PT1346041E - Agentes terapêuticos e métodos para a sua utilização no tratamento de uma doença amiloidogénica. - Google Patents

Description

ΕΡ1346041 1 DESCRIÇÃO "AGENTES TERAPÊUTICOS E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE UMA DOENÇA AMILOIDOGÉNICA"

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica prioridade relativamente ao Pedido de Patente Provisória U.S. N° de Série 60/253 302 entregue em 27 de Novembro, 2000; Pedido de Patente Provisória U.S. N° de Série 60/250 198 entregue em 29 de Novembro, 2000; Pedido de Patente Provisória U.S. N° de Série 60/257 186 entregue em 20 de Dezembro, 2000, cuja totalidade do teor é aqui incluída como referência.

Fundamento do Invento

Os fagócitos mononucleares estão estreitamente associados a doenças do sistema nervoso central. As células da microglia encontradas no cérebro adulto normal são células quiescentes, altamente ramificadas, que controlam processos e se tornam altamente reactivas durante lesões do SNC (Rio-Hortega (1932) . As células da microglia reactivas (fagócitos mononucleares do cérebro activados) têm sido identificados com as placas neuríticas da Doença de Alzheimer (AD) (Bolsi, 1927; McGeer et al., 1987; Rogers et ai., 1988; Giulian, 1992; Perlmutter et al., 1992; Giulian 2 ΕΡ1346041 et al., 1995a). Como resultado, pensa-se que a destruição de neurónios induzida por beta-amilóide (Αβ) envolva células inflamatórias. Na Doença de Alzheimer, a histopatologia quantitativa determinou que >80% das placas centrais estão associadas a grupos de células da microglia reactivas, enquanto que menos de 2% dos depósitos Αβ apresentam tal associação (Giulian et al., 1995a). Estas observações sugerem que as respostas inflamatórias do cérebro possam ser dirigidas especificamente contra os constituintes das placas neuriticas e centrais. Como principais células imunes efectoras do cérebro, as células da microglia activadas são capazes de libertar agentes citotóxicos tais como enzimas proteoliticas, citocinas, proteínas do complemento, intermediários de oxigénio reactivos, toxinas tipo NMDA e óxido nítrico (Thery et al., 1991; Giulian, 1992; Rogers et al.; Lees, 1993, Banati, R.B., 1993) . A doença de Alzheimer (AD), descrita pela primeira vez pelo psiquiatra da Bavária Alois Alzheimer em 1907, é uma alteração neurológica progressiva que começa com perda de memória a curto prazo e progride com desorientação, incapacidade de julgamento e racionalização e, finalmente, demência. O curso da doença geralmente conduz à morte num estado de imobilização altamente debilitado, entre quatro e doze anos após o início. Calculou-se que AD atinja 5 a 11 por cento da população com mais de 65 anos e 47 por cento da população com mais de 85 anos. O custo social de AD é superior a 80 biliões de 3 ΕΡ1346041 dólares anualmente, principalmente devido aos amplos cuidados de custódia necessários para dos doentes com AD. Ainda, uma vez que os adultos nascidos durante a explosão populacional dos anos 40 e 50 se aproximam da idade em que AD se torna mais prevalente, o controlo e tratamento de AD torna-se um problema de cuidados de saúde cada vez mais significativo. Presentemente, não existe tratamento que retarde significativamente a progressão da doença. Para uma revisão sobre AD, ver Selkoe, D.J. Sei. Amer., Novembro 1991, pp. 68-78; e Yankner, B.A. et al., (1991) N. Eng. J. Med. 325:1849-1857.

Foi descrita (Games et al. (1995) Nature 373:523-527) a criação de uma neuropatologia do tipo Alzheimer em ratinhos transgénicos. Os ratinhos transgénicos expressam niveis elevados de proteína precursora amilóide humana mutante e progressivamente desenvolvem muitas das condições associadas a AD.

Patologicamente, a AD caracteriza-se pela presença de lesões distintas no cérebro da vítima. Estas lesões do cérebro incluem filamentos intracelulares anormais designados entrançados neurofibrilhares (NTFs) e depósitos extracelulares de proteínas amiloidogénicas em placas senis ou amilóides. Os depósitos amilóides estão também presentes nas paredes dos vasos sanguíneos cerebrais dos doentes com AD. O principal constituinte proteico das placas amilóides foi identificado como um peptídeo de 4 quilodaltons designado peptídeo β-amilóide (β-ΑΡ) (Glenner, 4 ΕΡ1346041 G.G. e Wong, C.W. (1984) Biochem. Bipophys. Res. Commun. 120:885-890; Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4245-4249). Depósitos difusos de β-ΑΡ são frequentemente observados em cérebros adultos normais, enquanto que o tecido cerebral com AD caracteriza-se por placas β-amilóides com um centro denso mais compacto. (Ver e.g., Davies, L. et al. (1988) Neurology 38:1688-1693). Estas observações sugerem que a deposição de β-ΑΡ preceda e contribua para a destruição de neurónios que ocorre em AD. Ainda apoiando o papel patogénico directo de β-ΑΡ, demonstrou-se que β-amilóide é tóxica para os enurónios maduros, tanto em cultura como in vivo. Yankner, B.A. et al. (1989) Science 245:417-420; Yankner, B.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:9020-9023; Roher, A.E. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:572-579; Kowall, N.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7247-7251. Ainda, os doentes com hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo Holandês (HCHWA-D), que se caracteriza por depósitos β-amilóides difusos dentro do córtex cerebral e cerebrovasculatura, demonstrou-se possuírem uma mutação pontual que conduz a uma substituição de aminoácido dentro de β-ΑΡ. Levy, E. et al. (1990) Science 248:1124-1126. Esta observação demonstra que uma alteração específica da sequência de β-ΑΡ pode causar o depósito de β-amilóide. β-ΑΡ natural deriva, por proteólise, de uma proteína muito maior designada proteína precursora amilóide (APP). Kang, J. et al. (1987) Nature 325:733; Goldgaber, D. et al. (1987) Science 235:877; Robakis, N.K. et al. (1987) 5 ΕΡ1346041

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:4190; Tanzi, R.E. et al. (1987) Science 235:880. O gene APP está situado no cromossoma 21, proporcionando assim uma explicação para o depósito β-amilóide observado em indivíduos jovens com síndrome de Down, o qual é causado por trissomia do cromossoma 21. Mann, D.M. et al. (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15:317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J. Med. 320:1446. APP possui um único domínio que atravessa as membranas, com uma longa região terminal amina (cerca de dois terços da proteína) estendendo-se para o ambiente extracelular e uma região terminal carboxilo mais curta projectando-se para o citoplasma. "Splicing" diferencial do RNA mensageiro de APP conduz a pelo menos cinco formas de APP, compostas por 563 aminoácidos (APP-563), 695 aminoácidos (APP-695), 714 aminoácidos (APP-714), 751 aminoácidos (APP-751) ou 770 aminoácidos (APP-770).

Dentro de APP, o péptido β-amilóide natural começa num resíduo de ácido aspártico na posição de aminoácido 672 de APP-770. β-ΑΡ natural, derivada da proteólise de APP, tem 39 a 43 aminoácidos de comprimento, dependendo do ponto de terminação do extremo carboxilo, o qual apresenta heterogeneidade. A forma circulante predominante de β-ΑΡ no sangue e fluido cerebrospinal de doentes com AD e adultos normais é βΐ—40 ("β curta").

Seubert, P. et al. (1992) Nature 359:325; Shoji, M. et al. (1992) Science 258:126. No entanto, β1-42 e βΐ—4 3 ("β longa") são também formas das placas β-amilóides. Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4245; 6 ΕΡ1346041

Miller, D. et al. (1993) Arch Biochem. Biophys. 301:41; Mori, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17082. Se bem que o mecanismo molecular preciso que conduz à agregação e depósito de β-ΑΡΡ seja desconhecido, o processo tem sido comparado ao das polimerizações dependentes de nucleação, como seja a cristalização de proteínas, formação de microtúbulos e polimerização de actina. Ver e.g., Jarrett, J.T. e Lansbury, P.T. (1993) Cell 73:1055-1058. Nesses processos, a polimerização dos componentes monoméricos não ocorre até à formação do núcleo. Assim, estes processos são caracterizados por um intervalo antes de ocorrer a agregação, seguido de polimerização rápida até à nucleação. A nucleação pode ser acelerada pela adição de uma "semente" ou núcleo pré-formado, que resulta em polimerização rápida. Demonstrou-se que as formas β longas de β-ΑΡ actuam como sementes, acelerando assim a polimerização de formas β-ΑΡ longas e curtas. Jarrett, J.T. et al. (1993) Biochemistry 32:4693. Num estudo, em que foram feitas substituições de aminoácidos em β-ΑΡ, dois peptídeos β mutantes foram descritos como interferindo com a polimerização de β-ΑΡ não mutada quando as formas mutante e não mutante do peptídeo foram misturadas. Hilbich C. et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:460-473. Quantidades equimolares de peptídeos β-amilóide mutante e não mutante (i.e., natural) foram usadas para observar este efeito e os peptídeos mutantes foram descritos como sendo inadequados para usar in vivo. Hilbich, C. et al. (1992), supra. WO 96/28471 descreve um composto modulador 7 ΕΡ1346041 amilóide compreendendo uma proteína amiloidogénica, ou seu fragmento peptídico, acoplado directa ou indirectamente a pelo menos um grupo de modificação, de forma a que o composto module a agregação de proteínas ou peptídeos amilóides naturais quando postos em contacto com as proteínas ou peptídeos amiloidogénicos naturais. Compostos, células recombinantes, composições farmacêuticas, método para a sua preparação e sua utilização de acordo com o invento não são descritos nem sugeridos por WO 96/28471.

Pallitto, M. et al. (Bíochemístry, 1999, 38, 3570-3578) descreve uma estratégia modular para a geração de compostos que inibem a toxicidade Αβ, baseada na associação de um elemento de reconhecimento para Αβ a um elemento de disrupção projectado para interferir com a agregação de Αβ. Um desses compostos, com a sequência 15-25 de Αβ como elemento de reconhecimento e um hexâmero de lisina como elemento de disrupção, alterou a cinética de agregação de Αβ e protegeu células da toxicidade de Αβ. As experiências de optimização com elementos de reconhecimento consistindo em 4-8 resíduos revelou que nenhum dos peptídeos de reconhecimento alterou a cinética de agregação de Αβ e apenas dois, KLVFF e KLVF, tiveram algum efeito protector contra a toxicidade de Αβ. O peptídeo híbrido KLVFF-KKKKKK alterou dramaticamente a cinética de agregação de Αβ e a morfologia dos agregados e proporcionou protecção significativamente melhorada contra a toxicidade de Αβ comparativamente com o peptídeo de reconhecimento sozinho. A sequência mista VLFKF foi quase tão eficaz quanto um 8 ΕΡ1346041 domínio de reconhecimento como KLVFF, sugerindo que as características hidrofóbicas da sequência de reconhecimento são críticas. Os compostos, células recombinantes, composições farmacêuticas, método para a sua preparação e sua utilização de acordo com o invento não são descritas nem sugeridas por Pallitto, M. et al. (Biochemistry, 1999, 38, 3570-3578).

Sumário do Invento O presente invento proporciona agentes terapêuticos, suas composições farmacêuticas e métodos para a sua utilização no tratamento de doença amiloidogénica. Os agentes terapêuticos do invento incluem compostos compreendendo a fórmula I-L-P, em que I é uma imunoglo-bulina, e.g., IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE, região constante da cadeia pesada ou seu fragmento; L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P é um peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica, e.g., β-amilóide, trans-tirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, citatina C, β2 microglobulina, ApoA-l, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio, lisozima, Huntington ou α-sinucleína. Numa forma de realização, I pode compreender a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:10. Numa outra forma de realização, I compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais de identidade com a sequência de 9 ΕΡ1346041 aminoácidos descrita em SEQ ID NO:10. I pode ter 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 ou 1-10 aminoácidos. P compreende cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos e, de preferência, cerca de 50, 40, 30, 20 ou 10 aminoácidos. Nalgumas formas de realização P pode compreender pelo menos um aminoácido não natural ou pelo menos um D-aminoácido. Numa forma de realização preferida, P compreende uma sub-região de uma proteína amiloidogénica como seja o peptídeo β-amilóide, transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, citatina C, β2 micro-globulina, ApoA-I, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio ou lisozima. Numa forma de realização preferida, P pode compreender a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:l ou seus fragmentos. Numa outra forma de realização, P compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:l.

Numa outra forma de realização, P é um peptídeo constituído na totalidade por D-aminoácidos e tendo pelo menos três resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados do grupo constituído por uma estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina, uma estrutura de D-iodotirosina e uma estrutura 10 ΕΡ1346041 de D-alanina. Numa forma de realização preferida, P é um peptideo compreendendo a estrutura (Y_ Xaâi—Xââ2—Xaa3—Xaa4—Z) em que Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são individualmente estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de entre Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são, independentemente, selec-cionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina; Y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e a é um inteiro entre 1 e 15; e Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro entre 1 e 15;

Numa forma de realização particularmente preferida, P é um peptideo seleccionado do grupo consistindo em: D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Fenetilamida, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTir, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-lodoTir-D-Ala, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala- 11 ΕΡ1346041 D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu e D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu.

Num outro aspecto, o presente invento tem por objectivo dímeros ou outros multímeros dos compostos do invento. Num outro aspecto, o invento tem como objectivo uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona métodos para eliminação de uma proteína amiloidogénica de um indivíduo através do contacto da proteína amiloidogénica com um composto do invento, de forma a que a proteína amiloidogénica seja eliminada do indivíduo.

Ainda num outro aspecto, o invento tem por objectivo métodos para o tratamento de um indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica, e.g., doença de Alzheimer ou encefalopatia espongiforme, através da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento, tratando assim o indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica.

Numa outra forma de realização, o presente invento proporciona um método de preparação de um agente terapêutico compreendendo a fórmula I-L-P', em que I é uma 12 ΕΡ1346041 imunoglobulina, e.g., IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE, região constante da cadeia pesada ou seu fragmento; L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P' é um peptideo capaz de se ligar a uma proteína alvo. O método compreende (1) rastreio de uma biblioteca de peptídeos para identificar um ou mais peptídeos que se ligam à proteína alvo; (2) determinação da sequência de aminoácidos de pelo menos um peptideo que se liga à proteína alvo; e (3) produção de um agente terapêutico compreendendo um peptideo tendo a sequência de aminoácidos identificada no passo (2) e uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento, ligada através de um grupo de ligação L ou de uma ligação directa.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 descreve uma análise de transferência Western de lisados de células COS e meio colhido das células COS expressando a região Fc de igGl de ratinho fundida com os resíduos de aminoácidos 1-40, 1-42, 10-25, 16-30, 17-21 ou 17-21 (A21L) de β-amilóide com ou sem uma protecção N-terminal de três glicinas.

Figura 2 descreve uma análise de imuno-histo-química de secções frontais de cérebro derivadas de ratinhos com 20-22 semanas transgénicos para a mutação Sueca da proteína amilóide precursora e presenilina de IgGl de ratinho fundida com vários segmentos de β-amilóide, meio de células COS não transfectadas ou anticorpo policlonal anti^-amilóide. 13 ΕΡ1346041

Figura 3 descreve os oligonucleótidos sintéticos que foram usados para montar o gene sintético APP/IgG. Estes oligonucleótidos possuem locais para endonucleases de restrição únicos necessários para a montagem.

Figura 4 é uma representação esquemática do vector de expressão pTlg.

Figura 5 é uma representação esquemática da montagem de Αβ1-40 e Αβ1-42 sintéticos, com e sem um grupo de ligação, com três glicinas entre o propeptideo tPA e o peptideo β-amilóide.

Figura 6 descreve a sequência de DNA, composição de aminoácidos e locais de reconhecimento por endonucleases de restrição do gene β-amilóide sintético.

Figura 7A descreve a sequência dos oligonucleótidos usados na montagem de subfragmentos do gene β-amilóide sintético e uma compilação das construções β-amilóides/IgGl que foram preparadas.

Figura 7B descreve a sequência dos oligonucleótidos usados na montagem de subfragmentos do gene β-amilóide sintético e uma compilação das construções β-amilóides/lgGl que foram preparadas.

Figura 8 é um gráfico que demonstra que a inter- 14 ΕΡ1346041 nalização de fibrilhas mediada pelo receptor Fc pelas células ocorre na presença da proteína de fusão Αβ(16—30)— Fc ou do anticorpo α-β-amilóide.

Figura 9 é um gráfico gue demonstra gue a proteína de fusão Αβ (16-30)-Fc interfere com a ligação do peptídeo β-amilóide à fibrilhas amilóides.

Figura 10 é uma secção do cérebro corada com Tioflavina S, demonstrando gue o tratamento de um ratinho transgénico para o modelo da doença de Alzheimer com a proteína de fusão Αβ(16-30)-Fc resulta num decréscimo das placas no local de administração.

Figura 11 descreve a região codificadora do gene sintético de tPAApro/16-30/Fc cDNA (SEQ ID NO:ll).

Figura 12 descreve a sequência de aminoácidos da proteína de fusão tPAApro/16-30/Fc (SEQ ID NO:12). Os elementos funcionais anotados estão também apresentados. A proteína Αβ(16-30)-Ρσ está aqui descrita como SEQ ID NO:13.

Descrição Detalhada do Invento O presente invento proporciona agentes terapêuticos e métodos para a sua utilização no tratamento de uma doença amiloidogénica. Os agentes terapêuticos do invento incluem compostos compreendendo a fórmula I-L-P, em que I é uma região constante da cadeia pesada de imuno- 15 ΕΡ1346041 globulina ou seu fragmento (e.g., compreendendo a região Fc) ; L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P é um peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloi-dogénica.

Sem pretender estar limitado pela teoria, pensamos que a fracção P dos compostos do invento servirá para ligar uma proteína amiloidogénica, e.g., uma proteína amiloidogénica dentro de uma placa amilóide, e a porção I dos compostos do invento servirão para dirigir a microglia para a proteína amiloidogénica, a qual microglia pode internalizar e degradar a proteína amiloidogénica e a placa amilóide.

