis (soro lácteo) e proteínas não solúveis lavadas (caseína micelar), foram realizados os seguintes passos: O leite magro foi ultra-centrifugado como descrito em 1.1.

Os 198 mL de sobrenadante foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Proteína de soro lácteo solúvel) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína micelar (0,5 g) foi dispersa em 32 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl e ultra-centrifugada (como descrito no Exemplo 1.1). O sobrenadante assim obtido (32,8 mL) foi dividido em reservatórios, os quais 26 foram etiquetados (lavagem de caseína micelar) e congelados em azoto líquido.

Os 0,4 g recuperados de caseína micelar lavada foram dispersos numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, de modo a obter um volume de 33 mL. A mistura resultante foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (caseína micelar) e congelados. 1.3. Leite de búfalo O leite de búfalo fresco puro foi obtido na região de Lahore do Paquistão e fornecido refrigerado a um laboratório próximo onde foi liofilizado. A temperatura de congelamento foi de cerca de -20 °C a cerca de -25 °C e a temperatura de secagem foi de 40 °C. A pressão sob vácuo foi mantida abaixo de 2 Torr, com uma pressão final de 0,2 Torr. O pó seco foi selado em sacos de plástico revestidos com alumínio, expedidos e, em seguida, armazenados à temperatura ambiente. Quando não indicado explicitamente de outro modo, todos os passos do processo foram realizados como descrito no Exemplo 1.1. O leite de búfalo liofilizado foi reconstituído a 13% de sólidos totais (TS) por dissolução de 70 g do pó em 468 mL de H20, e adicionando 5,4 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 200 mM (200 mmol/L). Foram obtidos 543 mL de leite de búfalo reconstituído tendo uma concentração final de 2 mM de Ca2+. Após uma centrifugação para separação de nata, como apresentado no Exemplo 1.1., foram recuperados 46 g de nata como uma camada superior e foram separados 485 mL de leite magro. 27 A separação de soro lácteo doce de caseína foi obtida por tratamento enzimático de leite magro induzindo coagulação de caseína. Foram aquecidos 145 mL de leite magro a 35 °C, em seguida, foram imediatamente adicionados 73 pL de coalho sob agitação magnética moderada. Após 1 min, a mistura foi incubada durante 50 min a 35 °C num banho de água, vertida em garrafas para centrifugação e, subsequentemente, centrifugadas durante 30 min a 13600 g (como descrito no Exemplo 1.1) de modo a separar soro lácteo doce da caseína do coalho não solúvel.

Os 13 0 mL de sobrenadante (i. e., soro lácteo doce) foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo doce) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a -20 °C. A caseína do coalho (14 g) foi dispersa em 140 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, e centrifugada (como apresentado no Exemplo 1.1). O sobrenadante assim obtido (130 mL) foi dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (lavagem de coalho caseína) e congelados em azoto líquido.

Os 13 g recuperados de caseína do coalho lavado foram dispersos numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, de modo a obter um volume de 145 mL. Em seguida, a mistura resultante foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (caseína do coalho) e congelados. 28 A separação de soro lácteo ácido/caseína é obtida por acidificação química de leite magro induzindo coagulação de caseína. Foram acidificados 145 mL de leite magro a 25 °C por adição de 0,6 mL de uma solução aquosa de HC1 (32%) de pH 6,74 até pH 4,6 sob agitação magnética moderada. Após 1 min de agitação, a mistura foi incubada durante 60 min a 25 °C, vertida em garrafas para centrifugação e, subsequentemente, centrifugada durante 30 min a 13600 g (como descrito no Exemplo 1.1) de modo a separar soro lácteo ácido da caseína ácida não solúvel.

Os 129 mL de sobrenadante foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Soro lácteo ácido) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína ácida (13 g) foi dispersa em 130 mL de uma solução aquosa de acetato de sódio a 20 mM (mmol/L) tendo pH 4,6, e a mistura foi centrifugada (ver Exemplo 1.1). O sobrenadante (129 mL) foi dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (Lavagem de caseína ácida) e congelados em azoto líquido.

Os 12 g recuperados de caseína ácida lavada foram dispersos em água e o pH foi ajustado a 6,7 por adição de NaOH. Subsequentemente, o volume foi ajustado a 145 mL. Em seguida, a mistura foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (Caseína ácida) e congelados.

