PT1328814E - Método para identificação in vivo de epítopos intracelulares - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Método para identificação in vivo de epitopos intracelulares" 0 presente invento refere-se a um método para a identificação in vivo de epitopos intracelulares. Mais concretamente, o invento refere-se a um método in vivo de mapear epitopos de um antigénio, que se encontra normalmente presente numa célula, utilizando anticorpos intracelulares.

Constitui um elemento essencial para utilizar eficazmente anticorpos, bem como anticorpos intracelulares, a sua identificação de epítopo(s), ou seja a parte de antigénio reconhecida pelo próprio anticorpo. De facto, para a investigação, diagnóstico e terapia é desejável conhecer o epitopo de um antigénio e seleccionar anticorpos capazes de se ligaram ao mesmo.

Foram utilizadas muitas abordagens diferentes para mapear os epitopos de um antigénio, todas utilizando tecnologias in vitro e procedimentos muito laboriosos. A limitação das tecnologias in vitro é consequência do facto da ligação antigénio-anticorpo não ser investigada no contexto funcional natural do antigénio, ou seja o ambiente intracelular.

Um método (rastreio de péptidos) utiliza: a) síntese de péptidos que se sobrepõe em alguns aminoácidos e, na sua globalidade, incluem a sequência de aminoácidos completa do antigénio investigado e b) a provocação de cada péptido com anticorpos. 0 método demora muito tempo, é laborioso, dispendioso e, globalmente, nem sempre proporciona resultados satisfatórios. De facto, nem sempre um epitopo reconhecido por um anticorpo consiste de uma sequência linear de aminoácidos.

Actualmente, a tecnologia mais útil para a identificação de epitopos reconhecidos por diferentes anticorpos é a utilização de péptidos com sequências aleatórias, quer seleccionados de bibliotecas de fago de péptidos, quer sintetizados sinteticamente. A estratégia permite ainda identificar péptidos activos como epitopos sem qualquer homologia com a sequência primária de antigénio, resultando assim num epitopo descontínuo ou conformacional. Assim, a 2 ΕΡ 1 328 814 /PT metodologia permite mapear uma colecção virtual de epítopos reconhecidos por um determinado anticorpo, mesmo sem qualquer correlação estrutural com o antigénio de partida.

Alternativamente podem ser concebidas racionalmente formas mutadas, truncadas ou eliminadas do antigénio alvo, expressas em sistemas celulares adequados, purificadas e ensaiadas individualmente. Obviamente, este procedimento é também muito laborioso.

Os autores do presente invento proporcionam agora um método que identifica in vivo, no ambiente natural, epítopos de antigénios intracelulares através de anticorpos que são expressos e activos no ambiente celular (anticorpos intracelulares). A utilização de anticorpos intracelulares, ou seja anticorpos ou suas partes, expressos e activos dentro de uma célula, representa uma tecnologia bem sucedida para interactuar com a função de uma proteína, no seu ambiente intracelular fisiológico (Cattaneo e Neuberger, 1987; Carlson, 1988; Biocca e Cattaneo, 1995; Cattaneo e Biocca, 1997; Cattaneo e Biocca, 1999; Marasco, 1997). Assim, a tecnologia permite conseguir o bloqueio funcional da proteína alvo. É assim possível conferir um determinado fenótipo a uma célula ou organismo através de anticorpos intracelulares adequados. A tecnologia de anticorpos intracelulares baseia-se em dois aspectos vantajosos: 1) a disponibilidade virtualmente ilimitada do repertório do sistema imunológico (natural ou artificial), proporcionando uma fonte de moléculas adequadas para reacções de elevada afinidade e especificidade contra qualquer proteína e 2) a possibilidade de direccionar uma proteína (e consequentemente um anticorpo) para compartimentos intracelulares diferentes através de sinais de localização intracelular adequados, autónomos e dominantes. A tecnologia é utilizada validamente para aplicações em investigação e biotecnologia, nomeadamente para terapia génica de patologias humanas e animais, para proporcionar modelos experimentais de patologias e em biotecnologia vegetal para produzir plantas transgénicas resistentes a patogénios. 3

ΕΡ 1 328 814 /PT Ο grande desenvolvimento recente das tecnologias de sequenciação do genoma, tanto humano como de outras espécies, levou a um aumento da procura de tecnologias adequadas para esclarecer a função de genes identificados, resultando assim num novo campo de investigação, denominado assim genómica funcional. Inclui métodos e tecnologias adequados para identificar funções de genes de um modo tanto quanto possível paralelo, com elevado rendimento e adequado para automatização. Actualmente, esta etapa representa um constrangimento apreciável para a indústria e em particular para os procedimentos que levam dos genes a novas classes de fármacos.

