PL98718B1 - Sposob wytwarzania nowego antybiotyku antibioticum bay g 7299 - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku Antibioticum Bay g 7290.Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku, nadaje sie do izwalczania mikroorganizmów w medycynie ludzkiej d zwienzecej, a jako czynny skladnik paszy dla zwierzat wzmaga i przy¬ spiesza wzrost zwierzat i zwieksza stopien wyko¬ rzystywania przez nie paszy.Wiadomo, ze szereg antybiotyków pochodzenia mikrobiologicznego dziala przeciwko mikroorganiz¬ mom. Zakres dzialania tych antybiotyków jest je¬ dnak czesciowo niezadowalajacy, a poza tym ma¬ ja one jeszcze 'inne wady. Antybiotyki JS-laktamto- we czesto Itraca aktywnosc pod wplywem penicyli- nazy, a cMoraimifenikol, tetracyklina i streptomy¬ cyna powoduja w wielu przypadkach powazne, niepozadane dzialania uboczne (porównaj Walter Heilmeyer, Antybilotika Filbel, /wydawnictwo Georg Thieme, Stuttgart, wydanie 3, 1969, strony 248, 27i8—fiB0 i 3111^3110).Stwierdzono, ze otrzymuje sie nowy antybiotyk Aotiibioticum Bay g 7299, gdy szczepy Actinopla- nes SE 73 zdeponowane pod nr CBS — Nr 423.74 tylob SE 73/B zdeponowane pod nr CBS — Nr 434.74 poddaje sie hodowli w warunkach aerobo- wych w zwyklej pozywce zawierajacej wegiel, azot i substancje mineralne i antybiotyk wyosab- nia z pozywki znanymi sposobami. Stwierdzono równiez, ze antybiotyk ten dziala silnie przeciw mikroorganizmom, a poza tym ma te wlaisciwosc, 2 ze przyspiesza wzrost zwierzat i zwieksza stopien wykorzystywania przez nie paszy.Zwiazek, wytwarzany sposobem wedlug wyna¬ lazku, ma nastepujace cechy charakterystyczne chemiczne i fizyczne: (1) Analiza elementarna i wzór sumaryczny Obliczono dla C6gH9dO,4 (1468) Obliczono: 56/MWo C, i6^4% H, 37,Wo O, 4 OCH, 7,8% Znaleziono:* 56^19% C, 6,54% H, 37,125% O, OCH, 7;y9% Nalezy zaznaczyc, ize przy tak duzych czastecz¬ kach wielkosc bledu przy analizie elementarnej (±0,8% pnzy poszczególnym oznaczeniu) nie pozwa¬ la na dokladne wyliczenie sumarycznego wzoru [R.B. Woodward, Angew. Chem. 69, str. 50^511 (1*957)]. Podany wzór sumaryczny moize przeto wy¬ kazywac pewien blad. 02) Temperatura topnienia: substancja zaczyna sie rozkladac nieco od temperatury okolo 142°C, a silnie od temperatury ,1T7°C. Przy ogrzewaniu z predkoscia okolo 5°C na 1 minute mozna za¬ obserwowac proces topnienia w temperaturze jl<96— aa5°c. (3) Skrecalnosc wlasciwa [a]D20=-6,6° (C=1,0% w metanolu) (4) Ciezar czasteczkowy oznaczono, mierzac os- * po 4 dniach suszenia pod silnie obnizonym cis¬ nieniem w temperaturze lO0°C. 9871898718 a mometrycznie cisnienie pary roztworu antybiotyku w chloroformie: 1570 (C=2,10°/o) 1630 (C=l;05%) (5) Widmo absorpcyjne antyfoiotyku w nadfiole¬ cie ipodamo na fig. 1, przy czym na osi odcietych podano dlugosc fal w milimikronach, a na osi rzednych ekstynkcje: ^maks=^307 mim [(C=O,Gl(0i6°/o w metanolu) (El1/!] om] 307 mm=i351 (6) Widmo absorpcyjne antybiotyku w podczer¬ wieni (podano na -fig. 2, przy czym na osi odcie¬ tych podano dlugosc fal w om-1, a na osi rzed¬ nych absorpcje. Przy badaniu antybiotyku, ^pra¬ sowanego z KBr, widmo wykazuje pasma absorp¬ cyjne przy dlugosciach fal, wyrazonych w cm-1, przedstawionych w tablicy 1.Tablica 1 Czestotli¬ wosc jpasm i on-^ 3450 2980 2940 2900 1710 1615 1450 J415 1375 132 0 1290 1255 1215 1 1 Intensyw¬ nosc s m m m m s m m s s s s s Czestotli¬ wosc pasm 'Cm-1 H195 1U30 1040 945 905 870 840 820 785 750 735 700 Intensyw¬ nosc s s s m m m m m m m m m <7) Widmo rezonansu jadrowego *H podano w czesciach na milion (ppm) i wahaniach na sekunde (Hz) zgodnie z fig. 3. i(8) Widmo rezonansu jadrowego 13C, (wedlug fig. 4) W tablicy 2 podane jest widmo rezonansu jadro¬ wego 13C, wykazujace sygnaly, podane w czesciach na milion (ppm) i wahaniach na sekunde (Hz) w ich wzglednych intensywnosciach. ciag dalszy tablicy 2 1 1 9 11 12 13 14 16 17 18 19 21 22 23 24 26 27 28 .29 | 30 31 32 33 34 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 2 72 204 79 37 99 49 23 23 22 32 31 23 49 62 3.7 41 44 89 39 41 41 95 93 38 89 56 70 64 92 39 61 58 38 41 • 59 34 62 44 32 34 21 21 70 45 61 1 3 3230,6 3155,1 3053,0 3037,3 303(31,6 - 3flll2.7 263)2.3 2561,2 2511,8 2434,5 2419,7 2399,8 2174,2 2074,7 (5^7,0 !a037,8 2031,4 2006,1 1969,0 1963,0 1965,5 1941*9 1937,3 1905,5 1898,6 189i3,6 1878,4 1843,9 1831,9 1811,5 1805,4 1790,9 1777,8 ¦ 1767,7 1763,5 1745,0 1731,6 1562,4 1558,0 1536,4 1488,2 508,7 506,6 450,9 404,4 0,0 1 4 128,205 125,209 121,157 120,533 120,386 119,|556 104,463 101,638 99,680 96,612 96,024 95,234 86,283 82.334 81,631 80,868 80,614 79,612 78,138 77,900 77,602 77,06(2 | 76,879 75,620 75,345 75,147 74,543 73,176 1 72,700 1 71,889 71,647 71,071 70,550 70,149 69,982 69,251 68,719 62,004 61,830 60,972 59,061 ,190 ,106 17,893 . 16,050 0,000 Tablica 2 Numer sygnalu !l 1 2 3 4 6 7 8 Intensyw¬ nosc 2 66 33 42 37 , 41 42 174 | PiOlozenie isyignalu 3 4206,3 3657,6 3514,1 3436,1 3389,4 3344,7 3286,0 • 323(3,4 | Polozenie sygnalu (Plpm) 4 166,925 145,149 130„456 136,357 134^506 132,730 130(,402 128^3)16 1 (9) Antybiotyk rozpuszcza sie dobrze w chloro¬ formie, acetonie, estrze etylowymi kwasu octowego, acetoniittryilu, dwumetylaforinamidzie, sulfotlemku dwumetylu i nizszych alkoholach, np. metanolu i etanolu, natomiast gorzej w wodzie, eterze ety¬ lowym, eterze naftowym i cykloheksanie. (iliO) Antybiotyk, wytwarzany jgposobem wedlug wynalazku, mozna przez kwasna lub alkaliczna hydinolize przeprowadzac w ^zwiazki, które równiez wykazuja dzialanie antyibiotyiczne. Tak mp. dziala¬ jac kwasem solnym i woda ii +. 1 czesci objetos¬ ciowe) przy wartosci pH = 4,5, albo wodorotlen¬ kiem sodowym w metanolu z woda (1 +»1 czesci 40 45 50 55 605 objetosciowe) przy wartosci pH = 11 juz w tem¬ peraturze -pokojowej (20°C) w ciagu niewielu go¬ dzin otrzymuje sie produkty rozkladu, kitóre jesz¬ cze wyraznie dzialaja im vitro na gramuijeimne i gramdodatnie bakterie, np. Escherichia coli. (11) Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, stanowi bezpositacioiwa, bezbairwna sub¬ stancje obojetna, nie wedrujaca ,przy elektrofore^ zie. Przy silnie kwasnej hydrolizie (np. wiodnym roztworem kwasu siarkowego o stezeniu 10% wa¬ gowych w temperaturze 80°C) ulegaja odiszczepie- niu rózne redukujace cukry. W ten stposób miozna uwidoczniac antybiotyk metoda cienkowarstwowej chromatografii na plycie z zelu krzemionkowego przez charakterystyczne zabarwienia za pomoca substancji reagujacych z cukrami, np. za pomoca aldehydu anyzowego z kwasem siarkowym, tymo¬ lu z kwasem siarkowym, waniliny z kwasem nad¬ chlorowym lub dimedonu z kwasem fosforowym, aUJbo za pomoca kwasu