Sendo aqui usados de forma permutável, os termos "I" e "região constante da cadeia pesada de imunoglobulina" destinam-se a incluir a região constante de qualquer cadeia pesada de imunoglobulina, e.g., cadeia pesada ylr γ2, γ3, γ4, μ, ai, α2, δ, ou ε, ou um seu fragmento. A região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento pode ser de origem monoclonal ou policlonal, não ter especificidade epitópica e, de preferência, possuir uma região Fc (i.e., mantém a capacidade para se ligar a um receptor Fc, e.g., um receptor Fc numa célula da microglia como seja um receptor Fcy) . Em formas de forma de realização preferidas, incluirá a região Fc de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, de preferência inclui os domínios CH2 e CH3 e a região de charneira de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina. 16 ΕΡ1346041

As regiões constantes da cadeia pesada de imuno-globulina são conhecidas. Por exemplo, a sequência da IgG de ratinho pode ser encontrada no N° de Acesso GenBank M60428, a sequência de igGl humana pode ser encontrada no N° de Acesso GenBank J00228, a sequência IgG2 humana pode ser encontrada no N° de Acesso GenBank J00230, a sequência de lgG3 humana pode ser encontrada no N° de Acesso GenBank AJ390267 e a sequência de IgG4 humana pode ser encontrada no N° de Acesso GenBank K01316, cujo conteúdo está na totalidade aqui incluído como referência. As sequências preferidas para serem usadas incluem a sequência IgG de ratinho começando no resíduo 98 e terminando no extremo C da molécula, a sequência igGl humana começando no resíduo 97 e terminando no extremo C da molécula, a sequência IgG2 humana começando no resíduo 97 e terminando no extremo C da molécula, a sequência lgG3 humana começando no resíduo 98 e terminando no extremo C da molécula e a sequência IgG4 humana começando no resíduo 97 e terminando no extremo C da molécula. Numa forma de realização, I pode compreender a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:10 ou seus fragmentos.

Um "receptor Fc", como aqui é usado, é uma proteína expressa na superfície de uma célula, e.g., uma célula da microglia, que reconhece e se liga à região constante não específica da cadeia pesada de imunoglobulinas circulantes, e.g., IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE. 17 ΕΡ1346041

Uma "região Fc" como aqui é usada, inclui a parte de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina que é necessária para a ligação a um receptor Fc.

Sendo aqui usados de forma permutável, os termos "P" e "peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloi-dogénica" destinam-se a incluir compostos compreendendo quatro ou mais resíduos de aminoácido ligados através de ligações amida que possuem a capacidade de ligação a uma proteína amiloidogénica. Tais compostos podem ser biomo-léculas peptídicas naturais, variantes da sequência de aminoácidos de uma biomolécula peptídica natural ou peptí-deos sintéticos, o peptídeo inclui qualquer um ou a totalidade dos vinte L-aminoácidos naturais. 0 peptídeo pode também incluir um ou mais resíduos de D-aminoácidos e/ou um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais.

Como aqui é usado, o termo "proteína amiloidogénica" inclui qualquer proteína que seja capaz de formar ou estar envolvida na formação de um depósito amilóide, e.g., um depósito proteico extracelular característico de uma série de doenças diferentes. Apesar de serem de ocorrência diversa, todos os depósitos amilóides possuem propriedades morfológicas comuns, coram com corantes específicos (e.g., vermelho Congo) e possuem um aspecto bi-refringente vermelho-verde característico na presença de luz polarizada após coloração. Também partilham caracte-rísticas ultra-estruturais comuns e espectros de difracção 18 ΕΡ1346041 de raios X e de infravermelhos. Exemplos de proteínas amiloidogénicas incluem transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, citatina C, β2 microglobulina, ApoA-I, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio, lisozima, Huntington ou a-sinucleína.

Sendo aqui usados de forma permutável, os termos "L" e "agente de ligação" incluem uma ligação directa ou qualquer agente que possa ser usado para ligar a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, ou seu fragmento, e o peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica. Agentes de ligação preferidos incluem agentes de ligação peptídicos, assim como agentes de ligação cruzada heterobifuncionais, os quais podem ser usados para ligar proteínas de forma gradual. Na área é conhecida uma grande variedade de agentes de ligação cruzada heterobifuncionais, incluindo 4-(N-maleimido-metil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo (SMCC), éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida (MBS); (4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB) de N-succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), hidroclo-reto de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); 4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(2-piridiltio)-tolueno (SMPT), 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-[3-(2-piridiltio)propionato]hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP) . 19 ΕΡ1346041

Numa forma de realização, o agente de ligação é um resíduo de aminoácido ou uma sequência de resíduos de aminoácidos. De preferência, o agente de ligação possui cerca de 1-20, cerca de 1-15, cerca de 1-10 ou cerca de 1-5 resíduos de aminoácidos. Mais de preferência, o agente de ligação compreende resíduos de aminoácidos com pequenas cadeias laterais, e.g., alanina ou glicina. Mais de preferência, o agente de ligação é AlaN ou GliN, em que N é cerca de 1-10 resíduos. O presente invento também proporciona métodos para o tratamento de um indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica. Os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento, tratando assim o indivíduo que sofre da alteração amiloidogénica.

Como aqui é usado o termo "alteração amiloidogénica" inclui qualquer doença ou condição causada ou caracterizada por depósitos de uma proteína amiloidogénica. Exemplos não limitantes de alterações amiloidogénicas incluem as causadas ou caracterizadas pelos depósitos de Transtirretina (TTR), e.g. polineuropatia amilóide familiar (Tipo Português, Japonês e Sueco), cardiomiopatia amilóide familiar (Tipo Dinamarquês), amilóide cardíaca isolada e amiloidose sistémica senil; as causadas ou caracterizadas por depósitos da Proteína dos Priões (PrP), e.g., encefalopatias espongiformes, incluindo a coceira dos carneiros ("scrapie"), encefalopatia espongiforme bovina em 20 ΕΡ1346041 vacas e doença de Creutzfeldt-Jakob (CJ) e síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) em humanos; as causadas ou caracterizadas por depósitos de Polipeptídeo dos Ilhéus Amilóide (IAPP, também conhecido como amilina), e.g., diabetes estabelecidos de adultos e insulinoma; as causadas ou caracterizadas por depsóitos de Factor Natriurético Auricular (ANF), e.g., amilóide auricular isolada; as causadas ou caracterizadas por depósitos da cadeia leve capa ou lambda, e.g., amiloidose idiopática (primária), mieloma ou amiloidose associada a macroglobu-linemia, e amiloidose primária nodular cutânea localizada associada a sindrome de Sjogren; as causadas ou caracterizadas por depósitos de Amilóide A, e.g., amiloidose reactiva (secundária) (ver e.g., Liepnieks, J.J., et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta 1270:81-86), Febre Mediterrânica familiar e nefropatia amilóide familiar com urticária e surdez (sindrome de Muckle-Wells); as causadas ou caracterizadas por depósitos de Cistatina C, e.g., hemorregia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Islandês; as causadas ou caracterizadas por depósitos de β2 microglobulina (β2Μ), e.g., complicações associadas com hemodiálise a longo prazo; as causadas ou caracterizadas por depósitos de Apolipoproteína A-I (ApoA-I), e.g., amiloidose sistémica não neuropática hereditária (polineuropatia amilóide familiar III); as causadas ou caracterizadas por depósitos de Gelsolina, e.g., amiloidose familiar do tipo Finlandês; as causadas ou caracterizadas por depósitos de Procalcitonina ou Calcitonina, e.g., fibrilhas amilóides associadas a carcinoma medular da 21 ΕΡ1346041 tiróide; as causadas ou caracterizadas por depósitos de Fibrinogénio, e.g., amiloidose renal hereditária; e as causadas ou caracterizadas por depósitos de Lisozima, e.g., amiloidose sistémica hereditária. Outros exemplos de alterações amiloidogénicas incluem doença de Huntington e miocitose de corpos de inclusão.

Como aqui usado, o termo "indivíduo" inclui animais de sangue quente, de preferência mamíferos, incluindo humanos. Numa forma de realização preferida, o indivíduo é um primata. Numa forma de realização ainda mais preferida, o primata é um ser humano.

Como aqui usado, o termo "administração" a um indivíduo inclui distribuição, introdução ou aplicação de um composto, e.g., um composto numa formulação farmacêutica (como aqui descrito), a um indivíduo através de qualquer via adequada para administração do composto numa localização pretendida do indivíduo, incluindo introdução por via parentérica ou oral, injecção intramuscular, injecção subcutânea/intradérmica, injecção intravenosa, administração bucal, introdução transdérmica e administração pela via rectal, colónica, vaginal, intranasal ou através do sistema respiratório (e.g., por inalação).

Como aqui usado, o termo "quantidade eficaz" inclui uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para se conseguir o resultado pretendido, e.g., suficiente para tratar uma alteração 22 ΕΡ1346041 amiloidogénica num indivíduo. Uma quantidade eficaz de um composto do invento como definido pode variar de acordo com factores tais como estado de doença, idade e peso do indivíduo e capacidade do composto para induzir uma resposta pretendida no indivíduo. Os regimes de dosagens podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica óptima. Uma quantidade eficaz é igualmente uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou lesivos (e.g., efeitos secundários) do composto são ultrapassados pelos efeitos terapêuticos benéficos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento (í.e., uma dosagem eficaz) pode variar entre cerca de 0,001 e 30 mg/kg de peso do corpo, de preferência cerca de 0,01 a 25 mg/kg de peso do corpo, mais de preferência cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso do corpo e mesmo mais de preferência cerca de 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg ou 5 a 6 mg/kg de peso de corpo. Os familiarizados com a matéria sabem que determinados factores podem influenciar a dosagem necessária para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não estando limitados à gravidade da doença ou alteração, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Ainda, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos. Num exemplo, um indivíduo é tratado com um composto do invento na gama entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso do 23 ΕΡ1346041 corpo, uma vez por semana durante cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre 2 e 8 semanas, mais de preferência entre cerca de 3 e 7 semanas e mesmo mais de preferência durante cerca de 4, 5 ou 6 semanas. Será óbvio que uma dosagem eficaz de um composto do invento usado no tratamento pode aumentar ou diminuir no decurso de um tratamento particular. Vários outros aspectos do presente invento estão descritos mais detalhadamente nas subsecções que se seguem. I. Região constante da cadeia pesada de imuno- globulina A região constante da cadeia pesada de imuno-globulina usada nos compostos do invento pode ser obtida usando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, preparações de imunoglobulinas policlonais (que podem ser clivadas como descrito abaixo para gerar regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina ou seus fragmentos) podem derivar directamente do sangue das espécies animais pretendidas. Assim, no caso de seres humanos, preparações de imunoglobulinas policlonais podem ser preparadas a partir de unidades de sangue fora do prazo, usando protocolos conhecidos ou facilmente adquiridos. Tais produtos podem ser comprados (Sandoz Limited; Cutter Laboratories; Hyland Laboratories) e são de rotina usados na preparação de imunoglobulinas. 24 ΕΡ1346041

Ainda, caso se pretenda, preparações de imuno-globuilinas policlonais podem ser preparadas a partir de sangue de indivíduos imunizados das espécies pretendidas após imunização com qualquer um de uma variedade de anti-génios, seguido de colheita do sangue e processamento de acordo com técnicas conhecidas. Uma vantagem importante das preparações de imunglobulinas não especificas é que através da preparação de imunoglobulina da mesma espécie em que se quer administrar, as reacções imunes cruzadas devido à barreira das espécies são evitadas e administrações repetidas do mesmo produto são menos propícias a causar efeitos secundários. Deverá ser sublinhado que as administrações entre espécies diferentes poderão ser efectuadas. No entanto, a sua utilização deverá aumentar a incidência de reacções adversas, tais como reacções anafiláticas, reacções febris e/ou a geração de uma resposta imune à proteína imunoglobulina estranha que bloqueará o seu uso efectivo, assim como poderá pôr em perigo a saúde do indivíduo. 0 evitar tais reacções aumenta o desejo de usar uma preparação de imunoglobulina que seja da mesma espécie a ser tratada.

Imunoglobulinas monoclonais (que podem ser clivadas como descrito abaixo para gerar regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina ou seus fragmentos) podem ser preparadas usando técnicas conhecidas tais como a técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497) (ver também, Brown et al., (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al., (1980) J. 25 ΕΡ1346041

Biol. Chem. 255:4980-3; Yeh et al. (1976) Proc. Natl Acad.

Sei. USA 76: 2927-31; e Yeh et al. (1982) int. J. Câncer 29:269-75); a técnicas de hibridomas de céulas B humanas mais recente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72) ; ou a técnica de hibridomas com EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). A tecnologia para a obtenção de hibridomas para a produção de anticorpos monoclonais é conhecida (ver, de uma forma geral, R.H. Kenneth, In Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al., (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36).

Qualquer um dos muitos protocolos conhecidos usados para a fusão de linfócitos e linhas celulares imortalizadas pode ser aplicado com o objectivo de gerar um anticorpo monoclonal (ver e.g., G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., referido supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., referido supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, referido supra). Ainda, para os familiarizados com a área é óbvio que existem muitas variações a tais métodos que também serão úteis. Tipicamente, a linha celular imortalizada (e.g., uma linha celular de mieloma) deriva da mesma espécie de mamifero dos linfócitos. Por exemplo hibridomas murinos podem ser preparados fundindo linfócitos de um ratinho imunizado com uma preparação imunogénica do presente invento com uma linha celular imortalizada de ratinho. São linhas celulares 26 ΕΡ1346041 imortalizadas preferidas as linhas celulares de mieloma de ratinho que são sensíveis a meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio "HAT"). Qualquer uma das linhas celulares de mieloma pode ser usada como parceiro de fusão de acordo com técnicas convencionais, e.g., as linhas celulares de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/0-Agl4. Estas linhas celulares de mieloma podem ser adquiridas à ATCC. Tipicamente, as células de mieloma de ratinho sensíveis a HAT são fundidas com esplenócitos de ratinho usando polietilenoglicol ("PEG"). As células de hibridoma resultantes da fusão são então seleccionadas usando meio HAT, o qual mata células de mieloma não fundidas e fundidas não produtivamente (os esplenócitos não fundidos morrem após vários dias devido a não estarem transformados).

Como alternativa à preparação de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais, um anticorpo monoclonal (que pode ser clivado como descrito abaixo para gerar regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina ou seus fragmentos) pode ser isolado a partir de uma biblioteca combinatória de imunoglobulinas recombinantes (e.g., uma biblioteca de apresentação fágica de anticorpos). Estojos ("kits") para a geração e rastreio de bibliotecas de apresentação fágicas podem ser compradas (e.g., o Recombinant Phage Antibody System, da Pharmacia N° de Catálogo 27-9400-01; e o estojo ("kit") SurfZAP™ Phage Display, da Stratagene N° de Catálogo 240612) . Ainda, exemplos de métodos e reagentes particularmente adequados 27 ΕΡ1346041 para usar na geração e rastreio de bibliotecas de apresentação de anticorpos podem ser encontradas, por exemplo, em Ladner et al., Patente U.S. N° 5 223 409; Kang et al., Publicação Internacional PCT N° W092/18619; Dower et al., Publicação Internacional PCT N° W091/17271; Winter et al., Publicação Internacional PCT WO92/20791; Markland et al., Publicação Internacional PCT N° W092/15679; Breitling et al. Publicação Internacional PCT WO 93/01288; McCafferty et al., Publicação Internacional PCT N° W092/01047; Garrard et al. Publicação Internacional PCT N° WO 92/09690; Ladner et al., Publicação Internacional PCT N° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biol Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Biol Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7978-7982; e McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.

Ainda, imunoglobulinas recombinantes, tais como imunoglobulinas quiméricas e humanizadas, compreendendo porções humanas e não humanas, que podem ser preparadas usando técnicas convencionais de DNA recombinante, podem também ser usadas para gerar regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos. Tais imuno-globulinas/anticorpos monclonais humanizados podem ser 28 ΕΡ1346041 produzidos por técnicas conhecidas de DNA recombinante, por exemplo usando métodos descritos em Robinson et al. Pedido de Patente Internacional N° PCT/US86/02269; Akira, et al., Pedido de Patente Europeia 184 187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171 469; Morrison et al. Pedido de Patente Europeia 173 494; Neuberger et al. Publicação Internacional PCT N° WO 86/01533; Cabilly et al. Patente U.S. N° 4 816 567; Cabilly et al. Pedido de Patente Europeia 125 023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Can. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; e Shaw et al. (1988) J. Natl Câncer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4:214; Winter Patente U.S. 5 225 539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Anticorpos/imunoglobulinas preparados por qualquer uma das técnicas referidas podem então ser clivados, e.g., usando enzimas conhecidas tais como papaina, pepsina e subtilisina, para gerar regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina ou seus fragmentos.

Ainda, os compostos do invento (compreendendo uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou um seu fragmento, e.g., um fragmento compreendendo a região 29 ΕΡ1346041

Fc) podem ser preparados como proteínas de fusão usando técnicas convencionais de DNA recombinante, como descrito mais detalhadamente abaixo. II. Peptídeos capazes de se ligarem a uma proteína amiloidogénica 0 componente "P" dos compostos do invento pode ser qualquer molécula, compreendendo quatro ou mais resíduos de aminoácidos ligados por ligações amida, que tem capacidade para se ligar a uma proteína amiloidogénica.

Numa forma de realização, o componente "P" dos compostos do invento é projectado com base na sequência de aminoácidos de β-ΑΡ natural. Os termos "β-ΑΡ natural", "peptídeo β-amilóide natural" e "peptídeo Αβ natural", usados de forma permutável, pretendem englobar produtos de clivagem proteolítica naturais da proteína precursora β-amilóide (APP) que estão envolvidos na agregação β-ΑΡ e β-amiloidose. Estes peptídeos naturais incluem peptídeos β-amilóides tendo 39—43 aminoácidos (i.e., Αβι-39, Αβ 1-40, Αβ!-41 f Αβ 1-42 e Αβχ -43) . O resíduo de aminoácido amino-terminal de β-ΑΡ natural corresponde ao resíduo de ácido aspártico na posição 672 da forma de 770 resíduos de aminoácidos da proteína precursora amilóide ("APP-770"). A forma de 43 aminoácidos de comprimento de β-ΑΡ natural tem a sequência de aminoácidos DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT (SEQ ID NO:l), enquanto as formas mais curtas possuem 1-4 resíduos de aminoácidos deletados do extremo carboxi- 30 ΕΡ1346041 terminal. Qualquer fragmento da β-ΑΡ natural que é capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica pode ser usado como componente "P" nos compostos do invento. De preferência, o componente "P" nos compostos do invento pode compreender pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo Αβ natural.