Recentemente, foi introduzido um desenvolvimento da tecnologia de anticorpo intracelular, permitindo a sua utilização como uma metodologia de eleição para programas de genómica funcional: a denominada ITT (do inglês Intrabody Trap Technology, tecnologia de captura de intracorpo)). A metodologia permite isolar ou seleccionar, entre todos os anticorpos dirigidos contra uma proteína alvo, a subpopulação que é capaz de operar eficazmente in vivo, no ambiente intracelular. Descreve-se a tecnologia em Pedido de Patente Internacional PCT n° WO 00/54057. Resumidamente, consiste num método para seleccionar anticorpos a partir de bibliotecas de fagos ou de esplenócitos imunológicos, dada a sua capacidade de ligar um antigénio no ambiente intracelular. O método permite ultrapassar uma limitação da tecnologia de anticorpo intracelular, ou seja o facto de nem todos os anticorpos capazes de se ligarem in vitro ao antigénio serem capazes de se ligarem ao mesmo antigénio quando expressos como anticorpos citoplasmáticos. Os anticorpos seleccionados pelo procedimento ITT, com base no sistema de dois híbridos, são capazes de se enrolarem correctamente no ambiente intracelular e lá se ligarem ao antigénio alvo. Assim, são "validados" para utilização como anticorpos intracelulares (Visintin et al., 1999). Em todas as aplicações ITT, o antigénio é provocado com uma biblioteca de anticorpos.

Os autores do presente invento adaptaram e modificaram vantajosamente esta tecnologia para a identificação de epítopos, ou seja as partes do antigénio capazes de reconhecer e ligar um anticorpo. Tais epítopos, devido à técnica de 4

ΕΡ 1 328 814 /PT selecção, são reconhecidos in vivo pelo próprio anticorpo. De acordo com a tecnologia do invento, contrariamente a ITT, o anticorpo é o elemento constante a ser provocado com uma biblioteca ou uma série de antigénios. Esta nova técnica de mapeamento de epítopos in vivo de um anticorpo intracelular especifico (IVEM) representa uma alternativa válida às técnicas in vitro conhecidas. A simplicidade da técnica torna-a aplicável a rastreios em larga escala. A vantagem do método resulta também do facto da identificação do epítopo ocorrer in vivo, sem a necessidade de síntese de péptidos, mas com a mesma exactidão ou mesmo com maior exactidão do que métodos conhecidos. 0 método é capaz de acelerar a identificação de epítopos úteis em aplicações clínicas, de diagnóstico e farmacológicas, com rastreios em larga escala dentro de um contexto fisiológico.

Além disso, dado que se está a tornar evidente que os locais activos de uma proteína são mais conservados do que a estrutura completa, através do método do invento, é possível identificar proteínas ancestrais com funções semelhantes.

Assim, o método permite a identificação in vivo dos epítopos de uma proteína intracelular. Sabe-se que muitas proteínas intracelulares incluem domínios ou módulos homólogos estruturalmente, envolvidos em interacções proteína-proteína (por exemplo, domínios SH2, SH3, PH, WW, PTB, PDZ; Pawson, 1965) ou proteína-ADN (por exemplo dedos de zinco, caixa homeo, hélice-ansa-hélice, domínios crómio, domínios bromo). Ser capaz de conhecer a especificidade do anticorpo para um domínio relativamente a domínios similares pertencentes a outras proteínas representa um pré-requisito essencial das aplicações concebidas para anticorpos intracelulares. A informação é essencial também em todas as utilizações mais convencionais de anticorpos e a simplicidade do presente método proporciona uma solução fácil para esta necessidade. Assim, provoca-se um anticorpo de interesse, que tem como alvo um destes módulos ou domínios da proteína, com uma biblioteca de domínios de proteína da mesma família. 5

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De modo análogo, o método do invento permite identificar a especificidade de um determinado anticorpo para uma família de proteínas correlacionadas, bem como isoformas de uma proteína (ou seja, isoformas resultantes de splicing alternativo) e a especificidade de um determinado anticorpo para famílias de proteínas relacionadas evolutivamente. Tal permite efectuar muito facilmente estudos filogenéticos.

