PT1473294E - 1,3-oxatiolanos substituídos com propriedades antivirais. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "1,3-OXATIOLANOS SUBSTITUÍDOS COM PROPRIEDADES ANTIVIRAIS" A presente invenção relaciona-se com novos compostos de 1,3-oxatiolano substituído possuindo actividade farmacológica, com composições farmacêuticas que os contêm e com a utilização destes compostos no tratamento antiviral de mamíferos.

As infecções retrovirais são uma causa importante de doença, de modo muito particular, da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). 0 vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi identificado como o agente etiológico da SIDA. Estão a ser activamente procurados compostos que possuam um efeito inibidor da multiplicação do HIV ou que sejam, de outro modo, eficazes na terapêutica de infecções retrovirais. H. Mitsuya et al., "3'-Azido-3'-deoxithymidine (BW A509U): An antiviral agent that inhibits the infectivity e cytopathic effect of human T-lymphotropic virus type Ill/lymphadenopathy-associated virus in vitro", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, pág. 7096-7100 (1985), relaciona-se com 3'-azido-3'-desoxitimidina de fórmula (A), geralmente referida como AZT. Este composto é mencionado como sendo útil em proporcionar alguma protecção para portadores de SIDA contra o efeito citopatogénico do vírus da imunodeficiência (HIV). 2 2

CH, m H. Mitsuya e S. Broder, "Inhibition of the in vitro infectivity and cytopathic effect of human T-lymphotrophic virus type III/lymphadenopathy-associated vírus (HTLV-III/LAV) by 2',3'-dideoxinucleosides", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pág. 1911-15 (1986), descreveram também um grupo de 2',3'-didesoxinucleósidos mostrados na fórmula (B) os quais são mencionados como possuindo actividade protectora contra a citopatogenicidade induzida pelo HIV.

P. Herdewijn et al., "3'-Substituted 2',3'-dideoxinucleoside analogues as potential anti-HIV(HTLV-III/LAV) agents", J. Med. Chem., 30, pág. 1270-1278 (1987), descreveram a actividade anti-Ηΐν de um conjunto de análogos de nucleósidos substituídos na posição 3'. Embora os análogos 3'-fluoro de 3'-desoxitimidina e 2',3'-didesoxi-citidina mostrados nas fórmulas (C) e (D) possuam uma actividade anti-retroviral potente, os substituintes ligados ao carbono 3' via uma ponte tio ou oxigénio não produzem produtos activos. 3

A análise de estudos de conformação molecular em P. Van Roey et al., "Correlation between preferred sugar ring conformation and activity of nucleoside analogues against human immunodeficiency virus", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86(10), pág. 3929-3933 (1989), indica que os análogos de nucleósidos anti-HIV activos têm conformações de carbono 3' no lado oposto à base. D. Huryn et al., "Synthesis of iso-ddA, member of a novel class of anti-HIV agents", Tetrahedron Lett., 30(46), pág. 6259-6262 (1989), refere-se ao análogo iso-nucleósido de fórmula (E) como um inibidor estável da replicação de HIV.

R. Vince e M. Hua, "Synthesis and anti-HIV activity of carbocyclic 2,,3,-didehidro-2,,3,-dideoxilo 2,6-disubstituted purine nucleosides", J. Med. Chem., 33(1), pág. 17-21 (1990), descreve os análogos mostrados nas fórmulas (F) e (G) como possuindo actividade anti-HIV. O análogo insaturado (F) apresenta uma maior selectividade e 4 potência como um inibidor da replicação do HIV do que o análogo saturado (G). 4

C. Chu et al., "Synthesis and structure-activity relationships of 6-substituted 2',3'-dideoxipurine nucleosides as potential anti-human immunodeficiency virus agents", J. Med. Chem., 33(6), pág. 1553-1561 (1990), descreve o derivado N6-metilo mostrado na fórmula (H) como possuindo uma maior potência contra o HIV do que a 2',3'-didesoxiadenosina não metilada.

Finalmente, B. Belleau et al., "Design and activity of a novel class of nucleoside analogues effective against HIV-1", Resumos de artigos, Fifth International Conference on AIDS, Montreal, T.C.O. 1, pág. 515 (1989), refere-se a dioxolanos e oxatiolanos de fórmulas (J) e (K) como possuindo uma actividade anti-HIV potente.

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Foi constatado que o isómero eis de fórmula (K) era activo contra os HIV e HBV, e foi determinado que o seu enantiómero não natural ( (2R,5S eis) mencionado como "o enantiómero (-)" tinha uma toxicidade surpreendentemente baixa. Agora designado de lamivudina ou "3TC™, este novo fármaco antiviral está a tornar-se a escolha para a terapia de associação de doentes com SIDA e para terapia única e doentes com HBV.

Apesar de a lamivudina (3TC™) ter sido considerada um composto extremamente interessante em clínica, existe sempre a possibilidade de que o doente desenvolva estirpes virais que lhe são resistentes após períodos de tratamento prolongado. Por conseguinte, continua a existir uma necessidade para o desenvolvimento de agentes antivirais que sejam activos contra estirpes virais resistentes aos nucleósidos, em particular, contra estirpes virais resistentes à 3TC™.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Determinou-se que as classes de compostos conhecidas como 1,3-oxatiolanos 2-substituídos 4-substituídos possuem actividade antiviral potente. Em particular, constatou-se que estes compostos actuam como inibidores potentes da replicação do HIV-1 em linfócitos T ao longo de um período de tempo prolongado com menos efeitos secundários citotóxicos do que os compostos conhecidos na técnica. Constatou-se também que estes compostos eram activos contra estirpes de HIV resistentes à 3TC. Estes compostos também são úteis na profilaxia e tratamento de infecções pelo vírus da hepatite B. 6 São por consequência proporcionados num primeiro aspecto desta invenção enantiómeros individuais de compostos de fórmula (I) a configuração cis: 6 RjOCHj

em que Ri é hidrogénio, R.2 é citosina ou 5-fluorocitosina, e seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis.

Como aqui utilizado, "um sal, éster ou sal de um tal éster farmaceuticamente aceitável, de um composto de fórmula (I) ou qualquer outro composto que, após administração ao receptor, seja capaz de proporcionar (directa ou indirectamente) um composto de fórmula (I) ou um seu metabolito ou residuo activo como antiviral.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula (I) incluem os derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de ácidos adequados incluem os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, p-toluenossulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfónico, fórmico, benzóico, malónico, naftaleno-2-sulfónico e benzenossulfónico. Outros ácidos tal como o oxálico, apesar de não serem eles próprios farmaceuticamente, podem ser úteis a preparação de sais úteis como intermediários na obtenção de compostos da invenção e dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. 7

Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sódio), metal alcalino-terroso (por exemplo, magnésio), amoníaco e N-(alquil C4_4)4+.

Os especialistas na técnica compreenderão que os compostos de fórmula (I) podem ser modificados para proporcionar os seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis, em grupos funcionais tanto na unidade de citosina como no grupo hidroximetilo do anel de oxatiolano. A modificação em todos esses grupos funcionais está incluída dentro do âmbito da invenção. No entanto são de particular interesse os sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, ésteres ou ésteres de aminoácidos) obtidos através da modificação do grupo 2-hidroximetilo do anel de oxatiolano.

Os ésteres preferidos dos compostos de fórmula (I) incluem os compostos nos quais R4 está substituído por uma função carboxilo R-(CO) na qual a unidade não carbonilo R do agrupamento éster é seleccionada de hidrogénio, alquilo de cadeia linear ou ramificada (por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, t-butilo, n-butilo), alcoxialquilo (por exemplo, metoximetilo), aralquilo (por exemplo, benzilo), ariloxialquilo (por exemplo, fenoximetilo), arilo (por exemplo, fenilo opcionalmente substituído com halogéneo, alquilo Ci_4 ou alcoxilo Ci_4) ; di-hidropiridinilo substituído (por exemplo, N-metildi-hidropiridinilo); ésteres de sulfonato tais como alquil- ou aralquilsulfonilo (por exemplo, metanossulfonilo); ésteres de sulfato; ésteres de aminoácido (por exemplo, L-valilo ou L-isoleucilo) e ésteres de mono, di- ou trifosfato.

Estão também incluídos dentro do âmbito de tais ésteres os ésteres derivados de ácidos polifuncionais tais como ácidos 8 carboxílicos contendo mais do que um grupo carboxilo, por exemplo, ácidos dicarboxílicos H02C (CH2) nC02H em que n é um número inteiro de 1 até 10 (por exemplo, ácido succínico) ou ácidos fosfóricos. Os métodos para preparar tais ésteres são bem conhecidos. Ver, por exemplo, E. Hahn et al., "Nucleotide dimers as anti-human immunodeficiency virus agents", Nucleotide Analoques As Antiviral Aqents, J.C. Martin, Ed. Symposium Series #401, American Chemical Society, pág. 156-159 (1989) e M. Busso et al., "Nucleotide dimers suppress HIV expression in vitro", AIDS Research e Human Retroviruses, 4(6), pág. 449-455 (1988).

Compostos específicos de fórmula (I) incluem:

Composto #1:

2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; composto #2:

2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; composto #3:

9 2R-hidroximetil-4R-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1, 3-oxatiolano; e composto #4:

2S-hidroximetil-4S-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; e os seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis.

Nos processos para preparar os compostos desta invenção utiliza-se as seguintes definições: R2 é citosina ou 5-fluorocitosina; R„ é hidrogénio, um grupo sililo trissubstituido, alquilo Ci_6, aralquilo tal como benzilo ou tritilo, acilo Ci_i6, preferencialmente um benzoilo ou um benzoilo substituído em qualquer posição com pelo menos um halogéneo (bromo, cloro, flúor ou iodo), alquilo Ci_6, alcoxilo Ci_6^ nitro ou trifluorometilo;

Rx é alquilo Ci-e; e L é um "grupo de saída", isto é, um átomo ou grupo que é deslocado por reacção com uma base apropriada, com ou sem um ácido de Lewis. Os grupos de saída adequados incluem grupos aciloxilo, grupos alcoxilo, por exemplo, grupos alcoxicarbonilo tais como etoxicarbonilo; halogéneos tais como iodo, bromo, cloro ou flúor; amido; azido; isocianato; tiolatos saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos, tais como tiometilo ou tiofenilo; compostos de seleno ou selenino saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos, tal com selenieto de fenilo ou selenieto de alquilo; e cetonas aromáticas ou 10 alifáticas saturadas ou insaturadas, substituídas ou não substituídas tal como metilcetona.

Um grupo de saída adequado também pode ser -OR, em que R é um grupo alquilo saturado ou insaturado, substituído ou não substituído, por exemplo, um grupo alquilo ou alcenilo Ci_6; um grupo acilo alifático ou aromático, substituído ou não substituído, por exemplo, um grupo acilo alifático Ci-6 tal como acetilo e um grupo acilo aromático tal como benzoilo; um grupo alcoxi- ou ariloxicarbonilo saturado ou insaturado, substituído ou não substituído, tal como carbonato de metilo e carbonato de fenilo; sulfonilimidazolida substituída ou não substituída; grupo aminocarbonilo alifático ou aromático, substituído ou não substituído, tal como fenilcarbamato; grupo alquilimidato substituído ou não substituído tal como tricloroacetamidato; fosfonatos saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos, tal como fosfonato de dietilo; grupo sulfonilo aromático ou alifático substituído ou não substituído, tal como tosilato; ou hidrogénio.

Os compostos de oxatiolano de fórmula (I),

e sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis, podem ser preparados segundo os processos aqui discutidos ou por qualquer método conhecido na técnica para a preparação de compostos de estrutura análoga. O composto desta invenção pode ser produzido pelos métodos descritos por Mansour et al., "Anti-Human Immunodeficiency Virus and Anti-Hepatitis-B Virus Activities and Toxicities of the Enantiomers of 2'-Deoxi-3'-oxa-4'-thiacytidine and Their 5-Fluoro Analogues 11 in vitro", J. Med. Chem., 1995, Vol. 38, N° 1, pág. 1-4, a qual é aqui incorporada por referência.