molitodenianof6sforowe©o.Niektóre zabarwienia, molgace sluzyc do identyfika¬ cji, (podano w tablicy 3.Tablica 3 Numer 1 2 3 * 6 7 P Odczynnik *) % HsSOi jod kiwas molib- deniainiofostó- rowy azotan srebra ^NH8 tymol ^HgSC^ dimedon —H^P04 aldehyd any¬ zowy —.S*S04 wanilina — HO1O4 ; Barwa brazowa brazowa niebiesko- zielona brazowa czerwono- fioleitowa zielona, a w swie- itle nadfio¬ letowym zólta zielona braziowa - Tlo biale brazowo- zólte bladonie- foieskie jasnobra- ziowe bezbarwne bezbarwne 'bezbarwne | bezbarwne *) Odczynniki sitosuje sie zwyklymi sposobami ^porównaj E. Stahl. DUnniscMchtchroma^tograiphie, wydanie 2, Springer Verlag .Berlin, Heidelberg, New York 1967). (12) Wartosci Rf nowelgo antybiotyku na obojet¬ nych^ plyitiftaich z zelu krzemionkowego (Plnmy Merck, Darmstadt, RFN) w porównaniu z zasada eryitromycynowa w róznych eluentach podano w tablicy 4.Przedstawione na fig. 3 wictoo 220 Mhz rezo¬ nansu jadrowego XH otrzymano w roztworze an¬ tybiotyku w deuteryzowanym chloroformie z czte- rometylosdlaoeim jako wewnetrznym wzorcem, za pomoca spektrometru HR-SC iiiirmy Varian Assoc¬ iates, Paolo Alto, Kalifornia, St. Zj. Am.Widmo magnetyczne rezonansu jadrowego 1SC 98718 6 Tablica 4 Nu- mer 1 2 3 4 6 7 Elueait (czesci objetosciowe) Chloroform + metanol 95 + 5 90 + 10 80 + , 20 50 + 50 chloroform + metanol + amoniak* 40 + 6+ + 1 metanol butanol 4- lodowaty kwas octowy + woda 00 + 20+ + 20 Wartosc Rf no¬ wego anty¬ biotyku 0,00 0^27 0,5© 0,85 0,34 0,88 ! 0,55 ' Wartosc Rf za¬ sady erytro¬ mycyny ' 0/M) 0,08 0,211 0,26 0,62 0^5 0,39 *) Roztwór wodny o stezeniu 25% wagowych amoniaku. (fig. 4) mierzono z takiego siamego roztworu za pomoca spektrometru XIj-10{K15") firmy Yarian, przy 25y2 MHz z wyeliminowywaniem szumu pro- tonów.Intensywnosc ipasm w podczerwieni oznaczono literami s, m, w. Pasma s sa to pasma, majace intensywnosc, wynoszaca co najmniej 2/3 inten¬ sywnosci najsilniejszych pasm w widmie, pasma m maja intensywnosc 1/3—2/3 najsilniejszych pasm, a pasma w maja intensywnosc mniejsza niz . 1/3 intensywnosci najsiilniejiazych pasm. Oceny tej dokonano na podstawie procentowej przepuszczal¬ nosci. "¦¦'¦ 40 Nieoczekiwanie stwierdzono, ze sposobem we¬ dlug wynalazku antybiotyk jest wytwarzany przez podane wyzej szczepy Aotinoplanes i moze byc wyosobniany z dobra wydajnoscia z srodowiska hodowlanego. Stwierdzono równiez nieoczekiwa- 45 nie, ze antybiotyk ten wykazuje silne dzialanie przeciwko miikiroorganizmom, zwlaszcza bakteriom, takze i przeciwko gramujemnym bakteriom cho¬ robotwórczym, a przy tym nie ma on podanych wyzej wad znanych antybiotyków. Nowy amtyhio- 50 tyk ma równiez nieoczekiwanie zdolnosc przyspie¬ szania wzrostu zwierzat i polepszania ich zdol¬ nosci do wykorzystywania paszy. Z tycli wzgle¬ dów wynalazek stanowi wzbogacenie farmakologii i techniki. 55 W procesie, prowadzonym sposobem wedlug wynalazku, mozna stosowac nowe szczepy Acti- noplanes SE 73 i SE 73/B. Szczepy te naleza dó klasy Schizomycetes, rzedu Actinomycetales, ro¬ dziny Actinoplanaceae i gatunku ActinopUianes. 60 Szczep SE-73 wyosobniono z glleby, a szczep SE- - -73/B otrzymano jako samorzutny mutant szczepu SE-73. Szczepy SE-73 i SE-73/B maja nastepujace cechy.Grzybnia ma szerokosc 93—1,3 mikrona i jest 65 rozgaleziania. Zawodnie maja postac nieregularna^7 98718 8 przewaznie w zarysie w przyblizeniu kulista, ale z powierzchnia majaca garby, a srednica jej wy¬ nosi 5—1,8 mikronów. Zarodniki sa kuliste do elip¬ soidalnych, wiciowate, poruszaja sie szybko i ma¬ ja srednice 0,7—1,3 muikrona. Sa 'one umieszczone w zarodni w postaci zakrzywionych i sklebionych lancuchów.Cechy hodowli na róznych pozywkach obserwo¬ wane po 14 dniach wzrostu w temiperaturize 20— °C sa podane w tablicy 5.Tablica 5 Pozywka agar Czapka GPC (kazamino- pepton i agar Czapka mleko-agar tyrozyna-agar wytwarzainie melaniny peptoniaacja mleka Cechy hodowli W dobry do bardzo dobrego, SM pomaranczowa DP slaba barwa brazowo- zólta S|pg*+, ipowierzchniia grzyb¬ ni cienko oszroniona W dobry do bardzo dobrego SM pomaranczowa do pomaranczowobrazowej U? barwa brazowa, Spg.++, powierzchnia tgrzybni cienko oszroniona, W dobry do bardzo dobrego SM pomaranczowa LP barwa zlotobrazowa Sp|g.++, .powierzchnia grzybni cienko 'Oszroniona, Kazeina ulega peptonizacji W umiarkowany do dobrego SM brazowa DP barwa brazowa 'S(pg.—, ipowierzchniia grzybni czesciowo oienko oszroniona Krysztaly tyrozyny nie roz¬ puszczone, dodatnie dodatnie W oznacza wzrost,, SM oznacza grzybnie jako pozywike, LP oznacza rozpuszczalny pigment, Spg oznacza wytwarzanie zarodni, — oznacza brak, + oznacza wyrazne wystepowanie, ++ oznacza bardzo wyrazne wystepowanie.Szczep SE-73/B odróznia sie od szczepu SE-73 wzmozonym wytwarzaniem antybiotyku Antilbioti- cum Bay g 7299.Proces wedlug wynalazku mozna prowadzic przy - uzyciu stalych, pólstalych lub cieklych [pozywek. Ko¬ rzystnie stosuje sie wodne ptozywfoi ciekle. Pozywki zaszczepia sie zwyklymi metodami, np. poprzez skosne rurki lub kulturami w kolbach. Hodowle prowadzi sie w warunkach aerobowych, dowolny¬ mi znanymi sposobami, takimi jak hodowle wy¬ trzasane, np. w kolbach do wytrzasania, hodowle poruszane powietrzem lub hodowle wglebne. Ko¬ rzystnie prowadzi sie aerobowa hodowle wglejbna w napowietrzanych kadziach fermentacyjnych, np. w zwyklych zbiornikach do fermentacji wglebnej.Hodowle mozna prowadzic sposobem ciaglym lub nieciaglym i korzystnie stosuje sie sposób nie¬ ciagly.Hodowle mozna prowadzic we wszystkich po- zywkach znanych, stosowanych do hodowania mi¬ kroorganizmów rzedu Actinomycetales. Pozywka powinna zawierac jedno lub wieksza liczbe zró¬ del przyswajalnego wegla i azotu oraz sode mine¬ ralne, przy czym produkty te moga wystepowac w postaci okreslonych skladników pojedynczych albo tez w postaci kompleksowych mieszanin, zwlaszcza biologicznych produktów róznego po¬ chodzenia. Jako zródla wegla mozna stosowac zwy¬ kle zródla wegla,, np. takie; jak skrobia, melasa, sproszkowane mleko, dekstryna, cukry, np. sacha¬ roza, maltoza, glikoza, laktoza, sorbit i gliceryna.Jako zródla azotu stosuje sie znane organiczne i nieorganiczne zródla azotu, np. make sojowa, make z nasion bawelny, lnu i grochu rozpuszczalne i nie- rozpuszczalne proteiny roslinne, niamok kukury¬ dziany, wyciag z drozdzy, peptony i wyciajg mie¬ sny oraz sole amonowe i azotany, np. NH4CI, {NH4)2S04, NaNO, i KN03. Sole mineralne, które powinny sie znajdcwac w pozywce, daja np. na- stepujace jony: Mg++, Na+, K+, Ca++, NH4+, Cl-, S04~, —, P04 i NO3- jak równiez jony zwyklych pierwiastków sladowych, takie jak Cu, Fe, Mn, Me, Zn, po, Ni. Jesli zródla wejgla i azo¬ tu albo uzyta woda nie zawieraja dostatecznych ilosci tych so-lii i pierwiastków sladowych, to ko¬ rzystne jest uzupelniac odpowiednio pozywke. Sklad pozywek moze byc bardzo rózny. Rodzaj i sklad pozywek zwykle zalezy od telgo jakie skladniki sa .szczególnie korzystne do dyspozycji. 