Numa forma de realização preferida, o componente "P" nos compostos do invento foi projectado com base na sequência de aminoácidos de um "domínio nuclear de agregação Αβ" (ACD). Tal como aqui é usado, o termo "domínio nuclear de agregação Αβ" refere-se a uma sub-região de um peptídeo β-amilóide que é suficiente para modular a agregação de β-APs naturais quando esta sub-região, na sua forma de L-aminoácido, é apropriadamente modificada (e.g., modificada no extremo amina), como descrito detalhadamente no Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/548 998 e Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/616 081, cujos conteúdos são aqui expressamente incluídos como referência. De preferência, o componente "P" nos compostos do invento é ou é modelado a seguir à sub-região de β-ΑΡ natural que tem menos de 15 aminoácidos de comprimento e mais de preferência tem entre 4 e 10 aminoácidos de comprimento. Em várias formas de forma de realização, o componente "P" nos compostos do invento, ou é modelado depois, uma sub-região β-ΑΡ que tem 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos de comprimento. 31 ΕΡ1346041

Numa forma de realização, a sub-região β-ΑΡ, na qual o componente "P" nos compostos do invento é modelada, é uma região interna ou carboxi-terminal de β-ΑΡ (i.e., a jusante do extremo amina na posição de aminoácidos 1) . P pode, assim, ser um fragmento de Αβ que inclui 35 ou menos, 30 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos ou 15 ou menos resíduos de aminoácidos. Numa outra forma de realização, o componente "P" nos compostos do invento é, ou é modelado depois, uma sub-região de β-ΑΡ hidrofóbica. Os componentes "P" preferidos incluem os resíduos de aminoácidos 16-30, 17-20, 17-21, 16-25 ou 1-25 de β-ΑΡ natural (Αβι6-3ο, Αβί 7-20 , Αβί 7-21 , Αβχ6_25 OU Αβί _25, respectivamente) . As sequências de aminoácidos de Αβι7_20 e Αβι7_2ι são Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID N0:2) e Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:3), respectivamente. O componente "P" nos compostos do invento pode compreender uma sequência de D-aminoácidos correspondendo à sequência de L-aminoácidos de Αβι7_2ο; Αβι7_2ι, Αβι6-25 ou Αβχ_ 25, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero retro-inverso da sequência de L-aminoácidos de Αβΐ7_2ο, Αβι7-2ι, Αβΐ6-25 ou Αβι_25, ou uma sequência de D-aminoácidos que é uma versão mista ou substituída da sequência de L-aminoácidos de Αβΐ7-20, Αβί 7-21, Αβιε-25 ou Αβι_25. As estruturas de componentes "P" eficazes são geralmente hidrofóbicas e caracterizam-se pela presença de pelo menos duas estruturas de D-aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina. Como aqui é 32 ΕΡ1346041 usado, o termo "estrutura de D-aminoácido" (como seja uma "estrutura de D-leucina", uma "estrutura de D-fenilalanina" ou uma "estrutura de D-valina") destina-se a incluir o D-aminoácido, assim como análogos, derivados e moléculas que simulam o D-aminoácido, os quais mantém a capacidade do componente "P" para se ligar a uma proteína amiloidogénica. Por exemplo, o termo "estrutura de D-fenilalanina" destina-se a incluir D-fenilalanina assim como D-piridilalanina e D-homofenilalanina. O termo "estrutura de D-leucina" destina-se a incluir D-leucina, assim como substituição com D-valina ou outros aminoácidos, naturais ou não naturais, tendo uma cadeia lateral alifática, como seja D-norleucina. 0 termo "estrutura de D-valina" destina-se a incluir D-valina, assim como substituição com D-leucina ou outros aminoácidos, naturais ou não naturais, tendo uma cadeia lateral alifática.

Noutras formas de realização, a estrutura peptídica do componente "P" nos compostos do invento compreende pelo menos duas estruturas de D-aminoácido independentemente seleccionadas do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura D-valina, uma estrutura de D-alanina, uma estrutura de D-tirosina e uma estrutura de D-iodotirosina. Numa outra forma de realização, a estrutura peptídica do componente "P" nos compostos do invento é constituída por pelo menos três estruturas de D-aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma 33 ΕΡ1346041 estrutura de D-valina. Ainda numa outra forma de realização, a estrutura peptídica do componente "P" nos compostos do invento é constituída por pelo menos três estruturas de D-aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-valina, uma estrutura de D-alanina, uma estrutura de D-tirosina e uma estrutura de D-iodotirosina. Ainda numa outra forma de realização, a estrutura peptidica do componente "P" nos compostos do invento compreendem pelo menos quatro estruturas de D-aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina. Ainda, numa outra forma de realização, a estrutura peptídica do componente "P" nos compostos do invento é constituída por pelo menos quatro estruturas de D-aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina. Numa forma de realização preferida, a estrutura peptídica do componente "P" nos compostos do invento inclui um dipeptídeo de D-aminoácidos seleccionado do grupo consistindo em D-Phe-D-Phe, D-Phe-D-Tyr, D-Tyr-D-Phe, D-Phe-D-lodoTir e D-lodoTir-D-Phe.

Numa outra forma de realização, o componente "P" nos compostos do invento compreende uma fórmula (I):

34 ΕΡ1346041 em que Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são individualmente estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são, independentemente, seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina; y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de D- aminoácido e a é um inteiro entre 1 e 15; Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)b^ em que Xaa é qualquer estrutura de D- aminoácido e b é um inteiro entre 1 e 15; A, que pode ou não estar presente, é um grupo de modificação ligado directa ou indirectamente ao componente "P"; e n é um inteiro entre 1 e 15; em que Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Y, Z, A e n são seleccionados de forma a que o componente "P" se ligue a uma proteína amiloidogénica. Numa sub-forma de realização desta fórmula, um quinto resíduo de aminoácido, Xaas, é especificado para o extremo C de Xaa4 e Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro entre 1 e 14. Assim, o componente "P" nos compostos do invento pode compreender uma fórmula (II) :

em que b é um inteiro entre 1 e 14. 35 ΕΡ1346041

Numa forma de realização preferida, Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4 da fórmula (I) são seleccionados com base na sequência de Αβ17_20, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaa4 é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-valina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura e D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina.

Numa outra forma de realização preferida, Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaa5 da fórmula (II) são seleccionados com base na sequência de Αβ17_20, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaa4 é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-valina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura e D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa5 é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina.

Numa outra forma de realização preferida, Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4 da fórmula (I) são seleccionados com base no isómero retro-inverso de Αβι7_20, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaa4 é uma estrutura de D-alanina, uma estrutura de D-leucina ou 36 ΕΡ1346041 uma estrutura de D-fenilalanina, Xaa2 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-valina ou uma estrutura e D-leucina.

Numa outra forma de realização preferida, Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaa5 da fórmula (II) são seleccionados com base no isómero retroinverso de Αβι7_2ο, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaa4 é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-valina ou uma estrutura de D-leucina e Xaas é uma estrutura de D-leucina.

Numa outra forma de realização, o componente "P" nos compostos do invento pode compreender uma fórmula (III) : A- (Y) -Xaa4-Xaa2-Xaa3-Xaa4- (z) -B (m) em que Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são, independentemente, seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D- 37 ΕΡ1346041 fenilalanina e uma estrutura de D-valina; Y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura peptídica tendo a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de aminoácidos e a é um inteiro entre 1 e 15; Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura peptídica tendo a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de aminoácidos e b é um inteiro entre 1 e 15; e A, que pode ou não estar presente, é um grupo de modificação ligado directamente ou indirectamente ao extremo amina do componente "P"; e B, que pode ou não estar presente, é um grupo de modificação ligado directamente ou indirectamente ao extremo carboxilo do componente "P";

Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4, Y, Z, A e B sendo seleccionados de forma a que o composto se ligue a uma proteíma amiloidogénica. Numa sub-forma de realização da fórmula (III), um quinto resíduo de aminoácido, Xaa5, está especificamente no extremo C relativamente a Xaa4 e z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro entre 1 e 14. Assim, o componente "P" nos compostos do invento pode compreender uma fórmula (IV): A- ( Y) —Xââi-Xââ2—Xââ3—Xââ4—Xââ5— ( Z ) — B ( IV) em que b é um inteiro entre 1 e 14.

Numa forma de realização preferida, Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 da fórmula (III) são seleccionados com base na 38 ΕΡ1346041 sequência de Αβΐ7_2ο, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de forma de realização preferidas, Xaai é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-valina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura e D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina.

Numa outra realização preferida, Xaax, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaas da fórmula (IV) são seleccionados com base na sequência de Αβΐ7_2ο, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaai é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-valina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina, Xaa4 é uma estrutura de D-fenilalalina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa5 é uma estrutura de D-alanina ou uma estrutura de D-leucina.

Numa outra forma de realização preferida, Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 da fórmula (III) são seleccionados com base no isómero retroinverso de Αβι7-2ο, ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaai é uma estrutura de D-alanina, uma estrutura de D-leucina ou uma estrutura de D-fenilalanina, Xaa2 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina, Xaa3 é uma 39 ΕΡ1346041 estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-valina ou uma estrutura de D-leucina.

Numa outra forma de realização preferida, Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaa5 da fórmula (II) são seleccionados com base no isómero retroinverso de Αβι7_2ο^ ou suas substituições aceitáveis. Assim, em formas de realização preferidas, Xaa4 é uma estrutura de D-alanina, uma estrutura de D-leucina ou uma estrutura de D-fenilalanina, Xaa2 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina ou uma estrutura de D-iodotirosina e Xaa4 é uma estrutura de D-valina ou uma estrutura de D-leucina e Xaa5 é uma estrutura de D-leucina.

Em formas de realização preferidas, o componente "P" nos compostos do invento pode compreender uma estrutura peptidica seleccionada do grupo consistindo em D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Fenetilamida, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTir, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTir-D-Ala, 40 ΕΡ1346041 D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu e D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu.

Os componentes "P" preferidos podem compreender amidas de peptídeos de D-aminoácidos projectadas com base nos isómeros retro-inversos de Αβι7_2ο atrás descritos ou suas substituições.

As estruturas peptidicas de D-aminoácidos dos componentes "P" nos compostos do invento destinam-se ainda a incluir outras modificações peptidicas, incluindo análogos, derivados e moléculas simuladoras, que mantêm a capacidade do componente "P" para se ligar a uma proteína amiloidogénica. Por exemplo, uuma estrutura peptídica de D-aminoácidos de um componente "P" pode ainda ser modificado para aumentar a sua estabilidade, biodisponibilidade ou solubilidade. Os termos "análogo", "derivado" e "simulador" como aqui são usados destinam-se a incluir moléculas que simulam a estrutura química de uma estrutura D-peptídica e mantêm as propriedades funcionais da estrutura D-peptídica. Abordagens para a projecção de análogos peptídicos, derivados e simuladores são conhecidos. Por exemplo, ver Farmer, P.S. em Drug Design (E.j. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. Pp. 119-143; Bali J.B. e Alewood, P.F. (1990) J Mol. Recognítion 3:55; Morgan, B.A. 41 ΕΡ1346041 e Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; e Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sei. 10:270. Ver também Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Capítulo 17; Smith, A.B. 3rd, et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:1113-11123; Smith, aB. 3rd, et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9947-9962; e Hirschman, R., (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568.

Como aqui usado, um "derivado" de um composto x (e.g., um peptídeo ou aminoácido) refere-se a uma forma X em que um ou mais grupos de reacção no composto foram modificados com um grupo substituinte. Exemplos de derivados de peptídeos incluem peptídeos em que uma cadeia lateral de aminoácido, o esqueleto peptídico ou o extremo amina ou carboxilo foram modificados (e.g., compostos peptídicos com ligações amida metiladas). Como aqui é usado um "análogo" de um composto X refere-se a um composto que mantém as estruturas químicas de X necessárias à actividade funcional de X, ainda que também contenha determinadas estruturas químicas que diferem de X. Um exemplo de um análogo de um peptídeo é um peptídeo que inclui um ou mais aminoácidos não naturais. Como aqui é usado, um "simulador" de um composto X refere-se a um composto em que as estruturas químicas de X necessárias para a actividade funcional de X foram substituídas com outras estruturas químicas que simulam a conformação de X. Exemplos de simuladores peptídicos incluem compostos peptídicos em que 42 ΕΡ1346041 o esqueleto peptídico é substituído com uma ou mais moléculas de benzodiazepina (ver e.g., James, G.L. et al., (1993) Science 260:1937-1942).

Os análogos do componente "P" destinam-se a incluir compostos em que um ou mais D-aminoácidos da estrutura peptídica são substituídos com um aminoácido homólogo de forma a que sejam mantidas as propriedades do componente "P" original. De preferência, as substituições conservadas de aminoácidos são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos. Uma "substituição de aminoácidos conservada" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na área, incluindo cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (e.g. alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionnina, triptofano), cadeias laterais β-ramifiçadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Exemplos não limitantes de substituiões homólogas que podem ser feitas nas estruturas peptídicas do componente "P" incluem substituição de D-fenilalanina com D-tirosina, D-piridilalanina ou D-homofenilalanina, substituição de D-leucina com D-valina ou outro aminoácido, 43 ΕΡ1346041 natural ou não natural, tendo uma cadeia lateral alifática e/ou substituição de D-valina com D-leucina ou outro aminoácido natural ou não natural tendo uma cadeia lateral alifática. 0 termo simulador e, em particular, simulador peptidico, destina-se a incluir isósteros. O termo "isóstero" como é usado destina-se a incluir uma estrutura química que pode ser substituída por uma segunda estrutura química, porque a conformação espacial da primeira estrutura assume um local de ligação específico para a segunda estrutura. 0 termo especificamente inclui modificações do esqueleto peptidico (i.e., simuladores de ligações amida) bem conhecidas do familiarizados com a matéria. Tais modificações incluem modificações do azoto amida, o carbono a, carbonilamida, substituição completa da ligação amida, extensões, deleções ou ligações cruzadas de esqueletos. São conhecidas várias modificações do esqueleto peptidico, incluindo \|/[CH2S], ψ[0Η2Ν], \|/[CSNH2], ψ[ΝΗ00], ψ[C0CH2] e ψ[(E) ou (Z) CH=CH]. Na nomenclatura atrás descrita, ψ indica a ausência de uma ligação amida. A estrutura que substitui o grupo amida está especificada entre parêntesis.

Outras modificações possíveis incluem a substituição N-alquil (ou aril) (\|/[CONR]), ou esqueletos reticulados para construir lactamas e outras estruturas cíclicas. Outros derivados do componente "P" incluem derivados hidroximetilo C-terminais, derivados O- 44 ΕΡ1346041 modificados (e.g., éter hidroximetilbenzil C-terminal), derivados modificados no extremo N incluindo amidas substituídas tais como alquilamidas e hidrazidas e componentes "P" em que um resíduo de fenilalanina C-terminal é substituído com um análogo de fenilalanina (e.g., Val-Phe-fenilalamida como um análogo do tripeptídeo Val-Phe-Phe). O componente "P" pode também ser modificado com um grupo de modificação. 0 termo "grupo de modificação" destina-se a incluir estruturas que são directamente ligadas à estrutura peptídica do componente "P" (e.g., através de acoplagem covalente), assim como as indirec-tamente ligadas à estrutura peptídica (e.g., através de uma associação não covalente estável ou através de acoplagem covalente a resíduos de aminoácidos adicionais, ou simuladores, análogos ou seus derivados, que pode flanquear a estrutura peptídica). Por exemplo, o grupo de modificação pode ser acoplado ao extremo amina ou ao extremo carboxilo do componente "P". Como alternativa, o grupo de modificação pode ser acoplado a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de L- ou D-aminoácido do componente "P" (e.g., através do grupo amina epsilon de um ou mais resíduos lisilo, através do grupo carboxilo de um ou mais resíduos de ácido aspártico ou um ou mais resíduos de ácido glutâmico, através de um grupo hidroxilo de um ou mais resíduos tirosilo, um ou mais resíduos de serina ou um mais resíduos de treonina ou outro grupo reactivo adequado). Grupos de modificação covalentemente acoplados ao 45 ΕΡ1346041 componente "P" podem ser ligados por meios e métodos conhecidos na área da ligação de estruturas químicas, incluindo, por exemplo, amida, alquilamina, carbamato, ureia ou ligações éster.

Um componente "P" dos compostos do invento (assim como um componente "L" ou um componente "I" dos compostos do invento) podem ainda ser modificados para marcar o componente "P" (ou o componente "L" ou o componente "I") com uma substância detectável. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansilcloreto ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioactivo adequado incluem 14C, 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTc, 35S ou 3H. Numa forma de realização preferida, um componente "P" (ou um componente "L" ou um componente "I") é marcado radio-activamente com 14C através da incorporação de 14C no grupo de modificação ou numa ou mais estruturas de resíduo de aminoácido no componente "P" (ou o componente "L" ou "I"). Compostos marcados do invento podem ser usados para avaliar 46 ΕΡ1346041 as farmacocinéticas in vivo dos compostos do invento, assim como para detectar agregação de proteínas amilodoigénicas, por exemplo para fins de diagnóstico. A agregação de proteínas amiloidogénicas pode ser detectada numa amostra in vivo ou in vitro derivada de um indivíduo.

De preferência, para usar como agente de diagnóstico in vivo, um composto do invento é marcado (via componente "P" ou "L" ou "I") com tecnécio radioactivo, e.g., 99Tc, ou iodo. Os métodos para a marcação de compostos peptídicos com tecnécio são conhecidos (ver e.g., Patente U.S. Nos. 5443815, 5225180 e 5405597, todos por Dean et al.; Stepniak-Biniakiewicz, D. et al. (1992) J. Med. Chem. 35:274-279; Fritzberg, A.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85::4025-4029; Baidoo, K.E., et al. (1990) Câncer Res. Suppl. 50:799s-803s; e Regan, L. e Smith, C.K. (1995) Science 270:980-982). Pode ser escolhido um grupo de modificação que proporciona um local em que um grupo de quelatação para 99mTc pode ser introduzido, como seja o derivado Aic do ácido eólico, que tem um grupo amina livre. Numa outra forma de realização, o componente "P" (ou o componente "L" ou "T") pode ser marcado com iodo radioactivo. Por exemplo, um resíduo de fenilalanina dentro do componente "P" (como seja Fenig ou Fen2o dentro da sequência Αβ) pode ser substituído com iodotirosilo radioactivo. Qualquer um dos vários isótopos de iodo radioactivo pode ser incorporado para criar um agente de diagnóstico. De preferência, 123I (semi-vida =3,2 horas) é usado para cintigrafia do corpo completo, 124I (semi-vida = 47 ΕΡ1346041 4 dias) é usado para tomografia de emissão de positrões (PET), I (semi-vida = 60 dias) foi usado para estudos de renovação metabólica e 131I (semi-vida = 8 dias) é usado para contagem completa do corpo e estudos de imagiologia de baixa resolução retardada.