Num desses processos para produzir oxatiolanos desta invenção, um composto de fórmula (V),

(V) em que Rw é hidrogénio ou um grupo de protecção de hidroxilo e L é um átomo ou grupo substituível, isto é, um grupo de saída, é feito reagir com uma base apropriada.

Num segundo processo para produzir os oxatiolanos desta invenção, um composto de fórmula (VI)

pode ser convertido num composto de fórmula (I) por conversão de um grupo nh2 anomérico na base pretendida por métodos bem conhecidos na técnica de química de nucleósidos.

Os 1,3-oxatiolanos de fórmula (I) também podem ser preparados, por exemplo, por reacção de um aldeído de fórmula (VII) C6H5COOCH2CHO (VII) com 2-mercaptoetanol num solvente orgânico compatível seguida de rearranjos de Pummerer como é conhecido na técnica (T. Durst, "Dimethylsulfoxide in Organic Synthesis", Adv. Org. Chem., E.C. Tailor e B. Wynberg, Eds., 6, pág. 356-365 (1969)) para dar 1,3-oxatiolanos de fórmula (V), os quais são convertidos em 1,3-oxatiolanos de 12 fórmula (I) por métodos conhecidos na técnica de química de nucleósidos.

Outro processo para a preparação dos 1,3-oxatiolanos de fórmula (I) é ilustrado no ESQUEMA 1.

Os vários passos envolvidos na síntese de 1,3-oxatiolanos de fórmula (I) como ilustrados no ESQUEMA 1 podem ser descritos abreviadamente como se segue: ESQUEMA 1 m C^jCOOCWjCHO {VII}

«HjCOOCHj

Passo 1: 0 benzoiloxiacetaldeído de fórmula (VII) ou qualquer aldeído da fórmula RwOCH2CHO (C.d. Hurd e e.m. Filiachione, "A new approach to the syntheses of aldehyde sugars", J. Am. Chem. Soc., 61, pág. 1156-1159 (1939)) é condensado com um mercapto-álcool tal como 2-mercaptoetanol num solvente orgânico compatível, tal como tolueno, 13 contendo uma quantidade catalítica de um ácido forte para dar o intermediário mostrado na fórmula (VIII).

Passo 2: 0 1, 3-oxatiolano de fórmula (vni) é depois oxidado com um perácido tal como ácido monoperoxiftálico magnésio num solvente orgânico compatível tal como cloreto de metileno contendo um sal tal como brometo de tetrabutilamónio para dar o intermediário sulfóxido mostrado na fórmula (IX).

Passo 3: 0 intermediário sulfóxido mostrado na fórmula (IX) é tratado com um anidrido tal como anidrido acético ou qualquer outro anidrido da fórmula (RXC0)20 na presença de um tampão tal como acetato de tetra-n-butilamónio para dar o 1,3-oxatiolano 2,4-dissubstituído de fórmula (X) (T. Durst, Adv. Org. Chem., 6, pág. 356-365 (1969)).

Passo 4: 0 1,3-oxatiolano de fórmula (X) é depois feito reagir com uma base de pirimidina ou seu análogo, (por exemplo, citosina) previamente sililada com, por exemplo, hexametildissilazano num solvente compatível utilizando um ácido de Lewis ou triflato de trimetilsililo para dar o intermediário de fórmula (XI) como isómeros cis e trans. Os isómeros podem ser separados, preferencialmente por cromatografia, para dar cis (XI) puro e trans (XI) puro.

Passo 5: A função benzoato do composto de fórmula (XI) (isómero cis ou trans) é hidrolisada utilizando uma base tal como amoníaco metanólico para se obter o composto mostrado na fórmula (XII) como isómero cis ou trans. Preferencialmente sob pressão para dar o produto mostrado na 14

Muitas das reacções nos processos descritos acima foram consideravelmente descritas no contexto da síntese de nucleósidos de pirimidina, por exemplo, em L.B. Townsend, "Synthesis and reaction of pirimidine nucleoside", Chemistry of Nucleoside e Nucleotides vol. 1, Eds., Plenum Press, New York (1989) nas páginas 1-95, cujo texto é aqui incorporado por referência.

No processo descrito acima, os compostos de fórmula (I) são geralmente obtidos como uma mistura dos isómeros cis e trans.

Os isómeros cis e trans podem ser separados, por exemplo, por acetilação, por exemplo, com anidrido acético seguida de separação por meios físicos, por exemplo, cromatografia sobre sílica gel e desacetilação, por exemplo, com amoníaco metanólico ou por cristalização fraccionada. A resolução do produto final, ou de um intermediário ou material de partida pode ser assim conseguida por qualquer método adequado conhecido na técnica: ver por exemplo, Stereochemistry of Carbon Compounds, by E.L. Eliel (McGraw Hill, 1962) e Tables of Resolving Agents, by S.H. Wilen.

Nos casos em que o composto de fórmula (I) é desejado como um enantiómero individual ele pode ser obtido quer por resolução da mistura dos dois enantiómeros cis (por HPLC quiral) ou por síntese estereoespecífica a partir do material de partida ou qualquer intermediário conveniente isomericamente puro. Assim, o composto de fórmula (I) ou qualquer intermediário conveniente pode ser obtido por HPLC quiral utilizando uma fase estacionária adequada por exemplo β-ciclodextrina acetilada ou triacetato de celulose e um solvente adequado por exemplo um álcool tal como 15 etanol ou uma solução aquosa tal como acetato de trietilamónio. Alternativamente, o composto de fórmula (I) ou qualquer intermediário conveniente pode ser resolvido por catabolismo enantiosselectivo mediado por enzimas com uma enzima adequada tal como citidina desaminase ou degradação enzimatica selectiva de um derivado adequado utilizando uma 5'-nucleotidase por exemplo ver Storer et al., "The resolution and Absolute Stereochemistry of the Enantiomers of cis-1[2(Hydroxomethyl)-1,3-Oxathiolan-5-yl)Cytosine (BCH-189): Equipotent Anti-HIV Agents", Nucleosides & Nucleotides, 12(2), 225-236 (1993). Quando a resolução é efectuada enzimaticamente, a enzima pode ser utilizada em solução ou na forma imobilizada. As enzimas na forma imobilizada são conhecidas na técnica por exemplo, por absorção numa resina tal como Eupergit.

Entender-se-á que as reacções dos processos acima descritos podem requerer a utilização, ou ser convenientemente aplicadas, a materiais de partida possuindo grupos funcionais protegidos, podendo ser assim requerida desprotecção como um passo intermediário ou final para produzir o composto desejado. A protecção e desprotecção de grupos funcionais pode ser efectuada utilizando meios convencionais. Assim, por exemplo, os grupos amino podem ser protegidos por um grupo seleccionado de aralquilo (por exemplo, benzilo), acilo ou arilo (por exemplo, 2,4-dinitrofenilo); sendo a remoção subsequente do grupo de protecção efectuada quando desejada por hidrólise ou hidrogenólise, consoante apropriado, utilizando condições correntes. Os grupos hidroxilo podem ser protegidos utilizando qualquer grupo de protecção de hidroxilo convencional, por exemplo, como descrito em "Protective Groups in Organic Chemistry", Ed. J.F.W. McOmie (Plenum 16

Press, 1973) ou "Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W. Greene (John Wiley e Sons, 1981 o qual é aqui incorporado por referência). Exemplos de grupos de protecção de hidroxilo adequados incluem grupos seleccionados de alquilo (por exemplo, metilo, t-butilo ou metoximetilo), aralquilo (por exemplo, benzilo, difenilmetilo ou trifenilmetilo), grupos heterocíclicos tais como tetra-hidropiranilo, acilo, (por exemplo, acetilo ou benzoilo) e grupos sililo tais como trialquilsililo (por exemplo, t-butildimetilsililo). Os grupos de protecção de hidroxilo podem ser eliminados por técnicas convencionais. Assim, por exemplo, os grupos alquilo, sililo, acilo e heterociclico podem ser eliminados por solvólise, por exemplo, por hidrólise em condições ácidas ou básicas. Os grupos aralquilo tal como trifenilmetilo podem ser igualmente eliminados por solvólise, por exemplo, por hidrólise sob condições ácidas. Os grupos aralquilo tal como benzilo podem ser clivados, por exemplo, por tratamento com BF3/eterato e anidrido acético seguido de remoção dos grupos acetato assim obtidos numa etapa apropriada da síntese. Os grupos sililo também podem ser convenientemente eliminados utilizando uma fonte de iões fluoreto tal como fluoreto de tetra-n-butilamónio.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção podem ser preparados como se descreve na Patente dos Estados Unidos n° 4 383 114, cuja descrição é aqui incorporada por referência. Assim, por exemplo, quando se desejar preparar um sal de adição de ácido de um composto de fórmula (I), o produto de qualquer um dos procedimentos acima pode ser convertido num sal por tratamento da base livre resultante com um ácido adequado utilizando métodos convencionais. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente 17 aceitáveis podem ser preparados fazendo reagir a base livre com um ácido apropriado opcionalmente na presença de um solvente adequado tal como um éster (por exemplo, acetato de etilo) ou um álcool (por exemplo, metanol, etanol ou isopropanol). Os sais básicos inorgânicos podem ser preparados fazendo reagir a base livre com uma base adequada tal como um alcóxido (por exemplo, metóxido de sódio) opcionalmente na presença de um solvente tal como um álcool (por exemplo, metanol). Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser preparados a partir de outros sais, incluindo outros sais farmaceuticamente aceitáveis, dos compostos de fórmula (I) utilizando métodos convencionais.

Um composto de fórmula (I) pode ser convertido num fosfato farmaceuticamente aceitável ou outro éster por reacção com um agente de fosforilação, tal como P0C13, ou um agente de esterificação adequado, tal como um halogeneto ou anidrido ácido, consoante apropriado. Um éster ou sal de um composto de fórmula (I) pode ser convertido no composto parental, por exemplo, por hidrólise.

Os compostos da invenção possuem actividade antiviral. Em particular, estes compostos são eficazes na inibição da replicação do vírus da hepatite B e retrovírus, incluindo dos retrovírus humanos tais como os vírus de imunodeficiências humanas (Hiv), os agentes causadores da SIDA. É assim proporcionado como um outro aspecto da invenção um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável para ser utilizado como um agente terapêutico activo em particular como um agente 18 antiviral, por exemplo no tratamento de infecções virais de hepatite B e infecções retrovirais tal como a infecção pelo HIV. É também proporcionado num aspecto adicional ou alternativo desta invenção, a utilização de um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infecção virai.

Essas infecções virais podem ser, em particular infecções pelo hiv e hbv.

Num aspecto adicional ou alternativo é proporcionado um método para o tratamento de uma infecção virai, em particular uma infecção provocada pelo vírus da hepatite B ou um retrovírus tal como o HIV, num mamífero, incluindo um ser humano, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto antiviral de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da invenção também são úteis no tratamento de patologias relacionadas com a SIDA tais como complexo relacionado com a SIDA (ARC), lifadenopatia generalizada persistente (PGL), estados neurológicos relacionados com a SIDA (tal como demência), patologias positivas de anticorpos anti-Hiv e HIV, sarcoma de Kaposi, trombocitopenia púrpura e infecções oportunistas.

Os compostos da invenção são também úteis na prevenção da progressão para a doença clínica de indivíduos que são positivos para o anticorpo anti-HIV ou antigénio de HIV e na profilaxia após exposição ao HIV. 19

Os compostos de fórmula (I) ou os seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis também podem ser utilizados para a prevenção de contaminação virai de fluidos biológicos tais como sangue ou sémen in vitro.

Os especialistas na técnica compreenderão que as referências aqui feitas a tratamento se alargam à profilaxia bem como ao tratamento de infecções ou sintomas estabelecidos.