40 Przy prowadzeniu procesu sposobem wedlug wy¬ nalazku moze byc korzystne stosowanie do hodo¬ wli szczepów Actinoplianes tylko wzglednie malych stezen rozpuszczalnych skladników pozywki i na¬ stepnie w ciagu pierwszych 3 dni prowadzenia ho- 45 dowli dodawanie tych skladników w postaci wy¬ jalowionych, stosunkowo stezonych roztworów.Wartosc pH rozwijajacych sie kultur nalezy utrzy¬ mywac korzystnie 6—6, zwlaszcza 6,5—7,5. Zbyt znaczny spadek wartosci pH w kierunku odczynu ° kwasnego mozna hamowac przez dodawanie orga¬ nicznych lub nieorganicznych zasad, korzystnie Ca003. Jak w znanych procesach fermentacji, mozna tez i tu stosowac samoczynne regulowanie wartosci pH, wtryskujac do roztworu kultury w 55 odstepach czasu wyjalowione kwasy onganiczne lub, nieorganiczne, np. U^Oit albo wyjalowione lugi, np. NaOH.Korzystnie jest zapewnic wystarczajace stykanie sie. imdkToorganiizrnów z tlenem i isulbstancjamd, sta- 60 nowiacymi pozywke. Osiaga sie to zwyklymi spo¬ sobami, takimi jak wytrzasanie i mieszanie.Hodowle mozna prowadzic w temperaturze oko¬ lo 20°C do okolo 40°C, zwlaszcza 25--35qC, a szcze¬ gólnie korzystnie w temperaturze okolo 28°C. Czas 65 trwania hodowli¦, moze byc bardzo rózny, w za-9 98718 Jezmoscd np. od skladu pozywki i temperatury ho¬ dowli. Optymalne warunki moga byc kazdorazowo latwo ustalone przez fachowca w dznecfczftnie mi¬ krobiologii. Stwierdzono, ze najwieksza zawartosc antybiotyku, gromadzacego .sie w brzeczce hodo¬ wlanej, osiajga sde zwykle po uplywie okolo 2—12, korzystnie 5—8 dni od rozpoczecia hodowania. Jak zwykle w procesach mikrobiologcznych nalezy uni¬ kac obcych zakazen srodowisk 'hodowlanych. W tym iceliu stosuje sie zwykle iza/biegi,, akie jak wy¬ jalawianie srodowisk hodowlanych, naczyn stoso¬ wanych w procesie oraz powietrza niezbednego do inapowietrzania. Do wyjalowienia mozna stoso¬ wac zwykle zalbiegi, np. sterylizacje para wodna luib tez na sucho. JezeM podczas hodowania po¬ wstaje w niepozadanych ilosciach piana, to mo¬ zna stosowac znane, chemiczne srodki do zwal¬ czania piany, np. ciekle tluszcze i oleje, emulsje olej-woda, parafiny, wymsze alkohole, takie jak oktadekanol, oleje silikonowe, zwiazki polioksy- etylenowe luib potocksypropylenowe. Piane mozna tez tlumic luib usuwac za pomoca zwyklych urza¬ dzen mechanicznych, np. przy uzyciu sil odsrod¬ kowych.Antybiotyk, wytworzony sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna wyosatooiac z grzybni i/lub ze srodowiska hodowlanego zwyklymi sposobami fi- zytocchemtenymi, np. za pomoca zwyklych spo¬ sobów ekstrakcji, wytracania i/lub chromatografi¬ cznie. Wyosobniony antybiotyk mozna tez dalej oczyszczac wymienionymi metodami, ale w wielu przypadkach dalsze oczyszczanie nie jest koniecz¬ ne, pondieiwaz ewentualnie obecne zanieczyszczenia nie wplywaja ujemnie na .skuiteczmosc antybioty¬ ku. We wszyisltkdch operacjach -wyosaibnlianda i oczyszczania nalezy dbac o to, aby utrzymana byla wartosc pH=7,0 lub wyzsza, korzystnie 7,0—0,0.Do podwyzszania wartosci pH mozna stosowac za¬ sady ndeorgandczjne lub organiczne, np. amoniak, wodorotlenki metali alkalicznych albo metali zdem alkalicznych, weglany lub wodoroweglany metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, np.KOH;, NiaOH, NajGO* NaHCO,, OaC03, trójalki- loaminy, takie jak trójettyloamiinia, morfolina i pi¬ rydyna. Do ustalania, w której frakcji przy sto¬ sowaniu wyzej podanych metod wyosafoniania i oczyszczania antybiotyk, wytwarzany sposobem we¬ dlug wynalazkUj znajduje sie w najwyzszym ste¬ zeniu albo o najwyzszej czystosci, mozna sitosowac zwykle metody fizyko-chemiczne, np. mierzenie pasm w nadfiolecie przy dlugosci fali 307 mdlimi- kronów,, wartosci Rf lub korzystanie badianie akty¬ wnosci przeciwko mikroorganizmom. Szczególnie korzystne jest w takim przypadku badanie aktyw¬ nosci pa^eciwko Escherichia coli, np. Escherichia coli ATCC 9637, za pomoca zwyklych prób plyt¬ kowych (porównaj np. P. Klein, Bakteriologiiische Grundlaigen der chemotnerapeutiischen Lalborato- riuimsprasiis, Springer-Verlag# GOttiingen) 1967, .(star. 86 i nas Przy stosowaniu cieklej pozywki wodnej wyo¬ sobnianie i oczyszczanie antybiotyku, wytwarzane¬ go sposobem wedlug wynalazku, mozna prowadzic np. w ten sposób, ze do brzeczki hodowlanej ra¬ zem z grzybnia dodaje sie rozpuszczalnik miesza¬ jacy sie z woda i miesza dokladnie, powodujac z jednej strony ekstrahowanie czynnej su/hstancji z grzybni, a z drugiej strony wyklarowanie brze¬ czki hodowlanej. Jako rozpuszczalnik mozna sto- sowac np. nizsze alkiUoalkohole o 1—4 atomach wegla, takie jak metanol, n — albo izopropainiol lub Illnrzed. butanol, dwuimetyloformamid, czte- rowodorofuran, a zwlaszcza aceton. Ilosc rozpusz¬ czalnika mozna zmieniac w szerokich granicach, a korzystnie stosuje sie objetosc rozpuszczalnika w przyblizeniu równa objetosci brzeczki hodowla¬ nej. Nastepnie za pomoca saczenia, odwirowywa¬ nia, osadzania itp. Oddziela sie niierozpuJszczone sktadniiki (grzybnia, wyltracone proteiny iitp). Wo- dnoorganiczny roztwór zageszcza sie korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem, np. do objetosci uzytego srodowiska hodowli. Ewentualnie za po¬ moca zasady moca NaOH, doprowadza sie wartosc pH powy¬ zej 7,0, AP- 9,0. Otrzymany rozrtwor okresla sie nizej jako „roztwór I".Z roztworu I antybiotyk wyosabnia sie i ewen¬ tualnie oczyszcza za pomoca zwyklych procesów ekstrakcji, stracania it/ialibo chromatograficznie. Z metod chromatograficznych mozna stosowac meto¬ de chromatografii kolumnowej lub preparaityw- nej chroma-togiraifii cienkowarsibwowej. Jako srod¬ ki adsorpcyjne mozna stosowac wszystkie zwykle (nie kwasne) nieorganiczne lub organiczne srodki adsorpcyjne, tafcie jak np. tlenek glinu, zel krze¬ mionkowy, krzemian magnezu, wegiel aktywowa¬ ny celuloza, pochodne celulozy, sztuczne zywice, takie jak poliamidy, pochodne poliamidów iitp., np. acetylowany poliamid lub zele dekstranowe. Jako srodek rozwijajacy w preparatywnej chromato¬ grafii cienkowarstwowej mozna stosowac najróz¬ niejsze rozpuszczalniki lub mieszaniny rozpuszczal¬ ników, w ktccych nowy antybiotyk jest rozpusz¬ czalny. Korzystnie stosuje sie mieszanine chloro¬ formu z metanolem, np. 9:1 w stosunku obje¬ tosciowym* Jako eluent w chromatografii kolum¬ nowej takze stosuje sie rozpuszczalniki lub