Numa forma de realização, o componente proteico "P" é preparado numa forma de "pró-droga", em que o próprio componente "P" não se liga a uma proteina amiloidogénica, mas antes pode ser transformado, quando do metabolismo in vivo, num peptideo capaz de se ligar a uma proteina amilodoigénica, como aqui definido. Na área é conhecida uma variedade de estratégias para a preparação de prodrogas peptidicas que limitam o metabolismo, de forma a optimizar a administração da forma activa da droga baseada em peptideo (ver e.g., Moss, J. (1995) em Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds), Capítulo 18. Outras estratégias foram especificamente delineadas para se conseguir atingir o SNC baseadas em "metabolismo sequencial" (ver e.g., Bodor, N., et al. (1992) Science 257:1698-1700; Prokai, L., et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:2643-2644; Bodor, N. e Prokai, L. (1995) em Peptide-Based Drug Design: Controllinhg Transport and Metabolism, Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds), Capítulo 14. Numa forma de realização de uma forma de pró-droga de um componente "P", o grupo de modificação compreende um éster alquilico para facilitar a permeabilidade da barreira hemato-cefálica. 48 ΕΡ1346041

Peptídeos capazes de se ligarem a uma proteína amiloidogénica (o componente "P" nos compostos do invento) podem ser preparados por técnicas convencionais conhecidas, como sejam as descritas em Bodansky, M. Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) e Grant, G.A. (ed.). Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Os sintetizadores de peptídeos automáticos podem ser comprados (e.g., Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Ainda, um ou mais grupos moduladores podem ser ligados ao componente "P" por métodos convencionais, por exemplo usando métodos para reacção através de um grupo amina (e.g., o grupo alfa-amina no extremo amina de um peptideo), um grupo carboxilo (e.g., no extremo carboxilo de um peptideo), um grupo hidroxilo (e.g., num resíduo tirosina, serina ou treonina) ou outro grupo reactivo adequado numa cadeia lateral de aminoácido (ver e.g., Greene, T.W. e Wuts, P.G.M. Protective Groups ín Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc. New York (1991) .

Ainda, os compostos do invento compreendendo um componente "P" podem ser gerados como proteínas de fusão usando técnicas convencionais de DNA recombinante, como descrito mais detalhadamente abaixo. III. Métodos para a preparação dos compostos do invento

Os compostos do invento podem ser preparados 49 ΕΡ1346041 através de qualquer um de métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou um seu fragmento, e.g., um fragmento compreendendo a região Fc, ("I") e o peptideo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica "P") podem ser preparados como descrito nas secções anteriores e ligados de forma reticulada através de um grupo de ligação. São conhecidos numerosos agentes químicos para a ligação reticulada (e.g., os comercializados pela Pierce, Rockford IL) . Pode ser escolhido um agente de ligação reticulada que permite níveis elevados de acoplagem da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ao peptideo de ligação a uma proteína amiloidogénica.

Como alternativa, os compostos do invento podem ser preparados como proteínas de fusão usando técnicas de DNA recombinante convencionais como descrito por exemplo em Sambrook, J., Frish, E.F., e Maniatis, T. Molecular Clonlng: A laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Resumidamente, pode ser gerada uma construção, num vector de expressão adequado, em que uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou um seu fragmento, e.g., um fragmento compreendendo a região Fc, ("I") é operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico codificadora de um peptideo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica ("P"). 0 termo "ligado operacionalmente" destina-se a 50 ΕΡ1346041 indicar que o polipeptídeo da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina codificada e o peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica são fundidos em grelha um ao outro. O polipeptídeo da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina pode ser fundido ao extremo N ou extremo C do peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica, desde que seja mantida a actividade do composto resultante. Por exemplo, os fragmentos de DNA codificadores das duas sequências polipeptídicas são ligados na mesma grelha de leitura de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, empregando na ligação extremos cerses ou coesivos, digestão com enzimas de restrição para proporcionar extremos adequados, preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação enzimática. A amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando sequências iniciadoras de ancoragem que dão origem a extremos salientes complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos, que podem, subsequentemente, ser novamente emparelhados e re-amplificados para gerar uma sequência de gene quimérica (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). O vector de expressão resultante pode ser introduzido numa célula hospedeira adequada para assim produzir a proteína de fusão. Os vectores de expressão recombinantes usados podem ser projectados para a expressão da proteína de fusão em células procarióticas ou eucarió- 51 ΕΡ1346041 ticas. Por exemplo, as proteínas de fusão referidas podem ser expressas em células bacterianas tais como E. coli, células de insecto (usando vectores de expressão de baculo-vírus) células de levedura ou células de mamífero. Células hospedeiras adequadas são discutidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como alternativa, o vector de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando as sequências reguladoras do promotor de T7 e polimerase de T7. O local preciso em que a fusão é feita não é crítico; locais particulares são bem conhecidos e podem ser seleccionados de forma a optimizar a actividade biológica e caracteristicas de ligação dos componentes "P" e "I" dos compostos do invento. Tipicamente, tais fusões retêm pelo menos um domínio CHl, CH2, CH3 e/ou domínio de charneira funcionalmente activo da região constante da cadeia pesada de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão mantêm um domínio CH2 funcionalmente activo da região constante da cadeia pesada de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões podem ser feitas com o extremo C do domínio CH3 da região constante da cadeia pesada ou imediatamente N-terminal relativamente ao domínio CHI da região constante da cadeia pesada. De preferência, P é fundido, facultativamente via L, ao extremo N de I.

De preferência, I inclui os domínios CH2 e CH3 e 52 ΕΡ1346041 o domínio de charneira ou uma porção dos mesmos. Numa forma de realização particularmente preferida, I inclui os domínios CH2 e CH3 e o domínio de charneira ou uma porção dos mesmos, mas não inclui o domínio CHl. Nesta forma de realização, P é fundido directamente ou via um agente de ligação ao extremo N de I. A expressão das proteínas de fusão do invento pode ser conseguida usando uma variedade de construções As construções contendo uma sequência líder, com ou sem um propeptídeo, expressam e secretam as proteínas de fusão directamente para o sobrenadante. Ainda, as proteínas de fusão do invento podem ser fundidas com um domínio extracelular de uma proteína de membrana, como seja o domínio extracelular do receptor FGF, o receptor TNF ou gpl20, por exemplo, com um local de clivagem por protease entre as duas fusões. Numa forma de realização preferida, o local de clivagem por proteases é um local de uma enterocinase. Nesta forma de realização, a grande proteína de fusão incluindo o domínio extracelular é expressa e secretada para o sobrenadante e a proteína de fusão pretendida do invento pode ser separada do domínio extracelular por clivagem específica com enterocinase.

Nalgumas formas de realização, os compostos do invento são montados como monómeros, hetero- ou homo-dímeros ou como multímeros. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma em que IgG, IgD e IgE existem. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas 53 ΕΡ1346041 imunoglobulinas de peso molecular mais elevado; IgM de um modo geral existe como um pentâmero de uma unidade básica de quatro cadeias mantidas juntas por ligações dissul-fureto. A globulina IgA e ocasionalmente a globulina igG, podem também existir numa forma multimérica no soro. No caso de multímeros, cada uma das quatro cadeias pode ser igual ou diferente.

De preferência, os compostos do invento são preparados como dimeros com duas unidades monoméricas ligadas via ligações dissulfureto entre as duas regiões constantes da cadeia pesada ou seus fragmentos, e.g., fragmentos compreendendo a região Fc. Os compostos do invento podem ser preparados como homodimeros ou como heterodimeros dos compostos que possuem diferentes componentes "P". IV. Composições farmacêuticas

Um outro aspecto do invento está relacionado com composições farmacêuticas dos compostos do invento. Numa forma de realização, a composição inclui um composto do invento numa quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz suficiente para se ligar a uma proteína amiloidogénica e dirigi-la para uma célula da microglia e um veículo farmaceuticmanete aceitável. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e períodos de tempo necessários, para se conseguir o resultado terapêutico preten- 54 ΕΡ1346041 dido, como seja a redução da deposição de proteína amiloi-dogénica e/ou redução ou reversão da neurotoxicidade relacionada com a proteína amiloidogénica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento pode variar de acordo com factores tais como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do composto para induzir uma resposta pretendida no indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta trerapêutica óptima. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou lesivos do composto são ultrapassados pelos seus benefícios terapêuticos. A neurotoxicidade potencial dos compostos do invento pode ser testada usando os ensaios aqui descritos e pode ser seleccionado um composto terapeuticamente eficaz que não apresente neurotoxicidade significativa. Numa forma de realização preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento é suficiente para alterar e, de preferência inibir, a agregação de um excesso molar de proteínas amiloidogénicas. Um "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para se conseguir o resultado profilático pretendido, como seja prevenção ou inibição da velocidade de deposição de proteína amilodoigénica e/ou neurotoxicidade associada a proteína amiloidogénica num indivíduo com predisposição para a deposição de proteína amiloidogénica. Uma quantidade profilacticamente eficaz pode ser determinada como descrito atrás para a quantidade terapeuticamente eficaz. Tipicamente, uma vez que uma dose 55 ΕΡ1346041 profilática é usada em indivíduos antes ou no inicio da fase de doença, a quantidade profilacticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Um factor que pode ser considerado quando da determinação de uma quantidade terapeuticamente ou profi-lacticamente eficaz de um composto do invento é a concentração de uma proteina amiloidogénica, e.g., β-ΑΡ natural, numa amostra biológica obtida de um individuo, como seja fluido cerebrospinal (FCS) do individuo. A concentração natural de β-ΑΡ no FCS foi estimada em 3 nM (Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8368-8372). Uma gama não limitante para uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um composto do invento é 0,01 nM-10 μΜ.

Deve-se salientar que os valores de dosagem podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda entendido que para qualquer individuo particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração dos compostos e que as gamas de dosagem aqui descritas são apenas exemplos e não se destinam a limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada. A quantidade de composto na composição pode variar de acordo com factores tais como o estado de doença, 56 ΕΡ1346041 idade, sexo e peso do indivíduo, cada um deles pode afectar a quantidade de proteína amiloidogénica numa indivíduo. 0 regime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar a resposta terpêutica óptima. Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, dividido em várias doses pode ser administrado ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui é usado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas a dosagens unitárias para mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada do composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação das formas de dosagem unitárias do invento são ditadas e directamente dependentes (a) das características únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido e (b) das limitações inerentes na área da formulação de tal composto activo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Como aqui é usado "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um de uma variedade de solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacte-rianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardação da absorção e similares que são fisiologicamente compatí- 57 ΕΡ1346041 veis. Numa forma de realização, o veículo é adequado para administração parentérica ou para administração via inalação. De preferência, o veículo é adequado para administração no sistema nervoso central (e.g., intraspinalmente ou intracerebralmente). Como alternativa, o veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intraperi-toneal ou intramuscular. Numa outra forma de realização, o veículo é adequado para administração oral. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecido. Exceptuando se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto activo, é considerada a sua utilização nas composições farmacêuticas do invento. Outros compostos activos podem ser igualmente incorporados nas composições.

As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis nas condições de produção e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a concentrações elevadas de fármaco. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e similares) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento como seja lecitina, através da manutenção do 58 ΕΡ1346041 tamanho necessário das partículas no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplos açúcares, poliálcoois tais como manitol,, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida através da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monostearato e gelatina. Ainda, os compostos do invento podem ser administrados numa formulação de libertação controlada, por exemplo numa composição que inclui um polímero de libertação lenta. As formulações de libertação controlada estão descritas na Patente U.S. N° 5 968 895, aqui incluída na sua totalidade por referência. Os compostos activos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a libertação rápida, como seja uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de libertação microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como sejam acetato de etilenovinilo, poli-anidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, ácido polilácti-co e copolímeros polilácticos e poliglicólicos (PLG). Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são, de um modo geral, conhecidos dos familiarizados com a matéria. conforme

Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto activo na quantidade necessária num solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes atrás enumerados, 59 ΕΡ1346041 necessário, seguido de esterilização por filtração. De um modo geral, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto activo num veiculo estéril que contem um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados atrás. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e liofilização que dá um pó do ingrediente activo, mais qualquer outro ingrediente desejável, a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

Um composto do invento pode ser formulado com um ou mais compostos adicionais que aumentam a solubilidade do composto. Compostos preferidos que podem ser adicionados às formulações para aumentar a solubilidade dos compostos do invento são derivados de ciclodextrina, de preferência hidroxipropil-y-cclodextrina. Os veículos de administração de fármacos contendo um derivado de ciclodextrina para introdução de peptídeos no sistema nervoso central estão descritos em Bodor, N., et al. (1992) Science 257:1698-1700. Para os compostos aqui descritos, a inclusão na formulação de hidroxipropil-y-ciclodextrina numa concentração de 50-200 mM pode aumentar a solubilidade aquosa dos compostos. Ainda, para aumentar a solubilidade, a inclusão de um derivado de ciclodextrina na formulação pode ter outros efeitos benéficos, uma vez que a própria β-ciclodextrina foi descrita como interagindo com uma proteína amiloidogénica, e.g., o peptídeo Αβ, e inibem a formação de fibrilhas ín vitro (Camilleri, P. et al. (1994) 60 ΕΡ1346041 FEBS Letters 341:256-258. Assim, a utilização de um composto do invento em combinação com um derivado ciclodextrina pode resultar numa maior inibição da agregação de Αβ do que a utilização do composto sozinho. Modificações químicas de ciclodextrinas são conhecidas (Hanessian, S., et al., (1995) J. Org. Chem. 60:4786-4797).

Uma outra formulação preferida para os compostos do invento que ajuda a aumentar a introdução no cérebro compreende o detergente Tween-80, polietilenoglicol (PEG) e etanol numa solução de soro fisiológico. Um exemplo não limitante de tal formulação preferida é 0,16% Tween-80, 1,3% PEG-3000 e 2% etanol em soro fisiológico.

Numa outra forma de realização, uma composição farmacêutica compreendendo um composto do invento é formulada de forma a que o composto seja transportado através da barreira hematocefálica (BBB). Várias estratégias conhecidas para aumentar o transporte através da BBB podem ser adaptadas aos compostos do invento para assim aumentar o transporte dos compostos através da BBB (para revisões de tais estratégias, ver e.g., Pardridge, W.M. (1994) Trends in Biotechnol. 12:239-245; Van Bree, J.B. et al. (1993) Pharm. World Sei. 15:2-9; e Pardrige, W.M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71:3-10). Numa abordagem, o composto é quimicamente modificado para formar uma profármaco com um melhor transporte transmembranar. Modificações quimicas adequadas incluem ligação covalente de um ácido gordo ao composto através de uma ligação amida ou éster (ver e.g., 61 ΕΡ1346041

Patente U.S. 4 933 324 e Publicação PCT WO 89/07938, ambas de Shashoua; Patente U.S. 5 284 876 de Hesse et al.; Toth, I. et al. (1994) J. Drug Target. 2:217-239; e Shashoua, V.E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27:659-664) e adição de glicanos ao composto (ver e.g., Patente U.S. 5 260 308 por Poduslo et al.). Igualmente, podem ser usados derivados do ácido N-acilamino num composto para formar um profármaco "lipídico" (ver e.g., 5 112 863 de Hashimoto et al.).

Numa outra abordagem para aumentar o transporte através da BBB, um composto é conjugado com um segundo petídeo ou proteína, formando assim uma proteína quimérica, em que o segundo peptídeo ou proteína sofre transcitose mediada por absorção ou mediada por receptor através da BBB. Assim, através da acoplagem do composto a este segundo peptídeo ou proteína, a proteína quimérica é transportada através da BBB. O segundo peptídeo ou proteína pode ser um ligando para um ligando do receptor das células endoteliais capilares cerebrais. Por exemplo, um ligando preferido é um anticorpo monoclonal que especificamente se liga ao receptor da transferrina nas células endoteliais capilares cerebrais (ver, e.g., Patentes U.S. 5 182 107 e 5 154 924 e Publicações PCT WO 93/10819 e WO 95/02421, todos de Friden et al.). Outros peptídeos ou proteínas adequados que podem mediar o transporte através da BBB incluem histonas (ver e.g., Patente U.S. 4 902 505 de Pardridge e Schimmel) e ligandos tais como biotina, folato, niacina, ácido pantoténico, riboflavina, tiamina, piridoxal e ácido ascórbico (ver e.g., Patentes U.S. 5 416 016 e 5 108 921, 62 ΕΡ1346041 ambas de Heinstein) . Ainda, o transportador de glucose GLUT-1 foi descrito como transportando glicopeptídeos (análogos L-serinil-p-D-glucósido de [Met5]encefalina) através da BBB (Polt, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7114-1778). Assim, um composto do invento pode ser acoplado a tal glicopeptideo para direccionar o composto para o transportador de glucose GLUT-1. Proteínas quiméricas podem ser formadas por métodos de DNA recombinante (e.g., através da formação de um gene quimérico codificador de uma proteína de fusão) ou por ligação reticulada química do composto ao segundo peptídeo ou proteína para formar uma proteína quimérica, como descrito atrás.

Ainda numa outra abordagem para aumentar o transporte através da BBB, o composto do invento é encapsulado num vector veículo que medeia o transporte através da BBB. Por exemplo, o composto pode ser encapsulado num lipossoma, como seja um lipossoma unilamelar carregado positivamente (ver e.g., Publicações PCT WO 88/07851 e WO 88/07852, ambas de Faden) ou em microsferas poliméricas (ver e.g., Patente U.S. 5 413 797 de Khan et al.r Patente U.S. 5 271 961 de Mathiowitz et al., e 5 019 400 de Gombotz et al.). Ainda, o veículo pode ser modificado para ser dirigido para o transporte através da BBB. Por exemplo, o veículo (e.g. lipossoma) pode ser modificado covalentemente com uma molécula que é activamente transportada através da BBB ou com um ligando para os receptores das células do endotélio cerebral, tais 63 ΕΡ1346041 como anticorpos monoclonais que especificamente se ligam a receptores de transferrina (ver e.g.r Publicações PCT WO 91/04014 de Collins et al. e WO 94/02178 de Greig et al.).

Ainda numa outra abordagem para aumentar o transporte do composto através da BBB, o composto pode ser formulado com um outro agente que funciona para permeabilizar a bbb. Exemplos de tais "permeabilizadores" da BBB incluem bradiquinina e agonistas de bradiquinina (ver e.g., Patente U.S. 5 112 596 de Malfroy-Camine) e compostos peptidicos descritos na Patente U.S. 5 268 164 de Kozarich et al.