Uma aplicação adicional muito interessante que se torna possível com o presente invento é representada pelo isolamento mais fácil de anticorpos específicos para formas mutadas de uma determinada proteína. Neste aspecto, a biblioteca de antigénio consiste de uma colecção de mutantes pontuais da proteína antigénica de interesse. 0 isolamento de anticorpos para formas mutadas de proteínas intracelulares tau, presentes em patologias neurodegenerativas, como taupatias, (Hong, M., et al., 1998; Spillantini MG, et al., 1998; Goedert et al., 1999) ou de p21-ras, presente em muitos cancros humanos (Barbacid, 1987; Grand e Owen, 1991) pode ser efectuada mais facilmente do que anteriormente.

Como sistema experimental de exemplo, os autores utilizaram proteína tau, uma proteína envolvida na doença de Alzheimer. No entanto, o invento refere-se a um método geral para identificação de epítopo. É assim um objectivo do presente invento um método para a identificação epítopos da proteína tau capazes de se ligarem intracelularmente a um anticorpo específico incluindo as etapas de: a) co-transformar células com um primeiro vector incluindo a sequência de nucleótidos que codifica a região de um anticorpo anti-tau capaz de reconhecer e ligar intracelularmente a proteína tau e através de uma segunda família de vectores, em que cada membro da família inclui uma sequência de nucleótidos que codifica um péptido e formando na sua globalidade uma biblioteca de péptidos; b) crescer as células co-transformadas num ambiente tal que somente as células em que a região de anticorpo e o péptido capazes de se reconhecerem e interactuarem entre si 6

ΕΡ 1 328 814 /PT são capazes de replicar e/ou ser reconhecidos, porque: a região de anticorpo capaz de reconhecer e ligar o péptido intracelularmente está associada a uma primeira molécula; o péptido está associado a uma segunda molécula; a interacção entre a primeira e a segunda molécula gera um fenótipo seleccionável e/ou um sinal reconhecível; e a interacção entre a primeira e a segunda molécula ocorre apenas quando a região de anticorpo e péptido se reconhecem e interactuam entre si; c) seleccionar células e identificar o péptido como epítopo.

De acordo com uma concretização preferida, a biblioteca de péptidos é uma biblioteca de fragmentos de péptido tau; ou variantes filogenéticas; ou mutantes associados à patologia ou suas isoformas de splicing.

De acordo com uma concretização preferida, as células são células de levedura. 0 invento descreve-se agora de acordo com concretizações preferidas, com referência às seguintes figuras: A figura 1 é um esquema de mutantes de deleção da proteína tau; A figura 2 apresenta análise de hibridação de “Western" de proteínas de fusão de mutantes de deleção lexA-tau reveladas por utilização de um anticorpo policlonal anti-lexA (painel a); um anticorpo monoclonal anti-tau genérico (Tau-1) (painel a); outro anticorpo monoclonal anti-tau genérico (7.51) (painel c). A figura 3 apresenta o mapa de mutantes de deleção tau tal como descrito em Fasulo et al. 200 (painel a) e a especificidade anti-tau de fragmentos scFv2, scFvl4 e scFv52 relativamente a vários mutantes de deleção in vivo (painel b). A ligação epítopo-scFv é detectada por tecnologia ITT medindo a activação em trans dos genes HIS3 e lacZ e assim a capacidade das células crescerem num meio sem histidina e sintetizarem beta-galactosidase. 7

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Exemplo 1 - Mutantes tau e construções de fusão com lexA

Fundiram-se em quadro mutantes de deleção da proteína tau com o domínio de ligação lexA. Tal domínio de ligação de ADN é derivado de uma proteína de repressão de E. coli (Brent e Ptashne, 1985) (Golemis e Brent, 1992) (Silver et al., 1986). Os locais de ligação de LexA localizam-se a montante de genes repórter, na região de activação de transcrição ou promotor. A ligação de proteínas mutantes de deleção lexA-tau pode atingir e ligar os locais de ligação de lexA mas são incapazes de activar a transcrição dos genes repórter devido à ausência do domínio de activação de transcrição. Os fragmentos tau encontram-se ilustrados na figura 1 e são: - Tau 151-274 incluindo o sequência repetida RI capaz d - Tau 151-305 incluindo o sequências repetidas RI e microtúbulos; - Tau 151-336 incluindo o sequências repetidas Rl, R2 microtúbulos; - Tau 151-368 incluindo o sequências repetidas Rl, R2, microtúbulos; - Tau 151-391 incluindo o sequências repetidas Rl, R2, domínio rico em prolina e a 5 se ligar a microtúbulos; domínio rico em prolina e as R2 capazes de se ligarem a domínio rico em prolina e as e R3 capazes de se ligarem a domínio rico em prolina e as R3 e R4 capazes de se ligarem a domínio rico em prolina e as 13 e R4, até ao resíduo Glu 391; - Tau 151-402 incluindo o domínio rico em prolina e todas as sequências repetidas até ao resíduo Asp 402; - Tau 151-412 incluindo o domínio rico em prolina e todas as sequências repetidas até ao resíduo Ser 412; - Tau 151-422 incluindo o domínio rico em prolina e todas as sequências repetidas até ao resíduo Ser 422; - dGAE incluindo a região mínima que constitui o núcleo do filamento PHF observado em doentes de Alzheimer.