ich mieszaniny, w których nowy antybiotyk jest roz¬ puszczalny /ip. czterochlorek wegla^ chlorek mety¬ lenu i korzystnie chloroform.W celu wyosobniania antybiotyku korzystnie stosuje sie metode ekstrakcji, ewentualnie w po¬ laczeniu z metoda chromatografii i metoda stra¬ cania. W stadium ekstrakcji nalezy dbac o to, aby w zaleznosci od tego, czy antybiotyk ma znajdo¬ wac sie w fazie wodnej, czy w fazie organicznej, rozpuszczalnik byl tak dobrany, aby antybiotyk byl w nim trudniej lub latwiej rozpuszczalny.Ekstrakcje prowadzi sie np. w nastepujacy spo¬ sób. Roztwór I ekstrahuje sie zwyklymi sposoba¬ mi (wytrzasanie, metoda przeciwpradowa itp.) za pomoca organicznych rozpuszcza^ików, nie mie¬ szajacych sie z woda. Jako rozpuszczalnik mozna stosowac zwykle rozpuszczalniki ekstrakcyjne, np. estry, takie jak octan etyki i octan butylu, wyz¬ sze alkohole, takie jak alkohole amylowe, rop. al¬ kohol n-amylowy, ketony, nie mieszajace sie. z woda, np. keton metyloizoibuftylowy, chlorowane nizsze weglowodory ,mp. chloroform, chlorek roe- tyienu i czterochlorek wegla. Korzystnie stosuje 40 45 50 55 6011 98718 12 sie octan etylu i octan butylu, a zwlaszcza octan etylu. Jezeli do ekstrakcji roztworu I stosuje sie octan etylu i/albo octan butylu, to wodna faze.od¬ rzuca sie, gldyz nowy antybiotyk znajduje sie w fazie organicznej. Faze organiczna zateza sie np. do okolo 1/10—1/30 pierwotnej objetosci, po czym wytraca antybiotyk przez dodanie organicznego srodka stracajacego (rozpuszczalnika), w którym antybiotyk jest trudno rozpuszczalny, np. eteru etylowego lub nasyconego, weglowodoru & lancu¬ chu prostym lub rozgalezionym, albo cyklicznego, np. eteru naftowego, n-heksanu lub cykloheksanu, postepujac zwyklymi sposobami.Surowy antybiotyk mozna dalej oczyszczac me¬ toda ekstrakcji ciecznciecz (np. metoda Craiga), albo ewentualnie zwyklymi metodami chrómato- graflicznymi (chromatiograflia kolumnowa, prepara- tywna chromatograifiia cienkowarstwowa), przy ozym jako srodki adsorpcyjne, jak wyzej wspom¬ niano, mozna stosowac zwykle, nie kwasne, nie¬ organiczne i organiczne srodki adsorpcyjne, np. tlenek glinu, zel krzemionkowy, krzemian magne¬ zu, wegiel aktywowany, celuloze, pochodne celu¬ lozy, sztuczna zywice, taka jak poliamidy i po¬ chodne poliamidów, np. acetylowany poliamid, ze¬ le dekstranowe, wymieniacze jonowe itp.Jezeli do ekstrakcji roztworu I stosuje sie ntie octan etylu lub octan butylu, lecz inny rozpusz¬ czalnik, np. czterochlorek wegla, to wodna faze odrzuca sie, poniewaz antybiotyk znajduje sie w fazie organicznej. W tym przypadku organiczny rozpuszczalnik odparowuje sie korzystnie do okolo 1/10—1/30 pierwotnej objetosci i przez dodanie od¬ powiedniego organicznego srodka wytracajacego, w którym antybiotyk jest trudno rozpuszczalny, np. eteru etylowego albo nasyconego weglowodo¬ ru o lancuchu prostym lub rozgialezionym albo weglowodoru cyklicznego np. eteru naftowego, n- heksanu lub cykloheksanu, wytraca sie antybiotyk zwyklymi sposobami. Osad rozpuszcza sie w wo¬ dzie i roztwór suszy przez wymrazanie. Otrzymany surowy produkt mozna wzbogacac ewentualnie przez ekstrakcje octanem etylu lub octanem buty¬ lu* w którym niepozadane substancje towarzy¬ szace sa przewaznie nierozpuszczalne i oczyszczac zwyklymi metodami chromatogiraficznymi, np. me¬ toda chiwwnaitoigraifiiii kolumnowej lub preparatyw- nej chromatografii cienkowarstwowej, przy uzyciu zwyklych srodków adsorpcyjnych (porównaj takze wyzej podane informacje), albo metoda ekstrakcji ciecz — ciecz. Jak wyzej wspomniano, nowy an¬ tybiotyk mozna tez oczyszczac przez wytracanie z roztworu surowego produktu w organicznym roz¬ puszczalniku, np. w czterochlorku wegla, chloro- fonzrie i chlorku metylenu, za pomoca odpowied¬ niego organicznego srodka wytracajacego, w któ¬ rym antybiotyk ten jest trudno rozpuszczalny np. za pomoca eteru etylowego, nasyconego weglowo¬ doru o lancuchu prostym lub rozgalezionym albo weglowodoru cykMcznegjb, np. eteru nafltowego, n- heksanu lub cykloheksanu. Antybiotyk mozna wy- osatoniac z roztworów zwyklymi sposobami np. przez odparowywanie rozpuszczalnika, suszenie pnaez wymnazianie ilt Nowe szczepy Actinoplanes oznakowane dla po¬ trzeb laboratoryjnych SE 73 i SE 73/B, zlozono w urzedowych placówkach do deponowania pod na¬ stepujacymi numerami: SE 73 ATCC — nr 31058 CBS — nr 432.74 FRJ — nr 2669 SE 73/B ATCC — nr 31060 CBS — nr 434.74 FRJ — nr 2671 (2.08.1974 r.) (12.08.1074 r.) (9.084074 r.) (2.08.1074 r.) (12.08.1074 r.) {9.08.1074 r.) ATCC oznacza American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2086(2, J5 St. Zjedn. Am. CBS oznacza Centralbureau voor SchimmelcuHtures, Baarn, Holandia.FRJ oznacza Fermentatkwi Research Institute, To¬ kio, Japonia.Nowy antybiotyk mozna przeprowadzac w far- maceutyczne preparaty, które oprócz nietoksycz¬ nych obojetnych nosników stosowanych w farma¬ kologii zawieraja substancje czynna, wytworzona sposobem wedlug wynalazku lub skladaja sie z tej substancji czynnej. Preparaty te moga wyste- powaó w postaci jednostek dozowania, to jest po¬ jedynczych elemetnów, np. tabletek, drazetek, kap¬ sulek, piigulek, czopków i ampulek, w których za¬ wartosc substancji czynnej stanowi ulamek albo wielokrotnosc pojedynczej dawki. Jednostki dozo- waniia moga zawierac np. 1, 2, 3 albo 4 dawki je¬ dnostkowe albo 1/2, 1/3 albo 1/4 dawki jednostko¬ wej. Jednostkowa dawka zawiera korzystnie taka ilosc substancji czynnej, która poddaje sie przy sto¬ sowaniu i która zwykle odpowiada jednej dawce w dziennej lub jej polowie, jednej trzeciej albo je¬ dnej czwartej.Pod okresleniem nietoksycznych, obojetnych nos¬ ników nadajacych sie do stosowania w farmako¬ logii rozumie sie róznego rodzaju stale, pólstale 40 lub ciekle rozcienczalniki, wypelniacze i srodki po¬ mocnicze do formowania preparatów. Korzystny¬ mi preparatami sa tabletki, drazetki, kapsulki, pi¬ gulki, granulaty, czopJci, roztwory, zawiesimy, emul¬ sje, pasty, mascie, zele, kremy, plyny do przemy- 45 wania, pudry i preparaty do rozpylania. Tabletki, drazetki, kapsulki, pigulki i granulaty moga obok jednej lub wiejkszej liczby substancji czynnych za¬ wierac zwykle nosniki, takie jak wypelniacze i rozcienczalniki np. skrobie, cukier mlekowy, cu- M kier trzcinowy, glikoze, mannit i krzemionke, sub¬ stancje wiazace, np. karboksymetyloceluloze, algi- niany, zelatyne i pc^iwMyliopirolidon, substancje utrzymujace wilgoc, np. gliceryne, substancje roz¬ sadzajace, np. agar, weglan wapniowy i weglan 55 sodowy, substancje opózniajace rozpuszczanie, np. parafine i przyspieszacze pochlaniania, np. czwar¬ torzedowe zwiajzki