Entender-se-á ainda que a quantidade de um composto da invenção necessária para ser utilizada no tratamento variará não só com o composto particular seleccionado mas também com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada e a idade e patologia do doente e estará em última análise à discrição do médico ou veterinário assistente. No entanto, duma maneira geral, uma dose adequada situar-se-á na gama desde cerca de 1 até cerca de 750 mg/kg de peso corporal por dia, tal como 3 até cerca de 120 mg por quilograma de peso corporal do receptor por dia, preferencialmente na gama de 6 até 90 mg/kg/dia, muito preferencialmente na gama de 15 até 60 mg/kg/dia. A dose desejada pode ser convenientemente apresentada numa única dose ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. O composto é convenientemente administrado na forma de dosagem unitária; por exemplo contendo 10 até 1500 mg, convenientemente 20 até 1000 mg, muito convenientemente 50 20 até 700 mg de substância activa por forma de dosagem unitária.

Idealmente a substância activa deveria ser administrada para se obter concentrações máximas no plasma do composto activo desde cerca de 1 até 75 μΜ, preferencialmente cerca de 2 até 50 μΜ, muito preferencialmente cerca de 3 até cerca de 30 μΜ. isto pode ser conseguido, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução 0,1 até 5% da substância activa, opcionalmente em soro fisiológico, ou administrada como um "bolus" contendo cerca de 0,1 até cerca de 110 mg/kg da substância activa. Os niveis desejados no sangue podem ser mantidos por infusão continua para proporcionar cerca de 0,01 até cerca de 5,0 mg/kg/hora ou por infusões intermitentes contendo cerca de 0,4 até cerca de 15 mg/kg da substância activa.

Embora seja possivel que, para utilização em terapia, um composto da invenção possa ser administrado como o produto quimico em bruto é preferível apresentar a substância activa como uma formulação farmacêutica.

Assim a invenção proporciona ainda uma formulação farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável conjuntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis deste e, opcionalmente, outras substâncias terapêuticas e/ou profilácticas. 0(s) veículo(s) tem de ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial para o seu receptor. 21

As formulações farmacêuticas incluem as adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo intramuscular, subcutânea e intravenosa) ou numa forma adequada para administração por inalação ou insuflação. Quando apropriado as formulações podem ser convenientemente apresentadas em unidades de dosagem discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem o passo de colocar em associação o composto activo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e depois, se necessário, transformar o produto na formulação desejada.

As formulações farmacêuticas adequadas para administração oral podem ser convenientemente apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, hóstias ou comprimidos contendo cada um uma quantidade predeterminada da substância activa; na forma de um pó ou granulado; como uma solução; como uma suspensão; ou como uma emulsão. A substância activa também pode estar presente como um "bolus", electuário ou pasta. Os comprimidos e cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais tais como aglutinantes, enchimentos, lubrificantes, desintegrantes ou humectantes. Os comprimidos podem ser revestidos segundo métodos bem conhecidos na técnica. As preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosos ou oleosos, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes de ser utilizado. Estas preparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, 22 emulsionantes, veículos não aquosos (os quais podem incluir óleos comestíveis) ou conservantes.

Os compostos de acordo com a invenção também podem ser formulados para administração parentérica (por exemplo, por injecção, por exemplo injecção "bolus" ou infusão contínua) e podem ser apresentados na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-enchidas, infusão de pequeno volume ou em recipientes de dose múltipla com um conservante. As composições podem tomar formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a substância activa pode estar na forma de um pó, obtido por isolamento asséptico de um sólido estéril ou por liofilização a partir da solução, para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água apirógena, estéril, antes de ser utilizada.

Para administração tópica à epiderme, os compostos de acordo com a invenção podem ser formulados como pomadas, cremes ou loções, ou como um adesivo transdérmico. As pomadas e cremes podem, por exemplo, ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou de gelificação. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e também conterão em geral um ou mais emulsionantes, estabilizantes, dispersantes, agentes de suspensão, espessantes ou corantes.

As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem rebuçados compreendendo a substância activa numa base aromatizada, geralmente sacarose e goma-arábica ou tragacanta; pastilhas compreendendo a substância activa 23 numa base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e goma-arábica; e colutórios compreendendo a substância activa num veiculo liquido adequado.

As formulações farmacêuticas adequadas para administração rectal em que o veiculo é um sólido, são muito preferencialmente apresentadas como supositórios de dose unitária. Os veiculos adequados incluem manteiga de cacau e outros materiais habitualmente utilizados na técnica, e os supositórios podem ser convenientemente preparados por combinação do composto activo com o(s) veiculo(s) suavizado(s) ou fundido(s) seguida de congelação e modelação em moldes.

As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou formulações para pulverização contendo para além da substância activa, veiculos tais como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

Para administração intranasal os compostos da invenção podem ser utilizados como uma formulação liquida para pulverização ou pó dispersável ou na forma de gotas.

As gotas podem ser formuladas com uma base aquosa ou não aquosa compreendendo também um ou mais dispersantes, solubilizantes ou agentes de suspensão. As formulações liquidas para pulverização são convenientemente administradas a partir de embalagens pressurizadas.

Para administração por inalação, os compostos de acordo com a invenção são convenientemente administrados a partir de um insuflador, nebulizador ou uma embalagem pressurizada ou por outros meios convenientes de administração de uma 24 formulação para pulverização de aerossol. As embalagens pressurizadas podem compreender um propulsor adequado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma quantidade calibrada.

Alternativamente, para administração por inalação ou insuflação, os compostos de acordo com a invenção podem tomar a forma de uma formulação de pó seco, por exemplo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada na forma de dosagem unitária, por exemplo, em cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, embalagens de gelatina ou blister a partir das quais o pó pode ser administrado com a ajuda de um inalador ou insuflador.

Quando desejado pode utilizar-se as formulações descritas acima adaptadas para originar uma libertação prolongada da substância activa.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção também podem conter outras substâncias activas tais como agentes antimicrobianos ou conservantes.

Os compostos da invenção também podem ser utilizados em terapia de associação para evitar a produção de estirpes virais resistentes.

Em particular, os compostos da invenção também podem ser utilizados associados a outros agentes terapêuticos, por exemplo, outros agentes anti-infecciosos. Em particular, os 25 compostos da invenção podem ser utilizados em conjunto com agentes antivirais conhecidos. A invenção proporciona assim, num outro aspecto, uma associação compreendendo um composto de fórmula (I) ou um seu derivado fisiologicamente aceitável em conjunto com outro agentes terapeuticamente activo, em particular, um agente antiviral.

Os agentes terapêuticos adequados para serem utilizados nestas associações incluem os análogos de nucleósidos tais como 3TC™, 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'- didesoxicitidina (ddC), 2', 3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 3'-desoxitimidina, 2',3'-didesoxi-2', 3'-didesidrotimidina, e 2',3'-didesoxi-2',3 didesidrocitidina e ribavirina; nucleósidos aciclicos tais como aciclovir, ganciclovir, interferões tais como alfa-, beta- e gama-interferão; inibidores da glucuronação tal como probenecide; inibidores do transporte de nucleósidos tal como dipiridamole; imunomoduladores tal como interleucina II (IL2) e factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), eritropoietina, ampligeno, timomodulina, timopentina, fosfonoformato, inibidores de glicosilação tais como 2-desoxi-D-glucose, castanospermina, 1-desoxinojirimicina; e inibidores da ligação do HIV ao receptores de CD4 tais como CD4, fragmentos de CD4, moléculas híbridas de CD4 e inibidores da aspartil-protease de HIV tal como L-735 524.

Outros agentes terapêuticos adequados para serem utilizados em tais associações incluem também inibidores da transcriptase inversa de não nucleósidos tal como 26 revirapina, TIBO, HEPT, BHAP, MKC-422, α-APA, TSAO, calanolidos e L-697 661.

Preferencialmente, o outro agente terapêutico é seleccionado de: 3TC™, AZT, ddC e ddl.

Os componentes individuais de tais combinações podem ser administrados sequencial ou simultaneamente em formulações farmacêuticas separadas ou associadas.

As associações mencionadas acima podem ser convenientemente apresentadas para serem utilizadas na forma de uma formulação farmacêutica e, deste modo, as formulações farmacêuticas compreendendo uma associação como definida acima em conjunto com um veiculo farmaceuticamente aceitável daquela constituem um outro aspecto da invenção.

Quando o composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável é utilizado associado a um segundo agente terapêutico contra o mesmo virus, a dose de cada composto pode ser a mesma ou diferir daquela quando o composto é utilizado sozinho. As doses apropriadas serão facilmente estimadas pelos especialistas na técnica.

Entender-se-á ainda que a quantidade de um composto da invenção e a quantidade do outro agente terapêutico necessárias para serem utilizadas no tratamento variarão não só com o composto particular da invenção e o outro agente terapêutico seleccionado mas também com a via de administração, a natureza da patologia a ser tratada e a idade e condição do doente e estará em última análise à discrição do médico ou veterinário assistente. No entanto, duma maneira geral, uma dose adequada do composto da 27 invenção estará na gama de cerca de 1 até cerca de 750 mg/kg de peso corporal por dia, tal como 3 até cerca de 120 mg por quilograma de peso corporal do receptor por dia, preferencialmente na gama de 6 até 90 mg/kg/dia, muito preferencialmente na gama de 15 até 60 mg/kg/dia. Uma dose adequada do outro agente terapêutico estará na gama de cerca de 1 até cerca de 750 mg/kg de peso corporal por dia, tal como 3 até cerca de 120 mg por quilograma de peso corporal do receptor por dia, preferencialmente na gama de 6 até 90 mg/kg/dia, muito preferencialmente na gama de 15 até 60 mg/kg/dia. A dose desejada pode ser convenientemente apresentada numa única dose ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A invenção será adicionalmente descrita pelos exemplos seguintes os quais não se destinam a limitar a invenção seja de que forma for. Todas as temperaturas são em graus Celsius.

EXEMPLOS

Exemplo 1 BENZOILOXIACETALDEÍDO C6H5COOCH2CHO (VII)

Este intermediário conhecido foi preparado pela adição em porções de NaI04 (80 g) a uma mistura de 1-benzoilglicerol (50 g), CH2CI2 (500 ml) e H20 (25 ml) sob agitação vigorosa à temperatura ambiente. Agitou-se a solução resultante 28 durante 2 horas, adicionou-se MgS04 (100 g) e agitou-se a solução durante mais 30 minutos. Filtrou-se a mistura, evaporou-se o filtrado in vacuo e destilou-se o resíduo in vácuo para produzir 26 g de produto puro. p.e. 92-94°/0,25 mm RMN de 1R (200 MHz; TMS como referência interna): δ (ppm em CDC13) 9,71 (s, 1H; -CHO) 8,11 (d, 2H;-aromático) 7,60 (m, 1H; aromático) 7,46 (m, 2H; aromático) 4,88 (s, 2H; -CH2CHO)

Exemplo 2

2-BENZOILOXIMETIL-l,3-OXATIOLANO

Aqueceu-se uma mistura de benzoiloxiacetaldeído (exemplo 1) (6,21 g), 2-mercaptoetanol (3 ml) e ácido para-toluenossulfónico (0,2 g) em tolueno (150 ml) durante 3 horas a refluxo em condições de remoção de água utilizando um aparelho de Dean Stark. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente, lavou-se primeiro com solução aquosa de NaHC03 (1 x 50 ml) e depois com água (2,5 ml) e secou-se sobre MgS04. Filtrou-se a solução e evaporou-se o filtrado sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo sobre sílica gel utilizando hexano:acetato de etilo (9:1) como eluente. Proporcionou 7,63 g (90%) de produto puro, o qual foi identificado por RMN de 1ft e 13C. 29

Rf: 0,39 (hexano:acetato de etilo) RMN de 1R: δ (ppm em CDCI3) 8, 03 (m, 2H, aromático) 7, 53 (m, 1H, aromático) 7, 39 (m, 2H, aromático) 5, 41 (dd, 1H, 0 1 4, 43 (m, 2H, C2-CH2OCC6H5) 4, 21 (m, 1H, Cs-H) 3, 96 (m, 1H, 1 LO O 2, 98 (m, 2H, O 1 RMN de 13C: δ (ppm em CDC13) 166,82, 133,74, 130,35, 128,97, 83,58, 71,87, 66,62 e 32,74 Exemplo 3