Os ensaios que medem a estabilidade in vitro dos compostos no fluido cerebrospinal (CSF) e 0 grau de internalização pelo cérebro dos compostos em modelos animais podem ser usados como indicadores da eficácia in vivo dos compostos. Ensaios adequados para a medição da estabilidade em CSF e internalização pelo cérebro são aqui descritos.

Um composto do invento pode ser formulado numa composição farmacêutica em que o composto do invento é o único composto activo ou, alternativamente, a composição farmacêutica pode conter compostos activos adicionais. Por exemplo, dois ou mais compostos podem ser usados em combinação. Ainda, um composto do invento pode ser combinado com um ou mais agentes que tenham propriedades anit-amiloidogénicas. Por exemplo, um composto do invento 64 ΕΡ1346041 pode ser combinado com o inibidor da colinesterase tacrina (COGNEX®, Parke-Davies) ou com Aricept™, inibidores de secretases ou outros agentes que se sabe tratarem uma condição neurológica.

Numa outra forma de realização, uma composição farmacêutica do invento é proporcionada como uma formulação embalada. A formulação embalada pode incluir uma composição farmacêutica do invento num recipiente e instruções impressas para administração da composição para o tratamento de um indivíduo tendo uma alteração amiloidogénica, e.g., doença de Alzheimer. V. Método de utilização dos compostos do invento

Um outro aspecto do invento está relacionado com um método para o tratamento de um indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica, através da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento, tratando assim o indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica.

Uma "alteração amiloidogénica" inclui qualquer doença, alteração ou condição causada ou caracterizada por depósitos de proteínas amiloidogénicas. Exemplos não limitantes de proteínas ou peptídeos amiloidogénicos e alterações que lhes estão associadas, incluem:

Transtirretina (TTR)

Amilóides contendo 65 ΕΡ1346041 transtirretina ocorrem em polineuropatia amilóide familiar (tipos Português, Japonês e Sueco), cardiomiopatia amilóide familiar (tipo Dinamarquês), amiloidose cardíaca isolada e amiloidose sistémica senil. Demonstrou-se que fragmentos peptídicos de transtirretina formam fibrilhas amilóides in vitro. Por exemplo, TTR 10-20 e TTR 105-115 formam fibrilhas do tipo amilóide em 20-30% de acetonitrilo/água à temperatura ambiente (Jarvis, J.A., et ai (1994) Int. J. Pept. Protein Res. 4_4:388-398) . Ainda, a cardiomiopatia familiar (tipo Dinamarquês) está associada a mutação de Leu na posição 111 para Met e um análogo de TTR 105-115 em que Leu selvagem na posição 111 foi substituído com Met (TTR 105-115Metlll) também forma fibrilhas tipo amilóide (ver e.g., Hermansen, L.F. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 227:772; Jarvis et al. supra). Fragmentos peptídicos de TTR que formam fibrilhas amilóides In vitro estão também descritos em Jarvis, J.A., et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 192:991-998 e Gustavsson, A., et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175:1159-1164. Um fragmento peptídico de transtirretina selvagem ou mutada que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de polineuropatia amilóide (tipos Português, Japonês e Sueco), cardiomiopatia amilóide familiar (tipo Dinamarquês), amiloidose cardíaca isolada e amiloidose sistémica senil.

Proteína de priões (PrP) - Amilóides numa série de encefalopatias espongiformes, incluindo a coceira dos 66 ΕΡ1346041 carneiros, encefalopatia espongiforme bovina nas vacas e doença de Creutzfeldt-Jakob (CJ) e sindrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) em humanos, possuem PrP. Proteólise limitada de PrPSc (a proteína dos priões associada à coceira dos carneiros, "scrapie") conduz a um fragmento de 27-30 KDa (PrP27-30) gue polimeriza em amilóides em forma de bastonete (ver e.g., Pan, K.M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10962-10966; Gasset, M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1- 5). Demonstrou-se que fragmentos peptídicos de PrP de humanos e outros mamíferos formam fibrilhas amilóides in vítro. Por exemplo, polipeptídeos correspondendo a sequências codificadas por alelos normais e mutantes do gene PRNP (codificador do precursor da proteína dos priões envolvidas em CJ), nas regiões do codão 178 e do codão 220, espontaneamente formam fibrilhas amilóides in vítro (ver e.g., Goldfarb, L.G., et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 9_0: 4451-4454) . Um peptídeo incluindo resíduos 106-126 de PrP humana foi descrito como formando fibrilhas rectilíneas semelhantes às extraídas dos cérebros de GSS, enquanto que um peptídeo incluindo os resíduos 127-147 de PrP humana foi descrito como formando fibrilhas torcidas que se assemelham a fibrilhas associadas à coceira dos carneiros (Tagliavini, F. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9JD: 9678-9682). Peptídeos PrP de hamster sírio, englobando os resíduos 109-122, 113-127, 113-120, 178-191 ou 202-218 foram descritos como formando fibrilhas amilóides, com o peptídeo mais amiloidogénico sendo Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala (SEQ ID NO:4), que corresponde 67 ΕΡ1346041 aos resíduos 113-120 de PrP de hamster síro que também é conservado em PrP de outras espécies (Gasset, M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_9:10940-10944) . Um fragmento peptídico de PrP que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de coceira dos carneiros, encefalopatia espongiforme bovina, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJ) e síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS).

Polipeptídeo amilóide dos ilhéus (IAPP, também conhecido como amilina) - Amilóides contendo IAPP ocorrem em diabetes do adulto e insulinoma. IAPP é um polipeptídeo de 37 aminoácidos formado a partir de uma proteína percursora de 89 aminoácidos (ver e.g., Betsholtz, C., et al. (1989) Exp. Cell. Res. 183:484-493; Westermark, P., et al. (1987) Proc, . Natl. Acad. Sei. USA 84:3881-3885). Um peptídeo correspondendo a IAPP resíduos 20-29 foi descrito como formando fibrilhas tipo amilóide in vitro, com resíduos 25-29, tendo a sequência Ala-Ile-Leu-Ser-Ser (SEQ ID NO:5), sendo fortemente amiloidogénica (Westrmark, P. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5036-5040; Glenner, G.G., et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:608-614) . Um fragmento peptídico de IAPP que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na deleção ou tratamento de diabetes ou insulinoma no adulto. 68 ΕΡ1346041

Factor Natriurético Auricular (ANF) - Amilóides contendo ANF estão associados a amilóide auricular isolada (ver e.g., Johansson, B., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:1087-1092) . ANF corresponde aos resíduos de aminoácidos 99-126 (proANF99-126) da pro-hormona ANF (proANPl-126) (Pucci, A. et al. (1991) J. Pathol. 165: 235-241). ANF, ou um seu fragmento, que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amilóide auricular isolada.

Cadeia leve capa ou lambda - Amilóides contendo cadeias leves capa ou lambda estão associados a amiloidose idiopática (primária), mieloma ou amiloidose associada a macroglobulinemia e amiloidose nodular cutânea localizada primária associada a síndrome de Sjogren. A estrutura das cadeias leve capa e lambda amiloidogénica, incluindo análise da sequência de aminoácidos, foi caracterizada (ver e.g., Buxbaum, J.N., et al. (1990) Ann. Intern. Med. 112:455-464; Schormann, N., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:9490-9494; Hurle, M.R., et ai. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA ÇÇL:5446-5450; Liepnieks, J.J., et al. (1990) Mol. Immunol. 27_:481-485; Gertz, M.A, et ai. (1985) Scnd. J. immunol. 22:245-250; Inazumi, T. et al. (1994) Dermatology 189:125-128). Cadeias leves capa ou lambda, ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides, pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratameto de amiloidose idiopática (primária), mieloma ou amiloidose associada a 69 ΕΡ1346041 macroglobulinemia ou amiloidose nodular cutânea localizada primária associada ao sindrome de Sjogren.

Amilóide A - Amiloidose contendo a proteína amilóide A (proteína AA), derivada de amilóide A sérica, estão associados a amiloidose reactiva (secundária) (ver e.g., Lipnieks, J.J., et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1270:81-86), Febre Mediterrânica familiar e nefropatia amilóide familiar com urticária e surdez (sindrome de Muckle-Wells) (ver e.g., Linke, R.P., et al. (1983) Lab. invest. _48:698-704) . Amilóide A sérica humana recombinante forma fibrilhas do tipo amilóide in vitro (Yamada, T., et al. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1226:323-329) e estudos de dicroismo circular revelaram uma estrutura predominantemente em folha β/volta (McCubbin, W.D., et al. (1988) Biochem. J. 256:775-783). Amilóide A sérica, proteína amilóide A ou um seu fragmento que forma fibrilhas amilóides podem ser usados como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose reactiva (secundária), Febre Mediterrânica familiar e nefropatia amilóide familiar com urticária e surdez (sindrome de Muckle-Wells).

Cistatina C - Amilóides contendo uma variante de cistatina C estão associadas a hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo Islandês. A doença está associada a uma mutação de leucina para glicina na posição 68 e cistatina C contendo esta mutação forma agregados in vitro (Abrahamson, M. e Grubb, A. (1994) Proc. Natl. Acad. 70 ΕΡ1346041

Sei. USA _91:1416-1420) . Cistatina C ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Islandês. P2-microglobulina - Amilóides contendo β2 microglobulina (β2Μ) são uma das principais complicações da hemodiálise a longo prazo (ver e.g., Stein, G. et al. (1994) Nephrol. Dial. Transplant. 9:48-50; Floege, J., et al. (1992) Kidney Int. Suppl. 38:S78-S85; Maury, C.P. (1990) Rheumatol. Int. 10:1-8). Tem sido demonstrado que a proteína β2Μ forma fibrilhas amilóides in vitro (Connors, L.H., et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 131:1063-1068; Ono, K., et al. (1994) Nephron 66:404-407). β2Μ, ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides, pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose associada a hemodiálise a longo prazo.

Apolipoproteína A-I (ApoA-I) - Amilóides contendo formas variantes de ApoA-I foram encontradas em amiloidose sistémica hereditária não neuropática (polineuropatia III amilóide familiar). Por exemplo, fragmentos N-terminais (resíduos 1-86, 1-92 e 1-93) de uma variante ApoA-I tendo uma mutação Trp para Arg na posição 50 foram detectados em amilóides (Booth, D.R. (1995) QJM 8^:695-702). Numa outra família, foi encontrada uma mutação de leucina para arginina na posição 60 (Soutar, A.K., et al. (1992) Proc. 71 ΕΡ1346041

Natl. Acad. Sei. USA 8_9: 7389-7393) . ApoA-I ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides pode ser usada como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose sistémica hereditária não neuropática.

Gelsolina - Amilóides contendo variantes de gelsolina estão associados a amiloidose familiar do tipo Finlandês. Peptideos sintéticos de gelsolina que possuem homologia de sequências com gelsolinas selvagens ou mutantes e que formam fibrilhas amilóides in vitro estão descritos em Maury, C.P. et al. (1994) Lab. Invest. 70:558-564. Um segmento de nove resíduos à volta do residuo 187 (que está mutado na amiloidose de gelsolina familiar) foi definido como uma região amiloidogénica (Maury, et al., supra; ver também Maury, CC.P., et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:227-231; Maury, C.P. (1991) J. Clin. Invest. 8_7:1195-1199) . Gelsolina ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose familiar do tipo Finlandês.

Procalcitonina ou calcitonina - Amilóides contendo procalcitonina, calcitonina ou imuno-reactividade tipo calcitonina foram detectados em fibrilhas amilóides associadas a carcinoma medular da tiróide (ver e.g., Butler, M. e Khan, S. (1986) Arch . Pathol. Lab. Med. 110:647-649; Sletten, K. , et al. (1976) J. Exp. Med. 72 ΕΡ1346041 143:993-998). Tem sido demonstrado que a calcitonina forma uma estrutura fibrilhar não ramificada in vitro (Kedar, I., et al. (1976) Isr. J. Med. Sei. 12:1137-1140). Procalcitonina, calcitonina ou um seu fragmento que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose associada a carcinoma medular da tiróide.

Fibrinoqénio - Amilóides contendo uma forma variante da cadeia alfa do fibrinogénio foi encontrada em amiloidose renal hereditária. Uma mutação de arginina para leucina na posição 554 foi descrita em proteína de fibrilhas amilóides isolada a partir de rim post-mortem de um indivíduo afectado (Benson, M.D., et al. (1993) Nature Genetlcs 3:252-255) . A cadeia alfa do fibrinogénio ou um seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose renal hereditária associada a fibrinogénio.

Lisozima - Amilóides contendo uma forma variante de lisozima foram encontrados em amiloidose sistémica hereditária. Numa família a doença foi associada a uma mutação de treonina para isoleucina na posição 56, enquanto que numa outra família a doença foi associada com uma mutação de histidina para ácido aspártico na posição 67 (Pepys, M.B., et al. (1993) Nature 362:553-557). Lisozima ou seu fragmento peptídico que forma fibrilhas amilóides 73 ΕΡ1346041 pode ser usado como aqui descrito para criar um composto que pode ser usado na detecção ou tratamento de amiloidose sistémica hereditária associada a lisozima.

Os métodos do invento podem ser igualmente usados profilacticamente ou terapeuticamente para tratar outras ocorrências clinicas da deposição de proteína amiloido-génica, como seja indivíduos com síndrome de Down e doentes com hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo Holandês (HCHWA-D). Ainda, a acumulação anormal de proteínas amiloidogénicas, e.g., proteína precursora de β-amilóide, em fibras musculares tem sido implicada na patologia de miositite de corpos de inclusão esporádica (IBM) (Askana, V. Et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:1314-1319; Askanas, V. Et al. (1995) Current Opinion in Rheumatology 7:486-496). Assim, os compostos do invento podem ser usados profilacticamente ou terapeuticamente no tratamento de alterações em que proteínas amiloidogénicas são anormalmente depositadas em localizações não neurológicas, tais como tratamento de IBM através da introdução dos compostos nas fibras musculares.

Os compostos do invento podem ser administrados a um indivíduo através de qualquer via adequada, eficaz para inibição da agregação de proteína amiloidogénica no indivíduo, se bem que numa forma de realização particular preferida, o composto seja administrado parenteralmente, mais de preferência ao sistema nervoso central do indivíduo. Vias possíveis de administração ao SNC incluem 74 ΕΡ1346041 administração intraspinal e administração intracerebral (e.g., administração intracerebrovascular). Como alternativa, o composto pode ser administrado, por exemplo, oralmente, intraperitonealmente, intravenosamente ou intramuscularmente. Para vias de administração diferentes do SNC, o composto pode ser administrado numa formulação que permita transporte através da BBB. Determinados compostos podem ser transportados através da BBB sem qualquer outra modificação adicional, enquanto que outros podem necessitar de modificação como atrás descrito na subsecção IV.

Modos e dispositivos adequados para a introdução de compostos do invento no SNC de um indivíduo são conhecidos na área, incluindo reservatórios cerebrovas-culares (e.g., reservatórios Ommaya ou Rikker; ver e.g., Raney, J.P. et al. (1988) J. Neurose. Nurs. 20:23-29; Sundaresan, N. et al. (1989) Oncology 3:15-22), catéteres para introdução intratecal (e.g., Port-a-Cath, catéteres Y e similares; ver e.g., Plummer, J.L. (1991) Pain 44:215-220; Yaksh, T.L. et al. (1986) Pharmacol. Biochem. Behav. 25:483-485), reservatórios intratecais injectáveis (e.g., Spinalgesic; ver e.g., Brazenor, G.A. (1987) Neurosurgery 21:484-491), sistemas de bombas de infusão implantáveis (e.g., Infusaid; ver e.g., Zierski, J. et al. (1988) Acta Neurochem. Suppl. 43:94-99; Kanoff, R.B. (1994) J. Am. Osteopath. Assoe. 94:487-493) e bombas osmóticas (vendidas por Alza Corporationa). Um modo particularmente preferido de administração é via uma bomba de infusão programável externamente e implantável. Sistemas de bomba de infusão 75 ΕΡ1346041 adequados e sistemas de reservatórios estão também descritos em Patente U.S. N° 5 368 562 de Blomquist e Patente U.S. N° 4 731 058 de Doan, desenvolvidos pela Pharmacia Deltec Inc.

Os métodos do invento ainda incluem administração a umindividuo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento em combinação com um outro composto farmaceuticamente activo conhecido por inibir a deposição de proteína amiloidogénica, e.q., um derivado de ciclodextrina, ou em combinação com um agente que funciona como um agente para permeabilizar a barreira hematocefálica (BBB). Exemplos de tais "permeabilizadores" BBB incluem bradiquinina e agonistas de bradiquinina (ver e.q., Patente U.S. 5 112 596 de Malfroy-Camine) e compostos peptidicos descritos em Patente U.S. 5 268 164 de Kozarich et al. Outros compostos farmaceuticamente activos que possam ser usados nos métodos do invento podem ser encontrados em Harrison's Principies of Internai Medicine, 13a Edição, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; e o Physicians Desk Reference 50a Edição 1997, Oradell New Jersey, Medicai Economics Co., cujo conteúdo está expressamente incluído como referência. Os compostos do invento e o composto adicional farmaceuticamente activo podem ser administrados ao indivíduo na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas diferentes (em simultâneo ou desfasadamente).

Ainda numa outra forma de realização, o presente 76 ΕΡ1346041 invento proporciona métdos para o tratamento de um indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica através da administração ao indivíduo de um vector de expressão recombinante codificador de um composto do invento, de forma que o composto seja sintetizado no indivíduo, tratando assim o indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica.

As construções codificadoras dos compostos do invento podem ser inseridas nos vectors adequados para usar como vectores de terapia genética. Os vectores de terapia genética podem ser administrados ao indivíduo, por exemplo, por injecção intravenosa, administração local (ver Patente U.S. 5 329 470) ou por injecção estereotáctica (ver e.g., Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3054-3057). Uma preparação farmacêutica do vector de terapia genética pode também ser administrado a um indivíduo. A preparação farmacêutica do vector de terapia genética pode incluir o vector de terapia genética num diluente aceitável ou pode compreender uma matriz de libertação lenta em que o veículo de administração do gene está embebido. Como alternativa, sempre que o vector completo de introdução do gene possa ser produzido intacto a partir de células recombinantes, e.g., vectores retrovirais, uma preparação farmacêutica incluindo uma ou mais células que produzam o sistema de introdução do gene podem ser administradas ao indivíduo.