Exemplo 2 - Transformação com mutantes tau e sua expressão 0 plasmídeo de ADN que codifica o domínio lexA fundido a mutantes de deleção de proteína tau é utilizado para 8

ΕΡ 1 328 814 /PT transformar a estirpe de levedura L40 (Hollenberg et al, 1995) utilizando um método padrão incluindo acetato de litio para tornar as células de levedura permeáveis. 0 método foi proporcionado por Clontech com base em protocolos previamente publicados (Gietz et al., 1992; Hill et al., 1991; Schiestl e

Gietz, 1989). Transformam-se células de levedura utilizando 0,1 μg de plasmídeo de ADN e 100 μg de esperma de salmão como transportador, numa solução incluindo acetato de litio, polietilenoglicol e dimetilsulfóxido. Plagueiam-se as células transformadas em meio mínimo (selecção sintética) contendo todos os aminoácidos excepto triptofano para identificar o fenótipo obtido. De facto, o vector utilizado para expressar o domínio lexA fundido a proteínas mutantes de deleção tau é capaz de complementar o défice nutritivo resultante da ausência de triptofano, permitindo assim o crescimento da levedura sem o referido aminoácido.

Extraem-se as proteínas híbridas produzidas pelas células de levedura da cultura de levedura transformada utilizando um tampão de extracção contendo β-mercaptoetanol a 10%, SDS a 2%, azul de bromofenol a 0,1% e glicerol a 10% (Sambrook et al., 1990) . O nível de expressão das proteínas de fusão foi avaliado por análise de hibridação de "Western", utilizando anticorpos policlonais anti-lexA-proteína (figura 2a), mAb anti-Tau: Tau-1 (Roche) (figura 2b) e 7.51 (Novak et al., 1991) (figura 2c). A experiência revela que os mutantes de deleção tau são reconhecidos de modo diferente pelos dois anticorpos anti-tau, indicando assim que as proteínas bem expressas têm um peso molecular adequado e são assim traduzidas correctamente e expressam correctamente epítopos conhecidos, reconhecidos por vários anticorpos utilizados.

Exemplo 3 - Co-transformação de mutantes tau com fragmentos de anticorpo anti-tau de cadeia simples (ScFv), seleccionados através do método ITT A experiência utiliza um painel de fragmentos Fv em cadeia simples (scFv) seleccionados por tecnologia ITT (Visintin et 9 ΕΡ 1 328 814 /PT al., 1999 e PCT WO00/54057). Rastreou-se uma biblioteca de fragmentos scFv expostos na superfície de bacteriófagos filamentosos com a proteína tau recombinante purificada ligada a uma fase sólida. Após dois ciclos de adsorção, eluição, cultura dos fagos eluídos em E. coli, subclona-se a população "policlonal" de fragmentos de anticorpo enriquecidos em anti-proteína tau no vector de expressão de dois híbridos e ensaia-se para a capacidade de ligação de proteína tau no sistema de dois híbridos. Isolam-se fragmentos scFv de anticorpo anti-tau capazes de se ligarem a tau intracelularmente, a partir das células de levedura seleccionadas na ausência de histidina.

Plaquearam-se colónias de levedura, transformadas com mutantes tau e cada um dos scFv seleccionados por ITT, em meio selectivo para a identificação do fenótipo do repórter nutritivo HIS3, que se encontra sob controlo dos locais de ligação lexA, cuja expressão permite que as células cresçam na ausência de histidina. A reconstituição do factor de transcrição por interacção específica antigénio-anticorpo permite a transcrição de ambos os genes repórteres HIS3 e lacZ. A identificação de tal interacção é efectuada por análise qualitativa de colónias cultivadas na ausência de histidina e por alteração de cor (de branco para azul) da mesma colónia num ensaio colorimétrico para expressão de β-galactosidase. A especificidade dos três fragmentos scFv diferentes (2, 14, 52) contra o painel de fragmentos de anticorpo tau apresenta-se na figura 3 e resume-se na tabela 1.