2-BENZOILOXIMETIL-3-OXO-1,3-OXATIOLANO

O ÍIX}

Adicionou-se ácido monoperoxiftálico, sal de magnésio (mmpp, 28 g) em fracções sob agitação vigorosa a uma mistura de 2-benzoiloximetil-l,3-oxatiolano (exemplo 2) (20 g), brometo de tetrabutilamónio (0,4 g) em cloreto de metileno (200 ml) e água (200 ml). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e recolheu-se a camada orgânica. Extraiu-se a fase aquosa com cloreto de metileno (3 x 75 ml) e a camada orgânica reunida lavou-se primeiro com água (2 x 100 ml), depois com solução aquosa 30 saturada de cloreto de sódio (100 ml), secou-se sobre MgSOí e filtrou-se. Evaporou-se o filtrado in vacuo e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre sílica gel utilizando acetato de etilo como eluente para dar 18,5 g (86%) de produto puro como uma mistura de isómeros cis e trans numa proporção de 1:2 respectivamente. p.f.: 70-72° RMN de ΧΗ: δ (ppm em CDCI3) 8, 05 (m, 2H, aromático, isómero cis) 7, 95 (m, 2H, aromático, isómero trans) 7, 56 (m, aromático) 7, 23 (m, aromático) 4, 77 (m, 4H, C2-H, Cs-H, e C2-CH2OOCC6H5 4, 43 (m, 1H, C5-H, isómero trans) 4, 09 (m, 1H, C5-H, isómero cis) 3, 11 (m, 2H, C4-H, isómero trans) 2, 75 (m, 2H, C4-H, isómero cis) RMN de 13C: δ (ppm em CDC13) isómero cis: 166,64, 134,02, 130,42, 129,88, 129,06, 96,16, 68,83, 59,47 e 54,30 isómero trans: 166,36, 134,12, 130,29, 129,68, 129,15, 108,07, 70,09, 61,83 e 53,47

Exemplo 4

2-BENZOILOXIMETIL-4-ACETOXI-1,3-OXATRIOLANE 31

OQQCH (X) O—/

Aqueceu-se a 110 até 120°C sob árgon durante 14 horas uma mistura de 2-benzoiloximetil-3-oxo-l,3-oxatiolano (exemplo 3) (10,5 g), acetato de tetra-n-butilamónio (17 g) em anidrido acético (250 ml) e arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Eliminou-se o anidrido acético em excesso sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em cloreto de metileno (500 ml), lavou-se primeiro com NaHCCb aquoso saturado (2 x 200 ml), depois com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (200 ml), secou-se sobre MgS04, filtrou-se e evaporou-se in vacuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia sobre sílica gel utilizando hexano: acetato de etilo (8:1) como eluente para dar 7,4 g (60% de rendimento) do produto desejado como uma mistura de isómeros cis e trans. Isolou-se também uma pequena quantidade de cada isómero e caracterizou-se por RMN de XH isómero cis:

Rf: 0,43 (hexano:AcOEt) RMN ( de XH : δ (ppm em CDCI3 8, 05 (m, 2H, aromático) 7, 58 (m, 1H, aromático) 7, 45 (m, 2H, aromático) 6, 24 (d, 1H, 0 1 5, 50 (t, 1H, C2-H) 4, 61 (d, 1H, C2-CH2OOCC6H5) 4, 53 (d, 2H, Cs-H) 3,94 (dd, 1H, C5-H) isómero trans:

Rf: 0,43 (hexano:AcOEt 7:3) RMN de XH: δ (ppm em CDC13) 8, 04 (m, 2H, aromático) 7, 58 (m, 1H, aromático) 7, 45 (m, 2H, aromático) 6, 27 (dd, 1H, 0 1 5, 73 (dd, 1H, c2-h) 4, 53 (dd, 1H, C2-CH2OOCC6H5) 4, 34 (dd, 1H, Cs-H) 4, 26 (dd, 1H, c2-ch2occ6h5) 4, 20 (dd, 1H, 1 LO O 2, 09 (s, 3H, CH3) RMN de 13C: δ (ppm em CDC13) 177,66, 166,37, 133,46, 129,93, 128,60, 83,76, 81,22 74,33, 64,65 e 20,79

Exemplo 5 CIS- E TRANS-2-BENZOILOXIMETIL-4-(CITOSIN-l'-IL)-l,3

OXATIOLANO

33

Aqueceu-se a refluxo sob árgon uma mistura de citosina (206 mg), sulfato de amónio (10 mg) e hexametildissilazano (HMDS, 10 ml) até se formar uma solução transparente. Evaporou-se os reagentes em excesso in vacuo e eliminou-se o volátil remanescente sob alto vácuo (15 minutos).

Dissolveu-se o resíduo sólido em cloreto de metileno anidro (20 ml) e adicionou-se uma solução de 2-benzoiloximetil-4-acetoxi-1,3-oxatiolano (exemplo 4) (350 mg) em cloreto de metileno anidro (20 ml) sob árgon, seguida de uma solução de cloreto de estanho IV (SnCl4, 124 ml) em cloreto de metileno (20 ml) a 0°C. Agitou-se a mistura reaccional sob árgon dum dia para o outro à temperatura ambiente, aqueceu-se então a refluxo durante 3 horas e arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura com cloreto de metileno (100 ml) e verteu-se sob agitação para NaHC03 aquoso saturado. Separou-se a camada orgânica por filtração sobre celite, lavou-se primeiro com água (2 x 75 ml), depois com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 ml), secou-se sobre MgS04 e filtrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia sobre sílica gel utilizando acetato de etilo:CH3OH como eluente para dar 140 mg (35%) do produto desejado como uma mistura de isómeros cis e trans numa proporção de 1:1 como determinado por RMN de 1H. Separou-se estes isómeros como os derivados de N-acetilo no exemplo seguinte.

Exemplo 6

CIS- E TAANS-2-BENZOILOXIMETIL-4- (N4 ' -ACETIL-CITOSIN-1' -IL)-1,3-OXATIOLANO 34

Agitou-se dum dia para o outro à temperatura ambiente (16 horas) uma solução da mistura de eis e trans de 2-benzoiloximetil-4-(citosin-1'-il)-1, 3-oxatiolano (exemplo 5) (135 mg), 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 15 mg) e anidrido acético (44 ml) em piridina anidra (10 ml) e verteu-se para água fria (100 ml) seguida de extraeção com cloreto de metileno (3 x 50 ml) . Lavou-se o extracto com água, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e evaporou-se in vácuo. Adicionou-se tolueno ao residuo, evaporou-se então in vacuo. Adicionou-se tolueno ao residuo, evaporou-se então in vacuo e purificou-se o óleo residual por cromatografia sobre sílica gel utilizando acetato de etilo como eluente para produzir 65 mg do isómero trans puro como o produto de eluição rápida e 60 mg de isómero eis puro como o produto de eluição lenta. Estes foram caracterizador por RMN de 1H e 13C. isómero cis: RMN de 1H: ô(ppm em CDC13) 9, 61 d, 1H, C4'-NHCOCH3) 8, 29 (d, 1H, ac 1 ajD o 8, 06 (m, 2H, aromático) 1, 65 (m, 1H, aromático) 1, 51 (m, 2H, aromático) 7, 25 (d, 1H, C5'-H) 6, 61 (d, 1H, 0 1 ac 5, 50 (t, 1H, 0 1 ac 35 4, 80 (m, 2H, C2-CH2OOCC6H5) 4, 48 (d, 1H, Cs-H) 4, 05 (dd, 1H, 1 LO O 2,25 (s, 3H, CH3) RMN de 13C: ô(ppm em CDC13) 170,93, 166,28, 162,80, 155,76, 146,06, 133,91, 129,90, 128,84, 97,45, 85,88, 78,25, 64,60, 63,53 e 24,71. isómero trans: RMN de 1H: ô(ppm em DMSO de) 10 ,86 i (s, 1H, , C4'-NHCOCH3) 8, 13 (d, 1H, 1 CO O 7, 96 (m, 2H, aromático) 7, 68 (m, 1H, aromático) 7, 52 (m, 2H, aromático) 7, 20 (d, 1H, 1 LO 0 6, 35 (d, 1H, 0 1 5, 96 (dd, 1H, - c2-h) 4, 58 (dd, 1H, , C2-CH2OOCC6H5) 4, 44 (d, 1H, 1 LO 0 4, 29 (m, 2H, Cs-H e CH2OOCC 2, 07 (s, 3H, CH3) RMN de 13C: ô(ppm em DMSO d6) 171,53, 165,84, 162,76, 155,21, 146,59, 134,00, 129,64, 129,23, 96,54, 83,78, 74,24, 64,58, 64,01 e 24,35

Exemplo 7 36

36 Cis- E OXATIOLANO TAAWS-2-HIDROXIMETIL-4-(CITOSIN-1'-IL)-1,3-

{ΧΧΧΪΙΙ} isómero cis (BCH-270):

Agitou-se dum dia para o outro à temperatura ambiente (16 horas) uma solução de cís-2-benzoiloximetil-4(N4'-acetil-citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 6) (54 mg) em amoníaco metanólico (50 ml) . Evaporou-se o solvente in vácuo e tratou-se o residuo com éter para produzir 37 mg (90%) do produto desejado. O produto foi depois caracterizado por RMN de 1H e 13C. p.f.: 213-215°C UV: (CH3OH) Lamda max: 270 nm RMN de 1ti: δ (ppm em DMSO dô) 7, 85 (d, 1H, c6- -H) 7, 16 (d, 2H, C4 < -NH2) 6, 34 (d, 1H, C4- -H) 5, 76 (d, 1H, 05' —H) 5, 31 (t, 1H, c2- -CH2OH) 5, 18 (t, 1H, c2- -H) 4, 40 (d, 1H, c5- -H) 3, 92 (dd, 1H, c 5—H) 3, 78 (m, 2H, c2- -CH2OH) RMN de 13C: δ (ppm em DMSO d6) 165,95, 155,74, 142,39, 94,98, 88,85, 77,29, 62,91 e 62,48 37 isómero trans:

Agitou-se dum dia para o outro à temperatura ambiente (16 horas) uma solução de trans-2-benzoiloximetil-4-(N4'- acetil-citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 6) (63 mg) em amoníaco metanólico (50 ml) . Eliminou-se o solvente in vacuo e solidificou-se o resíduo com éter para dar 36 mg

(93%) do produto desejado o qual foi caracterizado por RMN de e 13C.

p.f.: 175-177°C UV: (CH3OH) Lamda max: 270 nm RMN de *Η: ô(ppm em DMSO d6) 7, 67 (d, 1H, C6' -H) 7, 19 (d, 2H, C4' -nh2) 6, 30 (d, 1H, c4- -H) 5, 77 (d, 1H, C5' -H) 5, 56 (t, 1H, c2- -CH2OH) 5, 23 (t, 1H, c2- -H) 4, 18 (m, 2H, c5- -H) 3, 61 (m, 1H, C2- -CH2OH) 3, 36 (m, 1H, C2- -CH2OH) RMN de 13C: δ (ppm em DMSO d6) 166,00, 155,65, 142,30, 95,11, 87,52, 74,52, 63,42 e 62,86 Exemplo 8

CIS E TRAN’S-2-BENZOILOXIMETIL-4—BENZOILOXI-1,3-OXATIOLANO

O82 38

Dissolveu-se 2-benzoiloximetil-l,3-oxatiolano (exemplo 2) (0,4 g, 1,78 mmol) em 200 mL de benzeno anidro desgaseifiçado sob uma corrente de árgon. A esta solução adicionou-se peróxido de benzoilo (0,863 g, 3,56 mmol) e catalisador AIBN (15 mg, 0,09 mmol, 5%) numa porção. Aqueceu-se a mistura resultante a refluxo durante 4 horas sob árgon. Eliminou-se então o solvente sob alto vácuo e dissolveu-se o residuo em diclorometano (40 ml), extraiu-se 2x com uma solução de bicarbonato de sódio a 10% (15 mL) e secou-se sobre MgSCg. A evaporação do diclorometano sob pressão reduzida e purificação do residuo sobre coluna de silica gel utilizando acetato de etilo:hexano (30%) como eluente proporcionou a mistura pura de derivados eis- e trans-1,3-oxatiolano como um óleo incolor (264 mg, 0,76 mmol, 43% de rendimento). Separou-se o isómero trans como um sólido branco p.f. 60-62°C. Esta mistura foi completamente caracterizada pelo espectro de RMN de 1H e 13C. Rf= 0,43 (acetato de etilo:hexanos 1:4). RMN de ΧΗ δ (ppm em CDC13) : 8,07 (m, 2H, aromático), 7,59 (m, 1H, aromático), 7,56 (m, 2H, aromático), 6,51 (t, 1H, C4-H), 5,79 (m, 1H, C2-H), 4,63 (m, 2H, CH2-OCOPh), 4,32 (m, 2H, C5-H) . RMN de 13C ô(ppm em CDC13) : 166,56, 166,36, 134,12, 133,78, 130,35, 129,04, 84,40, 82,53, 75,04, 65,33, 39,89, 25,43, 23,93.