Numa outra forma de realização, um composto do invento pode ser usado in vivo para detectar e, caso se 77 ΕΡ1346041

pretenda, quantificar a deposição de proteína amiloi-dogénica num indivíduo para, por exemplo, ajudar no diagnóstico de uma alteração amiloidogénica no indivíduo. Para ajudar à detecção, o composto pode ser modificado com uma substância detectável, de preferência 99mTc ou iodo radioactivo (descrito atrás), que pode ser detectada in vivo num indivíduo. O composto marcado é administrado ao indivíduo e, após tempo suficiente para permitir acumulação do composto em locais de deposição amilóide, o composto marcado é detectado por técnicas de imagiologia convencionais. 0 sinal radioactivo gerado pelo composto marcado pode ser directamente detectado (e.g., contagem do corpo total) ou, alternativamente, o sinal radioactivo pode ser convertido numa imagem ou numa autorradiografia ou num écran de computador para permitir visualizar os depósitos amilóides no indivíduo. Métodos para visualização de amiloidose usando proteínas marcadas radioactivamente são conhecidos na área. Por exemplo, o componente P amilóide sérico (SAP), marcado radioactivamente com 123I ou 99mTc, tem sido usado para visualizar amiloidose sistémica (ver e.g., Hawkins, P.N. e Pepys, M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22_: 595-599) . Dos vários isotipos de iodo radioactivo, de preferência é usado 123I (semi-vida = 13,2 horas) para cintigrafia do corpo completo, 124I (semi-vida = 4 dias) é usado para tomografia de emissão de positrões (PET), 125I (semi-vida = 60 dias) foi usado para estudos de conversão metabólica e 131i (semi-vida = 8 dias) é usado para contagem do corpo total e estudos de imagiologia de baixa resolução retardada. De forma análoga aos estudos que usam SAP 78 ΕΡ1346041 marcado radioactivamente, um composto marcado do invento pode ser introduzido num indivíduo através de uma via adequada (e.g., intravenosa, intraspinal, intracerebral) num único bolus, por exemplo contendo 100 pg de composto marcado contendo aproximadamente 180 MBq de radioactividade. VI. Agentes terapêuticos compreendendo a fórmula I-L-P'

Numa outra forma de realização, o presente invento proporciona um método de preparação de um agente terapêutico compreendendo a fórmula I-L-P', em que I é uma imunoglobulina, e.g., igG, igA, igM, igD ou igE, região constante da cadeia pesada ou seu fragmento; L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P' é um peptídeo capaz de se ligar a uma proteína alvo. O método compreende (1) rastreio de uma biblioteca de peptídeos para identificar um ou mais peptídeos que se ligam à proteína alvo; (2) determinação da sequência de aminoácidos de pelo menos um peptídeo que se liga à proteína alvo; e (3) produção de um agente terapêutico compreendendo um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos identificada no passo (2) e uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento, ligada através de um grupo de ligação L ou de uma ligação directa.

Numa forma de realização, o agente terapêutico é preparado através da síntese da sequência de aminoácidos 79 ΕΡ1346041 identificada no passo dois e conjugação desta sequência com uma sequência de aminoácidos compreendendo a região Fc de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina usando um agente de ligação peptidico ou um agente de ligação não peptidico, como descrito atrás. Nesta forma de realização, a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo pode compreender resíduos de L-aminoácidos, resíduos de D-aminoácidos e/ou resíduos de aminoácidos não naturais . 0 agente terapêutico compreendendo a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma sequência de aminoácidos que se liga a uma proteína alvo pode também ser uma proteína de fusão, como discutido atrás. Por exemplo, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, ou sua região Fc, pode ser directamente fundida com a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo, ou indirectamente fundida com a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo através de um ou mais resíduos de aminoácidos de ligação. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas como discutido atrás, por exemplo, através da expressão de uma molécula de ácido nucleico codificadora da proteína de fusão num hospedeiro adequado. A biblioteca de peptídeos testada no passo (1) pode ser uma biblioteca de peptídeos de L-aminoácidos, por exemplo, uma biblioteca fágica, uma biblioteca de fagemídeos ou uma biblioteca de peptídeos produzida por métodos sintéticos, como sejam os conhecidos na área. Uma 80 ΕΡ1346041 biblioteca de peptideos sintéticos pode também incluir peptídeos compreendendo residuos de D-aminoácidos e resíduos de aminoácidos não naturais. Numa forma de realização, a sequência de aminoácidos que se liqa à proteína alvo é identificada usando usando os métodos descritos em WO 97/22617, o conteúdo da qual é aqui incluído como referência. De preferência, a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo compreende 50 ou menos, 40 ou menos, 30 ou menos ou 25 ou menos resíduos de aminoácidos. Numa forma de realização preferida, a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo compreende 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos ou 7 ou menos resíduos de aminoácidos. O presente invento ainda proporciona os agentes terapêuticos preparados usando o método descrito. Os agentes terapêuticos preferidos deste tipo incluem aqueles em que a sequência de aminoácidos que se liga à proteína alvo não é significativamente homóloga de uma série de resíduos de aminoácidos contíguos numa proteína ou peptídeo que é um ligando natural da proteína alvo. Como aqui é usado, o termo "não significativamente homóloga" significa que o grau de homologia ou identidade entre duas sequências de aminoácidos é inferior a 50%.

Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas para uma comparação óptima (e.g., podem ser introduzidos intervalos numa ou em ambas de uma primeira e uma segunda 81 ΕΡ1346041 sequência de aminoácidos para um alinhamento óptimo e sequências não idênticas podem ser eliminadas da comparação) . Os resíduos de aminoácidos nas posições de amino-ácido correspondentes são então comparadas. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui usado, "identidade" é equivalente a "homologia" de aminoácidos). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em consideração o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessitam de ser introduzidos para alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser conseguidas usando um algoritmo matemático. Numa forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que foi incluído no programa GAP do pacote de programas GCG (disponível em www.gcg.cm), usando uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de intervalos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Numa outra forma de realização, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incluído no 82 ΕΡ1346041 programa ALIGN (versão 2.0 ou versão 2. OU), usando uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalização do comprimento dos intervalos de 12 e uma penalização de intervalos de 4.

Outros agentes terapêuticos deste tipo incluem aqueles em que o peptideo que se liga à proteína alvo (P') é uma variante de um ligando natural da proteína alvo, e.g., uma variante em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram substituídos com um resíduo de aminoácido não natural ou um resíduo de D-aminoácido. 0 presente invento também engloba moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas de fusão atrás descritas e células recombinantes que possuem um gene heterólogo que codifca as proteínas de fusão atrás descritas.

Numa forma de realização, a sequência de aminoácidos que se liga a um alvo é uma sequência natural, como seja um fragmento ou um ligando conhecido por se ligar ao alvo in vivo ou in vitro. De preferência, a sequência de aminoácidos que se liga ao alvo deriva da mesma espécie da sequência da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento. Mais de preferência, ambas as sequências derivam da espécie a ser tratada com a proteína. Numa forma de realização, tanto a sequência de ligação ao alvo como a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento, como seja a região Fc, são 83 ΕΡ1346041 ambas derivadas de proteínas humanas, ou seja ambas as sequências são codificadas pelo genoma humano. De preferência, a sequência de aminoácidos que se liga a um alvo consiste em menos de 100 resíduos de aminoácidos, mais de preferência menos de 50 resíduos de aminoácidos e, mais de preferência, cerca de 20 resíduos de aminoácidos ou menos. A proteína alvo pode ser qualquer proteína ou peptídeo. Numa forma de realização, a proteína é associada a um organismo patogénico e é, de preferência, uma proteína externa ou associada a membranas, como seja uma proteína externa de vírus ou uma proteína de membrana bacteriana. A proteína pode também ser uma proteína de superfície de uma célula aberrante, como seja uma célula cancerosa ou outra célula que apresenta um proliferação desregulada. Quando da administração de um agente terapêutico do invento a um indivíduo, infectado com tal organismo patogénico ou tendo tais células que apresentam uma proliferação desregulada, o agente terapêutico liga-se à proteína alvo e a componentes celulares e não celulares do sistem imune são recrutados para a região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina, ajudando à eliminação do organismo patogénico pelo sistema imune do indivíduo.

Numa outra forma de realização, a proteína alvo pode ser uma proteína que está associada a um estado de doença, como seja uma molécula de toxina, por exemplo, uma toxina bacteriana ou virai, ou uma proteína que se acumule 84 ΕΡ1346041 inadequadamente como parte do processo de doença. Exemplos das moléculas de toxina incluem endotoxinas bacterianas, tais como toxinas A e B de C. difficile e toxinas produzidas pelas estirpes patogénicas de E. coli.

Este invento é ainda ilustrado pelos exemplos que se seguem, os quais não devem ser encarados como limitativos. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citadas ao longo deste pedido, assim como as figuras e a Listagem de sequências são aqui incluídas como referência.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS DO INVENTO Método A: O peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica e a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina podem ser preparados num sintetizador de múltiplos peptídeos Advanced ChemTech Modelo 396, usando um protocolo automatizado estabelecido pelo fabricante para a escala de síntese de 0,025 mmoles. As acoplagens duplas são realizadas em todos os ciclos usando 2-(lH-benzotriazol-1-il)-1,1, 3,3,-tetrametilurónio hexafluorofosfato (HBTU)/N,N-diisopropiletilamina (DIEA)/HOBt/FMOC-aminoácido, num excesso de quatro vezes, durante 30 minutos, seguido de DIC/HOBt/FMOC-aminoácido num excesso de quatro vezes duran- 85 ΕΡ1346041 te 45 minutos. Os peptídeos são desprotegidos e removidos da resina através de tratamento com TFA/água (95%/5%) durante três horas e precipitados com éter. O sedimento é ressuspenso em 10% de ácido acético e liofilizado. O material é purificado por HPLC preparativa usando 15%-40% acetonitrilo durante 80 minutos numa coluna Vydac C18 (21 x 250 mm). O peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica e à região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é então ligado a um grupo de ligação, e.g., um agente de ligação cruzada heterobifuncional. Método B:

Plasmideos de expressão codificadores do peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica fundida com a região Fc de IgG2a murino foram construídos através da ligação de uma sequência de cDNA codificadora do peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica a um segmento de DNA codificador dos domínios charneira-CH2-CH3 de uma IgG2a.

Para a produção da proteína de fusão, as sequências reconstruídas são inseridas no vector de expressão pHTOP (Kaufman, R.J. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490). Os plasmideos recombinantes são usados para transfectar a linha celular CHO e amplificados por técnicas convencionais (Kaufman, R.J. et al. (1991) Nucleic Acids 86 ΕΡ1346041

Res. 19:4485-4490). As células CHO expressando a proteína de fusão são crescidas em DME/F12 (Life Technologies, Inc.) suplementado com 10% FCS, metotrexato 0,02 μΜ (Kaufman, R. J. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) e 1 mg/ml de G418 (Geneticin; Life technologies, Inc.). Na confluência, o meio de crescimento é rejeitado, as células são lavadas com PBS e adiciona-se meio sem soro. Os sobrenadantes de cultura são colhidos às 24 horas, clarificados por passagem sequenciada através de filtros de 5,0 e 0,22 μιη, e concentrados usando um filtro de cassete de fluxo tangencial para 30 KDa. O concentrado foi aplicado numa coluna de proteína A-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), lavada com PBS e eluida com citrato 20 mM (pH 3,0). As fracções eluidas contendo a proteína de fusão são neutralizadas com Tris 1 M (pH 8,0; Sigma, St. Louis, O) e o material foi formulado em PBS (pH 7,2) através da permuta de tampão usando uma célula de agitação com membrana YM30 (Amicon, Beverly, MA) . A proteína foi tornada apirogénica por cromatografia em Poros PI (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) . A concentração proteica foi calculada usando absorvãncia a 280 nm.

EXEMPLO 2: ENSAIO DE ESTABILIDADE DOS COMPOSTOS NO FLUIDO CEREBROSPINAL A estabilidade de um composto do invento em fluido cerebrospinal (CSF) pode ser testada num ensaio in vitro como se segue. Foi preparada uma solução de CSF contendo 75% de CSF de macaco Rhesus (comercializada pela 87 ΕΡ1346041

Northern Biomedical Research), 23% de soro fisiológico tamponado com fosfatos estéril e 2% de dimetilsulfóxido (v/v) (Aldrich Chemical Co., Catálogo N° 27685-5). Os compostos a testar foram adicionados à solução de CSF para uma concentração final de 40 μΜ ou 15 μΜ. Toda a manipulação de amostras foi realizada numa câmara de fluxo laminar e as soluções a testar foram mantidas a 37°C durante o ensaio. Após 24 horas, a actividade enzimática nas soluções foi parada pela adição de acetonitrilo para produzir uma concentração final de 25% (v/v). Amostras (no tempo 0 e às 24 horas) foram analisadas à temperatura ambiente usando HPLC de fase reversa. Uma coluna Microbore foi usada para maximizar a sensibilidade. Os parâmetros para HPLC analítica são como se segue:

Sistema solvente (v/v) A: 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) em água B: 0,085% TFA/acetonitrilo, 1% H20 (v/v)

Injecção e gradiente

Injectar: 100-250 μΐ de amostra a testar Corrida: 10% para B durante 5 min., depois 10-70% B durante 60 min. A análise cormatográfica foi realizada usando HPLC Hewlett Packard 1090 série II. A coluna usada para a 88 ΕΡ1346041 separação foi C4, 5 pm, 1 x 250 mm (Vydac #214TP51) . 0 fluxo foi de 50 μΐ/min e o perfil de eluição dos compostos a testar foi controlado a 214, 230, 260 e 280 nm.

EXEMPLO 3: ENSAIO DE INTRODUÇÃO NO CÉREBRO A introdução no cérebro dos compostos a testar foi medida usando a técnica de Oldenford (Brain Research (1970) 24:372-376). Neste modelo estabelecido, o índice de introdução no cérebro (BUI) é uma estimativa da capacidade relativa de um composto particular para atravessaer a barreira hematocefálica, expressa como percentagem da observada para a referência de difusão livre, água. Os compostos marcados radioactivamente foram administrados a uma animal de ensaio como um bolus rápido (200 μΐ) na artéria carótida comum esquerda (com a artéria carótida externa esquerda ligada). O animal é sacrificado 15 segundos mais tarde e determinada a quantidade de radioactividade dentro do prosencéfalo ipsilateral. O BUI é computado usando a equação abaixo: ; .. ... . ~ (dpm do composto a testar no cérebro)/(dpm da água no cérebro) índice de introdução no cerebro (BUI) = ---—-E---:— (dpm do composto a testar no injectado)/(dpm da água no injectado) O veículo usado para os compostos a testar pode ser ciclodextrina 50 mM em 75% de soro fisiológico tampo-nado com fosfatos. A água pode ser usada como referência que se difunde livremente e a sucrose pode ser usada como controlo negativo. 89 ΕΡ1346041 EXEMPLO 4: Síntese de genes sintéticos codificadores de uma fusão entre fragmentos de proteína precursora amilóide humana e cadeia pesada de imunoglobulina e clonagem num vector de expressão em células de mamífero

Um fragmento de IgGl de ratinho foi amplificado por PCR usando uma sequência iniciadora 5' (5' -CTGGTTCCGC-GTGGATCCGTGCCCAGGGATTGTGGT-3' (SEQ ID NO:6)) e a sequência iniciadora 3' (5'-ATTAAGCATTCTAGATCATTTACCAGGAGAGTG-3' (SEQ ID N0:7)). Este fragmento codifica as regiões de charneira, CH2 e CH3 de IgGl de ratinho e é flanqueada por um local BamHI em grelha no seu extremo 5' e um local Xbal após o codão de terminação. Este fragmento foi clonado em vários vectores convencionais de expressão em células de mamífero, incluindo pCMV4 e pED.

Um segundo fragmento de gene codificador da sequência líder e do propeptídeo do activador de plasmino-génio tecidular humano (t-PA) foi montado através de PCR. Uma mutação conservada foi introduzida neste fragmento para criar um local de restrição BssHl único. Este fragmento foi clonado no vector de expressão pED.

Um novo vector foi então construído através de uma ligação de três elementos com o fragmento Kpnl-BssHI do vector tPA, um fragmento BamHI a Kpnl do vector de expressão IgGl e os oligonucleótidos sintéticos de cadeia dupla mostrados na Figura 3. Este vector contém elementos reguladores para um elevado nível de expressão em muitas 90 ΕΡ1346041 células de mamífero, incluindo células COS, CHO e 293, uma sequência líder de secreção derivada do gene tPA, um fragmento codificador da região Fc de IgGl de ratinho, um BssHII único dentro da sequência tPA e um local único Spel entre a sequência tPA e a região IgGl. 0 vector está apresentado na Figura 4 e foi designado pTIg.

Um fragmento de DNA sintético codificador da porção β-amilóide do gene da proteína precursora amilóide humana foi montado usando uma estratégia de PCR sobrepo-nínel como indicado na Figura 5. Um local BssHII no extremo 5' e um local Spel no extremo 3' flanquearam este fragmento. O fragmento β-amilóide sintético foi montado com e sem uma sequência flanqueante gli-gli-gli no extremo 5' e terminado no aminoácido 40 de β-amilóide ou no aminoácido 42 de β-amilóide. As condições usadas para a montagem por PCR e a clonagem do fragmento β-amilóide sintético foram como se segue: Uma reacção com Klenow ou amplificação por PCR foi efectuada para cada par de oligonucleótidos a uma temperatura de emparelhamento de aproximadamente 42°C durante 25 ciclos, 15" de extensão para cada ciclo. Para a síntese sequenciada por PCR, os 217/218 produtos foram misturados com os 219/220 produtos, ou os 219/220 produtos foram misturados com os 221/222 produtos e a reacção de PCR foi repetida com sequências iniciadoras externas. Estes produtos foram então misturados (ou um produto de PCR deste passo foi misturado com um produto do passo um) e a reacção de PCR foi repetida com as sequências iniciadoras externas para a montagem final. As reacções de PCR foram limpas por 91 ΕΡ1346041 purificação em gel caso houvesse a presença de muitos produtos scundários ou por purificação em coluna se a mistura de reacção de PCR estivesse relativamente limpa.