De modo a separar proteínas solúveis e proteinas não solúveis lavadas (caseína micelar), foram realizados os seguintes passos: 29 145 mL de leite de búfalo magro foram ultra-centrifugados (como descrito no Exemplo 1.1) para separar soro lácteo da caseína micelar não solúvel. Os 132 mL de sobrenadante foram fraccionados em alíquotas de 10 x 1,3 mL (Eppendorf) e tubos de plástico de 40 mL, os quais foram etiquetados (Proteína de soro lácteo solúvel) e congelados por imersão em azoto líquido e armazenados em saco de plástico a menos 20 °C. A caseína micelar gelatinosa (11,4 g) foi dispersa em 133 mL de uma solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl. A mistura foi ultra-centrifugada (ver 1.1., acima). O sobrenadante assim obtido (125 mL) foi dividido em reservatórios, os quais foram etiquetados (lavagem de caseína micelar) e congelados em azoto líquido.

Os 11 g recuperados de caseína micelar lavada foram dispersos numa solução aquosa de CaCl2 a 2 mM (mmol/L), a referida solução de CaCl2 tendo sido suplementada com 0,9% em peso de NaCl, de modo a obter um volume de 145 mL. Em seguida, a mistura resultante foi dividida em reservatórios, os quais foram etiquetados (caseína micelar) e congelados. 30

Exemplo 2

Sub-fraccionamento de proteína de soro lácteo solúvel a partir de Leite Bovino 15 mL de proteína de soro lácteo solúvel, obtidos como descrito no Exemplo 1, foram descongelados durante 20 min num banho de água a 37 °C, misturados por meio de vórtice e centrifugados 1 min a 13000 rpm numa centrifugadora 5415 Eppendorf. Após filtração num filtro Millipore de 0,45 pm (306/GSWP04700.GS), 10 mL desta preparação foi injectada numa coluna HRl6x50 enchida com 100 mL de Source 15 RPC TN 17-0727-02 (poliestireno-divinilbenzeno), a qual foi ligada a um sistema FPLC controlado por uma estação UNICORN (Amersham Pharmacia Biotech).

As condições cromatográficas foram:

Tampão A: TFA a 0,1% em água (2000 mL de água miliQ filtrada num sistema Millipore de 0,45 pm, mais 2 mL de TFA (Sigma 91699, 100 mL)):

Tampão B: acetonitrilo a 80%, TFA a 0,85% (400 mL de água miliQ filtrada num sistema Millipore de 0,45 pm, mais 1600 mL de acetonitrilo, desgaseifiçado num banho de ultra-som durante 15 minutos e, finalmente, complementado com 1,7 mL de TFA). 31 A coluna foi equilibrada com 20% de tampão B. Em seguida, após um volume da coluna (CV), a amostra foi injectada, o tampão B aumentado para 75% em 15 CV e para 100% em 2,5 CV. No final, o gradiente diminuiu para 20% de tampão B em 0,4 CV. A velocidade de fluxo foi fixada a 3 mL/min. 96 fracções de 18 mL foram recolhidas em tubos de plástico. As fracções foram mantidas a -20 °C. Após análise por HIC-HPLC, os 96 tubos recolhidos foram reunidos em 14 fracções por semelhança de perfil por HPLC e concentradas por evaporação antes de liofilização para rastreio subsequente. A tabela 1 mostra 14 sub-fracções de proteína de soro lácteo por uma gama em percentagem de vol. de tampão B ou uma gama em acetonitrilo, na qual as sub-fracções são eluídas. 32

Tabela 1

Sub-fracções de proteína de soro lácteo solúvel definidas por cromatografia de interacção hidrófoba fracção % de Tampão B inicial % de Tampão B final % de acetonitrilo inicial % de acetonitrilo final 1 20 26 16 20,8 2 26 35 20,8 28 3 35 43 28 34,4 4 43 44,5 34,4 35,6 5 44,5 47 35,6 37,6 6 47 48,5 37,6 38,8 7 48,5 50 38,8 40 8 50 51,5 40 41,2 9 51,5 52,5 41,2 42 10 52,5 54 42 43,2 11 54 58 43,2 46,4 12 58 60 46,4 48 13 60 70 48 56 14 70 100 56 80 Tampão A: Água TFA a 0,1% Tampão B: Acetonitrilo/Água/TFA (80%/19,15%/0,85%; v/v) Coluna: Source 15 RPC Amersham (matriz: Poliestireno/divinilbenzeno) , volume da coluna (CV = 100 mL) Gradiente: partindo de 20% de Tampão B, a amostra foi injectada após 1 volume de coluna (CV), em seguida, o gradiente aumentado até 75% de B em 15 CV, em seguida, 2 CV para atingir 100% de Tampão B 33