Exemplo 9

CIS e T.RANS-2-BENZOILOXIMETIL—4-(5'-FLUOROCITOSIN-1'-ΙΣΟΙ, 3-OXATIOLANO 39

!)HMDS/(NH 4ψ04 "......-.............»““...... 2>CH2a2/SõQ4

0&2

Aqueceu-se a refluxo 5-fluorocitosina (700 mg, 5,4 mmol), HMDS (1,1,1,3,3,3-hexametildissilazano, 30 ml) contendo uma quantidade catalítica de sulfato de amónio (20 mg) dum dia para o outro (16 h). Evaporou-se a solução transparente até à secura sob pressão reduzida e dissolveu-se o resíduo em cloreto de metileno anidro (50 ml). A esta solução adicionou-se através de uma cânula uma mistura de 2-benzoiloximetil-4-benzoiloxi-l,3-oxatiolano (exemplo 8) (1,25 g, 3,63 mmol) em cloreto de metileno anidro (50 ml), seguida da adição de tetracloreto de estanho (4 ml de solução 1M em cloreto de metileno). Agitou-se a mistura reaccional sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante 16h e aqueceu-se a refluxo durante lh. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente verteu-se a mistura para solução aquosa saturada de NaHC03 (150 ml), agitou-se durante 15 min. e filtrou-se sobre celite. Recolheu-se a camada orgânica. Extraiu-se novamente a solução aquosa com cloreto de metileno (2 x 100 ml). Lavou-se a fase orgânica reunida duas vezes com água (2 x 150 ml), uma vez com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre Na2S04 e filtrou-se. Eliminou-se o solvente sob pressão reduzida. O resíduo continha dois compostos numa proporção de 2:3 para os isómeros cis e trans e foi purificado sobre sílica gel utilizando acetato de etilo-metanol 95:5 como 40 eluente para dar 280 mg do isómero cis e 420 mg do isómero trans para um rendimento total de 53 %.

Isómeros Cis: P.f . : 235-236°C (dec.) .

Rf .: 0,36 (AcOEt:MeOH 9:1) RMN de XH (300 MHz, DMSO-d6) : δ em ppm: 7,94 (m, 2H, aromático), 7, 80 (d, 2H, H-6' e 1H de NH2 por baixo, JH- f=6,8 Hz), 7,68 (m, 1H, aromático), 7,58 (1, 1H de NH2), 7,47 (m, 2H , aromático), 6,28 (d, 1H, H-4, J=3,0 Hz), 5,51 (t, 1H, H-2, J=3,8 Hz), 4,73 (m, 2H, -CH2OBz), 4,61 (d, 1H, H-5, J=ll Hz) e 3,98 (dd, 1H, H-5, J=4,7 e 11 Hz).

Isómeros trans: P.f. : 235-236°C (dec.) . RMN de XH (300 MHz, DMSO-d6) : δ em ppm: 7,97 (m, 2H, aromático), 7, 81 (d, 2H, H-6' e 1H de NH2 por baixo, Jh- f=7,1 Hz), 7, 66 (m, 1H, aromático), 7,55 (m, 3H, 2H de aromático e 1H de nh2 ), 6,32 (d, 1H, H-4, J: =4,8 Hz), 6 , 02 (dd, 1H, H-2, J=3,2 e 8,5 Hz), 4,55 (dd, 1H, -CH2OBz, J=8,4 e 11,9 Hz), 4,38 (d, 1H, H-5, J=10,2 Hz) e 4,26 (dd, 2H, 1H de H-5 e 1H de -CH2OBz, J=3,6 e 10,5 Hz).

Exemplo 10 CIS-2-HIDROXIMETIL-4-(5'-FLUOROCITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO (BCH-1081) 41

Dissolveu-se cis-2-benzoiloximetil-4-(5'-fluorocitosin-1 il)-1,3-oxatiolano (exemplo 9) (75 mg, 0,21 mmol) em amoníaco metanólico (25 ml) . Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 16h e eliminou-se os solventes sob pressão reduzida. Triturou-se o resíduo com éter (2 x 20 ml) . Recristalizou-se o sólido remanescente em etanol-éter para dar o composto desejado (43 mg) com 80% de rendimento. P.f.: >210°C (dec.)

Rf: 0,41 (AcOEt:MeOH 4:1) UV: Xmax (H20) : 284 nm RMN de (300 MHz, DMSO-d6) : δ em ppm: 8,14 (d, 1H, H-6', jh_f=7, 1 Hz), 7,79 (s 1, 1H, NH2, permutável com D20), 7,56 (s 1, 1H, NH2, permutável com D20), 6,28 (d, 1H, H-4, J=2,6 Hz), 5,44 (t, 1H, OH, permutável com D20), 5,18 (t, 1H, H-2, J=5,5 Hz), 4,44 (d, 1H, H-5, J=10,5 Hz), 3,91 (dd, 1H, H-5, J=4,6 e 10,6 Hz), e 3,78 (m, 2H, CH2OH).

Exemplo 11

(l'R,2,S,5'R)-l,3-OXATIOLAN-2S-CARBOXILATO DE MENTILO

42 A uma mistura de (1'R, 2'S, 5'R)-5S-acetoxi-l, 3-oxatiolan-2S-carboxilato de mentilo (WO 92/20669, aqui incluída por referência) (1,0 g, 3,03 mmol) e trietilsilano (4,84 ml, 30,3 mmol) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,584 ml, 3,03 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 12h e diluiu-se em seguida com diclorometano (150 ml), lavou-se com solução aquosa saturada de NaHCCb, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-AcOEt, 6:1) do produto em bruto deu o produto (0,7lg, 87%) como um óleo incolor: RMN de XH em CDCI3: δ 0,45-2,10 (m, 17H), 2,96- 3,20 (m, 2H), 4,20-4, 40 (m, 2H) , 4,72 (dt, 1H) , 5,45 (s, 1H); [a]D25 -102, 9 o (c, 1,02, CHC13) .

Exemplo 12

(l'R,2'S,5'R)-1,3-OXATIOLAN-2R-CARBOXILATO DE MENTILO

A uma mistura de (1'R, 2'S,5'R)-5S-acetoxi-l,3-oxatiolan-2R-carboxilato de mentilo (WO 92/20669) (0,50 g, 1,51 mmol) e trietilsilano (2,42 ml, 15,1 mmol) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,29 ml, 1,51 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 12h e diluiu-se em seguida com diclorometano (125 ml), lavou-se com solução aquosa 43 saturada de NaHCC>3, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-AcOEt, 6:1) do produto em bruto deu o produto (0,369g, 86%) como um óleo incolor: RMN de 1E em CDCI3: δ 0,40-2,10 (m, 17H), 2,98- 3,19 (m, 2H) , 4,20-4, 40 (m, 2H), 4,72 (dt, 1H) , 5,46 (s, 1H) .

Exemplo 13

2R-HIDROXIMETIL-1,3-OXATIOLANO

A uma solução de (1'R,2'S,5'R)-1,3-oxatiolan-2R-carboxilato de mentilo (exemplo 12) (3,23 g, 11,9 mmol) em etanol anidro (20 ml) a 0°C sob uma atmosfera de árgon adicionou- se boro-hidreto de sódio (1,12 g, 29,7mmol) e metanol anidro (0,916 ml, 47, 6 mmol) Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante lh e deixou-se aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 12h. Desactivou-se então a reacção com ácido acético e eliminou-se o solvente in vacuo. Diluiu-se o resíduo obtido com diclorometano (225 ml), lavou-se com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-Et20, 1:1) do produto em bruto deu o produto (1,3 Og, 91%) como um óleo incolor: RMN de :Η em CDCI3 δ 2,85-2, 97 (m, 2H), 3,58 (dd, 1H, J=12,2, 5,4Hz), 3,66 (dd, 1H, J=12,2, 3,3Hz), 3,75-3,85 (m, 1H), 4,14-4,25 (m, 1H), 5,16 (dd, 1H, J=5,4, 3,3Hz)

Exemplo 14 44

2S-HIDR0XIMETIL-1,3-OXATIOLANO

A uma solução de (1 'R, 2 'S, 5 'R) -1,3-oxatlolan-2S-carboxllato de mentilo (exemplo 11) (1,16 g, 4,26 mmol) em etanol anidro (10 ml) a 0°C sob uma atmosfera de árgon adicionou-se boro-hidreto de sódio (0,403 g, 10,7mmol) e metanol anidro (0,690 ml, 17,03 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante lh e deixou-se aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 12h. Desactivou-se então a reacção com ácido acético e eliminou-se o solvente in vacuo. Diluiu-se o resíduo obtido com diclorometano (150 ml), lavou-se com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-Et20, 1:1) do produto em bruto deu o produto (0,47 g, 92%) como um óleo incolor: RMN de 1H em CDC13: δ 2, 85-2, 99 (m, 2H), 3,60 (dd, 1H, J=12,2, 5,5Hz), 3,65 (dd, 1H, J=12,2, 3,3Hz), 3,80-3,90 (m, 1H), 4,20-4,30 (m, 1H) , 5,15 (dd, 1H, J=5,5, 3,3Hz); [a]D25 - 35, 6 ° (c, 1,25, CHCI3).

Exemplo 15

2S-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-l,3-OXATIOLANO

45 A uma solução de 2S-hidroximetil-l,3-oxatiolano (exemplo 14) (0,63 g, 5,3 mmol), imidazole (0,71 g, 10,4 mmol) em tetra-hidrofurano (15 ml) a 0°C sob uma atmosfera de árgon adicionou-se uma solução de cloreto de t-butildifenilsililo (2,16g, 7,9 mmol) em tetra-hidrofurano (8 ml). Deixou-se que a mistura reaccional aquecesse até à temperatura ambiente e agitou-se durante 12h, diluiu-se em seguida com diclorometano (125 ml). Lavou-se a camada orgânica com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-AcOEt, 6:1) do produto em bruto deu o produto (l,87g, 99 %) como um óleo incolor: RMN de XH em CDC13: δ 1,08 (s, 9H), 2,93-2,99 (m, 2H), 3,70 (dd, 1H, J=10,9, 4,6Hz), 3,86 (dd, 1H, J=10,9, 6,4Hz), 3,94-4,15 (m, 2H), 5,29 (dd, 1H, J=6,4, 4,6Hz), 7,35-7,50 (m, 6H), 7,68-7,75 (m, 4H) , [a] d25 -23,3 ° (c, 1,0, CHC13) .

Exemplo 16

2R-t-BUTILDIFENILSILIL0XIMETIL-l,3-OXATIOLANO

,S

A uma solução de 2R-hidroximetil-l,3-oxatiolano (exemplo 13) (1,30 g, 10,8 mmol), imidazole (1,47 g, 21,6 mmol) em tetra-hidrofurano (30 ml) a 0°C sob uma atmosfera de árgon adicionou-se uma solução de cloreto de t-butildifenilsililo (4,46g, 16,2 mmol) em tetra-hidrofurano (15 ml). Deixou-se que a mistura reaccional aquecesse até à temperatura ambiente e agitou-se durante 12h, diluiu-se em seguida com diclorometano (150 ml) . Lavou-se a camada orgânica com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se 46 sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (Hexano-AcOEt, 6:1) do produto em bruto deu o produto (3,64 g, 94 %) como um óleo incolor: RMN de 1R em CDC13: δ 1,04 (s, 9H), 2,89-2,99 (m, 2H), 3,65 (dd, 1H, J=10,9, 4,6Hz), 3,88 (dd, 1H, J=10,9, 6,4Hz), 3,90-4,14 (m, 2H), 5,27 (dd, 1H, J=6,4, 4,6Hz), 7,34-7,46 (m, 6H), 7,64-7,74 (m, 4H).