amoniowe, substancje zwilza¬ jace, np. alkohol cetylowy, monostearynian glice¬ ryny, substancje adsorpcyjne, np. kaolin i bento- «o nit oraz substancje zwiekszajace posfeg, np. talk, stearynian wapnia i stearynian magnezu oraz stale glikole polietylenowe albo mieszaniny substancji wymienjionych wyzej. * Tabletki, drazetki, kajpisulki, pigulki i granulaty 85 mozna zaopatrywac w zwykle powloki i otoczki,98718 13 14 ewentualnie zawierajace srodki powodujace nie- przezroczystosc, przy czym powloki te moga miec taki sklad, ze oddawanie substancji czynnej na¬ stepuje tylko lub zwlaszcza w okreslonej czesci przewodu pokarmowego, ewenltualniie z opóznie¬ niem, przy czym jako osnowe mozna stosowac np. polimery i woski. Substancje czynna z jednym lub wieksza liczba podanych wyzej nosników mozna ewentualnie umieszczac w milfcrokapsulkach.Czopki moga obok substancji czynnej zawierac zwykle nosniki rozpuszczalne albo nierozpuszczal- ne w wodzie, np. glikole polietylenowe, tluszcze, np. tluszcz kakaowy, albo wyzsze estry.* np. estry alkoholu o 14 atomach wegla z kwasem o 1<6 ato¬ mach wegla, lub tez mieazaininy tych substancji.Moscie, pasty,, kremy i zele moga obok substan¬ cji czynnej zawierac zwykle nosniki, np. zwierze¬ ce i roslinne tluszcze, woski, parafiny, skrobie, tragakamt; pochodne celulozy, glikole polietyleno¬ we silikony, bentonit, krzemionke, talk i tlenek cynku attxicl} mieszajniny. ' Rroszki i preparaty do rozpylania moga oprócz substancji, czynnej zawierac zwykle nosniki, np. cukier mlekowy, talk, krzemionke, wodorotlenek glinowy, krzemian wapnia i sproszkowany polia¬ mid albo mieszaniny tych substancji. Preparaty do rozpylania moga dodatkowo zawierac zwykle srod¬ ki wypychajace, np. chlorofliuoiroiweglowodory.Boztlwory i emulsje moga oprócz substancji czyn¬ nej zawierac zwykle nosniki, takie jak rozpusz¬ czalniki, substancje ulatwiajace rozpuszczanie i e- mudgatory, np. wode, alkohol etylowy*, aikohol i- zopropylowy, welglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propyleno¬ wy, glikol l|,3Hbutylenowy, dwumetyloiorniamidi, o- leje, zwlaszcza, olej z nasion bawelny, olej arachi¬ dowy, kukurydziany, oliwkowy, racznikowy d se¬ zamowy, gliceryne, formalogilitceryne, alkohol czte- rowodorafurfurydowy, glikole polietylenowe i estry kwasów tluszczowych z sorbitem lub mieszaniny tych substancji. Roztwory i emulsje do pozajelito¬ wego podawania moga tez byc wyjalowiane i izo- toniczne z krwia.Zawiesiny moga obok substancji czynnej zawie¬ rac zwykle nosniki, takie jak ciekle rozcienczal- nrikiii, np. wode, alkohol etylowy, glikol propyle¬ nowy, substancje ulatwiajace wytwarzanie zawie¬ siny, np, etoksyilowaoe alkohole izostearynowe, es¬ try polioksyetyflenosorfaitu i estry sorbitanowe, mji- krokrystaliiczna celuloze, metawodorotlenek glino¬ wy, bentonit, agar i tragakamt albo mieszaniny tych substancji.Wspomniane wyzej preparaty moga tez zawie¬ rac srodki barwiace,, konserwujace oraz dodatki polepszajace zapach i smak, np. olejek mietowy i eukaliptusowy oraz substancje slodzace, np. sa¬ charyne.Zwiazek o wlasciwosciach leczniczych powinien znajdowac sie w opisanych wyzej preparatach ko¬ rzystnie w stezeniu, wynoszacym okolo 0,1—09,5% korzystnie okolo 0,5—G5p/t wagowych calkowitej mieszaniny.Opasane wyzej, preparaty farmaceutyczne moga oprócz czynnej substancji, otrzymanej sposobem wedlug wynalazku, zawierac inne substancje czyn¬ ne farmakologicznie. Preparaty te wytwarza sie zwyklymi sposobami, np. przez mieszanie czynnej substancji z nosnikiem lub z nosnikami.Substancje czynna, wytwarzana sposobem we- dlug wynalazku, oraz preparaty lecznicze, zawie¬ rajace te substancje, mozna stosowac w medycy¬ nie i weterynarii w celach zapobiegawczych oraz do zwalczania i/lub leczenia wyzej podanych scho¬ rzen. Substancje czynna lub farmaceutyczne pre¬ paraty mozna podawac miejscowo, doustnie, po- zajefliiltowo, dootrzewnowo i/lub doodbytniczo, ko¬ rzystnie doustnie i pozajelitowo, zwlaszcza domies¬ niowo lub dozylnie, ewentualnie takze jako trwale kroplówki.Zarówno w medycynie, jak tez i weterynarii w celu osiajgniepia zadanego wyniku zwykle korzyst¬ nie jest stosowac substancje czynna przy poda¬ waniu doustnym lub pozajelitowym w lacznej i- losci okolo 10 do okolo 1000 mg, korzystnie 50— 500 mg na 1 kg masy ciala w ciagu 24 godnin, e- wentuaHnie w kilku dawkach Ipotjedynczych. Po- jiedyncza dawka zawiera substancje czynna, wy¬ twarzana sposobem wedlug wynalazku, korzyst¬ nie w ilosci okolo 15 do okolo 150 mig, zwlasz¬ cza 10—HOO mg na* 1 kg masy ciala, ale moze byc konieczne stosowanie odchylen od tych ilosci, w zaleznosci od rodzaju i masy ciala traktowanego obiektu, rodzaju i nasilenia schorzenia, rodzaju preparatu i sposobu jego podawania oraz okresu czasu wzglednie odstepów w czasie podawania.Tak np. w niektórych przypadkach wystarczaja dawki substancji czynnej mniejsze od wyzej.po¬ danych, podczas gdy w innych przypadkach tnze- ba stosowac dawki wieksze od podanych wyzej.Dozowanie i sposób podawania moze okreslic kazdy fachowiec na podstawie posiadanej znajomosci rze¬ czy.Substancja czynna, wytwarzana sposobem we¬ dlug wynalazku, wykazuje przy nieznacznej to¬ ksycznosci silne dzialanie przeciw mikroorganiz¬ mom. Dzieki tym wlasciwosciom moze ona byc stosowana jako substancja czynna w chemotera¬ pii w medycynie oraz jako substancja do konser¬ wowania nieorganicznych i organicznych materia¬ lów, zwlaszcza wszelkiego rodzaju produktów or¬ ganicznych, np. polimerów, srodków smarnych, farb,, wlókien, skóry, papieru .drewna, srodków zywnosci i wody.Substancja czynna, wytwarzania sposobem we¬ dlug wynalazku, jest skuteczna przeciw bardzo szerokiemu zakresowi m moca mozna zwalczac (gramujemne i gramdodat- nie bakterie, mlikroorganizmy podobne do bakterii, jak równiez zapobiegac schorzeniom, wywolywa¬ nym przez te chorobotwórcze mikroorganizmy o- raz powodowac poprawe stanu i/albo uzdrawiac.Substancja ta jest szczególnie skuteczna przeciw¬ ko bakteriom i mikroorganizmom podobnym do bakterii, przeto nadaje sie szczególnie dobrze do profilaktyki i chemoterapii w przypadkach miejs¬ cowych i ukladowych zakazen w medycynie i we¬ terynarii, wywolywanych przez te chorobotwórcze bakterie i mikroorganizmy bakteriopodoJbne. Na przyklad mozna zwalczac miejscowe d/afljbo ukla¬ dowe schorzenia i/albo zapobiegac schorzeniom, 40 45 50 55 0098718 wywolywanym przez nastepujace mfeoorganlizmy chorobotwórcze, lub ich miieszaoiny: Mdcnococaceae, takie jak gronkowce, np. Staphyiococcus aureus, Staph.epideanmiidis, Staph. aerogenes i Gaffyka te- fcragena (Staph.