Exemplo 3

Rasteiro de COX-2 2.1 Material e método Células HUV-EC-C (uma linha celular endotelial permanente derivada da veia de um cordão umbilical humano normal; ATCC CRL1730; M. Miralpeix, M. Camacho et al., Brit. J. Pharmacol. 121 (1997), 171-180), foram semeadas em placas de 96 poços (RPMI 1640 + FCS a 10%) e tratadas com 100 nM (nmol/L) de forbol 12-miristato 13-acetato durante 6 h a 37 °C para induzir a isoenzima de COX-2. 50 μΜ (pmol/L) de ácido araquidónico foram então adicionados e as células foram incubadas na presença de compostos de ensaio ou misturas, durante 30 min a 37 °C. A produção de prostaglandina-E2 foi medida por radioimunoensaio (RIA) e a radioactividade determinada com um contador de cintilação (Topcount, Packard) utilizando um coquetel de cintilação liquido (Packard).

Os resultados obtidos são expressos como uma percentagem de valores de controlo e como uma percentagem de inibição de valores de controlo obtidos na presença dos compostos de ensaio. Os valores de controlo são obtidos por realização dos passos acima indicados, em que, no entanto, em vez de ... (parece que ainda falta algo - por favor indicar). 34 A concentração que provoca metade de uma inibição máxima dos valores de controlo (valor IC50) e coeficientes de Hill (nH) foram determinados para os compostos de referência (ciclo-heximida) por análise de regressão não linear das suas curvas de inibição. Estes parâmetros foram obtidos por interpolação da equação de Hill. Os valores de IC50 obtidos para os compostos de referência estavam dentro dos limites aceites de médias históricas obtidas ±0,5 unidades de log.

Todas as experiências de rastreio de COX-2 foram realizadas uma vez. No que se segue, os valores de inibição inferiores a 10% não foram considerados e foram indicados como "0". 2.2. Rastreio de COX-2 de fracção de leite Humano O leite humano magro apresenta uma inibição significativa de COX-2 (25%; Tabela 2). Quando a caseina é removida por acidificação ou coalho (dando soro lácteo ácido e soro lácteo doce, respectivamente), foram conseguidos valores de 51% e 58% de inibição de COX-2. Assim, a remoção de caseina melhorou bastante a inibição de COX-2. Além disso, as caseínas sozinhas (ácida, doce, micelar) não exibem nenhum efeito inibidor na COX-2. O soro lácteo solúvel de leite humano teve um desempenho semelhante ao produto de partida (i. e., leite humano magro). 35

Tabela 2

Resultados do ratreio de COX- 2 com fracções de leite humano. TS, sólidos totais Leite Humano Magro Código TS (mg/mL) diluição para 50 gg/mL proteína estimada (mg/mL) COX-2 inibição em (%) Leite humano magro (comparativo) soro lácteo ácido de H2 100 5,00R-04 10 25 leite humano H3 80 6,25E-04 6 51 (comparativo) soro lácteo doce de HM H4 80 6,25E-04 6 58 soro lácteo solúvel de HM (comparativo) H5 80 6,25E-04 6 26 caseína ácida de HM (comparativo) H6 10 5,00E-03 10 0 caseína doce de HM (comparativo) H7 10 5,00E-03 10 0 caseína micelar de HM (comparativo) H8 5 1,00E-02 5 0 2.3 rastreio de COX-2 de Leite de búfalo (comparativo) 0 leite de búfalo magro apresenta um efeito inibidor médio (36%; Tabela 3). Contrariamente ao leite humano, a remoção ácida de caseínas conduz a uma perda de dois terços da sua actividade (inferior a 12%), provavelmente devido a uma perda de actividade induzida por ácido após acidificação, se o pH é mantido constante (í. e., no caso de tratamento com coalho e ultra-centrifugação), a actividade aumenta para 44% em ambos os casos. 36

Como com leite humano, as caseínas micelares de leite de búfalo não mostraram qualquer actividade. As caseínas ácida e doce não foram ensaiadas devido à sua falta de solubilidade.