Os produtos de PCR e o vector pTIg foram então digeridos com BssHII e Spel e os dois fragmentos foram ligados. A sequência do gene β-amilóide sintético montado foi confirmada e possui os codões e os locais de reconhecimento por endonucleases de restrição mostrados na Figura 6. O gene β-amilóide sintético foi usado como matriz para PCR para gerar fragmentos mais pequenos da β-amilóide: Os fragmentos de PCR do gene foram clonados como produtos de digestão BssHII-Spel (como descrito atrás para os frgamentos 1-40 e 1-42) . Os fragmentos codificadores e pentapeptideos de β-amilóide com ou sem adaptadores gli-gli-gli foram montados usando oligonucleótidos complementares com extremos salientes BssHII e Spel. Os fragmentos do gene β-amilóide sintético e os oligonucleótidos usados para sintetizar aqueles fragmentos estão apresentados na Figura 7A e 7B. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de DNA.

EXEMPLO 5: EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO

Os métodos que se seguem foram usados nestas experiências. 92 ΕΡ1346041

Transfecção de células e análise de proteínas Células COS foram semeadas em placas de 100 mm me Meio de Eagle modificação de Dulbecco (Gibco-BRL) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma), L-glutamina 4 mM, 50 pg de gentamicina e transfectadas com HDNA codificador de vários segmentos de β-amilóide flanqueado pela região Fc de IgGl de ratinho quando as células atingiram aproximadamente 50% de confluência. O reagente de transfecção foi preparado pela adição de 12 μΐ de FuGene (Roche) seguido de 5 pg de DNA de plasmideo a 0,3 ml de meio sem soro. Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, o reagente de transfecção foi adicionado ao meio das células. As placas foram agitadas suavemente para distribuir o reagente. Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram lavadas uma vez com Meio de Eagle modificação de Dulbecco/F12 (Gibco-BRL) suplementado com L-glutamina 4 mM, L-serina 0,8 mM, L-asparagina 0,3 mM, 10 pg/ml de insulina, sulfato ferroso 1,5 pM, hidrocortisona 100 nM, putrecina 10 mM e selenito de sódio 28 nM, depois incubadas em 6 ml do mesmo meio. Após 24 horas, o meio condicionado foi colhido. Uma alíquota do meio foi adicionada a tampão de aplicação em gel 6,25X (concentração final, Tris 50 mM, pH 6,8, 1% SDS, 0,1% azul de bromofenol e 10% glicerol) . As células foram lisadas em tampão de aplicação em gel e colhidas. As amostras foram aquecidas a 100°C durante 2 minutos e separadas num gel de 10% SDS-poliacrilamida e transferidas 93 ΕΡ1346041 para membrana de polivinilidina difluoreto (Millipore). As membranas forma bloqueadas durante 1 hora em 5% de leite em pó desnatado, 1% de albumina sérica bovina, 0,02% de azida de sódio em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS), lavado três vezes em PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBS-T) e incubadas durante duas horas em anticorpo anti-ratinho, produzido em carneiro, conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Amersham) diluído a 1/5000 em 1% de leite em pó desnatado em PBS-T. As transferências foram visualizadas por quimioluminescência reforçada usando um estojo ("kit") da Roche.

Imuno-histoquímica

Secções seriadas de vinte micron de cérebro frontal foram preparadas a partir de ratinhos transgénicos de 20-22 semanas de idade para a mutação Sueca da proteína precursora amilóide e presenilina M146L (ref.).Todas as incubações foram efectuadas à temperatura ambiente. As secções foram lavadas uma vez com Tris 100 mM, pH 7,4 (tampão Tris), incubadas em 70% de ácido fórmico durante 3 minuto, depois lavadas três vezes em tampão Tris. A actividade de peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação durante 20 minutos em 10% metanol, 3% peróxido de hidrogénio em Tris 40 mM, pH 7,4. As secções foram lavadas três vezes em tampão Tris, depois incubadas em 0,85% NaCl, 0,1% Triton X—100, tris 100 mM pH 7,4 (tampão Tris A) durante 5 minutos seguido de tampão B durante 15 minutos. As secções foram incubadas durante a noite em meio 94 ΕΡ1346041 condicionado de células que expressam proteínas de fusão secretadas ou anticorpo policlonal anti-p-amilóide diluído a 1/1000 em tampão Tris B. As secções foram lavadas duas vezes em tampão tris A uma vez em tampão tris B, depois incubadas com anticorpo anti-ratinho conjugado com biotina induzido em burro, comercializado por Jacson laboratories diluído a 1/500 em tampão Tris A durante 1 hora. As secções foram lavadas duas vezes em tampão Tris A e uma vez em tampão Tris B, depois incubadas com peroxidase de rábano silvestre conjugada com avidina usando o estojo ("kit") de imunohistoquímica ABC adquirido a Vector Laboratories. As secções foram lavadas três vezes em tampão Tris e coradas durante 5 minutos com diaminobenzidina hidrocloreto da Vector Laboratories. As secções foram desidratadas por passagem sucessiva através de 50% etanol,70% etanol, duas vezes em 95% etanol, duas vezes em 100% etanol e duas vezes em xileno. Após aplicação de uma lamela, as lâminas foram observadas usando um microscópio Olimpus BX-60 e as imagens foram captadas com o programa Bloquant.

Resultados O meio colhido das células COS expressando a região Fc de IgGl de ratinho fundida com os resíduos de aminoácidos 1-40, 1-42, 10-25, 16-30, 17-21 (A21L) de β-amilóide, com ou sem uma protecção de três glicinas N-terminais, foram separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida na ausência de um agente redutor e analisadas por transferências Western. A incubação das membranas 95 ΕΡ1346041 com um anticorpo anti-ratinho demonstrou que cada construção originou uma proteína que migrou a aproximadamente 75 KDa (Figura 1) . A migração das bandas foi alterada para aproximadamente 35 KDa quando β-mercaptoetanol foi adicionado às amostras, confirmando que as proteínas formaram dimeros através de ligações dissulfureto (dados não apresentados). Espécies com peso molecular mais elevado foram detectadas em algumas proteínas de fusão e provavelmente representam agregados não dispersos por SDS. Uma quantidade reduzida de proteína secretada foi detectada no meio das células expressando o domínio Fc fundido com os resíduos 1-40, 1-42 ou 10-25 de β-amilóide. O meio colhido das células COS que secretam a região Fc de IgGl de ratinho fundidas com vários segmentos de β-amilóide foi incubado com as secções de cérebro frontal de ratinhos transgénicos com 20-22 semanas para a mutação Sueca da proteína precursora amilóide e presenilina M146L e revelada com o anticorpo anti-ratinho. Secções de tecido incubadas com meio de células que expressam segmentos de β-amilóide fundido com Fc, mostra distribuição de placas consistente com a distribuição de placas amilói-des. A intensidade da coloração foi maior quando os resíduos 17-21 ou 16-30 de β-amilóide ligados à região Fc de IgGl foram analisados. Não se detectaram placas amilóides quando o meio condicionado de células não transfectadas ou de células expressando o domínio Fc com um fragmento β-amilóide foi testado (Figura 2) . Ainda, não foram observadas placas quando as secções foram incubadas 96 ΕΡ1346041 com igGl purificada. A co-localização das proteínas de fusão com placas amilóides foi confirmada por coloração de secções de cérebro adjacente com um anticorpo policlonal anti-P-amilóide ou tioflavina.

EXEMPLO 6: INTERNALIZAÇÃO DE FIBRILHAS PELAS

CÉLULAS A ligação da proteína de fusão de Αβ (16-30) e IgGl Fc(Αβ(16-39)-Fc) de ratinho a receptores Fc em macrófagos J774 e a células de cancro da mama MCF7 sem o receptor Fc foi determinada através de uma modificação do procedimento por Webster, S.D. et al. (2001) J. Immunol., 166, 7496-7503. Resumidamente, macrófagos J774 em Meio

Eagle modificação de Dulbecco (Gibco#11960-051) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma #2442) foram semados em placas de 24 alvéolos numa densidade de 3 x 105 células/alvéolo e mantidos a 37°C durante 24 horas antes do ensaio. β-3ΐηί1όίάβι-4ο agregado fluorescente (ΒΑβι_40) foi preparado através da incubação de Αβι_40 500 μΜ (Califórnia Peptide Research, Inc. #641-10) com Αβ4-4ο conjugado com fluoresceína 30 μΜ (AnaSpec #23513) em Hepes 10 mM (pH 7,4) com agitação durante a noite à temperatura ambiente. FAp4_40 foi diluída para 50 μΜ com soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) . As proteínas a testar ligaram-se a ΒΑβι_40 através da incubação de 100 pg de Αβ(16-30)-Fc, IgGl Fc de ratinho sozinho ou anticorpo αβ-amilóide (Biosource International #44-352) ou IgGl de ratinho (Sigma #M9269) com 1 ml de ΡΑβ4_40, a 37°C, durante 30 minutos. FAp4_40 97 ΕΡ1346041 ligado a proteína foi sedimentado por centrifugação a 14 000 xg durante 5 minutos, lavado duas vezes em PBS e ressuspenso para 500 μΜ em PBS. Imediatamente antes do ensaio, o meio das células J774 foi substituído por 0,5 ml de Meio de Eagle modificação de Dulbecco contendo 1% BSA. Fucoidan foi adicionado para uma concentração final de 100 pg/ml e as células foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Nalgumas experiências, 25 μg de anticorpo areceptor Fc (Pharmingen #01241D) foi adicionado e as células foram incubadas a 37°C durante mais 15 minutos. As células foram transferidas para 4°C durante 30 minutos. ΕΑβι_40 ligado a proteína foi adicionado numa concentração final de 10 μΜ e incubado a 4°C durante 45 minutos. A solução foi removida e as células foram lavadas duas vezes com soro fisiológico tamponado com Hepes (HBS). Adicionou-se tripsina fria (Gibco #25200-056) durante 20 minutos a 4°C para descolar as células. As células foram ressuspensas em HBS frio contendo 0,1% BSA e analisadas num analisador Becton Dickinson FACScan.

Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 8, a qual apresenta um gráfico mostrando a fluorescência celular relativa na presença de cada uma das proteínas e na presença e ausência do anticorpo anti-receptor Fc. A fluorescência celular foi avaliada relativamente à internalização de fibrilhas pelas células e mostra que na ausência do anticorpo anti-receptor Fc, tanto a proteína de fusão Αβ (16-30)-Fc como o anticorpo α-β-amilóide causou a internalizaçã celular pelas células de 98 ΕΡ1346041 macrófagos J774, mas na ausência de proteína adicional da proteína controlo, não foi observada internalização de fibrilhas. A internalização de fibrilhas na presença da proteína de fusão Αβ(16-30)-Fc e o anticorpo α-β-amilóide foi inibido pelo anticorpo α-receptor Fc. Pelo contrário, não houve internalização de fibrilhas pelas células MCF7, as quais não possuem receptor Fc, em qualquer uma das condições analisada. Os resultados anteriores indicam que a internalização de fibrilhas mediada pelo receptor Fc ocorre na presença da proteína de fusão Αβ(16-30)-Fc e do anticorpo α-β-amilóide.

EXEMPLO 7: ENSAIO DE LIGAÇÃO DE FIBRILHAS A capacidade de um composto do invento para modular (e.g., inibir ou promover) a agregação de β-ΑΡ quando combinado com a β-ΑΡ natural foi examinada usando o ensaio de ligação de fibrilhas. β-ΑΡ natural (β-ΑΡι_4ο) para usar nos ensaios de agregação é comercializado por Bachem (Torrance, CA).

Os materiais que se seguem foram necessários para o ensaio de ligação de fibrilhas: aparelho de multifil-tração Millipore; tubos de vidro de 12 x 75; filtros de vidro GF/F de 25 mm; PBS/0,1% tween 20 a 4°C (PBST) ; fibrilas Αβ; composto radioactivo; composto não radio-activo; pipetador de repetição Eppendorf com pontas; etiquetas; pinças; e vácuo. 99 ΕΡ1346041

Neste ensaio, cada amostra correu em triplicado. A fibrila Αβ "envelhecida" foi primeiro preparada aproximadamente 8 dias antes através do envelhecimento de alíquotas de 1 ml de uma solução 200 μΜ do peptideo Αβ1-40 em 4% DMSO/PBS, durante 8 dias, a 37°C com agitação. Tal peptideo Αβ "envelhecido" pode ser testado directamente nas células ou congelado a -80°C. A fibrilha Αβ 200 μΜ foi diluída em PBST para dar uma solução 4 μΜ (320 μΐ em 16 ml de PBST) . Alíquotas de 100 μΐ desta solução foram adicionadas por tubo com o pipetador de repetição. O composto testado (e.g., Αβ(16-30)-Fc, PPI-1019 ou PPI-1621) foi preparado em diluições de 2 μΜ-200 fM. O composto testado (200 μΐ) foi então adicionado ao tubo adequado contendo a fibrilha Αβ. O composto marcado radioactivamente foi preparado usando protocolos convencionais de segurança para radio-activos preparando uma diluição numa solução de PBS/0,1% tween-20 de forma a haver uma concentração final de 20 000 dpm por 100 μΜ. Alíquotas de 100 μΐ do composto marcado radioactivamente foram adicionadas por tubo usando o pipetador de repetição. As amostras foram cobertas com parafilme e incubadas a 37°C, durante a noite, dentro de sacos de plástico para radioactividade.

Para filtrar as amostras, os filtros foram pré- 100 ΕΡ1346041 aquecidos num pequeno volume de PBST. Dois aparelhos de multifiltração Millipore foram dotados de filtros GF/F em cada poço de filtração seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram removidas da estufa a 37°C e cada uma das amostras foi filtrada usando um pequeno volume (~5 ml) de tampão PBST frio. O tubo da amostra foi então lavado com mais dois volumes de 5 ml de tampão PBST frio. Deixou-se o vácuo actuar sobre o filtro semi-seco durante aproximadamente 2 minutos após a adição da última amostra e o filtro foi transferido para um tubo marcado para contagem da iodinação. As contagens de um minuto foram registadas, os dados foram representados graficamente e o programa Prism (GraphPAD) foi usado para analisar o gráfico, de acordo com as instruções do fabricante.

Os resultados desta experiência (descrita na Figura 9), demonstram que os compostos testados (e.g., PPI-1019, PPI-1621 e três preparações diferentes de Αβ(16-30)-Fc) foram inibidores eficazes da agregação Αβ.

EXEMPLO 8: EXPRESSÃO DE UMA. PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO Αβ(16-30) FUNDIDA COM O EXTREMO N DO DOMÍNIO FC DE IGG1 HUMANA A expressão da proteína de fusão, compreendendo Αβ (16-30) fundida com o extremo N de um peptídeo consistindo no domínio Fc de igGl humana e o domínio da região de charneira Αβ(16-30)-hFc), foi conseguida usando uma construção de expressão gerada no vector pcDNA3.1 em que o 101 ΕΡ1346041 gene de resistência à neomicina foi substituído com um gene codificador de di-hidrofolato redutase (DHFR). A expressão da construção foi dirigida pelo promotor CMV. A construção ainda incluiu uma sequência sinal tPA (sequência de aminoácidos MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID nO:8)) fundida com os aminoácidos 16-30 da sequência beta amilóide humana (sequência de aminoácidos KLVFFAEDVGSNKGA (SEQ ID NO: 9) fundida com o extremo N da região Fc e charneira de igGl humana (sequência de aminoácidos começando em EPKSCD...(SEQ ID NO :10)) seguido de um sinal de poliadenilação BGH. A proteína de fusão intacta tem 272 aminoácidos e após processamento da sequência sinal, a proteína madura tem 247 aminoácidos. A expressão transitória em células Cos, 293 ou 293T proporcionou uma proteína de fusão que estava principalmente presente como um dímero na análise de PAGE não redutora e, quando da redução, os monómeros foram detectados.

EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO IN VIVO DE Αβ (16-30)-FC

Avaliou-se a capacidade de Αβ(16-30)-Fc para eliminar placas amilóides num modelo de doença de Alzheimer em ratinho. A proteína de fusão foi administrada a um ratinho transgénico para a mutação Sueca da proteína precursora amilóide e presenilina M146L, através de infusão directa no córtex cerebral num hemisfério. O ratinho foi morto e a quantidade de amilóide em secções do cérebro foi determinada por coloração de Tioflavina S. Como indicado na Figura 10, a quantidade de placas no local da infusão foi 102 ΕΡ1346041 significativamente diminuída comparativamente com o hemisfério controlado. Secções do cérebro de um ratinho que recebeu uma proteína consistindo na região Fc de IgGl mas sem a sequência de ligação a amilóide não apresentaram diferença na quantidade de placas entre os dois hemisférios. EXEMPLO 10: Construção e análise de um gene sintético codificador de uma fusão entre fragmentos da proteína precursora amilóide humana e um fragmento da cadeia pesada da imunoglobulina 61 humana em vectores de expressão para células de mamífero.

Um fragmento de cDNA de IgGl humana codificador da região Fc da proteína, correspondendo aos aminoácidos 242-473 da cadeia pesada de IgGl humana (acesso da sequência #CAA75030), foi sintetizado usando RT-PCR. No processo de síntese deste fragmento, um local de endonuclease de restrição EcoRV conservado foi criado dentro da região Fc para facilitar os passos de clonagem subsequentes. Um segundo fragmento de DNA sintético correspondendo à sequência líder e prepropeptídeo do activador do plasmidogénio de tecido (tPA) foi sntetizado e fundido com o fragmento Fc usando PCR. A fusão tPA/Fc foi clonada num derivado do vector de expressão pcDNA3.1 em que o gene de resistência à neomicina foi substituído por di-hidrofolato redutase. O gene sintétio foi projectado de forma a que um local único BamHI flanqueasse o extremo 5' e o local único EcoRV introduzido dentro da região Fc possam ser 103 ΕΡ1346041 substituídos com um correspondente fragmento BamHI/EcoRV para preparar duas proteínas de fusão Fc adicionais.

Um fragmento de DNA sintético codificador dos aminoácidos 16-30 do peptídeo beta amilóide humano foi gerado usando PCR e clonado no vector de fusão tPA/Fc. A região do propeptídeo foi removida deste vector usando PCR, dando o vector ptAprol6-30hFc. A região codificadora do gene sintético está apresentada na Figura 11 e SEQ ID NO:11. A sequência de aminoácidos da proteína codificada e os elementos funcionais anotados estão apresentados na figura 12 e SEQ ID NO:12. O vector foi usado para transfectar células COS e 293T usando o reagente FuGENE6 (Boehringer Mannheim) e o meio condicionado de proteína expressa transitoriamente foi colhido 48-72 horas mais tarde. Como alternativa, o vector foi usado para transfectar células CHO e linhas celulares estáveis expressando a proteína foram geradas usando amplificação de genes mediada por metotrexato ou cotrans-fectado em células 293 com um segundo plasmídeo contendo a marca de resistência à neomicina e seleccionado relativamente a resistência a G418.