Exemplo 17

TRANS E CIS-2R-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4-ACETOXI-l,3-OXATIOLANO

7

Adicionou-se ácido meta-cloroperbenzóico sólido (MCPBA) (0,23 g, 80%, 1,06 mmol) a uma solução mantida sob agitação de 2R-t-butildifenilsiloximetil-1,3-oxatiolano (exemplo 16) (0,32g, 0,89 mmol) em diclorometano (20 ml) a 0°C. Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 2h e diluiu-se em seguida com diclorometano (150 ml), lavou-se com solução aquosa saturada de Na2C03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de sulfóxidos. Aqueceu-se então a mistura do sulfóxido obtido, anidrido acético (10 ml), acetato de tetrabutilamónio (0,32 g, 1,06 mmol) a 120°C durante 6h e eliminou-se o anidrido acético em excesso in vácuo. Diluiu-se o resíduo em diclorometano (150 ml), lavou-se com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de acetato (0,164 g, 45%) como um óleo incolor: RMN de em CDC13: δ 1,05 (s, 9H), 47 2,03 (s, 1,35H), 2,08 (s, 1,65H), 3,60-4,50 (m, 4H), 5,28 (t, 0,45H, J=5,4 Hz), 5,55 (dd, 0,55H, J=6,5, 4,7Hz), 6,14-6,20 (m, 1H), 7,30-7,50 (m, 6H), 7,60-7,78 (m, 4H).

Exemplo 18

TRANS E CIS-2S-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4-ACETOXI-l,3-OXATIOLANO

Adicionou-se mcpba sólido (0,85 g, 80%, 3,9 mmol) a uma solução mantida sob agitação de 2S-t-butildifenilsiloximetil-1,3-oxatiolano (exemplo 15) (l,35g, 3,9 mmol) em diclorometano (30 ml) a 0°C. Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 2h e diluiu-se em seguida com diclorometano (225 ml), lavou-se com solução aquosa saturada de Na2C03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de sulfóxidos. Aqueceu-se então a mistura do sulfóxido obtido, anidrido acético (15 ml), acetato de tetrabutilamónio (l,19g, 3,9 mmol) a 120°C durante 6h e eliminou-se o anidrido acético em excesso in vacuo. Diluiu-se o resíduo com diclorometano (200 ml), lavou-se com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de acetato (0,601 g, 40%) como um óleo incolor: RMN de em CDC13: δΙ,ΙΟ (s, 9H), 2,05 (s, 1,2H), 2,10 (s, 1,8H), 3,60-4,50 (m, 4H), 5,30 (t, 0,4H, J=5,5 Hz), 5,58 (dd, 0,6H, J=6,5, 4,8Hz), 6,14-6,23 (m, 1H), 7,33-7,50 (m, 6H), 7,65-7,78 (m, 4H). 48

Exemplo 19 2R-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4S-(N-4'-ACETILCITOSIN-1'-IL)-1,3-0XATI0LAN0 e 2R-t-BUTILDIFENILSILILOXILMETIL-4R-(N-4'-ACETILCITOSIN-1'-IL)-1,3-0XATI0LAN0

Adicionou-se 2,6-lutidina (0,054 ml, 0,49 mmol) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,095 ml, 0,49 mmol) a uma suspensão de N-4'-acetilcitosina (0,045 g, 0,29 mmol) em dicloroetano (2 ml) à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. Agitou-se a mistura durante 15 min e introduziu-se sucessivamente uma mistura de cis e trans 2r-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-l,3-oxatiolano (exemplo 17) (0,100 g, 0,25 mmol) em dicloroetano (2 ml) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,048 ml, 0,25 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional a refluxo durante meia hora e diluiu-se com diclorometano, lavou-se com solução aquosa saturada de NaHC03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de isómeros trans e cis os quais foram submetidos a separação por TLC preparativa para dar o isómero cis (33 mg, 26%) [RMN de 1H em CDC13: δ 1,08 (s, 9H) , 2,22 (s, 3H), 3,85-4, 45 (m, 4H), 5,26 (t, 1H, J=4,3Hz), 6,54 (d, 1H, J=4,2Hz), 7,21 (d, 1H, J=7,4Hz), 7, 35-7, 50 (m, 6H), 7, 60-7, 75 (m, 4H) , 8,23 (d, 1H,

J=7,4Hz), 9,02 (s 1, 1H)] e isómero trans (49 mg, 39%) [RMN 49 de XH em CDC13: δ 1,04 (s, 9H), 2,21 (s, 3H), 3,56-4,26 (m, 4H) , 5,64 (dd, 1H, J=6,8, 4,4Hz), 6,39 (d, 1H, J=3,6Hz), 7,31-7,48 (m, 7H), 7,58-7,71 (m, 4H), 8,01 (d, 1H, J=7,4Hz), 8,86 (S 1, 1H)].

Exemplo 20

2S-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4R-(N-4'-ACETILCITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO e 2S-t-BUTILDIFENILSILILOXILO METIL-4S-(N-4 '-ACETILCITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO

JN

Adicionou-se 2,6-lutidina (0,131 ml, 1,13 mmol) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,218 ml, 1,13 mmol) a uma suspensão de N-4'-acetilcitosina (0,104 g, 0,68 mmol) em dicloroetano (2 ml) à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. Agitou-se a mistura durante 15 min e introduziu-se sucessivamente uma mistura de eis e trans 2S-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-l,3-oxatiolano (exemplo 18) (0,235 g 0,56 mmol) em dicloroetano (2 ml) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,109 ml, 1,13 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional a refluxo durante meia hora e diluiu-se com diclorometano, lavou-se com solução aquosa saturada de NaHC03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia (AcOEt) do produto em bruto deu uma mistura de isómeros trans e eis (0,225 g, 78 %) : RMN de XH em CDC13: δ 1,05 (s, 5, 4H) , 1,08 (s 3,6H), 2,24 (s, 1,2H), 2,28 (s, 1,8H), , 3,67' -4,42 (m, 4H) 50

Exemplo 21 2R-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4S-(N-4'-ACETIL-5'-

FLU0R0CIT0SIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO

E 2R-t

BUTILDIFENILSILIL0XIMETIL-4R-(N-4'-ACETIL-5'-FLUOROCITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO

Adicionou-se 2,6-lutidina (0,124 ml, 1,07 mmol) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,207 ml, 1,07 mmol) a uma suspensão de N-4'-acetil-5'-fluorocitosina (0,110 g, 0,64 mmol) em dicloroetano (3 ml) à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. Agitou-se a mistura durante 15 min e introduziu-se sucessivamente uma mistura de eis e trans 2R-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-l,3-oxatiolano (exemplo 17) (0,223 g 0,54 mmol) em dicloroetano (3 ml) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,103 ml, 0,54 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional a refluxo durante meia hora e diluiu-se com diclorometano, lavou-se com solução aquosa saturada de NaHC03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto deu uma mistura de isómeros trans e eis os quais foram submetidos a separação por TLC preparativa para dar o isómero eis (97 mg, 34%) [RMN de 1H em CDC13 δ 1,08 (s, 51 9H), 2,65 (s, 3H), 3, K£> 0 1 , 50 (m, 4H), 5,27 (t, J=4, 2Hz) , 6, 53 (d, 1H, J=4,2Hz) / 7, 32- 7, 530 (m, 6H), 7,55 -7,76 (m, 4H) , 8,21 (d, 1H, J=t >, 1Hz )] e isómero trans (68 mg, 24%) [RMN de 1E [ em CDC13 δ 1,07 (s, 9H), 2,63 (s, 3H), 3,56 -4,26 (m, 4H), 5, 68 (dd, j= =6,9, 4, 4Hz), 6,37 (d, 1H, J=2, 4Hz), 7,30 -7,53 (m, 6H) r 7, 57 -7, 75 (m, 4H) , 7,93 (d, 1H, J=6, 1Hz)] .

Exemplo 22 2S-t-BUTILDIFENILSILILOXIMETIL-4R-(N-4'-ACETIL-5'-FLU0R0CIT0SIN-1' -IL)-1,3-0XATI0LAN0 E 2S-t- BUTILDIFENILSILIL0XIMETIL-4S-(N-4'-ACETIL-5'-FLUOROCITOSIN-1'-IL)-1,3-0XATI0LAN0

Adicionou-se 2,6-lutidina (0,248 ml, 2,13 mmol) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,418 ml, 2,13 mmol) a uma suspensão de N-4'-acetil-5'-fluorocitosina (0,218 g, 1,27 mmol) em dicloroetano (4,5 ml) à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. Agitou-se a mistura durante 15 min e introduziu-se sucessivamente uma mistura de eis e trans 2S-t-butildifenilsiloximetil-4-acetoxi-l, 3-oxatiolano (exemplo 18) (0,433g 1,06 mmol) em dicloroetano (4 ml) e trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (0,206 ml, 1,06 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional a refluxo durante meia hora e diluiu-se com diclorometano, lavou-se com solução aquosa saturada de NaHC03, água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A cromatografia do produto em bruto 52 deu uma mistura de isómeros trans e eis os quais foram submetidos a separação por TLC preparativa para dar o isómero eis (145 mg, 26%) [RMN de em CDC13 δ 1,09 (s, 9H), 2,66 (s, 3H), 3, 90-4, 50 (m, 4H), 5,26 (t, J=4,lHz), 6,53 (d, 1H, J=4, 1Hz), 7, 36-7, 50 (m, 6H), 7,55-7, 78 (m, 4H), 8,20 (d, 1H, J=6,lHz)] e isómero trans (119 mg, 21%) [RMN de XH em CDC13 51,07 (s, 9H), 2,64 (s, 3H), 3,58-4,25 (m, 4H), 5,68 (dd, J=6,8, 4,2Hz), 6,37 (d, 1H, J=2,7Hz), 7,35-7,51 (m, 6H), 7, 60-7, 76 (m, 4H), 7,93 (d, 1H, J=6,1Hz)] .

Exemplo 23 2R-HIDROXIMETIL-4R-(CITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO - COMPOSTO 1

A uma solução de 2R-t-butildifenilsiloximetil-4R-(N-4'-acetilcitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 19) (72 mg, 0,14 mmol) em THF (3 ml) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se lentamente solução de fluoreto de tetrabutilamónio (0,212 ml, 1M em THF, 0,21 mmol) e ácido acético glacial (0,012 ml, 0,21 mmol). Deixou-se que a mistura reaccional agitasse durante lh, seguida da adição de sílica gel (0,5 g). Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre sílica gel (AcOEt-MeOH, 9:1) para dar o produto dessililado. Dissolveu-se o produto dessililado em solução metanólica saturada de K2C03 e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante meia hora. Neutralizou-se a 53 mistura reaccional com solução de HC1 lN/metanol seguida da adição de sílica gel (0,5 g) . Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre sílica gel (AcOEt-MeOH, 4:1) para proporcionar o produto (27 mg, 91%) como um sólido branco que foi triturado em Et20-Me0H: p.f. 200°C (dec.); [a] D25 -126,8° (c, 0,5, MeOH) ; RMN de (DMSO-d6) : δ 3,70-3,82 (m, 2H), 3,91 (dd, 1H, J=10,4, 4,6Hz), 4,38 (d, 1H, J=10,4Hz), 5,16 (t, 1H, J=4,6Hz), 5,32 (t, 1H, J=5,8Hz), 5,75 (d, 1H, J=7,4Hz), 6,32 (d, 1H, J=4,6Hz), 7,12 (s 1, 1H), 7,23 (s 1, 1H), 7,84 (d, 1H, J=7,4Hz); RMN de 13C (DMSO-d6) : δ 62, 7, 63, 1, 77, 4, 89, 0, 95,6, 142,4, 155,4, 165,8.