Tabela 3

Resultados de rastrelo de COX -2 com leite de búfalo. TS, sólidos totais. proteína Leite de Búfalo (BM) Código TS (mg/mL) diluição para 50 ]ig/mL estimada (mg/mL) na amostra COX-2 inibição (%) leite de búfalo magro (BM) B2 100 5,00E-04 30 36 soro lácteo ácido de BM B3 70 7,14E-04 6 12 soro lácteo doce de BM B4 70 7,14E-04 6 44 soro lácteo solúvel de BM B5 70 7,14E-04 6 44 caseína ácida de BM não solúvel caseina doce de BM não solúvel caseína micelar de BM B8 25 2,00E-03 25 0 37 2.4 Rastreio de COX-2 de Leite de vaca

As elevadas actividades de leite de vaca cru e magro (52-53%; Tabela 4) demonstram que a eliminação de nata não tem qualquer efeito na inibição de COX-2. A actividade permanece constante em soro lácteo solúvel (53%), diminui ligeiramente em soro lácteo ácido (45%) e aumenta em soro lácteo doce (68%). Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, o decréscimo da actividade em soro lácteo ácido pode, como no leite de búfalo, estar relacionado à influência do ácido, ao passo que o aumento de actividade após tratamento com coalho poderia ser explicado pela teoria de que a destabilização de caseína liberta alguma bioactividade "latente", tal como é por vezes descrito durante "destilação fraccionada imperfeita", conduzindo a um rendimento superior a 100%. 38

Tabela 4

Resultados de rastreio de COX-2 com leite bovino. TS, sólidos totais. proteína Leite de vaca (CM) Código TS (mg/mL) diluição para 50 gg/mL estimada (mg/mL) na amostra COX-2 inibição (%) leite de vaca CM (comparativo) Cl 100 5,00E-04 31 53 CM magro(comparativo) C2 100 5,00E-04 35 52 soro lácteo ácido de CM (comparativo) C3 70 7,14E-04 6 45 soro lácteo doce de CM C4 70 7,14E-04 6 68 soro lácteo solúvel de CM (comparativo) C5 70 7,14E-04 6 53 caseína ácida CM (comparativo) C6 50 1,00E-03 50 42 caseína doce CM (comparativo) Cl 50 1,00E-03 50 65 caseina micelar CM (comparativo) C8 25 2,00E-03 25 0 2.5 Rastreio de COX-2 de preparações de proteína de soro lácteo (comparativo)

Duas preparações de proteína de soro lácteo comercialmente disponíveis também foram submetidas a uma rastreio de COX-2: 39

Lacprodan 80 (MD Foods Ingredients, Viby, Dinamarca) a qual contém elevadas quantidades de formas de lactosil β-lactoglobulina; WPI 95, um isolado de proteína de soro lácteo natural, a qual é virtualmente baixa em lactosil β-lactoglobulina (verificada por espectrometria de massa). WPI está disponível em: Davisco Foods International. Inc. 620 North Main, Le Sueur, MN 56058 EUA; BIPRO lote JE 251-0-420.

Tabela 5

Resultados de rastreio de COX- 2 com preparações de proteína de soro lácteo. TS, sólidos totais. proteína Preparação de lácteo soro Código de proteína TS (mg/mL) diluição para 50 gg/mL estimada (mg/mL) na amostra COX-2 inibição (%) Lacprodan 80 LN 100 5,00E-04 80 23 soro lácteo natural WPI 95 NW 100 5,00E-04 95 33 cisteína CY 10 5,00E-03 10 0 hidrolisado tripsínico de soro DH 100 5,00E-04 80 0 lácteo DM 10

Como se pode deduzir da Tabela 4, também estes compostos apresentam uma actividade de inibição da COX-2 considerável de 40 23% e 33%, respectivamente. Contrariamente a isto, uma proteólise por tripsina destrói a actividade da inibição de COX-2 de proteína de soro lácteo. Além disso, a cisteína "aminoácido anti-oxidante" natural não tem nenhum efeito na inibição de COX-2. 2.5. Ra st rei o de COX-2 de leite bovino oxidado comparativo

As amostras de leite bovino fresco (50 mL) foram suplementadas com peridrol (H2O2 a 30%) de modo a obter uma concentração final de 0,1 mM, 1 mM, 10 mM, 100 mM (mmol/L) de H202 na mistura resultante. Todas as amostras foram incubadas durante 4 h a 30 °C.