=Staphylococcus); Lactobacteriace- ae, 'takie jak paciorkowe, np. iStireptococcus pyc- genes, a lub 0 hemoliziujace paciorkowe, mie (y) heirnolizujajce paciorkowe, Sfor. viiT.idans, Str. fae- cailiis (drobnoustroje przewodu pokarmiowego). Str. alalactiae, Str. lactis, Str. eqiui, Str. anaerobis i Diplococcus pneumoniae (dwoimki zapalenia pluc).(S(tr.=Streptococcus); Neiisseriaceae, taMe jak Neisserde, np. Nelssenia go- norrhoeae (gonokokd), N. meningiitklis (meningokoki).N. catorcrbalis i N. flaya (N=iNeiisiseriia); Coryneibacteiriiaceae, takie jak maczugowce, np.Corynebactterium diphtheriae, C. pyolgenes, C. dd- phtheroides, C. acnes, C. parvum, C. ,bovis, C. re- nale,, C. ovus, C. muarósepticum, bakterie Liisteria, np. Histeria monocytogenes, bakterie rózy, np, Ery- sdpelotlirix dnsidiosa, bakterie Kuflthiia, nip. Kur- tchia zopiflti (C. = Corynebacterium); Mycobaoteriaceae, takie jak bakterie, wywolujace pratkowanie np. Mycobacteriuim tuberculosis, M. bovis, M. ayiuira, tak zwane nietypowe bakterie, wywolujace pratkownie z grup Bunyona I, II, III i IV, M. leprae (M. = Mycobacteóuim); Enterobacteriaceae, takiie jak bakterie Escheriehiae z gru|py Coli: bakterie Escherichia, np. Escheanichda coli, bakterie przewodu pokarmowego, np. E. de- rogenes, E. cloaoae, bakterie KOehsieflfla np. K. pneunwniae, K. ozaenae, Erwiniae, np. Erwinia s(pec., Serratia*. mp. Serratia maccescens E. = Eni- terabacter) (K. = Klebsiella), bakterie Proteae z grupy Proteus: Proteus, np. Proteus vulgaris, Pr. moangaiiii, Pr. rettgeri, Pr. mirabiltis, Providencia, np. B. Proviidencia sp. (((Px. Proteus); Salimoneleae: Bakterie SaamoaefliLa, np.. Salmonella pairatyphd A i B„ S. typlhi, S. enteniitaciiis, S. cholera suiis, S. ty- phtimuiri.uim (S. = Salmonella), bakterie Shiigella, np. Shdgella dysenteriae, Sh. amibigua, Sn. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei (SH. ^ Shigella); Spirilla- ceae, takie jak bakterie Vojbrio, np. Viibrdo Chole- rae, V. proteus, V. fetus (V. = Vdbrio), bakterie SpirillUm, np. Spiriilhim minus; Bacillaceae, takie jak wytwarzajace zarodniki aerobowe,, np. Bacillus anifchtracds, B. sufotilis, B. cereus (B. .= Bacillus), wytwarzajace zarodniki aerobowe bakterie z ro¬ dzaju Clostridiiuim, np. Clostridium perfringens, Cl. septaoum, Cl. oedematiens, CU. histolyrtricuim, CI. te- tani, Cl."ootulinum (Cl. = Ciostnidiium); Mykoplasmy, takie jak np. Mycoplaisma pneumo- ndae, M. hominiis, M. suis pneumoniae, M. galliisep- ticuim,, *M. hyorhdnis (M. = Mycoplasma).Podane wyzej cmikroonganizniy choribotwórcze sttanorwda jedynie przyklady i w zadnym przypad¬ ku nie stanowia ograniczenia. Ze schorzen, którym mozna .zapobiegac za pomoca substancji czynnej, wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku, lub któ¬ re mozna lagodzic i/albo z nich uzdrawiac mozna wymienic przykladowo naistepujace: .schorzeniia dróg oddechowych i jamy gardla,. Otiitis, Pharyn- giitis, Pneumonie, Peritoniitiis, Pyeionephniitiis, Cys- tditósy.Endocardiitis, zakazenia ukladowe, Bronchiitis, Arthritis zapaleniia miejscowe i schorzenia skóry. 16 Substancje czynna, wyt/wanzana sposobem we¬ dlug wynalazku, mozna takze stosowac w pelnym zakresie w hodowli i utrzymywaniu zwierzat jako srodek wplywajacy korzystnie na wzrost, przyspie- szajacy wzrost oraz polepszajacy wykorzystywanie paszy u zwierzat zdrowych i chorych. Skutecznosc tej substancji czynnej zalezy przy tym w duzej mierze od rodizajiu i ploi ztwierzajt Szczególnie war¬ tosciowe jest dzialanie substancji w hodowli i u- trzymyiwaniu zwierzat mlodych i opasowych. Ze z/wderzat u których substancja czynna, otrzymywa¬ na sposobem wedlug wynalazku, moze byc stoso¬ wana do wzmagania i przyspieszania wzrostu oraz do polepszania wykorzystywania paszy, mozna przykladowo wymienic nastepujace zwierzeta uzy¬ teczne lub utrzymywane w innych celach: cieplo- krwiste, takie jak bydlo, swinie, konie, owce, kozy, koty, psy, króliki, zwierzeta futerkowe, np. norki i szynszyle, ptactwo, np. kury gasi, kaczki* jndy- ki, golebie, papugi i kanarki oraz zimnokrwiste, takie jak ryiby, np. karpie i gady; np. weze.Ilosc substancji czynnej, wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku, która podaje sie zwierzetom w celu osiagniecia zamierzonego skutku, mozna ?5 dzieki cennym wlasciwosciom tej substancji zmie¬ niac w szerokich granicach i wynosi ona korzy¬ stnie okolo 5 do okolo 500 mg, zwlaszcza 10— 100 mg na 1 kg masy ciala na 1 dzien. Okres po¬ dawania tej substancji moze wynosic od niewielu godzin lub dni do kilku lat. Odpowiednia ilosc substancji czynnej oraz czas trwania podawania zalezy zwlaszcza od rodzaju, wieku, plci, stanu zdrowia zwierzecia i warunków, w jakich jest ono utrzymywane i moze byc latwo ustalona przez fa- chowca.. Substancje, wytwarzana sposobem wedluig wy¬ nalazku, podaje sie zwierzetom zwyklymi metoda¬ mi. Sposób podawania zalezy zwlaszcza od posta¬ wy zwierzecia i stanu jego zdrowia. Tak np, po- 40 dawanie moze odbywac sie raz lub wiecej razy dziennie, w regularnych lub nieregularnych odste¬ pach czasu, doustnie lub pozajelitowo. Korzystne jest w wiekszosci przypadków podawanie doustne, zwlaszcza w,rytmie pmyjniówania pokarmu i/albo 45 pojenia. Substancje czynna mozna podawac jako czysty produkt luib w postaci preparatu, równiez w mieszaninie z nietoksycznymi, obojetnymi nosni¬ kami dowolnego rodzaju, np. z nosnikami i w pre¬ paratach, jakie opisano wyzej przy omawianiu pre- 50 paraltów farmaceutycznych. Substancje te niozna ewentualnie podawac w postaci preparatów takze razem z farmakologicznie czynnymi substancjami, solami mineralnymi, pierwiastkami sladowymi, wi¬ taminami, bialkami, tluszczami barwnikami i/albo 55 sulbstancjami smakowymi^ w odpowiedniej .postaci.Korzystne jeoSt podawanie razem z pasza i/lub woda pitna, przy czym w zaleznosci od potrzeby substancje czynna podaje sie z caloscia lub tylko z czescia paszy i/albo wody pitnej.M Substancje czynna, wytwarzana sposobem weSlug wynalatzku, mozna dodawac do paszy i/lufo dó.wo^ dy pitnej zwyklymi sposobami, przez proste zmie¬ szanie czystej substancji, korzystnie rozdrobnionej, ale w postaci preparatu w mieszaninie z jadalny- ^5 mi nie trujacymd nosnikami^ ewentualnie takze w17 98718 18 postaci przedmieszki albo koncentratu paszowego.Pasza i/lub woda pitna moze zawierac substan¬ cje czynna w stezeniu okolo 5—*500, zwlaszcza 10— —ilOO czesci wagowych na- milion. Optymalne ste¬ zenie tej substancji w paszy i/luib wodzie zalezy zwlaszcza od ilosci paszy i/lub wody, pobieranej przez zwierzeta i moze byc latwo ustalona przez fachowca. Rodzaj paszy i jej sklad nie ma przy tyim znaczenia. Mozna stosowac wszystkie uzywa¬ ne, znajdujace sie w handlu lub specjalnie zesta¬ wiane pasze, które korzystnie zawieraja skladniki, bedace zródlem energii i stanowiace material nie¬ zbedny dla rozwoju w równowadze, niezbednej przy odzywianiu, w tym równiez witaminy i sub¬ stancje mineralne. Pasza moze sie skladac np. z produktów roslinnych, takich Jak siano, buraki, zboze i produkty zbozowe, z produktów zwierze¬ cych, np. miesa, tluszczów, maczki kostnej, pro¬ duktów rybnych,* witamin, np. witaminy A, D- Hkompleks i B^comgpleks protein, aminokwasów, np. I^nmetioniiny i produktów naieorgantonych, np. wapna i sold kuchennej.Koncentraty paszowe zawieraja substancje czyn¬ na, w^liwairaatfia sposobem wedlug wynalazku, obok .produktów jadalnych, nip. maki zytniej, makikuku¬ rydzianej, maki sojowej lub wapna ewentualnie dnne produkty odzywcze i wykorzystywane do bu¬ dowy oraz proteiny, sole mineralne i witaminy.Wytwarza sie je zwyklymi metodami' mieszania.IW przedmieszkach i koncentratach paszowych substancja czynna moze byc ewentualnie chronio¬ na przed dzialaniem powietrza swiatla i/lub wil¬ goci przez pokrycie jej powierzchni odpowiednimi srodkami, np. nietoksycznymi woskami lub zela¬ tyna. » -¦ ¦ Przykladowo sklad paszy dla- kurczat, zawiera¬ jacej substancje czynna, wytwarzana sposobem wedlug wynalazku, jest nastepujacy: 200 g pszenicy, 340 g kukurydzy, 361 g srutu sojo¬ wego, 60 g loju wolowego, 15 g fosforanu dwu- wapniowego, 10 g weglanu wapnia, 4 g jodowanej soli kuchennej, 7,5 g mieszaniny witaimoinowio-mi- nerailnej i 2J5 g przedmieszki, zawierajacej sub¬ stancje czynna. Po dokladnym zmieszaniu sklad¬ niki te daja 1 kg paszy. Mieszanina wiitaminowo- mineralna zawiera: 6000 jednostek witaminy A, 1000 jednostek witaminy D3, 10 mg witaminy E, 1 mg witaminy K3, 3 mg rybofilawnny, 2 mg pi- rydoksyny, 20 mfe witaminy Blt, 5 mg pantotenia- nu wapnia^ 30 mg kwasu nikotynowego, 200 mg chlorku choliny, 200 mg MnS04 • H^O, 140 mg 2nS04 • 7H^O, IGO mg FeS04 • TH/) i 20 mg OuSOj • 5H4O. Frzedmieszka z substancja czynna zawiera zadana ilosc substancji czynnej, np. 100mg i dodatkowo 1 g D(L-metioniny oraz tyle maki so¬ jowej, aby otrzymac 2J5 g przedmieszki.Basza dla swin, zawierajaca substancje czynna, wytwarzana sposobem wedlug wynalazku, ma przy¬ kladowo nastepujacy sklad: 630 g paszowego srutu zbozowego (zlozonego z 200 g kukurydzy, 150 g srutu jeczmiennego, 150 g srutu owsianego i 130 g srutu pszenicznego) 80 g maczka miesnej, 60 g sru¬ tu sojowego, 60 g maki tapioka, 38 g drozdzy piw¬ nych, 50 g mieszaniny witaimtinowOHmlmeralnejj dla swin"(sklad np. jak w przypadku paszy dla kur¬ czat) 30 g mielonych makuchów lnianych, 30 g paszy glutenokukurydzaanej, 10 g oleju sojowego, g melasy z trzciny cukrowej i 2 g przedmiesz¬ ki substancji czynnej (sklad np. jak w przypadku paszy dla kurczat). Skladniki te po dokladnym zmieszaniu daja 1 kg paszy.Podane wyzej mieszanki sa korzystnie przezna¬ czone dla hodowli i tuczenia kurczat lub swin, ale mieszanki o takim samym lub podobnymi skla¬ dzie mozna tez stosowac do hodowli i tuczenia in¬ nych zwierzat.Wysoka skutecznosc antybiotyku, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku, przeciwko mikro¬ organizmom mozna wykazac w nastepujacych pró- bach. a) Badania in vitro: Antybiotyk rozciencza sie pasta odzywcza Muller- -Hinton z dodatkiem 1% glikozy do zawartosci 200 mikrogramów antybiotyku w 1 md. Roztwór odzywczy zawieral w kazdej próbce 1X 10s do <2X'105 bakterii w ii ml. Probówki z tym roztwo¬ rem poddawano hodowli w oiajgu 18 godzin i na¬ stepnie okreslano stopien zmetnienia. Brak zmet¬ nienia wskazuje na skutecznosc antybiotyku. Przy zawartosci 200 mikrogramów antybiotyku na 1 ml nastejpujace kultury bakterii niie wykazywaly zmet¬ nienia: Escherichia coli 14, Escherichia coli C 165, Proteus vuO®aris 1017, KlebsieOiLa KIO, KlebsneNla 63, Salmonella sp., Shigella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., Proteus indolnegativ sp., Proteus in- doUpositw sp., Pasteurella pseudotuberculosis, Sta- phylococcus aureus 133, Neisseria catarrhalis sp., Diiplococcus pneumoniae sp., Streptococcus pyoge- nes W^, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Cory- •* ne-baoteriuim diphtheriae gravis Corynebacteraium pyogens M., Clostridium botulinum, Clostridium te- tani, Pseudomonas aeruginosa sp., Aeromonas hy- drophila sp., Mycoplazma sp. (sp. = „species" i oznacza blizej nie zidentyfikowane ale charakte- 40 ryistyczne szczepy). b) Badania in vivo: W tablicy 6 podano oddzialywanie antybiotyku na szereg bakterii w badaniach ze zwierzetami, mia¬ nowicie bialymi myszami. Biale myszy zakazono 45 dootrzewnowo podanymi w tablicy bakteriami.Tablica 6 Badanie na zwierzetach — z bialymi myszami Oznaczanie EDM po uplywie 24 godzin Zarodek Escherichia Gali 166 Sltaphylococcus aureus Dawka antybiotyku wedlug wynalazku w mg na 1 kg masy ciala 2 X 600 ; 1X400 60 Podawanie: jednorazowo, podskórnie, 30 minut po zakazeniu, dwukrotnie, 30 i 90 minut po zakazeniu.ED50 oznacza dawke, przy której 50°/o zakazonych zwierzat zyje jeszcze £X uplywie 24 [godzin. w Wysoka skutecznosc antybiotyku, wytwarzanego19 98718 sposobem wedlug wynalazku, jako srodka do wzmagania wzrostu zwierzat mozna wykazac w nastepujacej próbie. W próbach odzywiania poda¬ wano te substancje kurczetom w mieszaninie z pa¬ sza (iilosc paszy nieograniczona). Dawka antybioty¬ ku wynosila 10 lub 20 czesci na milion. Wyniki porównywano z wynikami próby kontrolnej (pasza bez dodatków). Okres badania wynosil 14 dni. Wy¬ niki badania zebrane sa w tablicy 7. zahamowania wzrostu o srednicy okolo 15 mm.Wyosobnianie antybiotyku z brzeczek hodowlanych prowadzi sie w sposób, opisany w przykladzie III.Tablica 7 Grupa Bróba kontrolna Antybiotyk, otrzy¬ mywany wedlug wynalazku czesci na milion 00 czesci na milion Przy¬ rost masy ciala w % 100 10ft,8 ^5 Zuzy¬ cie paszy w % 100 102,8 1012,3 Stopien wyko¬ rzysta¬ nia paszy w % | 100 100 98.'5 Wytwarzanie antybiotyku sposobem wedlug wy¬ nalazku mozna zilustrowac nastepujacymi przykla¬ dami. Wszystkie wartosci podane w opisie i w przykladach w procentach, o ile nie zaznaczono inaczej, stanowia procenty wagowe. Skrót „C" oznacza stezenie. % objetosciowe = czesci objetosciowe, % wago¬ we = czesci wagowe.Przyklad I. Grzybnie szczepu Actinoplanes SE-73/B, wyrosla na skosie agarowym o skladzie: pepton produkt hydrolizy K2HPO4 • 3-H/) p. € KCl, pjBL.NHgS04, p.a.FaS04, p.a. cukier trzcinowy agar • kazeiny, 1. * kwasny 0,25% 0,25% 0,1% 0,05% 0,05% 0,01% '3,0% 2,0% woda do 100% przeszczepia sie do zawartego w kolbach Erlen- meyera o pojemnosci 1 litra wyjalowionego roz¬ tworu pozywki (zwanego dalej „roztwór pozywki A") w ilosci po 140 ml, majacego nastepujacy sklad: odtluszczona maka sojowa 3/)% gliceryna, najczystsza 3,0% CaCOa,p.a. 0,2% woda do 100% i obojetny poliol, zawierajacy grupy hydroksylowe, np. Niax Polyol LHT 67 (znak towarowy Union Cairbide Belg. N.V.) w ilosci 1 kropili na 140 ml roztworu pozywki, w celu usuniecia piany.Po 8 dniach hodowania szczepu na wytrzasarce obrotowej w temperaturze 28°C odwirowuje sie próbki kultur i otrzymany klarowny roztwór bada metoda agarowej plytki z otworami w odniesieniu do Escherichia coli ATCC 9637. Antybiotyk, znaj¬ dujacy sie w roztworze hodowli, powoduje strefy 40 45 50 55 Przyklad II. 0 skladzie: dekstryna gliceryna wyciag z drozdzy CaC03 woda wodociagowa Po 8 litrów rozt 0,4% 0,2% 0,2% 0,2% do 100% 65 i 3,0 ml obojetnego poliolu, zawierajacego grupy hydroksylowe, np. Niax Polyol LHT 67 (znak to¬ warowy Union Carbide Belg. N.V.) na 8 litrów roztworu pozywki, umieszcza sie w szklanych na¬ czyniach fermentacyjnych, zaopatrzonych w miie^ szadlo i urzadzenia do napowietrzania, doprowadza sie za pomoca wodorotlenku sodowego do wartosci pH = 6,8 i wyjalawia w temperaturze 120°C. Po ochlodzeniu roztworów zaszczepia sie naczynia fer¬ mentacyjne 240 ml (3,0% objetosciowych) szczepu SE 73 Actiinoplanes, wyroslego w ciagu 3 dni w roztworze pozywki A w wytrzasanej hodowli, na¬ powietrza, stosujac okolo 4 litry powietrza na 1 mi¬ nute przy okolo 600 obrotach mieszadla na 1 minu¬ te i utrzymuje w temperaturze 28°C.Po uplywie 17 i 24 godzin od rozpoczecia hodo¬ wli do nstczyn fermentacyjnych dodaje sie po 0,4% dekstryny, 0,2% gliceryny i 0,3% wyciagu z droz¬ dzy, a po uplywie 30, 41, 48 i 54 godzin dodaje sie po 0,4% dekstryny, 0,2% gliceryny i 0,4% wy- ciajgu z drozdzy w postaci stezonych mieszanin tych skladników, pozywki, stosujac po 200 nil mie¬ szaniny na kazde naczynie. Wzrost objetosci kul¬ tury na skutek tych dodatków jest kompensowa¬ ny przez zachodzace odparowywanie. Laczna ilosc skladników pozywki wynosi dla dekstryny 2,8%, dla gliceryny 1,4%, dla wyciagu z drozdzy 2,4%, dla CaCQ3 0,2%. Proces hodowania konczy sie po Uplywie 1£0 godzin.Przyklad III. Otrzymane w sposób, opisany w przykladzie II, brzeczki hodowlane z 5 naczyn fermentacyjnych (5 X 8 litrów) laczy sie, dodaje 4/8 litrów acetonu, miesza w ciagu 1 godziny w tem¬ peraturze okolo 25°C i nastepnie odwirowuje. Kla¬ rowna pozostalosc uwolniona od grzybni zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 20— -^35°C do okolo 35 litrów, dodaje wodorotlenku sodowego az do uzyskania wartosci pH = 9 i eks¬ trahuje 18 litrami octanu etylu. Organiczna faze suszy sie 500 g siarczanu sodowego, odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 1 litra i traktuje 2 litrami cykloheksanu. Wytracony osad odsacza sie i po wysuszeniu w powietrzu otrzy¬ muje 12,5 g surowego antybiotyku.Przyklad IV. Oczyszczanie antybiotyku me¬ toda preparatywnej chromatografii cienkowarstwo¬ wej (DC) W chromatogramiie cienkowarstwowym surowego antybiotyku,, otrzymanego sposobem, opisanym w przykladzie III, antybiotyk ten wystepuje w glów¬ nej strefie o wartosci R* = 0,34 (eliuemt nr 5 z tab¬ licy 2, plyty z zelu krzemionkowego firmy Merck, Darmlstadt, RiFN, zel krzemionkowy 60 F^). 1,00 g surowego antybiotyku poddaje sie rozdzielaniu na21 plytach z zelu krczemionkowegD (20X20 om) (zel krzemionkowy PSC F^ firmy Merck) (eluent nr 5 z tablicy 2). Wyosaibnia sie glówna strefe o wartosci R4 = 0,34. Wydajnosc wynosi 327 mig.Przyklad V. Oczyszczanie antybiotyku me¬ toda chromatografii! kolumnowej 3,5 g surowego antybiotyku, otrzymanego w spo¬ sób, opisany w przykladzie III, chromatoigrafuje sie na kolumnie o wysokosci 100 cm i srednicy cm, wypelnionej obojetnym zelem krzemionko¬ wym (zel krzemionkowy 60, wielkosc ziarna poni¬ zej 0,063, firmy Merck, Darmstadt) w eluencie nr z tablicy 2. Zbiera sie frakcje glówna, absorbu¬ jaca przy 307 milimikronach. Eluat odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc prze- krystalizowuje z octanu etylu z eterem naftowym.Antybiotyk suszy sie w ciagu 4 dni w temperatu- rze lt)0oC pod silnie obnizonym cisnieniem, wyno¬ szacym 0,01 tor. Wydajnosc 1,8 g.Przyklad VI. Oczyszczanie przez rozdziela¬ nie metoda Craiga 50 g surowego produktu, otrzymanego sposobem, opisanym w przykladzie III, poddaje sie, rozdzie¬ laniu metoda Craiga, stosujac aparature firmy La- bortec F. Schmddiger, Bazylea, Szwajcaria, przy objetosci faz 250 ml i z uzyciem mieszaniny roz- puiszczaWków, zawierajacych eter naftowy, octan etylu, dwumetyloformamid i wode w stosunku 1,5 : 8,5 : 5 : 5 (objetosciowo). Przeprowadza sie 180 zabiegów rozdzielania, przy czym po 60 zabiegach górna faze odbiera sie frakcjami. Antybiotyk znaj¬ duje sie w frakcjach 21—68. Zebrana górna faze plucze sie woda, steza silnie pod zmniejszonym cisnieniem i traktuje 100 ml octanu etylu. Anty¬ biotyk wytraca sie przez dodanie 1 litra eteru etylowego, odsacza i suszy w temperaturze 400°C 98718 22 pod silnie obnizonym cisnieniem 0,01 tor w ciagu 4 dni. Wydajnosc wynosi 11fi g.Wymienione w przykladach badania dyfuzyjne na plytkach prowadzi sie w nizej podany sposób (porównaj P. Klein, Bakteóologiische Grundlagen der Chemotheraipeutiischen Laboratoriumpraxis, wydawnictwo Springer, Góttingen 1957, str. 86 i nast.)/ W agarowej plycie, zakazonej Escherichia coli ATCC 9637, wytlacza sie otwory, w które io wlewa sie roztwór substancji, poddawanej bada¬ niu i prowadzi hodowle w temperaturze 37°C w ciagu okolo 16 godzin. Strefy zahamowania wyka¬ zuja skutecznosc przeciwko uzytym zarazkom i z wielkosci tych stref mozna wnioskowac o za- 16 wartosci antybiotyku, wytwarzanego sposobem we¬ dlug wynalazku. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 20 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku An- tiibioticum Bay g 7299, znamienny tym, ze szczepy Actinoplanes SE 73, zdeponowane pod nr CBS — Nr 432.74 i/lub SE 73/B, zdeponowane pod nr CBS — Nr 434.74 poddaje sie hodowli w warun¬ kach aerobowych w zwyklej pozywce, zawieraja¬ cej wegiel, azot i substancje mineralne, po czym wyosabmia sie antybiotyk zwyklymi sposobami z brzeczki hodowlanej i/lub grzybni i ewentualnie 30 oczyszcza.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle powadzi sie w temperaturze od okolo 20°C do okolo 40°C.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 hodowle prowadzi sie przy wartosci pH rozwijaja¬ cej sie kultury od okolo 6 do okolo 8. 100*, 50 360rai r/G. i «! ~T 4000 3000 2000 FIC. 2 1000 400 Y [cm-1]98718 11 10 9 8 FIG. 3 150 100 50 O PPM ric 4 Drukarnia Narodowa Zaklad Nr 6, zam. 365/78 Cena 45 zl PL