Para avaliar a pureza enantiomérica do nucleósido final sintetizado ou para resolver a mistura racémica dos análogos de nucleósidos desprotegidos utilizou-se métodos de HPLC. Por exemplo, constatou-se que o composto #1 acima tinha um tempo de retenção de 43,88 min nas condições seguintes: cyclobond RSP 4,6x250mm 0,27 ml/min TFAA 0,05%, pH 7,0 254 nm

Tipo de coluna:

Caudal:

Solvente:

Detecção:

Exemplo 24 2S-HIDROXIMETIL-4S-(CITOSIN-1'-IL)-1,3-OXATIOLANO -COMPOSTO #2 54

A uma solução de 2S-t-butildifenilsiloximetil-4S-(N-4 acetilcitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 20) (202 mg, 0,4 0 mmol) em THF (3,5 ml) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se lentamente solução de fluoreto de tetrabutilamónio (0, 595 ml, 1M em THF, 0,60 mmol) e ácido acético glacial (0,034 ml, 0,60 mmol). Deixou-se que a mistura reaccional agitasse durante lh, seguida da adição de silica gel (0,9 g). Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre silica gel (AcOEt-MeOH, 9:1) para dar o produto dessililado. Dissolveu-se o produto dessililado em solução metanólica saturada de K2C03 e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante meia hora. Neutralizou-se a mistura reaccional com solução metanólica de HC1 IN seguida da adição de silica gel (0,9 g) . Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre silica gel (AcOEt-MeOH, 4:1) para proporcionar o produto (74 mg, 81%)como um sólido branco que foi triturado em Et20-Me0H: p.f. 220° C (dec .) ; [a]D25 + 118, 6o (c, LO O , MeOE [) ; RMN de XH (DMSO-de) : δ 3,70- -3, 82 (m, 2H) r 3,92 (dd, 1H, J =10 ,6, 4,6Hz), 4 ,38 (d, 1H, , J=10 ,6Hz), , 5, 17 (t, 1H, J= -4, 5Hz) , 5 ,32 (t, 1H, J=5,8Hz), 5,75 (d, 1H, J=7,4Hz), 6,32 (d, 1H, II 6Hz), 7,12 (s 1, 1H), 7, ,22 (s 1, 1H), 7,85 (d, 1H, r- II >~D 4Hz) ; rmn de 13 C (DMSO-de) : δ 63 ,0, 63,1, 77,4, 88 ,9, 95, 1, 142, 4, 155, 4, 165, 7.

Para avaliar a pureza enantiomérica do nucleósido final sintetizado ou para resolver a mistura racémica dos 55 análogos de nucleósidos desprotegidos utilizou-se métodos de HPLC quiral. Por exemplo, constatou-se que o composto #2 acima tinha um tempo de retenção de 48,18 min nas condições seguintes: cyclobond™ RSP 4,6x250mm 0,27 ml/min TFAA 0,05%, pH 7,0 254 nm

Tipo de coluna:

Caudal:

Solvente:

Detecção:

Exemplo 25 2R-HIDROXIMETIL-4R-(5'-FLU0R0CIT0SIN-1'-IL)-1,3-0XATI0LAN0 - COMPOSTO #3

A uma solução de 2R-t-butildifenilsiloximetil-4R-(N-4 acetil-5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 21) (152 mg, 0,29 mmol) em THF (3,5 ml) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se lentamente solução de fluoreto de tetrabutilamónio (0,432 ml, 1M em THF, 0,43 mmol) e ácido acético glacial (0,025 ml, 0,43 mmol). Deixou-se que a mistura reaccional agitasse durante lh, seguida da adição de sílica gel (0,5 g) . Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre sílica gel (AcOEt-MeOH, 9:1) para dar o produto dessililado. Dissolveu-se o produto dessililado em solução metanólica saturada de K2C03 e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante meia hora. Neutralizou-se a mistura reaccional com solução metanólica de HC1 IN seguida da adição de sílica gel (0,5 g) . Submeteu-se a suspensão 56 resultante a cromatografia em coluna sobre sílica gel (AcOEt-MeOH, 4:1) para proporcionar o produto (58 mg, 81%) como um sólido branco que foi triturado em Et20-Me0H: p.f. 183 °C (dec.) ; [a] 25 D -86 ,5o O O ,57, MeOH) f RMN de (DMSO- cU) : 63 1 O Γ- 50 (m, 4H) , 5,18 (t, 1H, J: =3, 6Hz) , 5, 44 (t, 1H, J=5, 8Hz), 6,: 25-6, 30 (m, 1H) , 7,56 (s 1, 1H) , 7, 80 (s 1/ 1H), \—1 co (d, 1H, J= n,2Hz); RMN de 13C (DMSO-dc ;) : δβ 2 ,2, 63,4, 77,5, 88 ,9, : 126, 7, 127, 1, 134,7, 137 ,9, 153, 8, 157 ,6, 157,7,

Para avaliar a pureza enantiomérica do nucleósido final sintetizado ou para resolver a mistura racémica dos análogos de nucleósidos desprotegidos utilizou-se métodos de HPLC quiral. Por exemplo, constatou-se que o composto #3 acima tinha um tempo de retenção de 16,73 min nas condições seguintes: cyclobond™ RSP 4,6x250mm 0,43 ml/min TFAA 0,05%, pH 7,0 254 nm

Tipo de coluna:

Caudal:

Solvente:

Detecção:

Exemplo 26 2S-HIDROXIMETIL-4S-(5'-FLU0R0CIT0SIN-1'-IL)-1,3-0XATI0LAN0 - COMPOSTO #4

A uma solução de 2S-t-butildifenilsiloximetil-4S-(N-4'-acetil-5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (exemplo 22) 57 (78 mg, 0,15 mmol) em THF (3 ml) à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon adicionou-se lentamente solução de fluoreto de tetrabutilamónio (0, 222 ml, 1M em THF, 0,22 mmol) e ácido acético glacial (0,013 ml, 0,22 mmol). Deixou-se que a mistura reaccional agitasse durante lh, seguida da adição de silica gel (0,5 g). Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre silica gel (AcOEt-MeOH, 9:1) para dar o produto dessililado. Dissolveu-se o produto dessililado em solução metanólica saturada de K2C03 e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante meia hora. Neutralizou-se a mistura reaccional com solução metanólica de HC1 IN seguida da adição de silica gel (0,5 g) . Submeteu-se a suspensão resultante a cromatografia em coluna sobre silica gel (AcOEt-MeOH, 4:1) para proporcionar o produto (36 mg, 98%) como um sólido branco que foi triturado em Et20-Me0H: p.f. 180°C (dec.); [a]D25 +75,7° (c, 0,56, MeOH) ; RMN de XH (DMSO-d6) : δ 3, 69-4,50 (m, 4H), 5,18 (t, 1H, J=3,7Hz), 5,44 (t, 1H, J=5,8Hz), 6,25-6,29 (m, 1H) , 7,55 (s 1, 1H), 7,8 (s 1, 1H), 8,14 (d, 1H, J=7,2Hz) ; RMN de 13C (DMSO-d6) : 61,8, 63,1, 77,1, 88,6, 126,3, 126,8, 134,4, 137,6, 153,5, 157,1, 157,3.

Para avaliar a pureza enantiomérica do nucleósido final sintetizado ou para resolver a mistura racémica dos análogos de nucleósidos desprotegidos utilizou-se métodos de HPLC quiral. Por exemplo, constatou-se que o composto #4 acima tinha um tempo de retenção de 15,07 min nas condições seguintes:

Tipo de coluna: Caudal: cyclobond™ RSP 4,6x250mm 0,43 ml/min 58

Solvente: TFAA 0,05%, pH 7,0

Detecção: 254 nm

Exemplo 27 ACTIVIDADE ANTIVIRAL: ENSAIO DE FORMAZANO EM LINHAS DE CÉLULAS RESISTENTES AO MT-4 Θ 3TC™ A actividade antiviral anti-HIV-1 foi determinada em células MT-4 e células MT-4 tornadas resistentes ao 3TC™. Infectou-se uma suspensão de células (aproximadamente 106 células/ml) em meio de crescimento RPMI 1640 com a estirpe RF do HIV-1 a uma M.O.I. de 10”3 unidades infecciosas/célula. Em paralelo preparou-se uma suspensão de células não infectadas para avaliar a citotoxicidade de origem medicamentosa. Incubou-se as duas suspensões durante 90 minutos à temperatura ambiente. Diluiu-se sucessivamente os compostos de ensaio em decréscimos de 10 vezes de 100 pg/ml até 0,01 pg/ml (concentrações finais em duas placas microtítulo de 96 poços. Inoculou-se 20 μΐ da suspensão de células infectadas em cada poço de uma das placas (antiviral), enquanto se adicionou 20 μΐ da suspensão de células não infectada a cada poço da segunda placa (citotoxicidade). Incubou-se então as placas durante 7 dias a 37°C. Após incubação, adicionou-se 10 μΐ de brometo de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) a 20 mg/ml a todos os poços e incubou-se as placas durante mais 90 minutos a 37°C.

Adicionou-se então 150 μΐ de Triton X-100 alcoólico a 10% (v/v) e ressuspendeu-se as células. Após 15 minutos à temperatura ambiente, analisou-se as placas num leitor 59

Multiskan MC a 405 nm. A conversão do amarelo de MMT no seu derivado de formazano é máxima em células não infectadas e ausente em células infectadas não tratadas. Os valores de densidade óptica para os controlos de citotoxicidade e os poços de ensaio antiviral foram representados graficamente e calculada a dose do composto necessária para inibir em 50% a conversão de MMT dos controlos não infectados, não tratados. Deste modo pode calcular-se a dose citotóxica a 50% (CD 50%) e a dose antiviral a 50% (ID 50%) . O Quadro 1 mostra os valores de CD 50% e ID 50% obtidos para: QUADRO 1 (ensaio MT-4) COMPOSTO id50 ^g/ml) CD50 (Mg/ml) BCH - 270 (exemplo 7) 4,0 >100 #1 (exemplo 23) 13 >100 #2 (exemplo 24) 4,4 >100 #3 (exemplo 25) 6,0 >100 #4 (exemplo 26) 2,9 100 AZT (referência) 0,01 > 1 QUADRO 2 CÉLULAS RESISTENTES AO 3TC (mutação Met184->Ile) COMPOSTO ID50 (Mg/ml) CD50 (Mg/ml) #1 (exemplo 23) 8,5 >100 #2 (exemplo 24) 42 >100 #3 (exemplo 25) 3,4 >100 #4 (exemplo 26) 3,0 100 3 TC TM >100 >100

INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE SINCÍCIOS

Infectou-se células C8166 com HIV-1 (estirpe RF) a uma carga de lxlCT3 unidades infecciosas/célula e adsorveu-se à temperatura ambiente durante 60 minutos. Após adsorção, lavou-se as células três vezes em meio de crescimento. Adicionou-se aliquotas de 105 células a cada poço de placas 60 de 24 poços contendo diluições sucessivas de compostos de ensaio em concentrações finais de 5C^g/ml até 0,C^g/ml em meio de crescimento RPMI® 1640. Incluiu-se também células infectadas não tratadas e células não infectadas não tratadas como controlos. Incubou-se as placas a 37°C/5% C02 durante 3-4 dias em recipientes humidificados. Examinou-se as células diariamente à procura de evidência de formação de sincicios induzidos pelo HIV-1. Os sincicios foram quantificados por referência aos controlos infectados não tratados e calculada a dose de composto necessária para reduzir o efeito citopático em 50% (ID50) . QUADRO 3 (FORMAÇÃO DE SINCICIOS) COMPOSTO id50 ^g/ml) CD50 ^g/ml) #2 (exemplo 25) 0, 08 >100 #3 (exemplo 25) 0, 17 >100 #4 (exemplo 26) 0, 03 >100 ENSAIO DE CBM.

Os ensaios em células mononucleares de sangue do cordão umbilical foram efectuados essencialmente como descrito em Gu et al., J. Virol. (1992), 66: 7128-7135.