Tabela 6

Resultados de rastreio de COX-2 com leite bovino oxidado TS, sólidos totais proteína Oxidação de Proteína Código TS (mg/mL) diluição para 50 μ g/mL estima da (mg/mL) na amostra COX-2 inibição (%) leite bovino fresco LI 100 5,00E-04 3,1 41 leite bovino fresco H202 0,1 L2 100 5,00E-04 3,1 41 leite bovino fresco h2o2 1 L3 100 5,00E-04 3,1 35 leite bovino fresco leite bovino h2o2 10 L4 100 5,00E-04 3,1 27 fresco h2o2 100 L5 100 5,00E-04 3,1 0 mM 41

Leite bovino não tratado e leite tratado com H202 a 0,1 mM apresentam o mesmo efeito "médio" na inibição de COX-2 (41%). Com h202 a 1 mM, a inibição diminui ligeiramente (para 35%), aumento adicional para 10 mM reduz a inibição de COX-2 para 27%, e com H202 a 100 mM - o que está, no entanto, longe das condições fisiológicas - não se observou mais nenhuma actividade inibidora.

Os resultados indicam que o activo, i. e., o componente supressor de COX-2 em leite bovino resiste a H202 ao nivel de 0,1-10 mM. O decréscimo do efeito inibidor corresponde ao aumento de oxidação de proteína, o que indica que a actividade inibidora de COX-2 tem por base a proteína e está fortemente relacionada com o estado natural da proteína. 2.6. Rastreio de COX-2 de sub-fracções de proteínas de soro lácteo solúveis

Os resultados da inibição de COX-2 pelas sub-fracções de proteína de soro lácteo solúveis estão indicados na tabela 7. Os valores positivos indicam um melhor desempenho quando comparado com o controlo.

Tabela 7

Resultados da inibição de COX II fracção HIC % de inibição de valores de controlo 1 21 2 -3 3 -7 42 (continuação)

Resultados da inibição de COX II fracção HIC % de inibição de valores de controlo 4 7 5 -17 6 -21 7 -55 8 10 9 36 10 41 11 12 12 12 13 10 14 52

Lisboa, 6 de Novembro de 2008 43

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma ou mais fracções de proteína de leite exibindo uma actividade inibidora de cicloxigenase-2 para a preparação de uma composição nutricional e/ou farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção doenças mediadas por cicloxigenase-2, em que as referidas fracções de proteína de leite são seleccionadas de caseína doce de leite de vaca, soro lácteo doce de leite de vaca e soro lácteo doce de leite humano.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a composição nutricional e/ou farmacêutica é proporcionada na forma de dosagem oral, tópica, parentérica ou rectal.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que as doenças mediadas por cicloxigenase-2 são seleccionadas do grupo consistinto em cancro e/ou estados pré-cancerosos, em particular, cancro e/ou pré-cancerosos do cólon, estômago, esófago, fígado, corpo biliar, pâncreas, cabeça e pescoço, pulmão, mama, bexiga, órgãos genitais femininos e pele e/ou doenças inflamatórias, em particular, artrite, febre reumática, sintomas associados a gripe ou outras infecções virais, dismenorreia, dor de cabeça, dor de dentes, doenças degenerativas de articulação, e/ou doença de Alzheimer.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a composição farmacêutica e/ou nutricional proporciona um co-tratamento durante um tratamento de cancro e/ou um tratamento de um estado pré-canceroso, em particular, durante uma quimioterapia, uma terapia de 1 radiação, uma bioterapia e/ou durante um tratamento de dor, e/ou durante um tratamento de uma doença inflamatória e/ou durante o tratamento de doença de Alzheimer. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a composição nutricional compreende um material alimentar seleccionado de leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, produtos à base de cereais, pós à base de leite, fórmulas infantis. Lisboa 6 de Novembro de 2008 1/4

   Fig. 1 2/4

   Caseína de coalho

   Proteína não solúvel Caseína micelar

   Fig. 2 3/4

   4/4

   Fig. 4