Tabela 1 Antigénio 151-274 151-305 151-336 151-368 151-391 151-402 151-412

151-422 dGAE

ScFv2 ------ + +

ScFvl4 ---- + + + + +

ScFv52 ______ + + 10

ΕΡ 1 328 814 /PT A figura 3 apresenta a identificação dos epítopos de proteína tau por fragmentos variáveis de cadeia simples anti-tau, scFv2, scFvl4 e scFv52. A cultura em placas His- e o fenótipo β-gal mostra os péptidos Tau que interactuam com um ou mais dos três fragmentos scFV. Nomeadamente, os fragmentos S412-S422 e N368-E391 contêm um epítopo reconhecível in vivo.

Exemplo 4 - Selecção pelo método IACT

De acordo com o método tal como revelado em pedido PCT WO 00/54057, selecciona-se uma série de 18 novos ScFv anti-tau (A a Y) e caracterizam-se através do mesmo painel de mutantes de deleção Tau do exemplo 1, excepto dGAE.

Cada anticorpo foi provocado in vivo com cada um dos mutantes de deleção Tau, de acordo com o método de WO 00/54057. Os resultados apresentam-se na tabela 2 e demonstram que o método do invento (IVEM) permitiu a identificação de três regiões principais (I 151-K 274; N 368-E 391; D 402-S 412) de Tau, reconhecidas pelos anticorpos seleccionados com o método IACT.

Tabela 2

ScFv Fragmentos TAU I 151-K 274 I 151-S 305 I 151-Q 336 I 151-N 368 I 151-E 391 I 151-D 402 I 151-S 412 I 151-S 422 #A * * #B * ~k #C * ~k #D * * * ~k #E * ~k #F * * * * ~k * * ~k #G * ~k #K ~k * * ~k #M * ~k #N ~k * * ~k #0 * ~k #Q * ~k #S * ~k #T * ~k #U * ~k #v ~k :k * ~k #x ~k -k * ~k #Y * ~k 11

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Assim, o método de selecção (IVEM) permite uma rápida identificação de epítopos reconhecidos in vivo pelos ScFv seleccionados previamente com o método IACT, representando assim uma alternativa válida aos métodos tradicionais dispendiosos e demorados. Além disso, apenas através da presente técnica se conseguiu uma identificação fácil e precisa da região de antigénio reconhecida in vivo.

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Lisboa,

Claims (3)

1. ΕΡ 1 328 814 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificação de epítopos da proteína tau capazes de se ligarem intracelularmente a um anticorpo específico incluindo as etapas de: a) co-transformar células através de um primeiro vector incluindo a sequência de nucleótidos que codifica a região de um anticorpo anti-tau capaz de reconhecer e ligar intracelularmente a proteína tau e através de uma segunda família de vectores, em que cada membro da família inclui uma sequência de nucleótidos que codifica um péptido e formando no seu todo uma biblioteca de péptidos; b) crescer as células co-transformadas num ambiente tal que somente as células em que a região de anticorpo e o péptido se reconhecem e interactuam entre si são capazes de replicar e/ou ser reconhecidas porque: a região de anticorpo capaz de reconhecer e ligar o péptido intracelularmente está associada com uma primeira molécula; o péptido está associado com uma segunda molécula; a interacção entre a primeira e a segunda molécula gera um fenótipo seleccionável e/ou um sinal reconhecível; e a interacção entre a primeira e a segunda molécula ocorre apenas quando a região de anticorpo e o péptido se reconhecem e interactuam entre si; c) seleccionar as células e identificar o péptido como epítopo.
2. 2. Método para identificação de epítopos da proteína tau capazes de se ligarem intracelularmente a um anticorpo específico de acordo com a reivindicação 1 em que a biblioteca de péptidos é uma biblioteca de fragmentos de péptido tau; ou suas variantes filogenéticas ou mutantes associados à patologia ou isoformas de splicing.
3. 3. Método para identificação de epítopos da proteína tau capazes de se ligarem intracelularmente a um anticorpo específico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que as células são células de levedura. Lisboa,