Abreviadamente, passou-se virus (HTLV-IIIB) que tinham sido inicialmente multiplicados em células MT-4 para células mononucleares de sangue do cordão umbilical pré-estimuladas com fito-hemaglutinina (CBM). Para análise subsequente, pré-tratou-se amostras de CBM (5 x 105 células por mL) com várias concentrações dos diversos compostos durante 4 h e inoculou-se em seguida com HIV-1 multiplicado em CBL a uma multiplicidade de infecção de 1,0 na concentração do composto utilizado para pré-tratamento. Adicionou-se três vezes por semana meio fresco, incluindo a concentração 61 apropriada do composto e adicionou-se CBM pré-estimuladas com fito-hemaglutinina (5 x 105 células por ml) em intervalos de 2 dias. 0 cálculo de IC50 foi determinado com base nos niveis de RT nos fluidos de cultura como descrito em Gao et al., (1992), J. Virol. 66: 12-19. QUADRO 4 (CBM) COMPOSTO ID50 (ng/ml) CD50 (Mg/ml) BCH - 270 (exemplo 7) 0,03 >23 #1 (exemplo 23) 0,05-1,22 >23 #2 (exemplo 24) 0,03-1,22 >23 #3 (exemplo 25) 0,002-0,05 >23 #4 (exemplo 26) 0,02-0,05 >23 AZT (referência) <0,002 >1

DETERMINAÇÃO DE IC50 (μΜ) EM VÁRIOS ISOLADOS MUTANTES DE HIV-1 NA PRESENÇA DE DIVERSOS COMPOSTOS ANTIVIRAIS 0 procedimento é semelhante ao procedimento utilizado no ensaio de CBM, à excepção de se ter utilizado virus construídos e virus mutantes construídos.

Os virus construídos HXB2D-65 correspondem à mutação resistente à ddC e o virus construído HXB2D-184 corresponde à mutação resistente aos 3TC™ e FTC. QUADRO 5 Valores de IC50 em CBMC com vários Isolados

Mutantes de HIV-1 COMPOSTO IIIB HXB2D HXB2D-65 K->R HXB2D-184 M^W #1 0, 22 1,0 2, 5 0,53 #2 0, 28 0,1 3,5 3,0 #3 0, 83 3,0 11,5 9,0 #4 0, 34 3,0 6,5 2,0 AZT 0, 002 0,002 0,001 0,001 3 TC™ 0, 01 0,08 0,125 42, 5 62

DETERMINAÇÃO DE IC50 (μΜ) EM LINHAS DE CÉLULAS EXTREMAMENTE INFECTADAS COM HIV-1 NA PRESENÇA DE VÁRIOS COMPOSTOS ANTIVIRAIS

Infectou-se várias linhas de células com HTLV-IIIb (TCID50 = 200) e cultivou-se em seguida com várias concentrações de fármaco. A IC50 foi determinada medindo os niveis de antigénio p24 no sobrenadante de culturas no dia 6 da infecção. QUADRO 6 COMPOSTO id50 ^g/ml) MT-4 Jurkat H9 U937 CEM #1 (exemplo 23) 2,8 3,0 0,3 0,4 0,2 #2 (exemplo 24) 0,9 1,8 0, 075 0,3 0,4 #3 (exemplo 25) 3,0 3,5 0,1 0,6 0,2 #4 (exemplo 26) 3,2 6,0 1,0 0,4 0,3 AZT (referência) 0, 005 0,01 0, 07 0,04 0,01 AVALIAÇÃO DA DOSE INIBIDORA DA CULTURA DE CÉLULAS (CCID50) O crescimento de células foi determinado por contagem de células e viabilidade por exclusão de azul de tripano 7 dias após tratamento com o fármaco. A CCID50 é exprimida como a concentração de fármaco que inibe 50% do crescimento celular. QUADRO 7 (CCID50 em Várias Células (μΜ)) COMPOSTO CBMCs MT-4 U937 Jurkat H9 CEM #1 (exemplo 23) >500 >500 >500 450 >500 >500 #2 (exemplo 24) 105 >500 22 11 >500 103 #3 (exemplo 25) >500 >500 >500 >500 >500 >500 #4 (exemplo 26) >500 >500 >500 >500 >500 >500 AZT 45 110 110 >500 200 500 INIBIÇÃO DO VÍRUS DA HEPATITE B HUMANA. 63 0 método utilizado para este ensaio é descrito em pormenor em Korba et al., Antiviral Research 15, 217-228 (1992) o qual é descrito abreviadamente como se segue:

Multiplicou-se célula Hep G2 transfectadas com o ADN genómico do virus da hepatite B humana (célula 2.2.15) e manteve-se em meio de cultura RPMI-1640 contendo 5% de soro fetal bovino, glutamina 2mM e 5C^g/ml de sulfato de gentamicina, e verificou-se de modo rotineiro em relação à resistência ao G418. Multiplicou-se as culturas de células 2.2.15 até à confluência em placas de cultura de tecido de 24 poços e manteve-se durante 2 até 3 dias nessa condição antes do tratamento com o fármaco.

Dissolveu-se os fármacos em água estéril ou DMSO a 50% em água estéril a concentrações 100 vezes superior à concentração de ensaio mais elevada. Diluiu-se estas soluções consoante necessário em meio de cultura. O meio de cultura nas células confluentes foi mudado 24 horas antes da exposição aos compostos de ensaio. Durante o tratamento de 10 dias, o meio de cultura foi mudado diariamente. Após 10 dias de tratamento, recolheu-se o meio de cultura e congelou-se a -70°C para análise de ADN do HBV.

Para analisar o ADN extracelular do HBV, incubou-se amostras de 0,2ml de meio de cultura durante 20 minutos a 25°C em NaOH ΙΜ/lOx SSC (lx SSC é NaCl 0,15M/Citrato de Sódio 0,015M, pH 7,2) e aplicou-se em seguida a membranas de nitrocelulose pré-enxaguadas em 20x SSC. Lavou-se então 64 os filtros em 2x SSC e aqueceu-se a 80°C durante 1 hora sob vácuo.

Marcou-se um fragmento de ADN de HBV EcoRl de 3,2 kb purificado com [32P]dCTP por translação por cortes e utilizou-se como uma sonda para detectar ADN de HBV na transferência de manchas por hibridização de ADN. Após lavagem, secou-se a transferência hibridizada e quantificou-se o P utilizando um digitalizador beta Ambis. QUADRO 8 (HBV) COMPOSTO id50 (ng/ml) CD50 (w/ml) BCH -270 (exemplo 7) 7,5 >10

Composto #2 (exemplo 24) 4 >10

Lisboa, 30 de Maio de 2007

Claims (28)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação farmacêutica compreendendo um composto seleccionado do grupo consistindo de (a) 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1, 3-oxatiolano; (b) 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; (c) qualquer combinação dos isómeros (a) e (b); (d) 2R-hidroximetil-4R-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; (e) 2S-hidroximetil-4S-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; (f) qualquer combinação dos isómeros (d) e (e); e (g) sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis dos compostos precedentes, numa quantidade eficaz para tratar infecções pelo vírus da imunodeficiência humana resistente ao 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano e 2-hidroximetil-5-(S'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano, em que a referida formulação farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente, outro agente terapêutico, e em que a referida formulação farmacêutica está numa forma adequada para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo intramuscular, subcutânea e intravenosa) ou numa forma adequada para administração por inalação ou insuflação.

2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para tratar infecções 2 pelo vírus da imunodeficiência humana resistente ao 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano e 2- hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano.

3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)- 1.3- oxatiolano ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para tratar infecções pelo vírus da imunodeficiência humana resistente ao 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano e 2- hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano.

4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)- 1.3- oxatiolano ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para tratar uma infecção pelo Vírus da Hepatite B em mamíferos.

5. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)- 1.3- oxatiolano ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para tratar uma infecção pelo Vírus da Hepatite B em mamíferos.

6. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a referida formulação farmacêutica está numa forma adequada para administração oral ou parentérica.

7. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a referida formulação farmacêutica está numa forma adequada para administração oral, tal como uma cápsula, hóstia, comprimido (incluindo 3 comprimido revestido), pó, granulado, solução, suspensão (incluindo suspensão aquosa ou oleosa), emulsão, bolus, electuário, pasta, xarope, elixir ou pode ser apresentada como um produto seco para reconstituição em água ou outro veiculo adequado antes de ser utilizada.

8. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a referida formulação farmacêutica está numa forma adequada para administração parentérica, tal como um injectável, por exemplo injecção bolus ou infusão continua, ampola, seringa pré-enchida, infusão de pequeno volume, num recipiente de dose múltipla com um conservante, suspensão, solução, emulsão (incluindo uma emulsão num veiculo oleoso ou aquoso), ou pode estar na forma de um pó para reconstituição com um veiculo adequado (por exemplo água estéril, apirógena) antes de ser utilizada.

9. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente em que o outro agente terapêutico é um agente antiviral.

10. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente contendo 10-1500 mg do referido composto por dosagem.

11. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente contendo 20-1000 mg do referido composto por dosagem.

12. Formulação farmacêutica de reivindicação precedente contendo composto por dosagem. acordo com mg do 50-700 qualquer referido 4

13. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação precedente em que o referido outro agente terapêutico é um inibidor da transcriptase inversa não nucleósida ou um análogo de nucleósido ou um inibidor do transporte de nucleósidos ou um imunomodulador.

14. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, em que o análogo de nucleósido é seleccionado de 2R- hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (3TC™), 3'- azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxicitidina (ddc) e 2',3'-didesoxiinosina (ddl).

15. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o referido outro agente terapêutico é 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-l,3-oxatiolano.

16. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o referido outro agente terapêutico é 3'-azido-3'-desoxitimidina.

17. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o referido outro agente terapêutico é 2',3'- didesoxicitidina.

18. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o referido outro agente terapêutico é 2',3'- didesoxiinosina.

19. Utilização de uma formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 para o fabrico de uma preparação farmacêutica para o tratamento de infecções pelo virus da imunodeficiência humana em que as infecções pelo referido 5 vírus são resistentes ao 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1 '-il)-1,3-oxatiolano e 2-hidroximetil-5-(5'-fluorocitosin-1'-il)-1,3-oxatiolano ou para o tratamento de infecção pelo vírus da Hepatite B em mamíferos.

20. Utilização de acordo com a reivindicação 19 em que o mamífero é um ser humano.

21. Formulação farmacêutica para administração oral compreendendo um composto eficaz para tratar infecções pelo vírus da imunodeficiência humana num mamífero seleccionado do grupo consistindo de (a) 2R-hidroximetil-4R-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano; (b) 2S-hidroximetil-4S-(citosin-1'-il)-1, 3-oxatiolano; e (c) um sal ou éster farmaceuticamente aceitável de (a) ou (b), numa quantidade eficaz para tratar a referida infecção pelo vírus da imunodeficiência humana, e um excipiente farmaceuticamente aceitável seleccionado do grupo consistindo de aglutinantes, enchimentos, lubrificantes, desintegrantes, humectantes, agentes de suspensão, emulsionantes, veículos não aquosos, conservantes e combinações destes.

22. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 21 em que a quantidade do composto está entre 10 até 1500 mg.

23. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 22 em que após administração oral a um mamífero se obtém uma concentração do composto no plasma entre 1 até 75 μΜ. 6

24. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 21 compreendendo ainda um agente terapêutico seleccionado do grupo consistindo de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2R-hidroximetil-5S-(citosin-1'-il)-1,3-oxatiolano (3TC), 2',3'-didesoxicitidina (ddC), e 2',3'-didesoxiinosina (ddl).

25. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, em que o referido agente terapêutico é AZT.

26. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 até 25 em que a formulação está na forma sólida ou forma liquida.

27. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 em que a forma sólida é um comprimido ou uma cápsula adequada para administração oral.

28. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 em que a forma liquida é seleccionada do grupo consistindo de suspensões aquosas, suspensões oleosas, soluções, emulsões, xaropes e elixires adequados para administração oral. Lisboa, 30 de Maio de 2007