Transfecção de células e análise de proteínas das construções humanas Células 293T foram semeadas em placas de 6 alvéolos em Meio de Eagle modificação de Dulbecco (Gibco- 104 ΕΡ1346041 BRL) suplementado com 10% de soro fetal (Sigma) e L-glutamina 4 mM e transfectadas com DNA codificador dos aminoácidos 16-30 de β-amilóide fundido com a região Fc de IgGl humana quando as células atingiram aproximadamente 70% de confluência. O reagente de transfecção foi preparado pela adição de 3 μΐ de FuGene (Roche) seguido de 1 pg de DNA de plasmideo a 50 pml de meio sem soro. Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, o reagente de transfecção foi adicionado ao meio das células. As placas foram agitadas suavemente para distribuir o reagente. Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram lavadas uma vez com Meio de Eagle modificação de Dulbecco/F12 (Gibco-BRL) suplementado com L-glutamina 4 mM, L-serina 0,8 mM, L-asparagina 0,3 mM, 10 pg/ml de insulina, sulfato ferroso 1,5 μΜ, hidrocortisona 100 nM, putrescina 10 mM e selenito de sódio 28 nM, depois incubadas em 2 ml do mesmo meio. Após 24 horas, o meio condicionado foi colhido. Uma aliquota do meio foi adicionada a tampão de aplicação em gel 4X (InVitrogen). As células foram lisadas em tampão de aplicação em gel e colhidas. As amostras foram aquecidas a 100°C durante 2 minutos e separadas num gel de 10% SDS-poliacrilamida e transferidas para membrana de difluoreto de polivinilidina (Millipore). As membranas foram bloqueadas durante 1 hora em 5% de leite em pó desnatado, contendo 0,05% tween-20 em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS), lavadas três vezes em PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBS-T) e incubadas durante uma hora com anticorpo 105 ΕΡ1346041 anti-humano, produzido em carneiro, conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Amersham) diluído a 1/7000 em 5% de leite em pó desnatado em PBS com 0,05% tween-20. As transferências foram visualizadas por quimiolumines-cência reforçada usando um estojo ("kit") da Roche. As proteínas fram analisadas de forma semelhante relativamente à sua incorporação das sequências β-amilóides através da reacção das membranas, após bloqueio, com uma diluição a 1/1000 de anticorpos biotinilados anti-aminoácidos 17-24 de β-amilóide (Signet) em 5% de leite em pó desnatado em PBS com 0,05% de tween-20. As membranas foram então lavadas com PBS com 0,05% tween-20. Após lavagem, as membranas foram incubadas com 1/10 000 de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Pierce) em 5% de leite em pó desnatado em PBS com 0,05% de tween-20. As transferências foram então lavadas com PBS com 0,05% tween-20 seguido de PBS e depois visualizadas por quimiolumines-cência reforçada usando um estojo ("kit") da Roche.

Equivalentes

Os familiarizados com a matéria reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das formas de realização específicas do invento aqui descritas. Tais equivalentes destinam-se a ser englobados pelas reivindicações que seguem. ΕΡ1346041 106

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Praecis Pharmaceuticals, Inc. <120> AGENTES TERAPÊUTICOS E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE UMA DOENÇA AMILOIDOGÉNICA <130> ppi-105pc <140> <141> <150> 60/253,302 <151> 2000-11-27 <150> 60/250,198 <151> 2000-12-20 <160> 13 <170> Patentln Ver.2.0

<210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 âsp ? 1 t 3Lo '?h8 Mq m.B 5 âsp Ser Sly Tyi Glu Vai 10 Γ3 >. ? 'UIΠ 15 Leu 1 >sl i FOe Phé Ãlã <àlu "ϊ Λ Mp Vã 1. Glf 25 Mn C-i.y Si Us 1 30: sly Hat Vai Oly ©ly Vai Vai li® .ala Thr 35 m

<210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 ΕΡ1346041 107

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<210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <200> <223> Descrição da sequência artificial: sequências iniciadoras <400> 6 tstggtteegc gtggatccgt gcseagggat tgtggt 36

<210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <200> <223> Descrição da sequência artificial: sequências iniciadoras 108 ΕΡ1346041 < 4 0 0 > 7 attaageatl ctagatoatt taecaggaga gtg 33 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Síat 1 Asp Ala S$®t Lys Arg Giy 'Lau Cys Cys Vai Lsu Leu Leu " 5 10 Cys Gly 15 Má Vai Fhe Vai Ser Pro 20 <210> 9 <211> 15 < 212 > PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Lys Leu Vai Phe Fhe Ais Siu Asp Vai fíly §«r As» Lys I 5 10 1 Oiy Ala 15 <210> 9 < 211 > 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9

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<210> 10 <211> 232 <212> PRT <213> Homo Sapiens 109 ΕΡ1346041 <400> 10

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<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: alfa-beta(16-30)Fc <400> 11 ΕΡ1346041 110 afcíjgâtgeaa ããgsttgtãfe gsesaaactq ttecfcefctcc tgugtggtgg ggcgtggagg «Mftsgtía t.gesaggtct gggaàgaccc aaeeaggtca tggeae«QCA gseggqteefc saegtcttqt títctqpçtgfc tgaagagagg gctotgqigt gtgetgctgc tgtgtggage agtcttcgtt 60 tcfcteçesga sgacgteggs fceg&aeâàsg eàáàtèttgt 120 scaqafcgqc©. aççgtgççcs geac©*«*ae túcitgggggg aoCgtCagtc 10® cccceaaacc caaggaçacc «tcatgatst eeeggrsoeec fcgaggtcacs 2<0 tggacgfcgag eeacgaagac eetgagftca agfctcaacfcg gtacgtggae 3Ô0 tgoataatge eaagaeaaag açgoqgqsgg sgsagfcaqaa sagesagfcae 360 gegtçctcaq oftcxstgcac saggaetggc tgaaiggeaa ggagtacaag 4SÔ ccaacaaagç oetccjeagco ççcategaga aaasísafcefce ea&agae&aa 480 gáçsaccaca çgtgtacacc efcgeeeeeat ceegggatga geigaecaag 540 $6Ctgacctg ccfcggtcaa* ggcttcfcatç ccag^gacet cgccgtggag 600 ãtgggqãgcq ggagsacâsc taçaagsqqa çgcçteecgt gefcggactce 660 tcttcctctá cagcaagcts «ccgfeggaea agagcsggte geagcagggg 7àé cstgctccgt gafcgcatgsg getctgcaca accaet^cac geagaagsgc 780 çtqqgggta® ãfeg® 804

< 210 > 12 <211> 267 <212 > PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL < 2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: alfa-beta(16-30)Fc <400> 12 mt. Mg Ala Lys Arg Sly Leu Cys Cys vai Lbu leu leu Cys Cly i S 10 15 Ala V4.1 Fh® vai Lys Leu Vai Fhs Phs Ala 61« Asp Vai Giy Ser Asn 20 25 30 iys sxy Ala 6i« Pr© Lys Ser Cys Asp i>y® Thr Hl* ihr Cys Fr© Fxc· 35 40 45 cys Pr o Ala Pr© 61« Lsu Lm eiy siy Pro Ser Vai Phe leu Píse Pro 50 55 50 EXfis Lys Pr© Lys Asp Thr L«« Hat na Ser Arg Tur Pro Siu Vai íhr §5 70 75 80 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Sis Ciii Asp Pr® 61« Vai. Lys Phe &an 85 30 95 ttp m Vai &§p Gly Vai Liu Vai Kis Asn Ala Lys ti·-..': Lys Pre hXQ 100 105 110 61a 82 a 81a Tyx Asa Ser Tlr tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Ihr Vai 115 120 125 hm Sis <31* Mtp irp La*. Asn m Ly« Oiu iyx Lys Cys Lys Vai Sêr 130 135 140 Asa Lys Ala lea Fxo Ala FXô lie 61« Lys ihx Xis Ser Lys Ai a Lys 145 150 155 180 ely Gin Er* ãrg Gla Pr© eia Vai tyr ?hr Le« Pr© Pr© Ser A.rç? Asp 165 170 175 111 ΕΡ1346041 SIu L*:U Thr Lys ksn Gin VSl Ser Lm Thr Cys .Lsu Vai Lys siy PMs 180 185 ISO Tyr Fro Ser R5 p tle Ala val 61 u Trp 61 o Ser A$n GXy Gin pro GXb im 205 Asn ten Tyr Lys Thr Thr Pro Oyn Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 216 21S 220 Phe Leu fyr Ser Lys Leu Thr Vai ksp Xjtyifs Ser At-g ft'P Gin Gin Sly 223 230 335 240 ÃSB Vai Phe Ser Cys Ser Vai Hiu SIu Ma Leu ais Asn His tyr 245 250 255 Thr OiB Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Qly Lys 260 265

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Lisboa, 25 de Maio de 2007

Claims (46)

1. ΕΡ1346041 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto compreendendo a fórmula I-L-P, em que: I é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que retém a capacidade de se ligar a um receptor Fc L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P é um peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica.
2. 2. O composto da reivindicação 1, em que I compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQID N0:1 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:l.
3. 3. O composto da reivindicação 1, em que I é uma região constante da cadeia pesada de IgG ou seu fragmento.
4. 4. O composto da reivindicação 1, em que L é uma ligação directa ou um grupo de ligação.
5. 5. O composto da reivindicação 1, em que P é um peptídeo capaz de se ligar a β-amilóide, ou uma proteína amiloidogénica seleccionada do grupo consistindo em transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), poli- 2 ΕΡ1346041 peptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, cistatina C, β2 microglobulina, ApoA-l, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio e lisozima. 6. 0 composto da reivindicação 1, em que P compreende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos ou 40 aminoácidos, de preferência 30 aminoácidos, mais de preferência 20 aminoácidos. 7. 0 composto da reivindicação 1, em que P compreende pelo menos um aminoácido não natural. 8. 0 composto da reivindicação 1, em que P compreende pelo menos um D-aminoácido. 9. 0 composto da reivindicação 5, em que P compreende uma subregião de uma proteína amiloidogénica seleccionada do grupo consistindo em transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, cistatina C, β2 microglobulina, ApoA-l, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio e lisozima ou uma subregião de um peptídeo β-amilóide natural.
6. 10. O composto da reivindicação 5, em que P é um peptídeo compreendido totalmente por D-aminoácidos e tendo 3 ΕΡ1346041 pelo menos três resíduos de aminoácidos independentemente seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, uma estrutura de D-tirosina, uma estrutura de D-iodotirosina e uma estrutura de D-alanina. 11. 0 composto da reivindicação 5, em que P é um peptídeo compreendendo a estrutura (Y_ Xaâi—Xaâ2—Xaa3—Xaa4—Z) em que Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são individualmente estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de entre Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são, independentemente, seleccionados do grupo consistindo numa estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina; Y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e a é um inteiro entre 1 e 15; e Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura tendo a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro entre 1 e 15. D-Leu-D-Val-D- 12. 0 composto da reivindicação 5, em que P éum peptídeo seleccionado do grupo consistindo em: D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Fenetilamida, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTir, 4 ΕΡ1346041 Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTir-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-lodoTir-D-Ala, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu, Αβ(16-30), Αβ(10-25), Αβ(1-29), Αβ(1-40) e Αβ(1-42).
7. 13. Um dímero do composto da reivindicação 1.
8. 14. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da reivindicação 1 e um seu veiculo farmaceuticamente aceitável.
9. 15. Utilização de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para a eliminação de uma proteína amiloidogénica de um indivíduo.
10. 16. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo que sofra de uma alteração amiloidogénica.
11. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a alteração amiloidogénica é doença de Alzheymer ou uma encefalopatia espongiforme. 5 ΕΡ1346041
12. 18. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica codificadora de uma proteina de fusão, a referida proteina de fusão compreendendo uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou um seu fragmento, que mantém a capacidade para se ligar a um receptor Fc e uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica.
13. 19. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 18, em que a proteína amiloidogénica é seleccionada do grupo consistindo em β-amilóide, transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus ami-lóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, cistatina C, β2 microglobulina, ApoA-I, gelsolina, calci-tonina, fibrinogénio, lisozima, Huntigton e α-sinucleina.
14. 20. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 18, em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de IgG ou um seu fragmento.
15. 21. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 20, em que a IgG é uma IgG humana, canina, bovina, murina, ovina ou de rato.
16. 22. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 18, em que a região constante da cadeia pesada de 6 ΕΡ1346041 imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de IgM, IgA, IgD ou igE ou seu fragmento.
17. 23. A molécula de ácido nucleico da reivin dicação 21, em que a IgG humana é IgGl, lgG2, lgG3 ou IgG4.
18. 24. A molécula de ácido nucleico da reivin dicação 18, em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio CH2 funcionalmente activo.
19. 25. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 18, em que a sequência de aminoácidos capaz de se ligar à proteína amiloidogénica compreende Αβχ_42 ou um seu fragmento.
20. 26. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 25, em que a sequência de aminoácidos capaz de se ligar à proteína amiloidogénica compreende pelo menos quatro ou pelo menos cinco resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de Αβι_42.
21. 27. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 25, em que a sequência de aminoácidos capaz de se ligar à proteína amiloidogénica compreende cerca de 4-15, de preferência cerca de 5-10 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos Αβι_42.
22. 28. A molécula de ácido nucleico da reivin- 7 ΕΡ1346041 dicação 25, em que a sequência de aminoácidos capaz de se ligar à proteína amiloidogénica compreende uma sequência seleccionada do grupo consistindo em Leu-Val-Phe-Phe e Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID N0:3), Leu-Val-Phe-Phe-Leu, Αβ(16-30), Αβ(10-25), Αβ(1-29), Αβ(1-40) e Αβ(1-42).
23. 29. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 18, em que a proteína de fusão ainda compreende um grupo de ligação de pelo menos um resíduo de aminoácido, o referido grupo de ligação ligando a região constante da cadeia pesada de imunglobulina e a sequência de aminoácidos capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica.
24. 30. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 29, em que o grupo de ligação compreende cerca de 1-20, de preferência 1-10, mais de preferência 1-5 resíduos de aminoácidos.
25. 31. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 29, em que o grupo de ligação compreende a sequência- (Gly)n-, em que n é um inteiro de aproximadamente 1-10.
26. 32. Um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 17-31.
27. 33. Uma célula recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 17-31. ΕΡ1346041
28. 34. A célula recombinante da reivindicação 33, em que a referida célula é uma célula de mamífero.
29. 35. A célula recombinante da reivindicação 34, em que a referida célula é uma célula CHO ou uma célula COS.
30. 36. Um método de produção de um polipeptídeo compreendendo a cultura da célula recombinante da reivindicação 33 num meio de cultura adequado para, assim, produzir o polipeptídeo. 37. 0 polipeptídeo compreendendo uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, ou um seu fragmento, que mantém a capacidade de se ligar a um receptor Fc e uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica.
31. 38. O polipeptídeo da reivindicação 37, em que a proteína amiloidogénica é seleccionada do grupo consistindo em β-amilóide, transtirretina (TTR), proteína dos priões (PrP), polipeptídeo dos ilhéus amilóides (IAPP), factor natriurético auricular (ANF), cadeia leve capa, cadeia leve lambda, amilóide A, procalcitonina, cistatina C, β2 micro-globulina, ApoA-I, gelsolina, calcitonina, fibrinogénio, lisozima, Huntigton e α-sinucleina.
32. 39. O polipeptídeo da reivindicação 37 em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de IgG ou seu fragmento. 9 ΕΡ1346041
33. 40. O polipeptídeo da reivindicação 37 em que a IgG é uma IgG humana, canina, bovina, porcina, murina, ovina ou rato.
34. 41. O polipeptídeo da reivindicação 37, em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de igM, IgA, igD ou IgE ou seu fragmento.
35. 42. O polipeptídeo da reivindicação 40, em que a IgG humana é IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.
36. 43. O polipeptídeo da reivindicação 37, em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio CH2 funcionalmente activo.
37. 44. O polipeptídeo da reivindicação 38, em que a proteína amiloidogénica compreende Αβι_42 ou um seu fragmento .
38. 45. O polipeptídeo da reivindicação 44, em que a proteína amiloidogénica compreende pelo menos quatro, ou pelo menos cinco resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de Αβι_42.
39. 46. O polipeptídeo da revindicação 44, em que a proteína amiloidogénica compreende 4-15, de preferência cerca de 5-10 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de Αβΐ-42 · 10 ΕΡ1346041
40. 47. O polipeptídeo da reivindicação 44, em que a proteína amiloidogénica compreende uma sequência seleccio-nada do grupo consistindo em em Leu-Val-Phe-Phe e Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:3), Leu-Val-Phe-Phe-Leu, Αβ(16-30), Αβ(10-25), Αβ(1-29), Αβ(1—40) e Αβ(1-42). 48. 0 polipeptídeo da reivindicação 37, em que a proteína de fusão ainda compreende um grupo de ligação de pelo menos um resíduo de aminoácido, o referido grupo de ligação ligando a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina e a sequência de aminoácidos capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica.
41. 49. O polipeptídeo da reivindicação 48, em que o grupo de ligação compreende cerca de 1-20, de preferência 1-10, mais de preferência cerca de 1-5 resíduos de aminoácidos.
42. 50. O polipeptídeo da reivindicação 48, em que o grupo de ligação compreende a sequência -(Gly)n-, em que n é um inteiro de cerca de 1-10.
43. 51. Um método de preparação de um agente terapêutico compreendendo a fórmula I-L-P', em que em que I é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que retém a capacidade de se ligar a um receptor Fc; L é um grupo de ligação ou uma ligação directa; e P' é um peptídeo capaz de se ligar a uma proteína amiloidogénica, o método compreende: 11 ΕΡ1346041 1) rastreio de uma biblioteca de peptideos para identificar um ou mais peptideos que se ligam à proteina amiloidogénica; 2) determinação da sequência de aminoácidos de pelo menos um peptideo que se liga à proteina amiloidogénica; e 3) produção de um agente terapêutico compreendendo um peptideo tendo a sequência de aminoácidos identificada no passo (2), uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento, que retém a capacidade de se ligar a um receptor Fc, e um grupo de ligação ou uma ligação directa.
44. 52. O método da reivindicação 51, em que a biblioteca de peptideos compreende peptideos de L-aminoácidos, ou peptideos de D-aminoácidos.
45. 53. Um agente terapêutico preparado pelo método da reivindicação 51.
46. 54. Uma composição farmacêutica compreendendo o agente terapêutico da reivindicação 53. Lisboa, 25 de Maio de 2007